JPH04503904A

JPH04503904A - 組換えポックスウイルス宿主選択系

Info

Publication number: JPH04503904A
Application number: JP2505067A
Authority: JP
Inventors: パオレッティ、エンゾ
Original assignee: ヘルス・リサーチ・インク
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1992-07-16
Anticipated expiration: 2015-05-22
Also published as: AT400955B; AU625584B2; GB2245272A; IE900814L; LU88000A1; US5453364A; CA2011654A1; BE1004212A5; JP3044062B2; IT9019623A0; GB9117996D0; IT1239987B; CA2011654C; DE4090351T1; WO1990010693A1; IE62441B1; DK157091A; ATA902490A; NL9020389A; AU5332090A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えポックスウィルス宿主選択系関連出願の相互参照本出願は１９８９年３月８日出願の米国特許出願第３２０．４７１号の部分継続出願である。

発明の分野本発明は修飾組換えウィルス、かかる修飾組換えウィルスを用いて宿主中で遺伝子産物を発現させる方法、並びにかかる修飾組換えウィルスを含んでなるワクチン類に関する。

また、本発明は、修飾ポックスウィルス、特に修飾ワクシニアウィルス、並びにこれらの作成及び選択方法にも関する。より詳細には、本発明は組換えポックスウィルス（特に組換えワクシニアウィルス）中での解読枠のクローニング及び発現のための選択系に関する。

本出願においては、多数の刊行物を括弧内のアラビア数字によって引用した。これらの引用文献の詳細は、本明細書の最後の「請求の範囲」の直前に記載した。

これらの引用文献には、本発明の関連技術分野の技術水準が記載されている。

発明の背景ワクシニアウィルスは外来遺伝子の挿入及び発現に使用されており、また最近ではその他のポックスウィルスも使用されるようになっている。生きた感染性ポックスウィルス中に外来遺伝子を挿入するための基本的技術として、ドナープラスミド中の外来遺伝要素を挟みこんだボックスＤＮＡ配列と救援ポックスウィルス中に存在する相同配列との間の組換えが含まれる（３２）。

詳細には、組換えポックスウィルスは、米国特許第４、６０３．１１２号に記載されているワクシニアウィルスの合成組換え体の作成法などの公知の２段階法によって構築されている。

最初に、ウィルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列（特に非ボックス起源の解読枠）を、ポックスウィルスの非必須ＤＮＡ部分と相同なりＮＡを予め挿入しておいた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）プラスミド構造体中に導入する。別個に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに連結させる。上記プロモーター−遺伝子連結体を上記プラスミド構造体中に導入して、ボックスＤＮＡの非必須領域のフランキングＤＮＡ配列と相同なり　Ｎ　Ａで該プロモーター−遺伝子連結体の両端が挟み込まれるようにする。次いで、得られたプラスミド構造体を大腸菌中で増殖させることによって増幅しく４）、単離する（５．２２）。

次に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、ポックスウィルスと共に、培養細胞（例えばニワトリ胚繊維芽細胞）に感染させる。プラスミド及びウィルスゲノム中に存在するそれぞれ相同なボックスＤＮＡ間の組換えによって、ゲノムの非必須領域内の外来ＤＮＡ配列の存在によって修飾されたポックスウィルスができる。「外来Ｊ　ＤＮＡという用語は、外在性のＤＮＡ、特に非ボックス起源のＤＮＡで、それらを導入するゲノムが通常は産生じない遺伝子産物をコードするものを指す。

遺伝子組換えは、一般的には、２つのＤＮＡ鎖の間でのＤＮＡの相同部分の交換を意味する。核酸の相同部分とは、同一のヌクレオチド塩基の配列をもつような核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の部分をいう。

遺伝子の組換えは、感染宿主細胞中で新たにウィルスゲノムを複製もしくは生産する際に自然に起こり得る。

従って、ウィルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２種類以上の異なるウィルス又はその他の遺伝子構造体に同時に感染した宿主細胞内中で展開されるウィルスの複製周期の間に起こる可能性もある。あるウィルスゲノムのＤＮＡと相同なりＮＡを有するような同時に感染した第二のウィルスゲノムの部分を構築する際に、前者のゲノムに由来するＤＮＡ部分が交換して用いられる。

しかしながら、遺伝子の組換えは、異なるゲノム中の完全に相同とはいえないＤＮＡ部分間でも起こり得る。

仮に、かかる部分の一方が第一のゲノム由来のもので、もう一方のゲノムのある部分と相同ではあるが、ただし前者の相同なりＮＡ部分中に例えば遺伝子マーカー或いは抗原決定基をコードする遺伝子の挿入された非相同部分が存在していたとしても、組換えは依然として起こり得るし、その組換え産物も、組換えウィルスゲノム中の遺伝子マーカーもしくは遺伝子の存在によって検出できる。

挿入ＤＮＡ遺伝子配列が修飾感染性ウィルスによって首尾よく発現されるためには２つの条件が必要となる。

まず第一に、修飾ウィルスが生存し続けるために、挿入をウィルスの非必須領域中に行なう必要がある。挿入ＤＮＡに関する第二の条件は、該挿入ＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現すべきＤＮＡ配列の上流に位置するように置く必要がある。

