DE68920610T2

DE68920610T2 - Rekombinantes Virus der Marekschen Krankheit und Vakzin.

Info

Publication number: DE68920610T2
Application number: DE68920610T
Authority: DE
Inventors: Konosuke Fukai; Toyokazu Ishikawa; Sadao Manabe; Chisato Mori; Juichiro Osame; Keisuke Takaku; Akihisa Takamizawa; Iwao Yoshida
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1988-03-20
Filing date: 1989-03-14
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2009-03-15
Also published as: EP0334530B1; AU3142889A; MY103854A; ATE117369T1; CA1340243C; JP2779447B2; EP0334530A1; DE68920610D1; KR890014740A; JPH02291277A; KR920000116B1; NZ228409A; HUT52555A; US5650153A; AU619812B2; ES2066842T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Virus der Marekschen Krankheit. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Virus der Marekschen Krankheit, das ein abgeschwächtes Virus der Marekschen Krankheit und ein Fremdgen umfaßt, das von Natur aus nicht in dem abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit enthalten ist. Das erfindungsgemäße rekombinante Virus kann in vorteilhafter Weise als aktiver Bestandteil für einen multifunktionellen Lebendimpfstoff verwendet werden, und zwar für einen Lebendimpfstoff, der nicht nur die antigene und immunogene Beschaffenheit des Virus der Marekschen Krankheit aufweist, sondern auch die Eigenschaften, die dem Fremdgen zugeschrieben werden. Da ferner die geeigneten Wirtszellen für das erfindungsgemäße rekombinante Virus Vogelzellen sind, die in großen Mengen verfügbar und nicht teuer sind, kann das erfindungsgemäße rekombinante Virus in wirksamer Weise in einem großtechnischen Maßstab bei geringen Kosten hergestellt werden.

Erläuterungen zum Stand der Technik

Die Mareksche Krankheit ist eine virale lymphoproliferative Krankheit, die hochgradig ansteckend ist und sich hauptsächlich unter Scharen von jungen Hühnern ausbreitet. Die Krankheit wurde als eine Art lymphoider Leukämie erkannt, 1961 unterschied jedoch Biggs diese Krankheit von Leukämie bei Hühnern und bezeichnete sie als "Mareksche Krankheit", und zwar nach dem Namen des Entdeckers Marek, der als erster diese Krankheit beschrieben hat.
Das Virus der Marekschen Krankheit ist ein DNA-Virus mit einer Hülle und wird als Gallid-Herpesvirus 1 oder Gallid-Herpesvirus 2, die zur Unterfamilie Gammaherpesvirinae der Familie Herpesviridae gehören, klassifiziert (Intervirology, Bd. 17 (1982), S. 47-51; S. Kerger). Der Durchmesser eines reifen Viruspartikels dieses Virus unter Einschluß einer Hülle beträgt etwa 150 bis 180 nm. Das Virus besteht aus einer Hülle und einem Nucleocapsid, das darin enthalten ist. Das Nucleocapsid weist die Form eines regulären Icosaeders mit einem Durchmesser von etwa 100 nm auf. Im Zentrum des Nucleocapsids liegt ein Nucleoid mit einer toroidalen Struktur mit einem Durchmesser von etwa 50 bis 60 nm vor, das eine gerade doppelsträngige DNA mit einem Molekulargewicht von etwa 1,0 x 10&sup8; enthält. Das Virus befällt 12 bis 20 Wochen alte Küken und ruft Parese und spastische oder atonische Paralyse aufgrund von Läsionen der Nerven hervor. Außerdem ruft es Tumoren hervor. Das Virus der Marekschen Krankheit verbreitet sich rasch, und die Sterblichkeit bei dieser Krankheit ist überaus hoch. Dabei sind die wirtschaftlichen Schäden, die durch diese Krankheit hervorgerufen werden, sehr groß. Um diese Krankheit zu verhindern, wird ein Lebendimpfstoff mit dem Virus der Marekschen Krankheit auf dem Gebiet der Geflügelzucht seit etwa 10 Jahren allgemein verwendet. Das Virus der Marekschen Krankheit wird in die folgenden drei Serotypen entsprechend der Ergebnisse eines Fluoroimmunoassays, einer Agargel-Immundiffusion und eines Virusneutralisationstests klassifiziert (Advances in Virus Research, Bd. 30 (1985), S. 225-277; Academic Press, INC.; und The Herpesvirus, Bd. 1 (1982), B. Roizman (Herausgeber), S. 333-431; Plenum Press).
Typ I: Ein virulenter Stamm des Virus der Marekschen Krankheit (nachstehend als "MDV" bezeichnet), der pathogen und tumorogen bei Hühnern ist und verschiedene Symptome bei Hühnern hervorruft, und ein abgeschwächter Stamm des vorstehend genannten virulenten MDV, der nicht pathogen ist und durch künstliche Mutation des vorstehend genannten virulenten Stamms, der in Zellkultur in vitro gezüchtet wird, erhalten wird;
Typ II: ein wilder abgeschwächter Stamm des Virus der Marekschen Krankheit; und
Typ III: ein Herpesvirus des Truthahn (nachstehend als "HVT" bezeichnet), das bei Hühnern nicht pathogen ist.
Der Ausdruck "abgeschwächtes Virus der Marekschen Krankheit" bedeutet in der vorliegenden Anmeldung einen beliebigen abgeschwächten MDV- Stamm vom Typ I, einen wilden abgeschwächten MDV-Stamm vom Typ II und das HVT vom Typ III.
Seit etwa 1979 ist bereits über verschiedene Virusvektoren berichtet worden. Zum Beispiel kann auf Nature (London), Bd. 277 (1979), S. 108-114; ebenda, Bd. 278, (1979), S. 35-40 Bezug genommen werden, wobei in diesen Artikeln über die Herstellung von Kaninchen-β-Globin unter Verwendung eines SV40-Vektors berichtet wird. 1980 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) auf der allgemeinen Konferenz den Erfolg bei der Ausrottung der Pocken in der Welt erklärt und die Abschaffung der Impfung beraten, und zwar aufgrund der Gefahr, daß einige Personen, die die Impfung erhielten, aufgrund ihrer Nebenwirkungen starben. Seitdem sind im Hinblick auf den möglichen Nutzen des Vacciniavirus auf anderen Gebieten zahlreiche Studien durchgeführt worden. Zum Beispiel ist die Verwendung des Vacciniavirus als Clonierungsvektor und als Expressionsvektor untersucht worden, und es ist darüber berichtet worden [Proceedings of The National Academy of Sciences, USA, Bd. 79 (1982), S. 4927-4931; und ebenda, Bd. 79 (1982), S. 7415-7419]. Seitdem hat die spezielle Beratergruppe der WHO ein Projekt zur Förderung der Erforschung eines rekombinanten Impfstoffs unter Verwendung eines Virusvektors, der von einem Vacciniavirus abstammt, vorgeschlagen [Nature (London), Bd. 312 (1984), S. 299]. Seit der vorstehend genannten Erklärung und dem Vorschlag der WHO sind allgemein grundlegende Studien und Entwicklungen verschiedener Virusvektoren unternommen worden [Virus, Bd. 36 (1986), S. 1-41; und ebenda, Bd. 37 (1987), S. 1-40]. Es ist z.B. bereits berichtet worden, daß ein Papillomavirus, Polyomavirus, ein Adenovirus, ein Vacciniavirus, ein Retrovirus, ein Baculovirus, ein Parvovirus, ein Blumenkohlmosaikvirus und ein Tabakmosaikvirus als Clonierungsvektor oder als Expressionsvektor für ein Fremdgen verwendet werden können. Im Hinblick auf die Herstellung nützlicher Substanzen durch Verwendung eines Virusvektors, wie er vorstehend erwähnt wurde, kann z.B. auf die folgenden Druckschriften bezug genommen werden:
Verwendung eines abgeschwächten Vacciniavirus-Vektors:
EP-A-83286 (Herstellung von verschiedenen Antigenen), PCT-Anmeldung W084/02077 (Herstellung von verschiedenen Antigenen), JP-A-61-289888 (Herstellung eines Antigens eines Malariaparasiten), JP-A-62-44178 (Herstellung eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens), JP-A-62-151186 (Herstellung eines Katzen-Leukämievirus-Antigens), JP-A-62-294698 (Herstellung eines Melanom-Antigens), japanische Übersetzung Nr. 63-500003 einer PCT-Anmeldung (Herstellung von gamma-Interferon) und japanische Übersetzung Nr. 63-500005 einer PCT-Anmeldung (Herstellung von humanem Interleukin 2);
Verwendung eines nicht-pathogenen Adenovirus-Vektors: PCT-Anmeldung W083/02393 (Herstellung eines Polyomavirus-Antigens) und JP-A-63-12296 (Herstellung eines Proteins, wie C-Peptid);
Verwendung eines Rinder-Rotavirus-Vektors: PCT-Anmeldung W085/00184 (Herstellung eines humanen Rotavirus-Antigens);
Verwendung eines virulenten Herpes simplex-Virus Typ 1 als Vektor: JP-A-61-1390 (Herstellung eines Hepatitis B-Virus-oberflächenantigens und JP-A-62-257385 (Herstellung eines abgeschwächten rekombinanten Virus, das virulente Herpes simplex-Viren Typ 1 und 2 umfaßt);
Verwendung eines Vektors mit einer langen endständigen Wiederholung (LTR), der von einem Retrovirus abgeleitet ist: Japanische Übersetzung Nr. 61-502932 einer PCT-Anmeldung (Verstärkung der Bildung eines Tumorspezifischen Antigens);
Verwendung eines abgeschwächten Varicellavirus-Vektors; JP-A-63- 12277 (Herstellung eines Epstein-Barr-Virus-Antigens); und
Verwendung eines Tabakmosaikvirus-Vektors: JP-A-63-14693 (Transformation einer höheren Pflanzenzelle).
Die vorstehend genannten Techniken befinden sich jedoch immer noch im Versuchsstadium im Hinblick auf die Herstellung von biologischen Zubereitungen unter Einschluß von Impfstoffen, da diese herkömmlichen Techniken nicht nur keine zufriedenstellenden Ausbeuten und Reinheiten der gewünschten Produkte ergeben, sondern auch die Sicherheit und die Wirkungen der Produkte auf den Menschen, Zuchtgeflügel, domestizierte Tiere und Haustiere nicht völlig geklärt sind. Daher ist bisher keine biologische Zubereitung, die unter Verwendung eines herkömmlichen Virusvektors hergestellt wurde, offiziell zugelassen und praktisch in Gebrauch genommen worden. Zum Beispiel kann ein Vacciniavirus-Vektor für die Herstellung verschiedener nützlicher Substanzen verwendet werden, wie es vorstehend erwähnt wurde. Der Vacciniavirus-Vektor weist jedoch den Nachteil auf, daß der Vektor von Natur aus neuropathogen ist und daher die Gefahr besteht, daß er ernsthafte Nebenwirkungen hervorruft; z.B. besteht die Gefahr der Induktion einer Encephalitis nach einer Impfung. Dementsprechend sind die Sicherheit des Vacciniavirus-Vektors und der Produkte, die mittels des Vektors erhalten wurden, unklar. Ferner ist darauf hinzuweisen, daß, da nicht wenige Menschen und Tiere bereits eine Immunität gegen das Vacciniavirus erworben haben und Antikörper gegen das Virus aufweisen, bei Verabreichung des rekombinanten Vacciniavirus, das ein Fremdgen enthält, als ein Lebendimpfstoff an einen solchen Menschen oder ein solches Tier die Vervielfältigung des rekombinanten Vacciniavirus, d.h. die Vervielfältigung des Fremdgens, im menschlichen oder tierischen Körper, die erforderlich ist, um eine ausreichende Wirkung der Immunisierung zu erzielen, in unvorteilhafter Weise unterdrückt oder verhindert wird. Daher ist nicht immer zu erwarten, daß die gewünschte Wirkung eines rekombinanten Virus als multifunktioneller Lebendimpfstoff, der nicht nur die antigene und immunogene Beschaffenheit des Vacciniavirus, sondern auch die Eigenschaften, die dem Fremdgen zugeschrieben werden, aufweist, erzielt wird. Mit anderen Worten sind diejenigen, an die die Verabreichung des rekombinanten Vacciniavirus bewirkt wird, begrenzt, und daher kann ein derartiges rekombinantes Vacciniavirus, das das Fremdgen enthält, nicht immer als wirksamer Lebendimpfstoff verwendet werden.
Ferner ist versuchsweise auch die Herstellung verschiedener Substanzen mittels eines rekombinanten Virus durchgeführt worden, das, als einen Vektor, das Genom des Baculovirus umfaßte, z.B. von Autographa california-Kernpolyhedrosisvirus, das zur Infektion von Lepidopteraninsekten imstande ist [Bio/Technology, Bd. 8/6 (1988), S. 47-55]. Beispiele für Substanzen, die mit Hilfe des rekombinanten Baculovirus hergestellt wurden, umfassen etwa 35 Arten von Antigenen und Enzymen, z.B. humane Interferone α und β, humanes Interleukin 2, Parainfluenzavirus-Hämagglutinin-Neuraminidase, Influenzavirus-Hämagglutinin, verschiedene Antigene des AIDS-Virus, Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen, Escherichia coli-β- Galactosidase und dergl. Die Herstellung der vorstehend genannten Produkte unter Verwendung des Baculovirus muß jedoch in einer begrenzten Art von Kulturwirten, nämlich Insektenzellen, durchgeführt werden, und die Sicherheit und die Wirkungen der Produkte auf Menschen oder Tiere sind bis jetzt nicht völlig geklärt. Ferner ist die Eignung des Vektors zur Verwendung bei der Herstellung gewünschter Substanzen in einem großtechnischen Maßstab nicht berücksichtigt worden. Da darüber hinaus die Wirtszellen für den vorstehend genannten rekombinanten Baculovirus Insektenzellen sind, die nicht in großen Mengen verfügbar sind, und die teuer sind, können die gewünschten Substanzen mit Hilfe des rekombinanten Baculovirus nicht in einem großtechnischen Maßstab zu geringen Kosten hergestellt werden.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß ein rekombinantes Virus, das sicher in einem großen Maßstab hergestellt werden kann und das in vorteilhafter Weise als aktiver Bestandteil eines multifunktionellen Lebendimpf stoffs mit hoher Sicherheit verwendet werden kann, bisher nicht entwickelt worden ist, und es ist ernsthaft gewünscht, die vorstehend genannten Nachteile der herkömmlichen rekombinanten Virusvektoren zu überwinden.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben umfangreiche und gründliche Untersuchungen im Hinblick auf die Entwicklung eines rekombinanten Virus durchgeführt, das keinen der Nachteile der herkömmlichen rekombinanten Viren, wie sie vorstehend erwähnt wurden, aufweist. Als ein Ergebnis ist unerwarteterweise festgestellt worden, daß bei Verwendung der genomischen DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit als ein Virusvektor zur Herstellung eines rekombinanten Virus, das die genomische DNA und ein Fremdgen umfaßt, das erhaltene rekombinante Virus überaus stabil und frei von der Gefahr einer reversen Mutation zu einem virulenten Virus ist. Daher kann das erhaltene rekombinante Virus als ein sicherer und wirksamer Lebendimpfstoff verwendet werden, der nicht nur die antigene und immunogene Beschaffenheit des Virus der Marekschen Krankheit aufweist, sondern außerdem auch Eigenschaften, die von dem damit rekombinierten Fremdgen stammen. Ferner ist auch festgestellt worden, daß die Herstellung eines rekombinanten Virus ohne biologische Gefahr sicher durchgeführt werden kann. Wenn ein Gen, das für ein Antigen codiert, das von den Antigenen, die in dem abgeschwächten MDV vorhanden sind, verschieden ist, als ein Fremdgen verwendet wird, das mit der genomischen MDV-DNA rekombiniert wird, dann weist das erhaltene rekombinante Virus die Antigene sowohl des abgeschwächten MDV als auch des Fremdgens auf, und daher kann das rekombinante Virus als solches als ein multifunktioneller Lebendimpfstoff verwendet werden. Ein derartiger multifunktioneller Lebendimpfstoff kann durch eine einzige Vervielfältigung des vorstehend genannten rekombinanten Virus hergestellt werden. Die Herstellung des multifunktionellen Lebendimpfstoffs ist einfach und im Vergleich mit der Herstellung eines herkömmlichen multifunktionellen Impfstoffs weniger teuer, da es für die Herstellung herkömmlicher multifunktioneller Impfstoffe normalerweise erforderlich ist, Vervielfältigungen mehrerer Typen von Viren einzeln durchzuführen. Ferner können bei der Züchtung des rekombinanten Virus Tierzellen, insbesondere Vogelzellen, einer Primärkultur oder etwa der 2. bis 5. Subkultur als Wirt verwendet werden. Derartige Zellen können in großem Maßstab zu geringen Kosten erhalten werden. Daher kann das rekombinante Virus in einem großen Maßstab zu geringen Kosten hergestellt werden. Ferner ist die vorstehend genannte Wirtszelle frei von nicht-identifizierten karzinogenen Substanzen sowie anderen schädlichen Substanzen, wobei sich ein Unterschied zu einem Zellstamm oder einer etablierten Zellinie, die als Ergebnis einer Mutagenese erhalten wurden, zeigt. Daher besteht keine Gefahr, daß das erhaltene rekombinante Virus mit einer derartigen karzinogenen oder schädlichen Substanz kontaminiert ist.
Auf der Basis der vorstehend erwähnten Befunde ist die vorliegende Erfindung abgeschlossen worden, wobei sie auf die Bereitstellung eines neuen rekombinanten Virus, das sich als ein aktiver Bestandteil für einen multifunktionellen Lebendimpfstoff eignet; die Bereitstellung eines multifunktionellen Lebendimpfstoffs gegen die Mareksche Krankheit, der ein rekombinantes Virus der vorstehend genannten Art umfaßt; und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines multifunktionellen Lebendimpfstoffs gegen die Mareksche Krankheit, der ein rekombinantes Virus der vorstehend genannten Art umfaßt, gerichtet ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

