HUT52555A - Process for production of virus and vaccina against recombinant marek-desease - Google Patents
Process for production of virus and vaccina against recombinant marek-desease Download PDFInfo
- Publication number
- HUT52555A HUT52555A HU891319A HU131989A HUT52555A HU T52555 A HUT52555 A HU T52555A HU 891319 A HU891319 A HU 891319A HU 131989 A HU131989 A HU 131989A HU T52555 A HUT52555 A HU T52555A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antigen
- marek
- gene
- virus
- disease virus
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 3
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims abstract description 213
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 158
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 107
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 78
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 166
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 133
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 109
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 102
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 102
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 claims description 5
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 3
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 3
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 3
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 109
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 105
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 69
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 57
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 37
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 37
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 22
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 5
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- 241000700565 Swinepox virus Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- ZXUJWPHOPHHZLR-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloro-2-fluoroethane Chemical compound FCC(Cl)(Cl)Cl ZXUJWPHOPHHZLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 1
- 241000606767 Avibacterium paragallinarum Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101900264058 Escherichia coli Beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701046 Gammaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000004898 Herpes Labialis Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 201000008197 Laryngitis Diseases 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101150057093 RPS28 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OC([O-])=O.OC([O-])=O HDFXRQJQZBPDLF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
rekombináns marek-betegség vírus és vakcina Jfi
The Research Foundation fór Microbial Diseases of Osaka University,
Osaka, JAPÁN
Feltalálók:
ISHIKAWA Toyokazu, Kagawa-ken
MANABE Sadao, Kagawa-ken
MÓRI Chisato, Kagawa-ken
TAKAMIZAWA Akihisa, Kagawa-ken
YOSHIDA Iwao, Kagawa-ken
OSAME Juichiro, Kagawa-ken
TAKAKU Keisuke, Osaka-fu
FUKAI Konosuke, Osaka-fu JAPÁN
A bejelentés napja: 1989. 03. 20.
Elsőbbségei: 1988. 03. 20. (63-66973)
1988. 09. 14. (63-230851)
JAPÁN
66372-3529/SL
- 2 A találmány tárgya rekombináns Marek-betegség vírus.
A találmány tárgya közelebbről olyan rekombináns Marek-betegség vírus, amely egy legyengített Marek-betegség vírusból és egy idegen génből áll. A találmány szerinti rekombináns vírus egy sokoldalúan felhasználható élő vakcina hatóanyagaként felhasználható, amely vakcina nemcsak a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait, hanem az idegen gén tulajdonságait is hordozza. Mivel a találmány szerinti rekombináns vírus gazdasejtjeként nagy mennyiségben és olcsón hozzáférhető madársejt alkalmazható, a találmány szerinti rekombináns vírus ipari méretekben, kis költséggel előállítható.
A Marek-betegség egy erősen fertőző vírusos betegség, amely a nyirokmirigyeket támadja meg és főként fiatal csirkék között terjed. A betegséget a limfoid leukémiák közé sorolták, de 1961-ben Biggs elkülönítette ezt a betegséget a csirkék leukémiájától és felfedezője után Marek-betegségnek nevezte.
A Marek-betegség vírus egy burokkal ellátott DNS vírus, amely Gallid herpeszvirus 1 vagy Gallid herpeszvirus 2 néven osztályozható és a Herpesviridae család Gammaherpesvirinae alcsaládjába tartozik (Intervirology, 17, 47-51 /1982/). A vírus érett virusrészének átmérője a burokkal együtt mintegy 150-180 nanométer. A vírus egy burokból és abban található nukleokapszidból áll. A nukleokapszid szabályos okozaéder alakú és átmérője mintegy 100 nanométer. A nukleokapszid közepében gyűrűs szerkezetű és mintegy 50-60 nanométer átmérőjű nukleotid található, amely egyenes, kettős számú DNS-t • * »
- 3 Q tartalmaz, amelynek móltömege mintegy 1,0 x 10 . A vírus
12-20 hetes csirkék idegeit támadja meg és részleges bénulást, illetve görcsös vagy atoniás bénulást okoz, ami tumorhoz vezet. A Marek-betegség gyorsan terjed és a pusztulási arány különlegesen magas. Ezért a betegség nagyon nagy gazdasági kárt okoz. A betegség megelőzésére a baromfitenyésztésben mintegy 10 éve széles körben alkalmazzák a Marek-betegség vírus élő vakcináját. A Marek-betegség vírus a fluorimmunoassay, az agar gél immunodiffúzió és a vírus neutralizációs teszt (Advances in Vírus Research, 30, 225-277, Academic Press Inc., 1985 és The Herpesvirus, 1, 333-431, Plenum Press
1982) eredményei alapján a következő három szerotipusba sorolható :
I. típus:
Virulens Marek-betegség vírus törzs (továbbiakban
MDV), amely csirkékre patogén és tumorgén és különböző szimptómákat okoz, valamint az említett virulens MDV gyengített törzse, amely nem patogén és az említett virulens törzs in vitro sejttenyészetében végrehajtott mesterséges mutációval nyerhető,
II. típus:
vagy legyengült Marek-betegség vírus törzs, és
III. típus:
pulyka herpeszvirus (HVT) amely csirkékre nem patogén. A legyengített Marek-betegség vírus kifejezés valamely I. tipusu legyengített MDV törzset, II. tipusu legyengített MDV törzset vagy III. tipusu HVT törzset jelent.
1979 óta egy sor virusvektort ismertettek. Példaként említhető: Natúré 277, 108-114 /1979/ és 278, 35-40 /1979/, ahol nyúl bétaglobin előállítását ismertetik SV40 vektor felhasználásával. 1980-ban a World Health Organization (WHO) egy tanácskozáson a himlőbetegség világméretű megszüntetéséről adott hirt és javasolta a vakcinás kezelés megszüntetését, mivel a vakcina mellékhatásai néhány betegnél halált okoztak. Azóta több irányban keresik a vakcina vírus más területeken történő felhasználását. Például a vakcina vírus klónozó vektorként és kifejező vektorként használható (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 4927-4931 /1982/, és 79, 7415-7419 /1982/). A WHO egy speciális tanácsadó csoportja tervezetet javasolt a vakcina vírusból származó virusvektoron alapuló rekombináns vakcinák kutatásának elősegítésére (Natúré, 312, 299, /1984/). Azóta alapvető eredményeket értek el a különböző virusvektorok tanulmányozása terén (Vírus, 36, 1-41 /1986/ és 37.5 1-40 /1987/). Azóta felismerték, hogy idegen gének klónozó vektoraként és kifejező vektoraként alkalmazható például papillóma vírus, polióma vírus, adenovirus, vakcina virus, retrovirus, baculovirus, parvovirus, karfiol mozaikvírus és dohány mozaikvirus. Hasznos anyagoknak a fenti vírusvektorok felhasználásával történő előállítását ismertetik például a következő irodalmak:
Legyengített vakcina vírus alkalmazását ismerteti a 83 286. számú európai közrebocsátási irat (különböző antigének előállítása), a W0 84/02077 számon közzétett nemzetközi bejelentés (különböző antigének előállítása), a 61-289888 számú • · Λ >
- 5 japán közrebocsátási irat (maláriás parazita antigénjének előállítása), a 62-44178 számú japán közrebocsátási irat (hepatitisz B vírus felületi antigén előállítása), a 62-151186 számú japán közrebocsátási irat (macska leukémia vírus antigén előállítása), a 62-294 698. számú japán közrebocsátási irat (melanoma antigén előállítása), nemzetközi bejelentés 63-500003 számon közzétett japán fordítása (gamma-interferon előállítása) és nemzetközi bejelentés 63-500005 számon közzétett japán fordítása (humán interleukin-2 előállítása).
Nem patogén adenovirus vektor alkalmazását ismerteti a UO 83/02393 számon közzétett nemzetközi bejelentés (polióma vírus antigén előállítása) és a 63-12296 számú japán közrebocsátási irat (fehérjék, igy C-peptid előállítása).
Szarvasmarha rotavirus alkalmazását ismerteti a
W0 85/00184 számon közzétett nemzetközi bejelentés (humán rotavirus antigén előállítása).
1. tipusu virulens herpesz szimplex vírus vektor alkalmazását ismerteti a 61-1390 számú japán közrebocsátási irat (hepatitisz B vírus felületi antigén előállítása) és a 62-257 385 számú japán közrebocsátási irat (1. és 2. tipusu virulens herpesz szimplex vírust tartalmazó legyengített rekombináns vírus előállítása).
Retrovirusból származó hosszú terminális ismétlő (long terminál repeat, LTR) vektor alkalmazását ismerteti a nemzetközi bejelentés 61-502932 számon közzétett japán fordítása (tumorspecifikus antigén termelésének kiterjesztése) .
Legyengített varicella vírus vektor alkalmazását
ismerteti a 63-12277 számú japán közrebocsátási irat (Eppstein-Barr vírus antigén termelése).
Végül dohány mozaikvirus vektor alkalmazását ismerteti a 63-14693. számú japán közrebocsátási irat (magasabbrendü növényi sejtek transzformálása).
A fent említett technikák azonban a biológiai készítmények, igy a vakcinák termelése szempontjából még kísérleti stádiumba vannak, mivel nemcsak a termék kitermelése és tisztasága nem kielégítő, hanem a termékeknek emberekre, háziasított szárnyasokra, háziállatokra és kedvterlésből tartott állatokra gyakorolt hatása és biztonsága sincs felderítve. Ezért a szokásos virusvektorokkal előállított biológiai készítmények még nem kaptak hivatalos jóváhagyást és nem terjedtek el a gyakorlatban. A vakcina virusvektor felhasználható például egy sor hasznos anyag előállítására. A vakcina virusvektor hátránya azonban, hogy neuropatogén és ezért különböző súlyos mellékhatások veszélye áll fenn, igy például fennáll a veszélye a poszt-vakcinális agyvelőgyulladásnak. Ennek alapján a vakcina virusvektor és az általa előállított termék biztonsága bizonytalan. Megjegyezzük továbbá, hogy mivel néhány személynél és állatfajtánál már szerzett immunitás alakult ki a vakcinavirus ellen és rendelkeznek a vírus elleni vantitesttel, az idegen gént tartalmazó rekombináns vakcina vírus élő vakcinaként történő alkalmazása esetén a rekombináns vakcina vírusnak és az idegen génnek az immunizáláshoz szükséges szervezeten belüli elszaporodását gátolják, vagy teljes mértékben megszüntetik. Ezért a vakcina vírus antigén és immunogén tulajdonságaival, valamint az idegen gén tulajdonságaival rendelkező sok-
oldalú élő vakcinaként alkalmazott rekombináns vírus kívánt hatását nem lehet mindig elérni. Más szavakkal, korlátozott azon egyedek száma, amelyeknél alkalmazható a rekombináns vakcina vírus és igy az idegen gént tartalmazó rekombináns vakcina vírus hatékony élő vakcinaként nem alkalmazható minden esetben. További próbaként különböző anyagok előállítására alkalmazták a vaculovirus, például Autographa california nukleár polihedrózis vírus genomját vektorként tartalmazó rekombináns vírust, amely pikkelyes szárnyú rovarok fertőzésére alkalmas (Biotechnology, 8^, 6, 47-55 /1988/). A rekombináns bacukovirussal előállítható többek között mintegy 35-féle antigén és enzim, például a humán interferon-alfa és -béta, humán interleukin-2, a parainfluenzavirus hemmaglutinin-neuraminidáz, az influenzavírus hammaglutinin, különböző AIDS vírus antigének, a hepatitisz B vírus felületi antigén, valamint az Escherichia coli béta-galaktozidáz. A vaculovirus azonban csak néhány tipusu gazdasejtben, pontosabban rovarsejtben tenyészthető, és a termék hatása és biztonsága emberek és állatok vonatkozásában még nincs felderítve. Ezért a vektor kereskedelmi forgalomra alkalmas termékek előállítására még nem használható. További hátrány, hogy az említett rekombináns vaculovirus csak a rovarsejtekben tenyészthető, amely költséges és nagy mennyiségben nem hozzáférhető, ezért az előállított termék ipari termelése gazdaságtalan.
A fentiekből következik, hogy nem ismert olyan rekombináns vírus, amely sokoldalú élő vakcina hatóanyagának biztonságos és gazdaságos termelésére felhasználható lenne, és a szokásos rekombináns virusvektorok fenti hátrányainak kikü• · : · ··· · · ···♦ .....* ..· ··;·
- 8 szöbölése komoly szükséglet.
A találmány feladata olyan rekombináns vírus kidolgozása, amely nem rendelkezik a szokásos rekombináns vírusok fent említett hátrányaival.
Meglepő módon azt találtuk, hogy ha genom DNS-t és idegen gént tartalmazó rekombináns vírus előállításához vírusvektorként a legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét alkalmazzuk, a kapott rekombináns vírus különlegesen stabil és mentes a virulens vírus reverz mutációjának veszélyétől. Ezért a kapott rekombináns vírus biztonságos és hatékony élő vakcinaként alkalmazható, amely nemcsak a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait, hanem a vele rekombinált idegen gén tulajdonságait is hordozza. Azt találtuk továbbá, hogy a rekombináns vírus biztonságosan, biológiai kockázat nélkül előállítható. Ha a legyengített MDV-ben találhatótól eltérő antigént kódoló gént alkalmazunk az MDV genom DNS-ével rekombinálandó idegen génként, a kapott rekombináns vírus mind a legyengített MDV, mind az idegen gén antigénjét hordozza és ezért a rekombináns vírus sokoldalú élő vakcinaként alkalmazható. Ez a sokoldalú élő vakcina az említett rekombináns vírus egyszerű szaporításával előállítható. A sokoldalú élő vakcina előállítása egyszerűbb és olcsóbb, mint a szokásos sokoldalú vakcinák előállítása, mivel a szokásos sokoldalú vakcinák előállításánál különböző tipusu vírusokat egymástól függetlenül kell szaporítani. Továbbá, a rekombináns vírus tenyésztéséhez állati sejt, közelebbről elsődleges tenyészetből vagy második-ötödik altenyészetből származó madársejt alkalmaz• «
- 9 ható. Az ilyen sejtek alacsony költséggel nagy mennyiségben előállithatók. Ennek következtében, a rekombináns vírus nagy mennyiségű termelése is kis költséggel megoldható. További előny, hogy a mutagenezissel előállított sejttörzsektől vagy sejtvonalaktól eltérően a fent említett gazdasejt mentes az azonositatlan karcinogén anyagoktól és bármely egyéb káros anyagoktól. Ezért, nem kell azzal a veszéllyel számolni, hogy az előállított rekombináns vírus szennyeződésként karcinogén vagy egyéb káros anyagokat tartalmaz.
A találmány tárgya tehát uj rekombináns vírus, amely sokoldalú élő vakcina hatóanyagaként alkalmazható.
A találmány tárgya továbbá sokoldalú Marek-betegség élő vakcina, amely a fenti tipusu rekombináns vírust tartalmazza.
A találmány tárgya továbbá a fent említett tipusu rekombináns vírust tartalmazó sokoldalú Marek-betegség élő vakcina előállítására szolgáló eljárás.
Az ábrák ismertetése:
Az 1. ábra a HVT 01 törzs genom DNS-ének hasítási térképét mutatja.
A 2. ábra a HVT glikoprotein A antigénjének (továbbiakban aA antigén) kifejezésére alkalmas pSVB52-3 kifejező vektor előállításának folyamatábrája.
A 3(a)-3(k) ábrák az MDV C2 törzs és a HVT 01 törzs gA antigén génjének teljes nukleotid szekvenciáját és az általa kódolt aminosav szekvenciát mutatják.
A 4. ábra a Newcastle betegség vírus (továbbiakban
NDV) hemagglutininjét és neuraminidázát (továbbiakban HN) kódoló gén klónozásának és a gént tartalmazó pHN-1 plazmid előálli• · • ·
- 10 tásának folyamatábraja .
