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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verwendung eines HVT-Virus
(Herpes Virus of Turkey; Putenherpesvirus), in dem durch genetische
Rekombination mindestens eine Nukleotidsequenz inseriert wurde, die
für ein
antigenes Polypeptid eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert
und dieses exprimiert, für die
Herstellung eines Impfstoffs zur Anwendung bei Vögeln, unter Bedingungen mit
dem Zweck, eine Immunisierung sicher zu stellen, die zu einem wirksamen
Schutz des geimpften Tiers gegen das pathogene Agens führt.
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Es
sind bereits eine gewisse Anzahl rekombinanter Vogelvirusvektoren
mit der Absicht vorgeschlagen worden, Vögel gegen aviäre pathogene
Agenzien, insbesondere pathogene Viren zu impfen, worunter die Viren
der Marek'schen-Krankheit
(MDV), der Newcastle-Krankheit (NDV), der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV),
der Gumboro-Krankheit (infektiöse
Bursitis, IBDV), der infektiösen
Bronchitis (IBV) und der aviären
Anämie
(CAV) fallen.
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Die
verwendeten Virusvektoren umfassen Avipox, insbesondere Fowlpox
(
EP-A-0 517 292 ;
N. -G. Heine et al., Arch. Virol. 1993, 131, 277-292; D. B. Boyle
et al., Veterinary Microbiology 1994, 41, 173-181; C. D. Bayliss
et al., Arch. Virol. 1991, 120, 193-205), die Marek-Viren, insbesondere
die Serotypen 2 und 3 (HVT) (
WO-A-87
04463 ;
WO-A-89
01040 ;
WO-A-93
25665 ;
EP-A-0
513 921 ; J. McMillen, Poultry Condemnation Meeting, October
1994, 359-363; P. J. A. Sondermeijer et al., Vaccine 1993, 11, 349-357;
R. W. Morgan et al., Avian Diseases 1992, 36, 858-870, und 1993,
37, 1032-1040) oder auch die ILTV-Viren und das aviäre Adenovirus.
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Wenn
diese rekombinanten Viren zur Impfung verwendet werden, induzieren
sie einen Schutz in unterschiedlicher Höhe, der im allgemeinen schwach
oder unvollständig
ist, selbst wenn in besonderen, seltenen Fällen ein bedeutender Schutz
gezeigt werden kann.
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Unter
dem Schutz, der sich durch lebende, rekombinante Vogelimpfstoffe
am schwierigsten sicher stellen lässt, befindet sich der gegen
das Virus der Gumboro-Krankheit oder das IBDV-Virus. Wenn es auch klassische,
abgeschwächte
oder inaktivierte Lebendimpfstoffe gibt, die gegen diese Krankheit
wirksam sind, ist tatsächlich
noch von keinem rekombinanten Lebendimpfstoff eine angemessene Wirksamkeit
bewiesen worden.
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Das
Genom des Virus' der
Gumboro-Krankheit besteht aus einer doppelsträngigen RNA. Das größte Segment
(Segment A) kodiert für
ein Polyprotein mit 115 kDa, das sich sekundär in drei Proteine VP2 (41
kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa) aufspaltet. VP4 ist eine Protease,
die an der Reifung des Polyproteins mit 115 kDa beteiligt ist. Die
Position der Spaltungsstelle zwischen VP2 und VP4 ist nur ungefähr bestimmt
(M. Jagadish, J. Virol. 1988, 62, 1084-1 087). Das Protein VP2 ist
ein Immunogen, das neutralisierende Antikörper und einen Schutz gegen
die Gumboro-Krankheit induziert.
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Es
ist bereits vorgeschlagen worden, Gene, die für immunogene IBDV-Proteine
kodieren, in verschiedene Lebendvektoren zu inserieren:
EP-A-0 517 292 (Insertion
der für
VP2 oder das Polyprotein in einem Avipox kodierenden Sequenzen);
C. D. Bayliss 1991, H. -G. Heine 1993 und D. B. Boyle 1994, supra
(VP2 in Fowlpox).
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Die
Viren der Marek'schen-Krankheit
sind ebenfalls in der
WO-A-90
02802 und
WO-A-90
02803 (verschiedene Insertionsstellen wie etwa gC, TK,
RR1, RR2), in den
französischen
Patentanmeldungen Nr. 90 03105 (RR2) und
90 11146 (U53) wie auch insbesondere
in den Patentanmeldungen
WO-A-87
04463 und
WO-A-89
01040 (BamHI #16 und #19) und
WO-A-93 25655 (US2) vorgeschlagen
worden.
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R.
J. Isfort et al. (Virology 1994, 203, 125-133) haben eine bestimmte
Anzahl an Integrationsstellen des Retrovirus in dem HVT-Genom bestimmt,
Stellen, die sich in den Restriktionsfragmenten BamHI F, A und 1
befinden. Andere Beispiele von Insertionsstellen im HVT-Genom sind
in der
EP-A-0 431668 (US-Region)
und
EP-4 200 384 (gA)
vorgeschlagen worden.
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FR-A-2 697 534 beschreibt
ein rekombinantes HVT, dass eine Sequenz inseriert in der US2 (Unique Short
Sequence, BamHI A) unter der Kontrolle des HCMV IE Promotors exprimiert,
die für
das VP2 Protein von IBDV kodiert. Das rekombinante Virus exprimiert
das Protein in vitro, aber wird in einem Vakzine-Protokoll in vivo
nicht nachgewiesen.
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DARTEIL,
R. et al., Virology, Bd. 211, Nr. 2, Februar 1995, Seiten 481-490,
berichtet die Verwendung von zwei rekombinanten HVT, die das VP2
Protein von IBDV inseriert an einer nicht-essentiellen Stelle des HVT-Genoms im Bam HI
Fragment K1, d. h. in der kleinen Untereinheit des Gens der Ribonukleotidreduktase (RR2)
ohne exogenen Promotor (Virus vHVT001), bzw. an einer Stelle des
g1 Gens unter der Kontrolle des humanen CMV immediate early (IE)-Promotors
exprimieren, für
die Herstellung eines aviären,
rekombinanten Lebendimpfstoffs, der für die Vakzination bzw. Impfung
von ein Tag alten Küken
und Adulten gegen das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV) bestimmt
ist. Die ein Tag alten SPF-Küken
wurden durch einmalige intramuskuläre Injektion mit variablen
Dosen geimpft und in einem Alter von 21 Tagen durch intraokuläre Applikation eines
IBDV Virus' des
Stammes 52/70 auf die Probe gestellt. Die Ergebnisse wurden dahingehend
mit denen von Vergleichstieren verglichen, die nicht geimpft oder
mit dem inaktivierten Impfstoff GUMBORIFFA (ND) geimpft wurden,
ob sie einen Schutz durch das rekombinante Virus vHVT002 aufwiesen,
der eine Produktion von neutralisierenden anti-VP2-Antikörpern induzieren
und die Mortalität
sowie die klinischen Läsionen
reduzieren kann, da vHVT001 keinen teilweisen Schutz bietet. Der
Vergleich der zwei rekombinanten HVT-Viren zeigte, dass die Insertionsstelle
des exogenen Gens nebst des verwendeten Promotors zur Steuerung
der Expression des Gens zwei wichtige Parameter sind.
