CN101935676A - 一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 - Google Patents
一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101935676A CN101935676A CN 201010258187 CN201010258187A CN101935676A CN 101935676 A CN101935676 A CN 101935676A CN 201010258187 CN201010258187 CN 201010258187 CN 201010258187 A CN201010258187 A CN 201010258187A CN 101935676 A CN101935676 A CN 101935676A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scallop
- vitro
- histocyte
- chlamys
- inducing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法。包括构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒；其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，尤其是栉孔扇贝体外培养心脏细胞，并用灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的转化细胞。本发明利用重组泛嗜性慢病毒高效的将外源基因转移到栉孔扇贝体外培养心脏细胞中，将外源基因稳定的整合到栉孔扇贝心脏细胞基因组中，使该外源基因能够持续的表达，促进细胞增殖分裂，为进一步构建栉孔扇贝细胞系奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，即利用重组泛嗜性慢病毒介导外源基因整合到体外培养的栉孔扇贝细胞中。
背景技术
海洋双壳类具较高的经济价值，是我国海水养殖业的重要组成部分。建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将为其基础生物学、病原体侵染机制、新品种开发研究以及功能基因的分析等搭建平台，并最终为扇贝细胞系的建立构建基础。但在目前的研究中多涉及添加促进细胞分裂的营养因子，其研究过程漫长、工作量大且进展缓慢。
对比于其他组织，心脏组织由于心脏围心膜的存在，在体外培养时较易克服微生物的污染，但是心脏细胞属于终末分化细胞，退出了细胞分裂周期，导致体外培养时间有限，所以采用传统方法进行心脏细胞体外培养比较困难。工作量大且易发生污染。因此急需建立一种新的体外转化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，以克服现有技术的不足。
本发明特别使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养心脏细胞，使已经退出细胞分裂周期的心脏细胞重获分裂增殖能力，表明该方法用在具有一定分裂能力的扇贝其他组织细胞中同样可以获得成功转化的细胞，具有通用性。
本发明的技术方案如下：构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒；其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2～7微克/毫升的灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的转化细胞。
扇贝体外培养心脏细胞的培养方法是：首先将扇贝心脏组织样品，尤其是栉孔扇贝心脏组织用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3天换液一次栉孔扇贝心脏细胞培养基，以维持体外培养心脏细胞正常生长。
所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法：首先在溶解了13.7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加NaCl 20.2克、KCl 0.54克、CaCl20.60克、MgSO41克和MgCl23.9克，成为1100毫渗透摩尔的高渗透压的基本培养基，即使L15培养基粉末水溶液获得与煮沸的过滤海水相近的渗透压；用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；然后再添加已经过滤除菌的5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.2～7.4。
所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液配方是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。
所述的栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5％胎牛血清的L15基本培养基。
所述的煮沸的过滤海水较已有的高压灭菌过滤海水及其制备方法更加简单、节省时间，且能很好的达到除去过滤海水中微生物的目的。
所述栉孔扇贝的组织细胞的重组泛嗜性慢病毒感染方法是将含1000～3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞12～16小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。
所述的灭瘟素筛选方法为，使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3～5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4～14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3～4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7～10天呈现被筛选出的转化细胞。
本发明利用重组泛嗜性慢病毒高效的将外源基因转移到栉孔扇贝体外培养心脏细胞中，将外源基因稳定的整合到栉孔扇贝心脏细胞基因组中，使该外源基因能够持续的表达，促进细胞增殖，为进一步构建栉孔扇贝细胞系奠定基础。
具体实施方式
本发明首先将重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，与商品化的包装载体一同转染到293FT细胞中即产生重组泛嗜性慢病毒，收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液并低温保存。
然后将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；配制栉孔扇贝心脏组织专用消毒液，配方是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至0.5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，1天～4天后心脏组织块周围迁出大量细胞，即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，随后每3天替换栉孔扇贝心脏细胞培养基2毫升，以维持体外培养心脏细胞正常生长。
诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，将含1000～3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，同时加入6微克/毫升聚凝胺，之后培养栉孔扇贝心脏细胞12～16小时即完成扇贝组织细胞体外转化(即重组泛嗜性慢病毒成功感染扇贝组织细胞，使重组SV40LT或报告基因GFP能够表达)。
灭瘟素筛选转化细胞的方法：使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3～5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4～14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3～4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7～10天呈现被筛选出的转化细胞。
实施例1
本发明首先根据已发表的SV40LT基因序列设计正、反向引物，扩增出2.1kb的SV40LT基因，在TOPO酶的作用下将SV40LT基因连接到慢病毒表达质粒中，获得重组慢病毒表达质粒；采用促转染试剂LipofectamineTM 2000将重组慢病毒表达质粒pLenti6/V5-D-TOPO/LT转染包装细胞株293FT细胞，转染24h后，镜下观察，细胞与转染前相比，状态较差，形状变圆，将转染72h时收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液，并-80℃保存。
将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升的庆大霉素和2微克/毫升的制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；配制栉孔扇贝心脏细胞培养基：首先在溶解了L15培养基粉末的水溶液中添加NaCl 20.2克/升、KCl 0.54克/升、CaCl20.60克/升、MgSO41克/升和MgCl23.9克/升；用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；然后再添加5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.2。使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至0.5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，2天后心脏组织块迁出约4000个细胞，得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞。
将含约1000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞12小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染3天后，在2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基中添加4微克灭瘟素对转化细胞进行筛选，每3天重新添加上述含有灭瘟素的培养基。筛选10天后，部分细胞脱落死亡，仍然贴壁的细胞出现分裂现象。
实施例2
根据已发表的GFP基因序列设计正、反向引物，扩增出700bp的GFP基因。在TOPO酶的作用下将GFP基因连接到慢病毒表达质粒中，获得重组慢病毒表达质粒；采用促转染试剂LipofectamineTM 2000将重组慢病毒表达质粒pLenti6/V5-D-TOPO/GFP转染包装细胞株293FT细胞，转染24h后，镜下观察，细胞与转染前相比，状态较差，形状变圆，转染48h后收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液并-80℃保存。
