DE69735001T2

DE69735001T2 - Antigenprotein aus infektiöse laryngotracheitis viren

Info

Publication number: DE69735001T2
Application number: DE69735001T
Authority: DE
Inventors: Yoshinari Kawasaki-shi TSUZAKI; Takashi Kawasaki-shi OKUDA
Original assignee: Zeon Corp
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2017-08-22
Also published as: EP0953642B1; EP0953642A4; WO1998007866A1; AU3867897A; US6312696B1; EP0953642A1; JP3636368B2; DE69735001D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Antigenprotein, das aus einem infektiösen Laryngotracheitisvirus stammt, sein Gen, ein dieses Gen umfassendes rekombinantes Gen und einen Impfstoff für infektiöse Laryngotracheitis, der das rekombinante Gen oder das Antigenprotein als aktiven Bestandteil aufweist.
Stand der Technik
Infektiöse Laryngotracheitis tritt aufgrund einer Infektion mit infektiösem Laryngotracheitisvirus (als ILTV abgekürzt) auf. ILTV infiziert Hühner, Fasanen, Pfauen, Truthähne und anderes Geflügel. Kennzeichen seines Auftretens bei Hühnern schließen Symptome der Atmungsorgane, Fieber, verringerten Appetit und so weiter ein. Es wird starker Husten und der Auswurf von Sputum beobachtet. Außerdem erniedrigt sich bei eierlegenden Hühnern das Maß, in dem Eier gelegt werden, etwa 4 Tage nach dem Ausbruch und es wird etwa 1 Monat benötigt, bis das Eierlegen wieder auf einen normalen Wert zurückkehrt. Weiterhin ist auch eine Zunahme der Sterberate aufgrund einer Mischinfektion mit anderen Pathogenen berichtet worden, wodurch auf diese Weise bei der Geflügelindustrie ein enormer wirtschaftlicher Verlust verursacht wird.
Getrocknete Lebendimpfstoffe und gefrorene Lebendimpfstoffe aus abgeschwächten Vakzinstämmen werden herkömmlicherweise zur Prophylaxe von infektiöser Laryngotracheitis verwendet. Ihre Immunwirkungen schwanken jedoch beträchtlich in Abhängigkeit von der Zuchtumgebung, Zuchtdichte, Impfverfahren und so weiter. Weiterhin verursacht das Impfen von Impfstoffen einige Symptome im Atmungssystem und es besteht ein Krankheitsrisiko, falls bei der Verabreichungsweise oder Impfmenge Fehler gemacht werden. Außerdem gibt es auch Berichte über den Ausbruch einer Krankheit aufgrund eines Wiedererlangens der Pathogenität bei den Impfstoffstämmen in gewissen geographischen Regionen, wodurch ein Bedarf nach der Entwicklung eines sicheren und wirkungsvollen Impfstoffs geschaffen wird.
ILTV ist ein Typ eines Herpesvirus. Sein Virusgenom setzt sich aus doppelsträngiger DNA mit ungefähr 160 000 Basenpaaren zusammen. Derzeit sind sehr wenige Gene identifiziert und die einzigen, die bekannt sind, sind das Thymidinkinasegen (Griffin et al., J. Gen. Virol., Bd. 71, S. 841, 1990), gp60-Gen (Kongsuwan et al., Virus Genes, Bd. 7, S. 297–303, 1993), Capsid-p40-Gen (Griffin, Nucl. Acids Res., Bd. 18, S. 3664, 1990), Glykoprotein-B-Gen (gB) (Poulsen et al., Virus Genes, Bd. 5, S. 335–347, 1991), Glykoprotein-C-Gen (Kingsley et al., Virology, Bd. 203, S. 336–343, 1994) und RR2-Gen (Griffin, J. Gen. Virol., Bd. 70, S. 3085–3089, 1989). Außerdem ist bekannt, daß zwischen jedem Herpesvirusstamm mehrere homologe Gene existieren. Zum Beispiel gibt es jeweils ein homologes Gen von gB im Herpes-simplex-Virus (HSV-1), Marek-Krankheit-Virus (MDV), Rinderherpesvirus (BHV), Pferdeherpesvirus (EHV), Cytomegalovirus (CMV) und so weiter. Obschon jedoch bei EHV auch über homologe Gene bezüglich des UL32-Gens aus HSV-1 berichtet wird (Whittaker et al., J. Gen. Virol., Bd. 73, S. 2933, 1992), gibt es bis jetzt keine bekannten homologen Gene für ILTV. Weiterhin ist die Verwendung dieser Gene als Impfstoffe ebenfalls nicht bekannt.
Offenbarung der Erfindung
Als Ergebnis ernsthafter Untersuchungen zum Erhalten eines Gens, das ein neues Antigenprotein von ILTV kodiert, fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Berücksichtigung der vorstehend angeführten Lehre ein zu dem UL32-Gen von HSV-1 homologes ILTV-Gen, was dadurch zum Abschluß der Erfindung führte.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein (als Polypeptid UL32h bezeichnetes) Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Homologie von wenigstens 80% Identität zu der in SEQ ID Nr. 2 beschriebenen Aminosäuresequenz hat und das die Immunogenität von infektiösem Laryngotracheitisvirus besitzt.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das die vorstehend angeführte DNA und die DNA-Sequenz, die für das gB-Gen des infektiösen Laryngotracheitisvirus kodiert, umfaßt.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der die DNA-Sequenz eines der vorstehend angeführten DNA-Moleküle umfaßt.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Virus mit einem der vorstehend angeführten DNA-Moleküle bereit.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen Lebendimpfstoff für infektiöses Laryn gotracheitisvirus bereit, der als aktiven Bestandteil das vorstehend angeführte rekombinante Virus besitzt.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen Impfstoff für infektiöses Laryngotracheitisvirus bereit, der als aktiven Bestandteil eines der vorstehend angeführten Polypeptide oder dessen pharmakologisch annehmbaren Träger besitzt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Restriktionsenzymspaltungskarte eines DNA-Fragments darstellt, das aus dem ILTV-Genom stammt.
2 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pGTPsILUL32 erläutert.
3 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ29R/ILUL32 für rekombinantes Geflügelpockenvirus erläutert.
4 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ29R/ILgBUL32 für rekombinantes Geflügelpockenvirus erläutert.
5 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNP35S/ILUL32gB für rekombinantes Geflügelpockenvirus erläutert.
6 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ76 erläutert.
7 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pGTPs erläutert.
8 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ98 erläutert.
9 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ6929Sfi erläutert.
10 ist eine Zeichnung, die das Konstruktionsverfahren des Plasmids pNZ1829R erläutert.
Ausführungsform zum Durchführen der Erfindung
DNA-Molekül
Das DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das ein Antigenpolypeptid mit der in SEQ ID Nr. 2 bezeichneten Aminosäuresequenz kodiert oder das, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine Homologie von wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90% und bevorzugter wenigstens 95% Identität mit diesem Gen aufweist, wovon die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 ein spezifisches Beispiel ist.
Eine in der vorliegenden Erfindung angeführte Homologie bezieht sich gänzlich darauf, was mittels der Sequenzdatenbanksoftware „DNASIS" (vertrieben durch Takara Shuzo, hergestellt durch Hitachi Software Engineering) unter Anwenden des Algorithmus von Lipman und Pearson (Science 227, 1435, 1985) berechnet wird.
Jeder Stamm kann zum Klonieren des DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung (UL32h-Gen) verwendet werden, wovon Beispiele den Stamm NS-175 (Stamm Nr. VA0204 aus dem Livestock Hygiene Strain Catalog, Animal Biological Preparation Association), Stamm CE (Sachida, Azabu Veterinary College Research Report, 31, S. 133–202, 1976), Stamm SA-2 (Johnson et al., Arch. Virol., Bd. 119, S. 181–198, 1991) und den Stamm 632 (Keeler et al., Avian Diseases, Bd. 35, S. 920–929, 1991) einschließen.
Das Gen, das das in SEQ ID Nr. 1 der vorliegenden Erfindung beschriebene Gen (UL32h-Gen) kodiert, ist zu dem UL32-Gen von HSV-1 homolog. Weiterhin befindet sich das UL32-Gen von HSV-1 auf der internen Wiederholungsseite ungefähr 15 Kbp von dem gB-Gen in der langen einzelnen Region und die Genkonfiguration zwischen Herpesvirusarten ist äußerst ähnlich (Roizman und Sears, Virology, zweite Ausgabe, Kapitel 65, 1795–1841, 1990). Auf dieser Grundlage wird vorhergesagt, daß sich das UL32h-Gen auch was das ILTV-Genom betrifft auf der internen Wiederholungsseite von dem gB-Gen aus befindet.
Aus den vorstehenden Gründen wurde zum Erhalten eines DNA-Fragments, das das UL32h-Gen von ILTV enthält, ein Gene-walking-Verfahren durch Herstellen der λGEM- 12-Bibliothek des Genoms des ILTV-Stamms NS-175, Selektieren eines Klons der mit dem gB-Gen von ILTV aus dieser Bibliothek hybridisiert und weiterem Selektieren eines Klons, der mit dem Fragment der internen Wiederholungsseite genomischer ILTV-DNA mit diesem Klon hybridisiert, ausgeführt, das vom Wiederholen dieses Verfahrens gefolgt wurde.
