JPH08116976A - 免疫用核酸調製物およびこれを用いた免疫方法 - Google Patents
免疫用核酸調製物およびこれを用いた免疫方法Info
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- JPH08116976A JPH08116976A JP6282908A JP28290894A JPH08116976A JP H08116976 A JPH08116976 A JP H08116976A JP 6282908 A JP6282908 A JP 6282908A JP 28290894 A JP28290894 A JP 28290894A JP H08116976 A JPH08116976 A JP H08116976A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 動物でのＤＮＡ注入による種々の病原体に対
する免疫賦与において、優れた免疫効果を発揮する免疫
用核酸調製物を提供する。 【構成】 動物細胞中で機能する遺伝子発現用プロモー
ターの下流に病原体由来の免疫抗原をコードする遺伝子
を接続した線状化ＤＮＡからなることを特徴とする動物
用の免疫用核酸調製物およびこれを用いた動物の免疫方
法。
する免疫賦与において、優れた免疫効果を発揮する免疫
用核酸調製物を提供する。 【構成】 動物細胞中で機能する遺伝子発現用プロモー
ターの下流に病原体由来の免疫抗原をコードする遺伝子
を接続した線状化ＤＮＡからなることを特徴とする動物
用の免疫用核酸調製物およびこれを用いた動物の免疫方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、線状化したＤＮＡから
なることを特徴とする動物（ヒトも含む）用の免疫用核
酸調製物、詳しくは、線状化した外来遺伝子発現ＤＮＡ
を体内に注入することにより、動物体内において外来遺
伝子産物を発現させ、該動物において病原体に対して免
疫を賦与する方法およびこれに使用される免疫用核酸調
製物に関する。
なることを特徴とする動物（ヒトも含む）用の免疫用核
酸調製物、詳しくは、線状化した外来遺伝子発現ＤＮＡ
を体内に注入することにより、動物体内において外来遺
伝子産物を発現させ、該動物において病原体に対して免
疫を賦与する方法およびこれに使用される免疫用核酸調
製物に関する。
【０００２】
【従来技術】これまで、ワクチネーションは弱毒化した
生の病原体を用いた生ワクチン、或いは不活化された病
原体を用いた不活化ワクチンが用いられてきた。一般的
に不活化ワクチンは、安全性の面では生ワクチンに優れ
るものの、効果の持続が短かいという短所を有する。一
方、生ワクチンは、安全性の面では不活化ワクチンに比
べて副作用等が危惧されるものの、有効性や持続性では
優れているという一面を持っている。このような状況に
おいて、病原体の弱毒化に成功し、安全性の面でもこれ
を克服したケースでは、有効性を重視する観点から一般
に生ワクチンが広く使用されている。しかしながら、生
ワクチンである以上、安全性の問題が完全に解決された
という保証はなく、近年の麻疹生ワクチンによる無菌性
随膜炎の副作用のように、実際に国で認可されたワクチ
ンが安全性の面で大きな問題を引き起こすという可能性
も否定できない。
生の病原体を用いた生ワクチン、或いは不活化された病
原体を用いた不活化ワクチンが用いられてきた。一般的
に不活化ワクチンは、安全性の面では生ワクチンに優れ
るものの、効果の持続が短かいという短所を有する。一
方、生ワクチンは、安全性の面では不活化ワクチンに比
べて副作用等が危惧されるものの、有効性や持続性では
優れているという一面を持っている。このような状況に
おいて、病原体の弱毒化に成功し、安全性の面でもこれ
を克服したケースでは、有効性を重視する観点から一般
に生ワクチンが広く使用されている。しかしながら、生
ワクチンである以上、安全性の問題が完全に解決された
という保証はなく、近年の麻疹生ワクチンによる無菌性
随膜炎の副作用のように、実際に国で認可されたワクチ
ンが安全性の面で大きな問題を引き起こすという可能性
も否定できない。
【０００３】また、近年では、有効性・持続性に優れる
という生ワクチンの特性を生かすべく、これら生ワクチ
ンをベクターとして、他の病原体の感染防御抗原遺伝子
を組み込んだウイルスベクターによる多価生ワクチンの
作製が試みられている。
という生ワクチンの特性を生かすべく、これら生ワクチ
ンをベクターとして、他の病原体の感染防御抗原遺伝子
を組み込んだウイルスベクターによる多価生ワクチンの
作製が試みられている。
【０００４】しかしながら、このようなウイルスベクタ
ーワクチンにおいてもその基本系が生ワクチンであるこ
