AT400955B

AT400955B - Rekombinantes pockenvirus-wirtsselektionssystem

Info

Publication number: AT400955B
Application number: AT0902490A
Authority: AT
Inventors: Enzo Paoletti
Original assignee: Health Research Inc
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1996-05-28
Also published as: DE4090351T1; DK157091A; GB2245272A; IT1239987B; CH682669A5; ATA902490A; JP3044062B2; US5453364A; LU88000A1; NL9020389A; CA2011654A1; IE900814L; GB2245272B; WO1990010693A1; IT9019623A0; JPH04503904A; AU5332090A; BE1004212A5; IE62441B1; DK157091D0

Description

AT 400 955 B

Die Erfindung betrifft modifizierte rekombinante Viren, Verfahren zur Expression von Genprodukten in Wirtsorganismen unter der Verwendung solcher modifizierten rekombinanten Viren und Vakzine, die solche modifizierten rekombinanten Viren umfassen.

Die Erfindung betrifft ebenfalls modifiziertes Pockenvirus, insbesondere modifiziertes Vaccinia-Virus, und Verfahren zur Herstellung und Selektion desselben. Spezifischer betrifft die Erfindung ein Selektionssystem zur Clonierung und Expression von offenem Leserahmen in einen rekombinanten Pockenvirus, bevorzugt in einen rekombinanten Vaccinia-Virus.

In der Anmeldung wird durch arabische Ziffern in Klammern auf eine Reihe von Publikationen Bezug genommen. Diese Druckschriften werden am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen voll zitiert. Diese Druckschriften beschreiben den Stand der Technik, auf den sich die Anmeldung bezieht.

Vaccinia-Virus und in jüngerer Zeit andere Pockenviren sind zur Insertion und Expression fremder Gene verwendet worden. In die Basistechnik zur Insertion fremder Gene in ein lebendes infektiöses Pockenvirus ist die Rekombination zwischen Pocken-DNA-Sequenzen, die ein fremdes genetisches Element in einem Donor-Plasmid und den im Rettungs-Pockenvirus homologen Sequenzen involviert (32).

Genauer gesagt, werden die rekombinanten Pockenviren in zwei Schritten konstruiert, die im Stand der Technik bekannt und analog zu den Verfahren zur Erzeugung synthetischer Rekombinanter des Vaccinia-Virus sind, die beschrieben sind im US-Patent 4,603,112, auf dessen Offenbarungsgehalt hier Bezug genommen wird.

Zuerst wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus inseriert werden soll, bevorzugt ein offener Leserahmen aus einer Nicht-Pocken-Quelle, in eine E. coli-Plasmid-Konstruktion gebracht, in die DNA inseriert worden war, die homolog zu einem Abschnitt nicht essentieller DNA des Pockenvirus ist. Davon getrennt wird die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, mit einem Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbindung liegt so in der Plasmid-Konstruktion, daß sie an beiden Enden von DNA flankiert wird, die homolog mit einer DNA-Sequenz ist, die einen nicht essentiellen Bereich von Pocken-DNA flankiert. Die resultierende Plasmid-Konstruktion wird dann durch Wachstum in E. coli-Bakterien vermehrt (4) und isoliert (5, 22).

Zweitens wird eine Zellkultur, z.B. Hühnerembryofibroblasten, mit dem isolierten Plasmid, das die zu inserierende DNA-Sequenz enthält, zusammen mit dem Pockenvirus transfiziert. Rekombination zwischen homologer Pocken-DNA im Plasmid und dem viralen Genom ergibt ein Pockenvirus, das durch das Vorhandensein fremder DNA-Sequenzen in einem nicht essentiellen Bereich seines Genoms modifiziert ist. Der Begriff "fremde" DNA bezeichnet exogene DNA, bevorzugt DNA aus einer Nicht-Pocken-Quelle, die Genprodukte codiert, die normalerweise von dem Genom, in das die exogene DNA gebracht wurde, nicht produziert wird.

Genetische Rekombination ist im allgemeinen der Austausch von homologen DNA-Abschnitten zwischen zwei DNA-Strängen. In gewissen Viren kann die DNA durch RNA ersetzt sein. Homologe Nucleinsäu-rebereiche sind Nucleinsäure- (DNA- oder RNA-) Bereiche, die die gleiche Sequenz von Nucleotidbasen aufweisen.

Genetische Rekombination kann natürlicherweise während der Replikation oder der Herstellung neuer viraler Genome in einer infizierten Wirtszelle stattfinden. Somit kann die genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus Vorkommen, der in einer Zelle stattfindet, die mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Viren oder anderen genetischen Konstruktionen co-infiziert ist. Ein DNA-Bereich des ersten Genoms wird austauschbar zum Konstruieren des Genom-Abschnittes eines zweiten co-infizierenden Virus verwendet, in dem die DNA homolog zu der des ersten viralen Genoms ist.

Rekombination kann aber auch zwischen DNA-Bereichen in unterschiedlichen Genomen stattfinden, die keine perfekte Homologie aufweisen. Wenn ein solcher Abschnitt aus einem ersten Genom homolog mit einem Abschnitt aus einem anderen Genom ist, außer daß im ersten Abschnitt beispielsweise ein genetischer Marker oder ein Gen, das eine antigene Determinante codiert, vorhanden und in einen Teil der homologen DNA inseriert ist, kann Rekombination noch stattfinden, und die Produkte dieser Rekombination lassen sich durch Vorhandensein dieses genetischen Markers oder Gens im rekombinanten viralen Genom nachweisen.

Eine erfolgreiche Expression der inserierten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus erfordert zwei Bedingungen. Erstens muß die Insertion in einen nicht essentiellen Bereich des Virus erfolgen, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Bedingung zur Expression der inserierten DNA ist das Vorhandensein eines Promotors in einer geeigneten Beziehung zur inserierten DNA. Der Promotor muß so plaziert sein, daß er stromaufwärts der zu exprimierenden DNA-Sequenz liegt.

Eine ungestörte erfolgreiche Rekombination erfolgt mit einer Frequenz von ungefähr 0,1 %.

Eine Basis-Reihenuntersuchungs-Strategie zur Gewinnung der Viren, die durch eine erfolgreiche Rekombination modifiziert worden sind, schließt eine in situ Hybridisierung von rekombinanten auf Replikafil- 2

AT 400 955 B tern mit einer radioaktiv markierten, mit den inserierten Sequenzen homologen Sonde (26, 28) ein. Von einer Reihe von Modifikationen wurde berichtet, daß sie die Wirksamkeit der Rekombination selbst erhöhen oder die Identifikation von Rekombinanten erleichtern. Unter diesen Modifikationen sind eingeschlossen: Verwendung einzelsträngiger Donor-DNA (38); die Identifikation von Rekombinanten, die einzig vorkommende enzymatische Funktionen exprimieren, wie den 125Joddesoxycytidin-Einbau in DNA mittels der Expression der Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (28); chromogene Substrate zur (Co-)Expression fremder Gene zusammen mit 0-Galaktosidase (3, 29); Selektion auf Thymidinkinase-Expression (20, 28); auf Antikörper beruhende Reaktionen zur Sichtbarmachung von rekombinanten Plaques (21); Verwendung von bedingt letalen ts- oder Wirkstoff-Mutanten (9, 18); Auslese von Rekombinanten unter Verwendung des Neomycin-Resistenz-Gens von Tn5 und des Antibiotikums G418 (11); oder Selektionsdruck mit Mycophe-nolsäure und dem E. coli gpt-Gen (2, 8).

Unvorteilhafterweise ist all diesen bekannten Methoden zum Identifizieren oder Selektionieren von rekombinanten Pockenviren eine mühsame aus vielen Schritten bestehende Identifizierung der Rekombinanten zu eigen, die Einführung von Radiochemikalien, chromogene Substrate, für die Selektion nützliche Biochemikalien wie Mycophenolsäure und Bromdesoxyuridin, die für das virale Genom selbst schädlich (mutagen) sein können, die Verwendung von virologischen Reagenzien, die Kontaminationen einführen können und typischerweise die Gegenwart eines exogenen Gens in der End-Rekombinanten zusätzlich zum interessierenden fremden genetischen Element. Es ist daher verständlich, daß die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung und Selektionierung von Pockenvirus-Rekombinanten, bevorzugt Vaccinia-Rekombinanten, das die vorstehend diskutierten Probleme vermeidet, einen sehr erwünschten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellen würde.

Im Stand der Technik sind Verfahren entwickelt worden, die die Schaffung von rekombinanten Vaccinia-Viren und Vogelpocken-Viren durch die Insertion von DNA erlauben, die aus irgendeiner Quelle (z.B. viral, prokaryontisch, eukaryontisch, synthetisch) stammt, in einen nicht essentiellen Bereich des Vaccinia- oder Vogelpocken-Genoms, einschließlich von DNA-Sequenzen, die die antigenen Determinanten eines pathogenen Organismus codieren. Durch diese Verfahren geschaffene rekombinante Vaccinia-Viren sind verwendet worden, um in Säugetieren eine spezifische Immunität gegen eine Reihe von Säugetierpathogenen zu induzieren. Dies alles wird im US-Patent 4,603,112, auf dessen Offenbarungsgehalt hier Bezug genommen wird, beschrieben. Mit diesen Verfahren geschaffene rekombinante Vogelpocken-Viren sind verwendet worden, um in Vogelarten (21) und in Nicht-Vogelarten (42) eine spezifische Immunität zu induzieren.

Das unmodifizierte Vaccinia-Virus weist eine lange Geschichte eines relativ sicheren und wirksamen Gebrauchs zur Inokulation gegen Pocken auf. Vor der Ausrottung der Pocken gab es aber bei einer weit verbreiteten Verabreichung von unmodifizierten Vaccinia ein mäßiges, aber echtes Risiko einer Komplikation in Form einer generalisierten Vaccinia-Infektion, besonders bei denen, die unter Ekzem- oder Immunsuppression litten. Eine andere seltene, aber mögliche Komplikation, die sich aus einer Vaccinia-Inokulation ergeben kann, ist eine Nach-Vakzinierungs-Enzephalitis. Die meisten dieser Reaktionen ergaben sich aus der Inokulation von Individuen mit Hauterkrankungen, wie Ekzemen, oder mit einem geschwächten Immunsystem oder von Individuen in Haushalten mit anderen, die Ekzeme oder geschwächte Immunreaktionen hatten. Vaccinia ist ein lebendes Virus und ist normalerweise für gesunde Individuen harmlos. Es kann jedoch von einem Individuum auf das andere einige Wochen lang nach der Inokulation übertragen werden. Wenn ein Individuum mit einer Schwäche der normalen Immunantwort entweder durch Inokulation oder durch ansteckende Übertragung von einem kürzlich inokulierten Individuum infiziert wird, kann das ernsthafte Konsequenzen haben.

Geeignete modifizierte Virusmutanten mit einer eingeschränkten Replikation des Virus im Wirtsorganismus, die exogene Gene tragen, die in einem Wirtsorganismus als antigene Determinanten exprimiert werden, die die Produktion von Antikörpern gegen ein Wirtspathogen durch den Wirtsorganismus hervorru-fen, stellen neue Vakzine dar, die die Nachteile der herkömlichen Vakzine vermeiden, die abgetötete oder attenuierte lebende Organismen verwenden. Somit benötigt z.B. die Herstellung von Vakzinen aus abgetöteten Organismen das Züchten von großen Mengen von Organismen mit einer anschließenden Behandlung, die selektiv deren Infektiosität zerstört, ohne ihre Antigenität zu beeinflussen. Andererseits besteht bei Vakzinen, die attenuierte lebende Organismen enthalten, die Möglichkeit einer Reversion des attenuierten Organismus in einen pathogenen Zustand. Im Gegensatz dazu wird die Möglichkeit einer Reversion zu einem pathogenen Organismus vermieden, wenn man ein auf geeignete Weise modifiziertes rekombinantes Pockenvirus als Vakzin verwendet, da das Pockenvirus nur das Gen enthält, das die antigene Determinante des krankheitserregenden Organismus Codiert und nicht diejenigen genetischen Anteile des Organismus, die für die Replikation des Pathogens verantwortlich sind.

Es ist daher verständlich, daß ein Verfahren, das dem Stand der Technik die Vorteile einer Lebend-Virus-Inokulation hinzufügt, das aber die vorstehend diskutierten Probleme vermindert oder eliminiert, eine 3

AT 400 955 B höchst erwünschten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellt. Dies ist heutzutage mit dem Auftreten der als "acquired immune deficiency syndrome” (AIDS) bekannten Erkrankung noch wichtiger geworden. Opfer dieser Krankheit leiden unter einer schweren immunologischen Funktionsunfähigkeit und können leicht durch eine sonst sichere Lebend-Virus-Präparation geschädigt werden, wenn sie mit solch einem Virus entweder direkt oder über den Kontakt mit einer Person in Kontakt kommen, die kürzlich mit einem Vakzin immunisiert wurde, das solch einen Lebend-Virus enthält.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, zur Induktion einer Immunantwort in einem Wirtsorganismus ein Vakzin bereitzustellen, das die Vorteile eines Lebend-Virus-Vakzins aufweist, und das wenige oder keine der vorstehend aufgezähiten Nachteile eines Lebend-Virus-Vakzins oder eines Vakzins aus abgetöteten Viren aufweist.

Es ist eine zweite Aufgabe der Erfindung, modifzierte rekombinante Viren zur Verwendung in solchen Vakzinen bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen für die Expression eines Genproduktes in einem Wirtsorganismus durch das Inokulieren des Wirtsorganismus mit einem modifizierten rekombinanten Virus, das das Genprodukt im Wirtsorganismus codiert und exprimiert, wobei das Virus im Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist.

Es ist ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen für das Exprimieren eines Genproduktes in einer in vitro kultivierten Zelle, wobei das Verfahren die Einführung eines modifizierten rekombinanten Virus, das eine das Genprodukt codierende und exprimierende DNA enthält, in die Zelle umfaßt, wobei die Replikation des Virus in der Zelle eingeschränkt ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, modifizierte rekombinante Viren bereitzustellen, die in einem Wirtsorganismus mit einer eingeschränkten Replikation der Viren im Wirtsorganismus Genprodukte exprimieren, und ein Verfahren zur Herstellung solcher modifizierten rekombinanten Viren bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine schnelle Identifizierung in einem Schritt von rekombin-anten Viren und eine schnelle Reihenuntersuchung auf die Expression von fremden offenen Leserahmen in den Rekombinanten bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung und zum Selektionieren eines rekombinanten Pockenvirus, bevorzugt eines rekombinanten Vaccinia-Virus, und DNA-Sequenzen bereitzustellen, die in dem Verfahren produziert werden oder als Zwischenprodukte eine Rolle spielen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Selektionssystems zum Clonieren und Exprimieren eines offenen Leserahmens im rekombinanten Pockenvirus, bevorzugt im rekombinanten Vaccinia-Virus, wobei das rekombinante Virus außer dem interessierenden offenen Leserahmen kein anderes fremdes Gen enthält.

Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden ohne weiteres nach der Betrachtung des Nachfolgenden deutlich.

Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein modifiziertes rekombinantes Virus, bei dem Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus in einem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation hat, wobei das modifizierte rekombinante Virus eine in dem Wirtsorganismus ein Genprodukt codierende und exprimierende DNA enthält, wobei das Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Das erfindungsgemäße Virus ist vorteilhaft ein Pockenvirus, bevorzugt ein Vaccinia-Virus.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Expression eines Genproduktes in einem Wirtsorganismus durch Inokulieren des Wirtsorganismus mit einem modifizierten rekombinanten Virus, bei dem Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Das modifizierte rekombinante Virus enthält DNA, die in dem Wirtsorganismus das Genprodukt codiert und exprimiert, sogar unter eingeschränkter Replikation des Virus im Wirtsorganismus. Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Virus ist vorteilhaft ein Pockenvirus, bevorzugt ein Vaccinia-Virus. Das im Wirtsorganismus exprimierte Genprodukt ist vorteilhaft ein Antigen. Bevorzugter ist der Wirtsorganismus ein Vertebrat und das Antigen induziert in dem Vertebraten eine Immunantwort.

Unter noch einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Vakzin zur Induktion einer Immunantwort in einem mit dem Vakzin inokulierten Wirtsorganismus, wobei das Vakzin einen Träger und ein modifiziertes rekombinantes Virus einschließt, bei dem Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus im Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Das modifizierte rekombinante Virus enthält DNA, die ein Genprodukt codiert und im Wirt exprimiert, sogar mit der im Wirtsorganismus eingeschränkten Replikation des Virus. Das im erfindungsgemäßen Vakzin verwendete Virus ist vorteilhaft ein Pockenvirus, bevorzugt ein Vaccinia-Virus.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines rekombinanten Pockenvirus in einem Wirtsorganismus durch das Kombinieren einer Donor-DNA und eines modifi- 4

AT 400 955 B zierten Pockenvirus zur Bildung eines rekombinanten Pockenvirus und durch das Identifizieren des rekombinanten Pockenvirus aufgrund seiner Fähigkeit, in dem Wirtsorganismus zu replizieren.

Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Clonieren und Exprimieren eines offenen Leserahmens in einem rekombinanten Pockenvirus in einem Wirtsorganismus durch das Kombinieren von Donor-DNA und einem modifizierten Pockenvirus zur Bildung eines rekombinanten Pockenvirus, durch Replizieren des rekombinanten Pockenvirus im Wirtsorganismus und durch Exprimieren des offenen Leserahmens. Beim modifizierten Pockenvirus ist erfindungsgemäß ein Wirtsbereichsgen deletiert, so daß das modifizierte Pockenvirus im Wirtsorganismus nicht repliziert; die Donor-DNA enthält einen offenen Leserahmen aus einer Nicht-Pocken-Quelle und das Wirtsbereichsgen, das dem rekombinanten Pockenvirus erlaubt, im Wirtsorganismus zu replizieren.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Donorplasmid zur Herstellung des rekombinanten Pockenvirus des Selektionssystems. Das Donor-Plasmid enthält einen offenen Leserahmen aus einer Nicht-Pocken-Quelle und ein Wirtsbereichsgen, das dem rekombinanten Pockenvirus erlaubt, in der Wirtszelle zu replizieren. Vorteilhafterweise kann das Donor-Plasmid auch einen Promotor stromaufwärts des Pockenvirus-Wirtsbereichsgens, ein Translations-Initiations-Codon stromabwärts des Promotors, sich anschließende, einzig vorkommende multiple Restriktionsstellen, Translations-Terminations-Signalsequenzen und eine frühe Transkriptions-Terminations-Signalsequenz enthalten.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die beiliegenden Zeichnungen verwiesen, in denen:

Fig. 1A schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Vaccinia-Virus-Deletion/Rekombinante vP293 zeigt;

Fig. 1B eine Karte des linken Endes des Rettungs-Vaccinia-Virus VTK~79 bis Hindill K darstellt:

Fig. IC eine Karte des linken Endes der Vaccinia-Virus-Deletion.Rekombinante vP293 bis Hindlll K darstellt;

Fig. 2A schematisch ein Verfahren zur Clonierung des Wirtsbereichsgens K1L in das Plasmid pMP528L und seine Insertion in vP293 zur Erzeugung des Vaccinia-Virus vP457 zeigt;

Fig. 2B eine Karte des linken Endes von vP293 bis Hindlll K darstellt;

Fig. 2C eine Karte des linken Endes von vP457 bis Hindlll K zeigt;

Fig. 3A schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pMP528HRH und pHES1-4 zeigt;

Fig. 3B die in pMP528HRH vorhandene Sequenz des synthetischen H6-Promotors und stromabwärts liegende Restriktionsstellen zeigt;

Fig. 3C die DNA-Sequenz (mit Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühem Transkriptions-Terminationssignal), die die Sequenz in Klammern im Plasmid pHES1 von Fig. 3B ersetzt, zeigt;

Fig. 3D die DNA-Sequenz (mit Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühem Transkriptions-Terminationssignal), die die Sequenz in Klammern im Plasmid PHES2 von Fig. 3B ersetzt, zeigt;

Fig. 3E die DNA-Sequenz (mit Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühem Transkriptions-Terminationssignal), die die Sequenz in Klammern im Plasmid PHES3 von Fig. 3B ersetzt, zeigt;

Fig. 3F die DNA-Sequenz (mit Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühem Transkriptions-Terminationssignal), die die Sequenz in Klammern im Plasmid PHES4 von Fig. 3B ersetzt, zeigt;

Fig. 4A schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide PHES31-34 zeigt;

Fig. 4B die DNA-Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide HRL15-22 zeigt;

Fig. 5 die DNA-Sequenz des in den Plasmiden pHES31-34 vorhandenen Vaccinia u-Promotors zeigt. Zusätzlich zeigt Fig. 5 in der in Klammern gesetzten Sequenz die in pHES31-34 vorhandenen Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühe Transkriptions-Terminationssignale und die in pHES31-33 vorhandenen Initiations-Codons.