組換えが混乱せずに成功する頻度はおよそ０．１％である。

組換えによって首尾よく修飾されたウィルスを回収するための基本的なスクリーニング法には、レプリカフィルター上の組換え体と挿入配列に相同な放射性１識プローブとの間で行なうインシトウ（ｉｎｓｉｌｕ）ハイブリダイゼーシヨンが含まれる（２６．２８）。組換え効率自体を増大させるための或いは組換え体の同定を容易にするために多くの改良法が報告されている。かかる改良法には以下のものが含まれる。即ち、一本鎖ドナーＤＮＡの使用（３８）　；例えば単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼの発現を介した１２５■−デオキシシチジンのＤＮＡ中への取り込みなどの、独特な酵素機能を発現する組換え体の同定（２８）　；β−ガラクトシダーゼと外来遺伝子の（同時）発現に対する発色性基質（３，２９）　；チミジンキナーゼ発現に関する選択（２０，２８）　、組換え体のプラークを視覚化するための抗体反応（２＋）　；条件致死ｔｓ変異株又は薬物耐性突然変異株の使用（９，１８）　；Ｔｎ５由来ネオマイシン耐性遺伝子と抗生物質Ｇ４１８を用いる組換え体の選択（ＩＩ）　；或いはマイコフェノール酸及び大腸菌ｇｐｔ遺伝子による選択圧力（２，８）。

都合の悪いことに、これらの公知方法で組換えポックスウィルスを同定もしくは選択しようとすると、どの方においても、組換え体を面倒な多段階法で同定し、放射性化学物質、発色性基質、マイコフェノール酸（ａ＋ｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｘｃｉｄ）及びブロモデオキシウリジンのような選択には役立つがウィルスゲノム自体には有害な（変異原性）生化学物質を導入し、汚染源を導入する可能性のある血清学的試薬を使用し、そして通常は目的とする外来遺伝子要素以外に外在性遺伝子をも最終組換え体中に存在させる必要がある。

そこで、上述の問題点の解消されたポックスウィルス組換え体（特にワクシニア組換え体）の作成及び選択方法を提供することは、現在の技術水準からすれば非常に望ましい進歩であることが理解されるであろう。

先行技術として、病原体の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列などの任意の起源の（例えば、ウィルス、原核生物、真核生物、合成）ＤＮＡをワクシニア又はアビボックスのゲノムの非必須領域に挿入することによって、組換えワクシニアウィルス及びアビポックスウィルスを作成することができる方法が開発されている。かかる方法で作成した組換えワクシニアウィルスは、米国特許第４、６０３．１１２号に記載されている通り、種々の哺乳類病原体に対する特異的免疫を哺乳類に誘起させるために使用されている。かかる方法によって作成した組換えアビポックスウィルスは、鳥類（４１）及び非鳥類（４２）に特異的免疫を誘起させるために使用されている。

非修飾ワクシニアウィルスは天然痘の予防接種に比較的安全かつ有効に使用されてきたという永い歴史がある。

しかしながら、天然痘根絶前の、非修飾ワクシニアが広く投与されていた時代には、余り危険ではないにしても全身性ワクシニア感染という形で実際に合併症が起こす危険性があり、特に湿疹又は免疫抑制症に罹患している者には危険が伴っていた。ワクシニアの接種により稀にではあるが起こす可能性のある合併症として、ワクチン接種後の脳炎がある。これらの反応の殆どは、湿疹のような皮膚病又は免疫系不全症の患者、或いは家族に湿疹”又は免疫系不全症の患者をもつ人達に接種したことが原因であった。ワクシニアは生きたウィルスであるが、健常人に対しては通常は無害である。しかし、接種後数週間にわたって個体間で伝染する。正常な免疫反応系に障害を有する者が、接種により、或いは接種を受けてすぐの者からの接触伝染により、感染した場合、重大な結果をもたらす恐れがある。

宿主中でのウィルスの複製を制限しつつ、しかも病原体に対する抗体産生を誘導するような抗原決定基を宿主内で発現するような外来遺伝子を保有する適切に修飾したウィルス変異株は、従前の死滅又は弱毒化した生物体を用いるワクチンに伴う欠点を解消することのできる新規ワクチンとなる。例えば、死滅させた生物体からのワクチンを製造するには、該生物体を大量に増殖させ、それに続いてその免疫原性に影響を与えずにその伝染力のみを選択的に破壊する処理が必要である。一方、弱毒化した生物体を含有するワクチンには、弱毒化した生物体が病原性を有する状態に戻ってしまう可能性がある。これに対して、適切に修飾した組換えポックスウィルスをワクチンとして用いる場合、ポックスウィルスは病原体の抗原決定基をコードする遺伝子しか含んでおらず、病原体の複製を支配する遺伝子部分を含んでいないので、病原性を有する生物体に逆行する恐れはない。

このように、生きたウィルスの接種という当該技術における利点を有しつつ、前述の問題点を解決もしくは解消する方法は、現在の技術水準をからすれば非常に望まく進歩していることが理解されるはずである。このことは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られる疾患の到来した現在においては極めて重要である。この疾患の犠牲者は重い免疫不全症に罹患していて、他の者にとっては安全な生ウイルス製剤であっても、かかるウィルスに直接或いはかかる生ウイルス含有ワクチンの接種を受けて間もない人との接触によって接触した場合、その製剤によって容易に傷害を受ける。