とから、効果面と表裏一体の関係で常に病原性の問題は
存在している。さらに、生ワクチンは、上述した安全性
上の問題点の他に、 宿主が既にワクチン株やワクチ
ン株と同じ型の病原体に対する免疫を獲得している場
合、接種したワクチン株は宿主から容易に排除され、充
分なワクチン効果が得られない。 同様な理由で移行
抗体が存在する場合にも生ワクチンは充分な効果を発揮
しえない。 生ワクチン同志の干渉の点から、それら
を混合した多価生ワクチンの作製が困難であること等の
問題も有している。
ーワクチンにおいてもその基本系が生ワクチンであるこ
とから、効果面と表裏一体の関係で常に病原性の問題は
存在している。さらに、生ワクチンは、上述した安全性
上の問題点の他に、 宿主が既にワクチン株やワクチ
ン株と同じ型の病原体に対する免疫を獲得している場
合、接種したワクチン株は宿主から容易に排除され、充
分なワクチン効果が得られない。 同様な理由で移行
抗体が存在する場合にも生ワクチンは充分な効果を発揮
しえない。 生ワクチン同志の干渉の点から、それら
を混合した多価生ワクチンの作製が困難であること等の
問題も有している。
【０００５】このような状況下、全く新しい免疫手法と
して、感染防御抗原を生体中で発現させる遺伝子（プラ
スミド）を直接生体に投与する試みがなされ、ヘテロの
動物実験では充分な効果を示すことがニワトリインフル
エンザと狂犬病ウイルスで報告されている（Montgomer
y, DNA Cell.Biol., 12, 777-783(1993):インフルエン
ザ／マウス、Robinson, Vaccine, 11, 957-961(1993):
インフルエンザ／マウス・ニワトリ）。
して、感染防御抗原を生体中で発現させる遺伝子（プラ
スミド）を直接生体に投与する試みがなされ、ヘテロの
動物実験では充分な効果を示すことがニワトリインフル
エンザと狂犬病ウイルスで報告されている（Montgomer
y, DNA Cell.Biol., 12, 777-783(1993):インフルエン
ザ／マウス、Robinson, Vaccine, 11, 957-961(1993):
インフルエンザ／マウス・ニワトリ）。
【０００６】このようなプラスミド（ＤＮＡ）を用いた
ワクチン（以下、ＤＮＡワクチンと呼ぶ）の場合、生ワ
クチンとは異なり、複数を混合して接種してもお互いの
干渉によるワクチン効果の低減が理論的には考えらない
ため、容易に多価ワクチンが構築できるものと期待され
る。また、ＤＮＡワクチンでは、従来の生ワクチンや新
たに開発されている生ワクチンをベクターとする組換え
ワクチンが有する問題点、すなわち接種個体からワクチ
ンが排泄され新たな感染源になることを危惧する必要も
ない。
ワクチン（以下、ＤＮＡワクチンと呼ぶ）の場合、生ワ
クチンとは異なり、複数を混合して接種してもお互いの
干渉によるワクチン効果の低減が理論的には考えらない
ため、容易に多価ワクチンが構築できるものと期待され
る。また、ＤＮＡワクチンでは、従来の生ワクチンや新
たに開発されている生ワクチンをベクターとする組換え
ワクチンが有する問題点、すなわち接種個体からワクチ
ンが排泄され新たな感染源になることを危惧する必要も
ない。
【０００７】しかしながら、これまでに報告された技術
としては、例えばニワトリインフルエンザの場合、１回
100μgのプラスミドを三つのルート（静脈内、皮下、腹
腔内）から同時に、しかも２回投与することではじめて
50％の防御成績を得ている程度に過ぎない（Robinson,
Vaccine, 11, 957-961(1993)） また、マウスの実験では200μgのプラスミドを３回投与
することによって初めてインフルエンザを防御するに至
っている（Montgomery, DNA Cell.Biol., 12,777-783(1
993)） 一方、別の報告例では、プラスミドの投与量を低減する
ために高価な金パウダーに吸着させ投与することが試み
られているが（E.F.Fynan, ProNAS, 90, 11478-11482(1
993)）、ニワトリ等の家禽用ワクチンの様にワクチン自
体の値段が安い市場を有する技術分野では、コストの面
からも現実的ではない。
としては、例えばニワトリインフルエンザの場合、１回
100μgのプラスミドを三つのルート（静脈内、皮下、腹
腔内）から同時に、しかも２回投与することではじめて
50％の防御成績を得ている程度に過ぎない（Robinson,
Vaccine, 11, 957-961(1993)） また、マウスの実験では200μgのプラスミドを３回投与
することによって初めてインフルエンザを防御するに至
っている（Montgomery, DNA Cell.Biol., 12,777-783(1
993)） 一方、別の報告例では、プラスミドの投与量を低減する