Die Sequenz des auf diese Weise erhaltenen Fragments genomischer ILTV-DNA wurde analysiert und die aus dieser Sequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz wurde mit der Aminosäuresequenz des U32-Polypeptids von HSV-1 verglichen. Als Ergebnis wurde ein offener Leserahmen erhalten, der ein zu der Aminosäuresequenz des UL32-Polypeptids von HSV-1 homologes Polypeptid kodiert. Das DNA-Fragment und die voraussichtliche Aminosäuresequenz werden in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Rekombinantes DNA-Molekül
Das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt das vorstehend angeführte DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel UL32h-Gen) und wenigstens einen Typ einer weiteren DNA-Sequenz, die durch Gentechnik ligiert wurde. Die hier erwähnte weitere DNA-Sequenz ist eine Sequenz, die nicht mit dem UL32h-Gen von ILTV in der Natur verbunden ist, wovon spezifische Beispiele ein Markergen wie etwa das lacZ-Gen, das gB-Gen von ILTV, das gI-Gen von MDV, das gE-Gen von MDV und andere Antigene einschließen. Außerdem kann jedes Verfahren zum Verknüpfen der weiteren DNA-Sequenz verwendet werden, vorausgesetzt sie hemmt die Expression jedes Gens nicht. Die weitere DNA-Sequenz sollte mittels DNA-Ligase gemäß Routineverfahren entweder direkt oder mittels einer Linkersequenz nach dem Verdauen mit einer geeigneten Restriktase verknüpft werden.
Rekombinanter Vektor
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der wenigstens das vorstehend angeführte DNA-Molekül oder rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthält und ist mit einem später zu beschreibenden Promotor oder Marker und so weiter inseriert.
Ein Vektor, der diese DNA-Moleküle rekombiniert, ist aus typischerweise verwendeten Plasmiden, Cosmiden und Phagen willkürlich ausgewählt. Die DNA-Moleküle sollten gemäß Routineverfahren durch Behandeln von Plasmiden wie etwa pBR322, pBR325, pUC7, pUC8, pUC18 oder pUC19, Phagen wie etwa λ-Phage oder M13-Phage oder Cosmiden wie etwa pHC79 mit einem geeigneten Restriktionsenzym inseriert werden. Außerdem wird im Fall des Verwendens dieses rekombinanten Vektors zum Herstellen eines rekombinanten Virus ein DNA-Molekül nach dem Rekombinieren einer nicht-essentiellen Region wie der später beschriebenen inseriert.
Rekombinantes Virus
Das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung enthält das vorstehend angeführte DNA-Molekül (zum Beispiel UL32h-Gen) oder rekombinantes DNA-Molekül als Antigen-Gen und wird durch Inserieren eines dieser DNA-Moleküle in eine Region konstruiert, die zur Vermehrung des Elternvirus gemäß Routineverfahren wie etwa homologer Rekombination nicht wesentlich ist.
Außerdem kann bei Bedarf zusätzlich zu DNA-Molekülen ein Promotor oder Markergen enthalten sein.
Elternvirus
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Elternvirus ist ein Virus, in das das DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung inseriert ist und es gibt keine besonderen Einschränkungen bei seinem Typ. Spezifische Beispiele derartiger Viren schließen das Vogelpockenvirus (APV) wie etwa Geflügelpockenvirus (FPV), Pferdepockenvirus, Truthahnpockenvirus, Taubenpockenvirus, Baculoviren wie etwa Autographa californica, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou, Galleria mellonella, Bombyx mori und Truthahnherpesvirus usw. ein. Viren, die Geflügel infizieren, sind zur Herstellung von Lebendimpfstoffen besonders günstig und Vogelpockenviren sind besonders günstig, wovon spezifische Beispiele ATCC VR-251, ATCC VR-250, ATCC VR-229, ATCC VR-249, ATCC VR-288, Nishigahara-Stamm, Shisui-Stamm, CEVA-Stamm, FPV im engeren Sinn wie etwa Viren, die aus CEVA-Impfstoffstämmen stammen, die beim Infizieren von CEF (Hühnerembryofibroblasten) eine große Plaque bilden und FPV ähnliche Viren im engeren Sinn einschließen, die als Hühnerpocken-Lebendimpfstoffe wie etwa Taubenpockenvirusstamm NP (hühnerembryonischer Taubenpocken-Nakano-Stamm) verwendet werden. Diese können leicht erworben werden, da sie im Handel erhältlich sind oder bei offiziellen Institutionen hinterlegt sind.
Nicht-essentielle Region
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete nicht-essentielle Region ist eine DNA-Region, die zur Vermehrung des vorstehend angeführten Virus (Elternvirus) nicht essentiell ist oder eine Region, die eine homologe Rekombination damit erlaubt. Beispiele von Regionen, die verwendet werden können, schließen die Polyhedringenregion von Baculovirus, die TK-Genregion der Pockenvirusfamilie angehörender Viren und die in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 1-168279 beschriebene nicht-essentielle Region des Vogelpockenvirus ein. Spezielle Beispiele nicht-essentieller Regionen von Vogelpockenviren schließen das EcoRI-Fragment (7,3 Kbp), EcoRI-HindIII-Fragment (ungef. 5,0 Kbp), BamHI-Fragment (ungef. 4,0 Kbp) und HindIII-Fragment (ungef. 5,2 Kbp) der in der vorstehend angeführten Veröffentlichung beschriebenen DNA des Taubenpockenvirusstamms NP, die TK-Genregion des Wachtelpockenvirus, die TK-Genregion des Truthahnpockenvirus oder Regionen ein, die eine homologe Rekombination damit bewirken.
Eine nicht-essentielle Virusregion enthaltender Vektor
Der eine nicht-essentielle Virusregion enthaltende, bei der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor, der bei der Konstruktion eines Vektors zur Virusrekombination verwendet wird, kann der sein, der dem vorstehend angeführten rekombinanten Vektor ähnlich ist und er wird gemäß Routineverfahren durch Behandeln des Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym in die vorstehend angeführte nicht-essentielle Virusregion inseriert.
Antigen-Gen
Das in einen Virus bei der vorliegenden Erfindung inserierte Antigen-Gen braucht nicht nur das DNA-Molekül zu sein, das die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz kodiert (wovon ein spezifisches Beispiel das mit der in SEQ ID Nr. 1 beschriebenen Nukleotidsequenz ist), sondern auch sein Fragment, ein Gen oder ein Teil eines Gens und ein modifiziertes, das die Fähigkeit zum Auslösen einer Immunabwehrreaktion nicht verschlechtert. Ein derartiges modifiziertes Antigenprotein, bei dem ein Teil eines derartigen Fragments oder Sequenz einer Aminosäuresequenz aufweist, die bezüglich der in SEQ ID Nr. 2 beschriebenen Aminosäuresequenz geändert wurde und von ihm wird ferner angenommen, daß es in einem Wirt eine im wesentlichen äquivalente Immunreaktion ergibt. Eine Genmodifizierung ist die, bei der wenigstens eine Aminosäure durch Routineverfahren wie etwa in Nucleic Acid Research, Bd. 10, Nr. 20, S. 6487–6500 (1982), oder der japanischen geprüften Patentveröffentlichung Nr. 6- 16709 beschriebenen Verfahren zum Auslösen einer ortsspezifischen Mutation künstlich modifiziert wurde (einschließlich Substitution, Inserierung und Deletion) und ist vorzugsweise zu mindestens 80%, bevorzugter mindestens 90% und noch bevorzugter mindestens 95% mit der in SEQ ID Nr. 2 beschriebenen Aminosäuresequenz homolog.
Das Antigen-Gen der vorliegenden Erfindung kann auch das sein, das ein DNA-Molekül umfaßt, das mit einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID Nr. 1 beschriebenen Nukleotidsequenz unter Bedingungen von 42°C, 2% Magermilch, 6fach konzentriertem SSC (6x SSC; pH 7,0) und 0,1% SDS hybridisiert und ein Protein mit der Immunogenität von infektiösem Laryngotracheitisvirus kodiert. Die hier angeführte DNA, die mit einer Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, ist vorzugsweise die, die der Natur entstammt, wovon ein Beispiel die ist, die aus infektiösem Laryngotracheitisvirus stammt.
Dieses Gen kann in eine Region oder zwei oder mehr verschiedene Regionen des Virusgenoms inseriert werden. Weiterhin kann es auch mit einem ein Protein kodierenden. Gen oder seinem Fragment wie etwa dem lacZ-Gen, gB- oder gC-Gen von ILTV oder gB-, gC-, gD-, gH-, gI- oder gE-Gen von MDV rekombiniert werden.
Rekombinationsvektor
Der zur Virusrekombination bei der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor enthält eine nicht-essentielle Virusregion, in die wenigstens ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung und ein Promotor, der es kontrolliert, eingeführt wurde. Das vorstehend angeführte Antigen-Gen und ein Promotor, der es kontrolliert, sollte in die nicht-essentielle Virusregion des vorstehend angeführten Vektors, der eine nicht-essentielle Virusregion enthält, inseriert werden. Außerdem kann ein Fragment, das eine nicht-essentielle Virusregion enthält, in die ein einem derartigen Vektor entstammendes Antigen-Gen und ein Promotor inseriert wurden, auch in einem anderen Vektor rekombiniert werden. Weiterhin können ein Markergen wie etwa das lacZ-Gen von E. coli und ein Promotor, der es kontrolliert, auch zur Reinigung eines rekombinanten Virus und so weiter rekombiniert werden.
Promotor
Bei dem hier verwendeten Promotor gibt es keine besonderen Einschränkungen, vor ausgesetzt er wirkt als Promotor in einem mit einem rekombinanten Virus infizierten Wirt. Beispiele von Promotoren, die verwendet werden können, schließen den Promotor des ein 7,5 K Polypeptid kodierenden Vacciniavirusgens, den Promotor des ein 11 K Polypeptid kodierenden Vacciniavirusgens, den Promotor des Thymidinkinase kodierenden Vacciniavirus, den Polyhedrinpromotor von Baculovirus und den SV40-Promotor des Truthahnherpesvirus, modifizierte Promotoren wie etwa die, bei denen ein Teil deletiert wurde, vorausgesetzt, daß sie noch immer als Promotoren wirken und synthetische Promotoren ein, die unter Bezug auf das Dokument von Moss et al. (J. Mol. Biol., Bd. 210, S. 749–776, S. 771–784, 1989) als Promotoren bei der Pockenvirenfamilie angehörenden Viren wirken.
