DE69535092T2

DE69535092T2 - HERPESVIREN, UM gD IN VITRO ZU EXPRIMIEREN

Info

Publication number: DE69535092T2
Application number: DE69535092T
Authority: DE
Inventors: Jean-Christophe Francis Audonnet; Raphael Jean Darteil; Michel Albert Emile Riviere; Vladimir Zelnik; Louis Joseph Norman Ross
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: AU698913B2; AU2348795A; FR2719056B1; DE69535092D1; ES2270427T3; JPH10501964A; CA2188293C; PT757722E; EP0757722B1; US5676952A; EP0757722A1; JP3720843B2; FR2719056A1; WO1995029248A1; CA2188293A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante Herpesviren, die aus natürlicherweise an gD defizienten Herpesviren erhalten wurden, insbesondere Vogel-Herpesviren und Alpha-Herpesviren, insbesondere Vogel-Alpha-Herpesviren und insbesondere MDV-Serotypen 1, 2 und 3, sowie insbesondere VZV. Sie betrifft ferner u. a. ihre Verwendung als Impfstoffe und ihr Herstellungsverfahren.
Das für die Marek'sche Krankheit (Virus der Marek'schen Krankheit oder MDV) beim Huhn verantwortliche Virus ist ein Alpha-Herpesvirus. Drei Serotypen des MDV-Virus sind beschrieben (Bülow V.V. und Biggs P.M., Avian Pathology, 1975, 4, 133–146). Allein die onkogenen Viren des Serotyps 1 sind beim Huhn pathogen. Ihre Replikation im Wirt ruft die Bildung von Lymphomen der T-Zellen hervor, und eine Demyelinierung der motorischen peripheren Nerven setzt sich im Allgemeinen bei den befallenen Tieren in Anzeichen von Parese oder Paralyse fort (Calnek und Witter, Marek's Disease in Diseases of Poultry 9. Ausgabe, Seiten 342–390, Calnek B.W. et al., Hrsg. 1991, Iowa State Univ. Press). Dieser Krankheit mit sehr bedeutenden wirtschaftlichen Folgen für die Vogelzucht wird durch eine Impfung von 1 Tag alten Küken entweder mit dem Herpesvirus des Truthahns (Truthahn-Herpesvirus oder HVT oder auch MDV, Serotyp 3), ein Virus, der antigenisch dem MDV-Virus nahesteht, allerdings beim Huhn nicht pathogen ist, oder mit lebenden, beim Huhn nicht onkogenen und nicht pathogenen MDV-Stämmen, die den Serotypen 1 oder 2 angehören, vorgebeugt.
Für die Belange der Herstellung von Vakzinen werden diese drei Serotypen hauptsächlich auf primären Zellen von Hühnerembryonen (CEPs) kultiviert. Die primären Zellen von Entenembryonen können ebenfalls zur Multiplikation der MDV- Viren vom Serotyp 2 verwendet werden. Bei der Kultur in vitro sind diese Viren stark mit den Zellen assoziiert. Dieses Phänomen ist seit langem bekannt (Churchill A.E. und Biggs P.M. Nature, 1967, 215, 528–530), und es wurde auch festgestellt, dass die produzierten Virionen nach Kultur auf CEPs oral oder nasal für die Hühner nicht infektiös waren. Die Impfung mit diesen Viren macht demnach ihre Verabreichung auf parenteralem Weg, im Allgemeinen durch Transfixion der Flügelmembran oder durch intramuskuläre Injektion, nötig, was die Kosten der Impfung gegen die Marek'sche Krankheit in nicht-vernachlässigbarer Weise erhöht.
Im Gegensatz dazu existiert beim Huhn eine Produktion von infektiösen MDV-Viren, d. h. sie sind über die Luft oder durch einfachen Kontakt während der Infektion mit den pathogenen Stämmen des MDV-Virus übertragbar. Diese Produktion von infektiösem Virus erfolgt auf dem Niveau der Federfollikeln, und das Virus wird über die Mauserfedern, die Schuppen und die Federstäube in die Umgebung disseminiert (Calnek B.W. et al., Avian Diseases, 1970, 14, 219–233). Gerade dieser Mechanismus bewirkt die natürliche Ausbreitung der Krankheit in den Aufzuchten. Die zwischen der Kultur in vitro und der Replikation des MDV-Virus in vivo festgestellten Unterschiede wurden bis heute noch nicht erklärt.
Die Untersuchung der Kultur in vitro der HVT- oder MDV-Viren auf CEPs hat gezeigt, dass diese Viren mit den Zellmembranen fest assoziiert sind. Dies hat quasi die Abwesenheit von freien und infektiösen Virionen in den Kulturüberständen zur Folge.
Neuerdings wurde gezeigt, dass ein Gen, das ein zu HSV-1-gD homologes Glycoprotein kodiert, auf dem jeweiligen Genom der HVT- und MDV-Viren vorhanden ist (Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 1991, 72, 949–954; Zelnik V. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 2151–2162). Die Expressionsprodukte dieser Gene bei HVT und MDV wurden in Lysaten von CEPs, die mit diesen Viren infiziert waren, untersucht und erforscht. Durch diese Experimente ließ sich jedoch nicht die Expression des Glycoproteins gD bei diesen beiden Viren beweisen.
In der Tat wurden MDV-gD-Antigene, die in Form von Fusionsproteinen mit dem TrpE-Protein in E. coli exprimiert wurden, zur Auslösung der Antikörperproduktion bei Kaninchen verwendet, und kurioserweise haben die so hergestellten Seren in den Lysaten von CEPs, die mit HVT oder MDV infiziert waren, kein spezifisches Protein erkannt, obwohl die aus Fusionsproteinen, die MDV-gI- oder MDV-gE-Antigene exprimieren, hergestellten Antikörper die entsprechenden Glycoproteine erkennen, die von den MDV- oder HVT-Viren während der Kultur in vitro exprimiert wurden (Brunovskis P. et al., Proceedings 19th World's Poultry Congress, Seiten 118–122. Amsterdam, 19.–24. September 1992). Dies zeigt entweder ein Fehlen von Expression oder ein sehr geringes gD-Expressionsniveau während der Kultur in vitro von HVT und MDV.