ために高価な金パウダーに吸着させ投与することが試み
られているが（E.F.Fynan, ProNAS, 90, 11478-11482(1
993)）、ニワトリ等の家禽用ワクチンの様にワクチン自
体の値段が安い市場を有する技術分野では、コストの面
からも現実的ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述した様に、プラス
ミドを直接投与する免疫方法自体は既にいくつか試みら
れているものの、有効性や剤形上の実用性の観点からは
動物用免疫方法として実用に耐え得るものの報告はこれ
までには無く、従来のワクチンに代わる、実用的な効果
的免疫方法の開発が望まれている。
ミドを直接投与する免疫方法自体は既にいくつか試みら
れているものの、有効性や剤形上の実用性の観点からは
動物用免疫方法として実用に耐え得るものの報告はこれ
までには無く、従来のワクチンに代わる、実用的な効果
的免疫方法の開発が望まれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】このような状況下、発明
者らは、免疫抗原をコードする遺伝子をプロモーターの
下流に組み込んだプラスミドを構築し、通常の環状ＤＮ
Ａの形ではなく、これを制限酵素処理により線状化した
後、幼雛等の動物に対して直接投与することで投与した
動物を目的の感染症から効果的に防御することに成功し
た。
者らは、免疫抗原をコードする遺伝子をプロモーターの
下流に組み込んだプラスミドを構築し、通常の環状ＤＮ
Ａの形ではなく、これを制限酵素処理により線状化した
後、幼雛等の動物に対して直接投与することで投与した
動物を目的の感染症から効果的に防御することに成功し
た。
【００１０】これまでに相同組換えやゲノムへの外来性
ＤＮＡの組み込みにおいてプラスミドを線状化する方法
が用いられることはあった。しかしながら、ＤＮＡワク
チンの効果はこれまで環状ＤＮＡでしか確認されておら
ず、線状化することによってワクチン効果が改善された
ことは全く予想外の効果であった。
ＤＮＡの組み込みにおいてプラスミドを線状化する方法
が用いられることはあった。しかしながら、ＤＮＡワク
チンの効果はこれまで環状ＤＮＡでしか確認されておら
ず、線状化することによってワクチン効果が改善された
ことは全く予想外の効果であった。
【００１１】これまでのＤＮＡワクチンの実験で線状化
したＤＮＡが用いられていない理由の一つには、恐ら
く、線状化したＤＮＡはＤＮＡ分解酵素の影響を受け易
いと考えられていたためであると考えられる。しかしな
がら以下に示すように、今回の試験では、ワクチン効果
は線状化したプラスミドにおいてのみ認められ、環状の
プラスミドを投与した場合には、有意な抗体価の上昇お
よびワクチン効果の発現は全く認められなかった。すな
わち、従来の予想に反してＤＮＡワクチンの形状につい
ては、線状化する方が遥かに効果的であることが示され
た。
したＤＮＡが用いられていない理由の一つには、恐ら
く、線状化したＤＮＡはＤＮＡ分解酵素の影響を受け易
いと考えられていたためであると考えられる。しかしな
がら以下に示すように、今回の試験では、ワクチン効果
は線状化したプラスミドにおいてのみ認められ、環状の
プラスミドを投与した場合には、有意な抗体価の上昇お
よびワクチン効果の発現は全く認められなかった。すな
わち、従来の予想に反してＤＮＡワクチンの形状につい
ては、線状化する方が遥かに効果的であることが示され
た。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
は、まず、(1)各種感染防御抗原遺伝子を発現プラスミド
のプロモーター下流にクローニングする。(2)次に、同
プラスミドにおいて遺伝子発現に影響しない任意な箇所
を制限酵素で切断することにより線状化する。(3)これ
を被接種個体に投与する。(1)のプロモーターとしては
ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターが最も好ま
しい態様のひとつとして挙げられる。特にニワトリ用の
ワクチンとして本発明のＤＮＡワクチンが用いられる場
合には、このβ−アクチン遺伝子プロモーターはニワト
リ本来のプロモーターでもあり、好ましい態様として用
いられる。また、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモ
ーターに関しては、発現効率を向上させるべく、種々の
改良が施されたプロモーターが知られており（特開平2-
156891号、特開平3-168087号）、このようなニワトリの
β−アクチン遺伝子プロモーターをベースにした改良型
のプロモーターも好適に用いられる。
は、まず、(1)各種感染防御抗原遺伝子を発現プラスミド