Az 5(a)-5(d) ábrák az NDV HN-jét kódoló szerkezeti gén teljes nukleotid szekvenciáját és az általa kódolt aminosavszekvenciát mutatja.
A 6. ábra a HVT gA antigén génjét és idegen gént tartalmazó pHVT-1 plazmid előállításának folyamatábrája, amely plazmid a találmány szerinti rekombináns virus előállításához használható .
A 7. ábra a HVT gA antigén génjét és idegen gént tartalmazó pFGH-H plazmid előállításának folyamatábrája, amely összekapcsolt fehérje előállítására alkalmas találmány szerinti rekombináns vírus előállításához használható.
A 8. ábra az MDV C2 törzs genom DNS-ének hasítási térképét mutatja.
A 9. ábra az MDV gA antigén génjének kifejezésére alkalmas pSVB-12 kifejező vektor előállításának folyamatábrája.
A 10. ábra az MDV gA antigén génjét és idegen gént tartalmazó pMDV-1 plazmid előállításának folyamatábrája, amely a találmány szerinti rekombináns vírus előállításához használható.
A 11. ábra az MDV gA antigén génjét és idegen gént tartalmazó pFGH-M plazmid előállításának folyamatábrája, amely összekapcsolt fehérje előállítására alkalmas találmány szerinti rekombináns virus előállításához használható.
A 12. ábra a pSVB52-3 plazmiddal transzformált és a HVT gA antigénjének előállítására alkalmas LLC-MK2 sejtek avidin-biotin immunofluoreszcensz technikával elvégzett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja.
·· ·· ··· • · · ·4 • · ·*♦ ·· • · · · · ·· ··-· *
A 13. ábra fürj embrió fibroblaszt (továbiakban QEF) sejtek, amelyekbe transzfekcióval HVT 01R rekombináns vírus törzset vittünk be, indirekt immunofluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti HVT gA antigén csirke antiszérumot alkalmaztunk.
A 14. ábra HVT 01R rekombináns vírus törzzsel fertőzött QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikával végzett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti NDV HN csirke antiszérumot alkalmazunk .
A 15. ábra HVT 01F rekombináns vírus törzzsel fertőzött
QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti HVT gA antigén csirke antiszérumot alkalmaztunk.
A 16. ábra HVT 01F rekombináns vírus törzzzsel fertőzött
QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti NDV HN csirke antiszérumot alkalmaztunk .
A 17. ábra HVT 01FMH rekombináns virustörzzsel fertőzött
QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti HVT gA antigén csirke antiszérumot alkalmaztunk.
·· · • · · ··· · Μ • · ·· ·
A 18. ábra HVT 01FMH rekombináns virustörzzsel fertőzött QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti NDV HN csirke antiszérumot alkalmaztunk.
A 19. ábra pBEP-22 plazmiddal transzformált és gA antigén termelésére alkalmas LLC-MI^ sejtek avidin-biotin immunogluoreszcensz technikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja.
A 20. ábra MDV C2R rekombináns vírus törzzsel fertőzött
QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensztechnikával felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti MDV gA antigén csirke antiszérumot alkalmaztunk.
A 21. ábra MDV C2R rekombináns virustörzzsel fertőzött
QEF sejtek indirekt immunofluoreszcensz technikáival felvett immunoassay vizsgálatának eredményét mutatja, amelynek során elsődleges antitestként anti NDV HN csirke antiszérumot alkalmaztunk.
• · · * · · · •· •· ······· • · 4«· • · ·4 · • · ·♦· 4 « • ·»4*44 ·· ♦· «
Marek-betegség
A találmány lényege tehát egy rekombináns vírus, amely egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, ahol az adott idegen gént az adott genom DNS-be építjük be a genom DNS-ben található legalább egy promoterhez viszonyítva lefelé található korrekt leolvasó keretbe, ahol a promoter működőképes az adott idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtbe. A találmány szerinti rekombináns Marek-betegség vírus tartalmazza a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait, valamint az idegen gén által kódolt polipeptidet.
Mint fent említettük, a találmány értelmében alkalmazott legyengített Marek-betegség vírus (MDV) lehet legyengített I tipusu MDV vagy legyengített II tipusu MDV és III tipusu pulyka herpesz vírus (HVT). Legyengített MDV-ként előnyösen kereskedelmi forgalomban lévő és Marek-betegség élő vakcina előállítására alkalmas törzset alkalmazunk, mivel az ilyen törzset biztonság és hatékonyság szempontjából ellenőrzik és az ilyen törzs alkalmazását a legtöbb ország hatóságai engedélyezik. Legyengített MDV törzsekre példaként említhető az MDV (csirke vírus) D2 törzs (Gan Monograph on Cancer Research, 10, 91-107 /1971/),a HVT (pulykavirus) 01 törzs (The Journal of Tapanese Society of Veterinary, 27 , 20-24 /1974/), és hasonló törzsek. A fenti törzsek használatát a japán Mezőgazdasági, Erdészeti és Halászati Minisztérium jóváhagyta és kereskedelmi forgalomban kapható. Az MDV 01 törszet és a HVT C2 törszet például legyengített Marek-betegség élő vakcinaként a The Research Foundation fór Microbial Diseases of Osaka University, Japán cég termeli és forgalmazza ·· · ····
• · · ··· · · • ··· · ·« ·
- 14 a BIKEN C2 törzs és BIKEN 01 törzs kereskedelmi néven.
Az MDV C2 törzs és a HVT 01 törzs hozzáférhető továbbá az European Collection of Animál Cell Cultures (ECACC), Anglia gyűjteményben a V89030814 és a V89030815 szám alatt. A találmány értelmében alkalmazott legyengített MDV nem korlátozódik a fent említett törzsekre, felhasználható bármely tetszőleges legyengített MDV törzs.
A legyengített MDV genom DNS kifejezés alatt a legyengített MDV-ben található teljes DNS-t értjük.
Idegen génként bármely, a legyengített MDV genom DNS-ével szemben exogén gén felhasználható. Példaként említhetők a polipeptidet, igy antigént, enzimet, peptidhormon és szerkezeti fehérjét kódoló gének, amelyek a legyengített Marek-betegség vírustól eltérő vírusból, klamidiából, rikettsiából, mikoplazmából, baktériumból, protozoából, állati sejtből vagy növényi sejtből származnak vagy azok termelik. Idegen génként előnyösen alkalmazhatók a védő antigént, hemagglutinint, neuraminidázt és hasonlókat kódoló gének, amelyek Ibaraki betegség vírusból, szarvasmarha vírusos hasmenés-nyálkahártya betegség vírusból, fertőző szarvasmarha orr-légcsőgyulladásvirusból, szarvasmarha egynapos láz betegség vírusból, marhavész vírusból, hét tipusu adenovirusból, rotavirusból, lóinfluenzavírusból, száj és körömfájás vírusból, sertés koleravirusból, sertés parvovirusból, madárhimlő vírusból, sertés himlővirusból, Newcastle betegség vírusból, fertőző gége-légcsőhurut vírusból, madáragy-gerincverő gyulladásvirusból, madár fertőző bronchitis vírusból, kutya fertőző adenovirusból, szopornyicavirusból, macska panleukopenia vírusból, macska leukémia vírusból, menyét bélhurut vírusból, veszettség vírusból, Aujenszky-betegség vírusból, fertőző ··
9· 9 •999 ·
• · ··· 99 ’ -*· · • · · · • 999 9 · • · ♦··· ·· 9
- 15 nyálkatömlő betegség vírusból, influenza vírusból, Haemophilus-influenza vírusból, gerincvelő szürkeállomány gyulladás vírusból, japán agyvelőgyulladás vírusból, veseszindrómás vérzéses lázvirusból, sárgaláz vírusból, citomegalovirusból, csirkehimlő vírusból, mumpsz vírusból, kanyaróvirusból, rubeolavírusból, hepatitisz B vírusból, felnőtt T-sejt leukémia vírusból, AIDS-virusból és hasonló vírusokból származnak; toxint, szerkezeti fehérjét, enzimet, védő antigént, hemagglutint, fiziológiailag aktív anyagot és hasonló anyagokat kódoló gének, amelyek patogén baktériumokból, igy Bordetella bonchiseptica, Haemophilus paragallinarum A, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagica, és más patogén baktériumból származnak és tüneti antrax, antrax, sertés orbánc, botulinum C, kolera, diftéria, tetanusz, tuberkulózis, gázos üszkösödés, tüdőgyulladás, paratifusz, tífusz és meningitisz betegségeket okoznak. A találmány értelmében alkalmazható idegen gének köre azonban nem korlátozódik a fenti felsorolásra.
A találmány értelmében legalább egy idegen gént építünk be a legyengített MDV genom DNS-ébe. Az idegen gént a legyengített MDV genom DNS-ének promoterétől számítva lefelé egy teljes leolvasó keretbe építjük be. A legyengített DMS genom DNS-ébe különböző tipusu promoterek találhatók, amelyek a genom DNS különböző tipusu génjeit szabályozzák. A legyengített MDV genom DNS-ének génjei közül 40-50 tipusu gént azonosítottak SDS-poliakrilamid gél-elektroforézisen alapuló immunkiacspásos módszerrel. Ismert, hogy ezek a gének 19 000-350 000 közötti móltömegü, különböző tipusu fehérjéket kódolnak. Az említett gének szakaszait a promoter szabályozza. Ezért az idegen ·· • ·
V
gén kifejezéséhez az említett szerkezeti gének bármelyik szakasza alkalmas az idegen gén beépítésére. A gén hatékony kifejezése érdekében azonban előnyös, ha az idegen gént az alábbi génekhez tartozó promoterhez képest lefelé építjük be: glikoprotein A antigén (gA antigén) gén, glikoprotein B antigén (továbbiakban gB antigén) gén, antigén C gén, mintegy
135 000 móltömegü DNS megkötő fehérjét kódoló gén, mintegy
000 és mintegy 92 000 móltömegü és virusspecifikus fehérjéket kódoló gén, valamint minegy 36 000, mintegy 39 000 és mintegy 44 000 móltömegü foszforilezett fehérjéket kódoló gén.
A fenti gének vonatkozásában az alábbi irodalomra hivatkozunk: Advances in Vírus Research, 30, 225-277, Academic Press Inc. /1985/.
A találmány szerinti rekombináns vírus az alábbi lépésekkel állítható elő:
a) A legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ének restrikciós enzimmel végzett hasításával kapott DNS fragmenst replikálható vektorral ligáivá első replikálható vektort képzünk.
b) Az első replikálható vektor DNS fragmensébe legalább egy idegen gén szekvenciát beépítve második replikálható vektort állítunk elő.
c) A gazdasejtbe kotranszfekció segítségével bevisszük a második replikálható vektort és a legyengített Marek-betegség vírust.
d) A kezelt gazdasejtet annyi ideig inkubáljuk, ami elegendő, hogy homológ rekombináció játszódjon le a Marek-betegség vírus genom DNS fragmensét és az idegen gént tartalmazó második replikálható vektor DNS fragmense és a legyengített Marek-betegség virus genom DNS-ének egy szakasza között, amelynek nukleotid szekvenciája homológ vagyazonos a DNS fragmenssel.
e) A sejtből izoláljuk a legyengített Marek-betegség vírust és a beépített idegen gént tartalmazó rekombináns vírust.
Az a) lépésben a legyengített MDV-ből származó DNS-fragmenst egy replikálható vektorral ligáivá első replikálható vektort képzőnk. A DNS fragmens előállításához a legyengített MDV genom DNS-ét az alábbiak szerint restrikciós enzimmel hasítjuk.
Először, a legyengített MDV teljes genom DNS-ét állítjuk elő. Ehhez eljárhatunk például úgy, hogy a legyengített MDV-t gazdasejtben, igy madársejtben tenyésztjük a szokásos módon és a sejttenyészetből izoláljuk a virusrészecskéket. Például, csirke vagy fürj embri fibroblaszt sejttenyészetet legyengített MDV-vel oltunk be. A tenyésztéssel kapott vírusfertőzött sejteket roncsoljuk, kis sebességű centrifugálással eltávolítjuk a sejttörmeléket, ultracentrifugálással extraháljuk a virusrészecskéket, sűrűség gradiens centrifugálással izoláljuk és tisztítjuk a virusrészecskéket, majd szárítjuk, így száraz virusrészecskéket kapunk. A vírus genom DN5-e a virusrészecskékbén található. Ezért a genom DNS-t elválasztjuk a virusrészecskékből és az alábbi, szokásos módon tisztítjuk. Ennek során például a DNS irreverzibilis denaturálásának elkerülése érdekében az izolálást és a tisztítást előnyösen pH = 3-10 között végezzük. A genom DNS izolálása és tisztítása a szokásos módon elvégezhető, például nátrium-klorid oldat • · · · ····« • · · · ····· ···· ··· · · · · φ alkalmazásával 100 °C hőmérsékleten az úgynevezett forró só módszerrel nátrium-dodecil-szulfát (továbbiakban SDS), nátrium-dezoxikolát (továbbiakban SDC) vagy hasonlók felhasználásával a detergens módszerrel, a fenol extrakcics módszerrel, koncentrált guanidin-hidroklorid oldat felhasználásával a guanidin-hidroklorid módszerrel, nátrium-hidroxid oldat, nátrium-karbonát-nátrium-hidrogén-karbonát puffer és hasonlók felhasználóval a mintegy pH = 10 értéken a lúgos módszerrel és hideg etanol felhasználásával az alkoholos kicsapásos módszerrel. Ezek a módszerek alkalmazhatók önmagukban vagy egymással kombinálva.
Legyengített MDV-ként bármely fent említett törzs felhasználható .