Im Gegensatz dazu erkennen Seren von mit den pathogenen MDV-Stämmen infizierten Hühnern die Antigene HVT gD oder MDV gD, die in Form von Fusionsproteinen mit der Glutathion-Transferase exprimiert werden (Zelnik V. et al., Proceedings 19th World's Poultry Congress, Seiten 114–117. Amsterdam, 19.–24. September 1992). Diese Ergebnisse zeigen, dass die HV-gD- und MDV-gD-Gene während der Replikation in vivo beim Huhn recht gut exprimiert werden und dass die jeweiligen Glycoproteine nicht nur immunogen sind, sondern dass ihnen auch bestimmte antigenische Determinanten gemeinsam sind. Es ist festzustellen, dass bei den meisten bisher untersuchten Alpha-Herpesviren das Glycoprotein gD ein Hauptimmunogen ist, das signifikant zur Induktion der antiviralen Schutzimmunität bei dem infizierten oder immunisierten Tier beiträgt.
X. Tan und L.F. Velicer (Abstracts of the XVIII International Herpesvirus Workshop, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA, 1993, S. A145) haben auch festgestellt, dass gD nicht in Zellkultur oder zumindest nicht in einem durch Northern Blot nachweisbaren Spiegel exprimiert wurde, was die zellassoziierte Natur des MDV-Virus erklären könnte. Die Autoren schlagen vor, das MDV-gD im Epithel der Federfollikel vom Huhn exprimiert wird oder dass MDV in Form von umhüllten, nicht mit den Zellen assoziierten infektiösen Virionen gebildet wird. Dies wird auch in der internationalen Patentschrift WO 92/03587 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Durchführung einer konstitutiven Expression des gD-Glycoproteins durch das MDV-Virus, HVT eingeschlossen, überraschenderweise den Erhalt, wie bei der Infektion beim Huhn, von freien, nicht mit den Zellen assoziierten Virionen gestattet. Diese Besonderheit bietet die sehr vorteilhafte Möglichkeit der Verabreichung dieses Virus über die Luft zu Impfzwecken und gestattet zudem den Erhalt des freien Virus im Überstand der Kulturen in vitro, was den Erhalt und die Herstellung des Impfstoffs gegen die Marek'sche Krankheit erleichtert.
Überraschenderweise gestattet die vorliegende Erfindung durch Ersatz des natürlichen Promotors des gD-Gens bei den HVT- und MDV-Viren durch einen anderen Promotor die Expression der HVT-gD- und MDV-gD-Glycoproteine in vitro. Die Expression von gD, die insbesondere erhalten wird, indem dieses Gen unter die Kontrolle eines nicht durch das Virus geregelten Promotors gestellt wird, gestattet die vollständige Maturation der Virionen, die demnach die infizierten Zellen frei „verlassen" können. Diese gD-Expression in vitro wird unter Ersatz des natürlichen Promotors des Gens gD durch einen anderen Promotor realisiert, der insbesondere aus den klassischerweise bekannten starken eukaryotischen Promotoren gewählt werden kann (beispielsweise die HCMV IE-, oder SV40-Promotoren oder die frühen endogenen Promotoren des HVT- oder MDV-Virus ...) oder die späten Promotoren (beispielsweise die späten Promotoren von MDV oder HVT, insbesondere von gB MDV oder HVT ...). Diese neue Expression kann unter Anwendung der durch die Techniken der genetischen Rekombination beispielsweise unter Ersatz der Region, die stromaufwärts des ATG des gD-Gens liegt, durch einen exogenen Promotor vom HCMV IE- oder SV-40-Typ oder durch Übertragen des gD-Gens in die einzige lange Region des Virus und indem er unter die Kontrolle eines endogenen oder exogenen Promotors gestellt wird, erhalten werden. Es sind somit zahlreiche Möglichkeiten zur Expression des gD-Gens unter Kombination verschiedener Promotoren und verschiedener potentieller Insertionsstellen (wie die Stellen RR2, TK, gD, gI, US3, US2, US10 ...) realisierbar.
Diese Expression hat auf die biologischen Eigenschaften des rekombinanten Virus neue und unerwartete Folgen. Die Expression des gD-Glycoproteins während der Replikation in vitro der so konstruierten rekombinanten HVT- und MDV-Viren manifestiert sich in der Tat durch den Einbau des gD-Glycoproteins in die virale Hülle und den Erhalt von infektiösen Viren bei einem erhöhten Titer in den Kulturüberständen. Ferner sind die so erhaltenen rekombinanten Viren, indem die abgeschwächten Eigenschaften der Elternviren ganz beibehalten werden, für die Lymphozyten in vivo infektiöser und replizieren sich in diesen Zellen schneller. Dies hat eine größere und schnellere Diffusion dieser Viren in dem Organismus des Huhns zur direkten Folge. Somit ist der Schutz gegen die Marek'sche Krankheit ohne Rücksicht auf den Verabreichungsweg (oronasal oder parenteral) verbessert. Aufgrund dieser biologischen Modifikationen bei der Replikation des Virus kann der Schutz gegen die Marek'sche Krankheit früher und mit weitaus reduzierteren Vakzindosen als mit den klassischerweise verwendeten Vakzinen erhalten werden.
Es wurde außerdem festgestellt, dass es möglich ist, diese Information auf andere Herpesviren auszuweiten, deren genomische Struktur und biologischen Eigenschaften in vitro und in vivo denjenigen der vorstehend erwähnten Vogel-Herpesviren entsprechen. Beispielsweise ermöglicht die vorliegende Erfindung den Erhalt eines rekombinierten VZV-Virus, der das gD-Gen eines anderen Virus exprimiert, wie HSV-1 oder HSV-2, mit der sehr vorteilhaften Folge der Produktion von freiem VZV-Virus durch in vitro Kultur auf Zellen. Dieses rekombinante Virus kann ein Vakzin gegen VZV und gegen das Virus darstellen, das dem gD-Gen entstammt, beispielsweise HSV-1 oder HSV-2.
Tatsächlich existieren zwei umfangreiche die Erfindung betreffende Virustypen, die der Definition eines gD-definzienten Virus entsprechen, nämlich diejenigen, die in vitro in Zeltkulturen kein gD exprimieren, was der Fall ist bei den MDV-Viren, einschließlich HVT-Viren, und diejenigen, denen ein dem gD-Gen homologes Gen fehlt, was für das VZV-Virus (Varicella-zoster-Virus) der Fall ist.