のプロモーター下流にクローニングする。(2)次に、同
プラスミドにおいて遺伝子発現に影響しない任意な箇所
を制限酵素で切断することにより線状化する。(3)これ
を被接種個体に投与する。(1)のプロモーターとしては
ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターが最も好ま
しい態様のひとつとして挙げられる。特にニワトリ用の
ワクチンとして本発明のＤＮＡワクチンが用いられる場
合には、このβ−アクチン遺伝子プロモーターはニワト
リ本来のプロモーターでもあり、好ましい態様として用
いられる。また、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモ
ーターに関しては、発現効率を向上させるべく、種々の
改良が施されたプロモーターが知られており（特開平2-
156891号、特開平3-168087号）、このようなニワトリの
β−アクチン遺伝子プロモーターをベースにした改良型
のプロモーターも好適に用いられる。
【００１３】また、プラスミドに組み込まれる感染防御
抗原遺伝子としては、ウイルス性疾病、細菌性疾病、寄
生虫病等各種ニワトリ病疾病のワクチン抗原となり得う
る免疫抗原蛋白をコードする遺伝子が挙げられる。
抗原遺伝子としては、ウイルス性疾病、細菌性疾病、寄
生虫病等各種ニワトリ病疾病のワクチン抗原となり得う
る免疫抗原蛋白をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１４】多価ワクチンの構築は、プロモーター下流
に感染防御抗原をコードする遺伝子をつないだプラスミ
ドを混合するか、あるいはそれぞれ感染防御抗原遺伝子
の上流にプロモーターを付加したものを直列に複数つな
いだプラスミドを構築することで、容易に調製可能であ
る。市販されているファージミドベクターであるpUC119
を用いた場合、約20kbまでのＤＮＡをそこにクローニン
グし安定に複製させうるので、どのような感染防御抗原
遺伝子においても、pUC119上に、例えばβ-アクチンプ
ロモーター（約1.4kb）をクローニングし、さらにその
下流に各感染防御抗原遺伝子とポリＡ付加シグナルを安
定に組み込むことは可能である。その長さは、例えばニ
ワトリの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）の場合、ウイルス粒子を構成するカプシド蛋白、Ｖ
Ｐ２４３すべてを合わせても必要な遺伝子としては 3.2
kbに留まる。ニワトリのニューカッスル病ウイルス（Ｎ
ＤＶ）のＦ遺伝子の場合は1.7kb、伝染性気管支炎ウイ
スル（ＩＢＶ）のスパイク蛋白遺伝子では4.2kb程度の
長さの遺伝子であり、問題なく本発明に用いる線状化Ｄ
ＮＡを調製することが可能である。
に感染防御抗原をコードする遺伝子をつないだプラスミ
ドを混合するか、あるいはそれぞれ感染防御抗原遺伝子
の上流にプロモーターを付加したものを直列に複数つな
いだプラスミドを構築することで、容易に調製可能であ
る。市販されているファージミドベクターであるpUC119
を用いた場合、約20kbまでのＤＮＡをそこにクローニン
グし安定に複製させうるので、どのような感染防御抗原
遺伝子においても、pUC119上に、例えばβ-アクチンプ
ロモーター（約1.4kb）をクローニングし、さらにその
下流に各感染防御抗原遺伝子とポリＡ付加シグナルを安
定に組み込むことは可能である。その長さは、例えばニ
ワトリの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）の場合、ウイルス粒子を構成するカプシド蛋白、Ｖ
Ｐ２４３すべてを合わせても必要な遺伝子としては 3.2
kbに留まる。ニワトリのニューカッスル病ウイルス（Ｎ
ＤＶ）のＦ遺伝子の場合は1.7kb、伝染性気管支炎ウイ
スル（ＩＢＶ）のスパイク蛋白遺伝子では4.2kb程度の
長さの遺伝子であり、問題なく本発明に用いる線状化Ｄ
ＮＡを調製することが可能である。
【００１５】接種する対象となる動物としては、通常ワ
クチン接種が実施されている動物であれば特に限定され
るものではなく、豚、牛またはニワトリ等の家禽類を初
めとした鳥類や哺乳動物さらにはヒトへも用いることが
可能である。特に本発明の実施例では、ニワトリを用い
てその効果を確認しているが、特にニワトリに限定され
るものではなく、種々の動物で本発明の効果が得られる
と考えられる。特にニワトリの場合に、ニワトリの日齢
としては、今回の実施例では孵化直後の接種での試験例
を示しているが、特定の接種部位や日齢に限定されるこ
となく本ＤＮＡワクチンは有効であるものと考えられ
る。
クチン接種が実施されている動物であれば特に限定され