発明の目的本発明の目的は、従って、宿主内で免疫反応を誘起させるためのワクチンにして、生ウイルスワクチンの利点を有しつつ、しかも前述の生ウイルスワクチン又は死滅ウィルスワクチンの欠点を僅か或いは全くもたないようなワクチンを供することである。

本発明の二番目の目的は、かかるワクチンに使用するための修飾組換えウィルスを供することである。

宿主内でのウィルスの複製を制限したまま宿主中で遺伝子産物をコードしかつ発現するような修飾組換えウィルスを宿主に接種することによって、宿主中で遺伝子産物を発現させる方法を供することも、本発明のまた別の目的である。

細胞内でのウィルスの複製を制限したまま遺伝゛子産物をコードしかつ発現するようなりＮＡを含有する修飾組換えウィルスを細胞内に導入することを含んでなる、培養細胞内で遺伝子産物をインヴイトロ（ｊｎｖ自ｔｏ）で発現させる方法を供することも、本発明のまた別の目的である。

宿主内でのウィルスの複製を制限したまま宿主内で遺伝子産物を発現するような修飾組換えウィルスを供し、また、かかる修飾組換えウィルスの作成法を供することも、本発明のまた別の目的である。

組換えウィルスの迅速な一段階同定方法、並びに組換え体中での外来解読枠の発現を迅速にスクリーニングする方法を供することも、本発明のまた別の目的である。

組換えポックスウィルス、特に組換えワクシニアウィルスを作成かつ選択する方法を供し、また、かかる方法において中間体として作成又は使用するＤＮＡ配列を供することも、本発明のさらに別の目的である。

組換えポックスウィルス、特に組換えワクシニアウィルス中の解読枠のクローニング及び発現のための選択系にして、該組換えウィルスが目的とする解読枠以外の外来遺伝子を含まないような選択系を供することも、本発明のさらに別の目的である。

本発明における上記並びにその他の目的と利点は、本明細書の以下の記載から、より一層容易に理解できるは本発明は、その一つの態様において、宿主中におけるウィルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子の欠失した修飾組換えウィルスにして、宿主中での該ウィルスの複製が制限されたまま、宿主中で遺伝子産物をコードしかつ発現するＤＮＡを含有する修飾組換えウィルスに関する。本発明のウィルスは、好適にはポックスウィルス、特にワクシニアウィルスである。

本発明は、また別の態様において、宿主中におけるウィルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子の欠失した修飾組換えウィルスを宿主に接種することによって、宿主中で遺伝子産物を発現させる方法に関する。この修飾組換えウィルスは、宿主中でのウィルスの複製が制限された状態にあっても宿主中で遺伝子産物をコードしかつ発現するようなりＮＡを含有する。本発明の方法で使用するウィルスは、好適にはポックスウィルス、特にワクシニアウィルスである。宿主中で発現させる遺伝子産物は、好適には抗原である。特に好ましくは、宿主はを椎動物で、抗原は該を推動物中で免疫反応を誘起するようなものである。

本発明は、また別の態様において、ワクチンを接種した宿主中で免疫反応を誘起させるためのワクチンにして、宿主中でのウィルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子の欠失した修飾組換えウィルス及びキャリアーを含んでなるワクチンに関する。該修飾組換えウィルスは、宿主中でのウィルスの複製が制限された状態にあっても宿主中で遺伝子産物をコードしかつ発現するようなりＮＡを含有する。本発明のワクチンに用いるウィルスは、好適にはポックスウィルス、特にワクシニアウィルスである。

さらに別の態様において、本発明は、組換えポックスウィルスを作るためにドナーＤＮＡと修飾ポックスウィルスを組み合わせ、かつ宿主中での複製能力によって組換えポックスウィルスを同定することによって、宿主中で組換えポックスウィルスを選択する方法に関する。さらに別の態様において、本発明は、組換えポックスウィルスを作るためにドナーＤＮＡと修飾ポックスウィルスを組み合わせ、宿主中で組換えポックスウィルスを複製させ、かつ解読枠を発現させることによって、組換えポックスウィルス中の解読枠を宿主中でクローニング及び発現させる方法に関する。本発明において、上記修飾ポックスウィルスは宿主中で該修飾ポックスウィルスが複製しないように宿主域遺伝子を欠失したものであり、また、ドナーＤＮＡは非ボックス由来の解読枠及び宿主中での組換えポックスウィルスの複製を可能にする宿主域遺伝子を含有するものである。

本発明のさらに別の態様は、選択系の組換えポックスウィルスを作成するためのドナープラスミドに関する。

かかるドナープラスミドは非ボックス由来の解読枠、及び宿主中での組換えポックスウィルスの複製を可能にする宿主域遺伝子を含有する。好適には、かかるドナープラスミドは、上記ポックスウィルス宿主域遺伝子の上流にプロモーター、並びに該プロモーターの下流に翻訳開始コドンとそれに続く、ユニークな多重制限酵素部位、翻訳終結シグナル配列、及び初期転写終結シグナル配列をさらに含有する。