In der Zeichnung:
zeigt Fig. 1 eine Restriktionskarte der genomischen DNA des Stamms HVT O1;
zeigt Fig. 2 ein Flußdiagramm, das die Konstruktion eines Expressionsvektors pSVB52-3 für die Expression des Glycoprotein A-Antigens (nachstehend als "gA-Antigen" bezeichnet) von HVT angibt;
zeigen Figuren 3(a) bis 3(k) die gesamten Nucleotidsequenzen der gA-Antigen-Gene des Stamms MDV C2 und des Stamms HVT O1 sowie die Aminosäureseguenzen, die von den Nucleotidsequenzen codiert werden;
zeigt Fig. 4 ein Flußdiagramm, das die Clonierung eines Gens, das für Hämagglutinin und Neuraminidase (nachstehend als "HN" bezeichnet) eines Virus der Newcastle-Krankheit (nachstehend als "NDV" bezeichnet) codiert, und die Konstruktion des Plasmids pHN-1, das das Gen enthält, angibt;
zeigen Figuren 5(a) bis 5(d) die gesamte Nucleotidsequenz des Strukturgens, das für HN von NDV codiert, sowie die Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz codiert wird;
zeigt Fig. 6 ein Flußdiagramm, das die Konstruktion des Plasmids pHVT-1, das das gA-Antigen-Gen von HVT und ein Fremdgen umfaßt, angibt, wobei das Plasmid zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Virus verwendet wird;
zeigt Fig. 7 ein Flußdiagramm, das die Konstruktion des Plasmids pFGH-H, das das gA-Antigen-Gen von HVT und ein Fremdgen umfaßt, angibt, wobei das Plasmid zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Virus verwendet wird, das zur Herstellung eines Fusionsproteins imstande ist;
zeigt Fig. 8 eine Restriktionskarte der genomischen DNA des Stamms MDV C2;
zeigt Fig. 9 ein Flußdiagramm, das die Konstruktion eines Expressionsvektors pSVB-12 zur Expression des gA-Antigen-Gens von MDV angibt;
zeigt Fig. 10 ein Flußdiagramm, das die Konstruktion des Plasmids pMDV-1, das das gA-Antigen-Gen von MDV und ein Fremdgen umfaßt, angibt, wobei das Plasmid zur Herstellung eines erf indungsgemäßen rekombinanten Virus verwendet wird;
zeigt Fig. 11 ein Flußdiagramm, daß die Konstruktion des Plasmids pFGH-M, das das gA-Antigen-Gen von MDV und ein Fremdgen umfaßt, angibt, wobei das Plasmid zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Vektors verwendet wird, der zur Herstellung eines Fusionsproteins imstande ist;
ist Fig. 12 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem LLC-MK2-Zellen, die mit dem Plasmid pSVB52-3 transformiert wurden und zur Herstellung des gA-Antigens von HVT imstande waren, einem Immunoassay gemäß der Avidin-Biotin-Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden;
ist Fig. 13 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem Wachtelembryofibroblasten (nachstehend als "QEF" bezeichnet), die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1R transfiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden, bei dem anti-HVT-gA-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 14 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1R infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden, bei dem anti-NDV-HN-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 15 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1F infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz- Technik unterworfen wurden, bei dem anti-HVT-gA-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 16 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1F infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz- Technik unterworfen wurden, bei dem anti-NDV-HN-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 17 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1FMH infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden, bei dem anti-HVT-gA-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 18 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1FMH inf iziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden, bei dem anti-NDV HN-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
ist Fig. 19 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem LLC-MK2-Zellen, die mit dem Plasmid pBEP-22 transformiert wurden und zur Bildung von gA-Antigen imstande waren, einem Immunoassay gemäß der Avidin-Biotin-Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden;
ist Fig. 20 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm MDV C2R infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz- Technik unterworfen wurden, bei dem anti-MDV-gA-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde;
zeigt Fig. 21 eine Photographie, die das Ergebnis zeigt, das erhalten wurde, indem QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm MDV C2R infiziert wurden, einem Immunoassay gemäß der indirekten Immunofluoreszenz-Technik unterworfen wurden, bei dem anti-NDV-NH-Hühnerantiserum als primärer Antikörper verwendet wurde.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein rekombinantes Virus der Marekschen Krankheit bereitgestellt, das die genomische DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit und mindestens ein Fremdgen, das aus einer anderen Quelle stammt, enthält, wobei das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts von einem Promotor eines Glycoprotein A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist und wobei das rekombinante Virus der Marekschen Krankheit bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaften zum natürlichen Virus der Marekschen Krankheit äquivalent ist.
Wie vorstehend erwähnt wurde, ist das erfindungsgemäß verwendete abgeschwächte Virus der Marekschen Krankheit (MDV) als ein abgeschwächtes MDV vom Typ I, ein wildes abgeschwächtes MDV vom Typ II und ein Herpesvirus des Truthahns (HVT) vom Typ III definiert. Es ist bevorzugt, daß ein Stamm, der üblicherweise für die Herstellung eines Lebendimpfstoffs gegen die Mareksche Krankheit eingesetzt wird, als abgeschwächtes MDV verwendet wird, da Sicherheit und Wirksamkeit für einen derartigen Stamm bestätigt wurden und die Verwendung eines derartigen Stamms von den Behörden verschiedener Länder zugelassen wurde. Beispiele für abgeschwächte MDVs umfassen MDV (Hühnervirus) C2-Stamm [Gan Monograph on Cancer Research, Bd. 10 (1971), S. 91-107], HVT (Truthahnvirus) O1-Stamm [The Journal of Japanese Society of Veterinary, Bd. 27 (1974), S. 20-24] und dergl. Die Verwendung der vorstehend genannten Stämme wurde vom Minister für Landwirtschaft, Forstwesen und Fischerei in Japan zugelassen, und diese Stämme sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel werden der Stamm MDV C2 und der Stamm HVT O1 von The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University, Japan, hergestellt und als abgeschwächte Lebendimpfstoffe gegen die Mareksche Krankheit unter den Warenbezeichnungen BIKEN "C2"-Stamm und BIKEN "O1"-Stamm vertrieben. Der Stamm MDV C2 und der Stamm HVT O1 sind auch bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vereinigtes Königreich, unter den Hinterlegungsnummern V89030814 und V89030815 hinterlegt. Das erfindungsgemäß verwendete abgeschwächte MDV ist selbstverständlich nicht auf die vorstehend genannten Stämme beschränkt, und es können beliebige abgeschwächte MDV-Stämme verwendet werden.
Der Ausdruck "genomische DNA" des abgeschwächten MDV bedeutet in der vorliegenden Anmeldung die gesamte DNA, die das abgeschwächte MDV enthält.
Als Fremdgen kann ein beliebiges Gen, das exogen in bezug auf die genomische DNA des abgeschwächten MDV ist, verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Gen verwendet werden, das für ein Polypeptid codiert, das aus der aus Antigenen, Enzymen, Peptidhormonen und Strukturproteinen, die von Viren, die vom abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit verschieden sind, Chlamydien, Rickettsien, Mycoplasmen, Bakterien, Protozoen, tierischen und pflanzlichen Zellen abgeleitet sind oder hergestellt werden, bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Repräsentative Beispiele für Fremdgene umfassen Gene, die für ein schützendes Antigen, Hämagglutinin, Neuraminidase und dergl. codieren und vom Virus der Ibaraki-Krankheit, dem Virus der viralen Diarrhoe-Schleim-Rinderkrankheit, dem Virus der infektiösen Rinderrhinotrachitis, dem Virus der kurzzeitigen Rinderfieberkrankheit, dem Rinderpestvirus, dem Adenovirus Typ 7, dem Rotavirus, dem Pferdeinfluenzavirus, dem Virus der Maul- und Klauenseuche, dem Schweinecholeravirus, dem Schweineparovirus, dem Geflügelpockenvirus, dem Taubenpockenvirus, dem Virus der Newcastle-Krankheit, dem Virus der infektiösen Laryngotracheitis, dem Vogelencephalomyelitisvirus, dem Virus der infektiösen Vogelbronchitis, dem infektiösen Hundeadenovirus, dem Staupevirus, dem Katzenpanleukopenievirus, dem Katzenleukämievirus, dem Nerzenteritisvirus, dem Tollwutvirus, dem Pseudotollwutvirus, dem Virus der infektiösen bursalen Krankheit, dem Influenzavirus, dem Parainfluenzavirus, dem Poliomyelitisvirus, dem Virus der japanischen Encephalitits, dem Virus des Fiebers mit Blutungen und renalem Syndrom, dem Gelbfiebervirus, dem Cytomegalovirus, dem Hühnerpockenvirus, dem Mumpsvirus, dem Masernvirus, dem Rötelnvirus, dem Hepatitis B-Virus, dem Erwachsenen-T-Zell-Leukämievirus, dem AIDS-Virus und dergl. abgeleitet sind; Gene, die für ein Toxin, ein Strukturprotein, ein Enzym, ein schützendes Antigen, ein Hämagglutinin, eine physiologisch aktive Substanz und dergl. codieren, die von einem pathogenen Bakterium, wie Bordetella bronichseptica, Haemophilus paragallinarum A, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagica und weiteren pathogenen Bakterien, die Erkrankungen, wie Schwarzbein ("blackleg"), Karfunkel, Schweinewundrose, Botulinum C, Cholera, Diphtherie, Tetanus, Tuberkulose, Gasbrand, Pneumonie, Paratyphus, Unterleibstyphus, Typhus und Meningitis, hervorrufen, abgeleitet sind. Das Fremdgen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist jedoch nicht auf die vorstehend genannten Fremdgene beschränkt.
Erfindungsgemäß kann mindestens ein Fremdgen in die genomische DNA des abgeschwächten MDV inseriert werden. Das Fremdgen wird in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts von einem Promotor der genomischen DNA des abgeschwächten MDV inseriert. In der genomischen DNA des abgeschwächten MDV gibt es verschiedene Typen von Promotoren, die einzeln unterschiedliche Typen von Genen der genomischen DNA kontrollieren. Im Hinblick auf die Gene der genomischen DNA des abgeschwächten MDV sind bereits 40 bis 50 Typen von Genen durch Immunpräzipitation unter Anwendung der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese identifiziert worden. Es ist bekannt, daß diese Gene für unterschiedliche Typen von Proteinen mit Molekulargewichten von 19 000 bis 350 000 codieren. Die Region jedes der vorstehend genannten Gene befindet sich unter der Kontrolle eines Promotors. Um das Fremdgen zu exprimieren, kann daher jeder beliebige Abschnitt jedes der vorstehend genannten Strukturgene als ein Abschnitt genutzt werden, in den das Fremdgen inseriert wird. Vom Standpunkt einer großen Häufigkeit der Expression des Gens wird das Fremdgen in einer Position stromabwärts von einem Promotor des Gens, d.h. eines Glycoprotein A-Antigen-Gens (gA-Antigen-Gens), inseriert. Im Hinblick auf dieses Gen wird auf "Advances in Virus Research", Bd. 30, s. 225-277, Academic Press, Inc., 1985, Bezug genommen.
Das erfindungsgemäße rekombinante Virus kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) Ligation eines DNA-Fragments, das durch Schneiden genomischer DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde, an einen replizierbaren Vektor unter Bildung eines ersten Replikationsvektors;
b) Insertion mindestens einer Fremdgensequenz in das DNA-Fragment des ersten Replikationsvektors unter Bildung eines zweiten Replikationsvektors;
c) Cotransfektion einer Zelle mit dem zweiten Replikationsvektor und einem abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit;
d) Inkubation der cotransfizierten Zellen für eine ausreichende Zeitspanne zur homologen Rekombination zwischen dem DNA-Fragment des zweiten Replikationsvektors, der das DNA-Fragment des Genoms des Virus der Marekschen Krankheit zusammen mit dem Fremdgen enthält, und einem Abschnitt der genomischen DNA des abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit mit einer homologen oder ähnlichen Nucleotidsequenz in bezug auf das DNA-Fragment; und
e) Isolierung eines rekombinanten Virus aus der Zelle, das ein abgeschwächtes Virus der Marekschen Krankheit und ein darin inseriertes Fremdgen umfaßt.
In Stufe (a) wird ein DNA-Fragment, das aus einem abgeschwächten MDV stammt, an einen replizierbaren Vektor unter Bildung eines ersten Replikationsvektors ligiert. Das DNA-Fragment wird durch Schneiden genomischer DNA eines abgeschwächten MDV mit einem Restriktionsenzym wie folgt erhalten.
Zuerst wird die gesamte genomische DNA eines abgeschwächten MDV erhalten. Beispielsweise wird ein abgeschwächtes MDV in einer Wirtszellkultur, wie einer Vogelzellkultur, gemäß einem üblichen Verfahren gezüchtet, und virale Partikel werden aus der Wirtszellkultur isoliert. Zum Beispiel wird eine Impfkultur von abgeschwächtem MDV auf eine Zellkultur von Embryofibroblasten, die aus Hühnern oder Wachteln stammen, überimpft und gezüchtet, wobei man mit dem Virus infizierte Zellen erhält. Die mit dem Virus infizierten Zellen werden nacheinander einer Zell-Lyse; einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit, um Zellbruchstücke zu entfernen; einer Ultrazentrifugation, um Viruspartikel zu extrahieren; einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Viruspartikel zu isolieren und zu reinigen; und einer Trocknung unterworfen. Auf diese Weise erhält man trockene Viruspartikel. Die genomische DNA des Virus ist in den Viruspartikeln enthalten. Daher wird die genomische DNA aus den Viruspartikeln isoliert und gemäß einem üblichen Verfahren, das nachstehend genannt wird, gereinigt. In diesem Fall ist es, um eine irreversible Denaturierung von DNA zu vermeiden, bevorzugt, die Isolierung und Reinigung bei pH-Werten von 3 bis 10 durchzuführen. Bei der Ausführung von Isolierung und Reinigung der genomischen DNA können übliche Verfahren angewandt werden, z.B. ein Heißsalzverfahren unter Verwendung einer NaCl-Lösung bei 100ºC, ein Detergensverfahren unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (nachstehend als "SDS" bezeichnet), Natriumdesoxycholat (nachstehend als "SDC" bezeichnet) oder dergl., ein Phenolextraktionsverfahren, ein Guanidin-hydrochlorid-Verfahren unter Verwendung einer konzentrierten Guanidin-hydrochlorid-Lösung, ein Alkaliverfahren unter Verwendung einer NaOH- Lösung, eines Na&sub2;CO&sub3;-NaHCO&sub3;-Puffers oder dergl. bei einem pH-Wert von etwa 10 und ein Alkoholfällungsverfahren unter Verwendung von kaltem Ethanol. Alle diese Verfahren können allein oder in Kombination angewandt werden.
Als abgeschwächtes MDV kann jeder der vorstehend genannten Stämme verwendet werden.
Zweitens wird ein DNA-Fragment aus der genomischen DNA erhalten. Es kann ein beliebiges DNA-Fragment aus der genomischen DNA verwendet werden, solange das DNA-Fragment einen Abschnitt stromabwärts von einem Promotor der genomischen DNA enthält. Es ist stärker bevorzugt, daß das DNA- Fragment auch einen Promotor der genomischen DNA enthält. Um den gewünschten Abschnitt, der in dem DNA-Fragment enthalten sein soll, zu bestimmen, wird eine Restriktionskarte der genomischen DNA wie folgt aufgestellt. Zuerst wird eine Genbibliothek der genomischen DNA eines abgeschwächten MDV gemäß einem üblichen Verfahren unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme und eines bekannten Wirts-Vektor-Systems, wie es z.B. im ATCC-Katalog von Bakterien-Phagen-rDNA-Vektoren, 16. Auflage, S. 240-255, veröffentlicht von American Type Culture Collection, 1985 beschrieben ist, hergestellt. Repräsentative Beispiele für Vektoren umfassen die Plasmide pGS3, pMV, pPB101 und dergl. Repräsentative Beispiele für Wirte umfassen Vogelzellen und Säugerzellen. Beispielsweise wird die genomische DNA eines abgeschwächten MDV mit einem Restriktionsenzym verdaut, um virale DNA-Fragmente zu erhalten. Unter Verwendung einer DNA- Ligase werden die DNA-Fragmente einzeln in mit einem Restriktionsenzym geschnittene Plasmide in ihren entsprechenden Abschnitten unter Bildung rekombinanter Plasmide inseriert. Die rekombinanten Plasmide werden einzeln in Wirtszellen unter Bildung von Transformanten übertragen. Indem man die erhaltenen Transformanten einzeln kultiviert, wird jedes der vorstehend genannten DNA-Fragmente cloniert, wobei man eine MDV-Genbibliothek erhält. Aus jedem der Transformanten der Genbibliothek wird ein rekombinantes Plasmid nach einem üblichen Verfahren isoliert und mit einem Restriktionsenzym behandelt, um das rekombinante Plasmid in das Plasmid und das virale DNA-Fragment zu trennen. Das virale DNA-Fragment wird gewonnen und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um das Molekulargewicht jedes einzelnen DNA-Fragments zu bestimmen. Auf der Basis des Molekulargewichts der einzelnen DNA-Fragmente werden die Transformanten der Genbibliothek in Gruppen klassifiziert. Aus jeder der Gruppen wird ein repräsentativer Transformantenclon ausgewählt, und aus jedem der ausgewählten Clone wird ein rekombinantes Plasmid isoliert. Das rekombinante Plasmid wird dann mit einem Restriktionsenzym verdaut, und das erhaltene verdaute Material wird einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterworfen, um das virale DNA-Fragment zu isolieren. Das virale DNA-Fragment wird z.B. durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt. Das gereinigte DNA-Fragment wird mit einem Radioisotop durch Nick-Translation markiert. Unter Verwendung des markierten DNA-Fragments als Sonde werden die Transformantenclone der Genbibliothek einer Koloniehybridisierung unterworfen, und positive Clone werden ausgewählt und isoliert. Aus jeder der isolierten Kolonien werden Plasmide einzeln isoliert. Jedes Plasmid wird mit einer Reihe von Restriktionsenzymen behandelt und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Unter Verwendung des erhaltenen Agarosegels und der vorstehend erhaltenen Sonde wird eine Southern-Hybridisierung durchgeführt. Auf der Basis der Ergebnisse der Hybridisierung und der Art der eingesetzten Restriktionsenzyme wird eine Restriktionskarte der genomischen DNA des abgeschwächten MDV aufgestellt. Anschließend wird die Nucleotidsequenz der genomischen DNA nach einem üblichen Verfahren, z.B. dem Maxam-Gilbert-Verfahren oder dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren [Proceedings of the National Academy of Science, USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467; und Analytical Biochemistry, Bd. 152 (1986), S. 232-238] bestimmt. Auf der Basis der Restriktionskarte und der Nucleotidsequenz der genomischen DNA des abgeschwächten MDV wird ein Abschnitt, der aus der genomischen DNA ausgeschnitten und als DNA- Fragment, das an einen replizierbaren Vektor ligiert werden soll, bestimmt. Im Hinblick auf eine sichere Expression eines Fremdgens ist es, wenn das Fremdgen in die genomische DNA eines abgeschwächten MDV inseriert wird, bevorzugt, daß das DNA-Fragment einen Promotor der genomischen DNA des abgeschwächten MDV enthält. Stärker bevorzugt ist die Verwendung eines Promotors mit einer hervorragenden Stärke für die Genexpression, z.B. eines Promotors eines gA-Antigen-Gens, eines Promotors eines gB-Antigen-Gens, eines Antigen C-Gens, eines Gens, das für ein DNA- bindendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 135 000 codiert, Gene, die für hauptsächliche virusspezifische Proteine mit Molekulargewichten von etwa 86 000 bzw. etwa 92 000 codieren, und Gene, die für phosphorylierte Proteine mit Molekulargewichten von etwa 36 000, etwa 39 000 bzw. etwa 44 000 codieren. Das Ausschneiden eines DNA-Fragments, das einen gewünschten Abschnitt aus der genomischen DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit enthält, kann nach einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms erfolgen. Alternativ kann ein DNA-Fragment, das den gewünschten Abschnitt enthält, auch wie folgt aus der vorstehend genannten Genbibliothek erhalten werden. Ein Transformant, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das ein gewünschtes DNA-Fragment umfaßt, wird aus der Genbibliothek ausgewählt und kultiviert. Aus dem kultivierten Transformanten wird das rekombinante Plasmid extrahiert und mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Das erhaltene verdaute Material wird einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt in der gleichen Weise, wie es vorstehend angegeben wurde, unterworfen, um das gewünschte DNA-Fragment zu gewinnen.
Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wird an einen beliebigen handelsüblichen replizierbaren Vektor nach einem üblichen Verfahren unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert, wobei man einen ersten Replikationsvektor erhält. Im Hinblick auf den replizierbaren Vektor ist es erforderlich, einen replizierbaren Vektor zu verwenden, der imstande ist, in eine Wirtszelle für ein abgeschwächtes Virus der Marekschen Krankheit, wie eine Vogelzelle, transfiziert zu werden. Beispiele für replizierbare Vektoren sind im ATCC-Katalog für Bakterien-Phagen-rDNA-Vektoren, 16. Auflage, S. 240-255, veröffentlicht von American Type Culture Collection (1985) aufgelistet. Als replizierbare Vektoren können die gleichen Vektoren, die im Zusammenhang mit der Herstellung der Genbibliothek der genomischen DNA eines abgeschwächten MDV genannt wurden, wie die Plasmide pGS3, pMV und pPB101, verwendet werden.
Der auf diese Weise erhaltene erste Replikationsvektor wird in eine Wirtszelle unter Bildung eines Transformanten eingeführt. Der Transformant wird kultiviert, um den Replikationsvektor zu vervielfachen. Aus dem kultivierten Transformanten wird der Replikationsvektor in der gleichen Weise, wie es vorstehend angegeben wurde, extrahiert. Anschließend wird der extrahierte Replikationsvektor gemeinsam mit einem anorganischen Salz, wie Calciumphosphat, gefällt, Mit dem erhaltenen gefällten Material wird eine Zelle eines höheren Tiers, wie eine Säugerzelle oder eine Vogelzelle, transfiziert. Die erhaltene Zelle wird kultiviert und untersucht, z.B. nach einem immunocytochemischen Verfahren, wie einem Immunofluoreszenz-Verfahren, und zwar unter Verwendung eines handelsüblichen fluoreszierenden Antikörpers als sekundärem Antikörper, oder durch Koloniehybridisierung, so daß bestätigt wird, daß der erste Replikationsvektor ein gewünschtes DNA-Fragment enthält.
In Stufe (b) wird mindestens eine Fremdgensequenz, die aus einer anderen Quelle abgeleitet ist, in das DNA-Fragment des vorstehend erhaltenen ersten Replikationsvektors unter Bildung eines zweiten Replikationsvektors inseriert. Als Fremdgen kann ein beliebiges der Fremdgene, die vorstehend genannt wurden, verwendet werden. Zur Expression des Fremdgens ist es erforderlich, das Fremdgen in das DNA-Fragment in einem solchen Abschnitt zu inserieren, daß nach homologer Rekombination zwischen dem DNA-Fragment, das das Fremdgen enthält, und einem Abschnitt der genomischen DNA des abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit, was nachstehend erläutert wird, das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts von mindesten seinem Promotor der genomischen DNA inseriert ist, wobei der Promotor in einer Wirtszelle zur Expression des Fremdgens seine Funktion erfüllt.
Das Fremdgen, das in den ersten Replikationsvektor inseriert wird, kann aus einem Genom, das exogen in bezug auf das abgeschwächte MDV ist, in im wesentlichen der gleichen Weise wie im Fall der Herstellung des DNA-Fragments der genomischen DNA des abgeschwächten MDV, die vorstehend erläutert wurde, hergestellt werden. Wenn das exogene Genom aus RNA besteht, dann ist es erforderlich, eine DNA, die komplementär zu dem Genom ist, nach einem üblichen Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen reversen Transkriptase herzustellen. Für die korrekte Insertion des Fremdgens in den ersten Replikationsvektor ist es bevorzugt, eine Restriktionskarte des Fremdgens aufzustellen und die Nucleotidsequenz des Fremdgens zu bestimmen. Das Aufstellen der Restriktionskarte und die Bestimmung der Nucleotidsequenz können in der gleichen Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, durchgeführt werden.
Die Insertion des Fremdgens in den ersten Replikationsvektor kann nach einem üblichen Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise wird der erste Replikationsvektor mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten, und das Fremdgen wird an die geschnittene Stelle des ersten Replikationsvektors mittels einer DNA-Ligase unter Bildung eines zweiten Replikationsvektors ligiert. Mit dem erhaltenen Vektor wird eine Wirtszelle transformiert. Der erhaltene Transformant wird kultiviert, um den zweiten Replikationsvektor zu vervielfältigen. Wenn z.B. der erste Replikationsvektor ein DNA-Fragment enthält, das ein Strukturgen des abgeschwächten MDV und dessen Promotor umfaßt, dann kann das Fremdgen in das DNA-Fragment in einem Abschnitt stromabwärts vom Promotor und stromaufwärts vom Initiationscodons des Strukturgens inseriert werden, so daß das Polypeptid, das von dem Fremdgen codiert wird, durch Genexpression getrennt von dem Protein, das von dem Strukturgen codiert wird, hergestellt werden kann. Alternativ dazu kann das Fremdgen auch in das DNA-Fragment in einem Abschnitt innerhalb des Strukturgens inseriert werden, so daß ein Fusionsprotein des Polypeptids, das von dem Fremdgen codiert wird, und des Proteins, das von dem Strukturgen codiert wird, hergestellt wird.
In Stufe (c) wird eine Zelle mit dem zweiten Replikationsvektor, der vorstehend erhalten wurde, und mit einem abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit (MDV) cotransfiziert.
Als abgeschwächtes MDV, das für die Cotransfektion verwendet wird, kann der gleiche Stamm wie der, der verwendet wurde, um das DNA-Fragment des ersten Replikationsvektors zu erhalten, verwendet werden. Alternativ kann auch ein Stamm verwendet werden, der sich von dem Stamm, der verwendet wird, um das DNA-Fragment zu erhalten, unterscheidet.
Als Zelle, die mit dem zweiten Replikationsvektor und dem abgeschwächten MDV cotransfiziert wird, kann eine beliebige Zelle verwendet werden, solange ein abgeschwächtes MDV in der Zelle proliferiert werden kann. Da jedoch das MDV eine stark infektiöse Beschaffenheit im Hinblick auf Vogelzellen aufweist, wird es bevorzugt, als Wirtszelle eine Zelle zu verwenden, die von einem gesunden Vogel oder einem von spezifischen Pathogenen freien Vogel (SPF-Vogel) stammt, zu verwenden. Zum Beispiel wird die Verwendung einer primären Zellkultur oder der zweiten bis etwa fünften Subkultur, die durch serielle Passage davon erhalten wurde, eines Embryofibroblasten oder einer Embryonierenzelle, die von einem SPF-Huhn stammen, eines Embryofibroblasten von einem Truthahn, eines Embryofibroblasten von einer Wachtel oder dergl. bevorzugt.
Die Cotransfektion kann gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel werden ein abgeschwächtes MDV und das Copräzipitat des zweiten Replikationsvektors mit einem anorganischen Salz, das auf eine Weise, wie sie vorstehend in Stufe (b) beschrieben wurde, erhalten wurde, nacheinander auf eine Kultur einer Wirtszelle überimpft, um die Zelle mit dem abgeschwächten MDV und dem zweiten Replikationsvektor zu cotransfizieren.
In Stufe (d) wird die cotransfizierte Zelle für eine ausreichende Zeitspanne, damit eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment des zweiten Replikationsvektors, der das DNA-Fragment des Genoms des Virus der Marekschen Krankheit zusammen mit dem Fremdgen enthält, und einem Abschnitt der genomischen DNA des abgeschwächten MDV, der eine homologe oder ähnliche Nucleotidsequenz wie das DNA-Fragment aufweist, auftritt.
Die Inkubation der cotransfizierten Zelle kann im allgemeinen in einem handelsüblichen Kulturmedium, das in einem Behälter für eine Zellkultur enthalten ist, bei etwa 30 bis etwa 39ºC für etwa 15 bis etwa 30 Stunden durchgeführt werden.
In Stufe (e) wird ein rekombinantes Virus, das ein abgeschwächtes MDV und ein darin inseriertes Fremdgen umfaßt, aus der kultivierten Zelle wie folgt isoliert.
Nach der Inkubation der cotransfizierten Zellen in Stufe (d) wird das Kulturmedium verworfen. Die Zellen haften an der inneren Oberfläche des Behälters. Anschließend werden die Zellen mit frischem Kulturmedium, das Agarose enthält, überschichtet, gefolgt von einer Inkubation bei etwa 30 bis etwa 39ºC für etwa 1 bis 3 Tage, wobei sich Plaques bilden. Die einzelnen Plaques werden zusammen mit einem Bereich des Agarosegels z.B. unter Verwendung eines Korkbohrers gewonnen und auf einen handelsüblichen Membranfilter durch ein Verfahren ähnlich wie Stempeln übertragen. Der Filter wird einer Denaturierung, einer Neutralisation und dergl. unterworfen, um die einzelnen überstempelten Plaques auf dem Filter zu immobilisieren, und die immobilisierten Plaques werden einer Wärmebehandlung unterzogen. Der erhaltene Filter wird einer Plaquehybridisierung gemäß einem üblichen Verfahren unter Verwendung einer Replikakopie des Fremdgens, das durch Nick-Translation mit einem Radioisotop markiert ist, als Sonde, unterzogen. Ein überstempelter Plaque, der mit der Sonde hybridisiert, wird als positiv angesehen. Das rekombinante Virus wird aus dem Agarosegel, das einen Plaque enthält, der einem auf dem Filter überstempelten positiven Plaque entspricht, extrahiert.
Ob das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus zur Expression nicht nur der Antigen-Gene des Virus der Marekschen Krankheit, sondern auch des Fremdgens imstande ist, kann z.B. durch einen Festphasen-Enzym- Immunoassay (ELISA), eine Technik unter Verwendung fluoreszierender Antikörper und dergl. untersucht werden. Ob ferner das rekombinante Virus in wirksamer und sicherer Weise als Lebendimpfstoff verwendet werden kann, kann nach verschiedenen üblichen Verfahren z.B. durch Immunoassay, ein virologisches Untersuchungsverfahren, ein genetisches Untersuchungsverfahren, ein histopathologisches Untersuchungsverfahren und dergl., untersucht werden. Derartige Untersuchungsverfahren werden z.B. in Standards for Veterinary Biologics (Bekanntmachung Nr. 599 des Ministers für Landwirtschaft, Forstwesen und Fischerei, Japan) beschrieben.
Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus kann im allgemeinen im großen Maßstab durch Transfektion in die vorstehend genannte Wirtszelle und Kultivieren der Wirtszelle bei etwa 33 bis etwa 39ºC in einem üblicherweise eingesetzten oder handelsüblichen Medium für die Zellkultur, wie M199-Medium (hergestellt und vertrieben von Difco Laboratories, USA), und Eagle-MEM (hergestellt und vertrieben von Nissui Pharmaceutical, Co., Ltd., Japan) vervielfältigt werden. Als Verfahren zum Züchten der Wirtszelle kann ein beliebiges Verfahren der statischen Kultur, der rotierenden Schüttelkultur, der Tankkultur und dergl. angewandt werden.
Das erfindungsgemäße rekombinante Virus kann als aktiver Bestandteil für einen multifunktionellen Lebendimpfstoff gegen die Mareksche Krankheit verwendet werden. Erfindungsgemäß wird also ein multifunktioneller Lebendimpfstoff gegen die Mareksche Krankheit bereitgestellt, der folgendes umfaßt:
eine immunogene Menge eines vermehrten rekombinanten Virus der MarekschenKrankheit, welches die genomische DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit und mindestens ein Fremdgen, das aus einer anderen Quelle stammt, enthält, wobei das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts eines Promotors eines Glycoprotein A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist, wobei das vervielfachte rekombinante Virus der Marekschen Krankheit bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaften zum Virus der Marekschen Krankheit gleichwertig ist und ein durch das Fremdgen codiertes Polypeptid enthält; und
mindestens ein(en) pharmazeutisch verträglichen/verträgliches Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten.
Der Ausdruck "multifunktionell" bedeutet hier "mit einer Funktion, die einem Polypeptid zugeschrieben wird, das von dem Fremdgen codiert wird, zusätzlich zu der antigenen und immunogenen Beschaffenheit des abgeschwächten MDV". Wenn z.B. das Fremdgen für ein Antigen eines Stammes des Virus der Marekschen Krankheit codiert, der sich von dem abgeschwächten MDV unterscheidet, in den das Fremdgen inseriert ist, dann wirkt der erfindungsgemäße multifunktionelle Lebendimpfstoff als mehrwertiger Impfstoff. Wenn das Fremdgen für ein Antigen eines Virus codiert, das zu einer Spezies gehört, die sich vom abgeschwächten MDV unterscheidet, dann wirkt der erfindungsgemäße multifunktionelle Lebendimpfstoff wie ein herkömmlicher Mischimpfstoff. Wenn ferner das Fremdgen für ein Strukturprotein mit einer Adjuvans-Wirkung für die immunogene Beschaffenheit eines Impf stoffs codiert, dann wirkt der erfindungsgemäße multifunktionelle Impfstoff als ein Adjuvans-Impfstoff. Der erfindungsgemäße multifunktionelle Impfstoff gegen die Mareksche Krankheit kann in einer Form bereitgestellt werden, die in einem Behälter, wie einem Fläschchen oder einer Ampulle, enthalten und dicht eingeschlossen ist. Als pharmazeutisch verträglicher Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipient können eine sterilisierte isotone Lösung, wie physiologische Kochsalzlösung, und ein Phosphatpuffer zu dem rekombinanten Virus gegeben werden. Der erhaltene Impfstoff hat die Form einer Suspension. In diesem Fall wird es bevorzugt, daß ein Pepton, eine Aminosäure, ein Saccharid oder dergl. als Stabilisator der Suspension einverleibt wird. Alternativ kann das in einem Behälter enthaltene rekombinante Virus auch in lyophilisierter Form vorliegen. Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen Lebendimpf stoff gegen die Mareksche Krankheit bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
(1) Züchten eines rekombinanten Virus der Marekschen Krankheit in einer Vogelzellenkultur,
wobei das rekombinante Virus der Marekschen Krankheit die genomische DNA eines abgeschwächten Virus der Marekschen Krankheit und mindestens ein Fremdgen, das aus einer anderen Quelle stammt, enthält, wobei das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts von einem Promotor eines Glycoprotein A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist, und wobei das rekombinante Virus der Marekschen Krankheit bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaften zum natürlichen Virus der Marekschen Krankheit gleichwertig ist, wobei das abgeschwächte Virus vervielfältigt und gleichzeitig das Fremdgen exprimiert wird;
(2) Isolieren des vermehrten rekombinanten Virus, das auch ein Polypeptid enthält, das durch Expression des Fremdgens synthetisiert wurde, aus der Vogelzellenkultur; und
(3) Zugabe mindestens eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, Verdünnungsmittels oder Exzipienten zu dem so erhaltenen Virus der Marekschen Krankheit.
Das Züchten des erfindungsgemäßen rekombinanten Virus der Marekschen Krankheit in einer Vogelzellenkultur kann auf die gleiche Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, erfolgen. Zu dem auf diese Weise isolierten rekombinanten Virus wird mindestens einer der vorstehend genannten pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten gegeben. Der auf diese Weise erhaltene Impfstoff liegt in Form einer Suspension vor. Gegebenenfalls kann die Suspension einer Lyophilisierung unterworfen werden, um einen lyophilisierten Impfstoff zu erhalten.
Im allgemeinen wird ein Impfstoff in Form einer Suspension verabreicht. Wenn also das erfindungsgemäße rekombinante Virus in lyophilisierter Form vorliegt, dann wird das erfindungsgemäße rekombinante Virus in der vorstehend genannten sterilisierten isotonen Lösung vor der Verabreichung suspendiert. Die Konzentration des vorliegenden rekombinanten Virus in dem Impfstoff für die Verabreichung kann im allgemeinen etwa 10 bis 10 000 Plaque-bildende Einheiten (PFU)/ml betragen. Im allgemeinen wird der Impfstoff subkutan oder intramuskulär verabreicht. Die Dosis des Impfstoffs pro Erwachsenem kann im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 5,0 ml liegen. Der Impfstoff wird im allgemeinen zweimal in einem Intervall von etwa 1 Woche bis 1 Monat und dann etwa 1 Jahr später erneut verabreicht.
Ferner kann das erfindungsgemäße rekombinante Virus als immunologisches Diagnostikum zum Nachweis einer Infektion mit dem Virus der Marekschen Krankheit und dem Virus, aus dem das inserierte Fremdgen stammt, verwendet werden. Zum Beispiel eignet sich das erfindungsgemäße rekombinante Virus für die Verwendung in einem ELISA, einem Hämagglutinierungstest, einem passiven Hämagglutinierungstest, einem Komplementfixierungstest und einer Reihe weiterer Tests, bei denen ein rekombinantes Virus, das mit einem fluoreszierenden Pigment, einem Enzym, einem Radioisotop oder dergl. markiert ist, verwendet wird.
Das erfindungsgemäße rekombinante Virus weist die folgenden Vorteile auf:
(1) Wenn ein Gen, das für ein Antigen codiert, als Fremdgen, das in die genomische DNA des abgeschwächten MDV inseriert wird, verwendet wird, wobei das Gen aus einem Virus stammt, der sich hinsichtlich Stamm oder Spezies von dem abgeschwächten MDV-Stamm, der als Virusvektor verwendet wird, unterscheidet, dann weist das erhaltene Virus nicht nur die antigene und immunogene Beschaffenheit des abgeschwächten MDV-Stamms auf, sondern auch des anderen Typs von Virusstamm oder -spezies. Daher kann das rekombinante Virus als solches in vorteilhafter Weise als ein aktiver Bestandteil für einen multifunktionellen Impfstoff verwendet werden.
(2) Als abgeschwächtes MDV, das als erfindungsgemäßer Virusvektor verwendet wird, wird ein nicht-pathogener abgeschwächter Stamm, der genetisch stabil ist, verwendet. Daher ist das erfindungsgemäße rekombinante Virus überaus stabil, und es besteht nicht die Gefahr einer reversen Mutation zu einem pathogenen oder virulenten Virus. Dementsprechend kann die Sicherheit des vorliegenden rekombinanten Virus als Lebendimpfstoff sichergestellt werden.
(3) Ein Fremdgen wird in die genomische DNA eines abgeschwächten MDV in einem korrekten Leseraster stromabwärts eines Promotors der genomischen DNA inseriert. Daher kann das Fremdgen in wirksamer Weise exprimiert werden, ohne die Expression der Gene des abgeschwächten MDV zu beeinträchtigen.
(4) Erfindungsgemäß wird kein exogener Promotor verwendet, sondern es wird ein Promotor eines abgeschwächten MDV verwendet. Daher ist der für die Expression des Fremdgens verwendete Promotor völlig verträglich mit einer Wirtszelle, die für die Vervielfältigung des rekombinanten Virus verwendet wird, oder mit einem Individuum, das mit dem vorliegenden rekombinanten Virus als Lebendimpfstoff geimpft wird. Da der am besten verträgliche Wirt für das erfindungsgemäße rekombinante Virus eine Vogelzelle oder ein Vogelkörper ist, wird die Verträglichkeit des rekombinanten Virus mit dem Wirt insbesondere dann am höchsten, wenn das Fremdgen von einem Virus, der infektiös gegenüber einer Vogelzelle ist, stammt, was es ermöglicht, daß die Gene des erfindungsgemäßen rekombinanten Virus in besonders wirksamer Weise exprimiert werden.
(5) Ferner wird als Promotor der genomischen DNA des abgeschwächten MDV, von dem aus stromabwärts ein Fremdgen inseriert wird, ein Promotor mit einer großen Stärke für die Expression eines Gens erfindungsgemäß verwendet. Daher erfolgt die Expression des Fremdgens, das in die genomische DNA eines abgeschwächten MDV inseriert ist, in wirksamer Weise, und dies gilt auch für die Expression der Gene des abgeschwächten MDV.
(6) Ferner handelt es sich bei der Wirtszelle, die für die Vervielfältigung des vorliegenden rekombinanten Virus geeignet ist, um eine primäre Kultur einer Vogelzelle oder eine Subkultur davon, die einfach zu geringen Kosten erhalten werden können. Daher kann das erfindungsgemäße rekombinante Virus in einem großen Maßstab zu geringen Kosten vervielfacht werden, was zu einem Anstieg bei der Produktivität des gewünschten funktionellen Lebendimpfstoffs führt.
(7) Ferner besteht bei einer derartigen Wirtszelle im wesentlichen keine Gefahr, daß die Zelle mit gefährlichen Substanzen, wie einer karzinogenen Substanz, kontaminiert ist. Daher kann erfindungsgemäß ein sicherer Lebendimpfstoff hergestellt werden.
(8) Ferner kann, wie vorstehend erwähnt wurde, das erfindungsgemäße rekombinante Virus als solches als ein aktiver Bestandteil für einen multifunktionellen Lebendimpfstoff verwendet werden. Dies bedeutet, daß ein mehrwertiger oder multifunktioneller Lebendimpfstoff nach einem Verfahren erhalten werden kann, bei dem nur das erfindungsgemäße rekombinante Virus gezüchtet wird, was einfach und leicht im Vergleich mit einem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung eines mehrwertigen oder multifunktionellen Lebendimpfstoff ist, bei dem eine Mehrzahl von Typen von Stämmen oder Spezies von Viren getrennt kultiviert und dann miteinander vermischt werden müssen.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher mit Bezug auf die folgenden Referenzbeispiele und Beispiele erläutert, die jedoch nicht dahingehend mißverstanden werden dürfen, daß sie den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung beschränken.

