JPH0920682A - ベクターとして鳥類ヘルペスウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン - Google Patents

ベクターとして鳥類ヘルペスウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン

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JPH0920682A
JPH0920682A JP7355020A JP35502095A JPH0920682A JP H0920682 A JPH0920682 A JP H0920682A JP 7355020 A JP7355020 A JP 7355020A JP 35502095 A JP35502095 A JP 35502095A JP H0920682 A JPH0920682 A JP H0920682A
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avian
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promoter
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フランシス オードネ ジャン−クリストフ
Michel Joseph Marie Bublot
ジョゼフ マリー ブブロ ミシェル
Raphael Darteil
ジャン ダルテイル ラファエル
Carole Veronique Duinat
ヴェロニク デュイナ カロル
Eliane Louise Francois Laplace
ルイーズ フランソワーズ ラプラース エリアヌ
Michel Emile Albert Riviere
アルベール エミール リヴィエール ミシェル
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして用い
た鳥類用組換え生ワクチン 【解決手段】 CMV 即時初期プロモータの制御下にORF
UL55のATG とＵL とそれに隣接する繰り返し領域の接合
点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原ポ
リペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なくと
も１つ含む鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして含む
鳥類用組換え生ワクチンと、異なる配列が挿入されたワ
クチンを少なくとも２種類含む多価ワクチン製剤。ベク
ターはマレック病ウィルス（MDV およびHVT)、感染性喉
頭器官炎ウィルスILTVおよびアヒルのヘルペスウィルス
からなる群の中から選択するのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組み換えに
よって鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且
つ発現する少なくとも１つの塩基配列をワクチンを接種
した動物が病原物質から効果的に保護される免疫を獲得
するような条件で挿入した、鳥類ヘルペスウィルス、特
にマレック病(Marek's disease) ウィルス(MDV) 、特に
HVTウィルス（七面鳥のヘルペスウィルス）をベースと
した鳥類用の組換え生ワクチンに関するものである。本
発明は感染性喉頭器官炎ウィルス(ILTV)およびアヒルの
ヘルペスウィルスにも適用される。
【０００２】
【従来の技術】鳥類の病原物質、特にマレック病ウィル
ス(MDV) 、ニューカッスル病ウィルス(NDV) 、感染性喉
頭器官炎ウィルス(ILTV)、ガンボロ病ウィルス（感染性
滑液嚢炎ウィルスIBDV) 、感染性気管支炎ウィルス(IBV
)および鳥類の貧血症ウィルス(CAV) を含む病原性ウィ
ルスに対して鳥類に予防接種を行うための鳥類の組換え
生ベクターは既にいくつか提案されている。そのために
用いられる生ベクターはアヴィポックスウィルス(avipo
x viruses)特に鶏痘ウィルス（欧州特許第0,517,292
号；H. G. Heine 達、 Arch. Virol.1993. 131. 277-29
2；D.B. Boyle達, Veterinary Microbiology 1994. 41.
173-181 ；C.D. Bayliss達, Arch. Virol. 1991. 120.
193-205)、血清型が２および３のマレック病ウィルス
(HVT)(WO-A-87 04463 号；WO-A-89 01040 号；WO-A-93-
25665 号；欧州特許第 513,921号； J. McMillen, Poul
try Condemnation Meeting, 1994年10月, 359-363 ；P.
J.A. Sondermeijer 達, Vaccine 1993. 11. 349-357 ；
R.W. Morgan 達, Avian Diseases 1992. 36. 858-870、
1993, 37, 1032-1040）またはILTVおよび鳥類のアデノ
ウィルスである。
【０００３】これらのウィルスを予防接種に使用した場
合、特定の事例でかなりの防御効果が示されることが稀
にはあるが、これらの組換えウィルスによって誘導され
る防御レベルは変化し易く、一般には弱いか、部分的な
ものである。鳥類用組み換え生ワクチンによる予防の中
で最も困難なものはガンボロ病ウィルスまたはIBDVウィ
ルスである。すなわちこれらの病気に対しては従来の不
活化または弱毒化生ワクチンが効果的であるが、組換え
生ワクチンで適当な効果を示すものはない。カンボロ病
ウィルスのゲノムは二重鎖ＲＮＡで構成されており、そ
の最大断片（断片Ａ）は115kDaのポリプロテインをコー
ドする。このポリプロテインはさらに３つの蛋白質VP2
(41kDa)、VP4(28kDa)、VP3(32kDa)に分裂する。VP4 は1
15kDaのポリプロテインの成熟に関与するプロテアーゼ
であると言われている。VP2 とVP4 との間の分裂箇所に
ついては大体の位置しか分かっていない(M. Jagadish,
J. Virol. 1988, 62, 1084-1087)。蛋白質VP2 は中和抗
体を出す免疫源であり、ガンボロ病に対する防御を誘導
する。
【０００４】免疫原性のIBDV蛋白質をコードする遺伝子
を各種の生ベクターに挿入する方法は既に提案されてい
る：欧州特許第 517,292号（VP2 またはポリプロテイン
をコードする配列をアヴィポックスに挿入);上記のC.D.
Bayliss 1991, H.-G. Heine1993およびD.B. Boyle 199
4 (VP2 を鶏痘に）。 マレック病ウィルスも既に提案されている：WO-A-90 02
802 およびWO-A-90/02803 号（gC、TK、PR1,PR2 の各種
挿入部位）、フランス国特許出願第90/03105号(PR2) お
よび第90/11146号 (US3)および WO-A-87/04463号および
WO-A-89/01040号（BamHI#16および#19)および WO-A-93
/25655(US3) 。 R.J. Isfort 達(Virology 1994. 203. 125-133) は HVT
ゲノムにレトロウィルスを組み込むための組み込み部位
の数を決定しており、これらの部位はBamHI 制限酵素断
片Ｆ、ＡおよびＩ上に位置している。
【０００５】一般に市販のものを含む各種プロモータは
従来技術の各種構成で利用されている。すなわちPRV gX
プロモータ、HCMV IE （ヒトのCMV 即時初期）プロモー
タ、ヘルペス単純ウィルスのα−４プロモータ、FPV P.