Die Erfindung betrifft demnach sämtliche Herpesviren, die den MDV- und VZV-Virustypen im definierten Sinne gleichwertig sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein natürlicherweise an gD defizientes Herpesvirus (im Sinne der Erfindung nachstehend definiert), das transformiert worden ist, um während seiner Replikation ein gD-Glycoprotein in vitro zu exprimieren. Vorzugsweise handelt es sich um ein Vogel-Herpesvirus, insbesondere das MDV-Virus der Serotypen 1, 2 und 3, oder auch um das Varicella-Virus VZV.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die die Herpesviren betrifft, mit einem in vitro nicht exprimierten gD-Gen, steht beim Herpesvirus sein gD-Gen unter der Kontrolle eines Promotors, der anders ist als der natürliche Promotor dieses Gens. Der natürliche Promotor des gD-Gens wird durch einen endogenen Promotor (d. h. ein Promotor dieses Virus oder anderer Serotypen dieses Virus, insbesondere ein früher Promotor) oder exogenen Promotor ersetzt, der die Expression des gD-Gens in vitro gestattet.
Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Herpesvirus eine Expressionskassette, in der das gD-Gen unter der Kontrolle eines Promotors angeordnet ist, der seine Expression bei der Replikation des Virus in vitro gestattet.
Im Falle eines Herpesvirus, der das gD-Gen nicht von Natur aus präsentiert, umfasst die Kassette das gD-Gen eines anderen Virus, beispielsweise von HSV oder auch eines Virus, wie MDV, einschließlich HVT, und einen geeigneten Promotor, der der natürliche Promotor des inserierten Gens oder ein anderer Promotor sein kann, was der Fall ist, wenn das gD-Gen von einem Virus des Typs MDV stammt, mit der Maßgabe, dass eine Expression des gD-Gens in vitro ermöglicht wird.
Im Falle eines Herpesvirus, das nur in der Expression von gD in vitro defizient ist, kann die Kassette auch genauso gut das endogene gD-Gen wie ein anderes gD-Gen und einen geeigneten Promotor, wie vorstehend definiert, umfassen.
Die Expressionskassette wird in eine für die Replikation des Virus nicht essentielle Stelle und für die Wirksamkeit des Virus als Vakzin nicht essentielle Stelle inseriert. Für die MDV-Viren der Serotypen 1, 2 und 3 wird eine Insertionsstelle zweckmäßigerweise aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus US2, US3, US10, gI, gD, TK, RR2, UL13. Es ist selbstverständlich, dass diese Aufzählung nicht- einschränkend ist, und dass jede potentielle Insertionsstelle verwendet werden kann. Für das VZV-Virus kann eine Insertionsstelle aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus TK, US3, gI, gE, gC, der Intergenregion US3-gI.
Es ist selbstverständlich, dass das gD-Gen in einer Kassette, wie zuvor definiert und gleich welches ihr Ursprung ist, in MDV oder ein anderes Virus des gleichen Typs an die Stelle des gD-Gens selbst oder an eine andere Insertionsstelle inseriert werden kann.
Die vorliegende Erfindung hat vorzugsweise ein Herpesvirus zum Gegenstand, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus MDV der Serotypen 1, 2 und 3 und VZV, das in vitro während seiner Replikation ein gD-Glycoprotein exprimiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die in vitro Virus-Produktion, insbesondere von infektiösem HVT und MDV, in Form von freien Virionen, die im Kulturüberstand von Zellen vorhanden sind. Die Kulturtechniken sind insbesondere diejenigen, die in der Praxis üblicherweise für ein gegebenes Virus angewandt werden. Diese sind dem Fachmann hinreichend bekannt und wurden demnach hier nicht im Einzelnen beschrieben. Die Verwendung der erfindungsgemäßen transformierten Viren bei der Virus-Herstellung erleichtert die Herstellung von Vakzinen, insbesondere derjenigen gegen die Marek'sche Krankheit, und von rekombinanten Viren, insbesondere HVT und MDV, wodurch sich generalisierte schnellere zytopatische Wirkungen (2 bis 3 Tage, je nach Reichhaltigkeit des Inokulums) und eine bessere Resistenz des Virus gegenüber Konservierungsvorgängen durch Tiefgefrieren oder durch Lyophilisation erhalten lassen. Zweckmäßigerweise werden im Kulturüberstand erhöhte Titer an freien Viren im Vergleich zu demjenigen, der in Abwesenheit von gD-Expression erhalten wird, erhalten. Es handelt sich hier um ein bemerkenswertes Ergebnis.
Die Erfindung hat demnach ein Kultivierungsverfahren für natürlicherweise an gD defizientem Herpesvirus zum Gegenstand, wobei das Virus, das durch genetische Rekombination transformiert worden ist, um das gD-Glycoprotein zu exprimieren, auf Zellen kultiviert wird und anschließend die im Kulturüberstand produzierten Virionen geerntet werden. Die Kulturtechniken für Viren sind insbesondere diejenigen, die üblicherweise in der Praxis angewandt werden. Der Fachmann kennt die jedem Virus angemessenen Techniken. Diese wurden hier nicht mehr im Einzelnen beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Herpesvirus-Kulturen, die durch dieses Verfahren erhalten werden können. Kennzeichen dieser Kulturen ist insbesondere die Tatsache, dass sie das Virus, insbesondere MDV, HVT, VZV, im freien Virionenzustand, d. h. nicht mit Zellen assoziiert, umfassen und dass sie die bereits angegebenen Eigenschaften und Qualitäten aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Produktion von Viren in vitro, insbesondere von infektiösem HVT oder infektiösem MDV, die als Expressionsvektoren für Fremdgene verwendet werden können, insbesondere für Gene oder Fraktionen von Genen, die Antigene kodieren, die einen Schutz gegen Krankheiten, insbesondere einen Schutz von Zuchtvögeln gegen Viren, Bakterien oder pathogene Parasiten auslösen, die für Vogelkrankheiten verantwortlich sind, und insbesondere für Hühner.