図面の簡単な説明本発明は添付図面を参照することによってより深く理解できると思われる。

図ＩＡは、ワクシニアウィルス欠失／組換え体ｖＰ２９３の構築方法を図示したものである。

図ＩＢは、救援ワクシニアウィルスＶＴＲ−７９の左端からＨｉｎｄＩＩＩ　Ｋまでの地図である。

図ＩＣは、ワクシニアウィルス欠失／組換え体ｖＰ２９３の左端からＨｉｎｄｍ　Ｋまでの地図である；図２Ａは、宿主域遺伝子ＫＩＬをプラスミドｐＭＰ　５２８Ｌ中にクローン化する方法、並びにそれをｖＰ２９３に挿入してワクシニアウィルスｖＰ４５７を作成する方法を図示したものである。

図２Ｂは、ｖＰ２９３の左端からＨｉｎｄｍ　Ｋまでの地図である。

図２０は、ｖＰ４５７の左端からＨｉｎｄｌｌＩ　Ｋまでの地図である。

図３Ａは、プラスミドｐＭＰ５２８ＨＲＨ及びｐＨＥＳ１〜４の構築方法を図示したものである。

図３Ｂは、ｐＭＰ５２８ＨＲＨに存在する合成Ｈ６プロモーターと下流の制限酵素部位のＤＮＡ配列を示したものである。

図３０は、プラスミドｐＨＥｓ１において、図３Ｂの括弧内の配列と置き換ったＤＮＡ配列（制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルを含む）を示したものである。

図３Ｄは、プラスミドｐＨＥＳ２において、図３Ｂの括弧内の配列と置き換ったＤＮＡ配列（制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルを含む）を示したものである。

図３Ｅは、プラスミドｐＨＥｓ３において、図３Ｂの括弧内の配列と置き換ったＤＮＡ配列（制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルを含む）を示したものである。

図３Ｆは、プラスミドｐＨＥＳ４において、図３Ｂの括弧内の配列と置き換ったＤＮＡ配列（制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルを含む）を示したものである。

図４Ａは、プラスミドｐＨＥ８３１〜３４の構築方法を図示したものである。

図４Ｂは、合成オリゴヌクレオチドＨＲＬ１５〜２２のＤＮＡ配列を示したものである。

図５は、プラスミドｐＨＥｓ３１〜３４に存在するワクシニアＵプロモーターのＤＮＡ配列を示したものである。図５には、さらに、ｐＨＥｓ３１〜３４に存在する制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナル、並びにｐＨＥｓ３１〜３３に存在する開始コドンを、括弧内の配列で示しである。

図６Ａは、プラスミドｐＨＥｓ６１〜６４の構築方法を図示したものである。

図６Ｂは、合成オリゴヌクレオチドＨＲＬ３３〜４０のＤＮＡ配列を示したものである。

図７は、プラスミドｐＨＥ８６１〜６４に存在する合成ＡＴＩプロモーターのＤＮＡ配列を示したものである。

図７には、さらに、ｐＨＥｓ６１〜６４に存在する制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナル、並びにｐＨＥｓ６１〜６３に存在する開始コドンを、括弧中の配列で示しである。

図８は、ワクシニアのコペンハーゲン株の左端付近の１５５３７塩基対のＤＮＡ配列（制限酵素部位と共に）を示したものである。

図９は、組換え体ｖＰ５４８及びｖＰ６６１の構築方法を図示したものである。

図１０は、ワクシニアウィルスゲノムの左端の地図で生滅遺伝子の試験方法を図示したものである。

図１２は、組換え体ｖＰ６６５、ｖＰ６８３、ｖＰ７０６及びｖＰ７１６の構築方法を図示したものである。

図１３は、プラスミドｐＣＰ３及びｐＣＰ５の構築方法、並びにワクシニア系における潜在的カラボックス宿主域遺伝子の試験方法を図示したものである。

図１４は、組換え体ｖＰ６６４及びｖＰ６６８の構築方法を図示したものである。

図１５は、ｐＭＰｃＴＫ１Δから誘導されるプラスミド系列の構築方法を図示したものである。

図１６は、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３８、ＭＰＳＹＮ２３９、ＭＰＳＹＮ２５０〜２５５、及びＭＰＳＹＮ２７１〜２７４のＤＮＡ配列を示したものである。

図１７は、プラスミドｐＭＰＣ８−１及びｐＭＰＣＳ−４に存在する制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルを含有する合成りＮＡ配列を示したものである。図１７には、さらに、ｐｃＯＰｃｓ−３Ｈ及びｐＣＯＰＣ３−５Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０ＨＩ：、存在する合成Ｈ６プロモーター領域が示しである。図１７には、さらに、ｐｃＯＰｃｓ−３Ｈ及びｐｃＯＰｃｓ−５Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０Ｈ中に存在する制限酵素部位、終止コドン、初期転写終結シグナル、並びにｐｃＯＰｃｓ−６Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０Ｈ中に存在する開始コドンを括弧中の配列に示しである。