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Verschiedene
Promotoren, worunter sich die allgemein im Handel erhältlichen
befinden, wurden bei verschiedenen Konstruktionen des Standes der
Technik verwendet, darunter die Promotoren PRV gX, HCMV IE (humaner
(CMV) Immediate-early), Herpes simplex alpha-4, FPV P. E/L (Fowlpox-Promotor)
(N. Heine et al., Arch. Virol. 1993, 131, 277-292), P7.5 (C. Bayliss
et al., Arch. Virol. 1991, 120, 193-205) und P11 des Virus des Impfstoffs
(D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994, 41, 173-181), der aus der LTR-Sequenz
des RSV-Virus (Rous Sarcoma Virus) stammt, SV40 early, sowie MDV-
oder HVT-Promotoren, wie etwa die Promotoren der Gene gB, gC, TK,
RR2 usw., ohne dass dabei, insbesondere im Fall von Konstruktionen
in HVT, eine gewisse Regelmäßigkeit
festgestellt werden konnte. Die Sequenzen bestimmter Promotoren
können
die Replikation der rekombinanten HVT- oder MDV-Vektoren hemmen
(D. R. Marshall et al., J. Vir. Meth. 1992, 40, 195-204, und Virology
1993, 195, 638-648). Unter den angeführten Promotoren haben eine
gewisse Anzahl, wie zum Beispiel SV40, LTR RSV und PRV gX, ebenso
wie gewisse Promotoren, die bestimmten Genen des Marek-Virus zu
eigen sind, insbesondere des Serotyps 3, eine gewisse Wirksamkeit
gezeigt.
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Es
verbleibt ein Bedürfnis
auf diesem Gebiet, einen anderen HVT-Vektor für die Vakzination in ovo, für ein Tag
alte Küken
und für
Adulte zu entwickeln, um ein breiteres Vakzinationsspektrum zur
Verfügung
zu stellen, und um einen angemessenen Schutz gegen verschiedene
aviäre
Pathogene zu entwickeln.
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Die
Erfindung ermöglicht
das Bereitstellen eines rekombinanten Lebendimpfstoffs auf der Grundlage eines
HVT-Vektors, in den mindestens eine Sequenz inseriert ist, die für ein aviäres Immunogen,
insbesondere das Protein VP2 des IBDV, kodiert. Ein derartiger Impfstoff,
der eine für
VP2 kodierende Sequenz umfasst, sollte einen zufriedenstellenden
Schutz der Tiere gegen die Gumboro-Krankheit, nämlich einen Schutz gegenüber der
Sterblichkeit und Läsionen
der Bursa fabricius darstellen.
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Die
vorliegende Erfindung hat die Verwendung eines aviären Herpesvirus
HVT für
die Herstellung eines rekombinanten aviären Lebendimpfstoffs zum Gegenstand,
das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein antigenes
Polypeptid eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert und dieses
exprimiert und die in das Restriktionsfragment BamHI 1 des HVT,
bekanntlich in eine der drei intergenen Bereiche 1, 2 und 3, insbesondere
unter der Kontrolle des Immediate-early-Promotors des CMV inseriert
ist. Das Fragment BamHI 1 des HVT ist von A. E. Buckmaster in J.
Gen. Virol. 1988, 69, 2033-2042 vorgestellt worden. Diese intergenen
Bereiche entsprechen, bezogen auf den Stamm HVT, insbesondere auf
den, dem die Nukleotidsequenz der 1 entspricht,
den Nukleotiden der 1 1213 bis 1383 für das Intergen
1, 1942 bis 2283 für das
Intergen 2, und 3082 bis 3569 für das
Intergen 3.
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Unter
einer Insertion in die Insertionsregion versteht man insbesondere
eine Insertion ohne eine Deletion oder mit einer Deletion einiger
Basen der intergenen Bereiche.
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Unter
dem CMV Immediate-early-(IE)-Promotor versteht man sowohl das in
den Beispielen angegebene Fragment als auch seine Unterfragmente,
die dieselbe Promotoraktivität
bewahrt haben.
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Der
Promotor CMV IE kann der humane Promotor (HCMV IE) oder der murine
Promotor (MCMV IE) oder auch ein CMV IE Promotor anderer Herkunft
sein, zum Beispiel aus der Ratte oder dem Meerschweinchen.
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Die
zum Exprimieren in den Marek-Vektor inserierte Nukleotidsequenz
kann jede Sequenz eines aviären pathogenen Agens sein, die für ein antigenes
Polypeptid kodiert, und die in der Lage ist, wenn sie einmal unter
den von der Erfindung bereitgestellten Bedingungen exprimiert ist,
eine Immunisierung sicherzustellen, die zu einem wirksamen Schutz
des geimpften Tiers gegen das pathogene Agens führt. Man kann somit unter den
Bedingungen der Erfindung die für
die interessierenden Antigene für
eine vorgegebene Krankheit kodierenden Nukleotidsequenzen inserieren.
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Die
erfindungsgemäß erhaltenen
Impfstoffe sind für
Impfung in ovo, 1 Tag alter oder älterer Küken oder von Ausgewachsenen
(Adulten) bestimmt.
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Die
Erfindung kann insbesondere zur Insertion einer Nukleotidsequenz
benützt
werden, die zweckdienlich für
das Polypeptid VP2 des IBDV-Virus kodiert. Man erhält auf diese
Weise einen rekombinanten Lebendimpfstoff, der außer einem
Schutz gegen die Marek-Krankheit einen zufriedenstellenden Schutz
gegen die Gumboro-Krankheit sicherstellt. Falls gewünscht, kann
man auch eine Sequenz inserieren, die für ein anderes IBDV-Antigen
wie etwa VP3 oder auch das Polyprotein VP2 + VP4 + VP3 kodiert,
wobei diese anderen Möglichkeiten
nicht bevorzugt sind.
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Der
rekombinante Impfstoff gegen die Gumboro-Krankheit liegt vorzugsweise zu 10 bis
104 pfu/Dosis vor.
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Andere
bevorzugte Fälle
der Erfindung sind die Insertion von Nukleotidsequenzen, die für die Antigene des
Virus der Marek-Krankheit, insbesondere die Gene gB, gC, gD und
gH + gL (
WO-A-90 02803 ),
des Virus' der Newcastle-Krankheit,
insbesondere die Gene F und NH, des Virus der infektiösen Bronchitis
(IBV), insbesondere die Gene S und M (M. Sinns et al., J. Gen. Virol.