Herstellungsverfahren des rekombinanten Virus
Bei dem Herstellungsverfahren des rekombinanten Virus gibt es keine besonderen Einschränkungen und die Herstellung kann gemäß herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden. Mit anderen Worten erfolgt eine homologe Rekombination zwischen einem Vektor und einer viralen genomischen DNA in infizierten Zellen, was zur Konstruktion eines rekombinanten Virus als Ergebnis eines Rekombinationsvektors führt, der durch zum Beispiel Calciumphosphat-Cofällung in mit einem Virus vorinfizierte Zellen eingeführt wurde. Das sich daraus ergebende rekombinante Virus wird in Wirtszellen infiziert, die in einem geeigneten Medium kultiviert werden und die Plaque, die wächst, wird als Kandidat für das angestrebte rekombinante Virus ausgewählt. Dieser Kandidatenstamm wird anschließend durch Hybridisierung mittels eines rekombinierten Antigen-Gens als Sonde oder durch Selektieren des durch ein rekombiniertes Markergen mit einem Antigen-Gen exprimierten gereinigt. Von dem Kandidatenstamm sollte anschließend durch Anwenden eines Immuntests mittels eines Antikörpers gegen das durch das rekombinierte Antigen-Gen kodierte Antigen bestätigt werden, daß er das angestrebte rekombinante Virus ist. Zum Beispiel wird in dem Fall eines rekombinanten Virus, bei dem das lacZ-Gen als Markergen rekombiniert ist, β-Galactosidase exprimiert und in Gegenwart eines seiner Substrate, Bluo-Gel (Gibco-BRL), wird eine blaue Plaque gebildet.
Bei den Wirtszellen gibt es keine besonderen Einschränkungen, vorausgesetzt das verwendete Virus kann diese Zellen infizieren und sich darin vermehren. Beispiele von Wirtszellen, die verwendet werden können, schließen CEF-Zellen und wachsende Chorioallantoiszellen aus Hühnereiern im Fall des Verwendens von FPV, Spodoptera frugiperda-Zellen im Fall des Verwendens von Baculovirus und Entenembryofibroblasten im Fall des Verwendens von Truthahnherpesvirus ein.
Transformante
Die durch die vorliegende Erfindung hergestellte Transformante bezieht sich auf Zellen oder Mikroorganismen, die durch ein DNA-Molekül oder rekombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung oder durch einen ein derartiges DNA-Molekül enthaltenden Expressionsvektor transformiert wurden.
Bei Vektoren zum Konstruieren eines rekombinanten Expressionsvektors mit einem DNA-Molekül oder rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung gibt es keine besonderen Einschränkungen und Beispiele derartiger Vektoren schließen sowohl die Plasmide pUC8, pUC9, pUC10, pUC11, pUC18, pUC19, pBR322, pBR325, pBR327, pDR540 und pDR720 als auch Phagen wie etwa λgt11, λgt10, λEMBL3, λEMBL4 und Charon4A ein.
Das Verfahren zum Inserieren eines DNA-Moleküls oder rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in einen derartigen Vektor unter Bilden eines rekombinanten Expressionsvektors kann gemäß herkömmlichen Verfahren erfolgen. Zum Beispiel wird das vorstehend angeführte Gen nach dem Spalten eines Vektors mit einem Restriktionsenzym unter der Kontrolle eines Promotors, der in dem Wirt wirksam ist, direkt ligiert. Beispiele von Promotoren, die verwendet werden, schließen den lac-Promotor-Operator, trp-Promotor, tac-Promotor, lpp-Promotor, PL-Promotor, amyE-Promotor, Ga17-Promotor, PGK-Promotor und ADH-Promotor ein.
Bezüglich des Herstellens eines rekombinanten Vektors zum Exprimieren des aus ILTV stammenden Polypeptids UL32h ist ein Subklonierungsverfahren, bei dem das vorstehend angeführte DNA-Molekül oder rekombinante DNA-Molekül vorübergehend in einen zum Herstellen eines rekombinanten Vektors geeigneten Vektor inseriert wird, ein unter Durchschnittsfachleuten weitbekanntes Verfahren und diese subklonierten Gene können mit einem geeigneten Restriktionsenzym ausgeschnitten und mit einem der vorstehend angeführten Promotoren unter Herstellen eines Expressionsvektors, der Protein erzeugen kann, ligiert werden. Bei den Vektoren, die bei dem vorstehend angeführten Subklonieren verwendet werden können, gibt es keine besonderen Einschränkungen, wovon Beispiele Plasmide wie etwa pUC8, pUC9, pUC10, pUC11, pUC18, pUC19, pBR322, pBR325, pBR327, pDR540, pDR720, pUB110, pIJ702, YEp13, YEp24, YCp19, YCp50, pAC373 und pACTM1 einschließen.
Durch Transformieren verschiedener geeigneter Wirte mittels des sich daraus ergebenden Expressionsvektors kann ein Mikroorganismus erhalten werden, der die Fähigkeit zum Produzieren eines Fusionsproteins, das die vom ILTV abgeleitete UL32h-Aminosäuresequenz enthält, oder seines Polypeptids mit einer Antigenität aufweist.
Der hier verwendete Wirt kann unter Berücksichtigung der Eignung für den Expressionsektor, Stabilität des Produkts und so weiter ausgewählt werden und kann entweder prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, wovon spezifische Beispiele Escherichia-Arten (z.B. Escherichia coli), Salmonella-Arten (z.B. Salmonella typhimurium), Actinomycetes, Hefen, Insektenzellen, Vogelzellen und humane Zellen einschließen. Durch Einführung eines geeigneten Expressionsvektors transformierte Wirte können unter dem Durchschnittsfachmann weitbekannten Kulturbedingungen kultiviert und vermehrt werden.
Außerdem können bei der Proteinherstellung Bedingungen gewählt werden, die eine Promotorwirkung auslösen, wovon spezifische Beispiele den Zusatz von Isopropylthioβ-D-galactopyranosid zu einer geeigneten Menge Kulturmedium in dem Fall zum Beispiel des lac-Promotor-Operators einschließen.
Das Herstellen infektiösen Laryngotracheitisvirus-Impfstoffs unter Verwenden eines auf diese Weise erhaltenen transformierten Wirts kann gemäß herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden. Zum Beispiel kann das Kultivieren dieses Wirts unter Bedingungen, die normalerweise zum Kultivieren von Mikroorganismen angewendet werden, wie etwa im Fall von E. coli unter Verwenden eines LB-Kulturmediums bei 37°C unter aerophilen Bedingungen ausgeführt werden.
Antigen-Polypeptid
Das Antigen-Polypeptid der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel das UL32h-Polypeptid) wird durch das vorstehend angeführte DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel das UL32h-Gen) kodiert. Genauer weist es die in SEQ ID Nr. 2 beschriebene Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz auf, die zu dieser Sequenz mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens 90% und bevorzugter min destens 95% homolog ist.
Außerdem kann das Antigen-Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein Analogon der Polypeptide mit diesen Sequenzen sein. Das hier angeführte Analogon ist bezüglich des UL32h-Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 ausreichend homolog, so daß es im Falle des Verabreichens in einem Wirt eine Immunabwehrreaktion auslöst und kann eine Variante, bei der das Aminoende, Carboxyende, der Mittelteil oder andere Teile der Aminosäuren der vorstehend angeführten Sequenz fehlen oder eine Variante sein, bei der diese fehlenden Teile kombiniert sind. Eine Sequenzänderung ist die, bei der eine oder mehr Aminosäuren durch herkömmliche Verfahren künstlich modifiziert wurden (einschließlich Substitution, Inserierung und Deletion), wovon Beispiele die in Nucleic Acid Research, 10, Nr. 20, S. 6487–6500 (1982), oder der japanischen geprüften Patentveröffentlichung Nr. 6-16709 beschriebenen ortsspezifischen Mutagenisierungsverfahren einschließen und ist zu mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90% und bevorzugter mindestens 95% bezogen auf die in SEQ ID Nr. 2 beschriebene Aminosäuresequenz homolog.
Dieser Typ Antigen-Polypeptid kann durch Kultivieren der vorstehend angeführten Transformante der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Es kann auch durch Kultivieren des vorstehend angeführten rekombinanten Virus der vorliegenden Erfindung in geeigneten Wirtszellen hergestellt werden.
Das hergestellte Antigen-Polypeptid kann gemäß der Beschreibung von Methods in Enzymology, Bd. 182 („Guide to Protein Purification" Murry P. Deutscher, Hrsg., Academic Press Pub.) isoliert und gereinigt werden.
Das auf diese Weise erhaltene Antigen-Polypeptid wird gemäß Routineverfahren verdünnt oder mit einem geeigneten Adjuvans und so weiter gemischt, damit es als Komponentenimpfstoff verwendet werden kann. Beispiele verwendeter Adjuvantien schließen Freundsches komplettes Adjuvans, Freundsches inkomplettes Adjuvans, Alum und Aracel ein. Obschon es bei dem Mischungsverhältnis mit dem Adjuvans keine besonderen Einschränkungen gibt, ist das Mischungsverhältnis normalerweise 1:1. Im Fall des Verwendens als Komponentenimpfstoff bei Hühnern, sollte der Komponentenimpfstoff normalerweise zu 0,01 μg oder mehr je Körper angewendet werden und es gibt bei der Dosis keine besondere Obergrenze, vorausgesetzt es zeigt sich keine aku te Toxizität. Außer dem Verabreichen durch subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion kann der Komponentenimpfstoff durch Sprühen oder durch Verabreichen im Trinkwasser und so weiter zur Immunisierung angewendet werden.