Die Erfindung hat demnach auch die Herpesviren, wie zuvor definiert, zum Gegenstand, die ferner mindestens ein heterologes inseriertes Gen in ihrem Genom in der Weise umfassen, dass dieses Gen in vivo exprimiert werden kann. Hierzu kann das rekombinante Virus entweder eine doppelte Kassette umfassen, die das gD-Gen, den Promotor von diesem und das Gen, das das Antigen mit einem geeigneten Promotor kodiert, einschließt, wobei die Kassette an der gD-Stelle für ein Virus, wie MDV, oder an einer anderen Stelle, d. h. eine Kassette für jedes Gen, inseriert werden kann, wobei diese das gD-Gen umfasst, das beispielsweise an einer anderen Stelle inseriert werden kann, wie die natürliche gD-Stelle im Falle eines Virus, wie MDV, und wobei die andere Kassette beispielsweise an der natürlichen gD-Stelle oder an jeder anderen geeigneten Stelle inseriert werden kann, d. h. wiederum wird allein der natürliche Promotor des gD-Gens ersetzt, und die Kassette, die das heterologe Gen einschließt, wird an einer anderen geeigneten Stelle inseriert.
Als bemerkenswert ist anzumerken, dass wenn das Virus, wie MDV, transformiert worden ist, um endogenes gD-Gen oder eines von einem anderen Serotyps unter der Kontrolle eines wirksamen erfindungsgemäßen Promotors zu exprimieren, dieses inserierte Gen in vivo während der Virämie und nicht nur in den Federfollikeln (ist bei natürlichem gD der Fall) exprimiert wird, was sich insbesondere in einer stärkeren und früheren, insbesondere zellulären, Immunantwort manifestiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist noch die Herstellung von Vakzinen, die zweckmäßigerweise über die Luftwege (nasal, Okular), oral oder parenteral verwendbar sind, insbesondere zur Immunisierung der Hühner gegen die Marek'sche Krankheit und gegen andere Krankheiten, entsprechend den spezifischen, durch die rekombinanten HVT- oder MDV-Viren exprimierten Antigene.
Die erfindungsgemäßen Vakzine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Lebendvirus umfassen, wie zuvor definiert, und dass sie insbesondere in lyophilisierter oder tiefgefrorener Form vorliegen können.
Das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Lebendvakzins ist dadurch gekennzeichnet, dass auf Zellen ein natürlicherweise an gD defizientes Herpesvirus kultiviert wird, das transformiert worden ist, um gD während seiner Replikation in vitro zu exprimieren, und das ggf. transformiert worden ist, um in vivo mindestens ein heterologes Gen zu transformieren, das ein Antigen oder ein Vakzin betreffendes Immunogen kodiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Herstellung von in ovo verabreichbaren Vakzinen zum Impfen der Hühner gegen die Marek'sche Krankheit und die erhaltenen Vakzine.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht speziell in der Verwendung des gD-Gens als Insertionsstelle zur Konstruktion von rekombinanten Vogel-Herpesviren, insbesondere HVT oder MDV, die darüber hinaus Fremdgene exprimieren, die zur Impfung von Interesse sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch der Erhalt von Vogelviren, insbesondere infektiösem HVT oder infektiösem MDV, die als Vektoren zur Expression von Fremdantigenen dienen können und die Impfung in ovo erlauben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Impfverfahren, insbesondere von Zuchtvögeln, unter Verwendung der erfindungsgemäß transformierten Viren; und das insbesondere ihre Verabreichung über den Luftweg vorsieht, obwohl die anderen Wege nicht ausgeschlossen sind.
Schließlich gestattet die Entdeckung des der Erfindung zugrunde liegenden Prinzips dem Fachmann, auch bei den Viren vom MDV-Typ nach natürlichen Mutanten zu suchen, die gD in vitro exprimieren. Diese Mutanten gehören demnach zum Rahmen der Erfindung.
Die Erfindung wird nun ausführlicher mit Hilfe von Ausführungsbeispielen beschrieben, wobei auf die Zeichnung Bezug genommen wird. Es zeigen:
1: Durch Verdau des Plasmids pRD001, das ein HVT-DNA-Fragment von 29 kb umfasst, die Konstruktion der Plasmide pRD006 und pRD007, die ein 2,8 kb-Fragment, das den 5'-gD-Teil von PstI einschließt, beziehungsweise ein Fragment von 5,7 kb umfassen, welches den 3'-gD-Teil von PstI einschließt;
2: Konstruktion des Plasmids pRD015, das den flankierenden 5'-Teil von gD umfasst, ausgehend von Plasmid pRD001;
3: Plasmid pRD022, das ausgehend von dem Vektor pBS-SK+ erhalten wird und das gD-Gen, dem sein 5'-Teil der SacI-Stelle fehlt, umfasst;
4: Plasmid pRD030, das das Gen gD und die Restriktionsschnittstellen, die es flankieren, vollständig umfasst;
5: Ausgehend von pCMVβ die Konstruktion des Plasmids pRD031, das das gD-Gen unter der Kontrolle des HCMV IE-Promotors enthält, unter Ersatz des LacZ-Gens durch gD;
6: Plasmid pRD040, das eine Kassette, die das gD-Gen und den HCMV IE-Promotor einschließt, umfasst, in dem pBS-SK+-Vektor;
7: Konstruktion des Plasmids pRD041, erhalten durch Addition der 5'-flankierenden Sequenz, die in dem Plasmid pRD015 enthalten ist, an das Plasmid pRD040;
8: Konstruktion des Plasmids pRD043, umfassend das gD-Gen, den HCMV-Promotor und die SV40-Promotor/LacZ-Gen-Gruppe, die von pSVβ in pRD041 zwischen dem HCMV-Promotor und seiner 5'-flankierenden Sequenz eingeschleust wurde;
9: Konstruktion des Plasmids pRD046, ausgehend von Plasmid pBamB, das ein HVT BamHI B-Fragment enthält, das das TK-Gen einschließt;
10: Konstruktion des Plasmids pRD051 durch Einbau einer multiplen Restriktionsschnittstelle in die einzige DraIII-Schnittstelle des Plasmids pRD049;
11: Konstruktion des Plasmids pRD053, das die HCMV-Promotorkassette und das Gen HVT-gD, inseriert in das TK-Gen von HVT, umfasst.
BEISPIELE
Sämtliche für die Konstruktionen der gegebenen Plasmide angewandten Techniken sind die von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Standardtechniken. Der Inhalt dieser Veröffentlichung wird als in dieser Beschreibung durch Bezugnahme eingeschlossen betrachtet.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel hat die doppelte Aufgabe, einerseits die Expression von gD im Epithel der Federfollikel des Huhns zu zeigen und andererseits, gemäß der Erfindung, zu zeigen, dass die Nicht-Expression von gD in vitro mit dem natürlichen Promotor verbunden ist, und durch Ersatz des natürlichen Promotors durch einen anderen Promotor erhalten werden kann.