Másodszor, a genom DNS-ből DNS-fragmenst állítunk elő. A genom DNS-nek bármely DNS-fragmense felhasználható, ha ez tartalmazza a genom DNS promoterétől lefelé található szakaszt. Előnyös, ha a DNS fragmens tartalmazza a genom DNS promoterét is. A DNS-fragmenshez szükséges szakasz meghatározásához az alábbiak szerint elkészítjük a genom DNS restrikciós térképét. Először, a legyengített MDV genom DNS-éből géntárat készítünk a szokásos módon különböző restrikciós enzimek és ismert gazdavektorrendszerek, például az ATCC Catalogue of Bacteria-Phages-rDNA Vectors, 16. kiadás, 240-255, American Type Culture Collection 1985 helyen felsorolt rendszerek felhasználásával. A vektorokra példaként említhető a pGS3, a pMV, a pPBIOl plazmid. A gazdasejtre példaként említhető madársejt és emlőssejt. A legyengített MDV genom DNS-ét a vírusos DNS-fragmens előállításához előnyösen restrikciós enzimmel hasítjuk. DNS-ligáz felhasználásával a DNS-fragmenst önmagában a plazmid restrikciós • · · · · · · • · · · · · · • · ·· * enzimmel hasított helyére építjük be és igy rekombináns plazmidot kapunk. A rekombináns plazmidokat önmagukban gazdasejtekbe transzformáljuk és igy transzformánsokat kapunk. A kapott transzformánsokat egyenként tenyésztve a fent említett- DNS-fragmenseket klónozzuk és igy megkapjuk az MDV-gén-tárat. A géntár valamennyi transzformánsából a szokásos módon izoláljuk a rekombináns plazmidot és restrikciós enzimmel kezelve plazmidra és vírus DNS-fragmensre választjuk szét. A vírus DNS-fragmenst feltárjuk és agaróz gélelektroforézis segítségével meghatározzuk a móltömegét. A DNS-fragmensek móltömege alapján a géntár transzformánsait csoportokra osztjuk. Minden csoportból reprezentáns transzformáns kiónt választunk, és a kiválasztott kiónokból izoláljuk rekombináns plazmidokat. A rekombináns plazmidot restrikciós enzimmel haátjuk és a kapott részekből alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel izoláljuk a vírusos DNS fragmenst. A vírusos DNS-fragmenst például fenolextrakcióval van etanolos kicsapással tisztítjuk. A tisztított DNS fragmenst bemetszett transzláció segítségével radioizotóppal jelöljük. Mintaként a jelölt DNS-fragmenst használva a géntár transzformáns kiónjait telepesen hibridizáljuk és a pozitív kiónokat kiválogatjuk. Az izolált klónokból feltárjuk a plazmidot. A plazmidokat különböző restrikciós enzimekkel kezeljük és agaróz gél elektroforézissel vizsgáljuk. A kapott agaróz gél és az említett minta felhasználásával Southern hibridizációt hajtunk végre. A hibridizáció eredménye és az alkalmazott restrikciós enzimek típusa alapján felvesszük a legyengített MDV genom DNS-ének restrikciós térképét. Ezután a genom DNS nukleotid szekvenciáját a szokásos módon, például Maxam-Gilbert • · · ··· · · • · · · · · · • ·· ·· ·· · módszerrel és didezoxi-lánctermináló módszerrel (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74 , 5463-5467 /1977/, Analytical Biochemistry 152, 232-238 /1986/) módszerrel meghatározzuk. A restrikciós térkép és a genom DNS nukleotid szekvenciája alapján meghatározzuk a genom DNS-ből kivágandó és a replikálható vektor ligálásához alkalmazott DNS fragmensnek megfelelő szakaszt. Az idegen gén biztos kifejezéséhez előnyösen a legyengített MDV genom DNS-ének promoterét tartalmazó DNS-fragmenst alkalmazunk. Különösen előnyös, ha a gén kifejezés szempontjából hatékony promotert, például a gA antigén promoterét, a gB antigén génpromoterét, az antigén C gént, mintegy 135 000 móltömegü DNS kötő fehérjét kódoló gént, mintegy 86 000 és mintegy 92 000 móltömegü fő virusspecifikus fehérjéket kódoló gént vagy mintegy 36 000, mintegy 39 000 és mintegy 44 000 móltömegü foszforilezett fehérjéket kódoló gént alkalmazunk. A legyengített Marek-virus genom DNS-ének megfelelő szakaszát tartalmazó DNS szakasz kivágásához a megfelelő restrikciós enzim felhasználásával bármely szokásos módszer felhasználható. Eljárhatunk úgy is, hogy a kivánt szakaszt tartalmazó DNS -fragmenst a fent említett géntárból állítjuk elő az alábbiak szerint. Vagyis a kivánt DNS-fragmenst tartalmazó rekombináns plazmidot tartalmazó transzormánst kiválogatjuk a géntárból és tenyésztjük. A tenyésztett transzformánsból kiexsztraháljuk a rekombináns plazmidot és megfelelő restrikciós enzimmel hasítjuk. A kapott részekből alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel a fent említett módon kiválogatjuk a kivánt DNS-fragmenst.
A kapott DNS-fragmenst DNS-ligáz felhasználásával a szokásos módon valamely kereskedelmi forgalomban lévő replikálható • · · ······ • ·· · · · · · a ···· ··· ·· tt « vektorból ligáivá előállítjuk az első replikálható vektort. Replikálható vektorként olyan vektor alkalmazható, amely a legyengített Marek-betegség vírus gazdasejtjébe, igy madársejtbe transzfekcióval bevihető. Az alkalmazható vektorok felsorolása megtalálható az ATCC Catalogue of Bacteria Phages rDNA Vectors, 16. kiadás, 240-255, American Type Culture Collection, 1985 helyen. Replikálható vektorként előnyösen ugyanazt a vektort alkalmazzuk, mint a legyengített MDV genom DNS-éhez tartozó géntár előállítása során, ilyen például a pGS3, a pMV és a pPBIOl plazmid.
Az igy előállított első replikáié vektort gazdasejtbe visszük be és igy transzformánst kapunk. A tran^formánst tenyésztve elszaporitjuk a replikáié vektort. A tenyésztett transzformánsból a replikáié vektort a fent említett módon extraháljuk. Ezután, az extrahált replikáié vektort szervetlen sóval, igy kalcium-foszfáttal együtt kicsapjuk. A kapott csapadékot magasrendü állati sejtbe, igy emlős sejtbe vagy madársejtbe visszük be transzfekció segítségével. A kapott sejtet tenyésztjük és például immunocitokemikális módszerrel, igy kereskedelmi fluoreszcensz antitest, például másodlagos antitest felhasználásával végzett immunofluoreszcensz módszerrel vagy telephibridizációs módszerrel vizsgálva ellenőrizzük, hogy az első replikáié vektor tartalmazza-e a kívánt DNS-fragmenst.
A b) lépésben az első replikáié vektor DNS-fragmensében legalább egy idegen génszekvenciát építünk be és igy második replikáló vektort kapunk. Idegen génként bármely, fent említett idegen gén alkalmazható. Az idegen gén kifejezéséhez a gént a DNS-fragmens olyan szakaszára építjük be, hogy az idegen gént tartalmazó DNS-fragmens és a később tárgyalásra kerülő legyengített Marek-betegség vírus genom DNS szakasza közötti homológ rekombináció után az idegen gén a genom DNS legalább egy promoterétől számítva lefelé egy teljes leolvasó kereten belül épüljön be a genom DNS-be, ahol a promoter működőképes az idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben.
Az első replikáló vektorba beépítendő idegen gént a legyengített MDV-től exogén genomból állítjuk elő lényegében a legyengített MDV genom DNS-éből előállított DNS-fragmens fent leírt előállítási módjával analóg eljárással. Ha az exogén genom RNS-t tartalmaz, valamely kereskedelmi reverz transzkriptázzal a szokásos módon a genommal komplementer DNS-t állítunk elő. AZ idegen génnek az első replikáló vektorba történő megfelelő beépítéséhez célszerűen elkészítjük az idegen gén restrikciós térképét és meghatározzuk a nukleotid szekvenciát. A restrikciós térkép elkészítése és a nukleotid szekvencia meghatározása a fent ismertetett módon elvégezhető.
Az idegen gén az első replikáló vektorba a szokásos módon beépíthető. Eljárhatunk például úgy, hogy az első replikáló vektort megfelelő restrikciós enzimmel hasítjuk és az idegen gént DNS-ligázzal az első replikáló vektor hasítási helyére ligáljuk és igy megkapjuk a második replikáló vektort. A kapott vektorral gazdasejtet transzformálunk. A kapott transzformánt tenyésztve elszaporitjuk a második replikáló vektort. Ha például az első replikáló vektor olyan DNS-fragmenst tartalmaz, amely magában foglalja a legyengített MDV szerkezeti génjét és annak promoterét, az idegen gén a promotertől lefelé és a szerkezeti gén kezdő kódjától felfelé építhető be a DNS fragmensbe úgy, hogy az idegen gén által kódolt polipeptid a gén kifejezése során a szerkezeti gén által kódolt fehérjétől függetlenül termelődjön. Eljárhatunk úgy is, hogy az idegen gént a DNS-fragmensnek a szerkezeti génen belüli szakaszába építjük be úgy, hogy az idegen gén által kódolt polipeptidből és a szerkezeti gén által kódolt fehérjéből álló egyesült fehérje termelődjön.
A c) lépésben a második replikáié vektort és a legyengített Marek-betegség vírust (MDV) kótranszfekció segítségével bevisszük a gazdasejtbe.
Legyengített MDV-ként alkalmazható ugyanaz a törzs, amelyet az első replikáló vektor DNS-fragmensének előállításához használtuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a DNS-fragmens előállításához alkalmazott törzstől eltérő törzset használunk.
A kótranszfekcióhoz bármely olyan sejt felhasználható, amelyben a legyengített MDV szaporodásra képes. Mivel azonban az MDV erősen fertőzi a madársejteket, gazdasejtként előnyösen egészséges madártól vagy specifikus patogénmentes (SPF) madártól származó sejteket alkalmazunk. Előnyösen alkalmazható például SPF csirkéből származó embrióiibroblaszt vagy embrió vesesejt,pulykaembrio fibroblaszt sejt, fürje embrió fibroblaszt sejt és más hasonló sejt elsődleges sejttenyészete vagy ebből nyert 2-5-ödik altenyészet.
A kótranszfekció a szokásos módon elvégezhető. A legyengített MDV-t és a b) lépés során szervetlen sóval kapott második replikáló vektor csapadékot a gazdasejt tenyészetére inokuláljuk és igy legyengített MDV-vel és a második replikáló vektorral kiegészített gazdasejtet kapunk.
·· · ·· ·· ·
A d) lépésben a kezelt sejtet annyi ideig inkubáljuk, hogy homológ rekombináció játszódjon le a második replikáié vektornak a Marek-betegség vírus genom DNS-fragmensét és az idegen gént tartalmazó DNS-fragmense és a legyengített MDV genom DNS-ének egy szakasza között, amely szakasznak a nukleotid szekvenciája a DNS-fragmensével homológ vagy azonos.
Az inkubálás a szokásos módon a kereskedelmi tápközeggel mintegy 30-39 °C közötti hőmérsékleten mintegy 15-30 óra alatt elvégezhető.
Az e) lépésben a legyengített MDV-t és a beépített idegen gént tartalmazó rekombináns vírust izoláljuk a sejttenyészettől.
A d) lépésben kezelt sejtek inkubálása után a tápközeget eldobjuk. A sejteket hozzátapasztjuk a tenyészedény belső felületéhez. Ezután agarózt tartalmazó friss tápközeggel árasztjuk el a sejteket, majd mintegy 30-39 °C közötti hőmérsékleten mintegy 1-3 napon keresztül inkubálva foltokat képzünk. A foltokat egy darabka agaróz géllel együtt például parafa fúró segítségével összegyűjtjük és szokásos membrán szűrőre visszük. A szűrő denaturáljuk, semlegesítjük és az immobilizált foltokat hőkezeljük. A kapott szűrőt a szokásos módon folthibridizációval vizsgáljuk, amelynek során mintaként bemetszett transzláció segítségével radioizotoppal jelölt idegen gén másolatát alkalmazzuk. Pozitívnak tekintjük a mintával hibridizáló foltot. A szűrőn lévő pozitív folttal azonos foltot tartalmazó agaróz gélből kiextraháljuk a rekombináns vírust.
* ·
·« · *·· · · • · · · · ·· · ·· • · · ···· ·
- 25 Megvizsgáljuk, hogy a kapott rekombináns vírus
Marek-betegség vírus antigén gének mellett képes-e az idegen gén kifejezésére is. A vizsgálat elvégezhető például enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) segítségével, fluoreszcensz antitest technikával vagy más hasonló módon. Az a tény, hnny a rekombináns vírus élő vakcinaként hatékonyan és biztonságosan felhasználható-e, egy sor szokásos módon vizsgálható, ilyen például az immunoassay, a virusvizsgálat, a genetikus vizsgálat és a szövettani vizsgálat. Ezeket a vizsgálatokat ismerteti például a Standards fór Veterinary Biologics (Mezőgazdasági, Erdészeti és Halászati Minisztérium, Japán,
599. számú feljegyzés).
A kapott rekombináns vírus általában nagy mennyiségben elszaporitható, ha transzfekcióval a fent említett gazdasejtbe bevisszük és a gazdasejtet mintegy 33-39 °C hőmérsékleten a szokásos tápközegben, igy M199 tápközegben (Difco Laboratories, USA) vagy Eagle's MÉM tápközegben (Nissui Pharmaceutical Co., LTD., Japán) tenyésztjük. A gazdasejt tenyésztésére felhasználható a statikus tenyésztés, a forgó-rázó tenyésztés, a tanktenyésztés és bármely más szokásos tenyésztési eljárás.
A találmány szerinti rekombináns vírus sokoldalú Marek-betegség élő vakcina hatóanyagaként alkalmazható. A találmány oltalmi körébe tartozik a sokoldalú Marek-betegség élő vakcina, amelynek összetétele:
rekombináns Marek-betegség vírus immunogén mennyisége, amely egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, ahol az idegen gén a genom DNS legalább egy promoteréhez képest lefelé, egy teljes leolvasókereten belül épül be a genom DNS-be, ahol a promoter az idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben működőképes és ahol a rekombináns Marek-betegség vírus a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait mutatja és az idegen gén által kódolt polipeptidet tartalmazza, legalább egy, gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyag, higitóanyag vagy segédanyag. , ,
A sokoldalú kifejezés azt jelenti, hogy a találmány szerinti rekombináns vírus a legyengített MDV antigén és immunogén tulajdonságai mellett az idegen gén által kódolt polipeptid javára irható funkcióval is rendelkezik. Például, ha az idegen gén a beépítésére alkalmazott, legyengített MDV-től eltérő Marek-betegség vírus törzs antigénjét kódolja, a találmány szerinti sokoldalú élő vakcina polivalens vakcinaként működik.
Ha az idegen gén a legyengített MDV-től eltérő fajhoz tartozó vírus antigénjét kódolja, a találmány szerinti sokoldalú élő vakcina a szokásos vegyes vakcinaként működik. Továbbá, ha az idegen gén a vakcina immunogén tulajdonságát segítő szerkezeti fehérjét kódol, a találmány szerinti sokoldalú vakcina fokozott hatású vakcinaként működik. A találmány szerinti sokoldalú Marek-betegség élő vakcina megfelelő tartóedénybe, igy fiolába vagy ampullába tölthető és lepecsételhető. Gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagként, higitóanyagként vagy segédanyagként alkalmazható sterilizált izotoniás oldat, igy fiziológiás sóoldat és foszfát puffer. A kapott vakcina szuszpenziót képez. Ebben az esetben a szuszpenzió stabilizálására előnyösen peptont, aminosavat, szaccharidot vagy hasonló anyagot alkalmazunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a rekombináns vírust liofilizált formában töltjük a tartóedénybe.
A találmány tárgya továbbá eljárás sokoldalú Marek-betegség élő vakcina előállítására, olymódon, hogy (1) rekombináns Marek-betegség vírust madársejt tenyészetben tenyésztünk, ahol a rekombináns Marek-betegség vírus egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, ahol az idegen gén a genom DNS legalább egy promoterétől lefelé, egy teljes leolvasókereten belül épül be a genom DNS-be, ahol a promoter az idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben működőképes, és a rekombináns Marek-betegség vírus a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait hordozza és az idegen gén által kódolt polipeptidet tartalmazza, (2) az elszaporitott rekombináns Marek-betegség vírust izoláljuk madársejt-tenyészetből és (3) a kapott rekombináns Marek-betegség vírust legalább egy gyógyászati hordozóanyaggal, higitószerrel vagy segédanyaggal keverjük.
A találmány szerinti rekombináns Marek-betegség vírusnak madársejt tenyészetben történő tenyésztését a szokásos módon végezzük. Az elszaporitott rekombináns Marek-betegség vírusnak a madársejt tenyészetből történő izolálását a szokásos módon végezzük. Az izolált rekombináns vírushoz legalább egy, fent említett gyógyszerészeti hordozóanyagot, higitószert vagy segédanyagot adunk. A kapott vakcina szuszpenzió formájú. Ki• · • · ·· · ···· · • · ··· · · • · · ···· • ·« ♦· « vánt esetben a szuszpenzió liofilizált vakcinává liofilizálható.
A vakcinát általában szuszpenzió formájában adagoljuk.
Ezért, ha a találmány szerinti rekombináns vírus liofilizált formában található, adagolás előtt a fent említett sterilizált izotóniás oldattal szuszpenzióvá alakítjuk. A találmány szerinti rekombináns vírus koncentrációja az adagolásra alkalmas vakcinában általában 10-10 000 foltképző egység (PFU) 1 ml-re számolva. A vakcinát általában szubkután vagy intramuszkulárisan adagoljuk. A vakcina dózisa felnőtt egyedeknél általában 0,1-5,0 ml. A vakcinát általában kétszer mintegy egy hét és egy hónap közötti időintervallumban, majd ezután mintegy egy év elteltével ismételten adagoljuk.