Weiterhin kann dieses UL32h-Polypeptid auch als diagnostisches Mittel für infektiöse Laryngotracheitis verwendet werden.
Lebendimpfstoff
Der Lebendimpfstoff der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, der sich aus dem rekombinanten Virus der vorliegenden Erfindung zusammensetzt. Außer dem Verwenden eines rekombinanten Virus, in das nur das in der vorliegenden Erfindung offenbarte Antigen-Gen inseriert wurde, kann auch die kombinierte Verwendung dieses rekombinanten Virus mit einem rekombinanten Virus, in das ein anderes Antigen-Gen wie etwa das aus ILTV stammende gBh-Gen, das gB-Gen aus MDV oder HN-Gen und F-Gen aus NDV inseriert wurde oder eines rekombinanten Virus, in das ein anderes Antigen-Gen wie etwa das aus ILTV stammende gBh-Gen, das gB-Gen aus MDV oder HN-Gen und F-Gen aus NDV inseriert wurde, in Kombination mit dem Antigen-Gen der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Synergistische, die Immunogenität verbessernde Wirkungen werden durch die kombinierte Verwendung des Antigen-Gens der vorliegenden Erfindung mit einem anderen Antigen-Gen erhalten. Außerdem können zusätzlich zu dem rekombinanten Virus auch pharmakologisch annehmbare Träger wie etwa physiologische Kochsalzlösung enthalten sein.
Bei dem Herstellungsverfahren des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung gibt es keine besonderen Einschränkungen. Zum Beispiel wird das rekombinante Virus der vorliegenden Erfindung in Zellen infiziert, die dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Virus das Wachsen gestatten, gefolgt vom Kultivieren der infizierten Zellen, bis sich das rekombinante Virus vermehrt. Später werden die Zellen isoliert und homogenisiert. Dieses Zellhomogenisat wird anschließend zentrifugiert und in einen zentrifugierten Überstand, der das zellfreie rekombinante Virus mit einem hohen Titer enthält und Sediment getrennt. Der zentrifugierte Überstand, der Zellkulturmedium und rekombinantes Virus enthält, aber im wesentlichen frei von Wirtszellen ist, kann als Impfstoff der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Außerdem kann er auch nach dem Wiederherstellen mit einem pharmakologisch annehmbaren Träger wie etwa phy siologischer Kochsalzlösung verwendet werden. Weiterhin kann der zentrifugierte Überstand gefriergetrocknet und als gefriergetrockneter Impfstoff verwendet werden.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann durch jedes Verfahren verabreicht werden, vorausgesetzt das Verfahren gestattet dem rekombinanten Virus in dem Impfstoff Hausgeflügel zu infizieren und eine Immunabwehr zu bewirken. Zum Beispiel kann Hausgeflügel durch Kratzen der Haut oder durch subkutanes Verabreichen an Hausgeflügel mittels einer Spritzennadel oder eines anderen Instruments beimpft werden. Außerdem kann der Impfstoff im Trinkwasser des Hausgeflügels suspendiert oder zum oralen Beimpfen in festes Futter gemischt werden. Weiterhin können auch Verfahren, bei denen Impfstoff durch Verwenden eines Aerosols oder Sprays inhaliert wird, intravenöse Beimpfungsverfahren, intramuskuläre Beimpfungsverfahren und intraperitoneale Beimpfungsverfahren angewendet werden.
Die geimpfte Menge ist normalerweise 10³ bis 10⁶ pfu (plaquebildende Einheiten) je Geflügel im Fall zum Beispiel des Impfens von Hühnern mit rekombinantem Vogelpockenvirus. Im Fall der Injektion kann diese Menge mit einer pharmakologisch annehmbaren Flüssigkeit wie etwa physiologischer Kochsalzlösung auf etwa 0,1 ml verdünnt werden.
Obschon es keine Einschränkungen beim Impfzeitpunkt gibt, ist es bevorzugt, daß das Impfen 14 Tage oder später auf dieselbe Weise wie bei bestehenden Impfstoffen auf der Grundlage des beabsichtigen Lieferns einer Immunität durchgeführt wird.
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung, die als aktiven Bestandteil rekombinantes Vogelpockenvirus aufweisen, sind zellfreie Impfstoffe und können unter gewöhnlichen Bedingungen gelagert und verwendet werden. Folglich können eine Lagerung in flüssigem Stickstoff, die Handhabung, Impfung und andere lästige Verfahren, die im Fall bestehender, mit Zellen verbundener Impfstoffe erforderlich sind, verringert werden. Zum Beispiel erlaubt das Gefriertrocknen des rekombinanten Vogelpockenvirus der vorliegenden Erfindung, daß es lange Zeit bei Raumtemperatur (etwa 20–22°C) gelagert, gehandhabt und transportiert werden kann. Da das zellfreie rekombinante Vogelpockenvirus in diesem Impfstoff sogar dann gelagert werden kann, wenn es gefriergetrocknet ist, kann zum Beispiel eine Suspension des rekombinanten Vogelpockenvirus durch Gefrieren bei –20°C bis –70°C gelagert werden.
Beispiele
Beispiel 1. Gene-walking von genomischer DNA des ILTV-Stamms NS-175 (siehe 1)
Der ILTV-Stamm NS-175 (von der Animal Biological Pharmaceutical Association erworben) wurde in eine Chorioallantoismembran im Wachstum begriffener Hühnereier eingeimpft und genomische ILTV-DNA wurde gemäß dem Verfahren von Pignatti et al. (Virology, Bd. 93, S. 260–264, 1979) aus der 4 Tage später isolierten Chorioallantoisflüssigkeit isoliert. Die sich daraus ergebende genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3AI teilverdaut und nach dem Ligieren in halbe λGEM-12-Seitenarme (Promega) wurde ein In-vitro-Verpacken zum Herstellen einer λGEM-12-Bibliothek ausgeführt.
Zu Anfang wurde E. coli mit einem λ-Phagen, in den verschiedene Fragmente genomischer ILTV-DNA inseriert waren, infiziert und auf Agarmedium wurden Plaques gebildet. Als nächstes wurden die Plaques auf Nitrocellulosefilter mit Poren von 0,22 μm geblottet und die Plaquehybridisierung wurde mittels des gBh-Gens von ILTV als Sonde unter Erhalten eines λGEM-12/ILTV-11,5-Klons ausgeführt, der ungefähr 11,5 Kbp DNA enthielt. Von der in diesen Klon inserierten DNA wurde aus der Restriktionsenzymkartierung bestätigt, daß sie ungefähr 10 Kbp vom N-Terminus des gBh-Gens aus verlängert war (1). Von dem UL32-Gen ist bekannt, daß es sich an einer Stelle ungefähr 10 Kbp vom N-Terminus des gB-Gens in HSV-1 befindet, das ebenso wie ILTV der Herpesvirusfamilie angehört (Mcgeoch et al.,). Gen. Virol., Bd. 69, S. 1531–1574, 1988). Auf dieser Grundlage wird für das UL32h-Gen vorhergesagt, daß es sich ebenfalls am N-Terminus des gBh-Gens in ILTV befindet.
Weiterhin wurde die Plaquehybridisierung der λGEM-12-Bibliothek erneut unter Verwenden eines DNA-Fragments mit ungefähr 1,7 Kbp am weitesten entfernt von der gBh-Genregion der in den λGEM-12/ILTV-11,5-Klon inserierten DNA ausgeführt. Als Ergebnis wurde ein λGEM-12/ILTV-9,6-Klon erhalten, in den ungefähr 9,6 Kbp DNA inseriert waren, die eine DNA-Region mit ungefähr 10 Kbp bis 20 Kbp an der N-terminalen Seite des gBh-Gens enthielt (1). Von dem in diesen λ-Phagen inserierten DNA-Fragment wurde auf der Grundlage der HSV-1-Daten vorhergesagt, daß es das UL32h-Gen von ILTV enthält.
Beispiel 2. Subklonieren von in λGEM-12/ILTV-9,6 inserierter DNA
Ein inseriertes DNA-Fragment mit ungefähr 9,6 Kbp wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI, BamHI und EcoRI verdaut und die sich daraus ergebenden Fragmente wurden in das Plasmid pUC19 subkloniert, um eine Sequenzanalyse zum Bestätigen auszuführen, ob die in λGEM-12/ILTV-9,6 inserierte DNA das UL32h-Gen enthielt oder nicht. Als Ergebnis wurden fünf Plasmide erhalten, die ein SmaI-BamHI-Fragment mit ungefähr 4 Kbp (pUCSB4), ein BamHI-EcoRI-Fragment (pUCBE0.5) mit ungefähr 0,5 Kbp, ein BamHI-EcoRI-Fragment (pUCBE2.5) mit ungefähr 2,5 Kbp, ein BamHI-EcoRI-Fragment (pUCBE0.6) mit ungefähr 0,6 Kbp und ein SmaI-BamHI-Fragment (pUSB2.6) mit ungefähr 2,6 Kbp enthielten.