1985, 66, 719-726; M. Boursnell et al., Virus Research 1984, 1,
303-313), des Virus' der
aviären
Anämie
(CAV), insbesondere VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N. H. M. Noteborn
et al., J. Virol., 1991, 65, 3131-3139) und des Virus' der infektiösen Laryngotracheitis
(ILTV), insbesondere gB (
WO-A-90
02802 ), gC, gD und gH + gL kodieren.
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Die
Dosen sind vorzugsweise dieselben wie die für den Gumboro-Impfstoff.
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Gemäß einer
vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung verbindet man mit dem
Promotor CMV IE einen weiteren Promotor in der Art, dass die Promotoren
den entgegen gesetzten Transkriptions-Sinn aufweisen, was es gestattet,
in die Insertionszone zwei Nukleotidsequenzen, die eine in Abhängigkeit
vom Promotor CMV IE, die andere in der des verbundenen Promotors,
zu inserieren. Diese Konstruktion ist durch die Tatsache bemerkenswert,
dass die Anwesenheit des Promotors CMV IE, und insbesondere seines
aktivierenden Teils (Verstärker),
die durch den verbundenen Promotor induzierte Transkription aktiviert.
Ein bevorzugter verbundener Promotor ist der Promotor Marek RNA
1.8, dessen Transkriptionsaktivität unter diesen Bedingungen
ungefähr
die 4,4-fache ist.
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Ein
interessanter Fall der Erfindung ist ein Impfstoff, der eine Nukleotidsequenz,
die unter der Kontrolle des CMV IE für das VP2 des IBDV kodiert,
und eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Antigen einer anderen
Vogelkrankheit, insbesondere die weiter oben angeführten, unter
der Kontrolle des anderen Promotors kodiert.
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Man
kann auch zwei Promotoren CMV IE unterschiedlicher Herkunft in Kopf-Schwanz-Anordnung
zusammenstellen.
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Der
Promotor RNA 1.8 kann auch allein anstelle des Promotors CMV IE,
insbesondere für
Impfstoffe gegen die Marek'sche-Krankheit,
die Newcastle-Krankheit, die infektiöse Laryngotracheitis, die infektiöse Bronchitis
und die aviäre
Anämie
verwendet werden.
-
Die
Erfindung wird nun mit Hilfe der nicht eischränkenden Ausführungsbeispiele
genauer beschrieben, wobei auf die Zeichnungen Bezug genommen wird,
worin:
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Aufstellung der Zeichnungen und der Sequenzen
für die
Konstruktionen in den intergenen Stellen
-
1:
Sequenz des Fragments NVT BamHI 1
-
2:
Plasmid pEL039
-
3:
Plasmid pEL077
-
4:
Plasmid pEL079
-
5:
Plasmid pEL076
-
6:
Plasmid pEL078
-
7:
Plasmid pEL054
-
8:
Plasmid pEL055
-
9:
Plasmid pEL062
-
10:
Plasmid pEL066
-
11:
Plasmid pEL022
-
12:
Plasmid pEL023
-
13:
Plasmid pEL024
-
14:
Plasmid pCMVβ
-
15:
Plasmid pEL026
-
16:
Plasmid pEL090
-
17:
Plasmid pCD002
-
18:
Plasmid pCD009
-
19:
Plasmid pEL068
-
20:
Plasmid pEL070
-
21:
Plasmid pEL091
-
22:
Plasmid pCD011
-
23:
Plasmid pCD020
-
24:
Plasmid pEL092
-
25:
Sequenz des Gens NDV HN
-
26:
Plasmid pEL028
-
27:
Plasmid pEL029 bis
-
28:
Plasmid pEL030
-
29:
Plasmid pEL032
-
30:
Plasmid pEL093
-
31:
Plasmid pEL033
-
32:
Plasmid pEL034
-
33:
Plasmid pEL094
-
34:
Sequenz des Promotors MDV RNA 1.8 kbp
-
35:
Plasmid pBS002
-
36:
Plasmid pEL069
-
37:
Plasmid pEL080
-
38:
Plasmid pEL081
-
39:
Plasmid pEL095
-
40:
Plasmid pEL098
-
Aufstellung der Sequenzen SEQ ID für die Konstruktionen
in den intergenen Stellen
-
- SEQ ID N° 1
Sequenz des Fragments HVT BamHI 1
- SEQ ID N° 2
Oligonukleotid EL102
- SEQ ID N° 3
Oligonukleotid EL161
- SEQ ID N° 4
Oligonukleotid EL147
- SEQ ID N° 5
Oligonukleotid EL162
- SEQ ID N° 6
Oligonukleotid EL154
- SEQ ID N° 7
Oligonukleotid EL163
- SEQ ID N° 8
Oligonukleotid EL164
- SEQ ID N° 9
Oligonukleotid EL165
- SEQ ID N° 10
Oligonukleotid EL132
- SEQ ID N° 11
Oligonukleotid EL133
- SEQ ID N° 12
Oligonukleotid MB070
- SEQ ID N° 13
Oligonukleotid MB071
- SEQ ID N° 14
Oligonukleotid CD001
- SEQ ID N° 15
Oligonukleotid CD002
- SEQ ID N° 16
Oligonukleotid CD003
- SEQ ID N° 17
Oligonukleotid CD004
- SEQ ID N° 18
Sequenz des Gens NDV HN
- SEQ ID N° 19
Oligonukleotid EL071
- SEQ ID N° 20
Oligonukleotid EL073
- SEQ ID N° 21
Oligonukleotid EL074
- SEQ ID N° 22
Oligonukleotid EL075
- SEQ ID N° 23
Oligonukleotid EL076
- SEQ ID N° 24
Oligonukleotid EL077
- SEQ ID N° 25
Sequenz des Promotors MDV RNA 1.8 kbp
- SEQ ID N° 26
Oligonukleotid MB047
- SEQ ID N° 27
Oligonukleotid MB048
- SEQ ID N° 28
Oligonukleotid MB072
-
2. Beispiele
-
Alle
Plasmidkonstruktionen wurden durch Verwenden der von Sambrook J.
et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold
Spring Harbor Laboratory. New York. 1989) beschriebenen Standardtechniken
der Molekularbiologie ausgeführt.
Alle in der vorliegenden Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente
wurden unter Verwenden des Kits „Geneclean" (BIOl0l Inc. La Jolla, CA) isoliert.
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Das
als Elternvirus verwendete Virus ist der Stamm FC126 des Putenherpesvirus
(HVT), der von Dr. Witter vom Regional Poultry Research Laboratory
(USDA, East Lansing, Michigan) aus einer Herde 23 Wochen alter Puten
isoliert wurde (Witter R. L. et al., Am. J. Vet. Res. 1970, 31, 525-538).