E/L プロモータ（鶏痘プロモータ)(H.Heine et al., Ar
ch. Virol. 1993. 131. 277-292)、RSV(Rous sarcomavi
rus)のLTR 配列に由来する痘疹ウィルスの P7.5 (C. Ba
yliss et al., Arch.Virol. 1991. 120. 193-205)およ
びP11 (D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994.41. 173-
181)プロモータ、SV40の初期プロモータ、さらにMDV ま
たはHVT プロモータ、例えばgB、gC、TK、RR2 などの遺
伝子のプロモータがあるが、一貫したパターンは現れて
いない。特にHVT における構成の場合。いくつかのプロ
モータ配列は組換えHVT またはMDV ベクターの複製を禁
止する(D. R. Marshall et al.,J. Vir. Meth. 1992. 4
0. 195-204 およびVirology1993. 195. 638-648) 。上
記プロモータのいくつか、例えばSV40、LTR RSV および
PRV gXは、マレックウィルスのいくつかの遺伝子本来の
プロモータ、特に血清タイプ３と同様に何らかの効力を
示す。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、EVT
ベクターに鳥類の免疫原、特にIBDVの蛋白質VP2 をコー
ドする配列を少なくとも１つ挿入したものをベースとす
る組換え生ワクチンを開発することにある。VP2 をコー
ドする配列を組み込んだワクチンは動物をガンボロ病か
ら十分に防御することができ、死亡およびファブリシウ
ス滑液嚢炎から守ることができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、ベクタ
ーとして鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし
且つ発現する塩基配列を少なくとも１つ含む鳥類ヘルペ
スウィルスを含む鳥類用組換え生ワクチンであり、上記
塩基配列は、即時初期 CMVプロモータの制御下に、ORF
UL55のATG と隣接する繰り返し領域を有するＵL の接合
点との間の領域に挿入されている。この挿入領域は HVT
では Bam HI 断片Ｉに相当し、MDV ではBamHI 断片Ｋ＋
Ｈに相当する。このことはブックマスター(A. E. Buckm
aster)の J. Gen. Virol.1988. 69. 2033-2042)に記載
されている。
【０００８】本発明による鳥類用ヘルペスウィルスはマ
レック病ウィルス、特に HVT、感染性喉頭器官炎ウィル
スILTV、アヒルのヘルペスウィルスであるのが好まし
く、マレック病ウィルス、特に HVTウィルスが好まし
い。HVT のBamHI 制限断片Ｉは複数の ORFと３個の遺伝
子間領域とを有し、さらに本発明の挿入領域として複数
の好ましい挿入領域、好ましくは３つの遺伝子間領域
１、２および３と ORF UL55 とを含んでいる。挿入領域
への挿入とは、欠失を伴わない挿入、遺伝子間領域の複
数の塩基を欠失させて行う挿入、ORF を完全または部分
的に欠失させて行う挿入あるいは欠失させずに行う挿入
を意味する。CMV 即時初期プロモータ(CMV immediate e
arly promoter, IE)とは例に挙げた断片およびそれと同
じプロモータ活性を保持するサブ断片を意味する。CMV
IEプロモータはヒトのプロモータ(HCMV IE) またはネズ
ミのプロモータ(MCMV IE) あるいは由来の異なるCMV IE
プロモータ、例えばラットまたはモルモット由来のプロ
モータにすることができる。
【０００９】マレックベクターに挿入され、発現される
塩基配列は鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドすなわち
本発明で実現される好適な条件のもとで発現された時
に、予防接種をした動物が病原物質から効果的に防御さ
れるような免疫を獲得できるようなポリペプチドをコー
ドする任意の配列にすることができる。従って、所定の
病気の対象となる抗原をコードする塩基配列を本発明の
条件下で挿入することができる。本発明の組換え体は、
卵の状態での予防接種や生後１日目のヒナの予防接種、
さらに大きなヒナや成鳥の予防接種で使用することがで
きる。本発明は特にIBDVウィルスのVP2 ポリペプチドを
適切にコードする塩基配列の挿入に使用することができ
る。これによって得られる組換え生ワクチンはマレック
病に対する防御に加えてガンボロ病に対して完全に防御
できる。必要な場合には、別のIBDV抗原、例えばVP3 や
ポリプロテインVP2 ＋VP4 ＋VP3 などをコードする配列
を挿入することもできるが、これらの挿入は好ましくな
い。
【００１０】ガンボロ病に対する組換えワクチンは１回
の投与量当り10〜104pfuの濃度で与えるのが好ましい。
本発明の他の好ましいケースはマレック病ウィルスの抗
原をコードする塩基配列、特にgB、gC、gDおよびgH＋gL
遺伝子（ＰＣＴ特許公開第90/02803号）、ニューカッス
ル病ウィルスの抗原をコードする塩基配列、特にＦおよ
びHN遺伝子、感染性気管支炎ウィルス(IBV) の抗原をコ
ードする塩基配列、特にＳおよびＭ遺伝子 (M. Binns e
t al., J. Gen. Virol. 1985. 66. 719-726; M. Bours
nell etal., Virus Research 1984. 1. 303-313) 、鳥
類の貧血症ウィルス(CAV) の抗原をコードする塩基配
列、特にVP1(52kDa)＋VP2(24kD) (N.H.M.Noteborn et a
l.,J. Virol. 1991. 65. 3131-3139)および感染性喉頭
器官炎ウィルス(ILTV)の抗原をコードする塩基配列、特
にgB（ＰＣＴ特許公開第90/02802号）、gC、gDおよびgH
＋gLを挿入したものである。
【００１１】投与量はガンボロワクチンで確認されたも
のと同じにするのが好ましい。本発明の有利な展開は、
CMV IEプロモータを別のプロモータにヘッドツーテイル
(Head-to-tail)の向きで連結し、２つの塩基配列は一方
はCMV IEのプロモータの制御下に挿入し、もう一方は該
プロモータに連結されたプロモータの制御下に挿入じき
るようにすることである。この構成はCMV IEプロモー
タ、特にそのエンハンサー部分によって連結されたプロ
モータによって誘導される転写が活性化されるという点
で特筆すべきものである。連結されるプロモータとして
好ましいものはマレック1.8 RNA プロモータであり、そ
の転写活性はこれらの条件下で4.4倍になることが分か
っている。本発明の典型的なケースは、CMV IEの制御下
にIBDV VP2をコードする配列を含み、別のプロモータの
制御下にもう１つの鳥類疾患の抗原、特に上記のものを
コードする塩基配列を含むワクチンである。
【００１２】由来の異なるCMV IEプロモータをヘッドツ
ーテイルの向きに並べることも可能である。特に、マレ
ック病、ニューカッスル病、感染性喉頭器官炎、感染性
気管支炎および鳥類の貧血症に対するワクチンについて
は、1.8RNAプロモータをCMV IEプロモータの代わりに単
独で使用することもできる。本発明の他の対象は、異な
る病原体に由来する異なる配列を挿入された上記定義の
組換え生ワクチンを少なくとも２種含む、混合物または
混合用の多価ワクチン製剤にある。本発明は、さらに、
上記定義の組換え生ワクチンまたは多価ワクチン製剤を
投与する鳥類の予防接種法に関するものである。本発明
は特に卵の状態での予防接種、生後１日またはそれ以上
のヒナおよび成鳥の予防接種を行うための方法を対象に
する。
【００１３】以下、図を参照して非限定的な実施例を挙
げて本発明をより詳細に説明する。図は遺伝子間部位で
の構成図と配列のリストである。 遺伝子間部位での構成用配列リスト 配列 NO.１ HVTBam HI 断片Ｉの配列 配列 NO.２ オリゴヌクレオチドEL102 配列 NO.３ オリゴヌクレオチドEL161 配列 NO.４ オリゴヌクレオチドEL147 配列 NO.５ オリゴヌクレオチドEL162 配列 NO.６ オリゴヌクレオチドEL154 配列 NO.７ オリゴヌクレオチドEL163 配列 NO.８ オリゴヌクレオチドEL164 配列 NO.９ オリゴヌクレオチドEL165 配列 NO. 10 オリゴヌクレオチドEL132
【００１４】配列 NO. 11 オリゴヌクレオチドEL133 配列 NO. 12 オリゴヌクレオチドMB070 配列 NO. 13 オリゴヌクレオチドMB071 配列 NO. 14 オリゴヌクレオチドCD001 配列 NO. 15 オリゴヌクレオチドCD002 配列 NO. 16 オリゴヌクレオチドCD003 配列 NO. 17 オリゴヌクレオチドCD004 配列 NO. 18 NDV HV遺伝子の配列 配列 NO. 19 オリゴヌクレオチドEL071 配列 NO. 20 オリゴヌクレオチドEL073
【００１５】配列 NO. 21 オリゴヌクレオチドEL074 配列 NO. 22 オリゴヌクレオチドEL075 配列 NO. 23 オリゴヌクレオチドEL076 配列 NO. 24 オリゴヌクレオチドEL077 配列 NO. 25 MDV1.8-kbpRNA プロモータの配列 配列 NO. 26 オリゴヌクレオチドMB047 配列 NO. 27 オリゴヌクレオチドMB048 配列 NO. 28 オリゴヌクレオチドMB072
【００１６】
【実施例】全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sam
brook)達の Molecular Cloning:A Laboratory Manual.