るものではなく、豚、牛またはニワトリ等の家禽類を初
めとした鳥類や哺乳動物さらにはヒトへも用いることが
可能である。特に本発明の実施例では、ニワトリを用い
てその効果を確認しているが、特にニワトリに限定され
るものではなく、種々の動物で本発明の効果が得られる
と考えられる。特にニワトリの場合に、ニワトリの日齢
としては、今回の実施例では孵化直後の接種での試験例
を示しているが、特定の接種部位や日齢に限定されるこ
となく本ＤＮＡワクチンは有効であるものと考えられ
る。
【００１６】また、今回の試験では線状化ＤＮＡ単独で
の有効性が示されたが、ワクチン価格をより高く設定す
ることが可能な他の動物、例えば牛、豚、犬、猫、ある
いは人等を対象としたワクチンについては、これまでに
報告されている金粒子やリポソーム等担体との併用によ
りさらに効果的なワクチンの作出が可能になるものと期
待される。以下、ニワトリのニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドから調製したＤ
ＮＡワクチンを例に詳細に説明するが、本発明は何らこ
れに限定されるものではない。
の有効性が示されたが、ワクチン価格をより高く設定す
ることが可能な他の動物、例えば牛、豚、犬、猫、ある
いは人等を対象としたワクチンについては、これまでに
報告されている金粒子やリポソーム等担体との併用によ
りさらに効果的なワクチンの作出が可能になるものと期
待される。以下、ニワトリのニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドから調製したＤ
ＮＡワクチンを例に詳細に説明するが、本発明は何らこ
れに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】実施例１：Ｆ蛋白発現プラスミドの構築 ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを有するプ
ラスミドｐＣＡＧＧＳ（特開平3-168087号）を同プロモ
ーターの3'側（下流）に位置するＨｉｎｄIIIサイトで
切断後、プロモーターを含む3.8kbの断片を電気泳動後
のゲルから回収した。これを平滑末端処理した後、脱リ
ン酸し、同部位へ1.7kbのＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子（H.Sat
o et al., Virus Research., 7, p241-255 (1987)）を
挿入して、ＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドｐＣＡ
ＧＦを構築した。このようなＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現
プラスミドｐＣＡＧＦの構築法については、図１にその
概要を示した。
ラスミドｐＣＡＧＧＳ（特開平3-168087号）を同プロモ
ーターの3'側（下流）に位置するＨｉｎｄIIIサイトで
切断後、プロモーターを含む3.8kbの断片を電気泳動後
のゲルから回収した。これを平滑末端処理した後、脱リ
ン酸し、同部位へ1.7kbのＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子（H.Sat
o et al., Virus Research., 7, p241-255 (1987)）を
挿入して、ＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドｐＣＡ
ＧＦを構築した。このようなＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現
プラスミドｐＣＡＧＦの構築法については、図１にその
概要を示した。
【００１８】実施例２：Ｆ蛋白発現ＤＮＡによる免疫試
験 ＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドｐＣＡＧＦの線状
化は、制限酵素ＳｃａＩによりpUC119に由来する部分を
１ヶ所切断することにより行った（図１参照）。その
後、常法に従いフェノール処理、エタノール沈澱により
線状化したＤＮＡを回収した。
験 ＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子発現プラスミドｐＣＡＧＦの線状
化は、制限酵素ＳｃａＩによりpUC119に由来する部分を
１ヶ所切断することにより行った（図１参照）。その
後、常法に従いフェノール処理、エタノール沈澱により
線状化したＤＮＡを回収した。
【００１９】次に、環状または線状化したｐＣＡＧＦ10
0μgを１週齢ＳＰＦニワトリの下腿部筋肉内に注射器に
より投与した。その際、ＤＮＡを効果的に細胞内に取り