Fig 6A schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pHES61-64 zeigt;

Fig. 6B die DNA-Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide HRL33-40 zeigt;

Fig. 7 die DNA-Sequenz des in den Plasmiden pHES61-64 vorhandenen synthetischen ATI-Promo-tors zeigt. Zusätzlich zeigt Fig. 7 in der in Klammern gesetzten Sequenz die in pHES61-64 vorhandenen Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühen Transkriptions-Terminationssignale und die Initiations-Codons, die in pHES61-63 vorhanden sind;

Fig. 8 die DNA-Sequenz (mit Restriktionsstellen) von 15537 bp, die nahe des linken Endes des Vaccinia-Stammes Copenhagen liegen, zeigt;

Fig. 9 schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Rekombinanten vP548 und vP661 zeigt;

Fig. 10 eine Karte des linken Endes des Vaccinia-Virus-Genoms darstellt;

Fig. 11 schematisch ein Verfahren zum Testen der potentiellen Vaccinia-Wirtsbereichsgene im vP293-System zeigt;

Fig. 12 schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Rekombinanten vP665, vP683, vP706 und 5 5 70 75 20 25 30 35 40 45

SO

AT 400 955 B vP716 zeigt; Fig. 13 schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pCP3 und pCP5 und zum Testen eines potentiellen Kuhpocken-Wirtsbereichsgens im Vaccinia-System zeigt; Fig. 14 schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Rekombinanten vP664 und vP668 zeigt; Fig. 15 schematisch ein Verfahren zur Konstruktion einer Serie von aus pMPCTKIA abgeleiteten Plasmiden zeigt; Fig. 16 die DNA-Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide MPSYN238, MPSYN239, MPSYN250-255 und MPSYN271-274 zeigt; Fig. 17 die synthetische DNA-Sequenz, die die in den Plasmiden pMPCS-1 und pMPCS-4 vorhandenen Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühe Transkriptions-Terminationssignale enthält, zeigt. Zusätzlich zeigt Fig. 17 den im pCOPCS-3H und pCOPCS-5H bis pCOPCS-lOH vorhandenen synthetischen H6-Promotorbereich. Zusätzlich zeigt Fig. 17 in der in Klammern gesetzten Sequenz die in pCOPCS-3H und pCOPCS-5H bis pCOPCS-10H vorhandenen Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühen Transkriptions-Terminationssignale und die im pCOPCS-6H bis pCOPCS-10H vorhandenen Initiations-Codons; Fig. 18 schematisch ein Verfahren zur Herstellung der Plasmide pMPLENDA und pMPRENDA zeigt; Fig. 19 die 13978 bp DNA-Sequenz von Hindlll C des Genoms des Vaccinia-Virus Copenhagen, die links der in Fig. 8 dargestellten Sequenz liegende codierenden Sequenzen einschließt, zeigt; Fig. 20 die vollständige DNA-Sequenz für Hindlll F, das unmittelbar rechts von Hindlll K in Fig. 8 liegt, zeigt; Fig. 21 die in Hindlll ß nahe des rechten Terminus des Vaccinia-Virus Genoms enthaltene DNA-Sequenz zeigt. Die Erfindung betrifft modifizierte rekombinante Viren, bei denen Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus im Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist, und die DNA enthalten, die in dem Wirtsorganismus ein Genprodukt codiert und exprimiert, wobei ein Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Selektionssystem für Pockenvirus-Rekombinanten, vorzugsweise Vaccinia-Rekombinanten und für die Clonierung und Expression eines offenen Leserahmens im Pockenvirus, bevorzugt Vaccinia-Virus, unter Verwendung einer bedingt letalen Wirtsbereichs-Mutanten des Pockenvirus. Wirtsbereichs-Mutanten von Kaninchen-Pockenvirus (24, 13) und Vaccinia-Virus (6, 7, 12, 17, 23, 36) sind bekannt. Von Wirtsbereichs-Mutanten des Kaninchen-Pockenvirus glaubt man, daß bei ihnen einige Kontrollfunk-tionen, die zur Virus-Replikation benötigt werden, defekt sind (10). Eine anschließende genomische Untersuchung dieser Kaninchen-Pockenvirus-Mutanten zeigte ausgedehnte terminale Deletionen (bis zu 30 kb) der DNA (19, 25). Mutagenese des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen mit salpetriger Säure erlaubte Drillien et al. (6), eine in der Replikation in den meisten menschlichen Zellen defekte Wirtsbereichs-Mutante zu isolieren. Eine genomische Analyse dieser Mutante ergab eine ausgedehnte Deletion von ca. 18 kb in Richtung auf den rechten Terminus hin (6). Eine zusätzliche Analyse durch Marker-Übertragungs-Studien kartierte die für den Wirtsbereich verantwortliche genetische Funktion auf einen 5,2 kb EcoRI-Fragment (14) und schließlich auf einem 855 bp offenen Leserahmen, der die Hindlll-Fragmente M/K (15) überlappte. Das Wirtsbereichsgen des WR-Stammes von Vaccinia-Virus (27. 30) liegt zwischen 24 und 25,2 kb vom linken Ende des Vaccinia-Genoms. Dieses Wirtsbereichsgen, das nach links von Hindlll K nach Hindlll M transkribiert wird, wird hier als K1L-Gen beschrieben, womit der von Rosel et al. (33) empfohlenen Nomenklatur gefolgt wird. Eine Wirtsbereichsgen-Deletionsmutante des Vaccinia-Stammes WR wurde durch die Insertion des Neomycinresistenz-Gens aus dem Transposon Tn5 und die Selektion mit dem Antibiotikum G418 erzeugt. Dieser Deletion/Rekombinante, vP293, fehlen ungefähr 21,7 kb DNA, beginnend 3,8 kb vom linken Ende des Genoms. vP293 ist zur Plaquebildung auf primären Hühnerembryofibroblasten (CEF), zwei Affenzelli-nien (BSC-40 oder VERO) in der Lage, ist aber bezüglich der Replikation in der menschlichen MRC-5-Zellinie unvollständig. Die Insertion des Wirtsbereichsgens, K1L. in vP293 stellt die Fähigkeit, auf MRC-5-Zellen zu wachsen, wieder her. Eine Reihe von Plasmiden wurden konstruiert, die zusätzlich zum K1 L-Wirtsbereichsgen einen frühenspäten Vaccinia Promotor, H6, enthalten, dem bevorzugt einzig vorkommende Polylinkersequenz-Multiclonierungsrestriktionsstellen. Translations-Initiations- und Terminations-Codons und ein frühes Transkriptions-Terminationssignal folgen. Diese Plasmide, pMP528HRH und pHESl-4. erlauben in einem Schritt die schnelle Clonierung und Expression irgendeines offenen Leserahmens, wenn er mit vP293 rekombiniert 6 55

AT 400 955 B und Wachstum auf MRC-5-Zellen gefunden wird.

Die Insertion eines fremden offenen Leserahmens in diese Plasmide mit einer anschließenden Rekombination mit vP293 stellt simultan die Wirtsbereichs-Funktion (K1L-Gen) wieder her und führt den fremden offenen Leserahmen in das Rettungs-Virus vP293 ein. Die rekombinaten Viren werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf MRC-5-Zellen Plaques zu bilden.

Zu den Vorteilen dieses Systems gehört die Abwesenheit jeglicher exogener Nicht-Vaccinia-Gene in der Endrekombinanten, abgesehen vom interessierenden genetischen Element, das Fehlen genetischer Reversion des Virus, da vP293 eine Deletionsmutante von K1L ist, und die schnelle Identifizierung von Rekombinanten in einem Schritt. Dieser Einzelschritt läßt sich auch für eine schnelle Reihenuntersuchung der Expression fremder Gene, z.B. zum Kartieren von Epitopen, verwenden.

Es wurden zusätzliche Plasmide konstruiert, die das K1 L-Wirtsbereichsgen enthalten, wo der frü-he/späte Promotor, H6, durch einen streng frühen oder einen streng späten Vaccinia-Promotor ersetzt ist. Mit solchen zusätzlichen Plasmiden lassen sich die Feinheiten der zeitlichen Regulation der Expression fremder genetischer Elemente studieren.

Die erfindungsgemäßen wirtsbereichseingeschränkten Systeme werden vorteilhaft in Vakzinen für die Induktion einer Immunantwort in Wirtsorganismen, die mit dem Vakzin inokuliert sind, verwendet. In diesem Zusammenhang umfaßt das Vakzin einen Träger und ein modifiziertes rekombinantes Virus. Bei dem modifizierten rekombinanten Virus sind Wirtsbereichsgene deletiert, so daß das Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Zusätzlich enthält das modifizierte rekombinante Virus DNA, die in dem Wirtsorganismus ein Genprodukt codiert und exprimiert, wobei ein Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist. Es sind modifizierte rekombinante Viren mit einer eingeschränkten Replikation des Virus, die durch eine Deletion der Wirtsbereichsgene des Virus verursacht ist, konstruiert worden, die Genprodukte, insbesondere Antigene, exprimieren. In einer Ausführungsform ist der Wirtsorganismus ein Vertebrat, und das Antigen induziert eine Immunantwort in dem Vertebraten. In einer anderen Ausführungsform ist der Wirt eine in vitro kultivierte Zelle.

Es läßt sich leicht einsehen, daß sich zusätzlich zu den in dieser Anmeldung zitierten Viren und Arten noch weitere mit Wirtsbereichs-Restriktion finden lassen. Ferner läßt sich leicht einsehen, daß im Pockenvirus weitere "Wirtsbereichsgene" existieren. Ferner läßt sich leicht einsehen, daß sich eine Reihe fremder Gene in diesen Wirtsbereichs-Mutanten verwenden lassen.

Ein besseres Verständnis der Erfindung und ihrer vielen Vorteile erhält man durch die folgenden Beispiele, die zur Erläuterung angegeben sind. ln einigen dieser Beispiele wurde der Vaccinia-Virus WR-Stamm verwendet. Sein Ursprung und die Bedingungen für seine Züchtung sind früher bereits beschrieben worden (27). In einigen dieser Beispiele wurde der Vaccinia-Virus-Stamm Copenhagen verwendet. Sein Ursprung und Bedingungen für seine Züchtung sind früher bereits beschrieben worden (50). Primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF), Affenzelli-nien (VERO [ATCC Nr. CCL81] und BSC40) und die menschliche Zellinie MRC-5 (ATCC Nr. CCL171) wurden in die notwendigen Bestandteile enthaltendem Eagle’s Minimalmedium (MEM), das (bei VERO und BSC40) 5 % oder (bei MRC-5, CEF) 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, gezüchtet.

Die Plasmide wurden nach Standardverfahren konstruiert, durchgesehen und gezüchtet (22, 31, 32).

Beispiel 1

Konstruktion des Plasmids pMP528PiN und die Erzeugung von vP293

Mit Bezug auf Fig. 1A wurde ein EcoRI/Sall-Fragment, das die letzten 3,8 kb der Vaccinia-DNA enthielt, aus pAG5 (30) isoliert und in zuvor mit EcoRI und Sali gespaltenes pUC13 inseriert. Das resultierende Plasmid pMP5 wurde mit Hindill und Sali gespalten und mit einem 3,8 Hindlll/Sall-Fragment, das die mit dem rechten Ende des Vaccinia Hindlll-Fragmentes K korrespondierenden Sequenzen enthielt. Das resultierende Plasmid pMP528 enthält somit die 3,8 kb des linken Terminus des Vaccinia-Genoms und 3,8 kb vom rechten Ende des Hindill K-Fragmentes, womit die 21,7 kb zwischen den Sall-Stellen bei 3,8 und 25,5 kb vom linken Ende des Genoms deletiert sind. Die alleinige Sajl-Stelle in pMP528 wurde durch das Zufügen von synthetischen Linkern (im Handel erhältlich von Collaborative Research, Inc., Bedford, Mass.) in eine Smal-Stelle umgewandelt, wodurch pMP528L hergestellt wurde. Ein 1,5 kb Smal-Fragment, das das Neomycin-Phosphor-Transferase-Gen vom Transposon Tn5 (1) enthielt, wurde aus pSV2-neo (35, ATCC Nr. 37149) isoliert und unter die Kontrolle des frühen Vaccinia-Promotors (hier mit Pi bezeichnet) gebracht.

Der Pi-Promotor aus dem Aval H-Bereich von Vaccinia ist in (37) beschrieben worden. Genauer gesagt, leitet sich dieser Promotor’ von dem Aval H (Xhol G)-Fragment der L-Variante des WR-Vaccinia-Stammes ab, in dem der Promotor die Transkription von rechts nach links steuert. Die Lage des Promotors ist 7

AT 400 955 B ungefähr 1,3 kb vom linken Ende von Aval H, ungefähr 12,5 kb vom linken Ende des Vaccinia-Genoms und ungefähr 8,5 kb links von der Hindill C/N-Verbindung. Die Position des Promotors war durch Standard-Transkriptionskarten-Analyse bestimmt worden. Die Pi-DNA-Sequenz korrespondiert mit dem Bereich stromaufwärts des offenen Leserahmens, der ein kürzlich beschriebenes 5 kDa glycin-reiches Protein (40) codiert. Es war gezeigt worden, daß dieses Promotorelement fremde Gene in Vaccinia-Rekombinanten frühzeitig nach der Infektion exprimiert (37).

Eine mit Smal endende Pi-Promotor/Neo-Gen-Kassette wurde in die Smal-Stelle von pMP528L ligiert, womit pMP528PiN hergestellt wurde. pMP528Pin enthält 0,4 kb von einem Sau3A Subclon von Aval H, das den Pi-Promotorbereich enthält, abgeleitete Sequenzen, an die sich 1 kb Tn5-Sequenzen von der Bgjll bis zur Smal-Stelle anschließen (1).

Primäre CEF wurden gemäß Standardverfahren (28) mit pMP528PiN transfiziert und mit dem Rettungs-Vaccinia-Virus VTK"79 co-infiziert. Das rekombinante Virus wurde ausgewählt und in Gegenwart von 300 ug/ml G418 auf primären CEF gezüchtet (1, 11, 35).

Die genomische Konfiguration des rekombinanten Vaccinia vP293 wurde durch "Southem-Blot"-Hybri-disierungsanalyse bestätigt. Wie vorausgesagt, sind in dem rekombinanten Vaccinia vP293 21,7 kb von Vaccinia entfernt worden, und es enthielt das fremde neor-codierende Gen. Die Restriktionskarte des linken Endes des Rettungs-Virus VTK~79 und des rekombinanten Virus vP293, das neor-Gen exprimiert und auf primären CEF in Gegenwart von G418 selektioniert worden war, sind in den Fig. 1B und 1C gezeigt.

Beim Fehlen des Antibiotikums G418 produzierte vP293 große Plaques auf primären CEF und ergab Plaques auf BSC40- oder VERO-Zellen, obwohl die vP293-Plaques auf VERO-Zellen erkennbar kleiner waren als die des Vorläufers VTK-79. Es ist bemerkenswert, daß vP293 keine meßbare Replikation zeigte und nicht in der Lage war, auf der menschlichen Zellinie MRC-5 Plaques zu bilden.

Beispiel 2

Rekonstruktion von vP293 mit dem Wirtsbereichsgen K1L

Zum Beweis dafür, daß das Wirtsbereichsgen K1L das Virus in die Lage versetzen würde, auf menschlichen Zellen zu replizieren, wenn es in die Deletionsmutante vP293 des Vaccinia-Stammes WR wieder eingesetzt wird, wurde das Wirtsbereichsgen K1L in das Plasmid pMP528L cloniert und in vP293 inseriert.

Bezugnehmend auf Fig. 2A wurde die den rechten Arm von pMP528L (Fig. 1A und 2A) zusammensetzende Vaccinia-DNA-Sequenz gekürzt, um nicht erwünschte Restriktionsstellen zu eliminieren und zukünftige Clonierungsschritte zu erleichtern. pMP528L wurde mit EcoRV/Hindlll gespalten, mit dem Klenow-Fragment der E. coli Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit sich selbst ligiert. In dieser Weise wurde der rechte Arm des resultierenden Plasmids pMP528E auf 0,4 kb DNA vermindert.

Ein 891 bp Vaccinia Bglll (partiell)/Hpal-Fragment, das die gesamte codierende Sequenz und den Promotor des K1L-Wirtsbereichsgens (15) enthielt, wurde aus pSD452VC, einem Subclon des Vaccinia-Stammes Copenhagen, der Sequenzen aus Hindill M und K enthielt, hergestellt. Das K1L enthaltende Fragment wurde nur deshalb in den Polylinkerbereich von pUC8 cloniert, um das Gen mit bequemen Restriktionsstellen an seinen Enden zu versehen. Zum Isolieren des K1L enthaltenden Fragments wurde das resultierende Plasmid pUC8HR mit Hindill und Smal gespalten. Das Hindlll-Ende wurde mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase aufgefüllt und das Fragment in die Smal-Stelle von pMP528E cloniert. Ein Plasmid pMP528HR mit der Orientierung des K1 L-Wirtsbereichsgens nach links, wie in Fig. 2 A gezeigt, wurde nach Standardverfahren isoliert.

Die Verfahren zur Rekombination und Hybridisierung auf Nitrozellulosefiltern waren die im Stand der Technik bekannten und wie früher in (28) beschriebenen, mit den folgenden Modifikationen:

Das Donor-Plasmid pMP528HR wurde entweder in VERO- oder MRC-5-Zellen, die beide mit vP293 co-infiziert wurden, durch Elektroporation eingeführt. Noch nicht konfluente Einzelschichten von VERO- oder MRC-5-Zellen wurden mit dem Rettungs-Virus eine Stunde infiziert. Die Zellen wurden mit Trypsin geerntet, mit Hepes gepufferter Salzlösung (HeBS) (16) gewaschen und in Gegenwart von 25 ug Plasmid-DNA in HeBS elektroporiert. Die Virus-infizierten Zellen wurden unter Verwendung eines Bio-Rad/Gene Pulsers, der mit einem Bio-Rad/Gene Pulser Capacitance Extender ausgerüstet war, elektroporiert. Die Zellsuspension wurde in einer Bio-Rad/Gene Pulser-Küvette 10 Minuten auf Eis gehalten, dann bei 200 V pulsierend behandelt (Kapazität 960 uFD) und weitere 10 Minuten auf Eis gehalten. Die Zellen wurden dann in 8 ml MEM + 5 % FBS verdünnt, auf 60 mm Platten, die korrespondierende VERO- oder MRC-5-Zell-Einzelschichten enthielten (4 ml pro Platte) ausplattiert und über Nacht bei 37* C inkubiert. 8

AT 400 955 B

Die Nachkommenschaft wurde geerntet und entweder auf VERO- oder MRC-5-Zellen plattiert. Die Anzahl der auf VERO-Zellen erhaltenen Plaques war zehn- bis hundertmal größer als die Anzahl der auf MRC-5-Zellen erhaltenen Plaques. Isolierte Plaques (mit gleicher Größe) wurden von MRC-5- und von VERO-Zellkulturen (sowohl große als auch kleine Plaques) genommen. Diese Plaque-Isolate wurden auf VERO-Zellen replattiert, und nach drei Tagen wurden die resultierenden Plaques auf Nitrozellulosefilterscheiben übertragen und für die in situ Hybridisierung (26) vorbereitet. Alle von MRC-5-Zellen stammenden Plaques und alle größeren, von VERO-Zellen stammenden Plaques, nicht aber die kleineren Plaques, ergaben positive Hybridisierungssignale, wenn sie mit einer ^P-markierten Sonde für Kl L-codierende Sequenzen untersucht wurden. Dieses Ergebnis ist mit der Wiederherstellung der Wirtsbereichs-Funktionen, die in der K1 L-codierenden Sequenz enthalten sind, konsistent.

Ein von MRC-5-Zellen erhaltenes Isolat wurde weiter gereinigt und mit vP457 bezeichnet. In vP457 war das K1L-Gen wiederhergestellt und befand sich in seiner nativen Orientierung mit der Leserichtung von rechts nach links in der Deletion. Wie in den Fig. 2B und 2C gezeigt, hatten die K1 L-Sequenzen die in vP293 vorhandene Pi-Promotor/Neomycin-Pho$phortransferasegen-Kassette ersetzt. Verglichen mit dem Genom der Vaccinia L-Variante (30, 27) enthält vP457 eine 291 bp-Deletion rechtsseitig des K1L-Gens und eine 20,2 kb Deletion linksseitig des K1L-Gens.

Beispiel 3

Konstruktion der Plasmide pMP528HRH und pHESl-4

Um zu zeigen, daß die bedingt letale Mutation in vP293 sich für die Konstruktion von Donor-Plasmiden, in die zusätzliche offene Leserahmen geclont werden können, ausnutzen läßt, wurde eine Reihe von Plasmiden pMP528HRH und pHESl-4, konstruiert. Rekombination von exogenen offenen Leserahmen, die in einem Plasmid vorhanden sind, das das K1 L-Wirtsbereichsgen enthält, in vP293, wurde ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von Vaccinia-Rekombinanten mittels Wirtsbereichs-Restriktion ergeben.

Ein Vaccinia-Promotor, H6, wurde stromaufwärts des K1L-Gens in pMP528HR hinzugefügt. Dieser frühe/späte Promotor war zuvor durch Standardtranskriptionskartierung und DNA-Sequenz-Analyse identifiziert worden. Er besitzt die Sequenz (Positionen -125 bis +3).

ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTA

AATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTA TCGTAATG.

Die Sequenz ist die von Rosel et al. (33) beschriebene, stromaufwärts des offenen Leserahmens H6 liegende Sequenz.

Bezugnehmend auf Fig. 3 wurde eine DNA-Sequenz chemisch synthetisiert, die mit den Positionen -124 bis -1 (wobei die Position -102 von A nach G verändert worden war, um die Einführung eines potentiellen Initiations-Codons zu verhindern) korrespondierte und an die sich die Restriktionsstellen Xhol, Kpnl und Smal anschließen (Fig. 3B) und in die Smal-Stelle von pMP528HR cloniert, womit pMP528HRH (Fig. 3A) hergestellt wurde. Somit enthält pMP528HRH den H6-Promotor stromaufwärts des K1L-Gens, das unter der Kontrolle des endogenen K1 L-Promotors exprimiert wird. Beide befinden sich in einer Rechts-nach-links-Orientierung bezüglich der Vaccinia-Arme (Genom). Der H6-Promotor in pMP528HRH befindet sich unmittelbar stromaufwärts der einzig vorkommenden Xhol, Kpnl- und Smal-Restriktionsstellen.