図１８は、プラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔ及びｐＭＰＲＥＮＤΔの構築方法を図示したものである。

図１９は、ワクシニアウィルスのコペンハーゲンゲノムのＨｆｎｄｌｆＩ　Ｃから、図８に示した配列の左側に位置するコード配列までの、１３９７８塩基対のＤＮＡ配列を示したものである。

ある。また、図２１は、ワクシニアウィルスゲノムの右末端付近の本発明は、宿主中でのウィルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子を欠失し、かつ宿主中でのウィルスの複製が制限されたまま宿主中で遺伝子産物をコードし発現するＤＮＡを含有した修飾組換えウィルスに関する。

本発明は、また、ポックスウィルス組換え体、特にワクシニア組換え体の選択系、並びにポックスウィルスの条件致死宿主域変異株を用いてポックスウィルス、特にワクシニアウィルス中の解読枠のクローニング及び発現するための選択系に関する。

ラビットポックスウィルス（２４，１３）及びワクシニアウィルス（６，７，＋２．２３．３６）の宿主域変異株は公知である。

ラビットボックス（ｒｇｂｂＮｐｏｘ）　ウィルスの宿主域変異株は、ウィルスの複製に必要とされる幾つかの調節機能に欠陥があると考えられている（１０）。その後、これらのラビットポックスウィルス変異株のゲノム・が解析されるに至って、ＤＮＡの末端が広範囲にわたって欠失（３０Ｋｂに及ぶ）していることが明らかになった（１９゜２５）。

ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ）他は、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン株に亜硝酸で突然変異を誘発して、殆どのヒトの細胞中での複製に欠陥をもった宿主域変異株を単離した（６）。この変異株のゲノムの解析から、左側末端付近の約１８Ｋｂの広範囲な欠失が明らかになった（６）。マーカー移入法でさらに解析した結果から、宿主域を支配する遺伝的機能は、５．２ＫｂのＥｃｏＲＩフｍ　Ｍ／にフラグメント上に重なる８５５塩基対の解読枠に位置付けられた（１５）。

ワクシニアウィルスのＷＲ株（２７，３０）の宿主域遺伝子は、ワクシニアゲノムの左端から２４Ｋｂと２５．２Ｋｂ細書中ではローゼル（Ｒｏｇｅｌ）他（３３）の推奨する命名法に従ってＫＩＬ遺伝子と記載されている。

ワクシニアゲノムの宿主域欠失変異株は、トランスポソンＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子を挿入して抗生物質Ｇ４１８で選択して作成した。この欠失／組換え体ｖＰ２９３は、ゲノムの左端から３．　８Ｋｂの地点から始まる約２１ＫｂのＤＮＡを欠いている。ｖＰ２９３は初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）　、２種類のサルの細胞系（ＥＳＣ−４０又はｖＥＲＯ）上でのプラーク形成能を有しているが、ヒト細胞系ＭＲＣ−５中での複製能を欠いている。

ｖＰ２９３に宿主域遺伝子Ｋ　Ｉ　Ｌを挿入すると、ＭＲＣ−５細胞上での増殖能力が回復する。

Ｋ　Ｉ　Ｌ宿主域遺伝子の他に、ワクシニア初期／後期プロモーターＨ６、好ましくはそれに続いてユニークなポリリンカー配列マルチクローニング制限酵素部位、翻訳開始及び終止コドン、及び初期転写終結シグナルを含有する一連のプラスミドを構築した。これらのプラスミドｐＭＰ５２８ＨＲＨ並びにｐＨＥｓ１〜４は、ｖＰ２９３と組換えてＭＲＣ−５細胞上での増殖を評価すれば、どんな解読枠のクローニング及び発現も迅速な一段階で行なうことができる。

かかるプラスミドに外来解読枠を挿入し、続いてｖＰ２９３と組換えると、宿主域機能（ＫＩＬ遺伝子）が回復すると同時に救援ウィルスｖＰ２９３中に外来解読枠が導入される。組換えウィルスはＭＲＣ細胞でのプラーク形成能力によって同定される。

この系の利点は、最終的な組換え体中に目的とする遺伝要素以外の非ワクシニア外在性遺伝子が存在しないこと、ｖＰ２９３がＫ　１．　Ｌ欠失変異株であることからウィルスの遺伝的逆行が起こり得ないこと、並びに組換え体を一段階で迅速に同定できることである。この一段階法は、また、例えばエピトープの地図作成のための、外来遺伝子の発現に対する迅速なスクリーニングにも用いることができる。

°　さらに、Ｈ６初期／後期プロモーターを初期又は後期のいずれか発現調節に限定的なワクシニアプロモーターで置き換えたＫＩＬ宿主域遺伝子含有プラスミドも構築した。かかる追加のプラスミドを用いると、外来遺伝要素の発現に関する時期特異的調節（ｌｅ＋ｎｐｏｒｓｌ　ｒｅｇｕｌｘ目ｏｎ）の機構を研究することができる。