込ませることを目的として、ドラッグデリバリーシステ
ム（ＤＤＳ）の一つであるリポソームの効果も併せて検
討した。すなわち、500μgの線状化したｐＣＡＧＦをラ
イフテクノロジー（LIFE TECHNOLOGIES）社のプロトコ
ールに従ってリポフェクチンまたはリポフェクタミンと
混合し、プロトコールに定められた時間放置後、各々５
羽のニワトリに分けて接種した。
0μgを１週齢ＳＰＦニワトリの下腿部筋肉内に注射器に
より投与した。その際、ＤＮＡを効果的に細胞内に取り
込ませることを目的として、ドラッグデリバリーシステ
ム（ＤＤＳ）の一つであるリポソームの効果も併せて検
討した。すなわち、500μgの線状化したｐＣＡＧＦをラ
イフテクノロジー（LIFE TECHNOLOGIES）社のプロトコ
ールに従ってリポフェクチンまたはリポフェクタミンと
混合し、プロトコールに定められた時間放置後、各々５
羽のニワトリに分けて接種した。
【００２０】各群、接種後３週目から９週目まで採血
し、抗Ｆ蛋白抗体価の推移をＥＬＩＳＡにより測定し
た。ここで用いたＥＬＩＳＡは、Ｆ蛋白を持続的に産生
する細胞（上記β−アクチン遺伝子プロモーターに制御
されたＮＤＶ−Ｆ遺伝子によって形質転換されたマウス
ミエローマ細胞P3-X63-Ag8.653）を組織培養用９６穴プ
レートに固相化したものを抗原として用いた抗体測定法
であり、特願平5-96727号に詳細に示されている。
し、抗Ｆ蛋白抗体価の推移をＥＬＩＳＡにより測定し
た。ここで用いたＥＬＩＳＡは、Ｆ蛋白を持続的に産生
する細胞（上記β−アクチン遺伝子プロモーターに制御
されたＮＤＶ−Ｆ遺伝子によって形質転換されたマウス
ミエローマ細胞P3-X63-Ag8.653）を組織培養用９６穴プ
レートに固相化したものを抗原として用いた抗体測定法
であり、特願平5-96727号に詳細に示されている。
【００２１】その結果、表１に示したように線状化した
ＤＮＡを投与した群のうちＤＤＳ無添加の群およびリポ
フェクチンと混合した群の個体において有意な抗体価の
上昇が認められた。このとき、リポフェクチンと混合し
たＤＮＡを接種した群の抗体価は無添加群のそれ以下で
あり、抗体価の面から判断してワクチンプラスミドの線
状化はＤＤＳとしてリポフェクチンを使用する場合と同
等以上の効果を示すことが確認された。
ＤＮＡを投与した群のうちＤＤＳ無添加の群およびリポ
フェクチンと混合した群の個体において有意な抗体価の
上昇が認められた。このとき、リポフェクチンと混合し
たＤＮＡを接種した群の抗体価は無添加群のそれ以下で
あり、抗体価の面から判断してワクチンプラスミドの線
状化はＤＤＳとしてリポフェクチンを使用する場合と同
等以上の効果を示すことが確認された。
【００２２】
【表１】
【００２３】抗体価については、特願平5-96727号に記
載されたＥＬＩＳＡによる抗体測定法により測定した。
この結果から、本発明の免疫調製物を投与した固体から
は、強毒ＮＤＶの攻撃を充分防御することが推定され
た。そこでこの点を確認するために強毒ＮＤＶによる攻
撃試験を実施した。すなわち、９週目の採血後、ニュー
カッスル病ワクチンの国家検定基準に従って強毒ＮＤＶ
佐藤株104致死量で筋肉内攻撃し、２週間観察した。
載されたＥＬＩＳＡによる抗体測定法により測定した。
この結果から、本発明の免疫調製物を投与した固体から
は、強毒ＮＤＶの攻撃を充分防御することが推定され
た。そこでこの点を確認するために強毒ＮＤＶによる攻
撃試験を実施した。すなわち、９週目の採血後、ニュー
カッスル病ワクチンの国家検定基準に従って強毒ＮＤＶ
佐藤株104致死量で筋肉内攻撃し、２週間観察した。
【００２４】その結果、表２に示したように抗体価の上
昇が認められた個体では、ＤＮＡワクチン接種後９週目
においても充分な防御を示すことが確認され、抗体価の
成績から推定された防御効果が確認された。このとき、
従来のデータからは防御しないであろうと予測された個
体（No.89；攻撃時抗体価 0.13、No.93；攻撃時抗体価
0.08、およびNo.94；攻撃時抗体価 0.13）の防御には、
ＤＮＡワクチン接種によって惹起された細胞性免疫が関
与しているものと推定された。
昇が認められた個体では、ＤＮＡワクチン接種後９週目
においても充分な防御を示すことが確認され、抗体価の
成績から推定された防御効果が確認された。このとき、
従来のデータからは防御しないであろうと予測された個
体（No.89；攻撃時抗体価 0.13、No.93；攻撃時抗体価
0.08、およびNo.94；攻撃時抗体価 0.13）の防御には、
ＤＮＡワクチン接種によって惹起された細胞性免疫が関
与しているものと推定された。
【００２５】以上の結果は、１回の接種で、ブロイラー
の飼育期間を充分カバーする免疫を賦与しうる可能性を