Die Kulturbedingungen dieses Virus sind die an anderer Stelle beschriebenen
(
französische Patentanmeldung 90 03105 ).
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Beispiel 1: Extraktion der DNA des Virus
der Marek'schen-Krankheit
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Das
Gesamtblut eines 7 Tage alten Versuchshühnchens mit dem Stamm MDV RB1B
wird mit einer Spritze über
einem Antikoagulans (Heparinlösung
mit 100 IE/ml) 14 Tage nach der Infektion isoliert. Dieses Blut
wird anschließend
15 Minuten bei 30 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Plasma
sowie der „buffy coat" werden entnommen
und in steriler PBS verdünnt,
um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Nach 15 Minuten Zentrifugieren
bei 150 g wird das Zellpellet in 2 ml Kulturmedium 199 (Gibco-BRL
Cat# 042-011 83M), das 2% fetales Kälberserum enthält (SVF),
erneut suspendiert.
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Die
gesamte DNA der infizierten Lymphozyten wird anschließend gemäß der von
R. Morgan et al. (Avian Diseases, 1990, 34, 345-351) beschriebenen
Technik extrahiert und kann direkt als Matrize für die PCR-Versuche dienen. Zur Klonierung der
Genomfragmente des MDV-Virus wurde der Stamm RB1B auf CEP kultiviert
und die Virus-DNA wurde aus den gereinigten Virusteilchen wie von
Lee Y. et al. (J. Gen. Virol. 1980, 51, 245-253) beschrieben hergestellt.
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Beispiel 2: Herstellung der Genom-DNA
des MCMV-Virus (Mouse Cyto-MegaloVirus)
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Der
MCMV-Virusstamm Smith wurde von der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA (ATCC Nr. VR-194) erhalten. Dieses Virus
wurde auf Embryonenzellen der Maus Balb/C kultiviert und die Virus-DNA dieses Virus
wurde wie bei Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983, 47, 421-433) beschrieben
hergestellt.
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Beispiel 3: Herstellung der Genom-DNA
des HVT-Virus für
die Transfektionsversuche:
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Die
zu den Transfektionsversuchen verwendete Virus-DNA wurde gemäß der von R. Morgan et al. (Avian
Diseases, 1990, 34, 345-351) beschriebenen Technik aus einer mit
dem Stamm FC126 des NVT-Virus infizierten sekundären CEP-Kultur (CEP II) hergestellt.
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Beispiel 4: Beschreibung des Fragments
BamHI I
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Das
Fragment BamHI I mit 5,8 kbp des HVT-Virusstamms FC126 (Igarashi
et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 1789-1804) wurde durch Geneclean isoliert
und in die BamHI-Stelle
des Vektors pBS-SK+ kloniert, um das Plasmid pEL037 zu ergeben.
Die Sequenz dieses Fragments wurde in Gänze aufgestellt (5838 bp) (1 und SEQ
ID Nr. 1). 6 offene Leserahmen (= „open reading frames" = „ORF") wurden in dieser
Sequenz identifiziert. Die Untersuchung der möglicherweise durch diese ORF
kodierten Proteine hat gezeigt, dass gewisse Proteine davon eine
Homologie mit Proteinen zeigen, die durch ORF kodiert werden, die
bei anderen alpha-Herpesviren vorhanden sind. Der erste ORF (ORF1)
(Position 676 bis Position 1209 auf der SEQ ID N° 1) zeigt eine Homologie mit
den ORF HSV-1 UL55, EHV-1 Gen 4 und VZV Gen 5 und kodiert für ein theoretisches
HVT-Protein UL55 aus 178 Aminosäuren
(aa). Der ORF2 befindet sich an Position 1941 bis Position 1387
auf der SEQ ID N° 1
und kodiert für
ein Protein aus 185 aa, das zu dem durch den ORF3 EHV-1 Gen 3 kodierten
Protein homolog ist. Der ORF3 ist unvollständig. Er befindet sich an Position
5838 bis 3573 auf der SEQ ID N° 1
und er zeigt eine Homologie mit dem ORF 21 des MDV (Ross N. et al.,
Virus Genes, 1993, 7, 33-51). Drei andere auf dieser Sequenz identifizierte
ORF: ORF4 (Position 1403 bis Position 1957 (Protein aus 185 aa)),
ORF5 (Position 3081 bis Position 2287 (Protein aus 265 aa)) und
ORF6 (unvollständig;
Position 479 bis Position 1) besitzen keine Homologie in den Sequenzbanken.
Der Genomaufbau des Fragments BamHI I des HVT-Virusstamms FC126
ist derart, dass es 3 intergene Regionen gibt, die als Insertionsstellen
für die
Expressionskassetten von Fremdgenen verwendet werden können:
Eine
intergene Region (intergene Region 1) besteht zwischen dem ORF1
und dem ORF 265 aa. Eine zweite intergene Region (intergene Region
2) besteht zwischen dem ORF2 und dem ORF 265 aa. Eine dritte intergene
Region (intergene Region 3) besteht zwischen dem ORF 265 aa und
dem ORF3 HVT. Diese drei Regionen sind zum Inserieren von Expressionskassetten
verwendbar, ohne die in-vivo-Replikation
der so erhaltenen rekombinanten HVT-Viren zu beeinflussen. Beispiele
von Donor-Plasmidkonstrukten für
die intergenen Regionen 1, 2 und 3 werden nachstehend beschrieben:
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Beispiel 5: Konstruktion des Donor-Plasmids
für die
intergene Region 1
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Das
Plasmid pEL037 wurde durch BamHI und EcoRI verdaut; um die Fragmente
BamHI-EcoRI mit 2672 bp und 2163 bp zu isolieren. Diese Fragmente
wurden mit dem Vektor pBS-SK+ ligiert, der zuvor durch BamHI und
EcoRI verdaut worden war, um die Plasmide pEL039 mit 5167 bp beziehungsweise
pEL040 mit 6104 bp zu ergeben. Das Plasmid pEL039 (
2)
wurde durch BamHI und PstI verdaut, um das Fragment BamHI-PstI mit
997 bp (Fragment A) zu ergeben. Eine PCR wurde mit den folgenden
Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 zum Erzeugen eines Fragments mit 420 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch PstI und SalI verdaut, um ein Fragment PstI-SalI
mit 250 bp (Fragment B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden
zusammen mit dem Vektor pBSII-SK+ (Stratagene) ligiert, der zuvor
durch BamHI und SalI verdaut worden war, um das Plasmid pEL077 mit
4160 bp zu ergeben (
3). Das Plasmid pEL039 wurde durch
BstBI und ScaI verdaut, um ein Fragment BstBI-ScaI (freies Ende)
mit 475 bp (Fragment C) zu isolieren. Eine PCR wurde mit den folgenden
Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 durchgeführt,
um ein PCR-Fragment mit 715 bp zu erzeugen. Dieses Fragment wurde durch
BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 465 bp (Fragment
D) zu isolieren. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit dem zuvor
durch ApaI verdauten Plasmid pEL077 ligiert, mit Klenow-Polymerase
wiederhergestellt und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL079
mit 5082 bp (
4) zu ergeben. Dieses Plasmid
enthält
einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI an der intergenen Stelle 1.