第２版、Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Sprin
gHarbor. New York. 1989) に記載の分子生物学の標準
的手法で行った。本発明で使用した全ての制限酵素断片
はジェネクリーン(Geneclean) キット (BIO 101 Inc. L
a Jolla, CA)を用いて単離した。親ウィルスとして使用
したウィルスは七面鳥ヘルペスウィルス(HVT) のFC126
株で、地域家禽研究所 (Regional Poultry Research La
boratory USDA, EastLansing, Michigan)のウィッタ
博士が23週齢の七面鳥群から単離されたものである(Wri
tter R. L. et. al., Am. J. Vet. Res. 1970.31. 525-
538)。このウィルスの培養条件はフランス国特許出願第
90/03105号に記載のものを用いた。
【００１７】実施例１ マレック病ウィルスからのＤＮＡ抽出 ７日目にMDV のRB1B株を用いて攻撃したニワトリから感
染14日後に血液の全量を注射器を用いて抗凝結物質（10
0IU/mlのヘパリン溶液）上に回収した。次いでこの血液
を室温で15分間、30ｇで遠心分離した。軟膜と供に血漿
を除去し、無菌のPBS を用いて最終量が10mlとなるよう
に希釈した。150 ｇで15分間遠心分離した後、細胞ペレ
ットを２％の牛胎児血清(FCS) を含む199 培地（ギブコ
−BRL カタログ番号042-01183M）２mlに再懸濁した。次
に、感染させたリンパ球の全ＤＮＡをR. Morgan 達の方
法 (Avian Diseases1990. 34. 345-351)に従って抽出し
た。これはPCR 試験の鋳型として直接使用することがで
きる。MDV ウィルスのゲノム断片をクローニングするた
めに、RB1B株をCEF 上で培養し、リー(Lee Y.)達の方法
(J. Gen. Virol. 1980. 51. 245-253)に従って精製した
ウィルス粒からウィルスのＤＮＡを調製した。
【００１８】実施例２ MCMVウィルス（マウスのサイトメガロウィルス）のゲノ
ムＤＮＡの調製 米国タイプカルチャーコレクション(Type Culture Coll
ection, Rockville,Maryland, USA)からMCMVウィルス
のSmith 株を入手した(ATCC No. VR-194) 。このウィル
スをBalb/Cマウスの胎児細胞上で培養し、このウィルス
のウィルスＤＮＡをエベリング達(Ebeling A. et al.,
J. Virol. 1983. 47. 421-433)の方法で精製した。
【００１９】実施例３ トランスフェクション試験のためのHVT ウィルスのゲノ
ムＤＮＡの調製 トランスフェクション試験に用いるウィルスＤＮＡはモ
ルガン(R.Morgan)達のAvian Diseases. 1990. 34. 345-
351 に記載の方法でHVT ウィルスのFC126 株に感染させ
た二次培養CEC(CEC II) から調製した。
【００２０】実施例４ Bam HI断片Ｉの説明 HVT ウィルス FC126株の 5.8-kbpの Bam HI 断片Ｉ (Ig
arashi T. et al., J.Gen. Virol. 1989. 70. 1789-180
4)を Genecleanを用いて単離し、ベクターpBS-SK+ のBa
mHI 部位にクローニングしてプラスミドpEL037を作製し
た。この断片の配列の全体(5838bp)H 確定している（図
１〜４、配列 NO.１）。この配列では６個のオープンリ
ーディングフレーム(ORF) が同定されている。これらの
ORF によってコードされる可能性のある蛋白質を研究し
た結果、これらの蛋白質のいくつかが他のαヘルペスウ
ィルス内に存在するORF によってコードされる蛋白質と
の間に相同性を示すことが明らかになった。第１番目の
ORF (ORF1) (配列 NO.１の676 〜1209の位置) は HSV-1
UL55 のORF 、EHV-1 遺伝子４のORF およびVZV 遺伝子
５のORF との間に相同性を示し、178 アミノ酸(aa)の理
論上の蛋白質HVT UL55をコードする。 ORF2 は配列 NO.