Referenzbeispiel 1

Herstellung einer Phosphatpufferlösung:

Eine Phosphatpufferlösung (nachstehend als "PBS" bezeichnet) wurde durch Mischen einer Basislösung I mit einem Gehalt an 8,0 g/l an NaCl, 0,2 g/l an KCl und 1/75 m Na&sub2;HPO&sub4; mit einer Basislösung II mit einem Gehalt an 8,0 g/l an NaCl, 0,2 g/l an KCl und 1/75 m KH&sub2;PO&sub4; in einem solchen Volumenverhältnis hergestellt, daß das erhaltene Gemisch einen vorher festgelegten pH-Wert, der in dem entsprechenden Beispiel angewandt werden sollte, aufwies.

Referenzbeispiel 2

Herstellung einer Trypsinlösung:

2,5 g Trypsin 1:250 (hergestellt und vertrieben von DIFCO Co., USA) wurden in 1/75 m PBS (pH-Wert: 7,2), hergestellt in der in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Weise, gelöst, so daß das Gesamtvolumen der erhaltenen Lösung 1 l betrug. Die erhaltene Lösung wurde durch Filtration mittels eines Membranfilters sterilisiert, wobei man eine Trypsinlösung erhielt.

Referenzbeispiel 3

Herstellung einer Tris-Pufferlösung:

121,14 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (nachstehend als "Tris" bezeichnet) wurden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurde tropfenweise konzentrierte HCl gegeben, so daß der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf einen vorbestimmten Wert, der in dem entsprechenden Beispiel verwendet werden sollte, eingestellt wurde. Anschließend wurde destilliertes Wasser zu der Lösung in einer solchen Menge gegeben, daß das Gesamtvolumen der erhaltenen Lösung 1 l betrug, wobei man eine 1 m Tris-Pufferlösung erhielt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, um die Konzentration an Tris entsprechend für die Verwendung in den Beispielen einzustellen. Die Tris-Pufferlösung wird nachstehend als "Tris-HCl" bezeichnet.

Referenzbeispiel 4

Züchten des Stamms HVT O1:

Der Stamm HVT O1 wurde gemäß einem üblichen Verfahren wie folgt gezüchtet. Wachtelembryofibroblasten (nachstehend als "QEF" bezeichnet), die aus 7 Wachteleiern entnommen wurden, die 9 Tage inkubiert worden waren, wurden mit der in Referenzbeispiel 2 hergestellten Trypsinlösung verdaut, wobei man eine Embryofibroblastensuspension erhielt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 1000 U/min für 5 Minuten unterworfen, um die QEF zu gewinnen. Die gewonnenen QEF wurden in einem Kulturmedium, d.h. Eagle-MEM (hergestellt und vertrieben von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) mit einem Gehalt an 5 % (Vol./Vol.) Kälberserum suspendiert, so daß das Endvolumen 500 ml und die endgültige Zellkonzentration 2 x 10&sup6; Zellen/ml betrug. Die auf diese Weise hergestellte QEF-Suspension wurde in 5 Roux-Flaschen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 1 l in einer Menge von 100 ml/Flasche gegossen. Anschließend wurde 1 ml einer mit dem Stamm HVT O1 infizierten Zellsuspension mit einem Virusinfektionsgrad von 1,0 x 10&sup6; PFU (Plaque-bildende Einheiten)/ml als Vorkulturvirus in jede der Flaschen überimpft. Die Flaschen wurden mit einem Gummistopfen verschlossen und in einem Inkubator bei 37ºC für 2 Tage inkubiert. Die Inkubation wurde beendet, nachdem mittels eines Mikroskops bestätigt worden war, daß der Grad des cytopathischen Effekts, d.h. das Verhältnis von Riesenzellen zu Zellen, die eine Monoschicht bildeten, in jeder Roux-Flasche 90 % erreichte. Dann wurde das Kulturmedium aus jeder der Roux-Flaschen entnommen, und 100 ml 1/75 m PBS (pH-Wert: 7,4) wurden in jede Flasche gegossen, und jede Flasche wurde vorsichtig geschüttelt, um die infizierten Zellen, die eine Monoschicht bildeten, die die Innenwand jeder Flasche bedeckte, zu waschen. Dieser Waschschritt wurde dreimal durchgeführt. Anschließend wurden 20 ml 1/75 m PBS (pH-Wert: 7,4) in jede Flasche gegossen, und dann wurde eine Pipettierung durchgeführt, wobei ein Ablösen der infizierten Zellen von der Innenwand jeder Flasche erreicht wurde und die Zellen in PBS suspendiert wurden. Die in den Flaschen erhaltenen infizierten Zellsuspensionen wurden vereinigt und einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 2000 U/min für 10 Minuten unterworfen. Der erhaltene Überstand wurde entfernt, und der Bodensatz wurde aufgefangen. Der auf diese Weise erhaltene Bodensatz (etwa 1 ml) wurde in einem Gefrierschrank bei -70ºC für die spätere Verwendung als Rohmaterial für die Herstellung genomischer HVT-DNA konserviert.

Referenzbeispiel 5

Züchten des Stamms MDV C2:

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Referenzbeispiel 4 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß der Stamm MDV C2 anstelle des Stamms HVT O1 verwendet wurde, wobei man einen Bodensatz von MDV-infizierten QEF-Zellen erhielt. Der auf diese Weise erhaltene Bodensatz von MDV-infizierten QEF-Zellen wurde in einem Gefrierschrank für die spätere Verwendung zur Herstellung von genomischer MDV-DNA konserviert.

Beispiel 1

Stufe 1

Herstellung von genomischer HVT-DNA

Zu den in Referenzbeispiel 4 erhaltenen HVT-QEF-Zellen wurden 20 ml TEN&sup5;&sup0;-Lösung (10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 1 millimolar Dinatriumethylendiamintetraacetat (nachstehend als "Na&sub2;EDTA" bezeichnet) und 50 millimolar NaCl) gegeben; anschließend wurde unter Verwendung eines Rührers für 5 Minuten gerührt. Dann wurden zu der auf diese Weise erhaltenen Suspension 20 ml einer 2 x Zell-Lyse-Lösung [100 millimolar Tris- HCl (pH-Wert: 7,4), 7,2 millimolar CaCl&sub2;, 250 millimolar KCl, 1 millimolar Na&sub2;EDTA, 1 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat und 1 % (Gew./Vol.) Nonidet P-40 (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, USA)], 500 ug DNase I (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) und 1 mg RNase A (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, USA) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um den Ablauf einer Reaktion zu ermöglichen. Anschließend wurden 20 ml Trichlorfluorethan zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und es wurde dann kräftig gerührt. Anschließend wurde das Gemisch einer Zentrifugation bei 4ºC und 1500 U/min für 10 Minuten unterworfen. Der erhaltene Überstand wurde aufgefangen und einem Dichtegradienten von 5 bis 40 % (Gew./Gew.) Glycerin überschichtet und einer Ultrazentrifugation bei 27 000 U/min bei 4ºC unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (Modell 55P; Rotor Nr. RPS-28, hergestellt und yertrieben von Hitachi, Ltd., Japan) unterworfen, um ein Nucleocapsid auszufällen. Der Überstand wurde sorgfältig mittels einer Pasteurpipette entfernt. Sodann wurden zu dem gefällten Nucleocapsid 200 ul einer 1 x Zell-Lyse-Lösung (50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 3,6 m CaCl&sub2;, 125 millimolar KCl, 0,5 millimolar Na&sub2;EDTA, 0,5 % Natriumdesoxycholat und 0,5 % (Gew./Vol.) Nonidet P-40) gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde 5 Minuten bei 0ºC mittels eines Rührers gerührt. Die erhaltene Suspension wurde in ein Eppendorf-Röhrchen (hergestellt und vertrieben von Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Deutschland) überführt, und in das Eppendorf-Röhrchen wurden ferner 200 ul einer Lösung mit 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, USA) und 600 ul einer 2 x STE-Lösung (100 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 20 millimolar Na2EDTA und 2 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 65ºC gehalten, um den Ablauf einer Reaktion zu ermöglichen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch einer Phenolextraktion mit einem gleichen Volumen an wassergesättigtem Phenol und dann zweimal mit einem gemischten organischen Lösungsmittel (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol = 25:24:1, Volumenverhältnisse) unterworfen. Die wäßrige Phase wurde aufgefangen, und das doppelte Volumen an kaltem Ethanol wurde zu der wäßrigen Phase gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei -20ºC über Nacht in Ruhe stehengelassen, um die DNA zu fällen. Das Gemisch wurde einer Zentrifugation unterworfen, um die DNA zu gewinnen, und die DNA wurde getrocknet. Die getrocknete DNA wurde in 500 ul TE-Lösung [10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0) und 1 millimolar Na&sub2;EDTA] suspendiert, wobei man eine Suspension von genomischer HVT-DNA erhielt.