A találmány szerinti rekombináns vírus immunológiai diagnosztizálószerként is alkalmazható bármely Marek-betegség vírus és az idegen gén forrásául alkalmazott vírus általi fertőzés kimutatására. így például a találmány szerinti rekombinás vírus felhasználható az ELISA vizsgálatban, a hemagglutinációs vizsgálatban, a passzív hemaglutinációs vizsgálatban, a kiegészítő fixált vizsgálatban és bármely más olyan vizsgálatban, amelyeknél a rekombináns vírust fluoreszcensz festékanyaggal, enzimmel vagy radioizotóppal jelölik. A találmány szerinti rekombináns vírus a következő előnyökkel rendelkezik: (1) Ha a vírus vektorként alkalmazott legyengített MDV törzstől eltérő törzshöz vagy fajhoz tartozó vírusból származó gén egy antigént kódol, a kapott vírus nemcsak a legyengített MDV törzs antigén és immunogén tulajdonságait, hanem az eltérő ·· • 9
9999 törzsbe vagy fajba tartozó vírus antigén és immunogén tulajdonságait is hordozza. Ezért a rekombináns vírus előnyösen alkalmazható sokoldalú vakcina hatóanyagaként.
(2) A találmány értelmében a vírus vektorként alkalmazott legyengített MDV egy nem patogén legyengített törzs, amely genetikusán stabil. Ezért a találmány szerinti rekombináns vírus különösen stabil és mentes a patogén és virulens vírus reverz mutációval történő képződésének veszélyétől. Ezért a rekombináns vírus nagy biztonsággal alkalmazható élő vakcinaként.
(3) Az idegen gén a legyengített MDV genom DNS-ébe a genom DNS promoterétől lefelé, egy teljes leolvasókereten belül épül be. Ezért az idegen gén hatékonyan kifejezhető anélkül, hogy károsan befolyásolná a legyengített MDV génjeinek kifejezését.
(4) A találmány értelmében nem alkalmazunk exogén promotert, csak a legyengített MDV promoterét. Ezért az idegen gén kifejezésére alkalmazott promoter teljes mértékben kompatibilis a rekombináns vírus szaporítására alkalmazott gazdasejttel vagy a rekombináns vírussal élő vakcinaként inokulált anyaggal. Közelebbről, a találmány értelmében a rekombináns vírus legkompatibilisabb gazdasejtje egy madársejt vagy test, ezért ha az idegen gén madársejtre nézve fertőző vírusból származik, a rekombináns vírusnak a gazdával szemben mutatott kompatibilitása tovább nő, és lehetővé teszi a találmány szerinti rekombináns vírus génjének hatékony kifejezését.
(5) A legyengített MDV genom DNS-ének promotereként, amelytől lefelé be van építve az idegen gén, olyan promotert alkalmazunk, amely elősegíti a találmány értelmében alkalmazott gén kifejeését. Ezért a legyengített MDV genom DNS-ébe beépített idegen gén kifejezése hatékonyabban megvalósítható a legyengített MDV • · · · ····· • ··· ····· • · · · ··· · · ·· · génjének kifejezésével együtt.
(6) A rekombináns virus szaporításához alkalmazható gazdasejt egy madrásejt elsődleges tenyészete vagy ennek altenyészetei, amely könnyen és alacsony költséggel előállítható. Ezért a találmány szerinti rekombináns virus alacsony költséggel, nagy mennyiségben termelhető, ami fokozza a kívánt sokoldalú élő vakcina termelékenységét.
(7) Az alkalmazott gazdasejt lényegében veszélytelen, nem tartalmaz káros anyagokból vagy karcinogén anyagokból álló szennyeződést. Ezért a találmány értelmében biztonságos élő vakcina termelhető.
(8) Mint fent említettük, a találmány szerinti rekombináns virus önmagában sokoldalú élő vakcina hatóanyagaként alkalmazható. Ez azt jelenti, hogy polivalens vagy sokoldalú élő vakcina nyerhető, úgy, hogy csak a találmány szerinti rekombináns vírust tenyésztjük, amely a polivalens vagy sokoldalú élő vakcinák előállitásáthoz ismert módszerhez képest egyszerűbb és olcsóbb, mivel az ismert eljárásoknál egy sor különböző törzsbe vagy fajba tartozó vírust kell egymástól külön tenyészteni, majd végül összekeverni.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna .
1. referencia példa
Foszfát puffer oldat előállítása
Foszfát puffer oldatot (továbbiakban PBS) állítunk elő úgy, hogy egy I alapoldatot, amely 8,0 g/1 nátrium-kloridot, 0,2 g/1 kálium-kloridot és 1/75 mól/1 dinátrium-hidrogén-foszfátot tartalmaz, II alapoldattal keverünk, amely 8,0 g/1 nátrium-kloridot, 0,2 g/1 kálium-kloridot és 1/75 mól/1 kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, olyan térfogatarányban, hogy a kapott keverék a kivánt pH értéket mutassa.
2. referencia példa
Tripszin oldat előállítása
2,5 g tripszin l_250-et (Difco Co., USA) 1/75 mól/1
PBS oldatban (pH = 7,2) oldunk úgy, hogy a kapott oldat ossz térfogata elérje az 1 litert. A kapott oldatot membránszürőn szűrve sterilizáljuk.
3. referencia példa
Triszpuffer oldat előállítása
121,14 g trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt (továbbiakban trisz) 800 ml desztillált vízben oldunk és a kapott oldathoz cseppenként koncentrált sósavat adunk és igy a pH értéket a kivánt értékre állítjuk. Ezután az oldat térfogatát desztillált vízzel 1 literre kiegészítjük, és igy 1 mól/1 koncentrációjú trisz-puffer oldatot kapunk. A kapott oldatot desztillált vízzel a kivánt koncentrációra hígítjuk. A trisz-puffer oldatot a továbbiakban a Trisz-HCl rövidítéssel jelöljük.
4. referencia példa
HVT 01 törzs tenyésztése
A HVT 01 törzset a szokásos módon tenyésztjük. 7 darab fürjtojást 9 napon keresztül inkubálunk, majd a fürj embrió fibroblaszt sejteket (a továbbiakban QEF) a 2. referenciapélda szerint előállított tripszin oldattal emésztjük és igy embrió fibroblaszt szuszpenziót kapunk. A szuszpenziót 1000 fordulat mellett 5 percen keresztül centrifugálva összegyűjtjük a QEF sejteket. Az összegyűjtött sejteket tárolóközegben, igy Eagle MÉM közegben (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., japán) szuszpendáljuk, amely 5 térfogat% borjuszérumot tartalmaz.A szuszpenzió végső térfogata 500 ml és sejtkoncentrációja 2 x 10^ sejt/ml. 100-100 ml QEF szuszpenziót 5 darab 1 liter térfogatú Roux edénybe öntünk. Minden edényt 1 ml HVT 01 törzszsel fertőzött sejtszuszpenzióval inokuláljuk, ahol a vírusfertőzés mértéke 1,0 x 10^ PFU/ml. Az edényeket gumidugóval lezárjuk és inkubátorban 2 napon keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálást akkor fejezzük be, amikor mikroszkóppal megállapítható, hogy a citopatikus hatás mértéke, vagyis az óriássejteknek az egyrétegű sejtekhez mért aránya eléri a 90 Vöt. Ezután a tenyészközeget kiöntjük az edényből és a maradékhoz 100 ml 1/75 mól/1 PBS (pH = 7,4) oldatot öntünk és az edényeket óvatosan rázva kimossuk az edény’ belső falára telepedett egyrétegű fertőzött sejteket. A mosást háromszor megismételjük. Ezután 20 ml 1/75 mól/1 PBS oldatot (pH = 7,4) öntünk minden edénybe és az edények belső falára telepedett fertőzött sejteket a PBS oldatban szuszpendáljuk. A kapott fertőzött sejtszuszpenziót összegyűjtjük és 2000 fordulat • · · · ····« • ·· · ····» ···· ··· ·« «« «
- 33 mellett 10 percen keresztül centrifugáljuk. A felüluszót eltávolítjuk és az üledéket összegyűjtjük. Az üledéket (mintegy 1 ml), amely a HVT genom DNS előállításához felhasználható, -70 °C hőmérsékleten hűtőszekrényben tároljuk.
5. referencia példa
MDV C2 törzs tenyésztése
Lényegében a 4. referenciapéldában leirt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy HVT 01 törzs helyett MDV C2 törzset alkalmazunk és igy MDV-vel fertőzött QEF sejteket tartalmazó üledéket kapunk. AZ üledéket, amely az MDV genom DNS előállításához felhasználható, hűtőszekrényben tároljuk.
1. példa
1. lépés: HVT genom DNS előállítása
A 4. referencia példa szerint előállított HVT-vel fertőzött QEF sejtekhez 20 ml ΤΕΝ^θ oldatot (10 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 1 mmól/1 dinátrium-etilén-diamin-tetraacetát, továbbiakban Na2~EDTA, és 50 mmól/1 nátrium-klorid) , majd 5 percen keresztül kevertetjük. Ezután a kapott szuszpenzióhoz 20 ml 2 x sejtroncsoló oldatot (100 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 7,2 mmól/1 kálcium-klorid, 250 mmól/1 kálium-klorid, 1 mmól/1 Na2~EDTA, 1 vegyes% nátrium-dezoxi-kolát és 1 vegyes% Honidét P-40, Sigma Chemical Co., USA), 500 mikrogramm DNase I-et (Takara Shuzo Co., Ltd., Japán) és 1 mg RNase A-t (Sigma Chemical Co., USA) adunk. A kapott elegyet 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 20 ml triklór-fluor-etánt adunk hozzá és intenziven rázzuk. Ezután 4 °C hőmérsékleten 1500 fordulat mellett 10 percen keresztül centrifugáljuk.
A felüluszót összegyűjtjük és 5-40 tömeg% sürüség-gradiensü glicerolra visszük és 4 °C hőmérsékleten 27 000 fordulat mellett ultracentrifugáljuk (Model 55P, rotorszám RPS-28, Hitachi Ltd., Japán) és igy kicsapjuk a nukleokapszidot. A felüluszót Pasteur pipettával óvatosan eltávolítjuk és a kicsapott nukleokapszidhoz 200 mikroliter 1 x sejtroncsoló oldatot (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 3,6 mól/1 kalcium-klorid, 125 mmól/1 kálium-klorid, 0,5 mmól/1 Na2-EDTA, 0,5 vegyes% nátrium-dezoxi-kolát és 0,5 vegyest Nonidet P-40) és a kapott elegyet 5 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten kevertetjük. A szuszpenziót Eppendorf csőbe (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, NSZK) töltjük és hozzáadunk 200 mikroliter 10 mg/ml koncentrációjú proteináz K oldatot (Sigma Chemical Co., USA) és 600 mikroliter 2 x STE oldatot (100 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 200 mmól/1 Na2~EDTA és 2 vegyes% nátrium-dodecil-szulfát) . A reakcióelegyet 30 percen keresztül 65 °C hőmérsékleten tartjuk, majd azonos térfogatú vízzel telitett fenollal és kétszer oldószereleggyel (fenol/kloroform/izoamil-alkohol 25:24:1) extraháljuk. A vizes fázist Összegyűjtjük és kétszeres térfogatú hideg etanollal hígítjuk. Az elegyet -20 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül állni hagyjuk és igy kicsapjuk a DNS-t. Az elegyet centrifugáljuk, majd a DNS-t szárítjuk. A száraz DNS-t 500 mikroliter TE oldatban (10 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 8,0 és 1 mmól/1 Na2“EDTA) szuszpendálva HVT genom DNS szuszpenziót kapunk.
2. lépés: A restrikciós enzimmel hasított HVT genom DNS fragmens klónozása és a géntár előállítása
Ebben a lépésben a fent előállított HVT genom DNS-t BamHI, HindlII és PstI restrikciós enzimekkel hasítjuk és a kapott DNS fragmenseket pHC79 kozmid (BRL Inc., USA) segítségével klónozzuk.
mikrogramm fent előállított HVT genom DNS-t mikroliter 1 x RM oldattal (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 1 mmól/1 ditio-treitol - továbbiakban DTT - és 100 mmól/1 nátrium-klorid), amely 10 egység BamHI restrikciós enzimet (Nippon Gene Co., Japán) tartalmaz, hasítjuk. Ettől külön, 100 mg pHC79-et 50 mikroliter fenti összetételű oldatban BamHI segítségével teljesen emésztünk. A két reakcióelegyet a fent megadott módon fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. így HVT genom DNS fragmenseket • · « « ···«· • ·· · ····· • · · · «·· ·· ·« · és kozmid fragmenst kapunk. A kapott HVT genom DNS-fragmenseket és kozmid fragmenst 10:1 tömegarányban összekeverjük és a kapott elegyet 10 mikroliter 60 mmól/1 Trisz-HCl (pH = 7,6), 6,6 mmól/1 magnézium-klorid, 10 mmól/1 DTT, 1 mmól/1 ATP és 100 egység T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd., japán) tartalmú oldatban 2 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten tartjuk és igy a HVT genom DNS fragmenseket egyenként a pHC79 kozmid fragmens BamHI helyére ligáljuk és igy rekombináns plazmidot kapunk.
A fenti rekombináns plazmidot befogadó sejtként E. coli DH5 törzsbe (BRL Inc., USA) visszük be.
Az E. coli DH5 törzset rázókulturában egy éjszakán keresztül 30 °C hőmérsékleten 10 ml 2 közegben (0,5 vegyes% baktoélesztő extraktum, 2 vegyes% baktotripton és 0,5 vegyes% magnézium-szulfát) tenyésztjük. Ezután 1 ml tenyészetet 2 közeggel 100-szorosra hígítunk és rázókulturában 30 °C hőmérsékleten 550 nanométernél mért OD^^g = 0,48 optikai sűrűségig tenyésztjük. Ezután a tenyészetet jeges vízben 10 percen keresztül hütjük, majd 5000 fordulat mellett 10 percen keresztül centrifugáljuk. Az összegyűjtött sejteket 10 ml I transzformációs oldattal (30 mmól/1 kálium-acetát, 100 mmól/1 rubidium-klorid, 10 mmól/1 kalciumklorid és 15 vegyest glicerol) hígítjuk és igy sejtszuszpenziót kapunk. A szuszpenziót 10 percen keresztül jeges vízben hütjük, majd 5000 fordulat mellett percen keresztül centrifugáljuk. Az összegyűjtött sejteket 1 ml II transzformációs oldatban (10 mmól/1 piperidiri-N , N ' -bisz(2-etán-szulfonsav) /továbbiakban PIPES/, Dojindo Laboratories, japán, 75 mmól/1 kalcium-klorid, 10 mmól/1 rubidium-klorid és 15 vegyes% glicerol) szuszpendáljuk és a szuszpenziót • · • · • · · · ···«· • · · · ····· ··»· ··· ·· · · ·
- 37 200 mikroliteres részletekre osztva Eppendorf csövekbe töltjük és -70 °C hőmérsékleten tároljuk.
200 mikroliter fenti szuszpenziót felolvasztunk és mikroliter rekombináns plazmiddal keverjük és az elegyet percen keresztül 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd 2 percen keresztül 42 °C hőmérsékleten hőkezeljük. Ezután 800 mikroliter 0 közeggel hígítjuk és 60 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és L agar lemezre (1 vegyes% baktotripton, 0,5 vegyes% nátrium-klorid, 0,5 vegyes% élesztő extraktum, 1,5 vegyes% agar és mikrogramm/ml ampicillin) inokulálva egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk és igy transzformáns telepeket kapunk. Az egyes telepeket 25 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó L agar lemezre és 10 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmazó L agar lemezre visszük és a lemezeket egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Mivel a hasított HVT genom DNS-t tartalmazó transzformánsok ampicillinre rezisztensek, de tetraciklinre érzékenyek, összegyűjtjük azokat a telepeket, amelyek ampicillinre rezisztensek és tetraciklinre érzékenyek. Az igy kapott telepek a HVT genom DNS BamHI tárját képezik.