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Beispiel 6: Konstruktion des Donor-Plasmids
für die
intergene Region 2
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Das
Plasmid pEL039 (Beispiel 5) wurde durch BstBI und PstI verdaut,
um das Fragment BstBI-PstI mit 715 bp (Fragment A) zu isolieren.
Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 durchgeführt,
um ein PCR-Fragment mit 500 bp herzustellen. Dieses Fragment wurde durch
BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 430 bp (Fragment
B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor
pBSII-SK+ ligiert, der zuvor durch PstI und SalI verdaut worden war,
um das Plasmid pEL076 mit 4081 bp (
5) zu ergeben.
-
Eine
weitere PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 zum Herstellen eines PCR-Fragments mit 565 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch SalI und SspI verdaut, um das Fragment SalI-SspI
mit 535 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pEL076
ligiert, das zuvor durch ApaI verdaut worden war, mit Klenow-Polymerase
wiederhergestellt und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL078
mit 4598 bp (
6) zu ergeben. Dieses Plasmid
enthält
einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI
in der intergenen Region 2.
-
Beispiel 7: Konstruktion des Donor-Plasmids
für die
intergene Region 3
-
Das
Plasmid pEL040 (siehe Beispiel 5) wurde durch NcoI und SphI unter
Isolieren des Fragments NcoI-SphI mit 1468 bp verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem Plasmid pUC BM20 (Boehringer Mannheim Cat# 1219235)
ligiert, das zuvor durch NcoI und SphI verdaut worden war, um das
Plasmid pEL054 mit 4182 bp (
7) zu ergeben.
Das Plasmid pEL040 wurde mit EcoRI und SphI verdaut, um das Fragment
EcoRI-SphI mit 614 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem
Plasmid pUC BM20, das zuvor durch EcoRI und SphI verdaut worden
war, unter Ergeben des Plasmids pEL055 mit 3263 bp (
8)
ligiert. Das Plasmid pEL055 wurde mit EcoRI verdaut, mit Klenow-Polymerase
wiederhergestellt, mit sich selbst ligiert, durch HindIII verdaut,
mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt und schließlich mit
sich selbst unter Ergeben des Plasmids pEL062 mit 3279 bp (
9)
ligiert. Das Plasmid pEL054 wurde durch NcoI und SalI verdaut, um
das Fragment NcoI-SalI
mit 1492 bp (Fragment A) zu isolieren. Die beiden folgenden Oligonukleotide:
wurden
untereinander hybridisiert, um das Fragment SalI-SphI mit 24 bp (Fragment B) zu erzeugen.
Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Plasmid pEL062, das
zuvor durch NcoI und SphI verdaut worden war, unter Ergeben des
Plasmids pEL066 mit 4787 bp (
10) ligiert.
Dieses Plasmid enthielt einen Polylinker EooRI-HindIII-SalI in der
intergenen Region 3.
-
Beispiel 8: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL090 und Isolierung von vHVT16
-
Das
Plasmid pEL004 (= in der
französischen
Patentanmeldung 92.13108 beschriebenes Plasmid pGH004),
das das IBDV-VP2-Gen in Form einer BamHI-HindIII-Kassette enthält, wurde
durch BamHI und XbaI verdaut, um das Fragment BamHI-XbaI (verkürztes VP2-Gen)
mit 1104 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK+
kloniert, der zuvor mit XbaI und BamHI verdaut worden war, um das
Plasmid pEL022 mit 4052 bp (
11) zu
ergeben. Der Vektor pBS-SK+ wurde durch EcoRV und XbaI verdaut,
dann mit sich selbst unter Ergeben von pBS-SK* (modifiziert) ligiert.
Das Plasmid pEL004 wurde durch KpnI und HindIII unter Isolieren
des Fragments KpnI-HindIII
mit 1387 bp verdaut, das das vollständige IBDV-VP2-Gen enthielt. Dieses Fragment wurde
in den Vektor pBS-SK* kloniert, der zuvor durch KpnI und HindIII
verdaut worden war, um das Plasmid pEL023 mit 4292 bp (
12)
zu ergeben. Das Plasmid pEL022 wurde durch BamHI und NotI unter
Isolieren des Fragments BamHI-NotI mit 1122 bp (Fragment A) verdaut.
Das Plasmid pEL023 wurde durch BamHI und NotI unter Isolieren des
Fragments BamHI-NotI mit 333 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente
A und B wurden zusammen mit dem Vektor pBS-SK+, der zuvor durch
NotI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war,
unter Ergeben des Plasmids pEL024 mit 4369 bp (
23)
ligiert. Das Plasmid pEL024 wurde durch NotI unter Isolieren des
Fragments NotI-NotI mit 1445 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit
dem Plasmid pCMVß (Clontech
Cat# 6177-1) (
14), das zuvor durch Not' verdaut worden war,
unter Ergeben des Plasmids pEL026 mit 5095 bp (
15)
ligiert. Das Plasmid pEL026 wurde durch EcoRI, SalI und XmnI unter
Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 2428 bp verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5), das zuvor durch
EcoRI und SalI verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL090
mit 7514 bp (
16) ligiert. Dieses Plasmid
gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/IBDV VP2
in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
24
Stunden alte primäre
CEP-Zellen wurden anschließend
mit dem folgenden Gemisch transfiziert: 1 pg linearisiertes Plasmid
pEL090 + 5 pg HVT-Virus-DNA in 300 μl OptiMEM-Medium (Gibco BRL
Cat# 041-01985H) und 100 pg in 300 μl Medium verdünntes LipofectAMINE
(Endvolumen des Gemisches = 600 μl). Diese
600 μl wurden
anschließend
in 3 ml (Endvolumen) Medium verdünnt
und auf 3.106 CEP I ausgestrichen. Man beließ das Gemisch
5 Stunden in Kontakt mit den Zellen, entfernte und ersetzte es dann
durch 5 ml Kulturmedium. Man ließ die Zellen darauf 3 Stunden
bei +37°C
kultivieren, dann wurden sie mit Pronase behandelt, mit frischen
CEP II gemischt (3:1-Gemisch)
und auf 1 Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Man kultivierte diese
Platte 3 Tage, dann wurden die Zellen mit Pronase behandelt, mit
frischen CEP II gemischt und auf 2 Platten mit 96 Vertiefungen gegeben,
wobei eine Anfangsvertiefung zwei Schwestervertiefungen ergibt.