示すものである。驚くべきことに、No.94のように９週
目になって初めて抗体価が上昇する個体も認められ、個
体によってはさらに長期に亘って抗体価が持続すること
が推定された。
の飼育期間を充分カバーする免疫を賦与しうる可能性を
示すものである。驚くべきことに、No.94のように９週
目になって初めて抗体価が上昇する個体も認められ、個
体によってはさらに長期に亘って抗体価が持続すること
が推定された。
【００２６】
【表２】
【図１】 実施例１におけるＮＤＶ−Ｆ蛋白発現プラス
ミドｐＣＡＧＦの構築を示す。
ミドｐＣＡＧＦの構築を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ
Claims (11)
- 【請求項１】 動物細胞中で機能する遺伝子発現用プロ
モーターの下流に病原体由来の免疫抗原をコードする遺
伝子を接続した線状化ＤＮＡからなることを特徴とする
動物用の免疫用核酸調製物。 - 【請求項２】 遺伝子発現用プロモーターがニワトリβ
−アクチン遺伝子プロモーターもしくは改良型ニワトリ
β−アクチン遺伝子プロモーターである請求項１の免疫
用核酸調製物。 - 【請求項３】 病原体由来の免疫抗原をコードする遺伝
子が、ニワトリのニューカッスル病ウイルスＦ蛋白をコ
ードする遺伝子である請求項１の免疫用核酸調製物。 - 【請求項４】 動物が家禽類である請求項１の免疫用核
酸調製物。 - 【請求項５】 家禽類がニワトリである請求項４の免疫
用核酸調製物。 - 【請求項６】 動物細胞中で機能する遺伝子発現用プロ
モーターの下流に病原体由来の免疫抗原をコードする遺
伝子を接続した線状化ＤＮＡを調製し、このＤＮＡを動
物の体内に注入することを特徴とする動物の免疫方法。 - 【請求項７】 遺伝子発現用プロモーターがニワトリβ
−アクチン遺伝子プロモーターもしくは改良型ニワトリ
β−アクチン遺伝子プロモーターである請求項６の免疫
方法。 - 【請求項８】 病原体由来の遺伝子がニワトリのニュー
カッスル病ウイルスＦ蛋白をコードする遺伝子である請
求項６の免疫方法。 - 【請求項９】 動物が家禽類である請求項６の免疫方
法。 - 【請求項１０】 家禽類がニワトリである請求項９の免
疫方法。 - 【請求項１１】 ニワトリが雛である請求項１０の免疫
方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6282908A JPH08116976A (ja) | 1994-10-20 | 1994-10-20 | 免疫用核酸調製物およびこれを用いた免疫方法 |
| AU37094/95A AU3709495A (en) | 1994-10-20 | 1995-10-18 | Nucleic acid preparation for immunization and method for immunization using the same |
| PCT/JP1995/002134 WO1996012808A1 (en) | 1994-10-20 | 1995-10-18 | Nucleic acid preparation for immunization and method for immunization using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6282908A JPH08116976A (ja) | 1994-10-20 | 1994-10-20 | 免疫用核酸調製物およびこれを用いた免疫方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08116976A true JPH08116976A (ja) | 1996-05-14 |
Family
ID=17658674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6282908A Withdrawn JPH08116976A (ja) | 1994-10-20 | 1994-10-20 | 免疫用核酸調製物およびこれを用いた免疫方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08116976A (ja) |
| AU (1) | AU3709495A (ja) |
| WO (1) | WO1996012808A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009203242A (ja) * | 2002-03-08 | 2009-09-10 | Schweitzer Chemical Corp Usa | インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）マルチプルｄｎａワクチンと多価ｄｎａワクチン |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2751225B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique aviaire |