A fenti eljárást lényegében változatlan módon megismételjük azzal a különbséggel, hogy BamHI helyett HindlII, illetve PstI restrikciós enzimet kapunk és igy előállítjuk a HVT genom DNS HindlII tárját és a HVT genom DNS PstI tárját, amikoris a PstI alkalmazása esetén a kívánt transzformánsokat ampicillin érzékenység és tetraciklin rezisztencia alapján válogatjuk ki.
3. lépés; A HVT genom DNS restrikciós térképének elkészítése
A HVT genom DNS restrikciós térképét telephibridizációs módszerrel (Manual fór Genetic Engineering, 51-54 /1982/, Kodansha Scientific) és Southern folthibridizációs módszerrel (Molecular Cloning 382 /389/, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory) vesszük fel. Ennek során a 2. lépésben kapott BamHI tár 1128 kiónjából lúgos extrakcióval (Molecular Cloning 368-369) egyenként extraháljuk a plazmid DNS-t, majd BamHI restrikciós enzimmel teljesen emésztjük. A fragmensek mobilitását agaróz gél elektroforézissel határozzuk meg. A mozgékonyság alapján számoljuk a fragmensek móltömegét. Emellett, a plazmid DNS-t HindlII és PstI restrikciós enzimekkel is hasítjuk és a fragmenseket a fentiekei analóg módon agaróz gél elektroforézissel vizsgáljuk. így. mindhárom restrikciós enzimre meghatározzuk a hasítási mintákat. Az eredmények alapján a BamHI tár kiónjait az azonos hasítási mintát mutató kiónok alapján csoportokra osztjuk. Az igy osztályozott csoportokból kiválogatjuk a jellemző kiónokat. A kiválogatott kiónokat egyenként BamHI enzimmel hasítjuk és alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel összegyűjtjük a HVT genom DNS klónozott DNS fragmenseit. Az igy kapott DNS fragmenseket lényegében az egylépésben megadott módon fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk. A tisztított DNS fragmenseket bemetszéses transzlációs módszerrel (Manual fór Genetic
2
Engineering, 83-86) P-dCTP-vel jelöljük. Az igy kapott
P-vel jelölt DNS fragmenseket mintaként alkalmazva telephibridizációs vizsgálatot végzünk a 2 lépésben előálitott HindlII tár és PstI tár alapján. A mintával hibridizáló pozitív telepekből a fent említett lúgos extrakciós módszerrel ·♦ · izoláljuk a plazmid DNS-t. Az extrahált DNS-t az 1. ábrán megadott módon különböző restrikciós enzimekkel hasítjuk és agaróz gél elektroforézissel vizsgáljuk. A kapott gélen Southern hibridizálást hajtunk végre. A hibridizálás eredményei alapján felvesszük a HVT genom DNS restrikciós térképét. Az eredményeket az 1. ábra mutatja. Az 1. ábrában a felső sor a HVT 01 törzs genom DNS-ének vázlatos szerkezetét mutatja. Az 1. ábrában alkalmazott rövidítések jelentése: TF?l = hosszú terminális ismétlés TRg = rövid terminális ismétlés
IR^ = hosszú belső ismétlés IRg = rövid belső ismétlés U|_ = hossz egyedi szakasz.
4. lépés: A HVT gA antigén kifejezésére alkalmas kifejező vektor (első replikáig vektor) előállítása
Az a plazmid, amely a 3. lépés szerinti analízis eredménye alapján a HVT genom DNS két 3,9 kb és 3,3 kb BamHI fragmensét tartalmazza, a pB52 jelet kapja. Ezt a plazmidot BamHI segítségével részlegesen emésztjük és agaróz gél elektroforézissel kiválasztjuk a 7,2 kb BamHI fragmenst. A kapott fragmenst pSV2-neo plazmid (ATCC 37149) BamHI helyére építjük be. Az igy kapott rekombináns plazmidot E. coli DH5 törzs sejtjeibe visszük be. AZ igy előállított transzformánsban található plazmid a pSVB52-3 jelet kapja. AZ említett eljárást a 2. ábra tartalmazza. A pSVB52-3 plazmidot a transzformánsból a 3. lépésben leirt lúgos extrakcióval izoláljuk és száritjuk.
5. lépés: A pSVB52-3 plazmid emlős sejtbe történő bevitele és a HTV gA kimutatása mikrogramm pSVB52-3 plazmidot 200 mikrőliter 2 x HBS oldatban (50 mmól/1 N-2-hidroxi-etil-piperazin-N'-2-etán-szulfonsav - továbbiakban HEPES Dojindo Laboratories, Japán, 280 mmól/1 nátrium-klorid és 1,5 mmól/1 dinátrium-hidrogén-foszfát) oldunk. Az oldathoz 200 mikroliter 0,25 mól/1 koncentrációjú, vizes kalcium-klorid oldatot adunk és az elegyet 30 percen keresztül 20 °C hőmérsékleten inkubáljuk. így a plazmid DNS-t a kalcium-foszfát segítségével kicsapjuk. Ettől függetlenül LLC-MI<2 majomvese sejtet (ATCC CCL 7) tenyésztünk 6 cm átmérőjű Petri-csészében 24 órán keresztül. A kapott tenyészethez cseppenként hozzáadjuk a fent előállított csapadékot.
A sejttenyészetet széndioxidos inkubátorban 20 órán keresztül inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a 2. referencia példa szerint előállított tripszin oldatot és a sejteket leöblítjük a Petri-csésze faláról. A sejteket a tenyészet 3. referencia példában végzett centrifugálásával összegyűjtjük. Az összegyűjtött sejteket Eagle's MÉM közegben (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Japán) , amely 400 mikrogramm/ml G418-at (Sigma Chemical Co., USA) és 5 térfogata magzati borjuszérumot tartalmaz, tovább tenyésztjük. A pSVB52-3 plazmiddal transzformált emlős sejtek rezisztensek az antibiotikus G418 aminoglikozidra. Ezért a transzformáns telepek G418 rezisztencia alapján elkülöníthetők. Az elkülönített telepeket 10 napon keresztül tovább tenyésztjük. Az egyes telepek továbbtenyésztett sejtjeit tripszin oldattal átitatott szűrő segítségével klónozzuk és egyenként tovább tenyésztjük. Az egyes kiónok tenyészeteit HVT gA antigén ·· ·· · • · · 44
4·· •· · jelenlétére vizsgáljuk a szokásos avidin-biotin immunoiluoreszcensz technikával (BRL Products fór Immunodetection, Application Guide, No. 10444, Bio-Rad Laboratory USA). A kimutatáshoz M-34 monoklón antitestet (Journal of Generál Virology, 64, 2597-2610, 1983) alkalmazunk, amely mind a HVT gA antigénnel, mind az MDV gA antigénnel reagál. Szekunder antitestként antiegér IgG-t (Bio-Rad Laboratories, USA) alkalmazunk. A mérések szerint a G418 rezisztens kiónok mintegy egyharmada esetében a HVT gA antigénnel fluoreszcensz komponens mutatható ki a sejtek citoplazmájában. Ez arra utal, hogy ezek a kiónok termelik a HVT gA antigént. Az avitin-biotin immunofluoreszcensz technikával vizsgált jellemző klón fényképét a 12. ábra mutatja.
6. lépés: A HVT gA antigén gén nukleotid szekvenciájának meghatározása
A HVT gA antigén gén kifejezésére alkalmas és a 4. lépés szerint előállított pSV852-3 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítjuk és alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel kiválasztjuk a HVT genom DNS 7,2 kb BamHI fragmensét. Az igy kapott BamHI fragmenst különböző restrikciós enzimekkel tovább hasítjuk. Az igy kapott DNS fragmenseket a 4. lépésben leirt módon a pSV2-neoplazmid BamHI-re építjük be. A kapott plazmidokat egyenként LLC-MI^ sejtekbe visszük be transzfekcióval.
A kapott transzformánsokban vizsgáljuk a HVT gA antigén termelését. A mérések szerint a HVT gA antigén gén szakasza az 1. ábra szerinti SphI-Sphl szakaszban található és az egyik plazmid teljes terjedelmében tartalmazza a HVT gA antigén gént. Ez a plazmid a pSBS-1 jelet kapja. A pSBS-1 plazmidból • · * ·· ·· · • · · ♦ 4<· * 4 • · 4 · »···· ••44 444 ·· ·· · kivágjuk a fenti SphI-Sphl szakasznak megfelelő SphI-Sphl fragmenst és ennek felhasználásával a szokásos didezoxi lánctermináló módszer felhasználásával meghatározzuk a HVT gA antigén gén teljes nukleotid szekvenciáját. A HVT gA antigén gén nukleotid szekvenciáját és az általa kódolt aminosav szekvenciát az MDV gA antigén gén nukleotid szekvenciájával és az általa kódolt aminosav szekvenciával együtt a 3(a)-3(k) ábrák mutatják. Az ábrákban a szekvenciák a felső sortól az alsó felé az alábbi elrendezés szerint vannak megadva:
(1) MDV gA antigént kódoló nukleotid szekvencia, (2) MDV gA antigén (1) nukleotid szekvencia által meghatározott aminosav szekvenciája, (3) HVT gA antigént kódoló nukleotid szekvencia, (4) HVT gA antigén (2) nukleotid szekvencia által meghatározott aminosav szekvenciája.
7. lépés: Newcastle betegség vírus (továbbiakban NDV) hemagglutinint és neuraminidázt kódoló génjének (továbbiakban HN gén) klónozása
Ebben a példában idegen génként NDV HN gént alkalmazunk. A HN gén az alábbiak szerint állítható elő.
A szokásos módon 0,5 ml NDV FUDAI törzs (Japanese Association of Veterinary Biologics, Japán) virusoldatát inokuláljuk 10 napos embrionális csirketojás allantois üregébe és 2 napon keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a tojásokból összegyűjtjük az allantois folyadékot (mintegy 50 ml) és 15 percen keresztül 10 000 g mellett ·· · ·♦ ·· · • Λ · ··*··· • ··· * ··· · ·*«· ··· ·* ·· · centrifugáljuk. A felüluszót összegyűjtjük és 4 °C hőmérsékleten 90 percen keresztül 21 000 fordulat mellett ultracentrifugáljuk (Model 55P. Rotorszám PR-21, Hitachi Ltd., Japán). Az igy összegyűjtött NDV részecskéket 1 ml PK pufferben (0,1 mól/1 Trisz-HCl, pH = 7,4, 12,5 mmól/1 Na2~EDTA, 0,15 mól/1 nátrium-klorid és 1 vegyes% nátrium-dodecil-szulfát) szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 100 mikroliter 4 mg/ml koncentrációjú, vizes proteináz oldatot adunk. Az elegyet 30 percen keresztül 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az 1. lépésben leirt módon fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk az NDV genom RNS-t. 5 mikrogramm NDV genom RNS-t adunk
100 mikroliter oldathoz, amely 50 mmól/1 Trisz-HCl-t (pH = 7,9), 100 mmól/1 kálium-kloridot, 10 mmól/1 magnézium-kloridot mmól/1 DTT-t, 1 mmól/1 nukleotid trifoszfátot, 30 egység RNase inhibitort (Takara Shuzo Co., Ltd. Japán) és 2 mikrogramm szintetikus oligodezoxi-nukleotid prímért (17mer)tartalmaz. AZ elegyet 15 percen keresztül 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd fokozatosan 42 °C hőmérsékletre hűtve temperáljuk.
Ezután 10 mikroliter 3300 egység/ml reverz transzkriptáz oldattal elegyítjük és 90 percen keresztül 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció befejeződése után az elegyet 50 mmól/1 Trisz-HCl-t (pH = 7,2), 10 mmól/1 magnézium-szulfátot, 0,1 mmól/1 DTT-t, 50 mikrogramm/ml borjuszérum albumint, egység RNase H-t (Takara Shuzo Co., Ltd., Japán), 0,2 egység E. coli DNS-ligázt (Takara Shuzo Co., Ltd., Japán), 0,15 mmól/1 béta-nikotinamid-adenin-dinukleotidot és 30 egység DNS polimerázt tartalmazó oldattal elegyítjük úgy, hogy a kapott elegy végső téárfogata 400 mikroliter legyen. Ezt az elegyet ·· · ·· ·· · • »··· ·· · * • · · · ··· · · • · · · · ···· ···· ··· ·♦ ·· 9
- 44 2 órán keresztül 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással feldolgozzuk. A kapott csapadékot 100 mikroliter oldatban oldjuk, amely 50 mmól/1 Trisz-HCl-t (pH = 7,6), 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 5 mmól/1 DTT-t, 0,1 mmól/1 spermidint, 0,1 mmól/1 Na2~EDTA-t és mmól/1 adenozin-5-trifoszfátot tartalmaz. A kapott oldathoz mikroliter 1000 egység/ml T4 polinukleotid kináz oldatot adunk és az elegyet 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció befejeződése után az elegyet fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással feldolgozzuk. A csapadékot 100 mikroliter oldatban oldjuk, amely 33 mmól/1 trisz-ecetsavat (pH = 7,9), 66 mmól/ kálium-acetátot, 10 mmól/1 magnézium-acetátot, 0,5 mmól/1 DTT-t, 0,1 mg/ml borjuszérum albumint és 0,5 mmól/1 dezoxinukleotid trifoszfátot tartalmaz. A kapott oldathoz 10 mikroliter 400 egység/ml T4 DNS polimeráz oldatot adunk és az elegyet 15 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció befejeződése után az elegyet fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással feldolgozzuk. így az NDV genom RNS-ének különböző szakaszainak megfelelő komplementer DNS-t (cDNS) kapunk.
100 ng fenti cDNS-t és 100 ng HincII restrikciós enzimmel hasított pUC19 plazmidot (Takara Shuzo Co., Ltd., Japán, Gene 26, 101, 1983) 50 mikroliter oldatban oldunk, amely 60 mmól/1 Trisz-HCl -t, pH = 7,6, 6,6 mmól/1 magnézium-kloridot és 10 mmól/1 adenozin-5-trifoszfátot tartalmaz. A kapott oldathoz 10 mikroliter 60 000 egység/ml koncentrációjú T4 DNS ligáz oldatot adunk. Az elegyet 2 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten inkubálva a cDNS-eket egyenként a pUC19 plazmid ·· · ·· ·· · • ···· · · ··
HincII helyére ligáljuk. A kapott eleggyel a 2. lépésben leirt módon E. coli DM83 sejteket (ATCC 35607) transzformálunk. A transzformánsokat tenyésztve a különböző méretű cDNS fragmenseket a pUC19 vektor plazmidba klónozzuk. A transzformánsokból a rekombináns plazmidot izoláljuk és a plazmidból a 3. lépésben megadott módon különválasztjuk a klónozott DNS fragmenst. A klónozott DNS fragmensek nukleotid szekvenciáját a 6. lépésben ismertetett didezoxi-lánctermináló módszerrel meghatározzuk. A mérések szerint három, különböző NDV HN gén szakaszokat kódoló klónozott cDNS fragmenst állítottunk elő. Ezeket a klónozott cDNS fragmenseket tartalmazó plazmidok a pNCl, pNC2 és pNC9 jelet kapták. A teljes NDV HN gént tartalmazó cDNS fragmens előállításához a fenti klónozott cDNS fragmenseket az alábbiak szerint ligáljuk.