Um die Nützlichkeit des Systems weiter zu erhöhen, wurde eine Reihe von Plasmiden, pHES1-4, von pMP528HRH abgeleitet. pHES1 wurde nach dem folgenden Verfahren konstruiert: pMP525HRH wurde mit Xhol und Xmal gespalten, und die Oligonucleotide HRL1 5'(TCGACCATGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT)3' und HRL2 5’(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCATGG)3’ in diese Stelle cloniert. pHES2, pHES3 und pHES4 wurden in ähnlicher Weise konstruiert. pHES2 wurde mit den Oligonucleotiden HRL3 5'(TCGACCATGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT)3’ und HRL4 5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCATGG)3' konstruiert, pHES3 wurde mit den Oligonucleotiden HRL5 9

AT 400 955 B 5’(TCGACCATGGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT)3' und HRL6 5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCCATGG)3’ konstruiert, und pHES4 wurde mit den Oligonucleotiden HRL7 5'(TCGAGGATCCCGGGTACCGAGCTCTAAATAAATAATTTTTAT)3' und HRL8 5'(CCGG AT AAAAATT ATTT ATTT AG AGCTCGGT ACCCGGGATCQ3' konstruiert.

Die relevanten DNA-Sequenz-Elemente, Restriktionsstellen und Transkriptions- und Translationssignale von pMP528HRH und pHES1-4 sind die folgenden.

Die in pMP528HRH vorhandene Sequenz des synthetischen H6-Promotors (Position -124 bis -1, wobei die geänderte Base in Position -102 unterstrichen ist) und die stromabwärts gelegenen Restriktionsstellen sind in Fig. 3B gezeigt.

Wie angegeben, ist die in Klammern gesetzte Sequenz in den Plasmiden pHESl-4 durch Restriktionsstellen, Stop-Codons und frühes Transkriptions-Terminationssignal ersetzt, wie in Fig. 3C für pHESl, in Fig. 3D für pHES2, in Fig. 3E für pHES3 und in Fig. 3F für pHES4 gezeigt wird.

Zusätzlich zu den in pMP528HRH enthaltenen Elementen enthält jedes Plasmid pHESl-3 ein Transla-tions-lnitiations-Codon stromabwärts des H6-Promotors, dem einzig vorkommende multiple Restriktionsstellen Translations-Terminations-Signalsequenzen, eine spezifische frühe Vaccinia Transkriptions-Termina-tions-Signalsequenz (39) nachfolgen. Jedes Plasmid, pHESl-3, enthält ein Translations-Initiations-Codon in einem der drei Leserahmen. Deshalb läßt sich jede DNA-Sequenz, die einen offenen Leserahmen enthält, exprimieren, wenn sie in eines dieser Plasmide cloniert und in Vaccinia-Virus rekombiniert wird.

Das vierte Plasmid, pHES4, enthält kein Translations-Initiations-Codon, aber einzige multiple Restriktionsstellen, Translations-Terminations-Sequenzen und eine frühe Transkriptions-Terminations-Signalse-quenz. Eine DNA-Sequenz, die einen offenen Leserahmen und ein Initiations-Codon enthält, läßt sich exprimieren, wenn sie in pHES4 cloniert und in Vaccinia-Virus rekombiniert wird.

Beispiel 4

Einführung des bakteriellen lacZ-Gens in Vaccinia-Virus und Selektion der rekombinanten Viren auf der Grundlage der Wirtsbereichs-Restriktion

Zur Demonstration der Nützlichkeit des pHES1-4/vP293-Wirtsbereichs-Selektions-Systems wurde ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das das E. coli lacZ-Gen, das die ß-Galactosidase codiert, konstruiert.

Aus pMCl871 (34) wurde ein BamHI-Fragment, das die Codons 8 bis zum Ende des lacZ-Gens enthielt, erhalten. Dieses lacZ BamHI-Fragment wurde in die einzige BamHI-Stelle der Plasmide pHES1-4 cloniert.

Es wurde eine Rekombination zwischen den resultierenden Plasmiden pHESLZ1-4 durchgeführt, mit denen VERO-Zellen individuell transfiziert worden waren, die mit der Wirtsbereichs-Mutante vP293 co-infiziert worden waren. 24 Stunden nach der Infektion wurde das Nachkommens-Virus durch drei Gefrier-/Auftau-Zyklen geerntet und entweder auf VERO- (Tabelle 1A) oder MRC-5- (Tabelle 1B und 1C) Zellen plattiert.

Mit Neutralrot eingefärbte VERO- und MRC-5-Einzelzellschichten (Tabelle 1A und 1B) wurden nach 3 Tagen auf Nitrozellulosefilter transferiert und für die in situ Hybridisierung (26) unter Verwendung einer 32P-markierten lacZ-Gen-Sonde vorbereitet. VERO- (Ergebnisse nicht gezeigt) und MRC-5-Einzelzellschichten (Tabelle 1C) wurden X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-/8-D-galactopyranosid, Boehringer Mannheim) ausgesetzt und die Entwicklung der blauen Farbe nach 8 Stunden gemessen.

Wenn die Nachkommenschaft auf VERO-Zellen plattiert wurde und die Expression der /S-Galactosidase in Gegenwart von X-gal getestet wurde, wurden bei den Zellen, die mit pHESLZl, 2 oder 4 transfiziert worden waren, keine blauen Plaques beobachtet. Signifikanterweise ergaben ungefähr 20 % der mit dem Plasmid pHESLZ3 erzeugten Plaques in Gegenwart von X-gal blaue Plaques (Ergebnisse nicht gezeigt).

Wenn die Nachkommenschaft auf VERO-Zellen plattiert wurde und rekombinante Viren durch in situ Hybridisierung abgesucht wurden, ergaben 12 bis 22 % der Plaques positive Hybridisierungssignale auf lacZ (Tabelle 1A). Bei der Analyse durch in situ DNA-Hybridisierung (26) zeigte jeder Plaque auf MRC-5 die Anwesenheit des lacZ-Gens (Tabelle 1B). jS-Galactosidase-Aktivität wurde jedoch nur in den Plaques auf MRC-5 gefunden, die sich von pHESLZ3 (Tabelle IC) herleiteten. Lediglich die Plasmidkonstruktion pHESLZ3 besaß das lacZ-Gen im Leseraster mit dem Translations-Initiations-Codon. 10

AT 400 955 B TABELLE 1

Analyse des rekombinanten lacZ/Vaccinia-Virus, das mit den Plasmiden pHESLZ1-4 und dem Vaccinia-Virus vP293 hergestellt wurde Donor-Plasmid pHESLZl PHESLZ2 PHESLZ3 PHESLZ4 A. Gesamtzahl der 1056 637 793 1344 Plaques Hybridisierungs-Positive 153 141 95 269 Prozent-Positive 14.5 22 12 20 B. Gesamtzahl der 60 56 ND 71 Plaques Hybridisierungs-Positive 60 56 ND 71 Prozent-Positive 100 100 100 c. Gesamtzahl der 60 55 59 70 Plaques X-gal-Positive 0 0 59 0 Prozent-Positive 0 0 100 0

Beispiel 5

Konstruktion der Plasmide pHES31-34 und pHES61-64

Um zu zeigen, daß sich die bedingt letale Mutation von vP293 zur Konstruktion weiterer Donor-Plasmide verwenden läßt und um das auf Vaccinia WR vP293 basierende Wirtsbereichs-Selektions-System zu erweitern, wurde die pHES-Plasmid-Serie (Beispiel 3) dadurch vergrößert, daß der frühe/späte Vaccinia-Promotor, H6, durch andere temporär regulierte Promotoren ersetzt wurde. Die Plasmide pHES31-34 und die Plasmid-Serie pHES61-64 wurden hergestellt, um die Expression fremder Gene früh bzw. spät zu regulieren.

Die Lage und die Sequenz des Gens für ein 38 kDa-Protein im Kuhpocken-Virus, das für die (hämorrhagische) Bildung von roten Pocken auf der hühnerchorioallantoinen Membran (CAM) benötigt wird, wurde in (43) beschrieben. Dieses Gen, u, wird früh nach der Infektion stark exprimiert. Das u-Gen kartiert auf einem 1465 bp Ncol-Haelll-Fragment.

Der Bereich des Vaccinia-Virus-Genoms des Copenhagen-Stammes, der ein Äquivalent des Kuhpok-ken-u-Gens enthält, wurde unter Verwendung von clonierter Kuhpocken-DNA als Sonde durch "Southem-Blot”-Analyse (44) bestimmt. Das Copenhagen-Äquivalent des Kuhpocken-u-Gens kartiert auf Hindlll B und korrespondiert mit der Lage des υ-Gens im kürzlich beschriebenen Vaccinia-Virus-Stamm WR (45).

In Kuhpocken liegt der u-Promotorbereich stromabwärts der Ncol-Stelle bei -294 (43). Die das Copenhagen-u-Gen-Äquivalent und den Promotor enthaltene DNA wurde sequenziert (46). Das Copenha-gen-u-Gen-ÄquIvalent ist wegen Rasterverschiebungs-Mutationen innerhalb des codierenden Bereiches nicht wirksam, was zu der Bildung von weißen Pocken für auf CAM gezüchtetem Vaccinia-Virus Copenha-gen führt. Der stromaufwärts gelegene Bereich weist eine hohe Homologie im Kuhpocken-Promotorbereich auf und ist funktioneil aktiv. Rekombinante Vaccinia, die unter der Kontrolle des Copenhagen-Vaccinia-u-Promotors exprimierte E. coli /3-Galactosidase enthält, bilden in Gegenwart des chromogenen Substrates X-gal blaue Plaques. Wie die Kuhpocken, enthält das Copenhagen-Genom die Ncol-Stelle stromaufwärts des u-Promotorbereiches.

Um den Copenhagen-u-Promotorbereich in das pHES-System zu bringen, wurde der Ncol-Stelle stromaufwärts des u-Promotors durch Ligation mit dem sich selbst aneinander gelagerten Oligonucleotid HRL14 (5' CATGGAAGCTTC 3'; Hindlll-Stelle, unterstrichen) eine Hindlll-Stelle zugefügt. Ein 299 bp Hindlll-Clal-Fragment, das den u-Promotorbereich von der Ncol-Stelle bis zur Clal-Stelle bei -6 enthält, wurde isoliert. Der H6-Promotor wurde von pHESI (Beispiel 3) durch partielle Hindlll-Spaltung entfernt. Anschließend wurde mit Kpnl gespalten. Mit Bezug auf Fig. 4 wurde das 7,8 kb Hindlll-Kpnl-Vektor-Fragment aus einem Agarosegel (Fig. 4A) isoliert. Zum Ersetzen der Promotorsequenzen stromabwärts von der Clal-Stelle und den Polylinkersequenzen bis zur Kpnl-Stelle wurden acht Oligonucleotide, HRL15 bis HRL22, 11

AT 400 955 B synthetisiert (Fig. 4B). Paare von Oligonucleotiden wurden aneinander gelagert und mit dem 7,8 kb Hindlll-Kpnl-Vektor-Fragment von pHES1 und dem Hindlll-Clal-u-Promotorfragment ligiert, um die Plasmide pHES31-34 (Fig. 4A) zu erzeugen.

Mit Bezugnahme auf Fig. 5 enthalten die resultierenden Plasmide pHES31 bis pHES34 Polylinkerbereiche stromabwärts des Copenhagen-u-Promotorbereiches (Fig. 5). Die den u-Promotor spezifizierende 0,3 kb DNA-Sequenz ist in Fig. 5 nur für das Plasmid pHES3l gezeigt. Die identische Sequenz ist in den Plasmiden pHES32 bis pHES34 vorhanden. Die Sequenz in Klammern, die sich dem Promotorbereich in pHES31 anschließt, ist durch die für pHES32 bis pHES34 gezeigten Sequenzen in Klammern ersetzt. Restriktionsstellen sind aufgeführt. In pHES31 bis pHES33 liegt der Polylinkerbereich stromabwärts des Initiations-ATG in den drei verschiedenen Leserahmen. Das Plasmid pHES34 enthält kein Initiations-ATG. In allen Mitgliedern der pHES31- bis pHES34-Reihe schließen sich an den Polylinkerbereich Translationsstop-Codons in allen drei Leserahmen an, unterstrichen, an die sich die mit einem darüber liegenden Strich gekennzeichnete Sequenz TTTTTAT anschließt, für die gezeigt worden ist, daß sie in Vaccinia eine Termination der Transkription für frühe Gene spezifiziert (39).

So wie die pHESl- bis pHES4-Reihe von Plasmiden (Beispiel 3), erlaubt auch die pHES31- bis pHES34-Reihe ein Expression von fremden codierenden Sequenzen, die in den Polylinkerbereich inseriert sind. Fremde codierende Sequenzen, die ein Initiations-Codon enthalten, werden durch die Insertion in pHES34 unter der Kontrolle des Vaccinia-u-Promotors exprimiert. Fremde codierende Sequenzen ohne ein Initiations-Codon werden in dem geeigneten Leserahmen durch die Insertion in pHES31, pHES32 oder pHES33 exprimiert. So wie die ursprüngliche pHES-Reihe enthalten auch pHES31 bis pHES34 das menschliche Kl L-Wirtsbereichsgen (15). Die Rekombination zwischen der Vaccinia-Deletionsmutante vP293 (Beispiel 1) und allen Plasmid-Abkömmlingen der pHES-Reihe erzeugen ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das durch seine Fähigkeit, auf menschlichen Zellen zu wachsen, selektioniert wird. Für eine weitere Anpassung des pHES-Plasmidsystems, das eine Expression von fremden Genen in rekombinanten Vaccinia zu späteren Zeiten nach der Infektion erlaubt, wurde der Promotor des 160 kDa ATI-Gens von Kuhpocken gewählt (47). Es war gezeigt worden, daß der unmittelbar stromaufwärts des Kuhpocken-ATI-Gens liegende 533 bp-Bereich für ein hohes Niveau der Expression von fremden Genen zu späteren Zeiten nach der Infektion sorgt, wenn er in das Vaccinia-Virus inseriert wird (48). Der sich von der stromaufwärts liegenden Bglll-Stelle bis zum Initiations-Codon erstreckende 63 bp-Kuhpocken-DNA-Bereich reicht aus, als Promotor zur Expression von fremden Genen in Vaccinia zu wirken. Die diesen Promotorbereich spezifizierende DNA wurde synthetisiert und, wie unten im Detail beschrieben, in das pHES-System inseriert.

Der H6-Promotor wurde von pHESl (Beispiel 3) durch partielle Hindill- und anschließend BamHI-Spaltung entfernt. Mit Bezug auf Fig. 6 wurde das 7,8 kb Hindlll-BamHI-Vektor-Fragment aus einem Agarosegel (Fig. 6A) isoliert. Um die H6-Promotorsequenzen durch Kuhpocken-ATI-Promotorsequenzen und eine BamHI-Verbindung zu Polylinkersequenzen zu ersetzen, wurden 8 Oligonucleotide HRL33 bis HRL40 synthetisiert (Fig. 6B). Paare von Oligonucleotiden wurden aneinander gelagert und mit dem 7,8 kb Hindlll-BamHI-Vektor-Fragment von pHESl ligiert, um so die Plasmide pHES6l-64 zu erzeugen. Jedes aneinander gelagerte Paar von Oligonucleotiden enthält den synthetischen 63 bp Kuhpocken-ATI-Promotorbereich, der, wie gezeigt, von Hindill- und BamHI-Restriktionsstellen flankiert wird.

Mit Bezug auf Fig. 7 enthalten die resultierenden Plasmide pHES6t bis pHES64 Polylinkerbereiche stromabwärts des späten Kuhpocken-ATI-Promotorbereichs (Fig. 7). Die identische Sequenz für den Kuhpocken-ATI-Promotor, die in pHE$61 bis pHES64 vorhanden ist, wird hier nur für pHES61 gezeigt. Die dem Promotorbereich in pHES6l folgende Sequenz in Klammern wird durch die für pHES62 bis pHES64 gezeigten Sequenzen in Klammern ersetzt. Die Restriktionsstellen sind aufgeführt. In pHES61 bis pHES63 liegt der Polylinkerbereich stromabwärts des ATG-Initiations-Codons in den drei unterschiedlichen Leserahmen. Das Plasmid pHES64 enthält kein ATG-Initiations-Codon.

Wie in der pHES-Plasmidreihe, die andere Promotoren enthält, enthalten alle Mitglieder der Plasmid-Reihe pHES61 bis pHES64 Poly linkerbereiche, denen Translations- (unterstrichen) und Transkriptions-Terminations-Signale (mit einem darüberliegenden Strich versehen) folgen. Da die Abkömmlinge der pHES6l- bis pHES64-Reihe das Vaccinia K1 L-Human-Wirtsbereichsgen enthalten, wird die durch Rekombination dieser Plasmide mit vP293 erzeugte rekombinante Vaccinia-Virus-Nachkommenschaft durch ihre Fähigkeit, auf menschlichen Zellen zu wachsen, selektioniert. 12

AT 400 955 B

Beispiel S

Konstruktion der Rekombinanten vP548 und vP661

Die Sequenz der nahe des linken Endes des Copenhagen-Genoms gelegenen 15537 bp DNA ist von links nach rechts in Fig. 8 gezeigt. Die Sequenz enthält 7218 bp zwischen der am weitesten rechts liegenden Sall-Stelle in Hindill C und der Hindill C/N-Verbindung und erstreckt sich über die gesamten Sequenzen für Hindlll N (1544 bp; Positionen 7219 - 8762), Hindill M (2219 bp; Positionen 8763 bis 10981) und Hindlll K (4551 bp; Positionen 10982 bis 15532). Wegen der Übersichtlichkeit sind die codierenden Sequenzen und die Restriktionsstellen durch die Basenpositionen, wie in Fig. 8 gezeigt, bezeichnet. Nach der herkömmlichen Nomenklatur werden offene Leserahmen (ORFs) von Vaccinia durch Numerierung von links nach rechts innerhalb jedes Hindlll-Fragments angegeben (33). Da verschiedene Vaccinia-Stämme nennenswerte Unterschiede zum linken Ende von Hindlll C (der linke Terminus des Vaccinia-Genoms) enthalten, werden nachfolgend die im Vaccinia-Hindlll C-Fragment liegenden ORFs durch Numerierung von rechts nach links, beginnend mit der Hindlll C/N-Verbindung bezeichnet. Nach dieser Nomenklatur ist der ORF C1L der am weitesten rechts liegende ORF, der im Hindlll C-Fragment der Copenhagen Vaccinia-DNA beginnt (siehe Fig. 8).

Mit Bezug auf Fig. 9 wurden Plasmide konstruiert, um das K1 L-Human-Wirtsbereichsgen (15) aus dem Copenhagen-Virus zu entfernen mit der Erwartung, daß die Beseitigung des K1L-Gens zu einem Verlust der Fähigkeit des resultierenden Virus führen würde, in menschlichen Zellen zu replizieren. Das Copenhagen Kpnl-Fragment D, das ungefähr 2,5 kb DNA links der in Fig. 8 gezeigten Sequenz einschließt und sich nach rechts bis zur Position 12998 erstreckt, wurde in die Kpnl-Stelle von pUC18 cloniert, womit sich pSD435 (Fig. 9) ergab. (Beachte: In Fig. 9 erscheinen Plasmide der pSD-Reihe, die Vaccinia Copenhagen-Insertionen enthalten, wahlweise mit der "VC"-Bezeichnung. Somit ist pSD435 äquivalent mit pSD435VC. Die ”VC"-Bezeichnung ist in Fig. 10 weggelassen.) Das Kpn D-Fragment enthält das K1L-Gen (Positionen 11030 bis 10179). Zur einfachen Manipulation, des K1L-Gens und seines flankierenden Bereichs wurde pSD452, ein Subclon von pSD435, der Sequenzen zwischen der Sphl-Stelle (Position 9478) in Hindlll M und der Clal-Stelle in Hindlll K (Position 11731) einschließt, konstruiert (Fig. 9). Das K1 L-Gen ist durch einen schraffierten Block, die Transkriptions-Richtung durch einen Pfeil gekennzeichnet. pSD452, das zwei Hpal-Stellen (Positionen 9561, 10155) enthält, wurde durch die partielle Spaltung mit Hpal linearisiert, und die Bgjll-Linker wurden in die Hpal-Stelle (Position 10155) unmittelbar stromabwärts des K1L-Gens ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit Bglll gespalten und selbst-ligiert, wodurch pSD453 erzeugt wurde. In pSD453 sind das K1 L-Gen und sein Promotor deletiert. Die Deletionsstelle ist durch Dreiecke gekennzeichnet (Fig. 9).

Ein Fragment, das die codierenden Sequenzen von ß-Galactosidase (gepunkteter Block, Richtung des Gens durch einen Pfeil gekennzeichnet) unter der Kontrolle des späten 11 kDa Vaccinia Promotors (schwarzer Pfeil) (49) enthält, wurde in die Bglll-Stelle von pSD453 inseriert, womit pSD453BG erzeugt wurde (Fig. 9). pSD453BG wurde als Donor-Plasmid zur Rekombination mit vP410, einem Thymidin-Kinase-Minus-Abkömmling des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen (50) verwendet. Die Virus-Nachkommenschaft wurde in Gegenwart von X-gal getestet. Blaue Plaques wurden genommen und durch Züchten auf VERO-Zellen gereinigt. Wie erwartet wurde gezeigt, daß der resultierenden Rekombinante vP548 das K1L-Gen fehlte, wenn man 32P-markierte Kl L-Sequenzen als Sonde verwendete. Überraschenderweise bildete vP548 Plaques auf MRC-5-Zellen.

Um zu testen, ob die Anwesenheit des £-Galactosidase-Gens in vP548 eine Rolle für seine Fähigkeit, Plaques auf MRC-5-Zellen zu bilden, spielte, wurde die 11 kDa/ß-Galactosidase-Kassette aus vP548 durch Rekombination mit dem Donor-Plasmid pSD453 entfernt. Die resultierende Vaccinia-Deletions-Rekombinan-te vP661 bildete ebenfalls Plaques auf MRC-5-Zellen.