Beispiel 3. Sequenzanalyse der pUC19-Subklone von λGEM-12/ILTV-9,6
Die Sequenzanalyse mittels eines automatischen DNA-Sequenziergeräts (ABI) wurde an der in die vorstehend angeführten fünf Subklone inserierten DNA ausgeführt. Weiterhin wurden bezüglich pUCSB4 kleinere Fragmente enthaltende Subklone erhalten, gefolgt von der Analyse ihrer Sequenzen. Als nächstes wurden die aus den sich daraus ergebenden DNA-Sequenzen vorhergesagten Aminosäuresequenzen auf die Homologie mit der UL32-Aminosäuresequenz von HSV-1, der UL32h-Aminosäuresequenz von MDV und der UL32h-Aminosäuresequenz von EHV verglichen.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß das durch den in dem pUCSB4-Subklon enthaltenen offenen Leserahmen (ORF) mit 1 749 Kbp (SEQ ID. Nr. 1) kodierte Polypeptid eine Homologie von 411 Punkten mit dem UL32-Polypeptid von HSV-1, 454 Punkten mit dem UL32h-Polypeptid von MDV und eine Homologie von 592 Punkten mit dem UL32h-Polypeptid von EHV gemäß Lipman und Pearson (Science, Bd. 227, S. 1435, 1985) zeigt. Außerdem kodierte dieser ORF ein aus 582 Aminosäuren bestehendes Polypeptid. Diese Aminosäuresequenz wird in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Beispiel 4. Amplifizierung des UL32h-Gens durch PCR
Das UL32h-Gen wurde gemäß dem PCR-Verfahren von Saiki et al. (Science, Bd. 230, S. 1350–1354, 1985) amplifiziert. Bei dieser PCR wurde pfu Taq (Stratagene) zum Verändern der in dem UL32h-Gen vorhandenen T5NT-Sequenz (tatsächlich TTTTTTT) verwendet (die die Möglichkeit des Wirkens als Translationsstopsignal des Pockenvirus besitzt). Zuerst wurden die beiden folgenden Fragmente hergestellt: ein DNA-Fragment mit 1 487 bp, bei dem der Restriktionsenzym-BamHI-Linker unter Verwen den von in SEQ ID Nr. 3 dargestelltem GGAACTGTGGATCCGCCATGACA und in SEQ ID Nr. 4 dargestelltem TGCACACAATGGATCGCAAAAGAAGTGTTT als Primer und unter Verwenden von in Beispiel 2 erhaltenem pUCSB4 als Matrize an den N-Terminus des UL32h-Gens gebunden war und ein DNA-Fragment mit 334 bp, bei dem der Restriktionsenzym-SalI-Linker unter Verwenden von in SEQ ID Nr. 5 dargestelltem AACGCAATTTACAAACACTTCTTTTGCGAT und in SEQ ID Nr. 6 dargestelltem CGAGAAGTCGACGTCAGACATATCGAG als Primer und unter Verwenden von in Beispiel 2 erhaltenem pUCSB4 als Matrize an den C-Terminus des UL32h-Gens gebunden war.
Als nächstes wurde eine PCR unter Verwenden der beiden sich daraus ergebenden Fragmente als Matrizen und unter Verwenden von SEQ ID Nr. 3 dargestelltem GGAACTGTGGATCCGCCATGACA und in SEQ ID Nr. 6 dargestelltem CGAGAAGTCGACGTCAGACATATCGAG als Primer und Erhalten eines DNA-Fragments mit 1780 bp ausgeführt, das die modifizierte T5NT-Sequenz, den BamHI- und SalI-Linker aufweist. Das sich daraus ergebende DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut und in das Plasmid pGTPs kloniert. Das inserierte Fragment wurde bestätigt und es wurden keinerlei während der PCR verursachten Variationen beobachtet.
Beispiel 5. Expression des UL32h-Gens in E. coli und Erhalt von Kaninchen-Antiserum
Das in Beispiel 4 erhaltene DNA-Fragment, an das das UL32h-Gen gebunden war, das die Restriktionsenzym-BamHI- und SalI-Linker enthielt, wurde mit dem Restriktions enzym XhoI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,75 Kb (UL32h/BX) und eines DNA-Fragments mit ungefähr 1 Kb (UL32h/XS) verdaut. Als nächstes wurde UL32h/BX zum Herstellen eines Expressionsvektors pUL32hBX in mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdauten pATH11-Vektor inseriert. Außerdem wurde zum Herstellen eines Expressionsvektors pUL32hXS in mit dem Restriktionsenzym SalI verdauten pATH11-Vektor inseriert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Auf diese Weise hergestelltes Plasmid pUL32hBX oder pUL32hXS wurde anschließend in den E.-coli-Stamm RR-1 inseriert.
Die Expression der Plasmide pUL32hBX und pUL32hXS in dem E.-coli-Stamm RR-1 wurde gemäß dem Verfahren von Koerner et al. (Methods in Enzymology, Bd. 194, S. 477–490, 1991) ausgeführt und ein Fusionsprotein mit dem TrpE-Protein wurde aus der unlöslichen Fraktion des E.-coli-Stamms RR-1 isoliert. Ein Teil der sich daraus ergebenden Fraktion (Fusionsprotein) wurde zur Immunisierung bei einem Kaninchen gemäß Routineverfahren unter Erhalten eines Antiserums verwendet.
Getrennt davon wurde die verbliebene unlösliche Fraktion in einem Probenpuffer (Laemmli, Nature, Bd. 227, S. 680–685, 1970) suspendiert und gekocht. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand mit SDS-PAGE (Laemmli, Nature, Bd. 227, S. 680–685, 1970) entwickelt.
Als Ergebnis wurde wie in 2 dargestellt ein Protein mit ungefähr 65 Kilodalton aus E. coli mit pUL32hBX nachgewiesen und ein Protein mit ungefähr 75 Kilodalton wurde aus E. coli mit pUL32hXS nachgewiesen. Diese Proteine waren Fusionsproteine mit TrpE-Protein und ihre durch Subtrahieren des Molekulargewichts von TrpE von ungefähr 37 Kilodalton erhaltenen Molekulargewichte entsprachen den Molekulargewichten der aus jeder DNA-Sequenz vorhergesagten Proteine.
Auf der Grundlage des Vorstehenden wurde bestätigt, daß die sich daraus ergebenden Proteine jeweils Teile des aus NS-175 des ILTV stammenden UL32h-Proteins waren.
Beispiel 6. Konstruktion des Plasmids pNP35SCV2
Genomische DNA des Stamms NP, ein Hühnerpocken-Lebendimpfstoff, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI oder HindIII gespalten und das sich daraus ergebende Fragment wurde in das lange Fragment inseriert, das sich aus einem ähnlichen Spalten von pUC18 mit dem Restriktionsenzym EcoRI oder HindIII unter Erhalten der Plasmide pNP01 bis pNP60 ergab. Da die Restriktionsenzym-Spaltungsstellen ClaI, EcoRV und HpaI bei pUC18 nicht vorhanden sind, wurde pNP01 bis pNP60 mit den vorstehend angeführten Restriktionsenzymen gespalten und die, die an einem Ort irgendwo in der durch irgendeines dieser Restriktionsenzyme klonierten genomischen DNA gespalten wurden, konnten leicht selektiert werden. Es gab 9 Typen, d.h. pNP03, pNP04, pNP25, pNP26, pNP29, pNP32, pNP35, pnP36 und pNP38.
Jedes davon wurde mit einem Restriktionsenzym gespalten, von dem bekannt war, daß es an einem Ort spaltet und nur das mit ClaI gespaltene Plasmid wurde an seinen gespaltenen Enden mit DNA-Polymerase geglättet. Nach dem Behandeln des Plasmids mit einer alkalischen Phosphatase zum Entfernen der Phosphatgruppe am 5'-Terminus wurde es mit Phenol und Chloroform (1:1) extrahiert und gefällt, gefolgt vom Isolieren des gespaltenen Plasmids. Da das lacZ-Gen mit einem Promotor in Form von Termini mit glatten Enden aus in Bezugsbeispiel 1 beschriebenem pNZ76 mittels des in Bezugsbeispiel 2 beschriebenen Verfahrens erhalten wird, wird dieses mit dem zuvor isolierten gespaltenen Plasmid mittels Ligase ligiert, wonach E. coli TG1 mit dem sich daraus ergebenden Plasmid transformiert wurde.
Nachdem Kolonien, die auf einem LB-Agarmedium in Gegenwart von Ampicillin erschienen, in einem LB-Flüssigmedium in Gegenwart von Ampicillin kultiviert wurden, wurde das Plasmid unter Anwenden des Verfahrens von Biruboim und Doly extrahiert, gefolgt von der Selektion des Plasmids, in das das lacZ-Gen inseriert wurde. Auf diese Weise wurden die vorstehend angeführten 9 Rekombinationsplasmide, in die das lacZ-Gen inseriert worden war, erhalten. Diese wurden pNP1003, pNP1004, pNB1025, pNP1026, pNP1029, pNP1032, pNP1035, pNP1036 und pNP1038 genannt.
Der NP-Stamm wurde in eine Einzelschicht CEF-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 infiziert, wonach die Zellen durch Behandlung 3 h später mit Trypsin unter Erhalten einer Zellsuspension abgelöst wurden. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugieren getrennt, in einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml in Saline G (0,14 M NaCl, 0,5 mM KCl, 1,1 mM Na₂HPO₄, 0,5 mM MgCl₂·6H₂O, 0,011% Glucose) suspendiert und auf die Anzahl der in Beispiel 2 hergestellten Rekombinationsplasmide verteilt. Eine aliquote Menge von 10 μg des Rekombintionsplasmids wurde jeder Zellsuspension zugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur mittels eines Gene Pulser (Bio-Rad) unter Bedingungen von 3,0 kV/cm und 0,4 msec elektroporiert. Die Zellen, in die das Plasmid eingeführt worden war, wurden 72 h bei 37°C kultiviert, wonach die Zellen durch drei Mal Einfrieren und Auftauen lysiert wurden.