本発明の宿主域制限系は、ワクチン接種により宿主中で免疫反応を誘起させるためのワクチンとして好適に使用できる。この場合、該ワクチンはキャリアー及び修飾組換えウィルスを含んでなる。該修飾組換えウィルスは、宿主中でのウィルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子が欠失している。該修飾組換えウィルスは、さらに、宿主中でのウィルスの複製の制限されたまま宿主中で遺伝子産物をコードしかつ発現するようなりＮＡを含有する。ウィルス中における宿主域遺伝子の欠失によりウィルスの複製が制限された状態で、遺伝子産物、特に抗原を発現する修飾組換えウィルスを構築した。ある具体的態様においては、宿主はを推動物で、抗原は該を推動物中での免疫反応を誘起するものであや。また別の具体的態様においては、宿主はインヴイトロで培養した細胞である。

宿主域制限系が本明細書中に記載されたウィルス及び種だけに限られないことは容易に理解されるはずである。

また、ポックスウィルス中にさらに別の［宿主域遺伝子コが存在するとことも容易に理解できるはずである。さらに、かかる宿主域変異株には種々の外来遺伝子が使用できるということも容易に理解できるはずである。

説明のために挙げる以下の例から、本発明とその利点がより深く理解されるであろう。

幾つかの例において、ワクシニアウィルスのＷＲ株を使用した。その起源並びに培養条件は文献に記載されている（２７）。幾つかの例においては、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン株を使用した。その起源並びに培養条件は文献に記載されている（５０）。初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）　、サル細胞系（ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ８１）及びＢ５Ｃ４０）、及びヒト細胞系ＭＲＣ− ５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１７１）は、ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）を５％（ＶＥＲＯ及びＢ５Ｃ４０）もしくは１０％（ＭＲＣ−５、ＣＥＦ）含有するイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。

プラスミドの構築、スクリーニング及び増殖は常法に従った（２２．３１．３２）。

図１を参照して説明する。ｐＡＧ５（３０）からワクシニアＤＮＡ左側末端３．ｌｂを含んだＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ａスミドｐＭＰ５をＨ４ｎｄｌｌｌ及び５ａｌＩで切断し、ワクシニアＨｉｎｄｍフラグメントにの右端に対応するワクシニア配列を含有する３、８ＫｂＨ４ｎｄＩ［Ｉ／Ｓａ　ｌ　Ｉフラグメントに連結した。従って、得られたプラスミドｐＭＰ　５２８は、ワクシニアゲノムの左側末端の３，８Ｋｌ＋とＨ４ｎｄＩ［Ｉ　Ｋフラグメントの右端から３．　５１ｆｂとを含んでおり、該ゲノムの左端から３．８Ｋｂと２５．５Ｋｂとに位置する２つの５ａｌＩ部位間に挟まれた２１゜７Ｋｂを欠失している。合成リンカ−（コラボレイティブ伊すサーチφインク（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｌｉｖｃ　Ｒｅ５ｅａ「ｃｈ　Ｉｎｃ、）　。

マサチューセッツ州ベッドフォード　ＩＢｅｄｌｏｒｄ）から市販）を添加して、ｐＭＰ５２８に存在するユニークなＳａｌトランスポゾンＴｎ５　（１）由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する１、４ＫｂＳｍａ　Ｉフラグメントをｐ　ＳＶ２−　ｎｅｏ　（ＡＴＣＣ番号３７１４９）から箪“ −パ〔モ゛７蕎１゛−ｉり゛Ｖ筺テプロモーター（本明細書中ではＰｉと呼ぶ）の制御下においた。

ワクシニアのＡｖａＩ　Ｈ領域から得られるＰｉプロモーターは（３７）に記載されている。より詳細には、ここのプロモーターは右から左方向への転写を支配する。

該プロモーターの地図上の位置は、ＡｖａＩ　Ｈの左端からおよそ１．３Ｋｂ、ワクシニアゲノムの左端からおよソ１２．　５Ｋｂ、　ソしｒＨｉｎｄＩＵ　Ｃ／Ｎ接合部の約８゜５Ｋｂ左である。このプロモーターの位置は標準的な転写マツピング分析法によって確認された。５　ｋＤｘのグリシン富有タンパク質をコードする解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇｔｒａｍＣ）の上流領域に対応するＰｉ　ＤＮＡ配列は最近の論文に記載されている（４０）。このプロモーター要素はワクシニア組換え体中で感染後の初期に外来遺伝子を発現させることが判明している（３７）。

て、ｐＭＰ５２８ＰｉＮを得た。ｐＭＰ５２８ＰｊＮは、Ｐｉプロモーター領域を含有するＡｖａｌ　Ｈの５ａｕ３Ａサブクローンから得られる０、４Ｋｂのワクシニア配列とそれに続（ＢｇｌＩＩからＳｍａＩ部位までのＩＫｂのＴｎ５配列（１）を含んでいる。

ｐＭＰ５２８ＰｊＮを初代ＣＥＦ細胞に導入（トランスフェクション）シ、かつ常法（２８）に従って救援ワクシニアウィルス（ｒｃｓｃｕｉＢ　ｖａｅｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）　ＶＴＫ　−７９を同時感染させた。３００μｇ　／　ｍｌのＧ４１８存在下の初代ＣＥＦ細胞上で組換えウィルスを選択し、増殖させた（１．１１．３５）。