Beispiel 7

Identifizierung des C7L-Wirtsbereichsgens vom Vaccinia-Virus-Stamm Copenhagen

Die im Beispiel 6 beschriebenen Ergebnisse legen nahe, daß K1L nicht das einzige Vaccinia-Wirtsbereichsgen ist, das in der Lage ist, das Wachstum auf menschlichen Zellen zu ermöglichen. Es wurde die Möglichkeit erforscht, ob in den deletierten Bereichen des Vaccinia-Virus vP293 (Beispiel 3) und der 18 kb Vaccinia-Virus-Wirtsbereichs-Deletionsmutante (14) ein anderes Gen deletiert wurde, das, wie K1L, die Fähigkeit verleiht, auf menschlichen Zellen zu wachsen. Fig. 10 gibt die Restriktionskarte des linken Endes des Vaccinia-Virus-Genoms wieder und zeigt die Lage von potentiellen Wirtsbereichsgenen. 13

AT 400 955 B

Die Hindlll- und EcoRI-Karten des linken Endes des Vaccinia-Virus-Genoms sind im oberen Teil gezeigt. Es sind nur die relevanten EcoRI-Zellen angegeben. Das Ausmaß der Wirtsbereichs-Deletionen in der Vaccinia-Virus-Deletionsmutante vP293 (Beispiel 3) und der 18 kb Wirtsbereichs-Deletion (14) sind genau wie der den beiden Deletionsmutanten gemeinsame deletierte Bereich durch dicke Linien gekennzeichnet. Der 15537 bp lange sequenzierte Bereich (Fig. 8) von der am weitesten rechts sitzenden Sall-Stelle bis zum Hindlll K-Fragment ist erweitert. Es werden nur die relevanten Restriktionsstellen angegeben. Die Lage der hier diskutierten Gene ist innerhalb der offenen Kästen angegeben. Die Lage der Fragmente, die zum Testen der Gene auf ihre Wirtsbereichs-Fähigkeit hin verwendet werden, ist oberhalb der Tröge angegeben. Die Lage von Vaccinia-Insertionen in den hier beschriebenen Plasmiden ist zusammen mit den relevanten Restriktionsstellen ebenfalls angegeben. Der Code: S = Sali; E = EcoRI; H = Hindlll; Bg = Bgjll; Kp = Kpnl; B = BamHI; Sp = Sphl; C = Clal; Hp = Hpal.

Wie in Fig. 10 gezeigt, erstreckt sich der der 18 kb Wirtsbereichs-Deletion und der Deletion in vP293 gemeinsame Deletionsbereich von einem unbestimmten Punkt in EcoRI C bis zur Sall-Stelle im Hindlll K (Position 11412). Es wurde festgestellt, daß eine Wirtsbereichs-Funktion auf dem EcoRI K (Pos. 7550 bis 12875)-Fragment (14) kartierte, und ein Wirtsbereichsgen, K1L (Pos. 11030 bis 10179) wurde in einem 846 bp Bglll D-Fragment (Pos. 10271 bis 11116) innerhalb von EcoRI K (15) identifiziert. Das Bgjll A-Fragment (Pos. 8645 bis 10270) aus EcoRI K stellte das Wachstum auf menschlichen Zellen nicht wieder her. In diesen Untersuchungen wären jedoch mögliche Wirtsbereichsgene im EcoRI K-Fragment übersehen worden, die zwischen der EcoRI- (Pos. 7749) und der Bglll- (Pos. 8644) Stelle oder zwischen der Bglll-(Pos.11116) und Cla1- (Pos. 11731) Stelle liegen. Die Gene, die die EcoRI- (Pos. 7749), die Bglll- (Pos. 8644) oder die Clal- (Pos. 11731) Stellen von EcoRI K oder die EcoRI-Verbindung (Pos. 1295) zwischen EcoRI C und J überschneiden, würde man ebenfalls übersehen haben.

Eine Untersuchung der Aminosäure-Translation der hier beschriebenen 15,5 kb Sequenz ergab vier potentielle Gene, die früher (14, 15) nicht getestet worden wären. Alle vier offenen Leserahmen sind von rechts nach links orientiert. Die Positionen dieser vier ORFs, C7L (Pos. 1314 bis 863), N2L (Pos. 7943 bis 7416), M1L (Pos. 9329 bis 7985) und K2L (Pos. 12367 bis 11258) sind in Fig. 10 gezeigt. Das erste ATG im M1L-ORF liegt in der Position 9403. Da dies eine Lage stromaufwärts von (rechts von) den publizierten Lagen für die Transkriptions-Startstellen für M1L (51) und innerhalb der codierenden Sequenzen für das M2L-Gen ist, kann man das ATG in der Position 9329 als den wirklichen Translationsstart des M1L-Gens interpretieren.

Von den vier potentiellen Genen schien M1L zu Beginn der wahrscheinlichste Kandidat für ein Wirtsbereichsgen zu sein. Eine 32P-markierte DNA-Sonde für K1L kreuz-reagierte schwach auf einem "Southern-Blot" (44) mit M1L (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die hier beschriebene M1L-Gensequenz des Vaccinia-Stammes Copenhagen unterscheidet sich am Aminoterminus von der publizierten M1L-Sequenz im Vaccinia-Stamm WR (51). Die Insertion von zwei Basen (Pos. 9307, 9312) in der vorliegenden Sequenz bezüglich der publizierten Sequenz resultiert in Leserahmen-Verschiebungs-Mutationen. In der hier beschriebenen Sequenz beginnt die Translation beim ATG in Position 9329. In der veröffentlichten Sequenz (51) würde eine potentielle Translation von diesem ATG durch ein im Raster befindliches Stop-Codon bei Position 9278 terminiert werden und die Translation von M1L würde bei Position 9247 beginnen. In der hier beschriebenen Sequenz ist die Translation von Position 9329 bis zum vorher beschriebenen Stop-Codon von M1L (Pos. 7987) kontinuierlich. Als Netto-Resultat ergibt sich, daß das hier beschriebene M1L-Gen 27 zusätzliche Aminosäuren am Aminoterminus und außerdem zwei Aminosäuresubstitutionen bezüglich des beschriebenen M1L-Gens (51) enthält. Die Sequenz für das WR N2L-Gen ist ebenfalls publiziert (51). Das hier beschriebene Copenhagen N2L-Gen hat vier Aminosäuresubstitutionen bezüglich der publizierten Sequenz.

Eine Computer-Analyse des Proteins, das durch den hier beschriebenen M1L-ORF des Vaccinia-Virus Copenhagen codiert wird, offenbart einen höheren Ähnlichkeitsgrad mit dem Copenhagen-Vaccinia-Virus K1L-Protein (15) als mit irgendeinem anderen Protein in den PIR- oder Swiss-Prot-Daten-Banken (Ergebnisse nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zusammen mit dem aus der "Southern-Blot"-Analyse abgeleiteten Ergebnis legt nahe, daß das M1L-Genprodukt eine ähnliche Wirtsbereichs-Funktion wie das K1L-Genpro-dukt liefern könnte.

Deshalb wurde von den vier potentiellen menschlichen Wirtsbereichsgenen das M1L-Gen als erstes im Vaccinia-Virus vP293 Wirtsbereichs-Selektions-System getestet, um seine Fähigkeit, dem Vaccinia-Virus das Wachstum auf menschlichen Zellen zu ermöglichen, zu untersuchen. Zur Rekombination des M1L-Gens und nachfolgender Gene in das vP293 Selektions-System wurden pMP528 (Beispiel 1) und sein Abkömmling pMP528E (Beispiel 2) als Vektor-Plasmide verwendet. pMP528 ist das ursprüngliche Vaccinia-Deletions-Plasmid, von dem sich die Vaccinia-Rekombinante vP293 ableitet. pMP528 enthält eine Sall-Stelle in der Verbindungsstelle zwischen den aus den Vaccinia-DNA-Bereichen Hindlll C/Hindlll K abgeleite- 14

AT 400 955 B ten flankierenden Vaccinia-Armen. In pMP528E ist der von Vaccinia Hindill K-DNA abgeleitete rechte flankierende Arm verkürzt, und die ursprüngliche Sall-Stelle an der Hindill C/Hindlll K-Deletions-Verbindung ist durch eine Smal-Stelle ersetzt worden.

Das Testen von potentiellen Vaccinia-Wirtsbereichsgenen im vP293-System ist schematisch in Fig. 11 dargestellt. Die Hindlll-Karte des linken Endes des Vaccinia-Virus-Genoms ist auf der obersten Linie angegeben. Die Lage der Gene ist innerhalb der Kästen und die Transkriptions-Richtung durch Pfeile gekennzeichnet. Die Lage der Vaccinia-Fragmente, die zum Testen der Wirtsbereichsaktivität von Genen verwendet wurden, ist durch Tröge gekennzeichnet.

Ein DNA-Fragment, das sich vom 3’-Ende von M2L (Pos. 9384, 55 Basen stromaufwärts des M1L-Initiations-Codons) bis zur Seal-Stelle (Pos. 7906) stromabwärts von M1L erstreckt, wurde mit pMP528E, das mit Smal gespalten worden war, ligiert (Fig. 11). Das resultierende Plasmid pMP528m wurde als Donor-Plasmid zur Rekombination mit Vaccinia-Virus vP293 verwendet. Obwohl eine Analyse mit einer 32P-markierten DNA-Sonde für das M1L-Gen ergab, daß M1 L-Sequenzen in das Vaccinia inseriert wurden, bildete die Virus-Nachkommenschaft keine Plaques auf MRC-5-Zellen.

Da die Größe des Promotorbereiches, der für die Initiation der Transkription des M1L-Gens notwendig ist, unbekannt ist, ist es möglich, daß die 55 Basen stromaufwärts der MlL-codierenden Sequenzen im Plasmid pMP528m für die Transkription des M1L-Gens nicht ausreichend waren. Deshalb wurde ein größeres DNA-Fragment des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen, das die vollständigen Gene für M2L, M1L und N2L enthielt, getestet. Ein 2849 bp Hpal-Fragment (Pos. 7307 bis 10155) wurde durch partielle Hpal-Spaltung von pSD420, einem Sall-Clon von Copenhagen Vaccinia-Virus-DNA (Pos. 1 bis 10477), erhalten. Dieses Hpal-Fragment enthält die gesamten Gene für M2L (Pos. 10043 bis 9381), M1L (Pos. 9329 bis 7985) und N2L (Pos. 7943 bis 7416). Das Hpal-Fragment wurde in pMP528E, das mit Smal gespalten worden war (Fig. 11) cloniert. Das in Fig. 3 mit pMPm12n2 bezeichnete resultierende Plasmid wurde als Donor-Plasmid für die Rekombination mit vP293 verwendet. Obwohl die Untersuchung mit 32P-markierten DNA-Sonden zeigte, daß die drei Gene in Vaccinia inseriert wurden, bildete die rekombinante virale Nachkommenschaft keine Plaques auf MRC-5-Zellen. Dies zeigte, daß es sich bei M1L und N2L nicht um das (die) vermutete(n) Wirtsbereichsgen(e) handelte. Von M2L nahm man nicht an, daß es ein Wirtsbereichsgen ist, da das M2L-Gen vollständig in dem früher getesteten Bglll A-Fragment von EcoRl K enthalten war (15).

Die übrigbleibenden, möglichen Vaccinia-Virus-Human-Wirtsbereichsgene waren K2L, das in der 18 kb Wirtsbereichs-Mutante fehlte und in vP293 verstümmelt war, und C7L, ein ORF in Hindill C, der sich über die EcoRl C/J-Verbindung erstreckt und die Codierungskapazität für ein 18 kDa-Protein besitzt.

Das hier beschriebene K2L-Gen korrespondiert mit dem früher (52) für den WR Vaccinia-Stamm beschriebenen "ORF K1L", wovon es sich durch zwei Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Die Vacci-nia-Virus-Deletionsmutante vP293 enthält den Hauptteil der K2L-codierenden Sequenzen unmittelbar rechts von der Deletionsverbindung in Hindlll K (äquivalent mit der Sall-Stelle in der Position 11412). Um die Fähigkeit des K2L-Gens (Pos. 12367 bis 11258) zu testen, virales Vaccinia-Wachstum auf menschlichen Zellen zu ermöglichen, wurde das 3'-Ende des Vaccinia K2L-Gens in Plasmid pMP528 wiederhergestellt. Die synthetischen Polylinker MPSYN52 (5’ ATTΑΤΤΠΤATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT 3’) und MPSYN53 (5' AG AATT CG AGCTCCCCGGGGGT ACCCT CGAGGGAT CCAAGCTTAT AAAAATAAT 3') wurden aneinander gelagert und in die Sspl-Stelle (Pos. 11177) stromabwärts des K2L-Gens in einen Plasmid-Subclon von Copenhagen Hindlll K ligiert und ein Xhol/Sall-Fragment, das das 3'-Ende des K2L-Gens enthielt, wurde isoliert. Das Plasmid pMP528 wurde mit Sali gespalten und das Xhol/Sall-Fragment, das das 3'-Ende des K2L-Gens enthielt, wurde in der richtigen Orientierung inseriert (Fig. 11). Das resultierende Plasmid pMP528K2 wurde als Donor-Plasmid zur Rekombination mit dem Vaccinia-Virus vP293 verwendet. Wieder war die virale rekombinante Vaccinia-Nachkommenschaft nicht in der Lage, Plaques auf MRC-5-Zellen zu bilden und somit war gezeigt, daß es sich bei K2L um kein Human-Wirtsbereichsgen handelt.

Das hier beschriebene Copenhagen Vaccinia C7L-Gen korrespondiert auf der Aminosäure-Ebene genau mit dem vorher beschriebenen (40) WR 18 kDa-Gen. Um das C7L-Gen (Pos. 1314 bis 863) auf seine Wirtsbereichs-Fähigkeit hin zu testen, wurde das Plasmid pSD420 mit BamHI und Bglll gespalten, und ein 1040 bp-Fragment, das sich von der BamHI-Stelle in Position 724 bis zur Bglll-Stelle in Position 1764 erstreckt, wurde isoliert. Dieses Bglll/BamHI-Fragment, das das gesamte Gen für C7L enthält, wurde mit pMP528K2 ligiert, das mit BamHI gespalten worden war (Fig. 11). Wenn man das resultierende Plasmid pMP528C7L als Donor-Plasmid zur Rekombination mit dem Vaccinia-Virus vP293 verwendete, wurde eine 15

AT 400 955 B virale Nachkommenschaft produziert, die auf MRC-5-Zellen Plaques bildete. Dies zeigte, daß C7L (wie K1L) ein Wirtsbereichsgen war, das in der Lage war, Wachstum auf menschlichen Zellen zu spezifizieren. Da sich das C7L-Gen über die EcoRI C/J-Verbindung erstreckt, war es nicht früher getestet worden (14).

Beispiel 8

Deletion des C7L-Gens vom Copenhagen-Stamm des Vaccinia-Virus

Da das Vaccinia-Virus C7L-Gen, wie K1L, in der Lage war, die Fähigkeit der WR-Vaccinia-Stamm-vP293-Deletionsmutante wiederherzustellen, auf menschlichen Zellen Plaques zu bilden, wurde die Wirkung einer Deletion des C7L-Gens aus dem Copenhagen-Stamm von Vaccinia sowohl als Einzeldeletion als auch als doppelte Deletion mit dem anderen Wirtsbereichsgen, K1L, untersucht.

Die Konstruktion der Plasmide für die Deletion des Gens für C7L und die Erzeugung von Vaccinia-Rekombinanten, bei denen C7L deletiert ist, ist schematisch in Fig. 12 gezeigt. Eine Hindlll-Karte des linken Endes des Vaccinia-Genoms ist auf der obersten Linie dargestellt. Das C7L-Gen ist durch einen schraffierten Kasten und die Transkriptionsrichtung durch einen Pfeil gekennzeichnet. Das aus dem Plasmid pSD420 hergeleitete BamHI-Bglll-DNA-Fragment (Pos. 725 bis 1764) wurde mit dem Klenow-Fragment von E. coli Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit Pvull gespaltenem pUC18 ligiert, wodurch das Plasmid pMP420BB (Fig. 12) erzeugt wurde. pMP420BB wurde mit EcoRV linearisiert, das in den C7L-codierenden Sequenzen schneidet, und es wurde ein auf Smal endendes 3,2 kb DNA-Fragment; das aus der 11 kDa-Vaccinia-Promotor (dunkler Pfeil) ß-Galactosidase (dunkler gepunkteter Kasten, die Richtung des Gens ist durch einen Pfeil gekennzeichnet) -Kassette besteht, inseriert. Das resultierende Plasmid pMPC7LKBG enthält die 11 kDa-Promotor/0-Galactosidase-Kassette in einer Links-nachrechts-Orientierung bezüglich der Vaccinia-Sequenzen. Eine Rekombination wurde unter Verwendung des Donor-Plasmids pMPC7LKBG und des Rettungs-Copenhagen-Vaccinia-Virus vP410 durchgeführt, wobei sich die Vaccinia-Rekombinante vP665 ergab, die als ein blauer Plaque in Gegenwart von X-gal identifiziert wurde.

Zum Entfernen des C7L-Gens aus pMP420BB wurde das Plasmid durch Spaltung in der einzigen Sacl-Stelle (Pos. 999) im C7L-Gen linearisiert und anschließend mit Exonuclease Bai 31 abgebaut. Metagenese (53) wurde an der doppelsträngigen Matrize unter Verwendung eines synthetischen 46mer Oligonucleotids MPSYN234 (5' TGTCATTT AACACTAT ACT CAT AT ACT G AATGG AT GA ACGAATACC 3'). ausgeführt. Im resultierenden Plasmid pMPC7A ist das C7L-Gen (die Deletionsstelle ist durch Dreiecke gekennzeichnet, Fig. 12) unter Zurücklassen flankierender Vaccinia-Arme mit 140 bp nach links und 400 bp nach rechts deletiert. pMPC7A wurde als Donor-Plasmid verwendet, um die unterbrochenen C7L-Gen/11 kDa-Promotor/0-Galactosidase-Sequenzen von vP665 zu entfernen und somit vP706 zu erzeugen, das als farbloser Plaque in Gegenwart von X-gal identifiziert wurde. Sowohl vP665 als auch vP706 wachsen auf MRC-5-Zellen. Dies entspricht der Erwartung, da diese Rekombinanten noch das K1 L-Wirtsbereichsgen enthalten.

Um ein Virus herzustellen, das weder die Gene für K1L noch für C7L enthält, wurde pMPC7LKBG als Donor-Plasmid zur Rekombination mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP661, in dem K1L deletiert ist, verwendet. Das resultierende Virus vP683 wurde als blauer Plaque in Gegenwart von X-gal selektioniert. Das C7L-Gen wurde aus dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP683 durch Rekombination mit dem Donor-Plasmid pMPC7A deletiert. Das resultierende rekombinante Vaccinia-Virus mit einer Doppelmutation, vP716, wurde als farbloser Plaque in Gegenwart von X-gal selektioniert. Sowohl vP683 als auch vP716 bilden keine Plaques auf MRC-5-Zellen, was zeigt, daß die Deletion der beiden Gene K1L und C7L ausreichend ist, um das Wachstum des Vaccinia-Virus auf menschlichen Zellen zu verhindern.

Tabelle 2 vergleicht die Fähigkeit von Vaccinia-Virus-Genen, die Wirtsbereichs-Funktionen in der Vaccinia-Virus-Deletionsmutante vP293 wiederherzustellen. Verglichen wird die relative Fähigkeit, nach der Wiedereinführung der genannten Gene durch Rekombination in das Vaccinia-Virus vP293 auf menschlichen oder Affenzellen zu replizieren. 16

AT 400 955 B TABELLE 2

Virus inserierte Gene Titer (pfu/ml) VERO MRC-5 vP293 M1L 1.7 x 105 0 vP293 K2L 2.5 x 105 0 vP293 M2L, M1L, N2L 1.5 x 105 0 vP293 K1L 1.7 x 105 4.7 x 103 vP293 C7L 1.4 x 105 5.9 x 103

Beispiel 9

Das ein 77 kDa-Produkt codierende Kuhpockengen

Anders als das Vaccinia-Virus ist das Kuhpocken-Virus fähig, auf "Chinese Hamster Ovary" (CHO)-Zellen zu wachsen. Ein Bereich des Kuhpocken-Genoms, das Vaccinia-Viren erlaubt, auf CHO-Zellen zu replizieren, ist identifiziert worden (54). Das Kuhpockengen und der Promotor kartieren auf einem 2,3 kb Hpal-Fragment. Das Gen codiert ein vorausgesagtes Translationsprodukt mit 77 kDa. Das Kuhpockengen weist weder auf der DNA- noch auf der Proteinebene eine nennenswerte Homologie mit einem der beiden Vaccinia-Virus-Human-Wirtsbereichsgenen, K1L (54) oder dem hier beschriebenen C7L, auf.

Bezugnehmend auf Fig. 13 wurde als Vorbereitung zur Expression des 77 kDa-Kuhpockengens in dem erfindungsgemäßen Vaccinia-System Kuhpocken-DNA mit Hpal gespalten, und das 2,3 kb Fragment, das das Gen und seinen Promotor enthält, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Um das Gen mit Polylinkern zu umgeben, wurde das Kuhpocken-Hpal-Fragment mit Smal-gespaltenem p(BI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) ligiert und so pCP3 (Fig. 13) erzeugt. Zur Insertion in Vaccinia wurde das Kuhpockengen in den ATI-Deletionsbereich des Copenhagen-Vektor-Plasmids pSD494VC, wie vorstehend beschrieben, cloniert.