Die freigesetzten rekombinanten Viren wurden auf die folgende Weise durchmustert. 10fache serielle Verdünnungen der Lösung, die das aus den lysierten Zellen freigesetzte vermehrte Virus enthielt, wurden in CEF-Zellen infiziert und mit 10 ml Wachstumsmedium enthaltendem Agarmedium überschichtet. Nachdem man den Agar bei Raumtemperatur hatte festwerden fassen, wurden die Zellen bei 37°C kultiviert, bis sich typische APV-Plaques gebildet hatten. Nach etwa 1 Woche, als die Plaques größer wurden, wurde jede Kulturplatte mit einem unterschiedlichen, 600 μg/ml Bluo-gal enthaltenden Agarmedium überschichtet, gefolgt von weiteren 24 h Kultivieren bei 37°C. Die blaue Plaque wurde von der Platte entfernt und das darin enthaltene Virus wurde isoliert. Die Reinigung des rekombinanten Virus wurde außerdem mittels desselben Verfahrens ausgeführt, bis alle gebildeten Plaques mit Bluo-gal blau angefärbt waren. Dieses Verfahren ist normalerweise nach 4 bis 6 Zyklen abgeschlossen. Die auf diese Weise gereinigten rekombinanten Viren wurden fNP1003, fNP1004, fNB1025, fNP1026, fNP1029, fNP1032, fNP1035, fNP1036 beziehungsweise fNP1038 genannt.
10⁴ PFU rekombinanter AVP- und NP-Stamm als Kontrolle (Elternvirus) wurden im Bereich der Flügelspannhaut (wing-web) 4 Tage alter SPF-Hühnchen eingeimpft. 10 Hühnchen wurden auf eine Versuchsgruppe verwendet. Die Pockengröße jedes Tiers wurde 3, 7, 9, 11, 14, 17 und 21 Tage nach der Beimpfung gemessen und das Mittel wurde für jede Gruppe berechnet. Die Pockengröße wurde durch Messen der Länge, Breite und Höhe mittels eines digitalen Meßschiebers und Berechnen des Volumens aus diesen drei Abmessungen bestimmt. Als Ergebnis des Messens der Pockengröße zeigte nur fNP1035 eine dem Elternstamm ähnliche Pockenbildung und war eindeutig nicht abgeschwächt. Die Sequenzanalyse wurde an dem zum Herstellen von rekombinantem fNP1035 verwendeten rekombinanten Plasmid unter Verwenden der nicht-essentiellen Region von pNP35 als Insertionsstelle zum Bestimmen seiner Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 13) ausgeführt. Zum Inserieren des synthetischen DNA-Adapters der SEQ ID Nr. 14 in ClaI, das eine einzigartige Stelle von pNP35 ist, wurde pNP35 mit dem Restriktionsenzym ClaI gespalten und an synthetische DNA der SEQ ID Nr. 14 mittels T4DNA-Ligase unter Transformieren von E. coli TG1 ligiert. Plasmid-DNA wurde aus den sich daraus ergebenden Ampicillin-resistenten Kolonien hergestellt, das Plasmid wurde ausgewählt, das mit dem Restriktionsenzym SfiI gespalten wurde und dieses Plasmid wurde pNP35CV genannt. pNP35CV wurde mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und selbstligieren gelassen, gefolgt von der Transformation von E. coli TG1. Die sich daraus ergebenden, ampicillinresistenten Kolonien wurden zum Herstellen des Plasmids selektiert. Ein Plasmid mit einer Länge von ungefähr 5,7 Kbp wurde selektiert und pNP35SCV2 genannt.
Beispiel 7. Konstruktion der Plasmide pGTPsILUL32 und pUC-IL-UL32 (siehe 2)
Ein Fragment, das das durch dasselbe PCR-Verfahren wie Beispiel 4 verstärkte UL32h-Gen enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut und das sich daraus ergebende Fragment wurde in die BamHI-SalI-Stelle von pGTPs, das ein rekombinantes Plasmid ist, das durch Inserieren synthetischer DNA in pUC18 hergestellt und durch das in Bezugsbeispiel 3 beschriebene Verfahren erhalten wurde, eingeführt, um so pGTPsILUL32 zu konstruieren.
Ähnlich wurde ein das durch PCR verstärkte UL32h-Gen enthaltendes Fragment mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut und das sich daraus ergebende Fragment wurde in die BamHI-SalI-Stelle von pUC19 inseriert, um so pUC-IL-UL32 zu erhalten.
Beispiel 8. Konstruktion des Plasmids pNZ29R/ILUL32 für rekombinantes Geflügelpockenvirus (siehe 3)
In Beispiel 7 konstruiertes pUC-IL-UL32 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut und in die BamHI-SalI-Stelle von pNZ1829R, das ein Plasmid mit einer Stelle ist, die durch SfiI gespalten wird und unter Anwenden des in Bezugsbeispiel 8 beschriebenen Verfahrens konstruiert wird, unter Konstruieren von pNZ29R/ILUL32 eingeführt.
Beispiel 9. Konstruktion des Plasmids pNZ29R/ILgBUL32 für rekombinantes Geflügelpockenvirus (siehe 4)
Ein das gB-Gen von ILTV enthaltenes Fragment, das durch Spalten mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacI des Plasmids pNZ29RILTgB-2-1 erhalten worden war, das gemäß dem in Bezugsbeispiel 4 beschriebenen Verfahren konstruiert worden war, wurde gegen ein XhoI-SacI-Fragment ausgetauscht, das die HN- und F-Gene des NDV von pNZ6929Sfi enthielt, das ein Plasmid ist, in das ein aus dem Genom der Newcastle-Krankheit stammendes Antigen-Gen eingeführt worden war und mittels des in Bezugsbeispiel 5, 6 und 7 beschriebenen Verfahrens konstruiert worden war, um so das ILTV-gB-Gen enthaltendes pNZ29R/ILgB-Sfi herzustellen. Dieses wurde anschließend mit dem Restriktionsenzym SfiI gespalten und ein das ILTV-UL32-Gen von pGTPsILUL32, das in Beispiel 9 hergestellt wurde, enthaltende BglI-Fragment wurde unter Konstruieren von pNZ29R/ILgBUL32 inseriert.
Beispiel 10. Konstruktion des Plasmids pNP35S/ILUL32gB für rekombinantes Geflügelpockenvirus (siehe 5)
In Beispiel 6 hergestelltes pNP35SCV2 wurde mit dem Restriktionsenzym SfiI gespal ten, gefolgt von der Inserierung eines BglI-Fragments, das das in Beispiel 8 hergestellte ILTV-UL32-Gen von pGTPsILUL32 enthielt, um pNP35SCV2/ILUL32 herzustellen. Dieses wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen SfiI und SalI gespalten, gefolgt von der Insertion eines Sfil-SalI-Fragments, das lacZ des in Bezugsbeispiel 8 beschriebenen pNZ1829R enthielt, um pNZ35SCV2-lacZ/ILUL32 herzustellen. Getrennt davon wurde nach dem Spalten von pNZ29RILTgB-2-1 mit dem Restriktionsenzym BamHI ein Fragment mit 2633 Basen, das die gesamte Länge des durch teilweises Verdauen mit dem Restriktionsenzym DraI erhaltenen ILTVgB-Gens enthielt, in die BamHI-HincII-Stelle von in Bezugsbeispiel 3 beschriebenem pGTPs inseriert, um pGTPs/ILgB zu erhalten. Ein die gesamte Länge des durch Spalten dieses pGTPS/ILgB mit BglI erhaltenen ILTVgB-Gens wurde anschließend in die SfiI-Stelle von pNZ35SCV2-lacZ/ILUL32 zum Konstruieren von pNP35S/ILUL32gB inseriert.
Beispiel 11. Herstellung und Reinigung von rekombinantem Geflügelpocken virus
Taubenpockenvirus-NP-Stamm oder ein aus einem Geflügelpockenvirusimpfstoff isoliertes Virus, das als seinen Phänotyp die Bildung großer Plaques aufwies (Nazerian et al., Avian. Dis., Bd. 33, S.458–465, 1989), wurde in ein eine Einzelschicht CEF-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion von 0,1 infiziert. Drei Stunden später wurden diese Zellen durch Behandlung mit Typsin unter Bilden einer Zellsuspension abgelöst. Diese Zellsuspension wurde zum Abtrennen der Zellen zentrifugiert, die anschließend in einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml in Saline G (0,14 M NaCl, 0,5 mM KCl, 1,1 mM Na₂HPO₄, 0,5 mM MgCl₂·6H₂O, 0,011% Glucose) suspendiert wurden. 10 μg des rekombinanten Plasmids pNP35S/ILUL32gB wurde einer mit dem NP-Stamm infizierten Zellsuspension zugefügt.
Zum anderen wurden 10 μg jedes rekombinanten Plasmids pNZ29R/ILUL32 oder pNZ29R/ILgBUL32 einer mit einem Virus, der die Bildung großer Plaques als seinen Phänotyp aufwies, infizierten Zellsuspension zugefügt. Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur mittels eines Gene Pulsers (Bio Rad) unter Bedingungen von 3,0 kV/cm und 0,4 msec elektroporiert. Die das Plasmid enthaltenden Zellen wurden später 72 Stunden bei 37°C kultiviert, wonach die Zellen durch drei Mal Gefrieren und Auftauen lysiert wurden. Die freigesetzten rekombinanten Viren wurden auf die nachstehend beschriebene Weise durchmustert.
10fache serielle Verdünnungen der Lösung, die das aus den lysierten Zellen freigesetzte vermehrte Virus enthielt, wurden in CEF-Zellen infiziert und mit 10 ml Wachstumsmedium enthaltendem Agarmedium überschichtet. Nachdem man den Agar bei Raumtemperatur hatte festwerden lassen, wurden die Zellen bei 37°C kultiviert, bis sich typische APV-Plaques gebildet hatten. Nach etwa 1 Woche, als die Plaques größer wurden, wurde jede Kulturplatte mit einem unterschiedlichen, 600 μg/ml Bluo-gal enthaltenden Agarmedium überschichtet, gefolgt von weiteren 24 h Kultivieren bei 37°C. Die blaue Plaque wurde von der Platte entfernt und das darin enthaltene Virus wurde isoliert. Die Reinigung des rekombinanten Virus wurde außerdem mittels desselben Verfahrens ausgeführt, bis alle gebildeten Plaques mit Bluo-gal blau angefärbt waren. Dieses Verfahren ist normalerweise nach 4 bis 6 Zyklen abgeschlossen.