組換えワクシニアｖＰ２９３のゲノム配置をサザンブロットハイプリダイゼーシ１ン分析法で確認した。組換えワクシニアｖＰ２９３は予想通りワクシニアの２１゜７Ｋｂを欠失しており、ｎｅＯｒをコードする外来遺伝子を含んでいた。救援ウィルスＶＴＫ“７９の左側末端の制限酵素地図、並びにｎｅｏ　ｒ遺伝子を発現し、Ｇ４１−８存在下の初代ＣＥＦ細胞上で選択した組換えウィルスｖＰ２９３の制限酵素地図を図ＩＢ及び図ＩＣに示す。

抗生物質Ｇ４１８の非存在下では、ｖＰ２９３は、初代ＣＥＦ細胞上で大きなプラークを形成し、Ｂ５Ｃ４０又はＶＥＲＯ細胞上でもプラークを形成したが、ＶＰ２９３のプラークはＶＥＲＯ細胞上での親ＶＴＫ　−７９のものよりも小さかった。重要なことに、ヒト細胞系ＭＲＣ−５上では、ｖＰ２９３の複製は全く見られず、プラークを形成しなかった。

例２−　ｖＰ２９３と宿主域遺伝子ＫＩＬとの再構成宿主域遺伝子ＫＩＬをワクシニアのＷＲ株の欠失変異株ｖＰ２９３中に再構成したときに、該ウィルスがヒトの細胞上で複製できるようになることを実証するために、宿主域遺伝子ＫＩＬをプラスミドｐＭＰ５２８Ｌにクローン化して、ｖＰ２９３に挿入した。

今度は図２Ａを参照して説明する。不必要な制限酵素部位を除きかつ将来のクローニング段階を容易にするために、ｐＭＰ５２８Ｌの右腕で構成されるワクシニアＤＮＡ配列（図ＩＡ及び図２Ａ）を短くした。ｐＭＰ　５２８ＬをＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄｌＩ［で切断し、大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端として自己連結した。このようにして得られたプラスミドｐＭＰ　５２８Ｈの右腕はＤＮＡ０．４Ｋｂ分だけ短くなった。

Ｈｉｎｄｌ［［Ｍ及びに由来の配列を含むワクシニアのコペンハーゲン株のサブクローンであるｐＳＤ４５２ＶＣから、ＫＩＬ宿主域遺伝子（１５）由来の全コード配列及びプロモーターを含有する８９１塩基対のワクシニアＢｇｌＩ［（部分）／ＨｐａＩフラグメントを調製した。

都合のよい制限酵素部位を遺伝子の隣に与えることだけを目的として、上記ＫＩＬ含有フラグメントをｐＵＣ８のポリリンカー領域にクローン化した。得られたプラス本鎖部分を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントで埋めて、そのフラグメントをｐＭＰ５２８ＥのＳｍａ　Ｉ部位にクローン化した。図２Ａに示すように左方向に読まれるＫＩＬ宿主域遺伝子の配置されたプラスミドｐＭＰ５２８ＨＲを常法により単離した。

組換え並びにニトロセルロースフィルター上でのハイブリダイゼーションに関する手順は、公知並びに文献記載（２８）の方法に従って行なった。ただし以下の修正を加えた。

上記ドナープラスミドｐＭＰ５２８ＨＲを、各々ｖＰ２９３を同時感染させたＶＥＲＯもしくはＭＲＣ−５細胞のいずれかに電気穿孔法（エレクトロポレーション）によって導入した。ＶＥＲＯもしくはＭＲＣ−５細胞の亜集密的細胞単層（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅ＋ｔ　ｍｏｎｏｌＢｅ＋）を１時間救援ウィルスで感染させた。トリプシンを用いて細“胞を採集し、Ｈｅｐｅｓ含塩類緩衝液０１ｅｐｅｓ　ｂｅ目ｅｋｅｄ　５ｘｌｉｎｅ。

略してＨｅＢＳ）（１６）で洗浄し、２５μｇのプラスミドＤＮＡの存在下にＨｅＢ５中で電気穿孔した。ウィルス感染細胞は、バイオラッド（ＢｉＯ−Ｒｓｄ）社製のバイオラッド・ジーン・パルサー・キャパシタンス・エクステングー（Ｂｉｏ−Ｒｌｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　Ｃａｐｇｅｉｔｘｎｃｓ　ＥＮｅｎｄｅ＋）を装備したバイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒｓｄ　Ｇｅｎｅ？１ｓｅｒ）を用いて電気穿孔した。細胞懸濁液（０，８ｍ１）をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒｘｄ）社製のジーン・パルサー・キュベツト中で１０分間氷上に置き、２００ボルト（キャパシタンス９６０μＦＤ）でパルスして、さらに１０分間氷上に置いた。次いで、細胞を８　ｍｌのＭＥＭ＋５％ＦＢＳに稀釈し、対応するＶＥＲＯもしくはＭＲＣ−５細胞単層を含んだ６０ｍｍシャーレに撒き（シャーレ１個当り４ｍｌ）、３７℃で一晩インキユベートした。