– Federn und Gewebe:
1 Tag alte Rhode-Island-Red-(HPRS RIR)-Küken haben 1000 u.f.p. (Plaque-bildende Einheiten) eines MDV RB1B-Stammes oder eines HPRS16-Stammes erhalten, und die Federn, die Bursae, Thymus und Milz wurden 4 bis 6 Wochen nach der Impfung entnommen. Die gleichen Gewebe, die von nicht-infizierten SPF-Hühnern stammten, dienen als Kontrolle.
Die aus dem dorsalen und pektoralen Bereich erhaltenen Federn wurden an der proximalen Extremität entnommen, und die Spitzen der Federn von etwa 0,5 cm Länge wurden mit Scheren abgeschnitten und in PBS oder in Extraktionspuffer (Dithiothreitol 5 mM, PMSF 50 μg/ml, Sarkosyl 1,5 %) suspendiert. Im Regelfall werden 20 Federspitzen pro ml Puffer verwendet. Nach einer Inkubation von 24 bis 36 h bei 4°C wurden die Präparationen mit Ultraschall (3 × 30 s) behandelt und bei 10000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände, die gewöhnlich 2 μg Protein pro μl enthielten, wurden für eine Western-Blot-Analyse verwendet.
Die Antigene wurden aus Bursae, Thymus und Milz mit Hilfe derselben Puffer wie diejenigen, die für die Federn eingesetzt wurden, extrahiert.
– CEP, infiziert mit einer Vakzine-gD-Rekombinante:
Hühnerembryo-(CEP)-Fibroblasten wurden mit einem rekombinanten gD-Vakzin (Virus des Vakzins, umfassend das gD-Gen, das in eine für seine Replikation nicht-essentielle Stelle und unter der Kontrolle eines endogenen Vakzin-Promotors inseriert ist) in einer Infektionsmultiplizität von etwa 1 u.f.p./Zelle infiziert, und 3 bis 4 Tage später, wenn die e.c.p. (zytopathischen Wirkungen) sehr ausgeprägt waren, geerntet. Die Zellen wurden abgeschabt, schnell in PBS gewaschen und mit Ultraschall in PBS bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml behandelt.
– Western Blot:
Die zur Western-Blot-Analyse bestimmten Proben wurden in einem Denaturierungspuffer zum Sieden gebracht, und 10 μg Federn oder Gewebe wurden pro Vertiefung (oder pro Spur) angewandt. Im Falle der mit dem gD-Vakzin infizierten CEP wurden nur 4 μg pro Vertiefung angewandt. Die Polypeptide wurden durch Elektrophorese auf 12 % Acrylamid-Gel unter Verwendung eines BioRad Minigel-Gerätes aufgetrennt und auf Nitrocellulose (Hybond C, Amersham) übergeführt. Nach der Überführung wurden die Polypeptide mit Ponceau-Rot gefärbt und photographiert, um sicherzustellen, dass die abgeschiedenen Proteinmengen in jeder Vertiefung vergleichbar waren.
Die Blots wurden mit PBS gewaschen, mit 5 % entrahmter Milch in PEST (25 mM Tris pH 7,6, 0,14 M NaCl und 0,05 % Tween 20) blockiert und viermal in PEST jeweils 5 min gewaschen. Anschließend werden sie mit einem Überstand des DA7-Hybridoms (gD-spezifisch), verdünnt 1/50 in PBS, enthaltend 1 % BSA, 1 h bei Umgebungstemperatur behandelt. Nach 4 Waschgängen in PEST wurden die Blots mit Antimaus-Ziegen-IgG, konjugiert mit Peroxidase (Sigma), verdünnt 1/1000 in PEST, inkubiert, und die gebundenen Antikörper wurden durch Chemolumineszenz (reaktive Chemolumineszenz) für Dupont Western Blotting (Dupont) nachgewiesen. Röntgenstrahl-empfindliche Filme wurden 30 s bis 1 Minute nach der klassischen Technik exponiert.
– Immunofluoreszenztest:
Ausschnitte, die mit einem Microtom (Cyrostat) vorgenommen wurden, wurden 10 min bei Umgebungstemperatur in Aceton fixiert. Sie wurden an Luft getrocknet, mit 5 % BSA in PBS 30 min bei Umgebungstemperatur behandelt, um nichtspezifische Reaktionen zu verhindern. Der monoklonale DA7-Antikörper (Verdünnung 1/100 in BSA, 1 % PBS) oder monoklonaler BD1-Antikörper (Maus-Ascitesflüssigkeit, pp38/24 spezifisch, 1/1000 in PBS mit 1 % BSA verdünnt), wurde anschließend 1 h bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Die Plättchen wurden dreimal jeweils 15 min in PBS gewaschen. Antimaus-Ziegen-IgG, konjugiert mit FITC, 1/100 in PBS mit 1 % BSA verdünnt, wurde anschließend 1 h bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Die Plättchen wurden viermal jeweils 15 min in PBS gewaschen, in Wasser eingetaucht, in Glycerin/PBS fixiert und unter UV-Licht mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops ausgewertet.
– Ergebnisse:
Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass die Federpräparationen, die aus drei verschiedenen mit MDV infizierten Hühnern stammten mit dem monoklonalen DA7-Antikörper reagierten. Der Antikörper erkannte ein Polypeptid, das in Form einer 55-kDa-Bande auftrat, was mit der erwarteten Größe für gD und mit dem in vitro Translationsprodukt des MDV-gD (Zelnik et al., J. Gen. Virol. 75, 2747–2753) im Einklang steht. Produkte mit geringerem Molekulargewicht (35 kDa und kleiner) wurden festgestellt und könnten nicht-glycosylierten Formen entsprechen.
Dies zeigt die Expression von gD in den Federfollikeln bei den mit MDV infizierten Hühnern.
Extrakte von nicht infizierten Hühnern, von nicht infizierten CEP und von nur mit dem Vakzin infizierten CEP reagierten nicht mit dem monoklonalen DA7, was die Spezifität des Tests beweist. Die Extrakte von CEP, die mit dem rekombinanten gD-Vakzin infiziert waren, haben zwei Banden ergeben, wovon eine Bande der 55-kDa-Bande des Versuchs mit den Federextrakten entspricht.