Das Vaccinia-Äquivalent des Kuhpocken-ATI-Gen-Bereichs wurde im Vaccinia-WR-Stamm zuerst durch das Sequenzieren geeigneter Vaccinia-WR-Clone unter Verwendung von Primern lokalisiert, die gemäß der publizierten DNA-Sequenz am 5'-Ende der ATI-codierenden Kuhpocken-Sequenz (47) synthetisiert wurden. Im Gegensatz zu Kuhpocken, dessen ATI-Gen ein 160 kDa-Protein codiert, codiert das WR-Vaccinia-Gegenstück ein 94 kDa-Protein (siehe auch 48). Im Gegensatz zu WR enthält der Copenhagen-Stamm des Vaccinia-Virus eine 4,1 kb Deletion, die das 5'-Ende des ATI-äquivalenten Gens und das 3'-Ende des unmittelbar vorangehenden Gens umfaßt. Die übriggebliebenen Anteile der beiden ORFs sind im richtigen Raster miteinander verbunden und ergeben somit ein Hybrid-ORF von 966 bp. Das Copenhagen-Vektor-Plasmid pSD494VC ist ein Xbal/Bglll-Plasmidsubclon von Copenhagen-Hindlll A, in dem der hybride ORF durch Fusion des dem Kuhpocken-ATI entsprechenden Gens in Copenhagen gebildet ist und sein stromaufwärts liegender Nachbar durch einen Polylinkerbereich ersetzt wurde. Der Polylinkerbereich besteht aus der Sequenz 5' AGATCTCCCGGGAAGCTTGGATCCGAGCTCCTCGAGGAATTCGTTAAC 3’ die die Restriktionsstellen Bglll, Smal, Hindill, BamHI. Sstl, Xhol, EcoRI und Hpal spezifiziert. pSD494VC enthält 0,7 kb flankierende Vaccinia-DNA links des Polylinkerbereichs und 1.3 kb flankierende Vaccinia-DNA rechts des Polylinkerbereichs.

Aus pCP3 wurde ein 2,3 kb EcoRI-BamHI-Fragment isoliert, das das 77 kDa Kuhpockengen und dessen Promotor enthielt. Dieses Fragment wurde mit dem Polylinkerbereich von mit EcoRI und BamHI geschnittenem pSD494VC ligiert und somit das Plasmid pCP5 (Fig. 13) erzeugt. Wie erwartet, produzierte die Rekombination zwischen pCP5, das das 77 kDa Kuhpockengen enthielt, und dem Copenhagen-Vaccinia-Virus vP410 ein rekombinantes Virus, vP695, das in der Lage ist, auf CHO-Zellen Plaques zu bilden.

Um zu testen, ob das 77 kDa Kuhpocken-CHO-Wirtsbereichsgen ebenfalls in der Lage ist, das Wachstum von Vaccinia-Virus auf menschlichen Zellen zu bewirken, wurde eine Rekombination zwischen dem das Kuhpocken-77 kDa-Gen enthaltenden Plasmid pCP5 und vP293 der WR Vaccinia-Wirtsbereichs-Deletionsmutante, die auf menschlichen Zellen keine Plaques bildet, durchgeführt. Der rekombinante Virus-Nachkömmling, vP698, bildete auf MRC-5-Zellen Plaques. Das zeigt, daß das 77 kDa-Kuhpockengen außer, daß es ein CHO-Wirtsbereichsgen ist, zusätzlich, wie die Vaccinia-Gene K1L und C7L, ein Human-Wirtsbereichsgen ist (Fig. 13).

Angesichts der Beobachtung, daß das 77 kDa-Gen von Kuhpocken-Virus in der Lage ist, das Wachstum von Vaccinia-Virus sowohl auf CHO- als auch auf menschlichen MRC-5-Zellen zu spezifizieren, war es interessant, herauszufinden, welche Rolle C7L und K1L, die beiden Vaccinia-Human-Wirtsbereichsgene, bei 17

AT 400 955 B der Fähigkeit des Vaccinia-Virus spielen, in vitro auf Zellen zu replizieren, die von anderen Arten abgeleitet sind. Es war ebenfalls interessant zu bestimmen, ob andere Vaccinia-codierte Gene für das Wachstum von Vaccinia-Virus auf Zellen von anderen Arten spezifisch benötigt werden. Zuerst wurde die Reihe von Copenhagen-Vaccinia-Virus C7L- und K1 L-Deletionsmutanten auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Plaques auf LLC-PK1 -Zellen einer aus Schweineniere abgeleiteten Zellinie zu bilden.

Konfluente Einzelschichten von VERO-, MRC-5- und LLC-PK1-Zellen in 60 mm-Schalen wurden in zehnfachen seriellen Verdünnungen des Virus in einem Volumen von 200 ul Eagles MEM + 2 % Serum von neugeborenen Kälbern infiziert. Nach einer einstündigen Adsorptionsperiode wurde das Inokulum entfernt, und die Einzelschichten wurden mit 5 ml Eagles MEM, das 0,7 % Seakem Le Agarose und 10 % Serum von neugeborenen Kälbern enthielt, überschichtet. Die Schalen wurden bei 37 *C inkubiert. Am 4. Tag nach der Infektion wurden die Einzelschichten durch Zugabe einer zusätzlichen Schicht angefärbt, die aus 5 ml 0,6 % Agarose bestand, die 0,04 % Neutralrot enthielt. Plaques wurden 6 Stunden nach dem Anfärben beobachtet.

Wie in Tabelle 3A gezeigt, weisen die Copenhagen-Deletionsmutanten identische Plaquebildungsfähigkeiten auf Schweinenieren-LLC-PK1-Zellen im Vergleich mit menschlichen MRC-5-Zellen auf. Rekombinante Viren, bei denen entweder das K1L (vP661) oder C7L (vP706) deletiert ist, während das andere Human-Wirtsbereichsgen erhalten blieb, bildeten sowohl auf MRC-5- als auch auf LLC-PK1-Zellen Plaques. Rekombinante Viren, bei denen sowohl K1L als auch C7L (vP716) deletiert ist, ergaben weder auf MRC-5-noch auf LLC-PK1-Zellen Plaques. Beruhend auf dem Kriterium der in vitro Plaquebildungsfähigkeit auf der LLC-PK1-Zellinie, sind somit beide Vaccinia-Human-Wirtsbereichsgene K1L und C7L ebenfalls Schweine-Wirtsbereichsgene. Wie mit der menschlichen Zellinie MRC-5 beobachtet worden war, reicht die Anwesenheit von entweder K1L oder C7L im Vaccinia-Genom aus, um die Plaquebildung des Copenhagen-Vaccinia-Virus auf Schweinenieren-LLC-PK1-Zellen zu erlauben. Wie im Falle der Vaccinia-Human-Wirtsbereichsge-ne sind K1L und C7L die einzigen Vaccinia-Schweine-Wirtsbereichsgene, die im Copenhagen-Stamm des Vaccinia-Virus codiert sind, da das rekombinante Vaccinia-Virus vP716 (K1L-; C7L“) auf LLC-PK1-Zellen keine Plaques lieferte.

Diese Ergebnisse wurden bestätigt durch die Verwendung von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die Wirtsbereichsgene in die WR Vaccinia-Deletionsmutante vP293 inseriert enthielten (Tabelle 3B). Wie erwartet, fehlt vP293, das eine große Deletion enthält, die sich vom C7L- bis zum K1 L-Bereich erstreckt, die Fähigkeit, Plaques auf LLC-PK1-Zellen zu bilden. Die Insertion des K1L-Gens in vP293 reicht aus, um der resultierenden Vaccinia-Rekombinanten (vP457) Wachstum auf LLC-PK1-Zellen zu erlauben. Wie jedoch mit menschlichen MRC-5-Zellen beobachtet wurde, ist die Insertion des M1L-Gens in die WR-Deletionsmutante vP293 nicht ausreichend, um eine Plaquebildung des resultierenden Virus (vP596) auf LLC-PK1-Zellen zu erlauben (Tabelle 3B).

Wenn man entweder das Vaccinia-Virus-Gen C7L oder K1L oder das 77 kDa-Kuhpocken-Virus-Gen in die WR-Deletionsmutante vP293 inseriert, wird die Fähigkeit, Plaques auf Human-MRC-5-Zellen zu bilden, wiederhergestellt (Tabelle 3B). Ähnlich bilden die auf vP293 basierenden Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die entweder C7L (vP638) oder das 77 kDa Kuhpockengen (vP698) enthalten, Plaques auf LLC-PK1-Zellen. Somit ist das 77 kDa-Kuhpockengen, außer daß es ein Wirtsbereichsgen für CHO- (54) und Human-Zellen darstellt, zusätzlich auch ein Wirtsbereichsgen für Schweinezellen. 18 ΑΤ 400 955 Β TABELLE 3 A. Auf Copenhagen basierende Deletionsmutanten Virus Deletion VERO MRC-5 LLC-PK1 CHO vP410 + + + - vP661 K1L + + + - vP706 C7L + + + - vP716 K1L, C7L + - - - vP668 [C7L - K1L] + - - - B. Auf WR vP293 basierende Deletionsmutanten Virus Insert VERO MRC-5 LLC-PK1 CHO vP293 + - - - vP457 K1L + + + - vP596 M1L + - - - vP638 C7L + + + - vP698 Kuhpocken 77kDa + + + +

Beispiel 10

Wachstum von Copenhagen-Deletionsmutanten auf menschlichen Zellinien

Unter normalen Wachstumsbedingungen (3 Tage, Noble Difco-Agar-Auflage) bildete die WR-Deletions-mutante vP293 keine Plaques auf einer menschlichen MRC-5-Zell-Einzelschicht. Mit zunehmender Inkubationsdauer jedoch oder durch Modifikation der Agar-Oberschichtung kann vP293 auf MRC-5-Zell-Einzel-schichten kleine Plaques bilden. Insbesondere fördert die Verwendung von 0,6 % bis 1 % Seakem-Agarose oder Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt für die Überschichtung anstelle von Agar die Bildung von kleinen Plaques von vP293-Virus auf MRC-5-Zellen. Durch Rekombination zwischen vP293 und auf pHES basierenden Plasmiden, die das K1L-Gen (Beispiel 3) enthalten, erzeugte rekombinante Vaccinia-Nachkom-menschaft bildete auf einer MRC-5-Einzelschicht große Plaques, die deutlich vom Hintergrund der kleinen vP293-Plaques zu unterscheiden waren. Daher wurde die Fähigkeit von vP293 und von der Copenhagen-Reihe der Human-Wirtsbereichs-Deletionsmutanten untersucht, eine begrenzte Infektion in MRC-5- und VERO-Zellen unter einer flüssigen Überschichtung zu installieren.

Wie angegeben, wurden zweifach T-75-Kolben mit 5 x 106 MRC-5- oder VERO-Zellen geimpft. Nach zwei Tagen wurden die konfluenten Einzelschichten, wie in Tabelle 3 gezeigt, mit Vaccinia-Virus einer moi von 0,01 pfu pro Zelle (Anfangstiter 103 pfu pro Kolben) mit einem Volumen von 0,5 ml MEM + Serum von neugeborenem Kalb (NCS) infiziert. Nach einer einstündigen Adsorptionsperiode wurde zu jedem Kolben 10 ml Medium gegeben. Ein Kolben jeder Reihe wurde sofort eingefroren (1 hpi-Probe). Die verbleibenden Kolben wurden bis 96 hpi bei 37'C inkubiert und dann eingefroren. Das Virus von allen Proben wurde durch 3 Einfrier- und Auftau-Zyklen geerntet und auf VERO-Zellen getitert. MRC-5- und VERO-Zellen wurden mit einer moi von 0,01 pfu pro Zelle infiziert. Nach 96 Stunden Inkubation (96 hpi) wurde das Virus geerntet und auf VERO-Zellen getitert.

Copenhagen-Mutanten, die eine Deletion eines der beiden Human-Wirtsbereichsgene enthalten, vP661 (C7L+, K1L“) und vP706 (C7L-, K1L+), zeigten eine mit der vP410 (C7L+, K1 L+)-Kontrolle beinahe gleiche Multiplikation (3 bis 4 logio) sowohl auf MRC-5- als auch auf VERO-Zellen. Copenhagen-Mutanten, bei denen beide Human-Wirtsbereichsgene deletiert waren, vP716 (C7L~, K1L“) und vP668 ([C7L bis K1L]-) zeigten ebenso wie die WR-Deletionsmutante vP293 (21,7 kb Deletion) eine zu vP410, vP661 und vP706 beinahe äquivalente Multiplikation auf VERO-Zellen. Die Multiplikation der Virus-Deletionsmutanten vP716, vP668 und vP293 war auf menschlichen MRC-5-Zellen eindeutig positiv, wenn auch drastisch reduziert, wenn man sie mit der Multiplikation dieser Viren auf VERO-Zellen vergleicht. Unter den hier verwendeten Bedingungen sind alle drei Vaccinia-Viren vP716, vP668 und vP293, bei denen beide Vaccinia-Human-Wirtsbereichsgene K1L und C7L deletiert sind, in der Lage, menschliche MRC-5-Zellen erfolgreich, aber stark reduziert zu infizieren (ungefähr eine zehnfache Multiplikation innerhalb von 96stündiger Infektion). Diese in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse stimmen mit den früheren Berichten über eine 2,3fache Multiplikation innerhalb einer 36-Stunden-lnfektion (6) überein. 19

AT 400 955 B TABELLE 4

Wachstum von Vaccinia-Deletionsmutanten auf VERO-und MRC-5-Zellen Virus Deletionen Titer bei 96 hpi1 Multiplikation des Virus2 VERO MRC-5 VERO MRC-5 vP410 - 1.9 x 107 1.0 x 10« 5588 6250 vP661 K1L 3.8 x 107 1.1 x 107 9268 3235 vP706 C7L 2.3 x 107 8.6 x 10« 10000 3440 vP716 C7L, K1L 1.3 x 107 3.4 x 104 4375 11 vP668 [C7L- K1L] 8.0 x 10« 6.4 x 104 2857 21 vP293 [WR 21.7kb] 6.9 x 10« 6.4 x 103 3833 7 1 Eingangstiter beträgt 103 2Das Verhältnis des Titers bei 96 hpi (Stunden nach Infektion) zum Titer bei 1 hpi (Ende der Adsorptionsperiode)

Um zu bestimmen, ob das Vaccinia-Virus, bei dem die Human-Wirtsbereichsgene C7L und KlL deletiert sind, zur begrenzten Multiplikation auf anderen menschlichen Zellinien als MRC-5 in der Lage ist, wurde die Multiplikation der Copenhagen-Vaccinia-Viru$-MutantevP668 [Deletion von C7L bis K1 LJ auf drei zusätzlichen menschlichen Zellinien im Vergleich zu MRC-5- und VERO-Zellen untersucht (Tabelle 5).

Die Zellen wurden zwei Tage vor der Infektion mit 1,5 x 106 Zellen pro Schale in 60 mm Schalen ausgesät. Vaccinia-Virus vP410 und vP668 wurden mit einer moi von 0,01 pfu pro Zelle in einem Volumen von 0,5 ml MEM + 5 % Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) zu je zwei Schalen gegeben, die Einzelzellschichten jeder Zellinie enthielten. Nach einer einstündigen Adsorptionsperiode wurden zu jeder Schale 4 ml Medium gegeben, und die Hälfte der Schalen wurde eingefroren (1 hpi-Proben). Die übrigen Schalen wurden bis 96 hpi bei 37 "C inkubiert und dann eingefroren (96 hpi-Proben). Alle Proben wurden durch 3 Gefrier- und Auftau-Zyklen geerntet, und das Virus wurde auf VERO-Zellen getitert. Für jeden Zeitpunkt wurden zwei Schalen infiziert und der Durchschnitt der Titer verwendet. Die Multiplikation jedes Virus auf jeder Zellinie ist als Verhältnis des bei 96 hpi erhaltenen Titers zum Titer bei 1 hpi ausgedrückt. TABELLE 5

Die Multiplikation von Copenhagen-Vaccinia-Virus vP410 und vP668 auf Affen- und menschlichen Zellinien1 Zellinie Virus Ausbeute %2 vP668/vP410 vP410 vP668 Affe VERO 70,212 13,103 18.6 Mensch MRC-5 7,333 10 0.14 WISH 19,480 0.4 0.002 HeLa 50,000 0.4 0.0008 Detroit 9,660 2.8 0.03 'Verwendete Zellinien: VERO: Affenniere ATCC CCL 81; MRC-5: Menschliche embryonale Lunge ATCC CCL 171; HeLa: Menschlicher Cervix, epithelioidales Karzinom ATCC CCL 2; WISH: menschliches Amnion (HeLa-Marker) ATCC CCL 25; Detroit; Menschliche Vorhaut ATCC CCL 54. 2% Ausbeute νΡ688/νΡ410 für jede Zellinie ist das Verhältnis der Multiplikation von vP668 (96 hpi/1 hpi) geteilt durch die Multiplikation von vP410 (96 hpi/1 hpi) x 100.__

vP668-Virus zeigt eine Ein-Iog-Multiplikation auf MRC-5-Zellen während einer 96-Stunden-lnkubations-periode. Die Ausbeute von vP668-Virus 96 Stunden nach der Infektion (hpi) der Detroit (menschliche VorhautJ-Zellinie beträgt das 2,8-fache des Titers nach der Adsorption des Virus (1 hpi). Für WISH 20

AT 400 955 B (menschliches Amnion)- und HeLa (menschliches Cervix epithelioidales Karzinom)-Zeliinien betrug die Ausbeute von vP668-Virus 96 hpi weniger als die nach der Adsorption bei 1 hpi beobachtete, was zeigte, daß auf diesen Zellinien keine virale Replikation der Copenhagen-Vaccinia-Wirtsbereichs-Deletionsmutante vP668 stattfand. Alle Zellinien waren für Vaccinia-Virus permissiv, wie durch die Multiplikation des Kontroll-Virus vP410 gezeigt wurde. Andere Forscher haben ebenfalls Unterschiede in der Fähigkeit von verschiedenen menschlichen Zellinien gefunden, das Wachstum ihrer Wirtsbereichs-Mutanten 2u fördern (6).

Beispiel 11

Wirtsbereichs-Mutanten von Vaccinia-Virus als Vakzin-Vektoren

Wirtsbereichs-Mutanten des Vaccinia-Virus würden als rekombinante Vakzin-Vektoren von Vorteil sein. Die Verminderung und Abwesenheit der Replikation sollte die Sicherheitserwartung erhöhen, da der virale Vektor in den behandelten Arten, z.B., wie oben beschrieben, Mensch oder Schwein, defekt in der Replikation ist. Dies würde vorteilhafterweise die Möglichkeit einer durch die Vakzinierung verursachten ungehemmten Infektion im vakzinierten Individuum vermindern und auch eine Übertragung von vakzinierten auf unvakzinierte Individuen oder eine Kontamination der Umgebung verringern.

Deswegen sind diese Wirtsbereichs-Mutanten nützliche Vakzin-Vektoren. Die Deletionsmutante vP293 (Beispiel 3) beherbergt ein fremdes genetisches Element. Zu diesem Zweck sind ferner Rekombinante, die Pseudorabies-Virus-Gene (ein relevantes Schweinevakzin) enthalten und Rekombinante, die Tollwut-Virus-Glycoprotein (das nicht nur für veterinäre Anwendungen, sondern auch für Menschen Bedeutung hat) exprimieren, sind ebenfalls konstruiert und hier beschrieben worden. Es ist ohne weiteres verständlich, daß sich eine Reihe fremder Gene in diesen Wirtsbereichs-Mutanten verwenden läßt. Ferner ist ohne weiteres verständlich, daß sich weitere, zusätzlich zu den in dieser Anmeldung zitierten Arten mit einer Wirtsbe-reichs-Einschränkung dieser Vaccinia-Mutanten durch die erfindungsgemäßen Verfahren auffinden lassen.

Ferner ist außerdem leicht verständlich, daß es im Pockenvirus weitere Wirtsbereichsgene gibt. Beispielsweise wurde berichtet, daß der Vaccinia-MVA-Vakzin-Stamm besonders in immun-supprimierten Tieren attenuiert ist. Kürzlich wurde berichtet, daß das K1 L-Human-Wirtsbereichsgen in MVA zum Teil deletiert ist (55). Die gegenwärtige Untersuchung des MVA-Genoms bestätigt die publizierte Deletion im K1L-Gen, zeigte aber, daß das zweite Human-Wirtsbereichsgen C7L in MVA anwesend ist, obwohl das MVA-Vaccinia-Virus auf menschlichen Zellen keine Plaques ergibt. Der Promotorbereich stromaufwärts des C7L-Gens im MVA ist mit dem stromaufwärts liegenden Bereich im hier angeführten Copenhagen identisch. Die Aminosäuresequenz des vermuteten C7L-Translationsproduktes für MVA ist identisch mit dem von Copenhagen. Dies zeigt, daß das C7L-Human-Wirtsbereichsgen, das sowohl in WR als auch in Copenhagen funktionell gleichartig mit dem Kl L-Human-Wirtsbereichsgen zu sein scheint, selbst nicht in der Lage ist, das Wachstum des MVA-Vaccinia-Virus auf menschlichen Zellen zu spezifizieren. Ferner überträgt der Ersatz des defekten K1L-Gens in MVA durch das intakte K1L-Gen von Copenhagen, die Fähigkeit, auf menschlichen Zellen zu wachsen, nicht auf die hybride Vaccinia-Virus-Rekombinante. MVA-Vaccinia-Virus ist ebenfalls in seiner Fähigkeit eingeschränkt, auf Affenzellen zu wachsen, was auf das Vorhandensein eines anderen oder von anderen bisher nicht identifizierten Wirtsbereichsgen(en) schließen läßt. Unter der Anwendung ähnlicher zu den hier beschriebenen Methoden sollte es möglich sein, die für diese Einschränkungen notwendigen Gene zu bestimmen.

Es ist ferner eine anerkannte Tatsache, daß andere Pockenviren, wie Vogelpocken und Schweinepok-ken, in bezug auf ihre Replikation in Vogel- bzw. Schweinearten wirtsbeschränkt sind. Diese Wirtsorganismus-Beschränkungen legen das Vorhandensein einer Reihe von Wirtsbereichsgenen in Pockenviren nahe. Die Bestimmung dieser Gene durch erfindungsgemäße Methoden kann das Repertoire an konstruierten Wi rtsbereichs-Pockenvirus-Vektoren erhö hen.