Stufe 2

Clonierung von mit Restriktionsenzymen geschnittenen Fragmenten von genomischer HVT-DNA und Herstellung einer Genbibliothek:
In dieser Stufe wurde die in Stufe 1 erhaltene genomische HVT-DNA mit jeder von drei Typen von Restriktionsenzymen, d.h. BamHI, HindIII und PstI, verdaut, und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden unter Verwendung des Cosmids pHC79 (hergestellt und vertrieben von BRL Inc., USA) wie folgt cloniert.
1 ug der in Stufe 1 erhaltenen genomischen HVT-DNA wurde in 10 ul einer 1 x RM-Lösung [50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 10 millimolar MgCl&sub2;, 1 millimolar Dithiothreit (nachstehend als "DTT" bezeichnet) und 100 millimolar NaCl] mit einem Gehalt an 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (hergestellt und vertrieben von Nippon Gene Co., Japan) verdaut. Getrennt davon wurden 100 ug an pHC79 vollständig mit BamHI in 50 ul einer Lösung mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie unmittelbar vorstehend angegeben wurde, verdaut. Mit jedem der erhaltenen Reaktionsgemische wurden die Phenolextraktion und die Ethanolfällung in der gleichen Weise, wie sie vorstehend beschrieben wurden, durchgeführt, wobei man die Fragmente der genomischen HVT-DNA und das Cosmid-Fragment erhielt. Die auf diese Weise erhaltenen Fragmente der genomischen HVT-DNA und das Cosmid-Fragment wurden miteinander in solchen Anteilen vermischt, daß das Gewichtsverhältnis der genomischen HVT-DNA-Fragmente zum Cosmid- Fragment 10:1 betrug, und das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 20ºC in 10 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 60 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,6), 6,6 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT, 1 millimolar ATP und 100 Einheiten T4-DNA-Ligase (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gehalten, um die Fragmente der genomischen HVT-DNA einzeln mit dem Fragment des Cosmids pHC79 an dessen BamHI-Stelle zu ligieren, wobei man ein rekombinantes Plasmid erhielt.
Das vorstehend erhaltene rekombinante Plasmid wurde in eine Empfängerzelle des Stamms E. coli DH5 (hergestellt und vertrieben von BRL Inc., USA) wie folgt übertragen.
Der Stamm E. coli DH5 wurde in Schüttelkultur bei 30ºC über Nacht in 10 ml $-Medium (0,5 % (Gew./Vol.) Bactohefeextrakt, 2 % (Gew./Vol.) Bactotrypton und 0,5 % (Gew./Vol.) Magnesiumsulfat) gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml der erhaltenen Kultur entnommen, 100-fach mit $-Medium verdünnt und einer Schüttelkultur bei 30ºC unterworfen, bis die optische Dichte bei 550 nm (OD55o) der Kultur den Wert 0,48 erreichte. Sodann wurde die Kultur in Eiswasser für 10 Minuten gekühlt und anschließend einer Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten unterworfen, um die gezüchteten Zellen zu ernten. 10 ml einer Transformationslösung I (30 millimolar Kaliumacetat, 100 millimolar RbCl, 10 millimolar CaCl&sub2; und 15 % (Gew./Vol.) Glycerin) wurden zu den vorstehend erhaltenen Zellen gegeben, wobei man eine Zellsuspension erhielt. Die erhaltene Suspension wurde 10 Minuten in Eiswasser gekühlt und anschließend einer Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten unterworfen, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden in 1 ml einer Transformationslösung II [10 millimolar Piperidin-N,N'-bis-(2-ethansulfonsäure) (PIPES) (hergestellt und vertrieben von Dojindo Laboratories, Japan), 75 millimolar CaCl&sub2;, 10 millimolar RbCl und 15 % (Gew./Vol.) Glycerin] suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde in Eppendorf-Röhrchen in einer Menge von 200 ul pro Röhrchen übertragen und zur Konservierung bei -70ºC gehalten.
200 ul der vorstehend erhaltenen Suspension mit einem Gehalt an Empfängerzellen wurden aufgetaut und mit 1 ul des vorstehend erhaltenen rekombinanten Plasmids gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 0ºC in Ruhe stehengelassen. Anschließend erfolgte eine Hitzeschockbehandlung für 2 Minuten bei 42ºC. Sodann wurden 800 ul $-Medium zu dem Gemisch gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde 60 Minuten bei 30ºC in Ruhe stehengelassen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden auf eine L-Agarplatte (1 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, 0,5 % Gew./Vol.) Hefeextrakt, 1,5 % (Gew./Vol.) Agar und 25 ug/ml Ampicillin) überimpft und über Nacht bei 37ºC inkubiert, wobei man Kolonien der Transformanten erhielt. Anschließend wurde jede Kolonie der Transformanten sowohl auf eine L-Agarplatte mit einem Gehalt an Ampicillin bei einer Konzentration von 25 g/ml als auch auf eine L-Agarplatte mit einem Gehalt an Tetracyclin in einer Konzentration von 10 ug/ml übertragen, und die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Da die Transformanten, die die verdaute genomische HVT-DNA enthielten, resistent gegenüber Ampicillin, jedoch empfindlich gegenüber Tetracyclin waren, wurden die Kolonien von Transformanten, die resistent gegenüber Ampicillin, jedoch empfindlich gegenüber Tetracyclin waren, ausgewählt. Die auf diese Weise erhaltenen Kolonien werden als "BamHI-Bibliothek der genomischen HVT-DNA" bezeichnet.
Im wesentlichen das gleiche Verfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß jedes der Restriktionsenzyme HindIII und PstI einzeln anstelle von BamHI eingesetzt wurde und daß im Fall der Verwendung von PstI die Selektion der gewünschten Transformanten durchgeführt wurde, indem als Kriterium die Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und die Resistenz gegenüber Tetracyclin herangezogen wurde, wobei man die HindIII-Bibliothek bzw. die PstI-Bibliothek der genomischen HVT-DNA erhielt.

Stufe 3

Aufstellung einer Restriktionskarte der genomischen DNA von HVT:

Eine Restriktionskarte der genomischen DNA von HVT wurde unter Anwendung der Techniken der Koloniehybridisierung, wie sie in "Manual for Genetic Engineering", S. 51-54 (1982), veröffentlicht von Kodansha Scientific, beschrieben wird, und der Southern-Blot-Hybridisierung, wie sie in "Molecular Cloning", S. 382-389 (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben wird, aufgestellt. Beispielsweise wurden Plasmid-DNAs einzeln aus jedem der 1128 Clone der in Stufe 2 erhaltenen BamHI-Bibliothek durch ein Alkaliextraktionsverfahren, das in dem vorstehend genannten Buch "Molecular Cloning", S. 368-369 beschrieben ist, extrahiert. Jede der auf diese Weise extrahierten Plasmid-DNAs wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und einer Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, um die Beweglichkeit des verdauten Materials der Plasmid-DNA zu bestimmen. Aus der Beweglichkeit wurde das Molekulargewicht jedes der BamHI-Fragmente, die aus der genomischen HVT-DNA erhalten wurden, die mittels des Plasmids pHC79 cloniert wurden, berechnet. Ferner wurde die vorstehend erhaltene Plasmid-DNA mit jedem der Restriktionsenzyme HindIII und PstI verdaut, gefolgt von der gleichen Agarosegel-Elektrophorese, wie sie vorstehend erwähnt wurde, um das Schnittmuster des Plasmids im Hinblick auf jedes der Restriktionsenzyme zu erhalten. Auf der Basis der Ergebnisse wurden die Clone in der BamHI-Bibliothek in Gruppen klassifiziert, so daß jede Gruppe aus Clonen mit einem ähnlichen Schnittmuster bestand. Aus jeder der vorstehend klassifizierten Gruppen wurde ein typischer Clon ausgewählt. Dann wurde jeder der ausgewählten Clone getrennt mit BamHI verdaut und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterworfen, um nur clonierte DNA-Fragmente der genomischen HVT-DNA zu gewinnen. Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Phenolextraktion und Ethanolfällung im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 1 beschrieben wurde, gereinigt. Anschließend wurden die gereinigten DNA-Fragmente gemäß dem Nick-Translationsverfahren, wie es in dem vorstehend erwähnten Lehrbuch "Manual for Genetic Engineering", S. 83-86 beschrieben wurde, mit [³²P]-dCTP markiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen ³²P- markierten DNA-Fragmente als Sonde wurde eine Koloniehybridisierung für die HindIII-Bibliothek und die PstI-Bibliothek, die in Stufe 2 erhalten wurden, durchgeführt. Aus den positiven Kolonien, die mit der Sonde gemäß der Koloniehybridisierung hybridisierten, wurde eine Plasmid-DNA nach dem Alkaliextraktionsverfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, isoliert. Anschließend wurde die auf diese Weise extrahierte DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, wie es in Fig. 1 angegeben ist, und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Unter Verwendung des erhaltenen Gels wurde eine Southern-Hybridisierung durchgeführt. Auf der Basis der Ergebnisse der Southern-Hybridisierung wurde eine Restriktionskarte der genomischen DNA von HVT aufgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. ln Fig. 1 zeigt die obere Zeile als Diagramm die Struktur der genomischen DNA des Stamms HVT O1. Die in Fig. 1 verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung: TRL: lange endständige Wiederholung; TRS: kurze endständige Wiederholung; IRL: lange innere Wiederholung; IRS: kurze innere Wiederholung; und UL: lange einzigartige Region.

Stufe 4

Konstruktion eines Expressionsvektors für die Expression des HVT- gA-Antigens (erster Replikationsvektor):

Ein Plasmid, bei dem durch die Ergebnisse der Analyse in Stufe 3 bestätigt wurde, daß es zwei BamHI-Fragmente der genomischen HVT-DNA von 3,9 kb und 3,3 kb aufwies, wurde als "pB52" bezeichnet. Dieses Plasmid wurde teilweise mit BamHI verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, wobei ein BamHI-Fragment von 7,2 kb gewonnen wurde. Anschließend wurde das auf diese Weise erhaltene BamHI-Fragment in die BamHI- Stelle des Plasmids pSV2-neo (ATCC 37149) inseriert. Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid wurde in eine Zelle des Stamms E. coli DH5 unter Bildung eines Transformanten übertragen. Das in dem Transformanten enthaltene Plasmid wurde als "pSVB52-3" bezeichnet. Das vorstehend genannte Verfahren ist in Fig. 2 erläutert. Ferner wurde das Plasmid pSVB52-3 aus dem Transformanten gemäß dem Alkaliextraktionsverfahren, wie es in Stufe 3 beschrieben wurde, extrahiert und getrocknet.

Stufe 5

Transfektion des Plasmids pSVB52-3 in eine Säugerzelle und Nachweis des HVT-gA-Antigens:

5 ug des Plasmids pSVB52-3 wurden in 200 ul 2 x HBS [50 millimolar N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES) (hergestellt und vertrieben von DOJINDO Laboratories, Japan), 280 millimolar NaCl und 1,5 millimolar Na&sub2;HPO&sub4;] gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurden 200 ul 0,25 m wäßrige CaCl&sub2;-Lösung gegeben. Anschließend wurde das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei 20ºC inkubiert, wobei sich ein gemeinsamer Niederschlag der Plasmid-DNA mit Calciumphosphat bildete. Andererseits wurde eine Affennierenzelle LLC-MK2 (ATCC CCL 7) 24 Stunden in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm gezüchtet. Zu der erhaltenen Kultur wurde tropfenweise das vorstehend erhaltene Gemisch mit dem Gehalt an dem gemeinsam ausgefällten Material mittels einer Mikropipette gegeben. Anschließend wurde die erhaltene Zellkultur 20 Stunden in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Zu der erhaltenen Zellkultur wurde anschließend ein Trypsinlösung gegeben, die in Referenzbeispiel 2 hergestellt wurde, um die Zellen von der Oberfläche der Petrischale abzulösen. Anschließend wurde die Kultur einer Zentrifugation gemäß dem in Referenzbeispiel 3 beschriebenen Verfahren unterworfen, um Zellen zu gewinnen. Die auf diese Weise gewonnenen Zellen wurden unter Verwendung von Eagle-MEM (hergestellt und Vertrieben von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) mit einem Gehalt an 400 ug/ml G418 (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, USA) und 5 % (Vol./Vol.) an fötalem Kälberserum subkultiviert. Die mit dem Plasmid pSVB52-3 transformierten Säugerzellen wiesen eine Resistenz gegenüber dem antibiotischen Aminoglycosid G418 auf. Daher wurden Kolonien der Transformanten ausgewählt, indem als Kriterium die Resistenz gegenüber G418 herangezogen wurde. Anschließend wurden die ausgewählten Kolonien einer Subkultivierung für 10 Tage unterworfen. Dann wurden die subkultivierten Zellen jeder Kolonie unter Verwendung eines mit Trypsinlösung getränkten Filters cloniert, und die erhaltenen Clone wurden einzeln kultiviert. Anschließend wurde die Kultur jedes Clons untersucht, um zu bestimmen, ob ein HVT-gA-Antigen in der Kultur durch eine herkömmliche Avidin-Biotin-Immunofluoreszenz-Technik (BRL Products for Immunodetection-Application Guide, Nr. 10444, veröffentlicht von Bio-Rad Laboratories, USA) nachgewiesen werden konnte. Für den Nachweis wurde ein monoclonaler Antikörper M-34 (Journal of General Virology, Bd. 64 (1983), S. 2597-2610) verwendet, der zur Reaktion sowohl mit dem HVT-gA-Antigen als auch mit dem MDV-gA-Antigen imstande war, als primärer Antikörper verwendet, und ein Anti-Maus-IgG (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß für etwa 1/3 der G418-resistenten Clone eine Fluoreszenz, die spezifisch für ein HVT-gA-Antigen war, im Cytoplasma der Zellen jedes Clons nachgewiesen wurde. Dies zeigt, daß ein HVT-gA-Antigen von diesen Clonen gebildet wurde. Eine Photographie eines repräsentativen Clons, der durch die Avidin-Biotin-Immunofluoreszenz-Technik untersucht wurde, ist in Fig. 12 gezeigt.

Stufe 6

Bestimmung der Nucleotidsequenz des gA-Antigen-Gens von HVT:

Das Plasmid pSVB52-3, das zur Expression des HVT-gA-Antigen-Gens, das in Stufe 4 erhalten wurde, imstande war, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterworfen, um ein 7,2 kb umfassendes BamHI-Fragment der genomischen HVT-DNA zu gewinnen. Das auf diese Weise erhaltene BamHI-Fragment wurde weiter mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut. Jedes der auf diese Weise erhaltenen verdauten DNA-Materialien wurde in die BamHI-Stelle des Plasmids pSV2-neo in der gleichen Weise, wie es in Stufe 4 beschrieben wurde, eingeführt. Anschließend wurden die erhaltenen Plasmide einzeln in LLC-MK2-Zellen unter Bildung von Transformanten transfiziert, und es wurde untersucht, ob ein HVT-gA-Antigen in den Transformanten gebildet wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Region des HVT-gA-Antigen-Gens in der SphI-SphI-Region, die in Fig. 1 gezeigt ist, vorhanden war, und daß eines der Plasmide das gA-Antigen-Gen von HVT vollständig aufwies. Dieses Plasmid wurde als "pSBS-1" bezeichnet. Anschließend wurde ein SphI-SphI-Fragment, das der vorstehend erwähnten SphI-SphI-Region entsprach, in der gleichen Weise ausgeschnitten, wie es vorstehend im Hinblick auf das Ausschneiden der BamHI-Fragments beschrieben wurde. Unter Verwendung des erhaltenen SphI-SphI-Fragments wurde die gesamte Nucleotidsequenz des gA-Antigen-Gens von HVT gemäß dem üblichen Didesoxy-Kettenabbruchverfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, bestimmt. Die Nucleotidsequenz des gA-Antigen-Gens von HVT und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind in den Figuren 3(a) bis 3(k) zusammen mit der Nucleotidsequenz des gA-Antigen-Gens von MDV und der dadurch codierten Aminosäuresequenz, die nachstehend in Beispiel 3 erwähnt werden, gezeigt. In den Figuren 3(a) bis 3(k) sind die Sequenzen in der folgenden Reihenfolge von der oberen Zeile bis zur unteren Zeile angeordnet:
(1) Nucleotidsequenz, die für das gA-Antigen von MDV codiert;
(2) Aminosäuresequenz des gA-Antigens von MDV, die aus der vorstehend erwähnten Nucleotidsequenz (1) abgeleitet wurde;
(3) Nucleotidsequenz, die für das gA-Antigen von HVT codiert; und
(4) Aminosäuresequenz des gA-Antigens von HVT, die aus der vorstehend genannten Nucleotidsequenz (3) abgeleitet wurde.