Das auf diese Weise gereinigte rekombinante Virus, das aus dem Rekombinationsplasmid pNP35S/ILUL32gB hergestellt wurde, wurde NP35S/ILUL32gB genannt, das aus dem Rekombinationsplasmid pNZ29R/ILUL32 hergestellte, wurde US29R/ILUL32 genannt und das aus dem Rekombinationsplasmid pNZ29R/ILgBUL32 hergestellte wurde UL29R/ILgBUL32 genannt.
Beispiel 12. Inserierungsgen von rekombinantem Geflügelpockenvirus und Bestätigung der Expression
Von allen drei in Beispiel 11 hergestellten Typen von Rekombinanten wurde bestätigt, daß sie wie durch das gB-Gen und UL32h-Gen von ILTV gemäß der Southern-Hybridisierung vorhergesagt gelegen waren. Außerdem ließ man sie nach der Acetonfixierung der mit einem dieser drei Typen von Rekombinanten infizierten CEF-Zellen mit FITC-markiertem Anti-Kaninchen-(Ziege)-Serum (Tago) (100fache Verdünnung) reagieren. Beim Beobachten mittels des indirekten Fluoreszenz-Antikörperverfahrens wurde eine charakteristische Fluoreszenz beobachtet. Weiterhin wurde in Beispiel 5 erhaltenes Anti-UL32/XS-Kaninchenserum (100fache Verdünnung) mit einer lysierten Lösung mit jedem dieser drei Typen von Rekombinanten infizierter CEF-Zellen umgesetzt. Nach dem Umsetzen mit peroxidasemarkiertem Anti-Kaninchen-(Ziege)-Serum (Tago) (100fache Verdünnung), wurde mit 4-Chlor-l-naphthol eine Färbung erzeugt. Als Ergebnis wurde eine spezifische Bande an der Stelle des vorhergesagten Molekulargewichts von ungefähr 68 kd beobachtet, wodurch bestätigt wurde, daß das UL32h-Gen von ILTV in rekombinantem Geflügelpockenvirus exprimiert wurde.
Beispiel 13. Infektionsabwehrwirkung mit rekombinantem Geflügelpockenvirus gegen virulentes ILTV beimpfter Hühnchen
104 PFU (plaquebildende Einheiten) in Beispiel 11 hergestellten rekombinanten Geflügelpockenvirus und im US-Patent Nr. 5 443 831 beschriebenen rekombinanten Geflügelpockenvirus ILTVgB2-1 wurden in die Flügelspannhaut 40 Tage alter SPF-Hühnchen eingeimpft. Die Hühnchen wurden gleichzeitig mit ILT-Lebendimpfstoff (Kaketsuken) durch Tropfen eines Tropfens (ungefähr 0,03 ml) (10^4,0 TCID₅₀/Hühnchen oder mehr) in die Augen wie angegeben geimpft. Achtzehn Tage später wurden die Hühnchen durch Impfen mit 10^3,5 EID₅₀/0,1 ml virulentem ILTV Stamm NS-175 in die Nasennebenhöhle auf der Grundlage des in „Animal Biological Pharmaceuticals" (Animal Biological Pharmaceutical Association) beschriebenen Verfahrens belastet. Die Hühnchen wurden 1 Woche lang nach der Impfung auf klinische Symptome beobachtet und nach 1 Woche autopsiert. Hühnchen, die 2 Tage oder mehr klinische Symptome zeigten wurden als infiziert (zur Infektionsabwehr unfähig) beurteilt. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Außerdem wurde mit Ausnahme des Impfens von Lebendimpfstoff in 30 Tage alte anstatt 40 Tage alte Hühnchen und Belasten mit virulentem ILTV im Alter von 44 Tagen anstatt 18 Tage später (58 Tage alt) ein Versuch unter Anwenden eines identischen Verfahrens wie das vorstehend beschriebene ausgeführt. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Gemäß diesen zwei Tabellen wurde bei Hühnchen, die mit nur das UL32h-Gen des ILTV enthaltendem US29R/ILUL32 geimpft wurden, im Vergleich mit Hühnchen, die nicht geimpft wurden, eine gewisse Höhe der Abwehrwirkung beobachtet. Die Abwehrwirkung war jedoch niedriger im Vergleich mit ILNgB2-1, das nur aus dem gB-Gen des ILTV besteht. Überaschenderweise wurde jedoch in dem Fall der beiden rekombinanten Geflügelpockenviren US29R/ILgBUL32 und NP35S/ILUL32gB, in die außer dem gB-Gen das UL32-Gen eingeführt wurde, nachgewiesen, daß das Leistungsverhalten dem des ILTV-Lebendimpfstoffs gleich war und dadurch Ergebnisse anzeigte, die eine additive Wirkung einer nur gB-Gen enthaltenden Rekombinaten und nur UL32-Gen enthaltenden Rekombinante überschritten (synergistische Wirkungen).
Bezugsbeispiel 1. Herstellung eines Plasmids, das ein an den 7,5 K Promotor ligiertes β-Galactosidasegen umfaßt (siehe 6)
Nach dem Verdauen von 10 μg pMA001 [Shirakawa et al., Gene, 28, 127-, (1984)] mit BamHI wurde mit Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert, gefolgt von der Ethanolfällung zum Isolieren des β-Galactosidasegens (ungefähr 3,3 Kbp). Zum anderen wurde es nach dem Verdauen von 0,3 μg pUC19 mit BamHI mit Phenol-Chloroform extrahiert und durch Ethanolfällung isoliert. Es wurde anschließend mit dem vorstehend hergestellten β-Galactosidasegen ligiert, um das Hybridplasmid pNZ66 herzustellen.
Nach dem Verdauen von 40 μg pUWP-1 mit HpaII und EcoRI wurde ein Fragment mit ungefähr 0,26 Kbp, das einen 7,5 K Promotor enthielt, durch Gelelektrophorese (70 Volt, 6 Stunden) an 1,5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt abgetrennt, gefolgt von der Extraktion mit Phenol-Chloroform (1:1) und Ethanolfällung zum Isolieren der DNA. Die klebrigen Enden dieses DNA-Fragments wurden mit DNA-Polymerase zu glatten Enden modifiziert. Als nächstes wurden nach dem Verdauen von 0,3 μg pNZ66 mit HincII mit Phenol-Chloroform extrahiert und durch Ethanolfällung isoliert, gefolgt von der Ligation mit dem vorstehend angeführten 7,5 K Promotorgen mit 0,26 Kbp. Das sich daraus ergebende Hybridplasmid wurde pNZ76 genannt.
Bezugsbeispiel 2. Gewinnung des β-Galactosidasegens (glatte Enden)
Nach dem Verdauen von 10 μg pNZ76 mit HindIII und SmaI wurde ein Fragment mit ungefähr 3,6 Kbp durch Gelektrophorese (40 Volt, 20 Stunden) an 0,7% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt abgetrennt. Nach dem Bestätigen des DNA-Fragments durch Ethidiumbromidanfärbung wurde das Gel ausgeschnitten und mit Phenol behandelt, gefolgt von der Ethanolfällung zum Isolieren des DNA-Fragments.
Zum anderen wurde 1 μg pNZ180 mit EcoRV verdaut, gefolgt von der Extraktion mit Phenol-Chloroform und Isolierung durch Ethanolfällung. 0,3 μg der gespaltenen pNZ180-DNA und ungefähr 0,4 μg des vorstehend angeführten Fragments mit ungefähr 3,6 Kbp (das die mit dem β-Galactosidasegen verknüpfte 7,5 K Promotor-DNA umfassende Fragment) wurden gemischt, die klebrigen Enden wurde mit DNA-Polymerase zu glatten Enden modifiziert und nach dem Extrahieren mit Phenol-Chloroform wurde das β-Galactosidasefragment durch Ethanolfällung isoliert.
Bezugsbeispiel 3. Konstruktion des Donorplasmids pGTPs (siehe 7)
Synthetische DNA (5'-AGCTGCCCCCCCGCAAGCTTGCA-3'(SEQ ID Nr. 15)) wurde in die HindIII-PstI-Stelle von pUC18 inseriert, wonach synthetische DNA (5'-TCGACATTTTTATGTAC-3'(SEQ ID Nr. 16)) in die SalI-KpnI-Stelle des sich daraus ergebenden Plasmids inseriert wurde. Weiterhin wurden zwei angelagerte synthetische DNA (5'-AATTCGGCCGGGGGGGCCAGCT-3'(SEQ ID Nr. 17)) und (5'-GGCCCCCCCGGCCG-3' (SEQ ID Nr. 18)) in die SacI-EcoRI-Stelle des sich daraus ergebenden Plasmids inseriert und schließlich wurde das Plasmid pNZ1729R (Yanagida et al., J. Virol., 66, 1402–1408, 1992) mit HindIII und SalI verdaut und das sich daraus ergebende DNA-Fragment mit ungefähr 140 bp wurde in die HindIII-SacI-Stelle dieses Plasmids unter Aufbauen des Plasmids pGPTs inseriert.