Die Platten mit 96 Vertiefungen wurden bis zum Auftreten eines zytopathischen
Effekts kultiviert. Nach 72 Stunden Kultur wurde eine der beiden
Platten mit 96 Vertiefungen 30 Minuten mit 95%igem Aceton fixiert
und es wurde eine indirekte Immunfluoreszenzreaktion (IFI) mit einem
monoklonalen Anti-VP2-Antikörper
durchgeführt,
um nach das Protein VP2 exprimierenden Plaques zu suchen. Die „Schwester"-Vertiefungen der
bei der IFI positive Plaques aufweisenden Vertiefungen wurden mit
Pronase behandelt, mit frischen CEP II gemischt und in Grenzverdünnung auf
Platten mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Nach 3 Tagen Kultur wurden
die eine zytopathische Wirkung aufweisenden Vertiefungen mit Pronase
behandelt, mit CEP II gemischt und erneut auf Platten mit 96 Vertiefungen
gegeben, wobei eine Anfangsvertiefung 2 Schwestervertiefungen ergab.
3 Tage danach wurde nach den Protein VP2 exprimierenden Plaques
von neuem wie voranstehend durch IFI auf einer der 2 Schwesterplatten
durchmustert.
-
Im
allgemeinen reichen 4 aufeinanderfolgende Isolierzyklen (Ernten
einer Vertiefung, Ausstreichen, Kontrolle durch IFI, Umsetzen einer
Schwestervertiefung...) zum Erhalten rekombinanter Viren aus, deren
gesamte Nachkommenschaft eine spezifische Fluoreszenz zeigt. Ein
Virusplaque, der bei der IFI mit einem monoklonalen Anti-VP2-Antikörper 100%
positive Plaques ergeben hatte, wurde vHVT16 genannt. Die Genom-DNA dieses rekombinanten
Virus wurde auf molekularer Ebene durch klassische PCR-Techniken
und Southern Blot unter Verwenden geeigneter Oligonukleotide und
DNA-Sonden charakterisiert.
-
Beispiel 9: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL091 und Isolierung von vHVT17
-
Das
Plasmid pCMVß (
14)
wurde durch SalI und SmaI unter Isolieren des Fragments SalI-SmaI mit
3679 bp verdaut, das sowohl das Gen lacZ als auch das Polyadenylierungssignal
des späten
Gens des SV40-Virus enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor
pBS-SK+, der zuvor durch SalI und EcoRV verdaut worden war, unter
Ergeben des Plasmids pCD002 mit 6625 bp (
17) ligiert.
Dieses Plasmid enthält
das Reportergen lacZ, es befindet sich jedoch kein Promotor stromaufwärts dieses
Gens. Die Virusgenom-DNA des MCMV-Virus wurde wie in Beispiel 2
beschrieben hergestellt und durch PstI unter Isolieren des Fragments
PstI-PstI mit 2285 bp verdaut. Dieses Fragment wurde in den Vektor
pBS-SK+, der zuvor durch PstI verdaut und mit alkalischer Phosphatase
behandelt worden war, unter Ergeben des Plasmids pCD004 kloniert.
Das Plasmid pCD004 wurde durch HpaI und PstI unter Isolieren des
Fragments HpaI-PstI mit 1389 bp verdaut, das die Promotor-/Aktivatorregion
des Immediateearly-Gens des murinen Cytomegalovirus (Murine CytoMegaloVirus =
MCMV) enthielt (Dorsch-Häsler
K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82, 8325-8329, und Patentanmeldung
WO-A-87/03905 ).
Dieses Fragment wurde in das zuvor durch PstI und SmaI verdaute
Plasmid pCDOO2 unter Ergeben des Plasmids pCD009 mit 8007 bp (
18)
kloniert.
-
Ein
doppelsträngiges
Oligonukleotid wurde durch Hybridisierung der beiden folgenden Oligonukleotide
erhalten:
-
Dieses
doppelsträngige
Oligonukleotid wurde in den zuvor durch KpnI und SacI verdauten
Vektor pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pEL067 ligiert. Das Plasmid
pCD009 wurde durch PstI und SpeI unter Isolieren des Fragments PstI-SpeI
mit 1396 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor mit PstI
und SpeI verdauten Plasmid pEL067 unter Ergeben des Plasmids pEL068
(19) ligiert. Das Plasmid pEL026 (siehe Beispiel
8) wurde durch HindIII und SalI unter Isolieren des Fragments HindIII-SalI
mit 235 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B wurden zusammen
mit dem zuvor durch NotI und SalI verdauten Plasmid pEL068 unter
Ergeben des Plasmids pEL070 mit 5908 bp (20) ligiert.
Das Plasmid pEL070 wurde durch EcoRI, SalI und XmnI unter Isolieren
des Fragments EcoRI-SalI
mit 3035 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI
und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben
des Plasmids pEL091 mit 8109 bp (21) ligiert.
Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette MCMV-IE/IBDV
VP2 in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine
wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL091
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und Reinigung
von rekombinantem vHVT1 7.
-
Beispiel 10: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL092 und Isolierung von vHVT18
-
Das
Fragment EcoRI-SalI mit 3,9 kbp der Genom-DNA des MDV-Virusstamms
RB1B, der das MDV-Gen gB enthält
(Sequenz veröffentlicht
von Ross N. et al., J. Gen. Virol. 1989, 70, 1789-1 804), wurde mit
dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Vektor pUC13 unter Ergeben
des Plasmids pCD007 ligiert. Dieses Plasmid wurde mit SacI und XhoI
unter Isolieren des Fragments SacI-XhoI mit 2260 bp (zentraler Teil
des Gens gB = Fragment A). Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 222 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch KpnI und XbaI unter Isolieren eines Fragments
KpnI-XbaI mit 190 bp (5'-Ende
des Gens gB = Fragment B) verdaut. Eine weitere PCR wurde mit den
folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 195 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch SacI und SacII unter Isolieren des Fragments
SacI-SacII mit 162 bp (3'-Ende
des Gens gB = Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und C wurden
zusammen mit dem zuvor durch KpnI und SacI verdauten Vektor pBS-SK+
unter Ergeben des Plasmids pCD011 mit 5485 bp (
22)
ligiert. Das Plasmid pCD011 wurde durch NotI unter Isolieren des
Fragments NotI-NotI mit 2608 bp (gesamtes MDV-gB-Gen) verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase
behandelten Plasmid pCMVß unter
Ergeben des Plasmids pCD020 mit 6299 bp (
23) verdaut.
(In diesem Plasmid ist das MDV-gB-Gen durch das lacZ-Gen ersetzt.) Das
Plasmid pCD020 wurde durch EcoRI und SalI unter Isolieren des Fragments
EcoRI-SalI mit 3648
bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und
SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben des
Plasmids pEL092 mit 8718 bp (
24) ligiert. Dieses
Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/MDV-gB
in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine
wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL092
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der
Reinigung von rekombinantem vHVT18.