Stufe 7

Clonierung des Gens, das für Hämagglutinin und Neuraminidase (nachstehend als "HN-Gen" bezeichnet) des Virus der Newcastle-Krankheit (nachstehend als "NDV" bezeichnet) codiert:

In diesem Beispiel wird das HN-Gen von NDV als Fremdgen verwendet. Das HN-Gen wurde wie folgt erhalten.
Gemäß einem üblichen Verfahren wurden 0,5 ml einer Virus-Vorkulturlösung des Stamms NDV FUDAI (im Handel erhältlich von the Japanese Association of Veterinary Biologics, Japan) in die allantoische Cavität jedes von 10 Hühnereiern mit 10 Tage alten Embryos überimpft und 2 Tage bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die allantoische Flüssigkeit aus jedem der inkubierten Eier gewonnen. Auf diese Weise erhielt man etwa 50 ml allantoische Flüssigkeit. Die allantoische Flüssigkeit wurde 15 Minuten einer Zentrifugation bei 10 000 g unterworfen, und der Überstand wurde aufgefangen. Der Überstand wurde einer Ultrazentrifugation unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Modell 55P und eines Rotors Nr. PR-21 (hergestellt und vertrieben von Hitachi, Ltd., Japan) bei 21 000 U/min bei 4ºC für 90 Minuten unterworfen, wobei NDV-Partikel gewonnen wurden. Die auf diese Weise erhaltenen NDV-Partikel wurden in 1 ml PK-Puffer (0,1 m Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 12,5 millimolar Na&sub2;EDTA, 0,15 m NaCl und 1 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat) suspendiert. Dann wurden zu der erhaltenen Suspension 100 ul einer wäßrigen Proteinase-Lösung mit einer Proteinase-Konzentration von 4 mg/ml gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 65ºC inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung in der gleichen Weise, wie es in Stufe 1 beschrieben wurde, unterworfen, wobei man gereinigte genomische RNA von NDV erhielt. 5 ug der auf diese Weise erhaltenen genomischen NDV-RNA wurden zu 100 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,9), 100 millimolar KCl, 10 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT, 1 millimolar Nucleosidtriphosphat, 30 Einheiten RNase-Inhibitor (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) und 2 ug eines synthetischen Oligodesoxynucleotidprimers (17-Mer) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei 60ºC inkubiert, um eine Reaktion zu fördern, und anschließend wurde das Reaktionsgemisch allmählich auf 42ºC gekühlt, um eine Anelierung durchzuführen. Dann wurden zu dem erhaltenen Gemisch 10 ul einer Lösung mit 3300 Einheiten/ml reverse Transkriptase gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 90 Minuten bei 42ºC inkubiert, um eine Reaktion zu fördern. Nach Abschluß der Reaktion wurde zu dem Reaktionsgemisch eine Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,2), 10 millimolar MgSO&sub4;, 0,1 millimolar DTT, 50 ug/ml Rinderserumalbumin, 20 Einheiten RNase H (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), 0,2 Einheiten E. coli-DNA-Ligase (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), 0,15 millimolar β-Nicotinamidadenindinucleotid und 30 Einheiten DNA-Polymerase gegeben, so daß das Endvolumen des erhaltenen Gemisches 400 ul betrug. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 15ºC inkubiert, um eine Reaktion zu fördern. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung zur Bildung von Niederschlägen unterworfen. Die auf diese Weise erhaltenen Niederschläge wurden in 100 pl einer Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,6), 10 millimolar MgCl&sub2;, 5 millimolar DTT, 0,1 millimolar Spermidin, 0,1 millimolar Na&sub2;-EDTA und 1 millimolar Adenosin-5-triphosphat gelöst. Zu der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurden 10 ul einer T4- Polynucleotidkinase-Lösung mit einem Gehalt an 1000 Einheiten/ml gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um eine Reaktion zu fördern. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung zur Bildung von Niederschlägen unterworfen. Anschließend wurden die auf diese Weise erhaltenen Niederschläge in 100 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 33 millimolar Tris-Essigsäure (pH-Wert: 7,9), 66 millimolar Kaliumacetat, 10 millimolar Magnesiumacetat, 0,5 millimolar DTT, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,5 millimolar Desoxynucleosidtriphosphat gelöst. Zu der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurden 10 ul einer Lösung mit 400 Einheiten/ml T4-DNAPolymerase gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, um eine Reaktion zu fördern. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung unterworfen, wobei man komplementäre DNAs (cDNAs) für verschiedene Abschnitte der genomischen RNA von NDV erhielt.
100 ng der auf diese Weise erhaltenen cDNAs und 100 ng Plasmid pUC19 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) (Gene, Bd. 26 (1983), S. 101), das mit dem Restriktionsenzym HincII geschnitten worden war, wurden in 50 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 60 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,6), 6,6 millimolar MgCl&sub2; und 10 millimolar Adenosin-5-triphosphat gelöst. Anschließend wurden zu der erhaltenen Lösung 10 ul einer Lösung von T4-DNA-Ligase mit einer T4-DNA-Ligasekonzentration von 60 000 Einheiten/ml gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 20ºC inkubiert, um jede der cDNAs an die HincII-Stelle des Plasmids pUC19 einzeln zu ligieren. Anschließend wurden unter Verwendung des erhaltenen Gemisches Zellen von Escherichia coli JM83 (ATCC 35607) in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Stufe 2 transformiert. Die erhaltenen Transformanten wurden kultiviert, um eine Clonierung der einzelnen cDNA-Fragmente mit verschiedener Größe mit dem Vektor-Plasmid pUC19 durchzuführen. Aus jedem der Transformanten wurde das rekombinante Plasmid isoliert, und aus dem Plasmid wurde das clonierte DNA-Fragment in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Stufe 3 isoliert. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz jedes der clonierten DNA-Fragmente gemäß der Didesoxy-Kettenabbruchmethode, wie sie vorstehend in Stufe 6 beschrieben wurde, bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß drei clonierte cDNA-Fragmente, die für verschiedene Abschnitte des HN-Gens des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) codieren, erhalten wurden. Die Plasmide, die diese clonierten cDNA-Fragmente enthielten, wurden als "pNC1", "pNC2" bzw. "pNC9" bezeichnet. Anschließend wurden die vorstehend clonierten cDNA-Fragmente, um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das das gesamte HN-Gen von NDV enthält, wie folgt ligiert. Zuerst wurden aus den vorstehend erhaltenen Plasmiden pNC1, pNC2 und pNC9 die clonierten cDNA-Fragmente in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Stufe 3 gewonnen. Das aus dem Plasmid pNC1 erhaltene cDNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen HpaI und PstI verdaut, wobei man ein pNC1-Fragment erhielt. Das aus dem Plasmid pNC9 erhaltene cDNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII verdaut, wobei man ein pNC9-Fragment erhielt. Das aus dem Plasmid pNC2 erhaltene cDNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRV verdaut, wobei man ein pNC2-Fragment erhielt. Anschließend wurden die auf diese Weise erhaltenen Fragmente unter Verwendung von T4-DNA-Ligase aneinander ligiert, wobei man ein cDNA-Fragment mit dem gesamten HN-Gen erhielt. Das auf diese Weise erhaltene cDNA-Fragment wurde in die HindI-Stelle des Plasmids pUC19 ligiert. Mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid wurde Escherichia coli JM83 transformiert, so daß das cDNA-Fragment, das das gesamte HN-Gen enthielt, cloniert wurde. Das Plasmid, das das cDNA-Fragment trug, das das gesamte HN-Gen von NDV enthielt, wurde als "pHN-1" bezeichnet. In Fig. 4 sind die Entsprechungen zwischen den Fragmenten pNC1, pNC2 und pNC9 sowie den cDNA- Fragmenten, die das gesamte HN-Gen enthalten, erläutert. Das cDNA-Fragment, das das gesamte HN-Gen von NDV enthielt, wurde aus dem Plasmid pHN- 1 in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Stufe 3 isoliert. Anschließend wurde die Nucleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen cDNA-Fragments, das das gesamte HN-Gen enthielt, gemäß der Didesoxy-Kettenabbruchmethode, die vorstehend erwähnt wurde, bestimmt. Die Nucleotidsequenz des HN-Gens und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den Figuren 5(a) bis (5d) gezeigt.

Stufe 8

Konstruktion eines zweiten Replikationsvektors, der das HVT-gA- Antigen-Gen und ein Fremdgen (HN-Gen) enthält:

100 ng Plasmid pSBS-1 mit dem gA-Antigen-Gen von HVT, das in Stufe 6 hergestellt wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten. Nach dem Schneiden wurde das geschnittene Plasmid durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen. Das gewonnene Plasmid wurde in 100 pl einer Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,9), 10 millimolar MgCl&sub2;, 50 millimolar NaCl, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 millimolar DTT und 1 millimolar Desoxyribonucleosidtriphosphat gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurden 10 ul einer T4-DNA-Polymerase-Lösung mit einer T4-DNA-Polymerase-Konzentration von 200 Einheiten/ml gegeben. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 37ºC durchgeführt, um beide Enden des geschnittenen Plasmids in stumpfe Enden zu überführen. Nach Abschluß der Reaktion wurde das erhaltene Reaktionsgemisch einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung unterworfen, um eine Plasmid-DNA zu gewinnen. Die Plasmid-DNA wurde mit der Nuclease Bal31 ("Molecular Cloning", erwähnt in Stufe 3, S. 136-139) verdaut, um das Initiationscodon ATG des gA-Antigen- Gens von HVT zu entfernen. Anschließend wurde gemäß dem in dem vorstehenden Buch Molecular Cloning, S. 243-246 beschriebenen Verfahren ein XhoI-Linker an beide Enden der Plasmid-DNA ligiert, und die Plasmid-DNA wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um beide Enden der Plasmid-DNA in stumpfe Enden umzuwandeln. Andererseits wurde Plasmid pHN-1, das in Stufe 6 erhalten worden waren, mit den Restriktionsenzymen HpaI und EcoRV verdaut und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterworfen, um ein DNA-Fragment von etwa 1,8 kb, das das HN-Gen von NDV enthielt, zu gewinnen. Anschließend wurde das DNA-Fragment von etwa 1,8 kb an die vorstehend erhaltene Plasmid-DNA ligiert. Mit dem erhaltenen Plasmid wurden Zellen des Stamms Escherichia coli JM83 transformiert, wobei man Transformanten erhielt. Das erhaltene Plasmid wurde als "pHVT-1" bezeichnet. Das vorstehende Verfahren ist in Fig. 6 erläutert.

Stufe 9

Herstellung eines rekombinanten HVT:

Eine QEF-Zellkultur wurde in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 4 hergestellt. Auf die QEF-Zellkultur wurden 1 x 10&sup6; PFU/Petrischale einer Vorkultur des Virusstamms HVT O1 überimpft. Anschließend wurde ein Kulturmedium zu der Kultur gegeben, und die erhaltene Kultur wurde in einem Kohlendioxid-Inkubator 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zu der erhaltenen Kultur wurde tropfenweise gemeinsam ausgefälltes Plasmid pHVT-1 mit Calciumphosphat gegeben, wie es in Stufe 8 erhalten wurde. Anschließend wurde die Kultur weitere 20 Stunden durchgeführt. Nach Abschluß des Kultivierens wurde das Kulturmedium vorsichtig entfernt, und 6 ml/Petrischale an Kulturmedium mit einem Gehalt an Agarose bei einer Konzentration von 0,8 % (Gew./Vol.) wurden auf die kultivierten Zellen in der Petrischale gegossen. Die Zellen wurden weiter in einem Kohlendioxid-Inkubator 48 Stunden bei 37ºC unter Bildung von Plaques inkubiert. Während des Kultivierens trat die homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment von Plasmid pHVT-1, das sowohl das gA-Antigen-Gen als auch das HN-Gen enthielt, und dem Abschnitt der genomischen DNA von HVT, der eine homologe oder ähnliche Nucleotidsequenz wie das DNA-Fragment aufwies, auf, wodurch ein rekombinantes HVT gebildet wurde. Anschließend wurde das rekombinante HVT aus jedem der Plaques durch das Plaquehybridisierungsverfahren isoliert, wie es im Manual for Genetic Engineering (1982), veröffentlicht von Kodansha Scientific, Japan, auf den Seiten 68 bis 73 beschrieben wurde. Anteile des Agarosegels, auf denen sich Plaques gebildet hatten, wurden also unter Verwendung eines sterilisierten Korbbohrers, mit einem Durchmesser, der geringfügig größer als der Durchmesser der einzelnen Plaques war, ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Anteile des Agarosegels wurden gegen einen sterilisierten Nylonmembranfilter (hergestellt und vertrieben von Nihon Pall Ltd., Japan) in einer Art Stempel gepreßt, um dabei die Plaques auf den sterilisierten Nylonmembranfilter zu übertragen. Die ausgeschnittenen Anteile des Agarosegels wurden in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 1/15 m PBS (pH-Wert: 7,4), 10 % (Gew./Vol.) Saccharose, 3 % (Gew./Vol.) L-Arginin, 1 % (Gew./Vol.) Gelatinehydrolysat bei -70ºC in gefrorenem Zustand gelagert. Der Filter mit den übertragenen Plaques wurde üblichen Behandlungen unterworfen, d.h. einer Modifizierung mit 0,5 n NaOH, einer Neutralisation mit 1 m Tris-HCl (pH-Wert: 7,5) und einer Wärmebehandlung 1 Stunde bei 80ºC in dieser Reihenfolge. Anschließend wurde der Filter einer Plaquehybridisierung im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es vorstehend erwähnt wurde, unterworfen, mit der Ausnahme, daß das NDV-HN-Gen, das mit [³²P]-Desoxycytidintriphosphat markiert und in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Stufe 3 hergestellt worden war, als Sonde verwendet wurde. Das gelagerte Agarosegel, das dem positiven Plague auf dem Filter entsprach, der mit der Sonde gemäß der Plaguehybridisierung hybridisierte, wurde auf eine QEF-Kultur überimpft, die getrennt in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Referenzbeispiel 4 hergestellt worden war. Anschließend erfolgte eine Kultivierung. Aus der erhaltenen Kultur wurde ein rekombinantes Virus in der gleichen Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, isoliert. Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1R" bezeichnet.

Stufe 10

Nachweis des HVT-Antigens und des NDV-HN-Antigens, die durch das rekombinante HVT gebildet werden:

Eine Suspension von Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1R, der in Stufe 9 erhalten wurde, infiziert waren, wurden im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 4 hergestellt. Die Suspension wurde auf ein Objektglas getropft, das für die Verwendung bei der fluoreszierenden Antikörpertechnik angepaßt ist. Anschließend wurde die aufgetropfte Suspension ausgebreitet, an der Luft getrocknet und 10 Minuten mit kaltem Aceton behandelt, um die virusinfizierten Zellen auf dem Objektglas zu fixieren.
Anschließend wurde durch die indirekte fluoreszierende Antikörpertechnik wie folgt untersucht, ob ein HVT-Antigen und ein NDV-HN-Antigen in den fixierten Zellen auf dem Objektglas vorhanden waren. 0,5 ml eines primären Antikörpers wurden auf die auf dem Objektglas fixierten Zellen gegeben, und die Reaktion wurde in einer Feuchtigkeitskammer 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Als primärer Antikörper wurde ein anti-NDV-HN-Hühnerantiserum verwendet. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen auf dem Objektglas dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 0,5 ml eines anti-Hühner-IgG-Antikörpers, der mit Fluoresceinisothiocyanat (4 anfärbende Einheiten) markiert war, als sekundärer Antikörper mit den Zellen umgesetzt, und diese wurden im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, gewaschen. Eine Glycerinpufferlösung (ein Gemisch aus 0,5 m Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Lösung (pH-Wert: 9,5) und Glycerin mit einer garantiert nicht fluoreszierenden Qualität im Volumenverhältnis 1:9) wurde auf die Zellen getropft, und dann wurden die Zellen mit einem Deckglas abgedeckt. Die auf diese Weise erhaltene Probe wurde einer mikroskopischen Analyse mittels eines Fluoreszenzmikroskops (hergestellt und vertrieben von Nippon Kogaku K.K., Japan) unterzogen.
Andererseits wurde ein weiteres Objektglas, auf dem die Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm HVT O1R infiziert waren, fixiert waren, in der gleichen Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, vorbereitet, und die Zellen wurden einer Analyse durch die indirekte fluoreszierende Antikörpertechnik im wesentlichen der gleichen Weise, wie es vorstehend erläutert wurde, unterzogen, mit der Ausnahme, daß ein anti-HVT-Hühner-Antiserum als primärer Antikörper verwendet wurde.
Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der rekombinante Virusstamm HVT O1R sowohl ein HVT-Antigen als auch ein NDV-HN-Antigen bildete. Die Photographien von repräsentativen Zellen, die der vorstehend erläuterten Analyse unterzogen wurden, sind in den Figuren 13 und 14 gezeigt.