Beispiel 12

Insertion des Tollwut-Glycoprotein-Gens in den TK-Deletions-Ort von verschiedenen Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutanten

Das Tollwut-Glycoprotein wurde als Modell für die Insertion eines fremden Gens in verschiedene Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutanten gewählt, um die vergleichende Analyse relativer Wirkungen dieser Deletionen zu ermöglichen. Das Gen für das Tollwut-Glycoprotein (18, 42) wurde unter die Kontrolle des synthetischen Vaccinia-H6-Promotors gestellt. Diese Expressionskassette wurde in das Copenhagen-TK-Deletions-Vektor-PlasmidpSD513VC inseriert. pSD513VC ist ein Subclon des Copenhagen-Vaccinia-Hindlll 21

AT 400 9SS B J-Fragmentes, in dem die codierenden Sequenzen für das Thymidin-Kinase- (TK-) Gen (56) durch einen Polylinkerbereich ersetzt sind. Der Polylinkerbereich besteht aus der die Restriktionsstellen Smal, BgIII, Xhol, Pstl, Narl und Barn Hl spezifizierenden Sequenz 5' CCCGGGA-GATCTCTCGAGCTGCAGGGCGCCGGATCC 3'. Das das Tollwut-Glycoprotein-Gen enthaltende resultierende Plasmid wurde mit pRW842 bezeichnet. In pRW842 sind codierende Sequenzen des Vaccinia-TK-Gens durch die H6-Promotor/Tollwut-Glycoprotein-Gen-Kassette, die bezüglich der flankierenden Vaccinia-Arme von links nach rechts orientiert ist, ersetzt. Die Rekombination zwischen pRW842 und irgendeinem Vaccinia-Virus ergibt ein TK-Minus-Virus, das das Tollwut-Glycoprotein-Gen unter der Kontrolle des H6-Promotors enthält.

Eine Rekombination wurde zwischen pRW842 und dem Satz von Copenhagen-Vaccinia-Viren, die Deletionen in einem oder in beiden Human-Wirtsbereichsgenen enthielten, durchgeführt. Der resultierende Satz von Vaccinia-Rekombinanten, die das Tollwut-Glycoprotein-Gen enthielten, ist in Tabelle 6 aufgeführt. Affen- (VERO-) Zellen wurden mit dem Satz von Vaccinia-Rekombinanten, die das Tollwut-Gen enthielten, infiziert. Unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen das Tollwut-Glycoprotein gerichtet sind (42), wurde eine Immunpräzipitation durchgeführt. Alle Rekombinanten exprimieren das Gen. TABELLE 6

Copenhagen-Deletionsmutanten, die das Tollwut-Glycoprotein-Gen enthielten Ausgangs-Virus Plasmid-Donor Rekombinantes Virus Deletionen Expression des Tollwut-Glycoproteins vP410 pRW842 vP744 TK + vP661 pRW842 VP745 TK, K1L + vP706 pRW842 vP746 TK, C7L + vP716 pRW842 vP750 TK, C7L, K1L + vP668 pRW842 vP752 TK, [C7L - K1L] +

Die Vaccinia-Rekombinante vP750 enthält das Tollwut-Glycoproteingen in einem C7L~-, K1 L"-Hinter-grund. vP752 enthält das Tollwutgen in einem [C7L bis K1L)-Deletions-Hintergrund. Da jedes der beiden Human-Wirtsbereichsgene in diesen beiden Vaccinia-Rekombinanten fehlte, erwartete man von diesen Rekombinanten keine produktive Infektion von menschlichen Zellen. Um zu testen, ob das Tollwutgen in menschlichen Zellen in Abwesenheit der Human-Wirtsbereichsgene exprimiert werden kann, wurden MRC-5-Zellen mit dem vollständigen Satz der Tollwut-Vaccinia-Rekombinanten einschließlich vP750 und vP752 infiziert. Bei allen Mitgliedern dieses Satzes ließ sich auf der Oberfläche der infizierten Zellen Immunfluoreszenz nachweisen.

Beispiel 13

Clonierung und Expression von Pseudorabies- (PRV-) Genen in einem vP668-Hintergrund

Die Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutante vP668, die eine Deletion enthält, die sich über die Bereiche erstreckt, die die Human- und Schweine-Wirtsbereichsgene [C7L bis K1L] umfaßt, wurde als Basis-Vektor ausgewählt. vP668 bildet auf menschlichen MRC-5-Zellen oder Schweinenieren-LLC-PK1-Zellen keine Plaques (siehe Tabelle 3). Die Pseudorabies-Gene gll, glll und gp50, die eine Homologie mit dem Herpes simplex-Virus- (HSV-) Genen gB (57) bzw. gC (58) und gD (59) enthalten, wurden, wie nachstehend im Detail beschrieben, in den vP668-Vektor inseriert. A. Inserieren des PRV-Glycoprotein-gll-Gens in den HA-Deletions-Ort des Copenhagen-Vaccinia-Virus PRV-DNA wurde mit BamHI gespalten und die resultierenden Fragmente wurden in pBR322, das mit BamHI gespalten worden war, cloniert. Das das PRV BamHI-Fragment 1 (60) enthaltende Plasmid pPR9.25 enthält das gesamte Gen für das PRV-Glycoprotein gll. Die Teile von pPR9.25, die das Gen für gll (57) enthalten, wurden in pBR322, pUCl8 und den M13-Phagen subcloniert. Die Nucleotid-Sequenz für das gll-Gen wurde bestimmt (46). 22

AT 400 955 B

Die das PRV-gll-Gen codierenden Sequenzen wurden in das Copenhagen-Vaccinia-Vektor-Plasmid pTP15 (50) inseriert. Im resultierenden Plasmid pPR18 liegt das gll-Gen im Copenhagen-Vaccinia-Hämag-glutinin- (HA-) Deletionsort unter der Kontrolle des H6-Vaccinia-Promotors. Die Rekombination zwischen dem Plasmid pPR18 und der Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutante vP668 resultiert in der Vaccinia-5 Rekombinanten vP726. In vP726 ist das PRV-gll-Gen in den HA-Deletionsort unter der Kontrolle des frühen/späten Vaccinia-Promotors H6 inseriert. Alle 5'- und 3'-PRV-DNA, die nicht zum Gen gehört, ist entfernt worden. Eine die Termination der frühen Vaccinia-Transcription spezifizierende Sequenz (39) ist stromabwärts der PRV-gll-codierenden Sequenz inseriert worden. 7o B. Insertion des PRV-gp50-Gens in den ATI-Deletionsort des Copenhagen-Vaccinia-Virus

Die das Gen für das PRV-Glycoprotein gp50 codierende DNA liegt im BamHI-Fragment 7 des PRV-Genoms (61). Das Plasmid pPR7.1 enthält das in die BamHI-Stelle von pBR322 clonierte PRV BamHI-Fragment 7. Ein Stul/Ndel-Subfragment von pPR7.1, das das gesamte Gen für PRV gp50 enthält, wurde in 75 plBI25 subcloniert, wodurch das Plasmid pPR22 erzeugt wurde. Die Nucleotid-Sequenz für das gp50-Gen wurde bestimmt (46).

Die PRV gp50-codierenden Sequenzen wurden unter die Kontrolle des frühen/mittleren Vaccinia-Promotors gesetzt, der mit den Sequenzen unmittelbar stromaufwärts von I3L (62, 63) äquivalent ist. Dieses Promotor-Element ist früher zur Expression von fremden Genen in Vaccinia-Virus-Rekombinanten verwen-20 det worden (31, 64). Die mit den Promotorsequenzen stromaufwärts des offenen Leserahmens I3L (62) korrespondierende DNA wurde mit einer Polymerase-Kettenreaktion (65) unter Verwendung der synthetischen Oligonucleotid-Primer P50PPBAM (5' ATCATCGGATCCCGGTGGTTTGCGATTCCG 3') und P50PPATG (5' GATTAAACCTAAATAATTG 3') und pMPIVC, einem Subclon von Copenhagen Hindlll I, als Matrize synthetisiert. Das resultierende Fragment wurde mit BamHI gespalten, um kohäsive BamHI-Enden 25 an den 5'-Enden der Promotorsequenz zu erzeugen. Das 3’-Ende blieb stumpfendig.

Die PRV-gp50-codierenden Sequenzen wurden aus dem Plasmid pPR22 ausgeschnitten. Das Plasmid pPR22 wurde mit Nsil, das 7 bp stromaufwärts des ATG spaltet und ein 3'-überhängendes Ende ergibt, gespalten. Das 3'-überhängende Ende wurde mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit von 2 mM dNTPs stumpfendig gemacht. Die resultierende DNA wurde partiell mit Bgjll gespalten, und ein 1,3 kb stumpfendi-30 ges/Bglll-Fragment, das das PRV-gp50-Gen enthielt, wurde isoliert.

Das 126 bp l3L-Promotor-Fragment (BamHI/stumpfendig) und das das gp50-Gen enthaltende 1.3 kb Fragment (stumpfendig/Bglll) wurden mit einem pBS-SK-Plasmid-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA), der mit BamHI gespalten worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pBSPRV50l3 bezeichnet. Die Expressionskassette, die den mit dem PRV-gp50-Gen verbundenen l3L-Promotor enthielt, wurde durch die 35 Spaltung mit BamHI und die anschließende partielle Spaltung mit Smal entfernt. Ein den/das l3L-Promo-tor/PRVgp50-Gen enthaltendes 1,4 kbp Fragment wurde isoliert und unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der E. coli-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. pSD541 ist ein Copenhagen-Deletions-Plasmid, in dem die flankierenden Arme für den ATI-Deletionsbe-reich (siehe pSD494VC) unter Verwendung von Subclonen des Copenhagen-Hindlll A als Matrize durch 4o eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (65) erzeugt wurden. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN267 (5’ GGGCTGAAGCTTGCGGCCGCTCATTAGACAAGCGAATGAGGGAC 3') und MPSYN268

(5 * AGATCTCCCGGGCTCGAGTAATTAATTAATTTTTATTACACCAGAAAAGACGGCTT 45 GAGATC 3 ') wurden als Primer verwendet, um den 420 bp Vaccinia-Arm rechts der Deletion herzustellen. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN269 50

(5' TAATTACTCGAGCCCGGGAGATCTAATTTAATTTAATTTATATAACTCATTTTTTG AATATACT 3') und MPSYN270 (5’ TATCTCGAATTCCCGCGGCTTTAAATGGACGGAACTCTTTTCCCC 3’) wurden als Primer verwendet, um dem 420 bp Vaccinia-Arm links der Deletion herzustellen. Die vorstehend erzeugten linken und rechten 23 55

AT 400 955 B

Vaccinia-Arme wurden miteinander vermischt und durch eine weitere Polymerase-Kettenreaktion verlängert, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das sowohl aus linken als auch aus rechten flankierenden Vaccinia-Armen bestand, die durch einen die Restriktionsstellen Bglll, Smal und Xhol spezifizierenden Polylinkerbereich getrennt waren. Das PCR-erzeugte Fragment wurde zum Erhalt adhäsiver Enden mit Hindlll und Xhol gespalten und mit pUC8, das mit Hindlll und EcoRI gespalten worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid ist pSD541.

Das stumpfendige 1,4 kb Fragment, das den/das !3L-Promotor/PRVgp50-Gen enthielt, wurde in das Copenhagen-Vektor-Plasmid pSD541, das mit Smal gespalten worden war, inseriert. In dem resultierenden Plasmid pATIpSO liegt das PRV-gp50-Gen in dem Copenhagen-Vaccinia-ATI-Deletionsort, unter der Kontrolle eines 126 bp Vaccinia-l3L-Promotor-Elementes. In pATIpSO ist jede unnötige PRV-DNA 3’-seitig des Gens entfernt worden. 7 bp der unnötigen PRV-Sequenzen verbleiben unmittelbar stromaufwärts des PRV-gp50-ATGs. Eine frühe Vaccinia-Transkriptions-Terminationssequenz (39) liegt stromabwärts der PRV gp50 codierenden Sequenzen. Zwischen dem Plasmid ρΑΤΙρδΟ und der Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutante vP668 wurde eine Rekombination durchgeführt. C. Inserieren des PRV-Glycoprotein-glll-Gens in den TK-Deletions-Ort des Copenhagen-Vaccinia-Virus

Die das PRV-Glycoprotein-glll codierenden Sequenzen kartieren auf den BamHI-Fragmenten 2 und 9 des PRV-Genoms (58). Die Plasmide pPR9.9 und pPR7.35 enthalten, cloniert in die BamHI-Stelle von pBR322, die PRV-BamHI-Fragmente 2 bzw. 9. Ein das 5'-Ende des PRV-glll-Gens enthaltendes Sphl/BamHI-Fragment wurde aus pPR9.9 isoliert. Ein den Rest des glll-Gens enthaltendes Ncol/BamHI-Fragment wurde aus pPR7.35 isoliert. Das gesamte PRV-glll-Gen wurde durch Ligation der beiden Fragmente in plBI25 eingebaut und ergab des Plasmid pPR17. Die Nucleotid-Sequenz des glll-Gens wurde bestimmt (46).

Das PRV-glll-Gen wurde unter die Kontrolle eines Copenhagen-Vaccinia-u-Promotor-Elementes gestellt, womit sich das Plasmid pPR24 ergab (die Vaccinia-u-Promotorsequenz ist im Beispiel 5, Fig. 5, beschrieben). Eine ein 120 bp Vaccinia-u-Promotor-Element und das gesamte PRV-gplll-Gen enthaltende Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pPR24 durch Spaltung mit SnaBI (in Position -120 stromaufwärts des Initiations-Codons) und mit Dral stromabwärts des PRV-glll-Gens herausgeschnitten. Das stumpfendige den/das u-Promotor/PRV-gplIl-Gen enthaltende 1,5 kb Fragment wurde isoliert und mit dem mit Smal gespaltenen Copenhagen-Vector-Plasmid pSD513VC ligiert, um pPRVIIIVCTK zu erhalten. In pPRVIIIVCTK wurden die Vaccinia-TK codierenden Sequenzen durch das PRV-glll-Gen ersetzt, das in einer Rechts-nachlinks-Orientierung unter der Kontrolle des 120 bp Copenhagen-Vaccinia-u-Promotor-Elementes inseriert war. Alle unnötigen PRV-Sequenzen 5’ und 3' des glll-Gens sind entfernt worden. Zwischen dem Plasmid pPRVIIIVCTK und der Copenhagen-Vaccinia-Deletionsmutante vP668 wurde eine Rekombination durchgeführt. D. Expression von PRV-gll in der Vaccinia Rekombinante vP726

Die Expression von PRV-gll in der Copenhagen-Vaccinia-Rekombinante vP726 wurde in VERO-, LLC-PK1- und MRC-5-Zellen getestet. vP726 enthält PRV-gll in einem vP668-Hintergrund [Deletion von C7L bis K1L] und man würde von ihr deshalb nicht erwarten, daß sie eine produktive Infektion in Schweinenieren-LLC-PK1- und menschlichen MRC-5-Zellen etabliert. Dennoch zeigt eine Immunfluoreszenz-Analyse, bei der ein spezifisch gegen PRV-gpll gerichteter monoklonaler Antikörper verwendet wurde, überraschenderweise die Expression des PRV-gpll-Genproduktes in Schweine-, Affen- und menschlichen Zellen. E. Konstruktion von Doppel- und Dreifach-PRV-Rekombinanten im vP668-Copenhagen-Vaccinia-Virus-Hintergrund

Zur Konstruktion von Vaccinia-Rekombinanten, die multiple PRV-Gene enthalten, wurde eine Rekombination durchgeführt. Die Rekombinationen wurden unter Verwendung der Donor-Plasmide pATIpSO (PRV-gp50, ATI-Deletionsort) und pPRVIIIVCTK (PRV-glll, TK-Deletionsort) und des Rettungsvirus vP726, der Copenhagen-Vaccinia-Rekombinante, die PRV-gll im HA-Deletionsort in einem [C7L bis K1 L]-Deletions-Hintergrund enthält, durchgeführt. Diese Rekombinationen erzeugen Vaccinia-Rekombinanten, die doppelte Insertionen der PRV-Gene gll + gp50 bzw. gll + glll erzeugen. Eine dieser Vaccinia-Doppel-PRV-Rekombinanten wird als Rettungsvirus zur Rekombination mit dem geeigneten Plasmid verwendet, um die Dreifach-Rekombinante zu erzeugen, die die PRV-Gene gll + gp50 + glll enthält. 24

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Beispiel 14

Konstruktion eines auf dem Vaccinia-Virus-Stamm, Copenhagen basierenden Wirtsbereichs-Selektionssy-stems

Zur Konstruktion eines auf dem Copenhagen-Vaccinia-Virus basierenden Wirtsbereichsselektionssystems (COPCS) wurden Plasmide konstruiert, um DNA zu deletieren, die den Bereich umfaßt, der die Gene von C7L auf der linken Seite bis K1L auf der rechten Seite codiert (Fig. 8). Von Vaccinia-Viren, die diese Deletion enthalten, würde man nicht erwarten, daß sie auf menschlichen Zellen wachsen, da beide Wirtsbereichsgene C7L (Beispiel 7) und K1L (15) deletiert wurden. Es wurden ebenfalls Plasmide zur Deletion des sich vom C6L bis zum K1L erstreckenden Bereiches konstruiert. Da die C6L- bis K1 L-Deletion das Human-Wirtsbereichsgen C7L nicht entfernt, würde man erwarten, daß Vaccinia-Viren, die diese Deletion enthalten, auf menschlichen Zellen wachsen.

Mit Bezug auf Fig. 14 wurde das Plasmid pSD420 (Fig. 14), das einen Sall-Clon der Copenhagen-Vaccinia-Virus-DNA (Fig. 8, 10) enthält, hergestellt. Ein Fragment aus dem Hindill C-Bereich des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen wurde aus pSD420 durch Spalten mit Xbal (Pos. 685) mit einem anschließenden Stumpfendigmachen mit dem Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Spaltung mit Bglll (Pos. 1764) abgeleitet. Das resultierende 1079 bp Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. pSD451 (Fig. 9, 14) ist ein Plasmid, das Vaccinia-Copenhagen-DNA zwischen der Sphl-Stelle in Hindill M (Pos. 9478) und der Kpnl-Stelle in Hindlll K (Pos. 12998) enthält. Ein Fragment aus dem Hindlll K-Bereich des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen wurde aus pSD451 durch Spaltung mit Bglll (Pos. 11116) und EcoRV (Pos. 11834) hergeleitet. Das 718 bp Restriktionsfragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Beide Fragmente wurden mit pUC8, das mit Hindlll gespalten, mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase stumpfendig gemacht und mit Smal gespalten worden war, ligiert (Fig. 14). Das resultierende Plasmid wurde mit pMP581CK bezeichnet. pMP581CK (Fig. 14) enthält das C7L-Gen (gefüllter Block, Transkriptions-Richtung durch Pfeil angezeigt). pMP581CK enthält eine nur einmal existierende Bgllll-Stelle, die von einem von Hindlll C abgeleiteten linken Vaccinia-Arm (Pos. 685 bis 1764) und von einem von Hindlll K abgeleiteten rechten Vaccinia-Arm (Pos. 11116 bis 11834) flankiert wird. Der linke Vaccinia-Arm enthält das gesamte Gen für C7L (codierende Sequenzen Pos. 1314 bis 863). Bezüglich des Vaccinia-Copenhagen-Genoms sind die beiden Arme durch eine 9351 bp Deletion (Pos. 1315-11115) voneinander getrennt. Die Deletions-Stelle zwischen den Hindlll C-Sequenzen und den Hindlll K-Sequenzen ist in Fig. 14 durch Dreiecke gekennzeichnet.

Zur Entfernung der überflüssigen DNA an den Deletions-Verbindungen wurde pMP58lCK mit Bglll gespalten und anschließend mit Bal3l-Exonuclease abgebaut. Eine Mutagenese (53) wurde an der doppeis-trängigen Matrize unter Verwendung des synthetischen 49mer Oligonucleotides MPSYN228 (5' TTTCTTAA-T AAAT ATT ATTTTT ATTT AAATT CGT AG CG AT AT AT AAAAC 3') durchgeführt. Das resultierende Plasmid pMPCTKIA behält das Vaccinia-Human-Wirtsbereichsgen C7L. Zwischen den Positionen 1513 bis 11165 ist es deletiert, und es sind elf Gene, C6L bis K1L deletiert (Fig. 8). Die Rekombination zwischen dem Plasmid pMPCTKIA und vP458, einem rekombinanten Copenhagen-Vaccinia-Virus, der das E. coli-lacZ-Gen im M2L-Deletionsort enthält, erzeugt die Vaccinia-Rekombinante vP664. Wie erwartet, ist vP664 in der Lage, Plaques auf menschlichen Zellen zu bilden, da es das intakte C7L-Gen behalten hat.

Zur Entfernung der C7L-codierenden Sequenzen (Pos. 1314 bis 863) und von überschüssiger DNA an den Deletions-Verbindungen wurde pMP581CK mit Ncol gespalten und anschließend mit Bal31-Exonuclea-se abgebaut. Eine Mutagenese (53) wurde an der doppelsträngigen Matrize durchgeführt unter Verwendung des synthetischen 44mer-Oligonucleotides MPSYN233 (5' TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAA-TAATATTTATT 3'). Das resultierende Plasmid pMPCSKIA ist zwischen den Positionen 862 bis 11163 deletiert, und es sind zwölf Gene C7L bis K1L deletiert. Die Rekombination zwischen dem Plasmid pMPCSKIA und vP458 erzeugt die Vaccinia-Rekombinante vP668. Wie erwartet, ist vP668 nicht in der Lage, auf menschlichen Zellen Plaques zu bilden, da beide Wirtsbereichsgene K1L und C7L deletiert worden sind.

Eine Serie von Plasmiden wurde von pMPCTKIA durch Hinzufügen von synthetischer Polylinker-DNA an der Deletions-Verbindung abgeleitet. Die Konstruktion von Plasmiden in der COPCS-Serie ist in den Figuren 15 bis 17 Zusammengefaßt. Die DNA-Sequenzen aller in der Konstruktion dieser Plasmide verwendeten synthetischen Oligonucleotide sind in den Figuren 15 bis 17 wiedergegeben.