-
Beispiel 11: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL093 und Isolierung von vHVT19
-
Der
Aufbau einer komplementären
DNA-Bank des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV), Stamm
Texas, wurde wie von Taylor J. et al. (J. Virol., 1990, 64, 1441-1450)
beschrieben durchgeführt.
Ein das Ende des Fusionsgens (F), die Gesamtheit des Hämagglutinin-Neuraminidase-Gens
(HN) und den Anfang des Polymerasegens enthaltender pBR322-Klon
wurde als pHN01 identifiziert. Die Sequenz des auf diesem Klon vorhandenen
NDV-HN-Gens wird in
25 dargestellt (SEQ ID N° 18). Das
Plasmid pHN01 wurde durch SphI und XbaI unter Isolieren des Fragments
SphI-XbaI mit 2520 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch
SphI und XbaI verdauten Vektor pUC19 unter Ergeben des Plasmids
pHN02 mit 5192 bp ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde mit ClaI und
PstI unter Isolieren des Fragments ClaI-PstI mit 700 bp (Fragment
A) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden
und der
Matrize pHN02 für
das Erzeugen eines PCR-Fragments
mit 270 bp durchgeführt.
Dieses Fragment wurde mit HindIII und PstI für das Isolieren eines Fragments
HindIII-PstI mit 220 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und
B wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und HindIII verdauten
Vektor pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pEL028 mit 3872 bp (
26)
ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde durch BsphI und ClaI für das Isolieren
des Fragments BsphI-ClaI mit 425 bp (Fragment C) verdaut. Eine PCR
wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pHN02 für
das Erzeugen eines PCR-Fragments
mit 425 bp durchgeführt.
Dieses Fragment wurde durch BsphI und NotI für das Isolieren des Fragments
BsphI-NotI mit 390 bp (Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und
D wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und NotI verdauten Vektor
pBS-SK+ für
das Ergeben des Plasmids pEL029 bis mit 3727 bp (
27)
verdaut. Das Plasmid pEL028 wurde durch ClaI und SacII für das Isolieren
des Fragments ClaI-SacII mit 960 bp (Fragment E) verdaut. Das Plasmid
pEL029 bis wurde durch ClaI und NotI für das Isolieren des Fragments
ClaI-NotI mit 820 bp (Fragment F) verdaut. Die Fragmente E und F
wurden zusammen mit dem zuvor durch NotI und SacII verdauten Vektor
pBS-SK+ für
das Ergeben des Plasmids pEL030 mit 4745 bp (
28) ligiert.
Das Plasmid pEL030 wurde durch NotI für das Isolieren des Fragments
NotI-NotI mit 1780 bp (gesamtes NDV-HN-Gen) verdaut. Dieses Fragment
wurde anstelle des lacZ-Gens mit dem zuvor durch NotI verdauten
und mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pCMVß für das Ergeben
des Plasmids pEL032 mit 5471 bp (
29) ligiert.
Das Plasmid pEL032 wurde durch EcoRI und ClaI für das Isolieren des Fragments
EcoRI-ClaI mit 1636 bp (Fragment G) verdaut. Das Plasmid pEL032
wurde durch ClaI und SalI für
das Isolieren des Fragments ClaI-SalI mit 1182 bp (Fragment H) verdaut.
Die Fragmente G und H wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI
und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) für das Ergeben
des Plasmids pEL093 mit 7890 bp (
30) ligiert.
Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV
HN in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
-
Eine
wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL093
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und zur
Reinigung von rekombinantem vHVT1 9.
-
Beispiel 12: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL094 und Isolierung von vHVT20
-
Ein
aus der komplementären
DNA-Bank des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (siehe Beispiel
11) stammender Klon, der das gesamte Fusionsgen (F) enthielt, wurde
pNDV81 genannt. Dieses Plasmid wurde früher beschrieben und die Sequenz
des bei diesem Klon vorhandenen NDV-F-Gens wurde veröffentlicht
(Taylor J. et al., J. Virol., 1990, 64, 1441-1450). Das Plasmid
pNDV81 wurde durch NarI und PstI unter Isolieren des Fragments NarI-PstI
mit 1870 bp (Fragment A) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgen
Oligonukleotiden:
und der
Matrize pNDV81 unter Erzeugen eines Fragments mit 160 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch PstI und SalI unter Isolieren des Fragments
PstI-SalI mit 130 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B
wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und SalI verdauten Vektor
pBS-SK+ für
das Ergeben des Plasmids pEL033 mit 4846 bp (
31) ligiert.
Das Plasmid pEL033 wurde durch NotI für das Isolieren des Fragments
NotI-NotI mit 1935 bp (gesamtes Gen F) verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase
behandelten Plasmid pCMVß für das Ergeben
des Plasmids pEL034 mit 5624 bp (das lacZ-Gen wurde durch das NDV-F-Gen
ersetzt) ligiert (
32). Das Plasmid pEL034 wurde
durch EcoRI und KpnI für
das Isolieren des Fragments EcoRI-KpnI mit 866 bp (Fragment C) verdaut. Das
Plasmid pEL034 wurde durch KpnI und SalI für das Isolieren des Fragments
KpnI-SalI mit 2114 bp (Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und
D wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid
pEL079 (siehe Beispiel 5) für
das Ergeben des Plasmids pEL094 mit 8043 bp (
33) ligiert.
Das Plasmid erlaubt die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV
F in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine
wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL094
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der
Reinigung von rekombinantem vHVT20.
-
Beispiel 13: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL095 und Isolierung von vHVT21
-
Die
stromaufwärts
gelegenen Sequenzen des MDV-RNA-Gens
mit 1,8 kbp werden bei Bradley G. et al. (J. Virol., 1989, 63, 2534-2542)
(
34 und SEQ ID N° 25)
beschrieben. Eine PCR-Amplifikation wurde ausgehend von einem DNA-Extrakt
von Lymphozyten, die aus mit dem Stamm MDV RB1 B (siehe Beispiel
1) infizierten Hühnchen
gewonnen wurden, mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
-
Das
auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment mit 163 bp wurde durch EcoRI
und SpeI verdaut und dann mit dem zuvor durch EcoRI und SpeI verdauten
Plasmid pCD002 (siehe Beispiel 9) für das Ergeben des Plasmids
pBS002 mit 6774 bp (35) ligiert. Das Plasmid pB5002
enthält
den stromaufwärts
des lacZ-Gens klonierten Promotor des MDV-RNA-Gens mit 1,8 kb.
-
Eine
PCR wurde mit den Oligonukleotiden
und der Matrize pBS002 durchgeführt. Das
auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment wurde durch PstI und SpeI
für das
Isolieren eines Fragments PstI-SpeI mit 200 bp verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem zuvor durch PstI und SpeI verdauten Plasmid pEL067
(siehe Beispiel 9) für
das Ergeben des Plasmids pEL069 (
36) ligiert.