Die Spezifität des Tests wurde außerdem kontrolliert, indem gezeigt wurde, dass der gegen pp38/24 gerichtete Antikörper weder mit den CEP, die mit dem rekombinanten gD-Vakzin infiziert waren, noch mit den CEP, die nicht infiziert waren, reagierte. Im Gegensatz dazu reagiert dieser monoklonale Antikörper, wie erwartet, recht gut mit den Extrakten von Federn von Hühnern, die mit den mit MDV infizierten CEP infiziert waren.
Es wurde also gezeigt, dass gleichzeitig die Federpräparationen, die mit MDV infiziert waren, und die CEP, die mit dem rekombinanten gD-Vakzin infiziert waren, mit dem monoklonalen Anti-gD reagierten und dass demnach die Expression dieses Gens in vitro erhalten wurde.
Der Ersatz des natürlichen Promotors des gD-Gens durch einen anderen Promotor ermöglichte demnach die Expression von gD in vitro.
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids pRD043
Der Stamm FC126 des HVT-Virus wurde im Jahre 1968 von Dr. Witter vom Regional Poultry Research Laboratory (U.S.D.A., East Lansing, Michigan, USA) in einer Herde von Puten von 23 Wochen (R.L. Witter et al., Am. J. Vet. Res. 31, 525–538, 1970) isoliert. Er wurde anschließend 10 Mal auf Entenfibroblasten passagiert, anschließend 9 zusätzlichen Passagen auf Embryonen-Fibroblasten von EOPS-Hühnern unterzogen. Die verwendete DNA stammte aus Virus, der insgesamt 23 bis 24 Passagen, ausgehend von dem Ursprungsisolat, unterzogen wurde.
Es kann beispielsweise auch der Stamm HVT, registriert bei der ATCC unter der Bezugsnummer VR584C, verwendet werden.
Die genomische DNA des HVT-Virus wurde nach der von N. Ross (Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 1989, 70, 1789–1804, hier durch Bezugnahme mit umfasst), beschriebenen Technik extrahiert. Diese DNA wurde durch BamHI verdaut, anschließend wurde das Fragment A von 29 kb (Igarashi T. et al., Virology 1987, 157, 351–358), das die US-Region von HVT umfasste, in den pBR322-Vektor kloniert, der zuvor mit BamHI verdaut wurde, um das Plasmid pRD001 zu ergeben. Das pRD001 wurde durch PstI verdaut, und die PstI-PstI-Fragmente von 2,8 kb und 5,7 kb wurden in das Plasmid pBR322 kloniert, das mit PstI verdaut wurde, um die Plasmide pRD006 und pRD007 zu ergeben (1).
pRD001 wurde mit XhoI verdaut, und das XhoI-XhoI-3,5-kb-Fragment wurde in den pBluescript-KS+-Vektor kloniert, um das Plasmid pRD015 zu ergeben (2). Das Plasmid pRD006 wurde mit SacI und PstI verdaut, um das SacI-PstI-Fragment von 340 bp zu isolieren (Fragment A). Eine PCR wurde mit den Oligonucleotiden RD045 (SEQ ID NO 1: 5'-TGCTGGTACCGTCGACAAGCTTGGATCCGTGCAGATAAC-ACGTACTGGC-3') und pBR Pst-(SEQ ID NO 2: 5'-CATGTAACTCGCCTTGATC-3') und der pRD007-Matrix durchgeführt, um die 3'-Region des gD-Gens (Positionen 6491 bis 6980 auf der HVT US-Sequenz zu amplifizieren (Zelnik V. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 2151–2162, hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen). Das PCR-Fragment von 560 bp wurde anschließend durch PstI und KpnI verdaut, um ein PstI-KpnI-Fragment B von 520 bp zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden in den Vektor pBS-SK+ kloniert, der zuvor mit SacI und KpnI verdaut wurde, um das Plasmid pRD022 zu ergeben (3), das das gD-Gen ohne einen 5'-Teil umfasste.
Das Plasmid pRD022 wurde mit BamHI und SacI verdaut, um das BamHI-SacI-Fragment von 850 bp (Fragment C) zu isolieren. Eine PCR wurde mit den Oligonucleotiden RD050 (SEQ ID NO 3: 5'-TGCTGAATTCGCGGCCGCATGATT-ATTGTCACCACTTC GAAGATGGC-3') und HVT40M1 (SEQ ID NO 4: 5'-GTCCCCGTTGACAACTACTA-3') und der Matrix pRD006 durchgeführt, um die 5'-Region des gD-Gens (Positionen 5747 bis 6286) auf der HVT-Us-Sequenz (Zelnik V. et al., J. Gen. Virol, 1993, 74, 2151–2162)) zu amplifizieren. Das PCR-Fragment von 560 bp wurde durch EcoRI und SacI verdaut, um ein EcoRI-SacI-Fragment D von 420 bp zu isolieren. Die Fragmente C und D wurden in einen modifizierten pBS-SK+-Vektor kloniert, der die XbaI- und SpeI-Stellen nicht mehr umfasste (pBS-SK+, verdaut mit XbaI und SpeI, anschließend Ligation), der mit EcoRI und BamHI verdaut wurde, um das Plasmid pRD030 (4), das das gD-Gen umfasste, zu ergeben.
Das Plasmid pRD030 wurde mit NotI verdaut, um das Fragment NotI-NotI von 1250 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den Vektor pCMvβ, (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA), verdaut mit NotI, zur Insertion des gD-Gens an die Stelle von LacZ, kloniert, was das Plasmid pRD031 (4944 bp) ergab, das das Gen HVT-gD unter der Kontrolle des Promotors HCMV IE (5) enthielt.
Das Plasmid pRD031 wurde einerseits mit EcoRI und BstBI und andererseits mit BstBI und BamHI verdaut, um das Fragment EcoRI-BstBI von 800 bp bzw. das Fragment BstBI-BamHI von 1250 bp zu isolieren. Diese beiden Fragmente wurden in den Vektor pBS-SK+, verdaut mit EcoRI und BamHI, kloniert, um das Plasmid pRD040 (6) zu ergeben, das den HCMV-Promotor und gD in dem SK+-Vektor umfasste.