Először a pNCl, pNC2 és pNC9 plazmidból a 3. lépésben megadott módon összegyűjtjük a klónozott cDNS fragmenseket. A pNCl plazmidból kapott cDNS fragmenst Hpal és PstI restrikciós enzimekkel hasítva pNCl fragmenst kapunk. A pNC9 plazmidból nyert cDNS fragmenst PstI és HindlII restrikciós enzimekkel hasítva pNC9 fragmenst kapunk. A pNC2 plazmidból kapott cDNS fragmenst HindlII és EcoR5 restrikciós enzimekkel hasítva pNC2 fragmenst kapunk. A kapott fragmenseket P4 DNS ligáz segítségével egymáshoz ligáljuk és igy a teljes HN gént tartalmazó cDNS gént kapunk. Ezt a cDNS fragmenst a pUC19 plazmid HincII helyére ligáljuk. A kapott rekombináns plazmidot E. coli DM 83 törzsbe transzforrnáljuk úgy, hogy a teljes HN gént tartalmazó cDNS fragmenst klónozzuk. A teljes NDV
- 46 HN gént tartalmazó cDNS fragmenst hordozó plazmid a pHN-1 jelet kapja. A 4. ábra a pNCl, pNC2 és pNC9 fragmensek és a teljes HN gént tartalmazó cDNS fragmens közötti kapcsolatot mutatja. A teljes NDV HN gént tartalmazó cDNS fragmenst lényegében a 3. lépésben megadott módon izoláljuk a pHN-1 plazmidból. Az igy kapott cDNS fragmens nukleotid szekvenciáját a fent említett didezoxi-lánctermináló módszerrel határozzuk meg. A HN gén nukleotid szekvenciáját és az ennek megfelelő aminosav szekvenciát az 5(a)-5(d) ábra mutatja.
8. lépés: HVT gA antigén gént és idegen gént (HN gén) tartalmazó második replikáig vektor előállítása
100 ng HVT gA antigén gént tartalmazó pSBS-1 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítunk. A hasított plazmidot fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással összegyűjtjük. Az összegyűjtött plazmidot 100 mikroliter oldatban oldjuk, amely 50 mmól/1 Trisz-HCl-t (pH = 7,9), 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 50 mmól/1 nátrium-kloridot, 0,1 mg/ml borjuszérum albumint, 1 mmól/1 DTT-t és 1 mmól/1 dezoxi-ribonukleozid trifoszfátot tartalmaz. Az oldathoz 10 mikroliter 200 egység/ml koncentrációjú T4 DNS polimeráz oldatot adunk és 10 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubálva a hasított plazmid mindkét végét tompa végűre alakítjuk. A reakció befejeződése után az elegy fenolos extrakciójával és etanolos kicsapásával feltárjuk a plazmid DNS-t. A plazmid DNS-t Bal31 nukleázzal (Molecular Cloning, 136-139) hasítva eltávolítjuk a HVT gA antigén gén ATG kezdőkódját. Ezután az idézett Molecular Cloning 243-246 oldalán leirt módon a plazmid DNS mindkét • · · · ····« • ·· · · · · · • · · · ·«· ·· ·· · végére Xhol linkért ligálunk és a plazmid DNS-t T4 DNS polimerázzal kezelve a plazmid DNS mindkét végét tompa végűre alakítjuk. Emellett, a 6. lépés szerint előállított pHN-1 plazmidot Hpal és EcoR5 restrikciós enzimmel emésztjük és alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel feltárjuk az NDV HN gént tartalmazó mintegy 1,8 kb DNS fragmenst. A mintegy 1,8 kb DNS fragmenst a fent említett plazmid DNS-sel ligáljuk. A kapott plazmidot E. coli 3M83 törzsbe transzformáljuk. A kapott plazmid a pHVT-1 jelet kapja. Az eljárást a 6. ábra mutatja.
9. lépés: Rekombináns HVT előállítása
A 4. referencia példában leirt módon QEF sejttenyészetet állítunk elő 6 cm átmérőjű Petri-csészében. A QEF- sejttenyészetet edényenként 1 x 10^ PFU HVT 01 virustörzzsel inokuláljuk. Ezután a tenyészethez fenntartó közeget adunk és széndioxidos inkubátorban 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott tenyészethez cseppenként a 8. lépésben előállított és kalcium-foszfáttal kicsapott pHVT-1 plazmidot adagolunk. Ezután a tenyésztést további 20 órán keresztül folytatjuk. A tenyésztés befejezése után a fenntartó közeget óvatosan eltávolítjuk és edényenként 6 ml fenntartóközeget adunk hozzá, amely 0,8 vegyest agarózt tartalmaz. A sejteket széndioxidos inkubátorban 48 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten tovább tenyésztve foltokat kapunk. A tenyésztés során homológ rekombináció játszódik le a gA antigén gént és a HN gént tartalmazó pHVT-1 plazmid DNS fragmense és a HVT genom • · · ·····.
• ·« · ····· • · · · ··· ·· ·· ·
DNS egy szakasza között, amely szakasznak a nukleotid szekvenciája homológ vagy hasonló a DNS fragmens szekvenciájához és igy rekombináns HVT-t kapunk. A rekombináns HVT-t az egyes foltokból folthib'iridizációs módszerrel (Manual fór Genetic Engineering, 68-73, 1982, Kodansha Scientific Japán ) izoláljuk. Ehhez a foltokat tartalmazó agaróz gélszakaszokat sterilizált parafa fúróval kivágjuk, amelynek átmérője alig nagyobb, mint a folt átmérője. A kivágott agaróz gél darabokat steril műanyag membránszürőn (Nihon Pali Ltd. Japán) áthajtjuk és igy a foltokat átvisszük a steril műanyag membrán szűrőre. A kivágott agarózgél darabokat 1/15 mól/1 PBS-t (pH = 7,4), 10 vegyes % szaccharózt, 3 vegyes% L arginint és 1 vegyes% zselatin hidrolizátumot tartalmazó pufferben -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A foltokat tartalmazó szűrőt a szokásos módon kezeljük, vagyis például 0,5 n nátrium-hidroxiddal kezeljük és 1 mól/1 Trisz-HCL-lel (pH = 7,5) semlegesítjük, majd 1 órán keresztül 80 °C hőmérsékleten hőkezeljük. Ezután a szűrőn lényegében a fent leirt módon folthibridizációt hajtunk végre azzal a különbséggel, hogy mintaként a 3. lépés szerint előállított 32p_dezoxi-citidin-trifoszfáttal jelölt NDV HN gén készítményt alkalmazunk. A mintával hibridizáló pozitív foltoknak megfelelő tárolt agaróz gélt a 4. referencia példa szerint külön előállított QEF tenyészetre inokuláljuk és tenyésztjük. A kapott tenyészetből a rekombináns vírust a fent említett módon izoláljuk. Az igy kapott rekombináns vírus a HVT 01 R törzs jelet kapja.
• · · · ·«··« • · · · ····· •··· ··· ·· ·« ·
10. lépés: Rekombináns HVT által előállított HVT antigén és NDV HN antigén kimutatása
A 4. lépésben leirt módon a 9. lépés szerint előállított HVT 01R rekombináns virustörzzsel fertőzött sejtszuszpenziót állítunk elő. A szuszpenziót fluoreszcensz antitest technikához alkalmazható üveglemezre csepegtetjük. A szuszpenziót szétterítjük, levegőn megszáritjuk és a vírussal fertőzött sejtek fixálásához 10 percen keresztül hideg acetonnal kezeljük.
Ezután indirekt fluoreszcensz antitest technikával vizsgáljuk a HVT antigén és az NDV HN antigén jelenlétét. Ehhez 0,5 ml primer antitestet juttatunk az üveglemezen fixált sejtekre és párakamrában 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Primer antitestként anti NDV HN csirke antiszérumot alkalmazunk. A reakció befejezése után a sejteket háromszor PBS oldattal mossuk. Ezután szekunder antitestként a sejteket 0,5 ml fluoreszcensz izotiocianáttal jelölt anticsirke IgG antitesttel (4. szinezőegység) reagáltatjuk és a fent leirt módon mossuk. A sejtekhez glicerin puffer oldatot (0,5 mól/1 nátrium-karbonát/nárium-hidrogén-karbonát oldat, pH = 9,5 és garantáltan nem fluoreszcensz minőségű glicerin 1:9 arányú elegye) csepegtetünk és a sejteket üveglemezzel lefedjük. Az igy kapott mintákat fluoreszcensz mikroszkóppal (Nippon
Kogaku K.K., Japán) vizsgáljuk.
Ettől függetlenül a HVT 01R rekombináns virustörzzsel fertőzött sejteket tartalmazó lemezt állítunk elő a fent említett módon és a sejteket indirekt fluoreszcens antitest technikával vizsgáljuk azzal az eltéréssel, hogy primer antitestként anti HVT csirke antiszérumot alkalmazunk.
• · * · ·«··· • · · · ····· ···· ··· ·· ·· «
A mérések szerint a HVT 01R rekombináns vírus törzs, mind a HVT antigént, mind az NDV HN antigént termeli. A fenti analízishez felhasznált sejtek fényképét a 13. és 14. ábrák mutatják.
2. példa
Az 1. példa 7. lépésében előállított pNC9 plazmidot HinfI restrikciós enzimmel hasítjuk. A kapott fragmenst T4 DNS polimerázzal kezelve mindkét végén tompa végűre alakítjuk. A kapott plazmid DNS-ből alacsony olvadáspontu agaróz gél elektroforézissel NDV HN gént tartalmazó mintegy 1,1 kb DNS fragmenst kapunk.
Ettől függetlenül az 1. példa 6. lépésében előállított pSBS-1 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítjuk éa T4 DNS polimerázzal kezeljük. Az igy kapott plazmid DNS-hez T4 DNS ligáz segítségével hozzákapcsoljuk a fent kapott DNS fragmenst. A kapott rekombináns plazmidot E. coli JM83 törzsbe transzformáljuk. A kapott rekombináns plazmid a pFGH-H jelet kapja. Az eljárást a 7. ábra mutatja. A plazmidban az NDV HN gén a HVT gA antigén gént tartalmazó DNS fragmensbe van beépítve és igy HVT gA antigénből és NDV HN-ből álló egyesült fehérjét fejez ki.
Lényegében az 1. példa 9. lépése szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy pHVT-1 plazmid helyett a fenti pFGH-H plazmidot használjuk és igy rekombináns vírust állítunk elő. Ez a rekombináns vírus a HVT 01F törzs jelet kapja.
A HVT 01F rekombináns virustörzset lényegében az 1.
példa 10. lépésében leirt módon analizáljuk. így megállapítható, hogy a rekombináns vírus mind a HVT antigént, mind az NDV HN-t termeli. A fenti analízishez használt sejtek fényképét a 14. és 15. ábrák mutatják.
3. példa
1. lépés: MDV genom DNS előállítása
AZ MDV C2 törzs genom DNS-ét lényegében az 1. példa
1. lépésében leirt módon állítjuk elő azzal a különbséggel, hogy HVT 01 törzzsel fertőzött QEF sejtek helyett MDV C2 törzzsel fertőzött QEF sejteket alkalmazunk.
2. lépés: Az MDV genom DNS restrikciós enzimmel hasított fragmenseinek klónozása és a géntár előállítása
Lényegében az 1. példa 2. lépésében megadott módon járunk el azzal a különbséggel, hogy a HVT genom DNS helyett a 3. példa 1. lépésében előállított MDV genom DNS-t alkalmazzuk és igy BamHI tárat, PstI tárat és HindlII tárat kapunk.
3. lépés: MDV genom DNS restrikciós térképének előállítása
Az MDV genom DNS restrikciós térképét lényegében az 1. példa 3. lépésében megadott módon vesszük fel. Az igy felvett restrikciós térképet a 8. ábra mutatja, ahol a rövidítések jelentése azonos az 1. ábrában megadott jelentésekkel.
• · · · ···*· • ·· · · · < · · ···· ··· ·' ·· «
A fent említett restrikciós térkép alapján a BamHI tárból kiválasztjuk az MDV genom DNS 18,3 kb BamHI fragmensét hordozó plazmidot tartalmazó kiónt. A klónból a plazmidot az 1. példa 4. lépésében megadott módon izoláljuk. A plazmid a pBam-B jelet kapja.
4. lépés: MDV gA antigén gén kifejezésére alkalmas kifejező vektor (első replikáig vektor) előállitása
A fenti három lépésben előállított pBam-B plazmid
18,3 kb BamHI fragmensét lényegében az 1. példa 4. lépésében megadott módon pSV-2 -neoplazmid BamHI helyére építjük be és igy pSVB-12 plazmidot kapunk. AZ eljárást a 9. ábra mutatja.
Emellett, a 3. lépésben előállított restrikciós térkép alapján a pBam-B plazmid 18,3 kb BamHI fragmens szakaszából mintegy 2,2 kb EcoRI-PvuII fragmenst hasítunk ki lényegében az 1. példa 2 lépésében megadott módon. Az igy kapott EcoRI-PvuII fragmenst alkalmazva lényegében az 1. példa 4 lépésében megadott módon pBEP-22 plazmidot állítunk elő.
5. lépés: pBEP-22 plazmid transzformációja emlős sejtben és MDV gA antigén kimutatása
LLC- M«2 majom vesesejtet pBEP-22 plazmiddal transzformálunk és a kapott transzformánst lényegében az 1. példa 5. lépésében leirt módon tenyésztjük. Szintén az 1. példa 5. lépésében leirt immunofluoreszcensz módszerrel vizsgáljuk, hogy a transzformáns termel-e MDV gA antigént. A mérések sze-
···* ··· ·· · ·
- 53 rint a fent előállított transzformáns termeli az MDV gA antigént (lásd a 19. ábrát). Eszerint a p9EP-22 plazmid képes a 3. példa 4. lépése szerint előállított MDV gA antigén kifejezésére, amelyet az 1. példa 6. lépésében leirt módon restrikciós enzimekkel hasítva az MDV gA antigén gént kódoló gént tartalmazó mintegy 2,2 kb EcoRI-PvuII fragmenst kapunk. A fragmens nukleotid szekvenciáját a didezoxi lánctermináló módszerrel határozzuk meg. A gA antigén gén nukleotid szekvenciáját és az általa meghatározott aminosav szekvenciáját a 3(a)-3(k) ábra mutatja.
6. lépés: MDV gA antigén gént és idegn gént (HN gén) tartalmazó második replikáig vektor előállítása
Az 1. példa 7. lépésében előállított pHN-1 plazmid és a 3. példa 4. lépésében előállított pBEP-22 plazmid felhasználásával az 1. példa 8. lépésében megadott módon pMDV-1 plazmidot állítunk elő. A pMDV-1 plazmid szerkezetét a 10. ábra mutatja.
7. lépés: Rekombináns MDV előálllitása
Lényegében az 1. példa 9. lépésében megadott módon járunk el azzal a különbséggel, hogy HVT-1 törzs helyett MDV C2 törzset és pHVT-1 plazmid helyett pMDV-1 plazmidot alkalmaunk. A kapott rekombináns vírus az MDV C2 törzs jelet kapja.
• ·
8. lépés: A rekombináns MDV által lőállitott MDV antigén és NDV HN antigén kimutatása
Az MDV C2R rekombináns virustörzzsel fertőzött QEF sejtek által termelt MDV antigént és NDV HN antigént az 1. példa 10. lépésében leírt indirekt fluoreszcensz antitest módszerrel határozzuk meg. Primer antitestként anti NDV HN antigén csirkeantiszérumot és anti MDV antigén csirke antiszérumot alkalmazunk. A mérések szerint a fent emlitett rekombináns vírus mind az MDV antigént, mind az NDV HN antigént termeli. A fenti vizsgálathoz alkalmazott megfelelő sejtek fényképét a 20. és 21. ábrák mutatják.
4. példa
Lényegében a 3. példa 6. lépésében megadott módon járunk el azzal a különbséggel, hogy a pHN-1 plazmid helyett az 1. példa 7. lépésében előállított pNC9 plazmidot alkalmazzuk, és igy pFGH-M plazmid jelű második replikáló vektort kapunk. A pFGH-M plazmid szerkezetét a 11. ábra mutatja.
Ez a plazmid kifejezi mind az MDV gA antigént, mind az NDV HN gént, igy az MDV gA antigénből és az NDV HN-ből álló egyesült fehérjét kapunk.
Ezután lényegében a 3. példa 7. lépésében megadott módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pMDV-1 plazmid helyett pFGH-N plazmidot alkalmazunk a rekombináns vírus előállításához. A kapott rekombináns vírus az MDV C2 törzs jelet kapja .