将栉孔扇贝心脏组织用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升的庆大霉素和2微克/毫升的制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；配制栉孔扇贝心脏细胞培养基：首先在溶解了L15培养基粉末的溶液中添加NaCl 20.2克/升、KCl 0.54克/升、CaCl20.60克/升、MgSO41克/升和MgCl23.9克/升；用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；然后再添加5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.4。使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至0.5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基；4天后心脏组织块迁出约8000个细胞，得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞。
将含约3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞16小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染5天后，在2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基中添加14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基。培养7天后，部分细胞脱落死亡，仍然贴壁的细胞在荧光显微镜下可观察到GFP基因表达产物发出绿色荧光信号。
Claims (8)
1.一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，包括构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒，其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2～7微克/毫升的灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的扇贝体外培养组织转化细胞。
2.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的扇贝体外培养的组织细胞是栉孔扇贝体外培养心脏细胞。
3.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞的感染方法是：将含1000～3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的扇贝组织细胞培养基中，同时加入6微克/毫升聚凝胺，培养扇贝组织细胞12～16小时即完成诱导扇贝组织细胞体外转化。
4.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的灭瘟素筛选方法：使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3～5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4～14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3～4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7～10天呈现被筛选出的转化细胞。
5.如权利要求2所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝体外培养心脏细胞的培养方法是：首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3天更换栉孔扇贝心脏细胞培养基一次，以维持体外培养心脏细胞正常生长。
6.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法：首先在溶解了13.7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加NaCl 20.2克、KCl 0.54克、CaCl20.60克、MgSO41克和MgCl23.9克，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；使用前再添加已过滤除菌的5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.2～7.4即制成。
7.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。
8.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5％胎牛血清的L15基本培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010258187 CN101935676A (zh) | 2010-08-20 | 2010-08-20 | 一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010258187 CN101935676A (zh) | 2010-08-20 | 2010-08-20 | 一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101935676A true CN101935676A (zh) | 2011-01-05 |
Family
ID=43389245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010258187 Pending CN101935676A (zh) | 2010-08-20 | 2010-08-20 | 一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101935676A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103060260A (zh) * | 2012-12-08 | 2013-04-24 | 中国海洋大学 | 一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010693A1 (en) * | 1989-03-08 | 1990-09-20 | Health Research, Inc. | Recombinant poxvirus host selection system |
| CN1800389A (zh) * | 2005-10-08 | 2006-07-12 | 中国科学院海洋研究所 | 栉孔扇贝h2a基因克隆与n末端表达技术 |
-
2010
- 2010-08-20 CN CN 201010258187 patent/CN101935676A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010693A1 (en) * | 1989-03-08 | 1990-09-20 | Health Research, Inc. | Recombinant poxvirus host selection system |
| CN1800389A (zh) * | 2005-10-08 | 2006-07-12 | 中国科学院海洋研究所 | 栉孔扇贝h2a基因克隆与n末端表达技术 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》 20091215 王华 栉孔扇贝（Chlamys farreri）心肌组织细胞培养的初步研究 , 第12期 2 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103060260A (zh) * | 2012-12-08 | 2013-04-24 | 中国海洋大学 | 一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法 |
| CN103060260B (zh) * | 2012-12-08 | 2015-02-25 | 中国海洋大学 | 一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞解离和分离的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohyama et al. | Flowering haploid plants obtained from protoplasts of tobacco leaves | |
| CN101491229B (zh) | 珍珠贝外套膜组织的离体培养方法及培养基 | |
| CN103436480B (zh) | 一种稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培养制备方法 | |
| CN101138321A (zh) | 一种甘蔗脱毒组培快繁的方法 | |
| CN109136167B (zh) | 百合叶肉原生质体的制备方法 | |
| CN102994401A (zh) | 一种制备苹果树腐烂病菌转化子及gfp标记菌株的方法 | |
| CN101372682B (zh) | 褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法 | |
| CN104152403B (zh) | 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系 | |
| Takahashi et al. | Improvement of microspore culture method for multiple samples in Brassica | |
| CN108707624A (zh) | 一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用 | |
| CN105198635A (zh) | 大规模培养海水小球藻的大量元素营养液 | |
| CN102827756A (zh) | 应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法和装置 | |
| CN102978154B (zh) | 一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法 | |
| CN107354098A (zh) | 一种利用丝状藻类同时培养的微藻共收获方法 | |
| CN112094814A (zh) | 一种通过灌流培养工艺制备腺病毒载体疫苗的方法 | |
| CN105039241B (zh) | 中华鳖心脏细胞连续细胞系及其构建方法和超低温冷冻保存方法 | |
| CN101935676A (zh) | 一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法 | |
| CN114409745B (zh) | 一种高效分泌表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的生产方法 | |
| CN110628693A (zh) | 小麦胚根原生质体悬浮液的制备方法 | |
| CN101451122B (zh) | 褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法 | |
| CN115340955A (zh) | 一种高效培养丛枝菌根真菌的方法 | |
| CN101451121A (zh) | 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法 | |
| CN112725377B (zh) | 白藜芦醇在电穿孔转染细胞中的应用及电转液 | |
| CN103614344A (zh) | 一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法 | |
| CN112126616B (zh) | 落叶松原生质体分离纯化及瞬时表达方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110105 |