Das Plasmid pRD015 wurde mit KpnI und BstBI verdaut, um ein KpnI-BstBI-Fragment von 2100 bp zu ergeben. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-KS+, verdaut mit KpnI und ClaI, kloniert, um das Plasmid pRD033 (5024 bp) zu ergeben. Das pRD040-Plasmid wurde mit EcoRI und SpeI verdaut, um das Fragment EcoRI-SpeI von 2000 bp zu ergeben. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pRD041, verdaut mit EcoRI und XbaI, kloniert, um das Plasmid pRD041 zu ergeben (7), das gD, den HCMV-Promotor und die flankierende 5'-Region umfasste.
Das Plasmid pSVβ (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, um das Fragment EcoRI-HindIII von 4300 pb zu isolieren. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pRD041, verdaut mit EcoRI und HindIII, kloniert, um das Plasmid pRD043 (11306 pb) zu ergeben (8), das zusätzlich zu pRD041 das Gen LacZ und seinen SV40-Promotor umfasste.
Das Plasmid pRD053 gestattete gleichzeitig den Austausch des natürlichen gD-Promotors durch den HCMV IE-Promotor und das Einbringen durch homologe Rekombination unter Verwendung des 5'-Endes, entsprechend dem Fragment der Basen 2152 bis 4245 (Zelnik 1993 – supra) (Fragment entsprechend dem größten Teil des Gens sORF-3, dem Gen US2 und dem Anfang des Gens US3), und des 3'-Endes von den Positionen 5747 (A von ATG des Gens gD) bis 6980 (was dem gD-Gen und polyA entspricht).
Es ist selbstverständlich, dass anstelle des Einbringens des LacZ-Gens auch leicht ein Gen eingebracht werden könnte, das ein Antigen von Interesse kodiert.
Beispiel 3: Konstruktion des Plasmids pRD053 (CMV-gD-Kassette in TK)
Das HVT BamHI B-Fragment (Igarashi T. et al., Virology, 1987, 157, 351–358), enthaltend das TK-Gen, wurde in den Vektor pBR322 kloniert, um das Plasmid pBamB zu ergeben. Das pBamB-Plasmid wurde mit HindIII verdaut, um das HindIII-HindIII-Fragment von 3200 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den pBS-SK+-Vektor, verdaut mit HindIII, kloniert, um das Plasmid pRD046 zu ergeben (9). Das Plasmid pRD046 wurde mit SalI verdaut, mit Klenow-Polymerase repariert und anschließend mit SacI verdaut, um das Fragment SalI(K-)SacI von 3200 bp zu isolieren. Anschließend wurde dieses Fragment mit dem pUC18-Vektor, der zuvor durch HindIII und SacI verdaut wurde, ligiert, um das Plasmid pRD049 (5943 bp) zu ergeben. Das Plasmid pRD049-Plasmid wurde nun durch DraIII (einzige Schnittstelle auf pRD049) verdaut, durch Einwirkung von alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und mit einem synthetischen doppelsträngigen Oligonucleotid ligiert, das durch Hybridisierung der beiden folgenden Oligonucleotide erhalten wurde:
RD053 SEQ ID NO 5: 5'-GTGGTACCATAGTCGACACCCT-3'
RD054 SEQ ID NO 6: 5'-GTGTCGACTATGGTACCACAGG-3'
Das so erhaltene Plasmid wurde pRD051 genannt (9). Dieses Plasmid wurde durch KpnI und SalI verdaut, um das Fragment KpnI-SalI von 5960 bp (Fragment A) zu isolieren. Das Plasmid pRD040 (siehe Beispiel 1) wurde mit KpnI und BstBI verdaut, um das Fragment KpnI-HCMV IE-ATG-BstBI von 800 bp (Fragment B) zu isolieren. Das Plasmid pRD031 wurde mit BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-HVT gD-SalI von 1450 bp (Fragment C) zu isolieren. Die Fragmente A, B und C wurden anschließend zusammen ligiert, um das Plasmid pRD053 (11) zu ergeben, das die in TK inserierte gD-Kassette umfasste.
Dieses Plasmid gestattete das Einbringen dieser gD-Kassette in das TK-Gen durch homologe Rekombination unter Verwendung der homologen flankierenden 5'- bzw. 3'-Enden der Region stromaufwärts der DraIII-Schnittstelle des TK-Gens (Fragment HintIII-DraIII von 520 bp) und stromabwärts der DraIII-Stelle des TK-Gens (Fragment DraIII-HindIII von 2650 bp). Diese Insertion führte zur Inaktivierung von TK.
Dieses Plasmid wird mit SacI vor der Transfektion mit viraler HVT-DNA linearisiert.
Beispiel 4: Isolierung und Reinigung des rekombinanten vHVT004-Virus
Die für die Transfektionsexperimente verwendete virale DNA wurde nach der von Robin Morgan (Morgan R.W. et al., Avian Diseases, 1990, 34, 345–351, durch Bezugnahme hier mit eingeschlossen) beschriebenen Technik hergestellt. Das Plasmid pRD043 wurde mit KpnI zur Linearisierung verdaut, anschließend mit einem Gemisch von Phenol/Chloroform (19:1) extrahiert, mit absolutem Ethanol präzipitiert und wieder in sterilem Wasser aufgenommen.
Primäre CEP-Zellen von 24 h wurden mit dem folgenden Gemisch transfiziert: 5 μg virale DNA + 1 μg pRD043-Plasmid, linearisiert in 300 μl OptiMEM-Medium (Gibco) und 100 μg Lipofectamin (Gibco BRL Ref. 18324-012) in 300 μl Medium (Endvolumen des Gemisches = 600 μl). Diese 600 μl wurden anschließend in 3 ml (Endvolumen) Medium verdünnt und auf 3 × 10⁶ CEPs ausgestrichen. Das Gemisch wird 5 h mit den Zellen in Kontakt gelassen, anschließend verworfen und durch 5 ml Kulturmedium ersetzt. Die Zellen werden anschließend 3 Tage bei 37°C in Kultur belassen, anschließend werden sie pronasiert, mit frischen sekundären CEPs vermischt (3:1-Gemisch) und wieder in Petrischalen bis zum Auftreten einer zytopathischen Wirkung (ECP) ausgestrichen. Der Zellbelag wird nun pronasiert und dient als Inokulum (im Verhältnis von 1 Plaque pro Schale) für Schalen von 60 mm (enthaltend 2 × 10⁶ sekundäre CEPs)). Drei Tage nach dem Animpfen wird eine Agar-Schicht über den Zeltteppich gegossen. 24 h später wird eine Agar-Überzugschicht, enthaltend X-Gal (500 μg pro ml Endkonzentration), darüber gegossen. Drei Stunden später entwickelt sich auf dem Niveau der die rekombinanten Viren enthaltenden Plaques eine intensive blaue Färbung. Jede blaue Plaque wird nun zur Amplifikation einzeln wieder in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte aufgenommen. Beim Auftreten einer ECP wurde jede Vertiefung pronasiert und dient zur Animpfung für eine neue 60-mm-Schale. Die Selektion der rekombinanten Plaques und die Abschätzung in Prozent der Reinigung dieser Plaques erfolgen wie zuvor durch X-Gal-Färbung der Plaques auf Agar. Im Allgemeinen sind 4 aufeinanderfolgende Isolierungscyclen ausreichend, um rekombinante Viren zu erhalten, wovon die Gesamtheit der Abkömmlinge die blaue Färbung zeigte. Jede einzelne zu 100 % gereinigte Plaque wird demnach auf molekularem Niveau durch PCR-Technik und Southern Blot unter Verwendung der Oligonucleotide und der entsprechenden DNA-Sonden gereinigt.