１の1941〜1387の位置にあって ORF EHV-1遺伝子３によ
ってコードされる蛋白質と相同な185aa の蛋白質をコー
ドする。 ORF３は不完全である。これは配列 NO.１の58
38〜3573の位置にあってMDV の ORF21との間に相同性を
示す(Ross No. et al. Virus Genes. 1993. 7. 33-51)
。この配列で同定される他３つの ORFすなわち ORF4
(1403 〜1957まで)(185aa の蛋白質）、ORF5（3081〜22
87まで)(265aa の蛋白質）およびORF6（不完全；479 〜
１まで）は、配列ライブラリー中に相同なものを持たな
い。HVT ウィルスのBam HI断片Ｉのゲノムは外部遺伝子
の発現のためのカセットの挿入部位として使用可能な遺
伝子間領域が３箇所存在する構成をしている。
【００２１】遺伝子間領域（遺伝子間領域１）は ORF U
L55 とORF HVT 遺伝子３との間に存在する。第２の遺伝
子間領域（遺伝子間領域２）はORF HVT 遺伝子３と 265
-aaORF との間に存在する。第３の遺伝子間領域（遺伝
子間領域３）は265-aaORF とORF21 との間に存在する。
これら３つの領域は、得られた組換え HVTウィルスのin
vivo での複製に影響を与えずに、発現カセットの挿入
のために使用することができる。以下、この遺伝子間領
域１、２および３のためのドナープラスミドの作製例を
説明する。
【００２２】実施例５ 遺伝子間領域１用のドナープラスミドの作製 プラスミド pEL037 を Bam HI と EcoRIとで処理して、
2672-bp と2163-bp のBamHI-EcoRI 断片を単離した。こ
れらの断片を予めBamHI とEcoRI で処理したベクターpB
S-SK+ に導入して 5167bp のプラスミド pEL039 と、61
04bpのプラスミド pEL040 とをそれぞれ得た。プラスミ
ドpEL039（図５）をBamHI およびPstIで処理して997bp
のBamHI-PstI断片（断片Ａ）を得た。下記のオリゴヌク
レオチドおよび鋳型pEL039を用いてＰＣＲにより420-bp
の断片を作製した： EL102 （配列 NO.２） 5'CATTATAAGACCAACGTGCGAGTC
3' EL161 （配列 NO.３） 5'GTTCACGTCGACAATTATTTTATTTA
ATAAC 3' この断片を PstI と SalI とで処理して250-bpのPstI-S
alI 断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを予め
BamHI とSalIとで処理したベクターpBSII-SK+（ストラ
タジーン社）に導入して4160-bp のプラスミドpEL077
（図６）を得た。プラスミド pEL039 をBstBI およびSc
aIで処理して（ブラントエンドを有する）475-bpのBstB
I-ScaI断片（断片Ｃ）を単離した。
【００２３】下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を
用いて715-bpのＰＣＲ断片を作製する： EL147 （配列 NO.４） 5'AAGATAATGGGCTCCCGCTGTTC 3' EL162 （配列 NO.５） 5' TAATTGTCGACCCCGGGGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC 3' この断片をBstBI とSal I とで処理して465-bpのBstBI-
SalI断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃおよび断片Ｄを
予めApaIで処理してクレノーポリメラーゼで修復した
後、SalIで処理したプラスミッドpEL077に導入して5082
-bp のプラスミドpEL079（図７）を得た。このプラスミ
ドは遺伝子間部位１にEcoRI-SmaI-SalI ポリリンカーを
含んでいる。
【００２４】実施例６ 遺伝子間領域２のためのドナープラスミドの作製 プラスミドpEL039（実施例５）をBstBI およびPstIで処
理して715-bpのBstBI-PstI断片（断片Ａ）を単離した。
下記オリゴヌクレオチドと鋳型pEL039を用いてＰＣＲを
行って500-bpのＰＣＲ断片を作製した： EL154 （配列 NO.６） 5'GAAATGCAAACTAACATTATTGTC
3' EL163 （配列 NO.７） 5'GTGTAAATAGTCGACAATATAGATAA
CGGGC 3' この断片をBstBI とSalIとで処理し、430-bpのBstBI-Sa
lI断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを予めPstIと
SalIとで処理したベクターpBSII-SK+ に導入して4081-b
p のプラスミドpBL076（図８）を得た。
【００２５】下記オリゴヌクレオチドと鋳型pEL039とを
用いて565-bpのＰＣＲ断片を作製した： EL164 （配列 NO.８） 5'CTATATTGTCGACCCCGGGGAATTCATCGACATGATTAAATAC 3' EL165 （配列 NO.９） 5' CAATGAAGAAATATTTTCTTTGTTCCTTGAAATGC 3' この断片をSalIおよびSspIとで処理して535-bpのSalI-S
spI 断片を単離した。この断片を、あらかじめApaIで処
理してクレノーポリメラーゼで修復後にSalIで処理した
プラスミドpEL076に導入して、4598-bp のプラスミドpE
L078（図９）を作製した。このプラスミドは、遺伝子間
領域２にEcoRI-SmaI-SalI ポリリンカーを含んでいる。
【００２６】実施例７ 遺伝子間領域３のためのドナープラスミドの作製 プラスミドpEL040（実施例５参照）をNcoIとSphIで処理
して1468-bp のNcoI-SphI 断片を単離した。この断片を
予めNcoIとSphIで処理したプラスミドpUC BM20（ベーリ
ンガーマンハイム、カタログ番号1219235 ）に導入して
4182-bp のプラスミドpEL054（図10）を作製した。プラ
スミドpEL040をEcoRI およびSphIで処理して614-bpのEc
oRI-SphI断片を単離した。この断片を予めEcoRI とSphI
とで処理したプラスミドpUC BM20に導入して3263-bp の
プラスミド pEL055 （図11）を得た。プラスミド pEL05
5 をEcoRI で処理し、クレノーポリメラーゼを用いて修
復し、それをつなぎ、HindIII で処理し、クレノーポリ
メラーゼで修復し、最後にそれをつないで3279-bp のプ
ラスミドpEL062（図12）を得た。プラスミドpEL054をNc
oIとSalIとで処理して1492-bp のNcoI-SalI 断片（断片
Ａ）を単離した。下記２種類のオリゴヌクレオチドを互
いにハイブリダイズさせて24-bp のSalI-SphI 断片（断
片Ｂ）を得た：
【００２７】 EL132 （配列 NO. 10) 5' CCGAATTCATATAAGCTTACGTG
3' EL133 （配列 NO. 11) 5' TCGACACGTAAGCTTATATGAATT
CGGCATG 3' 断片ＡとＢを予め NcoI と SphI とで処理したプラスミ
ドpEL062に導入して、4787-bp のプラスミドpEL066（図
13）を得た。このプラスミドは遺伝子間領域３にEcoRI-
HindIII-SalIポリリンカーを含んでいる。
【００２８】実施例８ ドナープラスミドpEL090の作製とvHVT16の単離 BamHI-HindIII カセット状のIBDV VP2遺伝子を含むプラ
スミドpEL004（＝フランス国特許出願第92/013109 号に
記載のプラスミド pGH004 に等しい）を BamHIとXbaIと
で処理して1140-bp のBamHI-XbaI断片（切り出されたVP
2 遺伝子）を単離した。この断片を予めXbaIおよびBamH
I で処理したベクターpBS-SK+ にクローニングして4052
-bp のプラスミドpEL022（図14）を得た。このベクター
pBS-SK+をEcoRV とXbaIとで処理し、次いでそれをつな
いでpBS-SK+ （変性されたもの）を得た。プラスミドpE
L004をKpnIとHindIII で処理して、完全なIBDV VP2を含
有する1387-bp のKpnI-HindIII断片を単離した。この断
片を予めKpnIとHindIII で処理したベクターpBS-SK* に
クローニングして 4292bp のプラスミドpEL023（図15）
を得た。プラスミドpEL022をBamHI およびNotIで処理し
て1122-bp のBamHI-NotI断片（断片Ａ）を単離した。
【００２９】プラスミドpEL023をBamHI とNotIとで処理
して333-bpのBamHI-NotI断片を単離した（断片Ｂ）。断
片ＡとＢを予め NotI で処理してアルカリホスファター
ゼで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4369-bp のプ
ラスミドpEL024（図16）を得た。プラスミドpEL024をNc
oIで処理して1145-bp のNotI-NotI 断片を単離した。こ
の断片を予め NotI で処理したプラスミドpCMVβ（クロ
ンテック カタログ番号6177-1）に導入して 5096-bpの
プラスミド pEL026 （図18）を得た。プラスミドpEL026
を EcoRI、SalIおよびXmnIで処理して 2428-bpのEcoRI-
SalI断片を単離した。この断片を予め EcoRIおよび Sal
I で処理したプラスミドpEL079（実施例５）に導入し
て、7514-bp のプラスミドpEL090（図19）を得た。この
プラスミドによって、HCMV-IE/IBDV VP2発現カセットを
HVT ウィルスの遺伝子間部位１に挿入することが可能と
なる。
【００３０】24時間培養した初代 CEF細胞を１μｇの直
鎖状プラスミドpEL090＋５μｇのHVT ウィルスDNA を 3
00μｌのOptiMEM 培地（ギブコ BRL カタログ番号041-
01985H）に入れたものと、100 μｇのLipofectAMINE を
300 μｌの培地に希釈したものとの混合物（混合物の最
終量は600 μｌ）を用いて感染させた。この600 μｌを
３ml（最終量）の培地に希釈して３×106 のCECI上に播
いた。混合物を細胞と接触させた状態で５時間保ち、そ
の後取り除いて５mlの培養培地で置き換える。その後細
胞を37℃で３日間培養し、その後プロナーゼ処理して、
新鮮なCECII と混合し（３：１で混合）、さらに再び96
ウェルのプレート１個に播く。このプレートを３日間培
養し、その後細胞をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と
混合し、再び２枚の96ウェルプレートに播く（元の１つ
のウェルから２つの姉妹ウェルを得る）。
【００３１】96−ウェルプレートを細胞変性効果が見ら
れるようになるまで培養した。72時間培養後、２枚の96
−ウェルプレートのうち一方を95％のアセトン中で30分
間固定し、抗VP2 モノクロナル抗体を用いて間接蛍光抗
体(IIF) 反応を行い、蛋白質VP2 を発現するプラークを
調べた。IIF で陽性のプラークを示すカップの「シスタ
ーカップ」をプロナーゼ処理し、新鮮なCEFII と混合
し、限定的な希釈で96ウェルのプレートに塗布した。３
日間培養後、細胞変性効果を示したカップをプロナーセ
処理し、CEF IIと混合して、再び96−ウェルのプレート
に播いた（元の１つのウェルから２つの姉妹ウェルを得
る）。３日後、蛋白質VP2 を発現しているプラークを、
再び、前回と同様IIF によって２つのシスタープレート
のうち一方について試験した。
【００３２】一般に、連続４回の単離サイクル（カップ
の回収、再播付け、IIF によるモニタリング、シスター
カップの継代培養等) を行うことによって子孫全てが特
異的な蛍光を示す組換えウィルスを得ることができる。
抗VP2 モノクロナル抗体を用いたIIF によって100 ％の
陽性プラークを与えるウィルスプラークをvHVT16と命名
した。この組換えウィルスのゲノムＤＮＡについて適当
なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプローブを用いた標
準的なＰＣＲおよびサザンブロット法によって分子レベ
ルでの特徴付けを行った。
【００３３】実施例９ ドナープラスミドpEL091の作製と、vHVT17の単離 プラスミドpCMVβ（図17）をSalIとSmaIで処理してlacZ
遺伝子並びにVS40ウィルスの後期遺伝子のポリアデニレ
ーションシグナルを含む3679-bp のSalI-SmaI断片を単
離した。この断片を予めSalIとEcoRV とで処理したベク
ターpBS-SK+ に挿入して6625-bp のプラスミドpCD002
（図20）を得た。このプラスミドはlacZレポータ遺伝子
を含むが、この遺伝子の下流に位置するプロモータはな
い。実施例２に従ってMCMVウィルスのウィルスゲノムＤ
ＮＡを調製し、PstIで処理して2285-bp のPstI-PstI 断
片を得た。この断片を予めPstIで処理したアルカリホス
ファターゼで処理したベクター pBS-SK+にクローニング
してプラスミド pCD004 を得た。プラスミドpCD004をHp
aIとPstIで処理して1389-bp のHpa-PstI断片を得た。こ
の断片はネズミのサイトメガロウィルス(MCMV)の即時初
期遺伝子のプロモータ／アクチベータ領域を含む(Dorsc
h-Hasler K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.1985. 8
2. 8325-8329 、WO-A-87/03905 号）。この断片を予めP
stIとSmaIとで処理したプラスミド pCD002 にクローニ
ングして8007-bp のプラスミドpCD009（図21）を得た。
【００３４】下記２つのオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーションを行って２本鎖のオリゴヌクレオチドを
作製した： MB070 （配列 NO. 12) 5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGG
TAC 3' MB071 （配列 NO. 13) 5' CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGA
GCT 3'
【００３５】この２本鎖オリゴヌクレオチドを予めKpnI
とSacIで処理したベクターpBS-SK+に導入してプラスミ
ドpEL067を得た。プラスミド pCD009 を PstI と SpeI
で処理して1396-bp のPstI-SpeI 断片を単離した。この
断片を予めPstIとSpeIとで処理したプラスミドpEL067に
導入して4297-bp のプラスミドpEL068（図22）を得た。
プラスミド pEL026 （実施例８参照）をHindIII および
SalIで処理して235-bpのHindIII-SalI断片（断片Ｂ）を
単離した。断片ＡとＢを同時に予めNotIとSalIで処理し
たプラスミドpEL068に導入して 5908-bpプラスミドpEL0
70（図23）を得た。プラスミド pEL070 を EcoRI、SalI
およびXmnIで処理して3035-bp のEcoRI-SalI断片を単離
した。この断片を予めEcoRI とSalIで処理したプラスミ
ドpEL079（実施例５参照）に導入して 9109-bpのプラス
ミドpEL091（図24）を得た。このプラスミドによってHV
T ウィルスの遺伝子間部位１にMCMV-IE/IBDV VP2発現カ
セットを挿入することが可能になる。プラスミドpEL091
およびHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に
記載の同時形質転換(cotransfection)を行って組換え体
vHVT17の単離および精製を行った。
【００３６】実施例10 ドナープラスミドpEL092の作製およびvHVT18の単離 MDV gB遺伝子を含む MDVウィルス RB1B 株のゲノムＤＮ
Ａの3.9-kbp のEcoRI-SalI断片〔この配列はロス(Ross
N.) 達が開示している (J. Gen. Virol. 1989.70. 1789
-1804)〕を予めEcoRI とSalIで処理したベクターpUC13
に導入してプラスミドpCD007を得た。このプラスミドを
SacI およびXhoIで処理して2260-bp のSacI-XhoI 断片
（gB遺伝子の中央部位＝断片Ａ）を単離した。下記のオ
リゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いてＰＣＲを行いて
222-bpのＰＣＲ断片を作製した： CD001 （配列 NO. 14) 5'GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3' CD002 （配列 NO. 15) 5'TTCGGGACATTTTCGCGG 3' この断片をKpnIとXbaIで処理して190-bpのkpnI-XbaI 断
片（gB遺伝子の５’末端＝断片Ｂ）を単離した。下記オ
リゴヌクレオチドと鋳型pCD007とを用いて195-bpのＰＣ
Ｒ断片を作製した： CD003 （配列 NO. 16) 5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3' CD003 （配列 NO. 17) 5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3'
【００３７】この断片をSacIとSacII で処理して162-bp
のSacI-SacII断片（gB遺伝子の３’末端＝断片Ｃ）を単
離した。断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めKpnIおよびSa
cIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して5485-bp のプ
ラスミドpCD011（図25）を得た。プラスミドpCD011をNo
tIで処理して2608-bp のNotI-NotI 断片（MDV gB遺伝子
全体）を単離した。この断片を予めNotIで処理してアル
カリホスファターゼで処理したプラスミドpCMVβに導入
して6299-bp のプラスミドpCD020（図26）を得た（この
プラスミドではlacZ遺伝子がMDV gB遺伝子に置き代って
いる）。プラスミドpCD020をEcoRI とSalIで処理して36
48-bp のEcoRI-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI
とSalIとで処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）
に導入して8718-bp のプラスミドpEL092（図27）を得
た。このプラスミドによって、HVTウィルスの遺伝子間
部位１にHCMV-IE/MDV gB発現カセットを挿入することが
可能となる。プラスミドpEL092とHVT ウィルスのゲノム
ＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換(cotrans
fection)を行って組換え体vHVT18の単離・精製をした。
【００３８】実施例11 ドナープラスミドpEL093の作製と、vHVT19の単離 テイラー達の方法(Taylor J. et al., J. Virol. 1990.
64. 1441-1450) に従ってニューカッスル病ウィルス(N
DV) テキサス株のゲノムに対して相補的なＤＮＡのライ
ブラリーを作製した。フュージョン遺伝子(F) の末端、
赤血球凝集素ノイラミニダーゼ(HN)遺伝子の全体および
ポリメラーゼ用の遺伝子の開始点を含むpBR322クローン
をpHN01 として同定した。このクローン内に存在するND
V HN遺伝子の配列を図28、29（配列 NO. 18)に示す。プ
ラスミドpHN01 をSphIおよびXbaIで処理して2520-bp の
SpaI-XbaI 断片を単離した。この断片を予めSpaIとXbaI
で処理したベクターpUC19 に導入して5192-bp のプラス
ミドpHN02 を得た。プラスミドpHN02 をClaIとPstIで処
理して700-bpのClaI-PstI 断片（断片Ａ）を単離した。
【００３９】下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を
用いてＰＣＲを行って270-bpのＰＣＲ断片を作製した： EL071 （配列 NO. 19) 5'CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC
3' EL073 （配列 NO. 20) 5'GTATTCGGGACAATGC 3' この断片をHindIII とPstIで処理して220-bpのHindIII-
PstI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂを同時
に予め ClaI および HindIIIで処理したベクターpBS-SK
+ に導入して3872-bp のプラスミドpEL028（図30) を得
た。プラスミドpHN02 をBsphI とClaIで処理して 425-b
p のBsphI-ClaI断片（断片Ｃ）を単離した。下記のオリ
ゴヌクレオチドと鋳型pHN02 を用いて425-bpのＰＣＲ断
片を作製した： EL074 （配列 NO. 21) 5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3' EL075 （配列 NO. 22) 5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3'
【００４０】この断片をBsphI とNotIで処理して390-bp
のBsphI-NotI断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃおよび
Ｄを同時に予めClaIおよびNotIで処理したベクターpBS-
SK+に導入して3727-bp のプラスミドpEL029bis （図3
1）を得た。プラスミドpEL028をClaIとSacII で処理し
て960-bpのClaI-SacII断片（断片Ｅ）を単離した。プラ
スミドpEL029bis をClaIとNotIで処理して820-bpのClaI
-NotI 断片（断片Ｆ）を得た。断片ＥとＦを同時に予め
NotIとSacIで処理したベクターpBS-SK+ に導入して4745
-bp のプラスミドpEL030（図32）を得た。プラスミドpE
L030をNotIで処理して1780bpのNotI-NotI 断片（NDV HN
遺伝子の全体）を単離した。この断片を、lacZの代わり
に予めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理し
たプラスミド pCMV βに導入して5471-bp のプラスミド
pEL032（図33）を得た。プラスミドpEL032をEcoRI とCl
aIで処理して1636-bp のEcoRI-ClaI断片（断片Ｇ）を単
離した。プラスミドpEL032をClaIとSalIで処理して1182
-bp のClaI-SalI 断片（断片Ｈ）を単離した。断片Ｇお
よびＨを予めEcoRI とSalIとで処理したプラスミドpEL0
79（実施例５参照）に導入して7890-bp のプラスミドpE
L093（図34) を得た。このプラスミドによってHVT ウィ
ルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV HNを挿入すること
が可能となる。プラスミドpEL093とHVT ウィルスのゲノ
ムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時形質転換を行っ
て組換え体vHVT19の単離・精製を行った。
【００４１】実施例12 ドナープラスミドpEL094の作製と、vHVT20の単離 ニューカッスル病ウィルスのゲノムに相補的なＤＮＡの
ライブラリー（実施例11参照）に由来するフュージョン
遺伝子(F) の全体を含むクローンをpNDV81とした。この
プラスミドは公知であり、このクローン中に存在するND
V F 遺伝子の配列は既に発表されている(Taylor J. et
al. J. Virol. 1990. 64. 1441-1450)。プラスミドpNDV
81をNarIとPstIで処理して1870-bp のNarI-PstI 断片
（断片Ａ）を単離した。下記オリゴヌクレオチドと鋳型
pNDV81を用いてＰＣＲを行って160-bpの断片を作製し
た： EL076 （配列 NO. 23) 5'TGACCCTGTCTGGGATGA 3' EL077 （配列 NO. 24) 5'GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3'