Az 1. példa 10. lépésében megadott analízis szerint ·· · ·· ·· • · · «·«£·· • · · · ····· • ·«· ··· ·· »· · az MDV C2F rekombináns virustörzs mind az MDV antigént, mind az NDV HN-t termeli.
5. példa
Lényegében az 1. példa 9. lépésében megadott módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pHVT-1 plazmid helyett a 3. példa 6. lépésében előállított pMDV-1 plazmidot alkalmazzuk a rekombináns vírus előállításához. A kapott rekombináns vírus a HVT 01MH törzs jelet kapja.
Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis alapján a HVT 01MH rekombináns virustörzs mind a HVT antigént, mind az NDV HN-t termeli. A vizsgálat fényképeit a 17. és 18. ábrák mutatják.
6. példa
Lényegében az 1. példa 9. lépésében megadott módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy pHVT-1 plazmid helyett a 4. példa szerinti pFGH-M plazmidot alkalmazzuk. Az igy kapott rekombináns vírus a HVT 01FM törzs jelet kapja. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében a HVT 01FMH rekombináns virustörzs mind a HVT antigént, mind az NDV HN-t termeli. Az analízis fényképeit a 20. és 21. ábrák mutatják.
7. példa
Lényegében a 3. példa 7. lépése szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pHVT-1 plazmid helyett az 1. példa 6. lépése szerinti pHVT-1 plazmidot alkalmazzuk. A kapott rekombináns vírus az MDV C2HH törzs jelet kapja. Az ·· ·· · • ·4 ·
1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében az MDV C2HH rekombináns virustörzs, mind az MDV antigént, mind az NDV HN-t termeli .
8. példa
Lényegében a 3. példa 7. lépése szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy pMDV-1 plazmid helyett 2. példa szerint pFGH-H plazmidot alkalmazunk. A kapott rekombináns virus az MDV C2HH törzs jelet kapja. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében az MDV C2FHH rekombináns virus törzs mind az MDV antigént, mind az NDV HN-t termeli.
9. példa
Idegen génként fertőző madár bronchitis virus spike protein génjét tartalmazó rekombináns MDV előállítása:
1. lépés:
Lényegében az 1. példa 7. lépésében megadott módon felvesszük az M41 fertőző madár bronchitis vírus (továbbiakban IBV törzs, Japanese Association of Veterinary Biologics, Japán) genom DNS-ének cDNS párját, azzal a különbséggel, hogy NDV Fudai törzs IBV M41 törzset alkalmazunk. Az IDV géntérképe és az IDV spike protein antigénjét (továbbiakban SP antigén) kódoló gén nukleotid szekvenciája (Journal of Generál Virology, 16, 719-726, 19Θ5) alapján a cDNS tárból az SP antigén gént tartalmazó DNS fragmenst hordozó plazmidot klónozunk. A klónozott plazmid a pSP-922 jelet kapja.
A pSP-922 plazmidot Xbal és HindlII restrikciós enzimmel ·· · ·· ·· · • · · · ··· · · • ·· · ····· ··«· ··· ·· «· « hasítjuk és Bal31 nukleázzal emésztjük. így az SP antigén gént tartalmazó DNS fragmenst kapunk. Ezután lényegében megismételjük az 1. példa 3. lépését, azzal a különbséggel, hogy NDV HN gént tartalmazó DNS fragmens helyett a fent előállított DNS fragmenst alkalmazzuk és igy a HVT gA antigén gén promoterét és ettől lefelé a vele ligáit SP antigén gént tartalmazó plazmidot kapunk, amelynek jele pHVSP-3.
2. lépés:
A pHVSP-3 plazmid és a HVT 01 törzs felhasználásával az 1. példa 9. lépésében megadott módon rekombináns vírust állítunk elő. A rekombináns vírus a HVT 01HS törzs jelet kapja. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében, ahol szekunder antitestként anti NDV HN csirke antiszérum helyett anti IBV antigén csirke antiszérumot alkalmazunk, a kapott rekombináns vírus mind a HVT antigént, mind az IBS SP antigént termeli.
10. példa
1. lépés:
Lényegében az 1. példa 9. lépésében megadott módon járunk el azzal a különbséggel, hogy az NDV HN gént tartalmazó DNS fragmens helyett IBS SP antigén gént tartalmazó DNS fragmenst és az 1. példa 6. lépése szerinti pSBS-1 plazmid helyett a 3. példa 4. lépése szerinti pBEP-22 plazmidot alkalmazunk és igy az MDV gA antigén génjének promoterét és az ettől lefelé vele ligáit SP antigén gént tartalmazó plazmidot kapunk, amelynek jele pMDSP-22.
• · • 4 · 4 • · · · 4 ···« ••4« *·4 ·· *« «
2. lépés;
A pMDSP-22 plazmid és a HVT 01 törzs felhasználásával lényegében az 1. példa 9. lépésében megadott módon rekombináns vírust állítunk elő, amlynek jele HVT 01MS törzs. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében, amelynek során primer antitestként anti NDV HN csirke antiszérum helyett anti IBV antigén csirke antiszérumot alkalmazunk, a kapott rekombináns vírus mind a HVT antigént, mind az IBV-SP antigént termeli.
11. példa
A 9. példa szerinti pHVSP-3 plazmid és az MDV C2 törzs felhasználásával az 1. példa 9. lépésében megadott módon rekombináns vírust állítunk elő, amelynek jele MDV C2HS törzs. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében, amelynek során primer antitestként anti NDV HN csirke antiszérum helyett anti IBV antigén csirke antiszérumot alkalmazunk, a kapott rekombináns vírus mind az MDV antigént, mind az IBV SP antigént termeli .
12. példa
10. példa szerinti pMDSP-22 plazmid és MDV 02 törzs felhasználásával az 1. példa 9. lépésével megadott módon rekombináns vírust állítunk elő, amelynek jele MDV C2MS törzs. Az 1. példa 10. lépése szerinti analízis értelmében, amelynek során primer antitestként anti NDV HN csirke antiszérum helyett anti IBV antigén csirke antiszérumot alkalmazunk, *··« ·· · ·*« · · • ···<* ·· *
- 59 a kapott rekombináns vírus mind az MDV antigént, mind az
IBV SP antigént termeli.
13. példa
Hatóanyagként rekombináns Marek-betegség vírust tartalmazó bivalens élő vakcina előállítása és ennek biztonsága és aktivitása vizsgálata
A 4. referencia példa szerint vírussal fertőzött
QEF sejteket állítunk elő, amelynek során vírusként az 1-8. példákban előállított HVT 01R, HVT 01F, HVT 01MH, HVT 01FMH, MDV C2R, MDV C2F, MDV C2HH és MDV C2FHH rekombináns vírustörzseket alkalmazzuk. A fertőzött QEF sejteket 50 darab literes Roux edényben tenyésztjük. A tenyésztés befejezése után a fertőzött sejteket 0,02 vegyes% h^-EDTA 2. referencia példa szerinti oldatban történő feloldásával előállított tripszin oldattal lemossuk az edények belső faláról és tripszin oldatban szuszpendáljuk. A rekombináns HVT törzsekkel fertőzött sejtek szuszpenzióját ultrahanggal kezeljük és a felüluszót összegyűjtjük. Ennek során minden rekombináns HVT törzsből mintegy 500 ml bivalens élő vakcina koncentrátumot kapunk, amely hatékony a Marek-betegség és a Newcastle-betegség ellen. Emellett, 500 ml rekombináns MDV törzzsel fertőzött sejtet tartalmazó szuszpenziót elkülönítünk és bivalens élő vakcina koncentrátumként alkalmazzuk. Az igy kapott koncentrátumokból 50 ml-t az alábbiak szerint vizsgálunk. A koncentrátum maradékát az 1. példa 9. lépésében említett stabilizátort tartalmazó pufferral hígítjuk úgy, hogy a vírus koncentráció 1000 PFU legyen. Az igy kapott hígított elegyből 5 litert • 4 · ·· ·· · • · ♦ · ··· 4 · • · 4 4 · ···· ·4·4 ··· ·· ·· ·
100 ml-es fiolákba töltünk. A fiolákat lezárjuk és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. 20 darab rekombináns HVT törzset tartalmazó hígított elegyet liofilizálunk, lezárjuk és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Az igy kapott fiolák két csoportjából véletlenszerűen kiválasztunk 4 darabot és a fent említett élő vakcina koncentrátummal együtt vizsgáljuk. Az élő vakcina biztonsága, hatékonysága, homognitása és tárolási stabilitása meghatározásához a mintákat a szárított Marek-betegség élő vakcina, a fagyasztott Marek-betegség élő vakcina és az élő Newcastle-betegség vakcina vonatkozásában előirt vizsgálatokkal (Standards of Biological Preparations fór Animals, No. 599, Mezőgazdasági-, Erdészeti- és Halászati Minisztérium, Japán) ellenőrizzük. A mérési eredmények szerint a fent előállított vakcinát bivalens élő vakcinaként alkalmazhatjuk. A vakcinákat HVT 01R törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (továbbiakban folyékony RHVT) és ugyanezt tartalmazó szárított vakcinaként (továbbiakban száraz RHVT), HVT 01F törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (továbbiakban folyékony RHVT-F) és ugyanezt tartalmazó szárított vakcinaként (továbbiakban száraz RHVT-F), HVT 01MH törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (továbbiakban folyékony RHVT-MH) és ugyanezt tartalmazó szárított vakcinaként (továbbiakban száraz RHVT-MH),HVT 01FMH törzset tartalmazó élő vakcinaként (továbbiakban folyékony RHVT-FMH) és ugyanezt tartalmazó száraz vakcinaként (továbbiakban száraz RHVT-MH), MDV C2R törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (továbbiakban folyékony RMDV), MDV C2F törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (továbbiakban folyékony RMDV-F), ·· · ·· ·· · • 4··· ·· · · • · · · ··· · · • · · · · ···· ···· ··· ·· «· ·
MDV C2HH törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (folyékony RMDV-HH) és MDV C2FHH törzset tartalmazó folyékony vakcinaként (a továbbiakban RMDV-FHH) a 14. példa szerinti klinikai vizsgálatokban próbáljuk ki.
14. példa
Rekombináns virustörzset tartalmazó bivalens élő vakcinák immunogén és immun hatásának vizsgálata
A 13. példában előállított vakcinák hatékonyságának vizsgálatához klinikai teszteket végzünk. 90 darab egynapos SPV csirkét 5 csoportba osztunk az alábbiak szerint. Az A-D csoport 20 állatból és az E csoport 10 állatból áll. A vakcinákat intramuszkulárisan befecskendezzük az A-C csoport és az E csoport állatainak alsó végtagjába. A D csoportot kontrollként alkalmazzuk, ezért vakcinát nem kap. A vakcina adagolását az alábbiak szerint végezzük. 2 ml folyékony RHVT vakcinát kap az A csoport, 2 ml száraz RHVT vakcinát kap a B csoport, 1 ml folyékony RMDV vakcinát kap a C csoport, 2 ml folyékony élő HVT 01 vakcinát kap az E csoport, amelyet a 13. példa szerint HVT 01 törzs felhasználásával állítunk elő. A csoportokat elkülönítjük és az állatokat megfigyelés közben neveljük. A vakcinák adagolása után 3 héttel a szárnyvénából vett vérből állatonként 1 ml szérumot gyűjtünk. A szérumminták antitest vizsgálatával meghatározzuk a vákcina immunogenitását. A vizsgálat során a szérum mintákat 1. referencia példa szerinti BBS oldatra kétszeresére hígítjuk és vizsgáljuk, hogy a szérum reagál-e HVT és MDV antigénekkel, amit indirekt fluoreszcensz antitest technikával ellenőrzünk • ·· · · « • · · · · · ♦· · az 1. példa 10. lépése szerint, és vizsgáljuk, hogy a szérum reagál-e MDV antigénnel, amelyet a szokásos hemagglucinációs inhibitor teszttel végzünk, amelyben 0,5 térfogat% csirke eritrocita szuszpenziót és az NDV Ishii törzs (Japanese Association of Veterinary Biologics, Oapan) hemagglutininjét alkalmazzuk. A vakcinák antitest titere a minták maximális higitásmértékének geometriai átlaga, amelyet a fenti vizsgálatban pozitív reakciót adó maximális hígítás 20-dik (A-C csoport) vagy 10-dik (E csoport) gyöke alapján számolunk.
Emellett vizsgáljuk a vakcinák immunhatását, amelynek során a csirkéket virulens vírussal fertőzzük. A 20 egyedből álló A-C és E csoportokat 10 állatból álló alcsoportra osztjuk, vagyis az A, B, C és E csoportokból 10 állatból álló A-a, A-b, B-a, B-b, C-a, C-b és E-a, E-b alcsoportokat képzünk. Az A-a, B-a, C-a és E-a alcsoportokhoz tartozó állatoknak, vagyis összesen 40 csirkének letális dózisu, vagyis 10 TCID^q dózisu virulens NDV SATO virustörzset fecskendezünk be intramuszkulárisan. A TCID^g érték az 50 Vos fertőzéshez szükséges mennyisége jelöli. Emellett az A-b, B-b, C-b és E-b, valamint a D csoportba tartozó állatoknak, vagyis összesen 50 csirkének 10 PFU mennyiségben intramuszkuláris injekció formájában virulens MDV.JM virustörzset (National Veterinary Assay Laboratory, Japán) adunk. Az egyes csoportokat elkülönítjük és a virulens vírussal kezelt csirkéket megfigyelés alatt neveljük. Az NDV SATO virulens vírussal kezelt csirkék pusztulását a kezelés után 2 héttel vizsgáljuk. Emellett, az MDV-JM virulens virustörzzsel kezelt csirkéknél a neurovirulenciát 5 héttel a kezelés után vizsgáljuk a Daralizis és görcsös szimptómák vizsgálata, boncolás és a patológiás szövetek mikroszkopikus vizsgálata alapján. A mérési eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az eredményekből látható, hogy valamennyi 13. példa szerinti RHVT és RMDV vakcina kiváló immunogenitással és kiváló fertőzés megelőző hatással rendelkezik.
A fenti vizsgálatokat elvégeztük a 13. példa szerint előállított többi bivalens élő vakcinán is, az eredményeket a 2-4. táblázat tartalmazza. Az eredményekből látható, hogy az említett bivalens élő vakcinák kiváló immunogenitással és kiváló fertőzés megelőző hatással rendelkeznek.