Das Plasmid pCD007 (siehe Beispiel 10) wurde durch EcoRI und XbaI
unter Isolieren des Fragments EcoRI-XbaI mit 2670 bp (Fragment A)
verdaut. Das Plasmid pCDO11 (siehe Beispiel 10) wurde durch NotI
und XbaI für
das Isolieren des Fragments NotI-XbaI mit 180 bp (Fragment) verdaut.
Das Plasmid pEL069 wurde durch NotI und SpeI für das Isolieren des Fragments
NotI-SpeI mit 180 bp (Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und
C wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SpeI verdauten Plasmid pEL067
(siehe Beispiel 9) für
das Ergeben des Plasmids pEL080 mit 5939 bp (
37) ligiert.
Das Plasmid pEL070 (siehe Beispiel 9) wurde durch KpnI und SpeI
für das
Isolieren des Fragments KpnI-SpeI mit 1345 bp (Fragment D) verdaut.
Das Plasmid pEL070 wurde ebenfalls durch KpnI und SalI unter Isolieren
des Fragments KpnI-SalI mit 1658 bp (Fragment E) verdaut. Die Fragmente
D und E wurden zusammen mit dem zuvor durch SalI und SpeI verdauten
Plasmid pEL080 für
das Ergeben des Plasmids pEL081 mit 8938 bp (
38) ligiert.
Das Plasmid pEL081 wurde durch EcoRI und SalI für das Isolieren des Fragments
EcoRI-SalI mit 6066 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor
durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5)
für das
Ergeben des Plasmids pEL095 mit 11139 bp (
39) ligiert.
Dieses Plasmid gestattet das Inserieren der Doppelexpressionskassette
VP2/MCMV-IE//RNA 1,8 kbp/MDV gB in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
-
Eine
wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL095
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der
Reinigung von rekombinantem vHVT21.
-
Beispiel 14: Konstruktion des Donor-Plasmids
pEL098 und Isolierung von vHVT24
-
Das
Plasmid pEL08O (siehe Beispiel 13) wurde durch EcoRI und SalI für das Isolieren
des Fragments EcoRI-SalI mit 3040 bp (RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB)
verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI
verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids
pEL098 mit 8140 bp (40) ligiert. Dieses Plasmid
gestattet die Insertion der RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB in die intergene Stelle
1 des HVT-Virus.
-
Eine
wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL098
und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der
Reinigung von rekombinantem vHVT24.
-
Beispiel 15: Konstruktion von Donor-Plasmiden
zur Insertion der Expressionskassetten IBV M und S in die intergene
Stelle 1 des HVT-Virus
-
Nach
derselben Strategie wie der weiter oben zur Insertion von Expressionskassetten
(unter die Kontrolle der HCMV-IE- oder MCMV-IE-Promotoren oder des
MCMV-IE/RNA-Doppelpromotors
1,8 kbp stehende Gene) in die intergene Stelle 1 ist es möglich, rekombinante
HVT-Viren herzustellen, die die Membran-(M) oder Spikeproteine (S)
des Virus der infektiösen
aviären
Bronchitis (IBV) auf höherem
Niveau exprimieren. Man stellt bevorzugt ein Konstrukt her, bei
dem das IBV-S-Gen unter der Abhängigkeit
des HCMV-IE-Promotors oder des MCMV-IE-Promotors steht, oder ein Konstrukt
her, bei dem die IBV-M-
und IBV-S-Gene zusammen mit dem MCMV-IE/RNA-Doppelpromotor 1,8 kbp in die intergene
Stelle 1 inseriert sind, wobei das M-Gen unter der Kontrolle des
RNA-Promotors 1,8 kbp steht und das S-Gen unter der Kontrolle des
MCMV-IE-Promotors steht. In dieser Konfiguration wird der RNA-Promotor
1,8 kbp durch die Aktivatorregion des MCMV-IE-Promotors aktiviert.
-
Beispiel 16: Konstruktion rekombinanter
HVT-Viren, die in die intergenen Stellen 2 und 3 inserierte Fremdgene umfassen
-
Der
Erhalt rekombinanter HVT-Viren, die in die intergenen Stellen 2
und 3 inserierte Expressionskassetten von Fremdgenen aufweisen,
erfolgt dadurch, dass man der für
die Beispiele 8 bis 14 beschriebenen Strategie folgt, aber die Plasmide
pEL078 (intergene Stelle 2) beziehungsweise pEL066 (intergene Stelle
3) anstelle des Plasmids pEL079 in den Beispielen 8 bis 14 zum Aufbauen
der speziellen Donor-Plasmide verwendet.
-
Beispiel 17: Herstellung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs:
-
Die
Herstellung erfindungsgemäßer Impfstoffe
kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik, zum Beispiel durch
Rollflaschenkultur erfolgen. Rollflaschen (175 cm2),
in die 200.106 Primärzellen aus Hühnchenembryonen
eingesät
sind, werden nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C mit 1 ml einer Viruslösung von rekombinantem
HVT-Virus mit einem Gehalt von 105 pfu/ml
beimpft. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wird der Überstand entfernt, die Zellen
werden mit einer Trypsin/Versene-Lösung getrennt und dann isoliert.
Die infizierten Zellen werden darauf zentrifugiert. Der Überstand
wird entfernt und die Zellen werden durch 20 ml einer einen Stabilisator
zur Lyophilisierung (zum Beispiel SPGA: Saccharose, Phosphat, Glutamat,
Albumin) enthaltenden Lösung
wieder aufgenommen. Dieses Gemisch wird danach beschallt, in Gläschen zu
Fraktionen von 1 ml verteilt und schließlich lyophilisiert.
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Falls
notwenig, kann der Impfstoff statt lyophilisiert zu werden auch
aufgeteilt und eingefroren werden.
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Beispiel 18:
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Ein
erfindungsgemäß erhaltener
rekombinanter Impfstoffkandidat, der das Protein VP2 des Virus der Gumboro-Krankheit
exprimiert, wurde zum Immunisieren von 1 Tag alten Küken auf
intramuskulärem
Weg verwendet. Diese Küken
wurden darauf im Alter von 21 Tagen dem Virus der Gumboro-Krankheit
ausgesetzt. Die Ergebnisse des Schutzes wurden 11 Tage nach dem
Aussetzen durch Vergleichen der Läsionen der Bursa fabricius
und der Sterblichkeit zwischen den Impfgruppen und der nicht geimpften
Kontrollgruppe bewertet. Die Ergebnisse dieses Impfungs-/Aussetzungsverfahrens
haben gezeigt, dass der gemäß der Erfindung
erhaltene Impfstoff den Erhalt eines guten Schutzniveaus gestattet.
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