Beispiel 2

Das Plasmid pNC-9, wie es in Stufe 7 von Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym HinfI verdaut. Das erhaltene verdaute Material wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die beiden Enden in stumpfe Enden umzuwandeln. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterworfen, wobei man ein DNA-Fragment von etwa 1,1 kb, das das HN-Gen von NDV enthielt, erhielt.
Andererseits wurde das Plasmid pSBS-1, wie es in Stufe 6 von Beispiel 1 erhalten worden war, mit BamHI geschnitten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt. An die auf diese Weise erhaltene Plasmid-DNA wurde das vorstehend erhaltene DNA-Fragment mit T4-DNA-Ligase ligiert. Mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid wurden Zellen von E. coli JM83 unter Bildung von Transformanten transformiert. Das vorstehend erhaltene rekombinante Plasmid wurde als "pFGH-H" bezeichnet. Das vorstehende Verfahren ist in Fig. 7 erläutert. In diesem Plasmid war das HN-Gen von NDV in das DNA-Fragment, das das HVT-gA-Antigen-Gen enthielt, inseriert, so daß ein Fusionsprotein des HVT-gA-Antigens und des NDV-HN exprimiert werden konnte.
Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 9 von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das vorstehend erhaltene Plasmid pFGH-H anstelle des Plasmids pHVT-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Dieses rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1F" bezeichnet.
Der auf diese Weise erhaltene rekombinante Virusstamm HVT O1F wurde einer Analyse im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 unterworfen. Auf diese Weise wurde bestätigt, daß das rekombinante Virus sowohl ein HVT-Antigen als auch eine NDV-HN bildete. Die Photographien der repräsentativen Zellen, die der vorstehend erläuterten Analyse unterzogen wurden, sind in den Figuren 14 und 15 gezeigt.

Beispiel 3

Stufe 1

Herstellung genomischer MDV-DNA:

Die genomische DNA des Stamms MDV C2 wurde im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 1 von Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß QEF-Zellen, die mit dem Stamm MDV C2 infiziert waren, anstelle der QEF-Zellen, die mit dem Stamm HVT O1 infiziert waren, verwendet wurden.

Stufe 2

Clonierung von mit Restriktionsenzymen geschnittenen Fragmenten der genomischen MDV-DNA und Herstellung einer Genbibliothek:

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 2 von Beispiel 1 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die in Stufe 1 von Beispiel 3 erhaltene genomische MDV-DNA anstelle der genomischen HVT-DNA verwendet wurde, wobei man drei Genbibliotheken der genomischen MDV-DNA erhielt, d.h. eine BamHI-Bibliothek, eine PstI-Bibliothek und eine HindIII-Bibliothek,

Stufe 3

Aufstellen einer Restriktionskarte der genomischen DNA von MDV:

Eine Restriktionskarte der genomischen DNA von MDV wurde im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 3 von Beispiel 1 beschrieben ist, aufgestellt. Die auf diese Weise aufgestellte Restriktionskarte ist in Fig. 8 gezeigt. In Fig. 8 haben die Abkürzungen die gleiche Bedeutung wie in Fig. 1.
Auf der Basis der vorstehend genannten Restriktionskarte wurde ein Transformantenclon, der ein Plasmid enthielt, das ein 18,3 kb umfassendes BamHI-Fragment der genomischen MDV-DNA trug, aus der in der vorstehenden Stufe 2 hergestellten BamHI-Bibliothek ausgewählt. Sodann wurde aus dem Clon das Plasmid in der gleichen Weise wie in Stufe 4 von Beispiel 1 isoliert. Das Plasmid wurde als "pBam-B" bezeichnet.

Stufe 4

Konstruktion eines Expressionsvektors für die Expression des MDV- gA-Antigen-Gens (erster Replikationsvektor):

Im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 4 von Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde das 18,3 kb umfassende BamHI-Fragment des Plasmids pBam-B, das in der vorstehenden Stufe 3 erhalten wurde, in das Plasmid pSV2-neo an dessen BamHI-Stelle inseriert, wobei man das Plasmid pSVB-12 erhielt. Dieses Verfahren ist in Fig. 9 erläutert. Ferner wurde auf der Basis der Restriktionskarte, die in Stufe 3 von Beispiel 3 aufgestellt wurde, ein EcoRI-PvuII-Fragment von etwa 2,2 kb aus der 18,3 kb umfassenden BamHI-Fragmentregion des Plasmids pBam-B im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 2 von Beispiel 1 beschrieben ist, ausgeschnitten. Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen EcoRI-PvuII-Fragments wurde das Plasmid pBEP-22 im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 4 von Beispiel 1 beschrieben ist, konstruiert.

Stufe 5

Transformation einer Säugerzelle mit dem Plasmid pBEP-22 und Nachweis des MDV-gA-Antigens:

Die Affennierenzelle LLC-MK2 wurde mit dem Plasmid pBEP-22 transformiert, und der erhaltene Transformant wurde im wesentlichen in der gleichen Weise, wie es in Stufe 5 von Beispiel 1 beschrieben ist, gezüchtet. Ob ein MDV-gA-Antigen in dem Transformanten gebildet wurde, wurde gemäß der Immunofluoreszenz-Technik, die ebenfalls in Stufe 5 von Beispiel 1 erwähnt wurde, analysiert. Als Ergebnis wurde die Bildung eines MDV-gA-Antigens durch den vorstehend erhaltenen Transformanten bestätigt (vgl. Fig. 19). Anschließend wurde das Plasmid pBEP-22, das zur Expression des MDV-gA-Antigen-Gens imstande war und in Stufe 4 von Beispiel 3 erhalten wurde, mit Restriktionsenzymen im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 6 von Beispiel 1 verdaut, wobei man ein EcoRI-PvuII- Fragment von etwa 2,2 kb erhielt, das ein für das gA-Antigen von MDV codierendes Gen enthielt. Die Nucleotidsequenz des Fragments wurde gemäß der Didesoxy-Kettenabbruchmethode bestimmt. Die Nucleotidsequenz des gA- Antigen-Gens und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den Figuren 3(a) bis 3(k) gezeigt.

Stufe 6

Konstruktion eines zweiten Replikationsvektors, der das MDV-gA-Antigen-Gen und ein Fremdgen (HN-Gen) enthält:

Das Plasmid pMDV-1 wurde unter Verwendung des in Stufe 7 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pHN-1 und des in Stufe 4 von Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pBEP-22 im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 8 von Beispiel 1 konstruiert. Die Konstruktion des Plasmids pMDV-1 ist als Diagramm in Fig. 10 erläutert.

Stufe 7

Herstellung eines rekombinanten MDV:

Im wesentlichen das gleiche Verfahren, wie in Stufe 9 von Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm MDV C2 anstelle des Stamms HVT O1 und daß das Plasmid pMDV-1 anstelle des Plasmids pHVT-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2R" bezeichnet.

Stufe 8

Nachweis des MDV-Antigens und des NDV-HN-Antigens, die durch das rekombinante MDV gebildet werden:

Der Nachweis des MDV-Antigens und des NDV-HN-Antigens, die in den QEF-Zellen, die mit dem rekombinanten Virusstamm MDV C2R infiziert waren, gebildet wurden, wurde gemäß der indirekten fluoreszierenden Antikörpertechnik, wie sie in Stufe 10 von Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt. Als primärer Antikörper wurden anti-NDV-HN-Antigen-Hühnerantiserum und ein anti-MDV-Antigen-Hühnerantiserum verwendet. Als Ergebnis wurden die gleichzeitige Bildung des MDV-Antigens und des NDV-HN-Antigens durch den vorstehend erwähnten rekombinanten Virusstamm bestätigt. Photographien von repräsentativen Zellen, die der vorstehend genannten Analyse unterworfen wurden, sind in Figuren 20 und 21 gezeigt.

Beispiel 4

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 6 von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das in Stufe 7 von Beispiel 1 erhaltene Plasmid pNC-9 anstelle des Plasmids pHN-1 verwendet wurde, wobei man einen zweiten Replikationsvektor erhielt, der als "Plasmid pFGH-M" bezeichnet wurde. Die Konstruktion des Plasmids pFGH-M ist als Diagramm in Fig. 11 erläutert. Dieses Plasmid ist zur Expression eines MDV-gA-Antigen-Gens und eines NDV-HN-Gens imstande, so daß ein Fusionsprotein des MDV-gA-Antigens und der NDV-HN gebildet wird.
Anschließend wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 7 von Beispiel 3 wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Plasmid pFGH-M anstelle des Plasmids pMDV-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2F" bezeichnet.
Durch die Analyse in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 wurde bestätigt, daß der rekombinante Virusstamm MDV C2F sowohl ein MDV-Antigen als auch eine NDV-HN bildet.

Beispiel 5

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 9 von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das in Stufe 6 von Beispiel 3 erhaltene Plasmid pMDV-1 anstelle des Plasmids pHVT-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1MH" bezeichnet.
Durch die Analyse in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 wurde bestätigt, daß der rekombinante Virusstamm HVT O1MH sowohl ein HVT-Antigen als auch eine NDV-HN bildet. Die Ergebnisse der Analyse wurden photographiert und sind in den Figuren 17 und 18 gezeigt.

Beispiel 6

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 9 von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das in Beispiel 4 erhaltene Plasmid pFGH-M anstelle des Plasmids pHVT-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1FMH" bezeichnet. Durch die Analyse in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 wurde bestätigt, daß der rekombinante Virusstamm HVT O1FMH sowohl ein HVT-Antigen als auch eine NDV-HN bildet. Die Ergebnisse der Analyse wurden photographiert und sind in den Figuren 20 und 21 gezeigt.

Beispiel 7

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 7 von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das in Stufe 6 von Beispiel 1 erhaltene Plasmid pHVT-1 anstelle des Plasmids pHVT-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2HH" bezeichnet.
Durch die Analyse in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 wurde bestätigt, daß der rekombinante Virusstamm MDV C2HH sowohl ein MDV-Antigen als auch eine NDV-HN bildet.

Beispiel 8

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 7 von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das in Beispiel 2 erhaltene Plasmid pFGH-H anstelle des Plasmids pMDV-1 verwendet wurde, wobei man ein rekombinantes Virus erhielt. Das rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2FHH" bezeichnet. Durch die Analyse in der gleichen Weise wie in Stufe 10 von Beispiel 1 wurde bestätigt, daß der rekombinante Virusstamm MDV C2FHH sowohl ein MDV-Antigen als auch eine NDV-HN bildet.

Beispiel 9

Herstellung eines rekombinanten MDV, das ein Spike-Protein-Gen des infektiösen Vogelbronchitisvirus als Fremdgen enthält:

Stufe 1

Eine cDNA-Bibliothek der genomischen DNA des infektiösen Vogelbronchitisvirus (nachstehend als "IBV" bezeichnet) Stamm M41 (der im Handel von der Japanese Association of Veterinary Biologics, Japan, erhältlich ist) wurde im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 7 von Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Stamm IBV M41 anstelle des Stamms NDV FUDAI verwendet wurde. Auf der Basis der Genkarte des IDV und der Nucleotidsequenz des Gens, das für das Spike-Protein-Antigen (nachstehend als "SP-Antigen" bezeichnet) von IDV codiert (Journal of General Virology, Bd. 16 (1985), S. 719-726), wurde ein Plasmid, das ein DNA- Fragment trägt, das das SP-Antigen enthält, aus der cDNA-Bibliothek cloniert. Das clonierte Plasmid wurde als "pSP-922" bezeichnet. Das Plasmid pSP-922 wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII geschnitten und mit der Nuclease Bal31 verdaut, wobei man ein DNA-Fragment, das das SP-Antigen-Gen enthielt, erhielt. Anschließend wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 8 von Beispiel 1 wiederholt, mit der Ausnahme, daß das vorstehend erhaltene DNA-Fragment anstelle des DNA-Fragments, das das NDV-HN-Gen enthielt, verwendet wurde, wobei man ein Plasmid erhielt, das den Promotor eines HVT-gA-Antigen-Gens und das SP-Antigen-Gen, ligiert stromabwärts davon, umfaßte. Dieses Plasmid wurde als "pHVSP-3" bezeichnet.

Stufe 2

Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pHVSP-3 und des Stamms HVT O1 wurde ein rekombinantes Virus im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 9 von Beispiel 1 hergestellt. Das hergestellte rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1HS" bezeichnet. Durch die Analyse gemäß dem gleichen Verfahren wie in Stufe 10 von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß anti-IBV-Antigen-Hühnerantiserum als sekundärer Antikörper anstelle von anti-NDV-HN-Hühnerantiserum verwendet wurde, wurde bestätigt, daß das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus sowohl ein HVT-Antigen als auch ein IBV-SP-Antigen bildete.

Beispiel 10

Stufe 1

Im wesentlichen das gleiche Verfahren wie in Stufe 9 von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das DNA-Fragment, das das IBV-SP- Antigen-Gen enthielt, anstelle des DNA-Fragments, das das NDV-HN-Gen enthielt, verwendet wurde und daß das in Stufe 4 von Beispiel 4 erhaltene Plasmid pBEP-22 anstelle des in Stufe 6 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pSBS-1 verwendet wurde, wobei man ein Plasmid erhielt, das den Promotor eines MDV-gA-Antigen-Gens und das SP-Antigen-Gen, ligiert stromabwärts davon, enthielt. Dieses Plasmid wurde als "pMDSP-22" bezeichnet.

Stufe 2

Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pMDSP-22 und des Stamms HVT O1 wurde ein rekombinantes Virus im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 9 von Beispiel 1 hergestellt. Das hergestellte rekombinante Virus wurde als "Stamm HVT O1MS" bezeichnet. Durch Analyse gemäß dem gleichen Verfahren wie in Stufe 10 von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß ein anti-IBV-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper anstelle des anti-NDV-HN-Hühnerantiserums verwendet wurde, wurde bestätigt, daß das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus sowohl ein HVT-Antigen als auch ein IBV-SP-Antigen bildete.

Beispiel 11

Unter Verwendung des in Beispiel 9 erhaltenen Plasmids pHVSP-3 und des Stamms MDV C2 wurde ein rekombinantes Virus im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 9 von Beispiel 1 hergestellt. Das hergestellte rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2HS" bezeichnet. Durch die Analyse gemäß dem gleichen Verfahren wie in Stufe 10 von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß ein anti-IBV-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper anstelle des anti-NDV-HN-Hühnerantiserums verwendet wurde, wurde bestätigt, daß das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus sowohl ein MDV-Antigen als auch ein IBV-SP-Antigen bildete.

Beispiel 12

Unter Verwendung des in Beispiel 10 erhaltenen Plasmids pMDSP-22 und des Stamms MDV C2 wurde ein rekombinantes Virus im wesentlichen in der gleichen Weise wie in Stufe 9 von Beispiel 1 hergestellt. Das hergestellte rekombinante Virus wurde als "Stamm MDV C2MS" bezeichnet. Durch die Analyse gemäß dem gleichen Verfahren wie in Stufe 10 von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß ein anti-IBV-Antigen-Hühnerantiserum als primärer Antikörper anstelle des anti-NDV-HN-Hühnerantiserums verwendet wurde, wurde bestätigt, daß das auf diese Weise erhaltene rekombinante Virus sowohl ein MDV-Antigen als auch ein IBV SP-Antigen bildete.