Das Plasmid pMPCTKIA (Fig. 14) wurde einer partiellen Dral-Spaltung unterworfen, und lineare DNA wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN238/MPSYN239 wurden aneinander gelagert und an der Deletions-Verbindung in einer Rechts-nach-links-Orientierung mit pMPCTKIA ligiert, wodurch sich das Plasmid pMPCS-1 ergab. 25

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Um an einem kleinen offenen Leserahmen, der von links in den Polylinkerbereich hineinläuft (ATG Pos. 1485) ein Stop-Codon anzufügen, wurde pMPCS-1 mit Pstl gespalten. Es wurde eine Mutagenese durchgeführt (53) unter der Verwendung des synthetischen 72mer-Oligonucleotids MPSYN249

(5' GTTTGTTTTATATATCGCTACGAATTTAAATAAAAATTATTTATTTATAGATCTAG AGTCGACCCGGGTACC 3').

Das resultierende Plasmid pCOPCS-4 (auf das in Fig. 17 durch seine alternative Bezeichnung pMPCS-4 hingewiesen wird) besitzt keine offenen Leserahmen, die in den Polylinkerbereich hineinlaufen oder ihn verlassen.

Um den Vaccinia-H6-Promotor an den Polylinkerbereich anzufügen, wurde pMPCS-1 mit Hindlll und Asp718 gespalten. Ein synthetisches Hindlll/Asp718-DNA-Fragment, das aus dem modifizierten H6-Promo-tor (Beispiel 3) besteht, wurde inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-3H ergab (die Promotorsequenz ist in Fig. 17 angegeben). Alle von pCOPCS-3H abgeleiteten nachfolgenden Plasmide pCOPCS-5H bis pCOPCS-10H enthalten den H6-Promotorbereich, der in Fig. 17 für pCOPCS-3H angegeben ist. Die dem Promotorbereich pCOPCS-3H folgende Sequenz in Klammern ist durch die für pCOPCS-5H bis pCOPCS-10H in Klammern angegebenen Sequenzen ersetzt. Die ATG-Initiations-Codons für die Plasmide pCOPCS-6H bis pCOPCS-10H sind unterstrichen. Es wird darauf hingewiesen, daß pCOPCS-3H und pCOPCS-5H keine ATG-Initiations-Codons stromaufwärts des Polylinkerbereiches enthalten. Der Translations-Rahmen, der mit dem ATG in den Plasmiden pCOPCS-6H bis pCOPCS-10H beginnt, ist angegeben. Um an den vorstehend genannten kleinen offenen Leserahmen von pMPCS-1 ein Stop-Codon anzufügen, wurde eine gleichartige Mutagenese unter Verwendung von MPSYN249 an pCOPCS-3H durchgeführt, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-5H ergab.

Um dem Plasmid pCOPCS-5H stromabwärts des H6-Promotors in allen Leserahmen bezüglich der Polylinker-Restriktionsstellen ein ATG-Initiations-Codon hinzuzufügen, wurde pCOPCS-5H in der Nrul-Stelle im H6-Promotor und an der Bglll-Stelle in dem Polylinkerbereich gespalten. Das Vektor-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN250/MPSYN251 wurden aneinander gelagert und in den pCOPCS-5H-Vektor inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-6H ergab.

Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN252/MPSYN253 wurden aneinander gelagert und in den pCOPCS-5H-Vektor inseriert, wodurch sich das Plasmid pC0PCS-7H ergab.

Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN254/MPSYN255 wurden aneinander gelagert und in den Vektor pCOPCS-5H inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-8H ergab. pCOPCS-6H, pCOPCS-7H und pCOPCS-8H enthalten den H6-Promotor mit einem ATG-Initiations-Codon, an das sich Restriktionsstellen in den drei verschiedenen Leserahmen anschließen. Die erste und die zweite codierte Aminosäure in diesen Plasmiden sind die folgenden: pCOPCS-6H met/val; pCOPCS-7H met/gly und pCOPCS-8H met/gly. Da das met/gly-Motiv in einigen Zusammenhängen (66) eine myristyla-tion? des translatierten Polypeptids spezifizieren kann, wurde das Plasmid pCOPCS-6H modifiziert, um Plasmide zu erzeugen, die ATG-Initiations-Codons in den anderen beiden Leserahmen enthielten, die wie pCOPCS-6H die Translation nicht mit einem met/gly-Motiv begonnen haben. pCOPCS-6H wurde mit Nrul und Asp718 gespalten, und das Vektor-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN271/MPSYN272 wurden aneinander gelagert und in den pCOPCS-6H-Vektor inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-9H ergab.

Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN273/MPSYN274 wurden aneinander gelagert und in den pCOPCS-6H-Vektor inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-10H ergab. Die beiden ersten in diesen Plasmiden codierten Aminosäuren sind die folgenden: pCOPCS-9H met/ser und pCOPCS-1 OH met/thr.

In der abschließenden COPCS-Serie wird die aus der codierenden Sequenz mit einem Promotor bestehende DNA zur Expression in pCOPCS-4 inseriert; die ein ATG enthaltenden codierenden Sequenzen werden zur Expression in pCOPCS-5H inseriert und codierende Sequenzen ohne ein ATG-Initiations-Codon werden zur Expression im geeigneten Leserahmen in eines oder mehrere Mitglieder der pCOPCS-6H- bis pCOPCS-1 OH-Serie inseriert. Die resultierenden Plasmide werden durch Rekombination in die Copenhagen-Vaccinia-Virus-Deletionsmutante vP668 gebracht, wodurch die Fähigkeit des Vaccinia-Virus zur Plaquebildung auf menschlichen Zellen wiederhergestellt wird. 26

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Beispiel 15 Nützlichkeit des COPCS-Systems für die Analyse der Promotor-Stärke

Die Fähigkeit der unter Verwendung des Copenhagen-Vaccinia-Virus vP668/COPCS-Plasmid-Wirtsbe-reichs-Selektionssystems durch Rekombination erzeugten rekombinanten Vaccinia-Nachkommenschaft zur Plaquebildung auf menschlichen MRC-5-Zellen erlaubt die schnelle Identifizierung von Rekombinanten. Das vP668/COPCS-System läßt sich zur Erzeugung von Vaccinia-Rekombinanten für eine Reihe von Zwecken verwenden.

Das Plasmid pCOPCS-4, ein Mitglied der COPCS-Serie, das stromaufwärts seines Polylinkerbereiches keinen Promotor enthält, wurde mit Bglll gespalten. Ein Bglll-Fragment, das die vollständige codierende Sequenz für das Tollwut-Glycoprotein-Gen (18, 42) enthielt, wurde in einer Rechts-nachlinks-Orientierung in pCOPCS-4 inseriert, wodurch sich das Plasmid pCOPCS-RAB ergab. Der Polylinkerbereich in pCOPCS-RAB liegt stromaufwärts des Tollwut-Gens. In den Polylinkerbereich von pCOPCS-RAB stromaufwärts des Tollwut-Glycoprotein-Gens sind eine Reihe von synthetischen Promotorbereichen und Promotoren, die sich vom Vaccinia-Virus oder anderen Pocken-Viren ableiten, inseriert worden. Die resultierenden Plasmide werden zur Rekombination mit der Vaccinia-Virus-Copenhagen-Deletionsmutante vP668 verwendet. Die rekombinante Nachkommenschaft wird aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, auf MRC-5-Zellen Plaques zu bilden. Die relative Promotor-Stärke läßt sich unter der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers durch die mengenmäßige Bestimmung der Expression des Tollwut-Glycoprotein-Gens in der rekombinanten Virus-Nachkommenschaft untersuchen. Zusätzliche Verwendungen sind mit denen des vP293 Wirtsbereichs-Selektions-Systems vergleichbar.

Beispiel 16

Deletion der invertierten terminalen Wiederholungen von Vaccinia-Virus

Eine große Menge der DNA von Vaccinia läßt sich deletieren, ohne dessen Fähigkeit zu zerstören, auf Gewebekultur zu wachsen. Zur Erhöhung der Stabilität des Vaccinia-Genoms und zum Entfernen nicht essentieller Gene, die mit der Virulenz assoziiert sein können, wurde in einer einzelnen Vaccinia-Virus-Rekombinante eine Deletion von 32,7 kb DNA vom linken Terminus und 14,9 kb DNA vom rechten Terminus vorgenommen.

Das Vaccinia-Virus-Genom besteht aus doppelsträngiger DNA. An jedem Terminus ist die DNA der komplementären Stränge durch einen DNA-Strang verbunden, der eine unvollständig basengepaarte terminale Schleife bildet (67). Unmittelbar innerhalb der terminalen Schleife enthält das Genom Sätze von Tandem-Wiederholungen. Es ist berichtet worden, daß eine clonierte Version des WR-Genoms 13 Tandem-Kopien einer 70 bp Wiederholungs-Einheit in der Nähe eines jeden Endes des Genoms enthält, die durch 435 bp nicht-repetitiver DNA von einem zusätzlichen Block aus 17 Tandem-Kopien der 70 bp Wiederholungs-Einheit getrennt sind (68). Die terminale Schleife und die repetitive DNA bilden den distalen Teil der invertierten terminalen Wiederholung von Vaccinia. Die invertierte terminale Repetition, die bei der clonier-ten Version von WR (69) auf 10 kb geschätzt worden war, enthält eine Reihe von Genen, die in zwei Kopien im Vaccinia-Genom vorhanden sind, da sie sowohl in linken als auch in rechten Kopien der invertierten terminalen Repetition enthalten sind.

Wenn DNA, die aus der plaque-clonierten Stammlösung des hier verwendeten Copenhagen-Vaccinia-Virus (VC-2) extrahiert wurde, mit Restriktions-Endonucleasen gespalten und auf einem Agarosegel analysiert wird, weisen die terminalen Fragmente Heterogenität auf. Statt als einzelne Bande zu wandern, erscheinen die terminalen Fragmente als eine Leiter, deren Sprossen ungefähr 1 kb voneinander entfernt sind. Es wurde bei ungefähr 80 % der Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die als Plaque-Isolate von VC-2 abgeleitet sind, oder bei dessen Derivaten, die ihrerseits heterogene Termini enthalten, durch Restriktions-Analyse festgestellt, daß sie heterogene Termini enthalten. In den übrigen 20 % der Vaccinia-Rekombinanten ist die Heterogenität der Termini verlorengegangen, und die terminalen DNA-Restriktions-Fragmente erscheinen als diskrete Banden. Wenn man neue Rekombinanten aus Viren mit diskreten Termini ableitet, beobachtet man für diese Rekombinanten immer, daß sie diskrete Termini enthalten.

Da die Termini der Virus VC-2-Stammlösung heterogen waren, wurde zur Clonierung in ein Plasmid das terminale Fragment des rekombinanten Virus vP452, ein VC-2-Derivat, das diskrete Termini enthielt, ausgewählt. Im vP452 sind die Vaccinia-Gene TK (Thymidin-Kinase) und HA (Hämagglutinin) (50) deletiert. Von vP452 wurde DNA extrahiert und mit Xhol gespalten, und die 2-molare terminale Bande mit ungefähr 7 kb wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das isolierte Fragment wurde einer eingeschränkten Abbau mit 27

AT 400 9S5 B BAL-31-Exonuclease unterworfen und anschließend mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Das stumpfendige Fragment wurde in die Smal-Stelle von pUC8 cloniert, wodurch pSD522VC hergestellt wurde (Fig. 18).

Die DNA-Sequenzierung von pSD522VC zeigt, wie im Fall des WR-Vaccinia die Termini der Copenha-gen-Vaccinia-Rekombinante vP452 Tandem-Wiederholungseinheiten enthalten. Zusätzlich zu den genannten Blocks von 70 bp Tandem-Wiederholungs-Einheiten des plaque-clonierten WR-Isolates enthalten die Termini von vP452, anders als das WR-Isolat, Tandem-Wiederholungs-Einheiten, die sich aus 54 bp, die innerhalb der 70 bp Tandem-Wiederholungs-Einheiten und proximal zu codierenden Sequenzen liegen, zusammensetzen. Fig. 19 führt die Sequenz eines Teils des Copenhagen-Genoms auf, beginnend mit der innersten Kopie der 54 bp Tandem-Wiederholungs-Einheit (Pos. 1 bis 54). Die in Fig. 19 gezeigte 13978 bp Sequenz wurde aus pSD522VC und verschiedenen Clonen der VC-2-Copenhagen-DNA in auf pUC-basierenden Plasmiden abgeleitet. Es schließt die codierenden Sequenzen im Hindlll C rechtsseitig des Endblockes der Tandem-Wiederholung mit ein. Die in Fig. 19 gezeigte Sequenz endet an der Sall-Stelle, die den Anfang der in Fig. 8 gezeigten Sequenz von Copenhagen-DNA darstellt.

Um ein Plasmid zu erzeugen, daß die vom Terminus von vP452 abgeleitete repetitive Vaccinia-DNA enthält, bei dem aber codierende Vaccinia-Sequenzen deletiert sind, wurde pSD522VC mit Clal und Hindlll gespalten und ein 7 kb Fragment isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN261 (5' CGATTCAGA-C ACACGCTTT GAGTTTT GTT G AAT CG AG AT CT A 3') und MPSYN262 (5’ AGCTTAGATCTCGATTCAACAAAACTCAAAGCGTGTGTCTGAAT 3') wurden aneinander gelagert und mit dem pSD522VC-Vektor-Fragment ligiert, wodurch pMPVCEND erzeugt wurde. pMPVCEND enthält Vaccinia-DNA vom Ende von pSD522VC (ungefähr 50 Basenpaare vom Ende des Genoms) bis einschließlich der Tandem-Wiederholungs-Blöcke, endend mit der Clal-Stelle bei Position 338 von Fig. 19. Ein kleiner ORF (Pos. 292 bis 336), der die Clal-Stelle bei Position 305 überbrückte, wurde in den synthetischen Oligonucleotiden MPSYN261/MPSYN262 rekonstruiert, die ebenfalls eine Bglll-Stelle zur Erleichterung zukünftiger Clonierungsschritte einführen. pMPVCEND, das keine ORFs enthielt, die aus der internen Vaccinia-DNA zum Terminus führte, wurde als Plasmid-Vektor und externer Arm zur Schaffung von Plasmiden verwendet, die zur Deletion von Genen sowohl vom linken als auch rechten Terminus von Vaccinia bestimmt sind.

In der Nähe des linken Terminus wurden alle Gene bis zum Gen, das die kleine Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase codiert, das im Hindlll F (70) liegt, deletiert. Die Sequenz für Copenhagen-Hindlll F wurde bestimmt und ist in Fig. 20 aufgeführt. Vaccinia-Hindlll F liegt unmittelbar rechts von Hindlll K. Die in Fig. 20 gezeigte DNA-Sequenz liegt in unmittelbarer Nachbarschaft zur in Fig. 8 gezeigten Sequenz, die die gesamte Sequenz von Hindlll K einschließt. Die kleine Untereinheit für Ribonucleotid-Reduktase wird durch ORF F4 (Pos. 3506 bis 2547, Fig. 20) codiert.

Um zu testen, ob die 10 Gene (K2L bis F4L) unmittelbar rechts der vP668-Deletion (C7L bis K1L) nicht essentiell waren, wurde das Plasmid pMPCTFRA wie folgt konstruiert. pSD521VC ist ein Subclon von Copenhagen-Hindlll F, enthaltend die Sequenzen der Hindlll K/F-Verbindung (Verbindung von Fig. 8/Fig. 20) Zusätze A/C bis zur alleinig vorkommenden BamHI-Stelle des Hindlll F-Fragments (Fig. 20, Pos. 5663). Um einen flankierenden Arm rechts von F4 zu erhalten, wurde pSD521VC mit Clal in der Position 3576 stromaufwärts der F4-codierenden Sequenzen und mit Bglll in der Position 2841 innerhalb der F4L-codierenden Sequenzen gespalten. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN256 (5’ CGATGTACAAAA-AAT CCAAGT ACAGG C AT ATAG AT AACT GA 3') und MPSYN257 (5’ GATCTCAGTTATCTA- TATGCCTGTACTTGGATTTTTTGTACAT 3') wurden aneinander gelagert und mit dem Vektor-Plasmid pSD521VC zwischen die Clal- und die Bgjll-Stellen ligiert. Im resultierenden Plasmid pMP256/257 ist der Promotorbereich stromaufwärts des F4-ORFs wieder gebildet und mit einer Bglll-Stelle verknüpft. Um den rechten flankierenden Vaccinia-Arm zu erhalten, wurde pMP256/257 mit Bglll und EcoRI gespalten, und ein 2,3 kb Fragment, das die Vaccinia-Sequenzen stromaufwärts des F4-Gens enthielten, wurde isoliert. Der linke flankierende Vaccinia-Arm von Hindlll C wurde aus dem Plasmid pCOPCS-4 (Beispiel 14) erhalten, das das Gen für C7L und weitere 140 bp Vaccinia-DNA links davon enthält. pCOPCS-4 wurde mit Bglll und EcoRI gespalten und das 3,5 kb Vektorfragment mit dem 2,3 kb Fragment, das den rechten Arm von Hindlll F enthält, ligiert. Das resultierende Plasmid pMPCTFRA enthält einen linken Vaccinia-Arm von Hindlll C und einen rechten Arm von Hindlll F, die eine Deletion von 20 Genen [C6L bis F4L] flankieren. pMPCTFRA wurde als Donor-Plasmid zur Rekombination mit vP668 (Beispiel 9) verwendet und ein rekombinantes Virus durch Wachstum auf MRC-5-Zellen selektioniert. Es wurde eine lebensfähige Vaccinia-Nachkommenschaft, vP749 (Deletion von C6L bis F4L) gewonnen, wodurch nachgewiesen war, daß alle Gene in dem deletierten Bereich nicht essentiell waren.

Um alle Gene vom linken Ende von Vaccinia bis einschließlich F4L zu deletieren, wurde das Plasmid pMPLENDÄ (Fig. 18) wie folgt konstruiert. Ein rechter flankierender Arm von Hindlll F wurde durch Spaltung 28

AT 400 955 B von pMPCTFRA mit Smal und Bglil und dem anschließenden Isolieren des 2,3 kb Fragmentes erhalten. pMPVCEND (Fig. 18), das die DNA-Tandem-Wiederholungen vom vP452-Terminus enthält, wurde mit Hindill gespalten, anschließend mit Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit Bglll gespalten. Die beiden Fragmente wurden miteinander ligiert und ergaben pMPLENDA. In pMPLENDA setzt sich der linke Vaccinia-Arm aus Tandem-Wiederholungs-Einheiten und der rechte Arm aus DNA, die sich aus Hindill F ableitet, zusammen. Im Plasmid pMPLENDA sind die am weitesten links liegenden 38 Gene [C23L bis F4L) des Copenhagen-Genoms, insgesamt 32681 bp, deletiert (von Hindill C: Fig. 19, Pos. 340 bis zum Ende (13638 bp deletiert); von Hindill C, Μ, N und K: alle von Fig. 8 (15537 bp) und von Hindill F: Fig. 20, Pos. 1 bis 3506).

Um die Gene vom rechten Ende des Genoms zu deletieren, wurde das Plasmid pMPRENDA zur Bereitstellung mit den flankierenden Vaccinia-Armen für die Deletion des hämorrhagischen (u) Vaccinia-Bereichs (Beispiel 5) und aller rechts dieses Bereiches liegenden Gene konstruiert. Die Sequenz von Hindlll B, des am weitesten rechts liegenden Hindlll-Fragmentes im Genom, wurde durch das Sequenzieren verschiedener auf pUC-basierender Clone dieses Bereichs bestimmt (Fig. 21). Ein Vergleich der von den linken und den rechten Bereichen abgeleiteten Sequenzen des Genoms zeigt, daß die terminale Repetition sich bis zur Position 8104 von Fig. 19 erstreckt. Somit enthält die hier untersuchte invertierte terminale Repetition des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen 8,1 kb des codierenden Bereiches zusätzlich zu den Blöcken der Tandem-Wiederholungen. Die am weitesten links liegenden 9 ORFs in Hindlll C, ORFs C23L bis C15L, korrespondieren mit den am weitesten rechts liegenden 9 ORFs in Hindlll B, ORFs B29R bis B21R. Fig. 21 enthält die Sequenz von Copenhagen-Hindlll B. Sie beginnt an der Hindlll A/B-Verbindung und setzt sich nach rechts bis zum am weitesten rechts liegenden ORF fort, der in einer alleinig vorkommenden DNA-Sequenz beginnt (B20R). Die rechte Kopie der terminalen Repetition beginnt bei Position 17132 von Fig. 21, 14 bp vor dem Ende des B20R-ORFs. pSD477VC ist ein auf pUC-basierender Ncol/Nrul-Subclon von Copenhagen-Vaccinia Hindlll B (Fig. 21, Pos. 9713 bis 11299), der den hämorrhagischen (u)-Bereich (ORFs B13R und B14R) enthält. pSD478VC (Fig. 18) ist ein Abkömmling von pSD477VC, in dem der gesamte u-Bereich (Pos. 10024 bis 11014, Fig. 21) durch einen die Bglll-Stelle einschließenden multiplen Clonierungs-Bereich ersetzt ist. Das Paar von synthetischen Oligonucleotiden, die zu diesem Zweck aneinander gelagert wurden, war das SD41mer (5’ CG ATT ACT AGAT CTG AGCT CCCCGGGCT CG AGGGAT CCGTT 3’) und das SD39mer (5' AACGGATCCCTCGAGCCCGGGGAGCTCAGATCTAGTAAT 3'). Um einen flankierenden Vaccinia-Arm links des u-Bereichs zu erhalten, wurde pSD478VC mit EcoRI an der Verbindung von pUC/Vaccinia-Sequenzen gespalten, mit dem Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit Bglll gespalten. Es wurde ein 0,3 kb Fragment isoliert, das den Vaccinia-u-Promotorbereich und flankierende Sequenzen links des u-Bereichs enthält. Dieses Fragment wurde mit einem Vektor-Fragment ligiert, das durch Spalten von pMPVCEND mit Hindlll, Stumpfendigmachen mit dem Klenow-Fragment von E. coli-Polymerase und Spalten mit BgJII erhalten worden war. Das resultierende Plasmid pMPRENDA enthält einen linken Vaccinia-Arm, der aus der Hindlll B-DNA stromaufwärts des B13R-ORFs abgeleitet war und den B13R (u)-Promotorbereich miteinschließt. Der rechte Vaccinia-Arm in pMPRENDA besteht aus Blöcken von Tandem-Wiederholungen und ist mit dem im Deletionsplasmid für das linke Ende, pMPLENDA vorhandenen linken Vaccinia-Arm identisch. Die beiden Arme von pMPRENDA flankieren eine Deletion von 17 ORFs [B13R bis B29R]. Die Gesamtgröße der Deletion zwischen den flankierenden Vaccinia-Armen ist im Deletionsplasmid für das rechte Ende, pMPRENDA, 14873 bp, die alle von Hindlll B stammen (Sequenz in Fig. 21 dargestellt, Pos. 10024 bis 17145; sich in der invertierten terminalen Repetition fortsetzend, wobei die deletierte Sequenz äquivalent zu der in Fig. 19, Pos. 8090 bis 340 ist). Die Strategie für die Konstruktion der Deletions-Plasmide pMPLENDA und pMPRENDA ist schematisch in Fig. 18 dargestellt. Die gefüllten Blöcke kennzeichnen Copenhagen-Vaccinia-DNA, die aus vom Terminus vP452 abgeleiteten Tandem-Wiederholungen bestehen; leere Blöcke kennzeichnen andere Copenhagen-Vaccinia-DNA. Die Lage der Deletionen in den Plasmiden pMPCTFRA, pSD478VC, pMPLENDA und pMPRENDA ist durch Dreiecke gekennzeichnet.