| EP0863151A1 (en) * | 1997-02-12 | 1998-09-09 | Akzo Nobel N.V. | "Canine parvovirus dna vaccines" |
| CA2223029A1 (en) | 1997-02-12 | 1998-08-12 | Akzo Nobel Nv | Canine parvovirus dna vaccines |
| WO2000077218A1 (en) * | 1999-06-10 | 2000-12-21 | Agricultural Research Council | Vaccine for newcastle disease virus |
| US20020061861A1 (en) * | 2000-08-17 | 2002-05-23 | Hans Herweijer | Nucleic acid expression from linear nucleic acids |
| JPWO2002038753A1 (ja) * | 2000-11-09 | 2004-03-18 | 渡辺 純一 | 病原体に感染した動物の病態または生存に影響を与える遺伝子のスクリーニング方法 |
| DK2327764T3 (da) | 2009-11-30 | 2012-04-02 | United Cancer Res Inst | Ny klon af Newcastle disease-virus, dens fremstilling og dens anvendelse ved medicinsk behandling af cancer |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339413C (en) * | 1988-06-24 | 1997-09-02 | Junichi Miyazaki | Exogenous gene expression vector containing chick .beta.-actin gene promoter |
| JP2824433B2 (ja) * | 1988-12-09 | 1998-11-11 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 新規なハイブリッドプロモーターおよびこれを組み込んだ外来遺伝子発現用ベクター |
| KR930701588A (ko) * | 1990-07-02 | 1993-06-12 | 스튜어트 알. 슈터 | 재조합 구두 바이러스 백신 |
| AU657144B2 (en) * | 1991-07-09 | 1995-03-02 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant Marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same |
-
1994
- 1994-10-20 JP JP6282908A patent/JPH08116976A/ja not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-10-18 WO PCT/JP1995/002134 patent/WO1996012808A1/en active Application Filing
- 1995-10-18 AU AU37094/95A patent/AU3709495A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009203242A (ja) * | 2002-03-08 | 2009-09-10 | Schweitzer Chemical Corp Usa | インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）マルチプルｄｎａワクチンと多価ｄｎａワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3709495A (en) | 1996-05-15 |
| WO1996012808A1 (en) | 1996-05-02 |
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