Bezugsbeispiel 4
Eine PCR wurde zum Ändern der beiden in dem gB-Gen (das die Möglichkeit aufweist, als Translationsstopsignal des Pockenvirus zu wirken) vorhandenen T5NT-Sequenzen auf dieselbe Weise, wie sie in Beispiel 4 ausgehend von der im US-Patent Nr. 5 443 831 beschriebenen Sequenz des ILTV geändert wurde, und zum Einführen einer in ein rekombinantes Plasmid zu inserierenden Restriktionsenzymstelle ausgeführt.
Genomische ILTV-DNA wurde mittels desselben Verfahrens wie Beispiel 1 aus dem im US-Patent Nr. 5 443 831 beschriebenen virulenten ILTV-Wildstamm 632 hergestellt. Eine PCR wurde unter Verwenden dieser DNA als Matrize und Verwenden sowohl der Sätze SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 22 als auch SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 ausgeführt, die auf der Grundlage der im US-Patent Nr. 5 443 831 beschriebenen Sequenzdaten hergestellt worden waren, um drei Fragmente herzustellen, bei denen eine Restriktionsenzymstelle (BamHI und XhoI) zum Ändern der beiden T5NT-Sequenzen und Inserieren eines Rekombinationsplasmids eingeführt war. Ein verändertes ILTV-gB-Gen wurde anschließend durch Ausführen einer PCR unter Verwenden dieser drei Fragmente als Matrizen und der Primer mit der SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 20 hergestellt. Ein sich daraus ergebendes Fragment wurde mit BamHI und XholI verdaut und in die BamHI-SalI-Stelle des Plasmids pNZ172R (Yanagida et al., J. Virol., 66, 1402–1408, 1992) unter Aufbauen eines Rekombinationsplasmids pNZ29RILTgB-2-1 inseriert. Weiterhin ist unter Verwenden dieses Rekombinationsplasmids pNZ29RILTgB-2-1 hergestelltes rekombinantes Geflügelpockenvirus das im US-Patent 5 443 831 beschriebene rekombinante Geflügelpockenvirus.
Bezugsbeispiel 5. Herstellung eines Hybridplasmids (pNZ98), das einen mit F-Gen-DNA verknüpften Promotor unter seiner Kontrolle umfaßt (siehe 8)
cDNA des F- und HN-Gens des NDV enthaltendes Plasmid XLIII-10H [Virus Research, 7, 241–255 (1987)] wurde von dem außerordentlichen Professor Masao Kawakida vom Fachbereich Ausbildung, Universität Tokio, erhalten.
Nach dem Verdauen von 4 μg dieses Plasmids XLIII-10H mit XbaI wurden die klebrigen Enden mit DNA-Polymerase zu glatten Enden modifiziert, gefolgt von der Extraktion mit Phenol-Chloroform und Isolieren durch Ethanolfällung. Nach dem teilweisen Verdauen der isolierten DNA mit BamHI wurde auf sie eine 0,8% Agarosegelelektrophorese unter Isolieren eines das gesamte F-Gen mit ungefähr 2,1 Kbp enthaltenden Fragments angewandt. Zum anderen wurde ein Hybridplasmid (pNZ76), das den in (3) von Bezugsbeispiel 1 hergestellten Promotor umfaßt, der mit einer DNA unter seiner Kontrolle verknüpft ist, die ein leicht nachweisbares Enzym kodiert, mit BamHI und SamI unter Isolieren eines BamHI-SmaI-Fragments mit ungefähr 3,0 Kbp verdaut, aus dem der lacZ-Genteil entfernt worden war. Dieses Fragment mit ungefähr 3,0 Kbp und das vorstehend angeführte Fragment mit ungefähr 2,1 Kbp wurden mit Ligase ligiert, gefolgt von der Transformation des kompetenten E.-coli-Stamms TG1. Ein Plasmid wurde aus Kolonien hergestellt, die auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium wuchsen, der Zielklon wurde durch Spalten mit Restriktionsenzym bestätigt und dieses Plasmid wurde pNZ98' genannt. Das Plasmid pNZ98' enthielt nicht nur die gesamte Länge des F-Gens, sondern auch ungefähr 300 bp des 5'-Terminus des HN-Gens. Zum Entfernen dieses Teils wurde pNZ98' mit SmaI und KpnI verdaut und ein SmaI-KpnI-Fragment mit ungefähr 4150 bp wurde durch 0,8% Agarosegelelektrophorese isoliert. Außerdem wurde pNZ98' auch mit SmaI und AvaII verdaut und ein SmaI-AvaII-Fragment mit ungefähr 650 bp wurde durch 1,5% Agarosegelelektrophorese isoliert. Diese beiden Fragmente wurden gemischt und nach der Modifizierung von klebrigen Enden zu glatten Enden durch DNA-Polymerase wurden sie durch Ligase ligiert, gefolgt von der Transformation des kompetenten E.-coli-Stamms TG1. Ein Plasmid wurde aus Kolonien hergestellt, die auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium wuchsen. Das Plasmid, das erneut mit dem Restriktionsenzym SmaI gespalten werden konnte, wurde selektiert und dieses Plasmid wurde pNZ98 genannt.
Bezugsbeispiel 6. Herstellung des Hybridplasmids pNZ87, umfassend einen Promotor und die verknüpfte HN-Gen-DNA des NDV unter seiner Kontrolle aus dem Hybridphagen mp10-HN180
pNZ76 wurde mit BamHI verdaut und ein Fragment mit ungefähr 2,9 Kbp, das kein β-Galactosidasegen enthielt, wurde durch 0,8% Agarosegelelektrophorese isoliert. Zum anderen wurde nach dem Verdauen des Hybridphagen mp10-HN180 mit BgIII und BamHI ein HN-Gen-DNA-Fragment mit ungefähr 1,8 Kbp durch 0,8% Agarosegelelektrophorese isoliert. Beide wurden mit Ligase ligiert, der kompetente E.-coli-Stamm TG-1 wurde mit dem sich daraus ergebenden Plasmid transformiert, das Plasmid wurde gemäß herkömmlichen Verfahren extrahiert und das das HN-Gen enthaltende Hybridplasmid wurde nachgewiesen. Dieses Hybridplasmid wurde pNZ87 genannt.
Bezugsbeispiel 7. Konstruktion des Akzeptorplasmids pNZ6929Sfi (siehe 9)
Nach dem teilweisen Verdauen des Plasmids pNZ98 (ein Plasmid mit dem F-Antigen-Gen mit Ursprung aus dem in Bezugsbeispiel 5 beschrieben Virus der Newcastle-Krankheit) mit SacI wurde es mit BamHI weiter teilverdaut, um ein Fragment mit ungefähr 1,9 Kbp zu isolieren. Zum anderen wurde nach dem Verdauen des Plasmids pNZ1829R mit BamHI weiter mit SacI teilverdaut, gefolgt vom Inserieren des vorstehend angeführten BamHI-SacI-DNA-Fragments mit 1,9 Kbp, um das Zielplasmid pNZ5929 aufzubauen.
Das angelagerte Produkt der beiden in SEQ ID Nr. 25 und SEQ ID Nr. 26 (5'-GATCCAGCATG-3'(SEQ ID Nr. 25) und 5'-GTCCATGCTG-3'(SEQ ID Nr. 26)) be schriebenen synthetischen DNAs wurde dem großen Fragment, das durch Spalten des Plasmids pNZ87 (Plasmid mit dem HN-Antigen-Gen mit Ursprung aus dem in Bezugsbeispiel 6 beschrieben Virus der Newcastle-Krankheit) mit HindIII erhalten wurde, und dem Fragment mit 95 bp zugefügt, das durch Verdauen des Plasmids pNZ1829R mit HindIII und BamHI erhalten wurde, um das Plasmid pNZ2929R aufzubauen. Nach dem Spalten dieses Plasmids pNZ2929R mit HindIII wurde es mit BamHI unter Erhalten eines Fragments mit ungefähr 1,9 Kbp teilverdaut. Nach dem Glätten der Enden dieses Fragments mittels des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase wurde es in das mit SmaI verdaute Plasmid pNZ5929 unter Erhalten des Akzeptorplasmids pNZ6929Sfi inseriert.
Bezugsbeispiel 8. Konstruktion des Akzeptorplasmids pNZ1829R (siehe 10)
Das Plasmid pNZ1729R (Yanagida et al., J. Virol. 66, 1402–1408, 1992) wurde mit EcoRI und SacI verdaut und ein eine SfiI-Stelle enthaltender synthetischer Adapter, an die zwei in SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28 (5'-AATTCGGCCGGGGGGGCCAGCT-3' (SEQ ID Nr. 27) und 5'-GGCCCCCCCGGCCG-3'(SEQ ID Nr. 28)) angelagert waren, wurde an dieser Stelle zum Aufbauen des Plasmids pNZ1829R inseriert.
SEQUENZLISTE

Claims

DNA-Molekül, das ein Polypeptid codiert, welches die in SEQ ID Nr. 2 beschriebene Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die eine Homologie von wenigstens 80% Identität mit dieser Aminosäuresequenz hat, aufweist und die Immunogenität von infektiösem Laryngotracheitis-Virus besitzt.
Rekombinantes DNA-Molekül, das die DNA gemäß Anspruch 1 sowie die DNA-Sequenz, die für das gB-Gen von infektiösem Laryngotracheitis-Virus codiert, enthält.
Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz eines DNA-Moleküls gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Rekombinantes Virus, das ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2 aufweist, welches in einen Bereich seiner DNA eingefügt ist, der für die Fortpflanzung nicht essentiell ist.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 4, das Geflügel infiziert.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 4, bei dem es sich um ein Vogelpocken- oder Geflügelpockenvirus handelt.
Impfstoff für infektiöses Laryngotracheitis-Virus, der ein rekombinantes Virus gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst.
Verwendung eines rekombinanten Virus gemäß Anspruch 5 oder 6 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verwendung bei der Immunisierung von Geflügel.