Um den Selektionsdruck bei der Erzeugung von rekombinantem Vaccinia-Virus, bei dem eine große Menge DNA an beiden Seiten des Genoms deletiert ist, auszunutzen, wurden zwei selektierbare Marker verwendet. Der erste ist das Vaccinia C7L-Human-Wirtsbereichsgen (Beispiel 7) mit einer Selektion der rekombinanten Virus-Nachkommenschaft auf menschlichen MRC-5-Zellen. Der zweite ist das E. coli-Gen, das das Gen für Guaninphosphoribosyl-Transferase (Ecogpt-Gen) mit einer Selektion einer rekombinanten Vaccinia-Virus-Nachkommenschaft unter der Verwendung von Mycophenolsäure (2,8), Codiert.

Um ein bewegliches Fragment zu erzeugen, das nur das Vaccinia-Gen C7L und seinen Promotor erhält, wurde pCOPCS-4 mit Ncol nahe des 3'-Endes des C7L-Gens (Pos. 870, Fig. 8) und mit BamHI 148 bp stromabwärts der C7L-codierenden Sequenzen gespalten. Das Ende des C7L-Gens wurde unter Verwen- 29

AT 400 955 B düng der synthetischen Oligonucleotide MPSYN258 (5' CATGGATTAATTAATTTTTTTG 3’) und MPSYN259 (5’ GATCCAAAAAAATTAATTAATC 3')· die aneinander gelagert und mit dem Vektor-Fragment ligiert wurden, rekonstruiert, wodurch das Plasmid pMP258/259 hergestellt wurde. pMP258/259 wurde mit Bglll und BamHI gespalten und ein 660 bp-Fragment, das das C7L-Gen und seinen Promotor enthielt, wurden für die Insertion in die Deletionsplasmide für das linke bzw. das rechte Ende pMPLENDA und pMPRENDA isoliert.

Ein 670 bp Bglll/BamHI-Fragment, das das Ecogpt-Gen enthielt, wurde aus dem Plasmid pSV2gpt (ATCC Nr. 37145) (71) durch das Hinzufügen eines BamHI-Linkers an der Ahalll-Stelle stromabwärts der codierenden Sequenzen (72) abgeleitet.

Die Plasmide pMPLENDA und pMPRENDA, die Vaccinia-Deletionen nahe des linken bzw. rechten Endes des Vaccinia-Genoms enthalten, wurden mit Bglll gespalten. Die Bglll/BamHI-Fragmente, die das C7L-Gen und das Ecogpt-Gen enthielten, wurden in die Plasmid-Vektoren inseriert, womit insgesamt vier Plasmide hergestellt wurden (Tabelle 7). Es wird darauf hingewiesen, daß das C7L-Gen sowohl in pMPLAC7 als auch in pMPRAC7 unter der Kontrolle seines eigenen Promotors steht. Das Ecogpt-Gen steht in pMPLgpt unter der Kontrolle des F4L-Promotors und in pMPRgpt unter der Kontrolle des B13R (u)-Promotors. Zwischen den in Tabelle 7 aufgeführten Plasmiden und den Rettungsviren wurde eine Rekombination durchgeführt. Die rekombinante Vaccinia-Virus-Nachkommenschaft aus den das C7L-Gen einführenden Rekombinationen wurden durch Plattieren auf MRC-5-Zellen selektioniert; die Nachkommenschaft aus den das Ecogpt-Gen einführenden Rekombinationen wurden durch Züchten in Gegenwart von Mycophenol-säure selektioniert. Es wird darauf hingewiesen, daß die Selektion durch Wachstum auf MRC-5-Zellen vorteilhaft unter der Verwendung eines Rettungsvirus wie z.B. vP668 ausgeführt wird, bei dem sowohl C7L als auch K1L deletiert sind. 30

AT 400 955 B TABELLE 7 λ. Konstruktion der Plasmide für die Deletionen nahe der Copenhagen-Termini

Plaeaid-Subatrat» selektierbarer Jterker Plasmid — Produkt Deletion pKPLEHDA C7L pMPLAC7 C23L-F4L pKPLEHDÄ t£27P- pKPLgpt C23L-F4L pKPRZHDA C7L PMPRAC7 B13R-B29R pKPRENDA Ecooot pKPRgpt B13R-B29R B. In-vivo-Rekombinationen unter Verwendung von Deletions-Plasmiden mit Copenhagen-Vaccinia-Virus

Rettungsvirus

Plasmid

Vaecinia“ Deletion" Mutante vP668(TX*, {C7L-K1L]*) vP668{TK*, [C7L-K1L]') vP617(TK*, ATI*, HÄ*) vP617(TK*, ATI*. HA*) pKPLAC7{[C23t-F4if, C7L*) vP789 pKPRAC7([B13R-B29R]*, C7L*) vP774 pKPRjpt([B13R-B29R]*, Ecotrcr* ) vP759 pKPLgpt([C23L-F4L]*, Ecoqpt* \ vP791 vP723(TK*, ATI*, HA*, ü‘) pKPLgpt({C23L-F4L]*, Sfißgpt*) VP796 vP796(TK*, ATI*, HA*, [C23L-F4L]*, ΐ££ςρt*) pKPRAC7{[BI3R-B29RJ* ♦ C7L) vPSll

Die rekombinante Vaccinia-Virus-Deletion-Mutante vP796 wurde durch Rekombination zwischen dem Deletions-Plasmid für das linke Ende, das den selektierbaren Marker Ecogpt, pMPLgpt, trägt, und dem Rettungsvirus vP723, bei dem zusätzlich die TK- und HA-Gene ebenso wie der ATI- und u-äquivalente Bereiche deletiert sind, erzeugt. Gemäß einer DNA-Restriktions-Analyse ist bei vP769 der [C23L bis F4L]-Bereich genauso wie die TK-, HA-, ATI- und u-Bereiche deletiert. Da die 38-Gen-Deletion nahe des linken Endes von vP796 sowohl C7L als auch K1L umfaßt, wurde vP796 als Rettungsvirus für die Rekombination mit pMPRAC7, dem C7L-enthaltenden Deletions-Plasmid für das rechte Ende, verwendet. Die resultierende Vaccinia-Rekombinante, vP811, die Deletionen nahe der beiden Termini enthielt, wurde durch Züchten auf MRC-5-Zellen selektioniert. 31

AT 400 955 B

Literaturverzeichnis 1. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E.A., Reiss, B., and H. Schaller, Gene 19, 327-336 (1982). 2. Eioyle, D.B. and B.E.H. Coupar, Gene 65, 123-128 (1988). 3. Chakrabarti, S., Brechling, K., und B. Moss, Mol. Cell. Biol. 5, 3403-3409 (1985). 4. Clewell, D.B., J. Bacteriol. VIO, 667-676 (1972). 5. Clewell, D.B. and D R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 62, 1159-1166 (1969). 6. Drillien, R„ Koehren, F., and A. Kirn, Virology VH, 488-499 (1981). 7. Drillien, R„ Spehner, D., and A. Kirn, J. Virol. 28, 843-850 (1978). 8. Falkner, F.G. and B. Moss, J. Virol. 62,1849-1854 (1988). 9. Fathi, Z., Sridhar, P„ Pacha, R.F., and R.C. Condit, Virology 155, 97-105 (1986). 10. Fenner, F. and J.F. Sambrook, Virology 28, 600-609 (1966). 11. Franke, C.A., Rice, C.M., Strauss, J.H., and D.E. Hruby, Mol. Cell. Biol. 5, 1918-1924 (1985). 12. Gangemi, J.D. and D.G. Sharp, Virology 85, 262-270 (1978). 13. Gemmell, A. and F. Fenner, Virology 21. 219-235 (1960). 14. Gillard, S., Spehner, D., and R. Drillien, J. Virol. 53, 316-318 (1985). 15. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., and A. Kirn, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 5573-5577 (1986). 16. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb, Virology 54, 536-539 (1973). 17. Hruby, D.E., Lynn, D.L., Condit, R., and J.R. Kates, J. gen Virol. 47, 485-488 (1980). 18. Kieny, M.P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wictor, T., Koprowski, H„ and J.P. Lecocq, Nature (London) 312 163-166 (1984). 19. Lake, J.R. and P.D. Cooper, J. gen Virol. 48, 135-147 (1980). 20. Mackett, M., Smith, G.L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 7415-7419 (1982). 21. Mackett, M. and J.R. Arrand, EMBO 4, 3229-3235 (1985). 22. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982). 23. Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V., and H. Stickl, Infection 3, 6-14 (1975). 24. McClain, M.E., Aust. J. exp. Biol. med. Sei. 43, 31-44 (1965). 25. Moyer, R.W. and C.T. Rothe, Virology 102, 119-132 (1980). 26. Nakano, E., Panicali, D„ and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1593-1596 (1982). 27. Panicali, D„ Davis, S.W., Mercer, S.R., and E. Paoletti, J. Virol. 37, 1000-1010 (1981). 28. Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4927-4931 (1982). 29. Panicali, D., Grzelecki, A., and C. Huang, Gene 47,193-199 (1986). 30. Perkus, M.E., Panicali, D., Mercer, S., and E. Paoletti, Virol. 152, 285-297 (1986). 31. Perkus, M.E., Piccini, A., Lipinskas, B.R., and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985). 32. Piccini, A., Perkus, M.E., and E. Paoletti, In: Methods in Enzymology, Vol. 153, ed. Wu, R. and L. Grossman (Academic Press), pp. 545-563 (1987). 33. Rosel, J.L., Earl, P.L., Weir, J.P., and B. Moss, J. Virol. 60 436-449 (1986). 34. Shapira, S.K., Chou, J., Richaud, F.V., and M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983). 35. Southern, P.H. and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982). 36. Tagaya, I., Kitamura, T., and Y. Sano, Nature (London) 192, 381-382 (1961). 37. Wachsman, M„ Aurelian, L., Smith, C.C., Lipinskas, B.R., Perkus, M.E., and E. Paoletti, J. Inf. Dis. 155, 1188-1197 (1987). 38. Wilson, E.M., Hodges, W.M., and D.E. Hruby, Gene 49, 207-213 (1986). 39. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6417-6421 (1987). 40. Kotwal, G.J. and B. Moss, Virology 167, 524-537 (1988). 41. Taylor, J., Weinberg, R., Kawaoda, Y., Webster, R.G., and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988). 42. Taylor, J., Weinberg, R., Languet, B., Desmettre, P., und E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988). 43. Pickup, D.J., Ink, B.S., Hu, W., Ray, C.A., and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 7698-7702 (1986). 44. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 9§, 503-517 (1975). 45. Kotwal, G.J. and B. Moss, J. Virol. 63, 600-606 (1989). 46. Tabor, S. and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 4767-4771 (1987). 47. Patel, D.D. and D.J. Pickup, EMBO 6, 3787-3794 (1987). 48. Patel, D.D., Ray, C.A., Drucker, R.P., and D.J. Pickup, Proc. Natl. Acad: Sei. USA 85, 9431-9435 (1988). 49. Bertholet, C., Drillien, R., and R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 2096-2100 (1985). 32

Claims

ΑΤ 400 955 Β

50. Guo, Ρ., Goebel, S., Davis, S., Perkus, M.E., Languet, B., Desmettre, P., Allen, G„ and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).

51. Tamin, A., Villarreal, E.C., Weinrich, S.L., and D.E. Hruby, Virology 165, 141-150 (1988).

52. Boursnell, M.E.G., Foulds, I.J., Campbell, J.I., and M.M. Binns, J. gen Virol. 69, 2995-3003 (1988).

53. Mandecki, W„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 7177-7181 (1986).

54. Spehner, D„ Gillard, S., Drillien, R., and A. Kirn, J. Virol. 62, 1297-1304 (1988).

55. Altenburger, W., Suter, C.-P., and J. Altenburger, Arch. Virol. 105, 15-27 (1989).

56. Hruby, D.E., Maki, R.A., Miller, D.B., and L.A. Ball, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 3411-3415 (1983).

57. Robbins, A.K., Dorney, D.J., Wathen, M.W., Whealy, M.E., Gold, C., Watson, R.J., Holland, L.E., Weed, S.D., Levine, M., Glorioso, J.C., and L.W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987).

58. Robbins, A.K., Watson, R.J., Whealy, M.E., Hays, W.W., and L.W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986).

59. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984).

60. Mettenleiter, T.C., Lukacs, N., Thiel, H.-J., Schreurs, C., and H.J. Rziha, Virology 152, 66-75 (1986)

61. Petrovskis, E.A., Timmins, J.G., Armentrout, M.A., Marchioli, C.C., Yancey, Jr., R.J., and L.E. Post, J. Virol. 59, 216-223 (1986).

62. Schmitt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988).

63. Vos, J.C. and H.G. Stunnenberg, EMBO 7, 3487-3492 (1988). 64. Bücher, D., Popple, S., Baer, M„ MikhaiT, A., Gong, Y.-F., Whitaker, C., Paoletti, E., and A. Judd, J. Virol. 63, 3622-3633 (1989).

65. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., and H.A. Erlich, Science 239, 487-491 (1988).

66. Kaplan, J.M., Mardon, G., Bishop, J.M., and H.E. Varmus, Mol. Cell. Biol. 8, 2435-2441 (1988).

67. Baroudy, B.M., Venkatesan, S., and B. Moss, Cell 28, 315-324 (1982).

68. Wittek, R. and B. Moss, Cell 21, 277-284 (1980).

69. Wittek, R., Müller, H.K., Menna, A., and R. Wyler, FEBS Leiters 90, 41-46 (1978).

70. Slabaugh, M., Roseman, N., Davis, R., and C. Mathews, J. Virol. 62, 519-527 (1988).

71. Mulligan, R.C. and P. Berg., Science 209, 1422-1427 (1980).

72. Pratt, D. and S. Subramani, Nuc. Acids Res. 1^, 8817-8823 (1983). Patentansprüche 1. Verfahren zum Selektionieren eines rekombinanten Pockenvirus in einem Wirtsorganismus, gekennzeichnet durch das Kombinieren einer Donor-DNA und eines modifizierten Pockenvirus zur Bildung eines rekombinanten Pockenvirus, - wobei bei dem modifizierten Virus Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das modifizierte Pockenvirus im Wirtsorganismus nicht repliziert und - wobei die Donor-DNA (a) einen offenen Leserahmen von einer Nicht-Pockenquelle und (b) mindestens ein Wirtsbereichsgen umfaßt, das dem rekombinanten Pockenvirus erlaubt, in dem Wirtsorganismus zu replizieren; und das Identifizieren eines rekombinanten Pockenvirus auf Grund seiner Fähigkeit, in dem Wirtsorganismus zu replizieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus Vaccinia ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der offene Leserahmen von der Nicht-Pockenquelle ein /8-Galactosidase codierendes E. coli lacZ Gen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus eine menschliche Zellinie ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Zellinie MRC-5 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus-Wirtsbereichsgen das Vaccinia-Wirtsbereichsgen K1L und C7L ist. 33 AT 400 955 B
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Donor-DNA und das modifizierte Pockenvirus zur Bildung des rekombinanten Pockenvirus durch Rekombination der Donor-DNA und des modifizierten Pockenvirus kombiniert werden.
8. Verfahren zum Klonieren und Exprimieren eines offenen Leserahmens in einem rekombinanten Pockenvirus in einem Wirtsorganismus, gekennzeichnet durch das Kombinieren einer Donor-DNA und eines modifizierten Pockenvirus zur Bildung eines rekombinanten Pockenvirus, - wobei bei dem modifizierten Pockenvirus ein Wirtsbereichsgen deletiert ist, so daß das modifizierte Pockenvirus im Wirtsorganismus nicht repliziert und - wobei die Donor-DNA (a) einen offenen Leserahmen von einer Nicht-Pockenquelle und (b) das Wirtsbereichsgen umfaßt, das dem rekombinanten Pockenvirus erlaubt, in dem Wirtsorganismus zu replizieren; das Replizieren des rekombinanten Pockenvirus in dem Wirtsorganismus; und das Exprimieren des offenen Leserahmens.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus Vacciniavirus ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der offene Leserahmen von der Nicht-Pockenquelle ein /3-Galactosidase codierendes E. coli lacZ Gen ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus eine menschliche Zellinie ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Zellinie MRC-5 ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus-Wirtsbereichsgen das Vaccinia-Wirtsbereichsgen K1L und C7L ist.
14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Donor-DNA und das modifizierte Pockenvirus zur Bildung des rekombinanten Pockenvirus durch Rekombination der Donor-DNA und des modifizierten Pockenvirus kombiniert werden.
15. Donorplasmid, das ein Pockenvirus-Wirtsbereichsgen und einen offenen Leserahmen von einer Nicht-Pockenquelle umfaßt.
16. Donorplasmid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Promotor stromaufwärts des Pockenvirus-Wirtsbereichsgens umfaßt.
17. Donorplasmid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner ein stromabwärts des Promotors liegendes Translations-Initiationscodon, dem sich alleinig vorkommende multiple Restriktionsstellen, Translations-Terminations-Signalsequenzen und eine Terminations-Signalsequenz für die frühe Transkription anschließen, umfaßt.
18. Donorplasmid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet daß das Pockenvirus-Wirtsbereichsgen das Vaccinia Wirtsbereichsgen K1L und C7L ist.
19. Ein modifiziertes rekombinantes Virus zur Expression eines Genproduktes in einem Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß von dem modifizierten rekombinanten Virus Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus in dem Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist, und daß das modifizierte rekombinante Virus DNA umfaßt, die das Genprodukt im Wirtsorganismus codiert und exprimiert, wobei das Virus eine eingeschränkte Replikation im Wirtsorganismus aufweist.
20. Virus nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Virus ein Pockenvirus ist.
21. Virus nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Pockenvirus Vaccinia ist. 34 ΑΤ 400 955 Β
22. Virus nach Anspruch 19. dadurch gekennzeichnet daß das Genprodukt ein Antigen ist.
23. Virus nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus ein Vertebrat ist und das Antigen in dem Vertebraten eine Immunantwort hervorruft.
24. Virus nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet daß das Antigen aus der aus Tollwutglycoprotein-und Pseudorabiesglycoprotein-Antigen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
25. Virus nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet daß der Wirtsorganismus eine in vitro kultivierte Zelle ist.
26. Verfahren zur Expression eines Genproduktes in einem Wirtsorganismus, gekennzeichnet durch das Inokulieren des Wirtsorganismus mit einem modifizierten rekombinanten Virus, bei dem Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus im Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist und wobei das modifizierte rekombinante Virus eine DNA umfaßt, die das Genprodukt im Wirtsorganismus codiert und exprimiert, wobei das Virus eine eingeschränkte Replikation im Wirtsorganismus aufweist.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Pockenvirus ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27. dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus Vaccinia ist.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Genprodukt ein Antigen ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus ein Vertebrat ist und das Antigen in dem Vertebraten eine Immunantwort hervorruft.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus der aus Tollwutglyco-protein- und Pseudorabiesglycoprotein-Antigen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
32. Verfahren zur Expression eines Genproduktes in einer in vitro kultivierten Zelle, gekennzeichnet durch das Einführen eines modifizierten rekombinanten Virus in die Zelle, wobei bei dem modifizierten rekombinanten Virus Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus in der Zelle eine eingeschränkte Replikation aufweist und wobei das modifizierte rekombinante Virus eine DNA umfaßt, die das Genprodukt in der Zelle codiert und exprimiert, wobei das Virus eine eingeschränkte Replikation in der Zelle aufweist.
33. Vakzin zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem mit dem Vakzin inokulierten Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß das Vakzin ein Trägermaterial und ein modifiziertes rekombinantes Virus umfaßt, daß bei dem modifizierten rekombinanten Virus Wirtsbereichsgene deletiert sind, so daß das Virus im Wirtsorganismus eine eingeschränkte Replikation aufweist, und daß das modifizierte rekombinante Virus eine DNA umfaßt, die das Genprodukt im Wirtsorganismus codiert und exprimiert, wobei das Virus eine eingeschränkte Replikation im Wirtsorganismus aufweist. Hiezu 96 Blatt Zeichnungen 35