Ein zu 100 % reiner Klon, der die Merkmale der erwarteten Rekombinanten zeigte, wurde isoliert und als vHVT004 bezeichnet. Dieses Virus enthält eine SV40-LacZ-Kassette, die zwischen den Genen US2 und gD inseriert ist, sowie den HCMV IE-Promotor, der direkt stromaufwärts des Gens gD angeordnet ist und somit dieses Gen an seiner Ursprungsstelle kontrolliert. Dieses Virus ist daher an US3 deletiert, das die Insertionsstelle ist.
Beispiel 5: Isolierung und Reinigung des rekombinanten Virus vHVT005 (TK-)
Die genomische DNA des HVT-Virus, die für die Transfektionsexperimente verwendet wurde, wurde wie zuvor hergestellt (Morgan R et al., Avian Diseases, 1990, 34, 345–351). Die Transfektionen wurden mit dem Plasmid pRD053, linearisiert durch ScaI, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Nach 3 Tagen in Kultur werden die Zellen pronasiert, mit frischen sekundären CEPs gemischt und wieder auf Petrischalen ausgestrichen. Beim Auftreten einer ECP wird der Zellteppich pronasiert und dient der Animpfung für die 60-mm-Petrischalen. Die Kultur wird nun mit einem Kulturmedium durchgeführt, enthaltend 1-β-D-Arabinofuranosylthymidin (ara T) (Sigma) in einer Endkonzentration von 100 μg/ml in Kulturmedium. Ara T hemmt die Replikation der HVT TK+-Viren, und nur die natürlichen Mutanten TK- oder die Rekombinanten TK- können sich in Gegenwart von ara T replizieren. Drei Tage nach der Infektion wird eine Agar-Schicht über die Zellkultur gegossen. 24 h danach werden die auf der Zellkultur vorhandenen viralen Plaques wieder einzeln in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgenommen. Die Kultur dieser Plaques erfolgt in Gegenwart von ara T in dem Kulturmedium. Beim Auftreten einer ECP werden die Vertiefungen pronasiert, die Verdünnungen der infizierten Vertiefungen werden auf Petrischalen ausgestrichen und ein neuer Kulturcyclus unter Agar wird wie zuvor durchgeführt. Nach zwei Kulturcyclen in Gegenwart von ara T kann die Kultur in normalem Milieu durchgeführt werden. Vier Isolier-/Reinigungscyclen sind ausreichend, um rekombinante, zu 100 % reine Klone für den TK-Merkmal zu enthalten. Diese Klone werden nun auf molekularem Niveau mit den in der Molekularbiologie üblichen Techniken (PCR, Southern Blot, etc. ...) charakterisiert.
Ein zu 100 % reiner Klon, der die Merkmale der erwarteten Rekombinante zeigt, wurde isoliert und als vHVT005 bezeichnet. Dieses Virus enthält das gD-Gen unter der Kontrolle des HCMV IE-Promotors in dem TK-Gen, welches demnach inaktiv ist.

Claims

Rekombinanter Virus der Marekschen Krankheit (MDV) vom Serotyp 1, 2 oder 3, (i) bei dem das gD-Gen des MDV-Virus unter der Kontrolle eines Promotors platziert ist, der ein anderer ist als der natürliche Promotor dieses Gens und in der Lage ist, die Expression des gD-Gens bei der Replikation des Virus in Zellkultur in vitro zu induzieren, oder (ii) der eine Expressionskassette umfasst, die ein gD-Gen enthält, das unter der Kontrolle eines Promotors platziert ist, der ein anderer ist als der natürliche Promotor dieses Gens, und dessen Expression bei der Replikation des Virus in Zellkultur in vitro ermöglicht, wobei die Kassette im Genom des MDV in einer Stelle inseriert wurde, die nicht essentiell für die Replikation des Virus und für die Wirksamkeit des Virus als Vakzin ist.
MDV-Virus nach Anspruch 1, bei dem die Insertionsstelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: US2, US3, US10, gI, gD, TK, UL13, RR2.
MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem der Promotor, der integriert ist, um die in vitro Expression eines gD-Gens sicherzustellen, der HCMV IE- oder der SV40-Promotor ist.
MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der weiterhin mindestens ein heterologes Gen umfasst, das ein Antigen von Interesse codiert, welches im MDV-Genom in der Weise inseriert ist, dass das Gen in vivo exprimiert werden kann.
MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Expressionskassette nach Anspruch 1 weiterhin mindestens ein heterologes Gen umfasst, das ein Antigen von Interesse codiert, das unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors platziert ist.
Vakzin, das einen rekombinanten MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Vakzin nach Anspruch 6, das über parenteralen-, oralen- oder Luftweg verwendbar ist.
Vakzin nach Anspruch 6 oder 7 in lyophilisierter oder gefrorener Form.
Verfahren zur Züchtung von Herpesvirus, von MDV-Virus vom Serotyp 1, 2 oder 3, bei dem der MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 auf Zellen kultiviert wird, worauf die Virionen, die in dem Kulturüberstand produziert werden, geerntet werden.
Verwendung eines rekombinanten MDV-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Vakzins gegen die Mareksche Krankheit, das zur Verabreichung an Zuchtvögel über parenteralen-, Luft- oder oralen Weg bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Luftweg der nasale oder okulare Weg ist.