1. táblázat
| Élő vakcinával inokulált csop. | Kísérleti állatok sz. | Antitest NDV | titer^/ HVT | Virus | Hatás' |
| Folyékony rHVT A-a csoport | 10 | 29,9 | 1194 | NDV | 0/10 |
| A-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Száraz rHVT B-a csoport | 10 | 30,4 | 1214 | NDV | 0/10 |
| B-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Folyékony rMDV C-a csoport | 10 | 33,1 | 1114 | NDV | 0/10 |
| C-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| HVT 01 D csoport | 10 | <4 | 1180 | MDV | 0/10 |
| Kontroll E-a csoport | 10 | < 4 | <20 | NDV | 10/10 |
| E-b csoport | 10 | MDV | 10/10 |
• · · • · ·· · · · • · · ·· ·· · • · ·
2. táblázat
| Élő vakcinával inokulált csop. | Kísérleti állatok sz. | Antitest titer^/ | Vírus | Hatás2,3/ | |
| NDV | HVT | ||||
| Folyékony rHVT- | F | 32,0 | 1084 | 0/10 | |
| A-a csoport | 10 | NDV | |||
| A-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Száraz rHVT -F B-a csoport | 10 | 31,2 | 1280 | NDV | 0/10 |
| B-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Folyékony rMDV- | F | 35,3 | 1318 | 0/10 | |
| C-a csoport | 10 | NDV | |||
| C-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| HVT 01 D csoport | 10 | <4 | 1200 | MDV | 0/10 |
| Kontroll E-a csoport | 10 | <4 | <20 | NDV | 10/10 |
| E-b csoport | 10 | MDV | 10/10 | ||
| 3. táblázat | |||||
| Élő vakcinával | Kísérleti | Antitest | titer^/ | Vírus | Hatás2’3/ |
| inokulált csop. | állatok sz. | NDV | HVT | ||
| Folyékony rHVT | -MH | 24,0 | 1280 | ||
| A-a csoport | 10 | NDV | 0/10 | ||
| A-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Száraz rHVT-MH B-a csoport | 10 | 28,5 | 1350 | NDV | 0/10 |
| B-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Folyékony rMDV | -MH | 20,3 | 990 | ||
| C-a csoport | 10 | NDV | 0/10 | ||
| C-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| HVT 01 D csoport | 10 | <4 | 1150 | MDV | 0/10 |
| Kontroll E-a csoport | 10 | < 4 | <20 | NDV | 10/10 |
| E-b csoport | 10 | MDV | 10/10 |
·♦ · • · · ·
- 65 4. táblázat
| Élő vakcinával inokulált csop. | Kísérleti állatok sz. | Antitest titer·*·/ | Vírus | Hatás | |
| NDV | HVT | ||||
| Folyékony rHVT - | FMH | 23,2 | 1140 | ||
| A-a csoport | 10 | NDV | 0/10 | ||
| A-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Száraz rHVT-FMH | 25,8 | 1090 | |||
| B-a csoport | 10 | NDV | 0/10 | ||
| B-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Folyékony rMDV-FMH | 31,4 | 880 | |||
| C-a csoport | 10 | NDV | 0/10 | ||
| C-b csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| HVT 01 | <4 | 1080 | |||
| D csoport | 10 | MDV | 0/10 | ||
| Kontroll | <4 | <20 | |||
| E-a csoport | 10 | NDV | 10/10 | ||
| E-b csoport | 10 | MDV | 10/10 | ||
| Megjegyzések az | 1-4. táblázatokhoz: | ||||
| 1/ = Az antitest | titer átlagértékét 20 | csirkén | vesszük | fel | |
| az NDV esetében | hemagglutinációs inhibitor teszttel és | az |
MDV esetében indirekt fluoreszcensz antitest vizsgálattal.
2/ = A hatás NDV esetében pusztulás, amelyet a B/A képlettel számolunk, ahol A a kezelt állatok számát és B az elhalt állatok számát jelöli.
3/ = MDV esetében a hatás megbetegedés, amit a C/A képlettel számolunk, ahol A jelentése a fenti, C a pozitív idegi sérülést mutató csirkék száma.
Claims (11)
- Szabadalmi igénypontok1. Rekombináns Marek-betegség vírus, amely egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, azzal jellemezve, hogy az adott idegen gént az adott genom DNS-be építjük be a genom DNS-ben található legalább egy promoterhez viszonyítva lefelé található korrekt leolvasó keretbe, ahol a promoter működőképes az adott idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben, ahol a rekombináns Marek-betegség vírus tartalmazza a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait, valamint az idegen gén által kódolt polipeptidet.
- 2. Az 1. igénypont szerinti rekombinánsMarek-betegség vírus, azzal jellemezve, hogy idegen génként polipeptidet, igy antigént, enzimet, peptidhormontés szerkezeti tartalmaz fehérjét kódoló gént r, amelyek a legyengített Marek-betegség vírustól eltérő vírusból, klamidiából, rikettsiából, mikoplazmából, baktériumból, protozoából, állati sejtből vagy növényi sejtből származnak vagy azok termelik.
- 3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns Marek-betegség vírus, azzal jellemezve, hogy legyengített Marek-betegség vírusként Biken C2 Marek-betegség vírus törzset vagy Biken 01 pulyka herpeszvirus törzset tartalmaz.
- 4. Az 1. igénypont szerinti rekombináns Marek-betegség vírus, azzal jellemezve, hogy promoterként ··· glikoprotein A antigén (gA antigén) gén, glikoprotein B antigén (továbbiakban gB antigén) gén, antigén C gén, mintegy135 000 móltömegü DNS megkötő fehérjét kódoló gén, mintegy86 000 és mintegy 92 000 móltömegü és virusspecifikus fehérjéket kódoló gén, valamint minegy 36 000, mintegy 39 000 és mintegy 44 000 móltömegü foszforilezett fehérjéket kódoló gén promoterét tartalmazza.
- 5. Sokoldalú Marek-betegség élő vakcina, azzal jellemezve, hogy rekombináns Marek-betegség vírus immunogén mennyisége, amely egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, ahol az idegen gén a genom DNS legalább egy promoteréhez képest lefelé, egy teljes leolvasókereten belül épül be a genom DNS-be, ahol a promoter az idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben működőképes és ahol a rekombináns Marek-betegség vírus a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait mutatja és az idegen gén által kódolt polipeptidet tartalmazza, legalább egy, gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyag, higitóanyag vagy segédanyag.
- 6. Az 5. igénypont szerinti sokol- dalú Marek-betegség élő vakcina, azzal jellemezve, hogy polipeptidet, igy antigént, enzimet, peptidhormorités szerkezeti fehérjét kódoló gént^rVmelyek a legyengített Marek-betegség vírustól eltérő vírusból, klamidiából, rikettsiából, mikof·- 68 plazmából, baktériumból, protozoából, állati sejtből vagy növényi sejtből származnak vagy azok termelik.
- 7. Az 5. igénypont szerinti sokoldalúMarek-betegség élő vakcina, azzal jellemezve, hogy glikoprotein A antigén (gA antigén) gén, glikoprotein B antigén (továbbiakban gB antigén) gén, antigén C gén, mintegy 135 000 móltömegü DNS megkötő fehérjét kódoló gén, mintegy86 000 és mintegy 92 000 móltömegü és virusspecifikus fehérjéket kódoló gén, valamint minegy 36 000, mintegy 39 000 és mintegy 44 000 móltömegü foszforilezett fehérjéket kódoló gén promoterét tartalmazza.
- 8. Eljárás sokoldalú Marek-betegség élő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy (1) rekombináns Marek-betegség vírust madársejt tenyészetben tenyésztünk, ahol a rekombináns Marek-betegség vírus egy legyengített Marek-betegség vírus genom DNS-ét és legalább egy idegen gént tartalmaz, ahol az idegen gén a genom DNS legalább egy promoterétől lefelé, egy teljes leolvasókereten belül épül be a genom DNS-be, ahol a promoter az idegen gén kifejezésére alkalmas gazdasejtben működőképes, és a rekombináns Marek-betegség vírus a Marek-betegség vírus antigén és immunogén tulajdonságait hordozza és az idegen gén által kódolt polipeptidet tartalmazza, (2) az elszaporitott rekombináns Marek-betegség vírust izoláljuk madársejt-tenyészetből és (3) a kapott rekombináns Marek-betegség vírust legalább egy gyógyászati hordozóanyaggal, higitószerrel vagy segédanyaggal keverjük.♦· ·· • · * · • · ··· • · · ·· ·· ···· ·· • · ···· ·· ···
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegen génként polipeptidet, igy antigént, enzimet, peptidhormorftés szerkezeti alkalmazunk fehérjét kódoló gént amelyek a legyengített Marek-betegség vírustól eltérő vírusból, klamidiából, rikettsiából, mikoplazmából, baktériumból, protozoából, állati sejtből vagy növényi sejtből származnak vagy azok termelik.
- 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként glikoprotein A antigén (gA antigén) gén, glikoprotein B antigén (továbbiakban gB antigén) gén, antigén C gén, mintegy135 000 móltömegü DNS megkötő fehérjét kódoló gén, mintegy86 000 és mintegy 92 000 móltömegü és virusspecifikus fehérjéket kódoló gén, valamint minegy 36 000, mintegy 39 000 és mintegy 44 000 móltömegü foszforilezett fehérjéket kódoló gén promoterét alkalmazzuk.
- 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. lépés után kapott keveréket liofilizáljuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6697388 | 1988-03-20 | ||
| JP63230851A JP2779447B2 (ja) | 1988-03-20 | 1988-09-14 | 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT52555A true HUT52555A (en) | 1990-07-28 |
Family
ID=26408175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU891319A HUT52555A (en) | 1988-03-20 | 1989-03-20 | Process for production of virus and vaccina against recombinant marek-desease |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650153A (hu) |
| EP (1) | EP0334530B1 (hu) |
| JP (1) | JP2779447B2 (hu) |
| KR (1) | KR920000116B1 (hu) |
| AT (1) | ATE117369T1 (hu) |
| AU (1) | AU619812B2 (hu) |
| CA (1) | CA1340243C (hu) |
| DE (1) | DE68920610T2 (hu) |
| ES (1) | ES2066842T3 (hu) |
| HU (1) | HUT52555A (hu) |
| MY (1) | MY103854A (hu) |
| NZ (1) | NZ228409A (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2583115B2 (ja) * | 1988-09-10 | 1997-02-19 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 |
| GB8821441D0 (en) * | 1988-09-13 | 1988-10-12 | Animal Health Inst | Viral vectors |
| ES2077017T3 (es) * | 1989-10-20 | 1995-11-16 | Akzo Nobel Nv | Vacuna contra el virus de la bronquitis infecciosa. |
| EP0431668B1 (en) * | 1989-12-04 | 1995-02-15 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof |
| EP0473210B1 (en) * | 1990-07-30 | 1994-04-13 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant Marek's disease virus |
| US5231023A (en) * | 1990-07-30 | 1993-07-27 | Akzo N.V. | Recombinant Marek's disease virus |
| FR2666589B1 (fr) * | 1990-09-07 | 1994-08-05 | Rhone Merieux | Nouveaux virus herpes recombinants, vaccin a base de ces recombinants, leur procede de preparation, genes, vecteurs et plasmides utilises dans ce procede. |
| ZA923041B (en) * | 1991-05-14 | 1993-04-28 | Akzo Nv | Recombinant vaccine against marek's disease |
| US5690939A (en) * | 1991-05-14 | 1997-11-25 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant vaccine against marek's disease |
| AU657144B2 (en) * | 1991-07-09 | 1995-03-02 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Recombinant Marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same |
| IL104382A0 (en) * | 1992-01-17 | 1993-05-13 | Solvay Animal Health Inc | Vaccine containing acemannan as an adjuvant |
| AU7971194A (en) * | 1993-10-12 | 1995-05-04 | Chiron Corporation | Methods for preserving recombinant viruses |
| EP0745127A4 (en) * | 1994-01-11 | 1999-10-20 | Cornell Res Foundation Inc | CONTROLLING MARE'S DISEASE BY PREVENTING LATENCY AND DEVELOPING TUMOR CELLS |
| JPH1084969A (ja) * | 1996-09-19 | 1998-04-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ヘモフィルス・パラガリナルム由来新規ポリペプチド及びその製法 |
| GB9808922D0 (en) * | 1998-04-24 | 1998-06-24 | Cantab Pharmaceuticals Res Ltd | Virus preparations |
| EP1038952A3 (en) * | 1998-12-09 | 2001-06-27 | Pfizer Products Inc. | Processes for preparation of Marek's Disease Virus using continuous avian cell lines |
| PE20141482A1 (es) | 2011-11-30 | 2014-11-08 | Merial Ltd | Vectores recombinantes de hvt que expresan antigenos de patogenos de aves y sus usos |
| US9114108B2 (en) | 2011-11-30 | 2015-08-25 | Merial, Inc. | Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof |
| CN117357642A (zh) | 2016-12-14 | 2024-01-09 | 勃林格殷格翰动物保健美国公司 | 表达禽病原体的多种抗原的重组hvt载体及其用途 |
| BR112022004488A2 (pt) | 2019-09-11 | 2022-05-31 | Zoetis Services Llc | Herpesvírus recombinante de vetores de peru que expressam antígenos de patógenos aviários e seus usos |
| MA58717A1 (fr) | 2020-06-17 | 2023-06-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vecteurs hvt recombinants exprimant l'hémagglutinine de la grippe et compositions immunogènes, et leur fabrication et leurs utilisations |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH666035A5 (de) * | 1984-12-24 | 1988-06-30 | Sandoz Ag | 8-alpha-acylaminoergolene. |
| JP2559384B2 (ja) * | 1985-07-29 | 1996-12-04 | ジ・アップジョン・カンパニ− | ウイルスワクチン |
| WO1987004463A1 (en) * | 1986-01-27 | 1987-07-30 | Syntro Corporation | Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same |
| ATE122720T1 (de) * | 1987-03-19 | 1995-06-15 | Synergen Inc | Virales vektorsystem zum einführen fremder dns- expressionserzeugnisse in gallinaceenvögeln. |
| EP0284416B1 (en) * | 1987-03-27 | 1995-02-22 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Recombinant avipoxyvirus |
| FR2632863B2 (fr) * | 1987-10-29 | 1990-08-31 | Transgene Sa | Virus du fowlpox recombinant et vaccins derives de ces virus |
-
1988
- 1988-09-14 JP JP63230851A patent/JP2779447B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-14 DE DE68920610T patent/DE68920610T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-14 AT AT89302485T patent/ATE117369T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-14 ES ES89302485T patent/ES2066842T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-14 EP EP89302485A patent/EP0334530B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-15 CA CA000593826A patent/CA1340243C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-17 AU AU31428/89A patent/AU619812B2/en not_active Ceased
- 1989-03-18 MY MYPI89000341A patent/MY103854A/en unknown
- 1989-03-20 HU HU891319A patent/HUT52555A/hu unknown
- 1989-03-20 NZ NZ228409A patent/NZ228409A/xx unknown
- 1989-03-20 KR KR1019890003474A patent/KR920000116B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-24 US US08/293,337 patent/US5650153A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0334530B1 (en) | 1995-01-18 |
| AU3142889A (en) | 1989-09-21 |
| MY103854A (en) | 1993-09-30 |
| ATE117369T1 (de) | 1995-02-15 |
| CA1340243C (en) | 1998-12-15 |
| JP2779447B2 (ja) | 1998-07-23 |
| EP0334530A1 (en) | 1989-09-27 |
| DE68920610D1 (de) | 1995-03-02 |
| KR890014740A (ko) | 1989-10-25 |
| JPH02291277A (ja) | 1990-12-03 |
| DE68920610T2 (de) | 1995-08-31 |
| KR920000116B1 (ko) | 1992-01-09 |
| NZ228409A (en) | 1990-09-26 |
| US5650153A (en) | 1997-07-22 |
| AU619812B2 (en) | 1992-02-06 |
| ES2066842T3 (es) | 1995-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT52555A (en) | Process for production of virus and vaccina against recombinant marek-desease | |
| RU2658439C2 (ru) | Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц | |
| CA2621320C (en) | Vaccines and methods to treat canine influenza | |
| KR970011149B1 (ko) | 재조합 아비폭스 바이러스 | |
| HU214904B (hu) | Eljárás pulyka rekombináns herpeszvírus és ebből származó élővektor-vakcina előállítására | |
| JPH09169663A (ja) | 組合わせタイプのニューカッスル病ウイルスワクチン | |
| NZ214984A (en) | Canine parvovirus vaccine | |
| JP6210998B2 (ja) | ベクターワクチンおよび生ワクチンの併用による感染症の予防方法 | |
| CN108368488B (zh) | 鸭肠炎病毒及其用途 | |
| US4303644A (en) | Feline infectious peritonitis virus vaccines | |
| US6913751B2 (en) | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production | |
| US20100008948A1 (en) | Recombinant herpesvirus useful in vaccine production | |
| RU2329060C2 (ru) | Способ получения непрерывной клеточной линии и ее применение | |
| TWI224139B (en) | Processes for preparation of Marek's disease virus using continuous avian cell lines | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| Losio et al. | A study on the long‐term immunity induced by La Sota strain of Newcastle disease virus grown in a BS/BEK cell line of bovine embryo kidney origin | |
| Abd El Wanis et al. | Effect of the infection with Cryptosporidium on the immune response of chickens vaccinated with Newcastle disease vaccines and/or Gumboro disease vaccines | |
| Aly et al. | Laboratory Evaluation of Live Recombinant HVT-IBD Vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |