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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Impfstoffe zur Anwendung bei Vögeln auf der Grundlage eines
HVT-Virus (Putenherpesvirus) in den durch genetische Rekombination
mindestens eine Nukleotidsequenz inseriert wurde, die für ein antigenes
Polypeptid eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert und dieses
exprimiert, unter Bedingungen, die eine Immunisierung sicher stellen,
die zu einem wirksamen Schutz des geimpften Tiers gegen das pathogene
Agens führt.
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Es ist bereits eine gewisse Anzahl
rekombinanter Vogelvirusvektoren mit der Absicht vorgeschlagen worden,
Vögel gegen
pathogene Agenzien aus Vögeln,
insbesondere pathogene Viren zu impfen, worunter das Virus der Marek-Krankheit
(MDV), der Newcastle-Krankheit (NDV), der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV),
der Gumboro-Krankheit (infektiöse
Bursitis, IBDV), infektiösen
Bronchitis (IBV) und Vogelanämie
(CAV) fallen.
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Die verwendeten Virusvektoren umfassen
Avipox, insbesondere Fowlpox (EP-A-0 517 292; N.-G. Heine et al.,
Arch. Virol. 1993, 131, 277–292;
D. B. Boyle et al., Veterinary Microbiology 1994, 41, 173–181; C.
D. Bayliss et al., Arch. Virol. 1991, 120, 193–205), die Marek-Viren, insbesondere
die Serotypen 2 und 3 (HVT) (WO-A-87 04463; WO-A-89 01040; WO-A-93
25665; EP-A-0 513 921; J. McMillen, Poultry Condemnation Meeting,
October 1994, 359–363;
P. J. A. Sondermeijer et al., Vaccine 1993, 11, 349–357; R.
W. Morgan et al., Avian Diseases 1992, 36, 858–870, und 1993, 37, 1032–1040) oder
auch die ILTV-Viren und das Vogel-Adenovirus.
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Wenn diese rekombinanten Viren zur
Impfung verwendet werden, induzieren sie einen Schutz in unterschiedlicher
Höhe, der
im allgemeinen schwach oder partiell ist, selbst wenn in besonderen,
seltenen Fällen ein
bedeutender Schutz gezeigt werden kann.
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Unter dem Schutz, der sich durch
lebende, rekombinante Vogelimpfstoffe am schwierigsten sicher stellen
läßt, befindet
sich der gegen das Virus der Gumboro-Krankheit oder das IBDV-Virus. Wenn
es auch klassische, abgeschwächte
oder inaktivierte Lebendimpfstoffe gibt, die gegen diese Krankheit
wirksam sind, ist tatsächlich
noch von keinem rekombinanten Lebendimpfstoff eine angemessene Wirksamkeit
bewiesen worden.
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Das Genom des Virus der Gumboro-Krankheit
besteht aus einer doppelsträngigen
RNA. Das größte Segment
(Segment A) kodiert für
ein Polyprotein mit 115 kDa, das sich sekundär in drei Proteine VP2 (41
kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa) aufspaltet. VP4 ist eine Protease,
die in die Reifung des Polyproteins mit 115 kDa eingreift. Die Position
der Spaltungsstelle zwischen VP2 und VP4 ist nur ungefähr bestimmt
(M. Jagadish, J. Virol. 1988, 62, 1084–1087). Das Protein VP2 ist
ein Immunogen, das neutralisierende Antikörper und einen Schutz gegen
die Gumboro-Krankheit einführt.
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Es ist bereits vorgeschlagen worden,
für immunogene
IBDV-Proteine kodierende Gene in verschiedene Lebendvektoren zu
inserieren: EP-A-0 517 292 (Insertion für VP2 oder das Polyprotein
in einem Avipox kodierende Sequenzen); C. D. Bayliss 1991, H.-G.
Heine 1993 und D. B. Boyle 1994, supra (VP2 in Fowlpox).
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Die Viren der Marek-Krankheit sind
ebenfalls in der WO-A-90 02802 und WO-A-90 02803 (verschiedene Insertionsstellen
wie etwa gC, TK, RR1, RR2), in den französischen Patentanmeldungen Nr.
90 03105 (RR2) und 90 11146 (US3) wie auch insbesondere in den Patentanmeldungen
WO-A-87 04463 und WO-A-89 01040 (BamHI #16 und #19) und WO-A-93
25655 (US2) vorgeschlagen worden.
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R. J. Isfort et al. (Virology 1994,
203, 125–133)
haben eine bestimmte Anzahl Integrationsstellen des Retrovirus in
dem HVT-Genom bestimmt, Stellen, die sich in den Restriktionsfragmenten
BamHI F, A und I befinden. Andere Beispiele von Insertionsstellen
im NVT-Genom sind in der EP-A-0 431668 (US-Region) und JP-4 200 384 (gA) vorgeschlagen
worden.
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Verschiedene Promotoren, worunter
sich die allgemein im Handel erhältlichen
befinden, wurden bei verschiedenen Konstruktionen des Standes der
Technik verwendet, darunter die Promotoren PRV gX, HCMV IE (humaner
Immediate-early-CMV),
Herpes simplex alpha-4, FPV P.E/L (Fowlpox-Promotor) (N. Heine et
al., Arch. Virol. 1993, 131, 277–292), P7.5 (C. Bayliss et
al., Arch. Virol. 1991, 120, 193–205) und P11 des Virus des
Impfstoffs (D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994, 41, 173–181), der
aus der LTR-Sequenz des RSV-Virus (Rous Sarcoma Virus) stammt, SV40
early sowie die MDV- oder HVT-Promotoren wie etwa die Promotoren der
Gene gB, gC, TK, RR2 usw., ohne daß dabei, insbesondere im Fall
von Konstruktionen in HVT, eine gewisse Regelmäßigkeit festgestellt werden
konnte. Die Sequenzen bestimmter Promotoren können die Replikation der rekombinanten
HVT- oder MDV-Vektoren hemmen (D. R. Marshall et al., J. Vir. Meth.
1992, 40, 195–204,
und Virology 1993, 195, 638–648).
Unter den angeführten
Promotoren hat eine gewisse Anzahl, wie zum Beispiel SV40, LTR RSV
und PRV gX, ebenso wie gewisse Promotoren, die bestimmten Genen
des Marek-Virus
zu eigen sind, insbesondere des Serotyps 3, eine gewisse Wirksamkeit
gezeigt.
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Die Erfindung erlaubt das Bereitstellen
eines rekombinanten Lebendimpfstoffs auf der Grundlage eines HVT-Vektors,
in den mindestens eine Sequenz inseriert ist, die für ein Vogelimmunogen,
insbesondere das Protein VP2 des IBDV kodiert. Ein derartiger Impfstoff,
der eine für
VP2 kodierende Sequenz umfaßt,
stellt einen zufriedenstellenden Schutz der Tiere gegen die Gumboro-Krankheit,
nämlich
einen Schutz gegenüber
der Sterblichkeit und Läsionen
der Bursa fabricius dar.
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Die vorliegende Erfindung hat einen
rekombinanten Vogellebendimpfstoff zum Gegenstand, der als Vektor
ein Vogelherpesvirus umfaßt,
das mindestens eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für ein antigenes Polypeptid
eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert und dieses exprimiert
und die in das Restriktionsfragment BamHI I des HVT, insbesondere
unter der Kontrolle des Immediate-early-Promotors des CMV inseriert ist.
Das Fragment BamHI I des HVT ist von A. E. Buckmaster in J. Gen.
Virol. 1988, 69, 2033–2042
vorgestellt worden. Diese Geninterzonen entsprechen bezogen auf
den Stamm HVT, insbesondere auf den, dem die Nukleotidsequenz der 1 entspricht, den Nukleotiden
der 1 1213 bis 1383
für das
Intergen 1, 1942 bis 2283 für
das Intergen 2 und 3082 bis 3569 für das Intergen 3.
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Unter einer Insertion in die Insertionsregion
versteht man insbesondere eine Insertion ohne eine Deletion oder
mit einer Deletion einiger Basen für die Geninterzonen.
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Unter dem Immediate-early-Promotor
(IE) CMV versteht man sowohl das in den Beispielen angegebene Fragment
als auch seine Unterfragmente, die dieselbe Promotoraktivität bewahrt
haben.
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Der Promotor CMV IE kann der humane
Promotor (HCMV IE) oder der murine Promotor (MCMV IE) oder auch
ein Promotor CMV IE anderer Herkunft sein, zum Beispiel aus der
Ratte oder dem Meerschweinchen.
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Die zum Exprimieren in den Marek-Vektor
inserierte Nukleotidsequenz kann jede Sequenz eines pathogenen Agens
aus einem Vogel sein, die für
ein antigenes Polypeptid kodiert, und die in der Lage ist, wenn sie
einmal unter den von der Erfindung bereitgestellten Bedingungen
exprimiert ist, eine Immunisierung sicherzustellen, die zu einem
wirksamen Schutz des geimpften Tiers gegen das pathogene Agens führt. Man
kann somit unter den Bedingungen der Erfindung die für die interessierenden
Antigene für
eine vorgegebene Krankheit kodierenden Nukleotidsequenzen inserieren.
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Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können zur
Impfung in ovo 1 Tag alter oder älterer
Küken oder
von Ausgewachsenen verwendet werden.
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Die Erfindung kann insbesondere zur
Insertion einer Nukleotidsequenz benützt werden, die zweckdienlicherweise
für das
Polypeptid VP2 des IBDV-Virus kodiert. Man erhält auf diese Weise einen rekombinanten
Lebendimpfstoff, der außer
einem Schutz gegen die Marek-Krankheit einen zufriedenstellenden
Schutz gegen die Gumboro-Krankheit sicherstellt. Falls gewünscht, kann
man auch eine Sequenz inserieren, die für ein anderes IBDV-Antigen
wie etwa VP3 oder auch das Polyprotein VP2 + VP4 + VP3 kodiert,
wobei diese anderen Möglichkeiten
nicht bevorzugt sind.
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Der rekombinante Impfstoff gegen
die Gumboro-Krankheit liegt vorzugsweise zu 10 bis 104 pfu/Dosis vor.
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Andere bevorzugte Fälle der
Erfindung sind die Insertion von Nukleotidsequenzen, die für die Antigene des
Virus der Marek-Krankheit, insbesondere die Gene gB, gC, gD und
gH + gL (WO-A-90 02803), des Virus der Newcastle-Krankheit, insbesondere
die Gene F und NH, des Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), insbesondere
die Gene S und M (M. Binns et al., J. Gen. Virol. 1985, 66, 719–726; M.
Boursnell et al., Virus Research 1984, 1, 303–313), des Virus der Vogelanämie (CAV),
insbesondere VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N. H. M. Noteborn et al.,
J. Virol., 1991, 65, 3131–3139)
und des Virus der infektiösen
Laryngotracheitis (ILTV), insbesondere gB (WO-A-90 02802), gC, gD
und gH + gL kodieren.
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Die Dosen sind vorzugsweise dieselben
wie die für
den Gumboro-Impfstoff.
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Gemäß einer vorteilhaften Entwicklung
der Erfindung verbindet man mit dem Promotor CMV IE einen weiteren
Promotor in der Weise, daß die
Promotoren den entgegengesetzten Transkriptions-Sense aufweisen, was
es gestattet, in die Insertionszone zwei Nukleotidsequenzen, die
eine in Abhängigkeit
vom Promotor CMV IE, die andere in der des verbundenen Promotors
zu inserieren. Diese Konstruktion ist durch die Tatsache bemerkenswert,
daß die
Anwesenheit des Promotors CMV IE, und insbesondere seines aktivierenden
Teils (Verstärker),
die durch den verbundenen Promotor induzierte Transkription aktiviert.
Ein bevorzugter verbundener Promotor ist der Promotor Marek RNA
1.8, dessen Transkriptionsaktivität unter diesen Bedingungen
ungefähr das
4,4fache ist.
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Ein interessanter Fall der Erfindung
ist ein Impfstoff, der eine Nukleotidsequenz, die unter der Kontrolle des
CMV IE für
das VP2 des IBDV kodiert, und eine Nukleotidsequenz umfaßt, die
für ein
Antigen einer anderen Vogelkrankheit, insbesondere die weiter oben
angeführten
unter der Kontrolle des anderen Promotors kodiert.
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Man kann auch zwei Promotoren CMV
IE unterschiedlicher Herkunft in Kopf-Schwanz-Anordnung zusammenstellen.
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Der Promotor RNA 1.8 kann auch allein
anstelle des Promotors CMV IE, insbesondere für Impfstoffe gegen die Marek-Krankheit,
die Newcastle-Krankheit, die infektiöse Laryngotracheitis, die infektiöse Bronchitis und
die Vogelanämie
verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung hat auch
eine Formulierung eines multivalenten Impfstoffs zum Gegenstand,
die im Gemisch oder zum Mischen mindestens zwei rekombinante Vogellebendimpfstoffe
wie sie weiter oben definiert sind umfaßt, wobei diese Impfstoffe
unterschiedliche inserierte Sequenzen, insbesondere unterschiedliche
Pathogene umfassen.
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Die vorliegende Erfindung hat auch
ein Verfahren zur Impfung von Vögeln
zum Gegenstand, das die Verabfolgung eines wie weiter oben definierten
rekombinanten Lebendimpfstoffs oder einer Formulierung eines multivalenten
Impfstoffs umfaßt.
Sie hat insbesondere ein Verfahren zur Impfung in ovo 1 Tag alter
oder älterer
Küken oder
von Ausgewachsenen zum Gegenstand.
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Die Erfindung wird nun mit Hilfe
der nicht begrenzendon Ausführungsbeispiele
genauer beschrieben, wobei auf die Zeichnungen Bezug genommen wird,
worin:
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Aufstellung der Zeichnungen
und der Sequenzen für
die Konstruktionen in den intergenen Stellen
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1:
Sequenz des Fragments NVT BamHI I
-
2:
Plasmid pEL039
-
3:
Plasmid pEL077
-
4:
Plasmid pEL079
-
5:
Plasmid pEL076
-
6:
Plasmid pEL078
-
7:
Plasmid pEL054
-
8:
Plasmid pEL055
-
9:
Plasmid pEL062
-
10:
Plasmid pEL066
-
11:
Plasmid pEL022
-
12:
Plasmid pEL023
-
13:
Plasmid pEL024
-
14:
Plasmid pCMVβ
-
15:
Plasmid pEL026
-
16:
Plasmid pEL090
-
17:
Plasmid pCD002
-
18:
Plasmid pCD009
-
19:
Plasmid pEL068
-
20:
Plasmid pEL070
-
21:
Plasmid pEL091
-
22:
Plasmid pCD011
-
23:
Plasmid pCD020
-
24:
Plasmid pEL092
-
25:
Sequenz des Gens NDV HN
-
26:
Plasmid pEL028
-
27:
Plasmid pEL029bis
-
28:
Plasmid pEL030
-
29:
Plasmid pEL032
-
30:
Plasmid pEL093
-
31:
Plasmid pEL033
-
32:
Plasmid pEL034
-
33:
Plasmid pEL094
-
34:
Sequenz des Promotors MDV RNA 1.8 kbp
-
35:
Plasmid pBS002
-
36 :
Plasmid pEL069
-
37:
Plasmid pEL080
-
38:
Plasmid pEL081
-
39:
Plasmid pEL095
-
40:
Plasmid pEL098
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Aufstellung der Sequenzen
SEQ ID für
die Konstruktionen in den intergenen Stellen
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SEQ ID N° 1 Sequenz des Fragments HVT
BamHI I
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SEQ ID N° 2 Oligonukleotid EL102
-
SEQ ID N° 3 Oligonukleotid EL161
-
SEQ ID N° 4 Oligonukleotid EL147
-
SEQ ID N° 5 Oligonukleotid EL162
-
SEQ ID N° 6 Oligonukleotid EL154
-
SEQ ID N° 7 Oligonukleotid EL163
-
SEQ ID N° 8 Oligonukleotid EL164
-
SEQ ID N° 9 Oligonukleotid EL165
-
SEQ ID N° 10 Oligonukleotid EL132
-
SEQ ID N° 11 Oligonukleotid EL133
-
SEQ ID N° 12 Oligonukleotid MB070
-
SEQ ID N° 13 Oligonukleotid MB071
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SEQ ID N° 14 Oligonukleotid CD001
-
SEQ ID N° 15 Oligonukleotid CD002
-
SEQ ID N° 16 Oligonukleotid CD003
-
SEQ ID N° 17 Oligonukleotid CD004
-
SEQ ID N° 18 Sequenz des Gens NDV HN
-
SEQ ID N° 19 Oligonukleotid EL071
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SEQ ID N° 20 Oligonukleotid EL073
-
SEQ ID N° 21 Oligonukleotid EL074
-
SEQ ID N° 22 Oligonukleotid EL075
-
SEQ ID N° 23 Oligonukleotid EL076
-
SEQ ID N° 24 Oligonukleotid EL077
-
SEQ ID N° 25 Sequenz des Promotors MDV
RNA 1.8 kbp
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SEQ ID N° 26 Oligonukleotid MB047
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SEQ ID N° 27 Oligonukleotid MB048
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SEQ ID N° 28 Oligonukleotid MB072
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2. Beispiele
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Alle Plasmidkonstruktionen wurden
durch Verwenden der von Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory. New
York. 1989) beschriebenen Standardtechniken der Molekularbiologie
ausgeführt.
Alle in der vorliegenden Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente
wurden unter Verwenden des Kits „Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA) isoliert.
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Das als Elternvirus verwendete Virus
ist der Stamm FC126 des Putenherpesvirus (HVT), der von Dr. Witter
vom Regional Poultry Research Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan)
aus einer Herde 23 Wochen alter Puten isoliert wurde (Witter R.
L. et al., Am. J. Vet. Res. 1970, 31, 525–538). Die Kulturbedingungen dieses Virus
sind die an anderer Stelle beschriebenen (französische Patentanmeldung 90 03105).
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Beispiel 1: Extraktion
der DNA des Virus der Marek-Krankheit
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Das Gesamtblut eines 7 Tage alten
Versuchshühnchens
mit dem Stamm MDV RB1B wird mit einer Spritze über einem Antikoagulans (Heparinlösung mit
100 IE/ml) 14 Tage nach der Infektion isoliert. Dieses Blut wird
anschließend
15 Minuten bei 30 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Plasma
sowie der „buffy coat" werden entnommen
und in steriler PBS verdünnt,
um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Nach 15 Minuten Zentrifugieren
bei 150 g wird das Zellpellet in 2 ml Kulturmedium 199 (Gibco-BRL
Cat# 042-01183M), das 2% fetales Kälberserum enthält (SVF),
erneut suspendiert.
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Die gesamte DNA der infizierten Lymphozyten
wird anschließend
gemäß der von
R. Morgan et al. (Avian Diseases, 1990, 34, 345–351) beschriebenen Technik
extrahiert und kann direkt als Matrize für die PCR-Versuche dienen.
Zur Klonierung der Genomfragmente des MDV-Virus wurde der Stamm
RB1B auf CEP kultiviert und die Virus-DNA wurde aus den gereinigten
Virusteilchen wie von Lee Y. et al. (J. Gen. Virol. 1980, 51, 245–253) beschrieben
hergestellt.
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Beispiel 2: Herstellung
der Genom-DNA des MCMV-Virus (Mouse Cyto-MegaloVirus)
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Der MCMV-Virusstamm Smith wurde von
der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC
Nr. VR-194) erhalten. Dieses Virus wurde auf Embryonenzellen der
Maus Balb/C kultiviert und die Virus-DNA dieses Virus wurde wie
bei Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983, 47, 421–433) beschrieben hergestellt.
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Beispiel 3: Herstellung
der Genom-DNA des HVT-Virus für
die Transfektionsversuche:
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Die zu den Transfektionsversuchen
verwendete Virus-DNA wurde gemäß der von
R. Morgan et al. (Avian Diseases, 1990, 34, 345–351) beschriebenen Technik
aus einer mit dem Stamm FC126 des NVT-Virus infizierten sekundären CEP-Kultur
(CEP II) hergestellt.
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Beispiel 4: Beschreibung
des Fragments BamHI I
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Das Fragment BamHI I mit 5,8 kbp
des HVT-Virusstamms FC126 (Igarashi et al., J. Gen. Virol., 1989, 70,
1789–1804)
wurde durch Geneclean isoliert und in die BamHI-Stelle des Vektors
pBS-SK+ kloniert, um das Plasmid pEL037 zu ergeben. Die Sequenz
dieses Fragments wurde in Gänze
aufgestellt (5838 bp) (1 und SEQ
ID Nr. 1). 6 offene Leserahmen (= „open reading frames = ORF") wurden auf dieser
Sequenz identifiziert. Die Untersuchung der möglicherweise durch diese ORF
kodierten Proteine hat gezeigt, daß gewisse Proteine davon eine
Homologie mit Proteinen zeigen, die durch ORF kodiert werden, die
bei anderen alpha-Herpesviren vorhanden
sind. Der erste ORF (ORF1) (Position 676 bis Position 1209 auf der
SEQ ID N° 1)
zeigt eine Homologie mit den ORF HSV-1 UL55, EHV– 1 Gen 4 und VZV Gen 5 und
kodiert für
ein theoretisches HVT-Protein UL55 aus 178 Aminosäuren (aa).
Der ORF2 befindet sich an Position 1941 bis Position 1387 auf der
SEQ ID N° 1
und kodiert für
ein Protein aus 185 aa , das zu dem durch den ORF3 EHV-1 Gen 3 kodierten
Protein homolog ist. Der ORF3 ist unvollständig. Er befindet sich an Position
5838 bis 3573 auf der SEQ ID N° 1
und er zeigt eine Homologie mit dem ORF 21 des MDV (Ross N. et al.,
Virus Genes, 1993, 7, 33–51).
Drei andere auf dieser Sequenz identifizierte ORF: ORF4 (Position
1403 bis Position 1957 (Protein aus 185 aa)), ORF5 (Position 3081
bis Position 2287 (Protein aus 265 aa)) und ORF6 (unvollständig; Position
479 bis Position 1) besitzen keine Homologie bei den Sequenzbanken.
Der Genomaufbau des Fragments BamHI I des HVT-Virusstamms FC126
ist derart, daß es
3 intergene Regionen gibt, die als Insertionsstellen für die Expressionskassetten
von Fremdgenen verwendet werden können:
eine intergene Region
(intergene Region 1) besteht zwischen dem ORF1 und dem ORF2. Eine
zweite intergene Region (intergene Region 2) besteht zwischen dem
ORF2 und dem ORF5. Eine dritte intergene Region (intergene Region
3) besteht zwischen dem ORF5 und dem ORF3 HVT. Diese drei Regionen
sind zum Inserieren von Expressionskassetten verwendbar, ohne die
In-vivo-Replikation der so erhaltenen rekombinanten Virus-HVT zu
beeinflussen. Beispiele von Donor-Plasmidkonstrukten für die intergenen Regionen 1,
2 und 3 werden nachstehend beschrieben:
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Beispiel 5: Konstruktion
des Donor-Plasmids für
die intergene Region 1
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Das Plasmid pEL037 wurde durch BamHI
und EcoRI verdaut; um die Fragmente BamHI-EcoRI mit 2672 bp und
2163 bp zu isolieren. Diese Fragmente wurden mit dem Vektor pBS-SK+
ligiert, der zuvor durch BamHI und EcoRI verdaut worden war, um
die Plasmide pEL039 mit 5167 bp beziehungsweise pEL040 mit 6104
bp zu ergeben. Das Plasmid pEL039 (
2)
wurde durch BamHI und PstI verdaut, um das Fragment BamHI-PstI mit
997 bp (Fragment A) zu ergeben. Eine PCR wurde mit den folgenden
Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 zum Erzeugen eines Fragments mit 420 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch PstI und SalI verdaut, um ein Fragment PstI-SalI
mit 250 bp (Fragment B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden
zusammen mit dem Vektor pBSII-SK+ (Stratagene) ligiert, der zuvor
durch BamHI und SalI verdaut worden war, um das Plasmid pEL077 mit
4160 bp zu ergeben (
3).
Das Plasmid pEL039 wurde durch BastBI und ScaI verdaut, um ein Fragment
BstBI-ScaI (freies Ende) mit 475 bp (Fragment C) zu isolieren. Eine
PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 durchgeführt,
um ein PCR-Fragment mit 715 bp zu erzeugen. Dieses Fragment wurde durch
BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 465 bp (Fragment
D) zu isolieren. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit dem zuvor
durch ApaI verdauten Plasmid pEL077 ligiert, mit Klenow-Polymerase
wiederhergestellt und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL079
mit 5082 bp (
4) zu ergeben. Dieses
Plasmid enthält
einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI an der intergenen Stelle 1.
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Beispiel 6: Konstruktion
des Donor-Plasmids für
die intergene Region 2
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Das Plasmid pEL039 (Beispiel 5) wurde
durch BstBI und PstI verdaut, um das Fragment BstBI-PstI mit 715
bp (Fragment A) zu isolieren. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrix pEL039 durchgeführt,
um ein PCR-Fragment mit 500 bp herzustellen. Dieses Fragment wurde durch
BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 430 bp (Fragment
B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor
pBSII-SK+ ligiert, der zuvor durch PstI und SalI verdaut worden war,
um das Plasmid pEL076 mit 4081 bp (
5 zu
ergeben).
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Eine weitere PCR wurde mit den folgenden
Oligonukleotiden:
und der
Matrize pEL039 zum Herstellen eines PCR-Fragments mit 565 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch SalI und SspI verdaut, um das Fragment SalI-SspI
mit 535 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pEL076
ligiert, das zuvor durch ApaI verdaut worden war, mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt
und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL078 mit 4598 bp (
6) zu ergeben. Dieses Plasmid
enthält
einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI
in der intergenen Region 2.
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Beispiel 7: Konstruktion
des Donor-Plasmids für
die intergene Region 3
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Das Plasmid pEL040 (siehe Beispiel
5) wurde durch NcoI und SphI unter Isolieren des Fragments NcoI-SphI
mit 1468 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUC BM20
(Boehringer Mannheim Cat# 1219235) ligiert, das zuvor durch NcoI
und SphI verdaut worden war, um das Plasmid pEL054 mit 4182 bp (
7) zu ergeben. Das Plasmid
pEL040 wurde mit EcoRI und SphI verdaut, um das Fragment EcoRI-SphI mit
614 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUC BM20,
das zuvor durch EcoRI und SphI verdaut worden war, unter Ergeben
des Plasmids pEL055 mit 3263 bp (
8)
ligiert. Das Plasmid pEL055 wurde mit EcoRI verdaut, mit Klenow-Polymerase
wiederhergestellt, mit sich selbst ligiert, durch HindIII verdaut,
mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt und schließlich mit
sich selbst unter Ergeben des Plasmids pEL062 mit 3279 bp (
9) ligiert. Das Plasmid
pEL054 wurde durch NcoI und SalI verdaut, um das Fragment NcoI-SalI
mit 1492 bp (Fragment A) zu isolieren. Die beiden folgenden Oligonukleotide:
wurden
untereinander hybridisiert, um das Fragment SalI-SphI mit 24 bp
(Fragment B) zu erzeugen. Die Fragmente A und B wurden zusammen
mit dem Plasmid pEL062, das zuvor durch NcoI und SphI verdaut worden war,
unter Ergeben des Plasmids pEL066 mit 4787 bp (
10) ligiert. Dieses Plasmid enthielt
einen Polylinker EcoRI-HindIII-SalI in der intergenen Region 3.
-
Beispiel 8: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL090 und Isolierung von vHVT16
-
Das Plasmid pEL004 (= in. der französischen
Patentanmeldung 92.13108 beschriebenes Plasmid pGH004), das das
IBDV-VP2-Gen in Form einer BamHI-HindIII-Kassette
enthält,
wurde durch BamHI und XbaI verdaut, um das Fragment BamHI-XbaI (verkürztes VP2-Gen)
mit 1104 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK+
kloniert, der zuvor mit XbaI und BamHI verdaut worden war, um das
Plasmid pEL022 mit 4052 bp (11)
zu ergeben. Der Vektor pBS-SK+ wurde durch EcoRV und XbaI verdaut,
dann mit sich selbst unter Ergeben von pBS-SK* (modifiziert) ligiert.
Das Plasmid pEL004 wurde durch KpnI und HindIII unter Isolieren
des Fragments KpnI-HindIII mit 1387 bp verdaut, das das vollständige IBDV-VP2-Gen
enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK* kloniert,
der zuvor durch KpnI und HindIII verdaut worden war, um das Plasmid
pEL023 mit 4292 bp (12)
zu ergeben. Das Plasmid pEL022 wurde durch BamHI und NotI unter
Isolieren des Fragments BamHI-NotI mit 1122 bp (Fragment A) verdaut.
Das Plasmid pEL023 wurde durch BamHI und NotI unter Isolieren des
Fragments BamHI-NotI mit 333 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente
A und B wurden zusammen mit dem Vektor pBS-SK+, der zuvor durch
NotI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war,
unter Ergeben des Plasmids pEL024 mit 4369 bp (23) ligiert. Das Plasmid pEL024 wurde
durch NotI unter Isolieren des Fragments NotI-NotI mit 1445 bp verdaut.
Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pCMVß (Clontech Cat# 6177-1) (14), das zuvor durch NotI verdaut worden war,
unter ergeben des Plasmids pEL026 mit 5095 bp (15) ligiert. Das Plasmid pEL026 wurde
durch EcoRI, SalI und XmnI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI
mit 2428 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pEL079
(siehe Beispiel 5), das zuvor durch EcoRI und SalI verdaut worden
war, unter Ergeben des Plasmids pEL090 mit 7514 bp (16) ligiert. Dieses Plasmid gestattet
die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/IBDV VP2 in die intergene
Stelle 1 des HVT-Virus.
-
24 Stunden alte primäre CEP-Zellen
wurden anschließend
mit dem folgenden Gemisch transfiziert: 1 μg linearisiertes Plasmid pEL090
+ 5 μg HVT-Virus-DNA
in 300 μl
OptiMEM-Medium (Gibco BRL Cat# 041-01985H) und 100 μg in 300 μl Medium
verdünntes
LipofectAMINE (Endvolumen des Gemisches = 600 μl). Diese 600 μl wurden
anschließend
in 3 ml (Endvolumen) Medium verdünnt
und auf 3.106 CEP I ausgestrichen. Man beließ das Gemisch
5 Stunden in Kontakt mit den Zellen, entfernte und ersetzte es dann
durch 5 ml Kulturmedium. Man ließ die Zellen darauf 3 Stunden
bei +37°C
kultivieren, dann wurden sie mit Pronase behandelt, mit frischen
CEP II gemischt (3 : 1-Gemisch) und auf 1 Platte mit 96 Näpfchen ausgestrichen.
Man ließ diese
Platte 3 Tage kultivieren, dann wurden die Zellen mit Pronase behandelt,
mit frischen CEP II gemischt und auf 2 Platten mit 96 Näpfchen ausgestrichen,
wobei ein Anfangsnäpfchen
zwei Schwesternäpfchen
ergibt. Die Platten mit 96 Näpfchen
wurden bis zum Auftreten eines zytopathischen Effekts kultiviert.
Nach 72 Stunden Kultur wurde eine der beiden Platten mit 96 Näpfchen 30
Minuten mit 95%igem Aceton fixiert und es wurde eine indirekte Immunfluoreszenzreaktion
(IFI) mit einem monoklonalen Anti-VPS-Antikörper durchgeführt, um nach
das Protein VP2 exprimierenden Plaques zu suchen. Die „Schwester"-Näpfchen der
bei der IFI positive Plaques aufweisenden Näpfchen wurden mit Pronase behandelt,
mit frischen CEP II gemischt und in Grenzverdünnung auf Platten mit 96 Näpfchen aufgebracht.
Nach 3 Tagen Kultur wurden die eine zytopathische Wirkung aufweisenden
Näpfchen
mit Pronase behandelt, mit CEP II gemischt und erneut auf Platten
mit 96 Näpfchen
ausgestrichen, wobei ein Anfangsnäpfchen 2 Schwesternäpfchen ergab.
3 Tage danach wurde nach den Protein VP2 exprimierenden Plaques
von neuem wie voranstehend durch IFI auf einer der 2 Schwesterplatten durchmustert.
-
Im allgemeinen reichen 4 aufeinanderfolgende
Isolierzyklen (Ernten eines Näpfchens,
Ausstreichen, Kontrolle durch IFI, Umsetzen eines Schwesternäpfchens
...) zum Erhalten rekombinanter Viren aus, deren gesamte Nachkommenschaft
eine spezifische Fluoreszenz zeigt. Ein Virusplaque, der bei der
IFI mit einem monoklonalen Anti-VP2-Antikörper 100% positive Plaques
ergeben hatte, wurde vHVT16 genannt. Die Genom-DNA dieses rekombinanten
Virus wurde auf molekularer Ebene durch klassische PCR-Techniken
und Southern Blot unter Verwenden geeigneter Oligonukleotide und
DNA-Sonden charakterisiert.
-
Beispiel 9: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL091 und Isolierung von vHVT17
-
Das Plasmid pCMVβ (14)
wurde durch SalI und SmaI unter Isolieren des Fragments SalI-SmaI mit
3679 bp verdaut, das sowohl das Gen lacZ als auch das Polyadenylierungssignal
des späten
Gens des SV40-Virus enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor
pBS-SK+, der zuvor durch SalI und EcoRV verdaut worden war, unter
Ergeben des Plasmids pCD002 mit 6625 bp (17) ligiert. Dieses Plasmid enthält das Reportergen
lacZ, es befindet sich jedoch kein Promotor stromaufwärts dieses
Gens. Die Virusgenom-DNA des MCMV-Virus wurde wie in Beispiel 2
beschrieben hergestellt und durch PstI unter Isolieren des Fragments
PstI-PstI mit 2285 bp verdaut. Dieses Fragment wurde in den Vektor
pBS-SK+, der zuvor
durch PstI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden
war, unter Ergeben des Plasmids pCD004 kloniert. Das Plasmid pCD004
wurde durch HpaI und PstI unter Isolieren des Fragments HpaI-PstI
mit 1389 bp verdaut, das die Promotor-/Aktivatorregion des Immediate-early-Gens
des murinen Cytomegalovirus (Murine CytoMegaloVirus = MCMV) enthielt
(Dorsch-Häsler
K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82, 8325–8329, und Patentanmeldung WO-A-87/03905). Dieses
Fragment wurde in das zuvor durch PstI und SmaI verdaute Plasmid
pCD002 unter Ergeben des Plasmids pCD009 mit 8007 bp (18) kloniert.
-
Ein doppelsträngiges Oligonukleotid wurde
durch Hybridisierung der beiden folgenden Oligonukleotide erhalten:
-
-
Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wurde
in den zuvor durch KpnI und SacI verdauten Vektor pBS-SK+ unter
Ergeben des Plasmids pEL067 ligiert. Das Plasmid pCD009 wurde durch
PstI und SpeI unter Isolieren des Fragments PstI-SpeI mit 1396 bp
verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor mit PstI und SpeI verdauten
Plasmid pEL067 unter Ergeben des Plasmids pEL068 (19) ligiert. Das Plasmid pEL026 (siehe
Beispiel 8) wurde durch HindIII und SalI unter Isolieren des Fragments
HindIII-SalI mit 235 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und
B wurden zusammen mit dem zuvor durch NotI und SalI verdauten Plasmid pEL068
unter Ergeben des Plasmids pEL070 mit 5908 bp (20) ligiert. Das Plasmid pEL070 wurde
durch EcoRI, SalI und XmnI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI
mit 3035 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI
und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben
des Plasmids pEL091 mit 8109 bp (21)
ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette MCMV-IE/IBDV
VP2 in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
-
Eine wie in Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL091 und der Genom-DNA des HVT-Virus
führte
zur Isolierung und Reinigung von rekombinantem vHVT17.
-
Beispiel 10: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL092 und Isolierung von vHVT18
-
Das Fragment EcoRI-SalI mit 3,9 kbp
der Genom-DNA des MDV-Virusstamms RB1B, der das MDV-Gen gB enthält (Sequenz
von Ross N. et al., ). Gen. Virol. 1989, 70, 1789–1804, veröffentlicht),
wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Vektor pUC13
unter Ergeben des Plasmids pCD007 ligiert. Dieses Plasmid wurde
mit SacI und XhoI unter Isolieren des Fragments SacI-XhoI mit 2260
bp (zentraler Teil des Gens gB = Fragment A). Eine PCR wurde mit
den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 222 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch KpnI und XbaI unter Isolieren eines Fragments
KpnI-XbaI mit 190 bp (Extremität
5' des Gens gB =
Fragment B) verdaut. Eine weitere PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 195 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch SacI und SacII unter Isolieren des Fragments
SacI-SacII mit 162 bp (Extremität
3' des Gens gB =
Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und C wurden zusammen mit
dem zuvor durch KpnI und SacI verdauten Vektor pBS-SK+ unter Ergeben
des Plasmids pCD011 mit 5485 bp (
22)
ligiert. Das Plasmid pCD011 wurde durch NotI unter Isolieren des
Fragments NotI-NotI mit 2608 bp (gesamtes MDV-gB-Gen) verdaut. Dieses
Fragment wurde mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer
Phosphatase behandelten Plasmid pCMVβ unter Ergeben des Plasmids
pCD020 mit 6299 bp (
23)
verdaut. (In diesem Plasmid ist das MDV-gB-Gen durch das lacZ-Gen
ersetzt.) Das Plasmid pCD020 wurde durch EcoRI und SalI unter Isolieren
des Fragments EcoRI-SalI mit 3648 bp verdaut. Dieses Fragment wurde
mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe
Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL092 mit 8718 bp (
24) ligiert. Dieses Plasmid
gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/MDV-gB in
die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine wie in Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL092 und der Genom-DNA des HVT-Virus
führte
zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT18.
-
Beispiel 11: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEfL093 und Isolierung von vHVT19
-
Der Aufbau einer komplementären DNA-Bank
des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV), Stamm Texas,
wurde wie von Taylor J. et al. (J. Virol., 1990, 64, 1441–1450) beschrieben
durchgeführt.
Ein das Ende des Fusionsgens (F), die Gesamtheit des Hämagglutinin-Neuraminidase-Gens
(HN) und den Anfang des Polymerasegens enthaltender pBR322-Klon
wurde als pHN01 identifiziert. Die Sequenz des auf diesem Klon vorhandenen
NDV-HN-Gens wird in
25 dargestellt
(SEQ ID N° 18).
Das Plasmid pHN01 wurde durch SphI und XbaI unter Isolieren des
Fragments SphI-XbaI mit 2520 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit
dem zuvor durch SphI und XbaI verdauten Vektor pUC19 unter Erge ben
des Plasmids pHN02 mit 5192 bp ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde
mit ClaI und PstI unter Isolieren des Fragments ClaI-PstI mit 700
bp (Fragment A) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden
und der
Matrize pHN02 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 270 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde mit HindIII und PstI unter Isolieren eines Fragments
HindIII-PstI mit 220 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und
B wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und HindIII verdauten
Vektor pBS-SK+ unter
Ergeben des Plasmids pEL028 mit 3872 bp (
26) ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde
durch BsphI und ClaI unter Isolieren des Fragments BsphI-ClaI mit
425 bp (Fragment C) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
und der
Matrize pHN02 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 425 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch BsphI und NotI unter Isolieren des Fragments
BsphI-NotI mit 390 bp (Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und
D wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und NotI verdauten Vektor
pBS-SK+ unter Ergeben
des Plasmids pEL029bis mit 3727 bp (
27)
verdaut. Das Plasmid pEL028 wurde durch ClaI und SacII unter Isolieren
des Fragments ClaI-SacII
mit 960 bp (Fragment E) verdaut. Das Plasmid pEL029bis wurde durch
ClaI und NotI unter Isolieren des Fragments ClaI-NotI mit 820 bp
(Fragment F) verdaut. Die Fragmente E und F wurden zusammen mit
dem zuvor durch NotI und SacII verdauten Vektor pBS-SK+ unter Ergeben
des Plasmids pEL030 mit 4745 bp (
28)
ligiert. Das Plasmid pEL030 wurde durch NotI unter Isolieren des
Fragments NotI-NotI mit 1780 bp (gesamtes NDV-HN-Gen) verdaut. Dieses
Fragment wurde anstelle des lacZ-Gens mit dem zuvor durch NotI verdauten
und mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pCMVβ unter Ergeben
des Plasmids pEL032 mit 5471 bp (
29)
ligiert. Das Plasmid pEL032 wurde durch EcoRI und ClaI unter Isolieren
des Fragments EcoRI-ClaI mit 1636 bp (Fragment G) verdaut. Das Plasmid
pEL032 wurde durch ClaI und SaII unter Isolieren des Fragments ClaI-SaII
mit 1182 bp (Fragment H) verdaut. Die Fragmente G und H wurden
zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SaII verdauten Plasmid pEL079
(siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL093 mit 7890 bp
(
30) ligiert. Dieses
Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV HN in die
intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
-
Eine wie in Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL093 und der Genom-DNA des HVT-Virus
führte
zur Isolierung und zur Reinigung von rekombinantem vHVT19.
-
Beispiel 12: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL094 und Isolierung von vHVT20
-
Ein aus der komplementären DNA-Bank
des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (siehe Beispiel 11) stammender
Klon, der das gesamte Fusionsgen (F) enthielt, wurde pNDV81 genannt.
Dieses Plasmid wurde früher
beschrieben und die Sequenz des bei diesem Klon vorhandenen NDV-F-Gens
wurde veröffentlicht
(Taylor J. et al., J. Virol., 1990, 64, 1441–1450). Das Plasmid pNDV81
wurde durch NarI und PstI unter Isolieren des Fragments NarI-PstI
mit 1870 bp (Fragment A) verdaut Eine PCR wurde mit den folgen Oligonukleotiden:
und der
Matrize pNDV81 unter Erzeugen eines Fragments mit 160 bp durchgeführt. Dieses
Fragment wurde durch PstI und SaII unter Isolieren des Fragments
PstI-SalI mit 130 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B
wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und SalI verdauten Vektor
pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pEL033 mit 4846 bp (
31) ligiert. Das Plasmid
pEL033 wurde durch NotI unter Isolieren des Fragments NotI-NotI
mit 1935 bp (gesamtes Gen F) verdaut. Dieses Fragment wurde mit
dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten
Plasmid pCMVß unter
Ergeben des Plasmids pEL034 mit 5624 bp (das lacZ-Gen wurde durch
das NDV-F-Gen ersetzt) ligiert (
32).
Das Plasmid pEL034 wurde durch EcoRI und KpnI unter Isolieren des
Fragments EcoRI-KpnI mit 866 bp (Fragment C) verdaut. Das Plasmid
pEL034 wurde durch KpnI und SalI unter Isolieren des Fragments KpnI-SalI mit 2114 bp
(Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit
dem zuvor durch EcoRI und SaII verdauten Plasmid pEL079 (siehe Bei spiel
5) unter Ergeben des Plasmids pEL094 mit 8043 bp (
33) ligiert. Das Plasmid erlaubt die
Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV F in die intergene
Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine wie im Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL094 und der Genom-DNA des HVT-Virus
führte
zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT20.
-
Beispiel 13: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL095 und Isolierung von vHVT21
-
Die stromaufwärts gelegenen Sequenzen des
MDV-RNA-Gens mit 1,8 kbp werden bei Bradley G. et al. (J. Virol.,
1989, 63, 2534–2542)
(34 und SEQ ID N° 25) beschrieben.
Eine PCR-Verstärkung
wurde ausgehend von einem DNA-Extrakt
von Lymphozyten, die aus mit dem Stamm MDV RB1B (siehe Beispiel
1) infizierten Hühnchen
gewonnen wurden, mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
-
-
Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment
mit 163 bp wurde durch EcoRI und SpeI verdaut und dann mit dem zuvor
durch EcoRI und SpeI verdauten Plasmid pCD002 (siehe Beispiel 9)
unter Ergeben des Plasmids pBS002 mit 6774 bp (35) ligiert. Das Plasmid pB5002 enthält den stromaufwärts des
lacZ-Gens klonierten Promotor des MDV-RNA-Gens mit 1,8 kb.
-
Eine PCR wurde mit den Oligonukleotiden
und der
Matrize pBS002 durchgeführt.
Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment wurde durch PstI und SpeI unter
Isolieren eines Fragments PstI-SpeI mit 200 bp verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem zuvor durch PstI und SpeI verdauten Plasmid pEL067
(siehe Beispiel 9) unter Ergeben des Plasmids pEL069 (
36) ligiert. Das Plasmid
pCD007 (siehe Beispiel 10) wurde durch EcoRI und XbaI unter Isolieren
des Fragments EcoRI-XbaI mit 2670 bp (Fragment A) ver daut. Das Plasmid
pCD011 (siehe Beispiel 10) wurde durch NotI und XbaI unter Isolieren
des Fragments NotI-XbaI mit 180 bp (Fragment) verdaut. Das Plasmid pEL069
wurde durch NotI und SpeI unter Isolieren des Fragments NotI-SpeI
mit 180 bp (Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und C wurden
zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SpeI verdauten Plasmid pEL067 (siehe
Beispiel 9) unter Ergeben des Plasmids pEL080 mit 5939 bp (
37) ligiert. Das Plasmid
pEL070 (siehe Beispiel 9) wurde durch KpnI und SpeI unter Isolieren
des Fragments KpnI-SpeI mit 1345 bp (Fragment D) verdaut. Das Plasmid
pEL070 wurde ebenfalls durch KpnI und SaII unter Isolieren des Fragments
KpnI-SalI mit 1658 bp (Fragment E) verdaut. Die Fragmente D und
E wurden zusammen mit dem zuvor durch SaII und SpeI verdauten Plasmid
pEL080 unter Ergeben des Plasmids pEL081 mit 8938 bp (
38) ligiert. Das Plasmid
pEL081 wurde durch EcoRI und SalI unter Isolieren des Fragments
EcoRI-SalI mit 6066 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor
durch EcoRI und SaII verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5)
unter Ergeben des Plasmids pEL095 mit 11139 bp (
39) ligiert. Dieses Plasmid gestattet
das Inserieren der Doppelexpressionskassette VP2/MCMV-IE//RNA 1,8
kbp/MDV gB in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
-
Eine wie im Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL095 und der Genom-DNA des HVT-Virus
führte
zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT21.
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Beispiel 14: Konstruktion
des Donor-Plasmids pEL098 und Isolierung von vHVT24
-
Das Plasmid pEL080 (siehe Beispiel
13) wurde durch EcoRI und SalI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI
mit 3040 bp (RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB) verdaut. Dieses Fragment
wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SaII verdauten Plasmid pEL079
(siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL098 mit 8140 bp
(40) ligiert. Dieses
Plasmid gestattet die Insertion der RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB
in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
-
Eine wie im Beispiel 8 beschrieben
durchgeführte
Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL098 und der Genom-DNA des NVT-Virus
führte
zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT24.
-
Beispiel 15: Konstruktion
von Donor-Plasmiden zur Insertion der Expressionskassetten IBV M
und S in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus
-
Nach derselben Strategie wie der
weiter oben zur Insertion von Expressionskassetten (unter die Kontrolle
der HCMV-IE- oder MCMV-IE-Promotoren oder des MCMV-IE/RNA-Doppelpromotors
1,8 kbp stehende Gene) in die intergene Stelle 1 ist es möglich, rekombinante
HVT-Viren herzustellen, die die Membran- (M) oder Spikeproteine
(S) des Virus der infektiösen
Vogelbronchitis (IBV) auf höherem
Niveau exprimieren. Man stellt bevorzugt ein Konstrukt, bei dem
das IBV-S-Gen unter der Abhängigkeit
des HCMV-IE-Promotors oder des MCMV-IE-Promotors steht, oder ein
Konstrukt her, bei dem die IBV-M- und IBV-S-Gene zusammen mit dem
MCMV-IE/RNA-Doppelpromotor 1,8 kbp in die intergene Stelle 1 inseriert
sind, wobei das M-Gen unter der Kontrolle des RNA-Promotors 1,8
kbp steht und das S-Gen unter der Kontrolle des MCMV-IE-Promotors steht.
In dieser Konfiguration wird der RNA-Promotor 1,8 kbp durch die
Aktivatorregion des MCMV-IE-Promotors
aktiviert.
-
Beispiel 16: Konstruktion
rekombinanter HVT-Viren, die in die intergenen Stellen 2 und 3 inserierte
Fremdgene umfassen
-
Der Erhalt rekombinanter HVT-Viren,
die in die intergenen Stellen 2 und 3 inserierte Expressionskassetten
von Fremdgenen aufweisen, erfolgt dadurch, daß man der für die Beispiele 8 bis 14 beschriebenen
Strategie folgt, aber die Plasmide pEL078 (intergene Stelle 2) beziehungsweise
pEL066 (intergene Stelle 3) anstelle des Plasmids pEL079 in den
Beispielen 8 bis 14 zum Aufbauen der speziellen Donor-Plasmide verwendet.
-
Beispiel 17: Herstellung
eines erfindungsgemäßen Impfstoffs:
-
Die Herstellung erfindungsgemäßer Impfstoffe
kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik, zum Beispiel durch
Rollflaschenkultur erfolgen. Rollflaschen (175 cm2),
in die 200.106 Primärzellen aus Hühnchenembryonen
eingesät
sind, werden nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C mit 1 ml einer Viruslösung von rekombinantem
HVT-Virus mit einem Gehalt von 105 pfu/ml
beimpft. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wird der Überstand entfernt, die Zellen
werden mit einer Trypsin/Versene-Lösung getrennt und dann isoliert.
Die infizierten Zellen werden darauf zentrifugiert. Der Überstand
wird entfernt und die Zellen werden durch 20 ml einer einen Stabilisator
zur Lyophilisierung (zum Beispiel SPGA: Saccharose, Phosphat, Glutamat,
Albumin) enthaltenden Lösung
wieder aufgenommen. Dieses Gemisch wird danach beschallt, in Gläschen zu
Fraktionen von 1 ml verteilt und schließlich lyophilisiert.
-
Nötigenfalls
kann der Impfstoff statt lyophilisiert auch aufgeteilt und eingefroren
werden.
-
Beispiel 18:
-
Ein erfindungsgemäß erhaltener rekombinanter
Virus, der das Protein VP2 des Virus der Gumboro-Krankheit exprimiert,
wurde zum Immunisieren 1 Tag alter Küken auf intramuskulärem Weg
verwendet. Diese Küken
wurden darauf im Alter von 21 Tagen dem Virus der Gumboro-Krankheit
ausgesetzt. Die Ergebnisse des Schutzes wurden 11 Tage nach dem
Aussetzen durch Vergleichen der Läsionen der Bursa fabricius
und der Sterblichkeit zwischen den Impfgruppen und der nicht geimpften
Kontrollgruppe bewertet. Die Ergebnisse dieses Impfungs-/Aussetzungsverfahrens
haben gezeigt, daß der
gemäß der Erfindung
erhaltene Impfstoff den Erhalt eines guten Schutzniveaus gestattet.