【００４２】この断片をPstIとSalIで処理して130bp の
PstI-SalI 断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂ
を同時に予めClaIおよびSalIで処理したベクターpBS-SK
+ に導入して4846-bp のプラスミドpEL033（図35）を得
た。プラスミドpEL033をNotIで処理して1935-bp のNotI
-NotI 断片（Ｆ遺伝子全体）を単離した。この断片を予
めNotIで処理してアルカリホスファターゼで処理したプ
ラスミドpCMBβに導入して5624-bp のプラスミドpEL034
（lacZ遺伝子がNDV F 遺伝子で置き換えられている）を
得た（図36）。プラスミド pEL034 をEcoRI とKpnIで処
理して866-bpのEcoRI-KpnI断片（断片Ｃ）を単離した。
プラスミドpEL034をKpnIとSalIで処理して2114-bp のKp
nI-SalI 断片（断片Ｄ）を単離した。断片Ｃと断片Ｄを
同時に予めEcoRI およびSalIで処理したプラスミドpEL0
79（実施例５参照）に導入して、8043-bp のプラスミド
pEL094（図37）を得た。このプラスミドによって、HVT
ウィルスの遺伝子間部位１にHCMV-IE/NDV F の発現カセ
ットを挿入することが可能となる。プラスミドpEL094と
HVTウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の
同時形質転換を行って組換え体vHVT20の単離・精製を行
った。
【００４３】実施例13 ドナープラスミドpEL095の作製と、vHVT21の単離 MDV の1.8-kbp RNA 遺伝子の上流に位置する配列はブラ
ドレー達によって報告されている（Bradley G. et al.,
J. Virol. 1989. 63. 2534-2542)(図38および配列 NO.
25)。下記オリゴヌクレオチドを用いてMDV のRB1B株に
感染したニワトリから得られるリンパ球から抽出したＤ
ＮＡについてＰＣＲ増幅を行った： MB047 （配列 NO. 26) 5' GGTCTACTAGTATTGGACTCTGGTGCGAACGC 3' MB048 （配列 NO. 27) 5' GTCCAGAATTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3' 得られた163-bpのＰＣＲ断片をEcoRI とSpeIで処理した
後、予めEcoRI とSpeIで処理したプラスミドpCD002（実
施例９参照）に導入して6774-bp のプラスミドpBS002
（図39）を得た。プラスミドpBS002は lacZ 遺伝子の上
流にクローニングされたMDV の1.8-kbp RNA 遺伝子のプ
ロモータを含んでいる。
【００４４】下記オリゴヌクレオチドと鋳型pBS002を用
いてＰＣＲを行った： MB047 （配列 NO. 26)および MB072 （配列 NO. 28) 5' GTGTCCTGCAGTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3' 得られたＰＣＲ断片をPstIとSpeIで処理して200bp のPs
tI-SpeI 断片を単離した。この断片を予め PstI および
SpeIで処理したプラスミドpEL067（実施例９参照）に導
入してプラスミドpEL069（図40）を得た。プラスミドpC
D007（実施例10参照）をEcoRI およびXbaIで処理して26
70-bp のEcoRI-XbaI断片（断片Ａ）を単離した。プラス
ミドpCD011（実施例10参照）を NotI およびXbaIで処理
して180-bpのNotI-XbaI 断片（断片Ｂ）を単離した。プ
ラスミドpEL069をNotIとSpeIで処理して180-bpのNotI-S
peI 断片（断片Ｃ）を単離した。
【００４５】断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めEcoRI と
SpeIで処理したプラスミド pEL067（実施例９）に導入
して5939-bp のプラスミドpEL080（図41）を得た。プラ
スミドpEL070（実施例９）をKpnIとSpeIで処理して1345
-bp のKpnI-SpeI 断片（断片Ｄ）を単離した。プラスミ
ド pEL070 も KpnI とSalIで処理して1658-bp のKpnI-S
alI 断片（断片Ｅ）を単離した。断片ＤおよびＥを一緒
に予めSalIとSpeIで処理したプラスミド pEL080 に導入
して8938-bp のプラスミドpEL081（図42）を得た。プラ
スミドpEL081をEcoRI とSalIで処理して6066-bp のEcoR
I-SalI断片を得た。この断片を予めEcoRI とSalIとで処
理したプラスミド pEL079 （実施例５参照）に導入して
最終的に11139-bpのプラスミドpEL095（図43を得た）。
このプラスミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１
にVP2/HCMV-IE//1.8-kbp RNA/MDVgBの二重発現カセット
を挿入することが可能となる。プラスミドpEL095とHVT
ウィルスのゲノムＤＮＡを用いて実施例８に記載の同時
形質転換を行って組換え体vHVT21の単離・精製を行っ
た。
【００４６】実施例14 ドナープラスミドpEL098の作製とvHVT24の単離 プラスミドpEL080（実施例13参照）をEcoRI とSalIで処
理して3040-bp のEcoRI-SalI断片（1.8-kbp RNA/MDV gB
カセット）を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで
処理したプラスミドpEL079（実施例５参照）に導入して
8140-bp のプラスミドpEL098（図44）を得た。このプラ
スミドによってHVT ウィルスの遺伝子間部位１に1.8-kb
p RNA/MDV gBのカセットを挿入することが可能となる。
プラスミドpEL098とHVT ウィルスのゲノムＤＮＡを用い
て実施例８に記載の同時形質転換を行って組換え体vHVT
21の単離・精製を行った。
【００４７】実施例15 HVT ウィルスの遺伝子間部位１にIBV M およびS の発現
カセットを挿入するためのドナープラスミドの作製 発現カセット（HCMV-IE またはMCMV-IE プロモータある
いはMCMV-IE//1.8-kbpRNA 二重プロモータの制御下に置
かれた遺伝子）を遺伝子間部位１に挿入するための上記
方法に従って、鳥類の感染性気管支炎ウィルス(IBV) の
膜(M) 蛋白質またはスパイク(S) 蛋白質を高レベルで発
現する組換えHVT ウィルスを作製することができる。IB
VS遺伝子がHCMV-IE プロモータまたはMCMV-IE プロモー
タの制御下にある構成あるいはIBV M およびIBV S 遺伝
子がMCMV-IE/1.8-kbp RNA 二重プロモータと一緒に遺伝
子間部位１に挿入され、Ｍ遺伝子が1.8-kbp RNA プロモ
ータの制御下にあり、Ｓ遺伝子がMCMV-IE プロモータの
制御下にあるような構成にすることができる。この構成
では1.8-kbp RNA プロモータがMCMV-IE プロモータのア
クチベータ領域によって活性化される。
【００４８】実施例16 遺伝子間部位２および３に挿入された外部遺伝子を有す
る組換えHVT ウィルスの作製 遺伝子間部位２および３に外部遺伝子発現のためのカセ
ットが挿入された組換えHVT ウィルスを実施例８〜14に
記載の方法に従って作製したが、特異的なドナープラス
ミドを作製するために実施例８〜14で用いたプラスミド
pEL079に代えてプラスミドpEL078（遺伝子間部位２）お
よびpEL066（遺伝子間部位３）をそれぞれ使用した。
【００４９】実施例17 本発明のワクチンの調製 本発明のワクチンは当業者には周知の任意の標準的な方
法、例えばローラボトル培養で調製することができる。
ニワトリの初期の胚細胞 200×106 を植えつけたローラ
ボトル（175 cm2 ）を37℃で24時間培養した後、ボトル
に105pfu/ml の力価を有する組み換えHVT ウィルスのウ
ィルス溶液１mlを接種した。37℃で４日間培養後、上澄
み液を除去してトリプシン／ヴェルセン溶液で細胞を剥
がし、その後に回収する。次いで、感染した細胞を遠心
分離する。上澄みを除去し、凍結乾燥安定剤（例えばSP
GAスクロース、リン酸塩、グルタメート、アルブミン）
を含む溶液20mlに再懸濁する。次いで、この混合物を超
音波処理し、１ml画分ずつバイヤルに分配して最後に凍