Beispiel 13

Herstellung eines zweiwertigen Lebendimpfstoffs, der ein rekombinantes Virus der Marekschen Krankheit als aktiven Bestandteil enthält, und Untersuchung der Sicherheit und Aktivität des zweiwertigen Lebendimpfstoffs:
Mit Viren infizierte QEF-Zellen wurden gemäß dem in Referenzbeispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar unter Verwendung jedes der rekombinanten Virusstämme HVT O1R, HVT O1F, HVT O1MH, HVT O1FMH, MDV C2R, MDV C2F, MDV C2HH und MDV C2FHH, die in den Beispielen 1 bis 8 erhalten wurden. Mit jedem der vorstehend genannten rekombinanten Viren infizierte QEF-Zellen wurden in 50 Roux-Flaschen mit einem Volumen von jeweils 1 l gezüchtet. Nach Abschluß der Kultur wurden die infizierten Zeilen von den Innenwänden der einzelnen Flaschen unter Verwendung einer Trypsinlösung abgelöst, die durch Lösen von Na&sub2;EDTA in der in Referenzbeispiel 2 erhaltenen Lösung in einer Konzentration von 0,02 % (Gew./Vol.) erhalten worden waren, und sie wurden in der Trypsinlösung suspendiert. Die Suspensionen, die die Zellen enthielten, die mit den rekombinanten HVT-Stämmen infiziert waren, wurden einer Ultraschallbehandlung unterworfen, und die erhaltenen Überstände wurden gewonnen. Als Ergebnis wurden von jedem rekombinanten HVT-Stamm etwa 500 ml eines zweiwertigen Lebendimpfstoff-Konzentrats, das wirksam gegen die Mareksche Krankheit und die Newcastle-Krankheit war, erhalten. Andererseits wurden im Hinblick auf die Suspensionen, die die mit den rekombinanten MDV-Stämmen infizierten Zellen enthielten, 500 ml der einzelnen Suspensionen entnommen und als zweiwertige Lebendimpfstoff-Konzentrate verwendet. Von jedem der auf diese Weise erhaltenen Konzentrate wurden 50 ml als Probe verwendet. Die Proben wurden den nachstehend erläuterten Tests unterzogen. Der Rest der einzelnen Konzentrate wurde mit Puffer mit einem Gehalt an Stabilisator, wie er in Stufe 9 von Beispiel 1 erwähnt wurde, verdünnt, so daß der Virusgehalt auf 1000 PFU eingestellt wurde. Von jeder der auf diese Weise erhaltenen Verdünnungen wurden 5 l genommen und in 100 ml fassende Fläschchen gefüllt. Die Fläschchen wurden mit Stopfen verschlossen und bei -70ºC gelagert. Im Hinblick auf die Verdünnungen, die die rekombinanten HVT-Stämme enthielten, wurden 20 Fläschchen der Verdünnungen, die die einzelnen rekombinanten HVT-Stämme enthielten, einer Lyophilisierung unterworfen, mit Stopfen verschlossen und bei 4ºC gelagert. Aus jeder der auf diese Weise erhaltenen Gruppen von Fläschchen wurden vier Fläschchen statistisch als Proben genommen und zusammen mit den vorstehend erwähnten Lebendimpfstoff-Konzentraten den nachstehenden Tests unterzogen. Um die Kompetenz jedes der Lebendimpfstoffe, d.h. die Sicherheit, Wirksamkeit, Homogenität und Lagerstabilität, zu bewerten, wurden die Proben Tests unterzogen, die in Beziehung zu "getrockneter Lebendimpfstoff gegen die Mareksche Krankheit", "gefrorener Lebendimpfstoff gegen die Mareksche Krankheit" und "Lebendimpfstoff gegen die Newcastle-Krankheit" stehen, wie sie in den Standards on Biological Preparations for Animals (Bekanntmachung Nr. 599 des Ministers für Landwirtschaft, Forstwesen und Fischerei, Japan) vorgeschrieben sind. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Impfstoffe eine zufriedenstellende Kompetenz als zweiwertige Lebendimpfstoffe aufwiesen. Die Impfstoffe wurden klinischen Tests unterzogen, wie sie im nachstehenden Beispiel 14 beschrieben sind, und zwar als ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm HVT O1R (nachstehend als "flüssiger rHVT" bezeichnet) und als getrockneter Impfstoff mit einem Gehalt an dem gleichen Material (nachstehend als "getrockneter rHVT" bezeichnet); ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm HVT O1F (nachstehend als "flüssiger rHVT-F" bezeichnet) und ein getrockneter Impfstoff mit einem Gehalt an dem gleichen Material (nachstehend als "getrockneter rHVT-F" bezeichnet); ein flüssiger lmpfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm HVT O1MH (nachstehend als "flüssiger rHVT-MH" bezeichnet) und ein getrockneter Impfstoff mit einem Gehalt an dem gleichen Material (nachstehend als "getrockneter rHVT-MH" bezeichnet); ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm HVT O1FMH (nachstehend als "flüssiger rHVT-FMH" bezeichnet); und ein getrockneter Impfstoff mit einem Gehalt an dem gleichen Material (nachstehend als "getrockneter rHVT-FMH" bezeichnet); ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm MDV C2F (nachstehend als "flüssiger rMDV" bezeichnet); ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm MDV C2F (nachstehend als "flüssiger rMDV-F" bezeichnet); ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm MDV C2HH (nachstehend als "flüssiger rMDV-HH" bezeichnet); und ein flüssiger Impfstoff mit einem Gehalt an dem Stamm MDV C2FHH (nachstehend als "rMDV-FHH" bezeichnet).

Beispiel 14

Immunogenizität und Immunwirkung des zweiwertigen Lebendimpfstoffs mit einem Gehalt an den rekombinanten Virusstämmen:

Um die Wirksamkeit der in Beispiel 13 hergestellten Impfstoffe im Feldversuch zu bewerten, wurden klinische Tests wie folgt durchgeführt. 90 einen Tag alte SPF-Küken wurden erhalten und in fünf Gruppen eingeteilt, und zwar die Gruppen A bis D, die jeweils aus 20 Küken bestanden, und die Gruppe E, die aus 10 Küken bestand. Die Impfstoffe wurden intramuskulär in die unteren Gliedmaßen der Küken der Gruppen A bis C und der Gruppe E injiziert. Den Küken der Gruppe D wurde kein Impfstoff injiziert, um diese Küken als Kontrollen zu verwenden. Die Einzelheiten der Injektion des Impfstoffs in die Küken waren wie folgt. Der flüssige rHVT- Impfstoff wurde den Küken der Gruppe A in einer Menge von 2 ml/Küken injiziert; der getrocknete rHVT-Impfstoff wurde den Küken der Gruppe B in einer Menge von 2 ml/Küken injiziert; der flüssige rMDV-Impfstoff wurde den Küken der Gruppe C in einer Menge von 1 ml/Küken injiziert; und der flüssige Lebendimpfstoff HVT O1, der unter Verwendung des Stamms HVT O1 als Vorkulturvirus gemäß dem in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, wurde den Küken der Gruppe E in einer Menge von 2 ml/Küken injiziert. Jede Gruppe wurde von den anderen Gruppen isoliert, und die Küken wurden unter Beobachtung aufgezogen. 3 Wochen nach der Injektion der lmpf stoffe wurde Blut aus den Flügelvenen jedes Küken entnommen, so daß man eine Serumprobe von 1 ml pro Küken erhielt. Die Serumproben wurden einer Untersuchung des Antikörpertiters unterworfen, um die Immunogenizität der einzelnen Impfstoffe zu bewerten. Bei der Untersuchung auf den Antikörpertiter wurden die einzelnen Serumproben einer doppelten Verdünnung unter Verwendung von PBS, wie sie in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, unterworfen, und die Untersuchung, um zu bestimmen, ob das Serum mit den HVT- und MDV-Antigenen reagierte, wurde gemäß der indirekten fluoreszierenden Antikörpertechnik, wie sie in Stufe 10 von Beispiel 1 beschrieben wurde, durchgeführt, während die Untersuchung, um zu bestimmen, ob das Serum mit dem NDV-Antigen reagierte, gemäß dem üblichen Hämagglutinierungs-Inhibitionstest durchgeführt wurde, bei dem eine 0,5 %-ige (Vol./Vol.) Hühnererythrocytensuspension und ein Hämagglutinin des NDV-Ishii-Stamms (im Handel erhältlich von der Japanese Association of Veterinary Biologics, Japan) verwendet wurden. Der Antikörpertiter der einzelnen Impfstoffe wurde als das geometrische Mittel des maximalen Verdünnungsgrades der Proben bestimmt, das durch Berechnung der 20. (im Fall der Gruppen A bis C) oder der 10. Wurzel (im Fall der Gruppe E) des Produkts der maximalen Verdünnungsgrade der Proben erhalten wird, wobei bei der maximalen Verdünnung eine positive Reaktion bei dem vorstehenden Assay beobachtet wurde.
Ferner wurden die Küken einem Test zur Bestimmung der Immunwirkung der einzelnen Impfstoffe unterworfen, bei dem die Küken von virulenten Viren befallen wurden. Zunächst wurden die Gruppen A bis C und E, die jeweils aus 20 Küken bestanden, in Untergruppen eingeteilt, die jeweils aus 10 Küken bestanden. Die Gruppen A, B, C und E wurden also jeweils in die Untergruppen A-a und A-b, B-a und B-b, C-a und C-b sowie E-a und E-b, die jeweils aus 10 Küken bestanden, aufgeteilt. Den Küken der Untergruppen A- a, B-a, C-a und E-a, insgesamt also 40 Küken, wurde intramuskulär einzeln der virulente Virusstamm NDV SATO in einer Menge von 10 TCID&sub5;&sub0;/Küken injiziert, was einer letalen Dosis des Stammes entsprach. Im Hinblick auf die Menge stellt TCID&sub5;&sub0; die Menge dar, durch die 50 % von gezüchtetem Gewebe inf iziert wird. Andererseits wurde den Küken der Untergruppe A-b, B- b, C-b und E-b zusammen mit denen der Gruppe D, insgesamt also 50 Küken, intramuskulär einzeln der virulente Virusstamm MDV JM (im Handel erhältlich vom National Veterinary Assay Laboratory, Japan) in einer Menge von 10 PFU/Küken injiziert. Jede der Untergruppen der einzelnen Gruppen wurde von den anderen isoliert, und die mit den virulenten Viren belasteten Küken wurden unter Beobachtung aufgezogen. Im Hinblick auf die Küken, die mit dem virulenten Virusstamm NDV SATO belastet worden waren, wurde die Sterblichkeit für jede der Untergruppen zwei Wochen nach der Belastung der Küken mit dem Virus bestimmt. Andererseits wurde im Hinblick auf die Küken, die mit dem virulenten Virusstamm MDV JM belastet worden waren, die Neurovirulenz für die einzelnen Untergruppen jeder Gruppe bestimmt, und zwar fünf Wochen nach der Belastung der Küken mit dem Virus durch eine Diagnose, die auf der Basis der Untersuchung von Paralyse- und Konvulsionssymptomen, Autopsie und mikroskopischer Beobachtung pathologischer Gewebe durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse bestätigen, daß alle in Beispiel 13 hergestellten rHVT- und rMDV-Impfstoffe eine hervorragende Immunogenizität aufwiesen und eine hervorragende Wirkung hinsichtlich einer Verhinderung der Infektion zeigten.
Ferner wurden im Hinblick auf die weiteren zweiwertigen Lebendimpfstoffe, die ebenfalls im Beispiel 13 hergestellt wurden, klinische Tests durchgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurden, und die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 bis 4 gezeigt. Die Ergebnisse bestätigen, daß die vorstehend genannten weiteren zweiwertigen Lebendimpfstoffe ebenfalls eine hervorragende Immunogenizität aufwiesen und eine hervorragende Wirkung hinsichtlich einer Verhinderung von Infektionen zeigten. Tabelle 1 Belastungstest Mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppen Anzahl der untersuchten Hühner Antikörpertiter1) Virus Sterblichkeit2) Erkrankungsziffer3) flüssiges Gruppe trockenes rHVT Kontrolle (nicht geimpft)

Anmerkungen:

1) Geometrischer Mittelwert der Titer, die im Hinblick auf 20 Hühner in jeder Gruppe nach dem Hämagglutinierungs-Inhibitionstest im Fall der Verwendung von NDV und nach dem indirekten fluoreszierenden Antikörperverfahren im Fall der Verwendung von MDV erhalten wurden.
2) Die Sterblichkeit (im Fall der Verwendung von NDV) ist durch die Formel B/A angegeben, worin A die Anzahl der untersuchten Hühner und B die Anzahl der gestorbenen Hühner ist.
3) Die Erkrankungsziffer (im Fall der Verwendung von MDV) ist durch die Formel C/A angegeben, worin A die gleiche Bedeutung wie vorstehend hat und C die Anzahl der Hühner ist, die positive Läsionen der Nerven aufweisen. Tabelle 2 Belastungstest Mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppen Anzahl der untersuchten Hühner Antikörpertiter1) Virus Sterblichkeit2) Erkrankungsziffer3) flüssiges Gruppe trockenes rHVT-F Kontrolle (nicht geimpft)

Anmerkungen:

1), 2) und 3) haben die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1. Tabelle 3 Belastungstest Mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppen Anzahl der untersuchten Hühner Antikörpertiter1) Virus Sterblichkeit2) Erkrankungsziffer3) flüssiges Gruppe trockenes Kontrolle (nicht geimpft)

Anmerkungen:

1), 2) und 3) haben die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1. Tabelle 4 Belastungstest Mit Lebendimpfstoff geimpfte Gruppen Anzahl der untersuchten Hühner Antikörpertiter1) Virus Sterblichkeit2) Erkrankungsziffer3) flüssiges Gruppe trockenes rMDV-FMH flüssiges Kontrolle (nicht geimpft)

Anmerkungen:

1), 2) und 3) haben die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1.

Claims

1. Rekombinantes Marek-Krankheits-Virus, welches die genomische DNA eines attenuierten Narek-Krankheits-Virus und mindestens ein Fremdgen aus einer anderen Quelle enthält, worin das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts eines Promotors eines Glycoprotein-A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist und wobei das rekombinante Marek-Krankheits-Virus bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaft zu dem natürlichen Marek-Krankheits-Virus gleichwertig ist.

2. Rekombinantes Marek-Krankheits-Virus nach Anspruch 1, worin das Eremdgen ein Polypeptid codiert, das aus Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Enzymen, Peptidhormonen und aus Strukturproteinen, die von anderen Viren als dem Marek- Krankheits-Virus und von Chlamydien, Rickettsien, Mycoplasmen, Bakterien, Protozoen, tierischen und pflanzlichen Zellen abgeleitet sind, besteht.

3. Rekombinantes Marek-Krankheits-Virus nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das attenuierte Marek-Krankheits-Virus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Marek-Krankheits-Virus- Stamm BINEN "C2" und dem Truthahn-Herpesvirus-Stamm BIKEN "O1" besteht.

4. Multifunktioneller Lebendimpfstoff gegen die Marek-Krankheit, welches die folgenden Komponenten enthält:

eine immunogene Menge eines vermehrten rekombinanten Marek-Krankheits-Virus, welches die genomische DNA eines attenuierten Marek-Krankheits-Virus und mindestens ein Fremdgen aus einer anderen Quelle enthält, wobei das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts eines Promotors eines Glycoprotein-A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist, wobei das verfielfachte rekombinante Marek- Krankheits-Virus bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaft zu dem Marek-Krankheits-Virus gleichwertig ist und ein durch das Fremdgen codiertes Polypeptid enthält, und

mindestens ein(en) pharmazeutisch verträglichen(s) Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten.

5. Multifunktioneller Lebendimpfstoff gegen Marek-Krankheit nach Anspruch 4, worin das Eremdgen ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Enzymen, Peptidhormonen und Stukturproteinen, die von anderen Viren als dem Marek-Krankheits-Virus und von Chlamydien, Rickettsien, Mycoplasmen, Bakterien, Protozoen, tierischen und pflanzlichen Zellen, abgeleitet ist, besteht.

6. Impfstoff aus einem rekombinanten Marek-Krankheits-Virus nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, worin das attenuierte Marek-Krankheits-Virus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Marek-Krankheits-Virus-Stamm BIKEN "C2" und dem Truthahn Herpesvirus-Stamm BIKEN "O1" besteht.

. Verfahren zur Herstellung eines multifunktionellen Lebendimpfstoffes gegen die Marek-Krankheit, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Züchten eines rekombinanten Marek-Krankheits-Virus in einer Vogelzellenkultur,

wobei das rekombinante Marek-Krankheits-Virus die genomische DNA eines attenuierten Marek-Krankheits-Virus und mindestens ein Fremdgen aus einer anderen Quelle enthält, worin das Fremdgen in die genomische DNA in einem korrekten Leseraster stromabwärts eines Promotors eines Glycoprotein-A-Antigen-Gens der genomischen DNA inseriert ist und wobei das rekombinante Marek-Krankheits-Virus bezüglich seiner antigenen und immunogenen Eigenschaft zu dem natürlichen Marek-Krankheits-Virus gleichwertig ist,

wodurch das attenuierte Virus vermehrt wird und gleichzeitig das Fremdgen exprimiert wird,

(2) Isolieren des Vermehrten rekombinanten Virus aus der Vogelzellenkultur, das auch ein Polypeptid enthält, das durch Expression des Eremdgens synthetisiert wurde, und

(3) Zugabe von mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten zu dem so erhaltenen Marek-Krankheits-Virus.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Eremdgen Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, Enzymen, Peptidhormonen und Struturproteinen, die von anderen Viren als dem Marek-Krankheits-Virus und von Chlamydien, Rikkettsien, Mycoplasmen, Bakterien, Protozoen, tierischen und pflanzlichen Zellen abgeleitet sind, besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei das attenuierte Virus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Marek-Krankheits-Virus-BIKEN "C2" und dem Truthahn-Herpesvirus- Stamm BIKEN "O1" besteht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches nach Schritt (3) Lyophilisieren des so erhaltenen Gemisches umfaßt.