結乾燥する。必要な場合にはワクチンを凍結乾燥でなく
分配後に凍結させることもできる。
【００５０】実施例18 本発明で得られたガンボロ病ウィルスのVP2 蛋白質を発
現する組換えウィルスを用いて生後１日のヒナに筋肉注
射で免疫処理した。このヒナに対して生後21日後にガン
ボロ病のウィルスを用いて攻撃（病原菌投与）した。攻
撃から11日後、ワクチン処理された群とワクチン未処理
の対照群との間で死亡とファブリシウス滑液嚢炎とを比
較して防御効果を評価した。このワクチン処理／攻撃プ
ロトコルの結果、本発明のワクチンは高レベルの防御を
示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 HVT BamHI 断片I
【図２】 HVT BamHI 断片I のつづき
【図３】 HVT BamHI 断片I のつづき
【図４】 HVT BamHI 断片I のつづき
【図５】 プラスミドpEL039
【図６】 プラスミドpEL077
【図７】 プラスミドpEL079
【図８】 プラスミドpEL076
【図９】 プラスミドpEL078
【図１０】 プラスミドpEL054
【図１１】 プラスミドpEL055
【図１２】 プラスミドpEL062
【図１３】 プラスミドpEL066
【図１４】 プラスミドpEL022
【図１５】 プラスミドpEL023
【図１６】 プラスミドpEL024
【図１７】 プラスミドpCMVβ
【図１８】 プラスミドpEL026
【図１９】 プラスミドpEL090
【図２０】 プラスミドpCD002
【図２１】 プラスミドpCD009
【図２２】 プラスミドpEL068
【図２３】 プラスミドpEL070
【図２４】 プラスミドpEL091
【図２５】 プラスミドpCD011
【図２６】 プラスミドpCD020
【図２７】 プラスミドpEL092
【図２８】 NDV HN 遺伝子の配列
【図２９】 NDV HN 遺伝子の配列のつづき
【図３０】 プラスミドpEL028
【図３１】 プラスミドpEL029bis
【図３２】 プラスミドpEL030
【図３３】 プラスミドpEL032
【図３４】 プラスミドpEL093
【図３５】 プラスミドpEL033
【図３６】 プラスミドpEL034
【図３７】 プラスミドpEL094
【図３８】 MDV 1.8-kbp RNA プロモータの配列
【図３９】 プラスミドpBS002
【図４０】 プラスミドpEL069
【図４１】 プラスミドpEL080
【図４２】 プラスミドpEL081
【図４３】 プラスミドpEL095
【図４４】 プラスミドpEL098
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ラファエル ジャン ダルテイル フランス国 69007 リヨン リュ ドゥ マルセイユ 29 (72)発明者 カロル ヴェロニク デュイナ フランス国 69007 リヨン リュ モン テスキュー 124 (72)発明者 エリアヌ ルイーズ フランソワーズ ラ プラース フランス国 69600 ウーラン ブルヴァ ール ドュ ジェネラル ドゥ ゴール ４ (72)発明者 ミシェル アルベール エミール リヴィ エール フランス国 69130 エキュイイ シュマ ン ドュ シャンスリエ 11

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 CMV 即時初期プロモータの制御下に、OR
    F UL55のATG と隣接する繰り返し領域を有するＵL の接
    合点との間の領域に挿入された、鳥類の病原物質の抗原
    ポリペプチドをコードし且つ発現する塩基配列を少なく
    とも１つ含む鳥類ヘルペスウィルスをベクターとして有
    する鳥類用組換え生ワクチン。
  2. 【請求項２】 ベクターがマレック病ウィルス（MDV お
    よびHVT)、感染性喉頭器官炎ウィルスILTVおよびアヒル
    のヘルペスウィルスからなる群の中から選択される請求
    項１に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  3. 【請求項３】 ベクターがHVT ウィルスであり、BamHI
    断片Ｉに挿入される請求項２に記載の鳥類用組換え生ワ
    クチン。
  4. 【請求項４】 遺伝子間領域１、２および３またはBamH
    I 断片のORF UL55に挿入される請求項３に記載の鳥類用
    組換え生ワクチン。
  5. 【請求項５】 CMV 即時初期プロモータがヒトのプロモ
    ータHCMV IE またはネズミのプロモータMCMV IE である
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワ
    クチン。
  6. 【請求項６】 CMV 即時初期プロモータの制御下に挿入
    される塩基配列がガンボロ病の抗原、マレック病の抗
    原、ニューカッスル病の抗原、感染性気管支炎の抗原、
    感染性喉頭器官炎の抗原および鳥類の貧血症の抗原より
    成る群の中から選択される抗原をコードする塩基配列で
    ある請求項１〜５のいずれか一項に記載の鳥類用組換え
    生ワクチン。
  7. 【請求項７】 CMV 即時初期プロモータの制御下に挿入
    される塩基配列がIBDVウィルスのポリペプチドVP2 をコ
    ードする塩基配列である請求項１〜６のいずれか一項に
    記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  8. 【請求項８】 CMV 即時初期プロモータにヘッドツーテ
    イル状に連結された他のプロモータを含み、２つの塩基
    配列が一方はCMV 即時初期プロモータの制御下に、もう
    一方は該プロモータと組み合わせて使用されるプロモー
    タの制御下に、それぞれ挿入領域に挿入される請求項１
    〜７のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  9. 【請求項９】 組み合せて使用されるプロモータがマレ
    ックの1.8RNAプロモータである請求項８に記載の鳥類用
    組換え生ワクチン。
  10. 【請求項１０】 CMV即時初期プロモータの制御下に挿入
    される塩基配列がIBDVウィルスのポリペプチドVP2 をコ
    ードする塩基配列であり、組み合わせて使用されるプロ
    モータの制御下に挿入される塩基配列が別の鳥類疾患の
    抗原をコードする塩基配列である請求項８または９に記
    載の鳥類用組換え生ワクチン。
  11. 【請求項１１】 別の鳥類疾患の抗原をコードする塩基
    配列がマレック病の抗原、ニューカッスル病の抗原、感
    染性気管支炎の抗原、感染性喉頭器官炎の抗原および鳥
    類の貧血症の抗原より成る群の中から選択される請求項
    10に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  12. 【請求項１２】 組み合わせて使用されるプロモータが
    由来の異なるCMV 即時初期プロモータである請求項８に
    記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  13. 【請求項１３】 挿入される塩基配列が下記遺伝子： 1) ガンボロ病ウィルスのVP2 、VP3 およびVP2 ＋VP4
    ＋VP3 、 2) マレック病ウィルスのgB、gC、gD及びgH＋gL、 3) 鳥類の貧血症ウィルスのVP1(52kDa)＋VP2(24kDa)、 4) 感染性気管支炎ウィルスのＳおよびＭ、 5) 感染性喉頭気管炎ウィルスのgB、gC、gDおよびgH＋
    gL をコードする配列の群の中より選択される請求項１〜12
    のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  14. 【請求項１４】 CVM即時初期プロモータの代わりに1.8
    RNA プロモータを使用する請求項１〜６のいずれか一項
    に記載の鳥類用組換え生ワクチン。
  15. 【請求項１５】 異なる配列が挿入された請求項１〜14
    のいずれか一項に記載の鳥類用組換え生ワクチンを少な
    くとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製
    剤。
  16. 【請求項１６】 挿入される異なる塩基配列が異なる病
    原体に由来する請求項15に記載の多価ワクチン製剤。
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