プロジエニイを採集して、ＶＥＲＯ又はＭＲＣ−５細胞上に撒いた。ＶＥＲＯ細胞上で得られたプラーク数はＭＲＣ−５細胞上で得られたプラーク数よりも１０乃至１００倍も多かった。複数の孤立プラーク（均一な大きさのもの）をＭＲＣ −５細胞培養物並びにＶＥＲＯ細胞培養物（どちらも大きなプラークと小さなプラーク）から採取した。これらの単離ブラークをＶＥＲＯ細胞上に再び撒いて、３日後に得られたプラークをニトロセルロースフィルターディスク上に移して、インシトウハイプリダイゼーション（２６）の準備をした。３２ｐ標識プローブでＫＩＬコード配列をプローブした時に、ＭＲＣ−５細胞由来のすべてのプラークと、ＶＥＲＯ細胞に由来する小さなプラークを除くすべての大きなプラークが、陽性ハイブリダイゼーションシグナルを与えた。この結果はＫＩＬコード配列に含まれている宿主域機能の回復に符合する。

ＭＲＣ−５細胞から得た単離物をさらに精製してｖＰ４５７と名付けた。ｖＰ４５７においてはＫＩＬ遺伝子が回復しており、該遺伝子は右から左に読むそのネイティブな配向で欠矢部内に位置する。ＫＩＬ遺伝子は、図２Ｂ及び図２０に示すように、ｖＰ２９３に存在するＰｉプロモーター／ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子カセットと置き換っている。Ｌ変異ワクシニア株のゲノム（３０．　２７）と比較した場合、ＶＰ４５７はＫＩＬ遺伝子の右側の２９１塩基対の欠矢部分並びにＫＩＬ遺伝子の左側の２０．２Ｋｂの欠矢部分を含んでいる。

追加の解読枠をクローン化できるようなドナープラスミドの構築にｖＰ２９３における条件致死変異が利用できることを実証するために、一連のプラスミドｐＭＰ５２８ＨＲＨ及びｐＨＥｓ１〜４を構築した。ＫＩＬ宿主域遺伝子含有プラスミド中に存在する外来解読枠をｖＰ２９３中に組換えることによって、宿主域制限によるワクシニア組換え体の簡単な作成法が得られる。

ワタシニアプロモーターＨ６をｐＭＰ５２８｝ＩＲのＫ−ＩＬ遺伝子の上流に加えた。この初期／後期プロモーターは転写マッピング及びＤＮＡ配列解析の常法によって既に同定されている。このプロモーターは以下の配列（−１２５番目から＋３番目の塩基まで）を有する。

＾ＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴ＾＾ＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧ＾＾＾ＧＣＧＡＧ＾＾＾ＴＡＡＴＣＡＴＡ＾＾ＴＴＡＴＴＴＣＡ７７ＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧ０この配列はローゼル他（３３）によって解読枠Ｈ６の上流にあると記載されている配列である。

今度は図３を参照して説明する。−１２４番目から−１番目に相当するＤＮＡ　（潜在的開始コドンの導入を防ぐために−１０２番目の塩基をＡからＧに変えたもの）とそれに続＜　Ｘｈｏ　Ｉ，Ｋｐｎ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉ制限酵素部位を化学的に合成し（図３Ｂ）　、ｐＭＰ５２８ＨＲのＳｍａＩ部位にクローン化してｐＭＰ５２８ＨＲＨを得た（図３Ａ）。従って、ｐＭＰ５２８ＨＲＨは、ＫＩＬ遺伝子の上流にＨ６プロモーターを含んでおり、ＫＩＬ遺伝子は該ＫＩＬ外来プロモーターの制御下で発現される。両者共にワクシニア腕（ゲノム）に対して右から左に配向している。ｐＭＰ５２８｝｛ＲＨ中のＨ６プロモーターはユニークなＸｈｏｒ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩ制限酵素部位の直ぐ上流に位置する。

この系の有効性をさらに増大させるために、一連のプラスミドｐＨＥ３１〜４をｐＭＰ５２８ＨＲＨから誘導した。ｐＨＥｓ１は以下の手順で構築した：ｐＭＰ５２８ＨＲＨをＸｈｏｌ及びＸｍａｌで切断し、オリゴヌクレオチドＨＲＬ　１５’　（ＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＧ＾ＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴ）　３’ 及びＨＲＬ２５’　ｆｃｃＧＧＡＴＡＡＡ＾＾ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧ）　３’ をこの部位にクローン化した。ｐＨＥＳ２、ｐＨＥＳ３及びｐＨＥＳ４を同様にして構築した。ｐＨＥＳ２はオリゴヌクレオチドＨＲＬ３５’　（ＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ７ＡＣＣＧＡＧＣ丁ＣＴＣＧＡＧ丁ＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴ）　３’ 及びＨＲＬ４５’　（ＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡ丁丁ＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧ丁ＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧ）　３’ を用いて構築し、ｐＨＥＳ３はオリゴヌクレオチドＨＲＬ５５′　（丁ＣＧ　Ａ　Ｃ　ＣＡＴＧＧＧＧＧ　ＡＴＣＣ　Ｃ　ＣＧ　ＧＧＴＡＣ　Ｃ　ＧＡＧＣＴ　Ｃ　Ｔ　ＣＧＡＧＴＡ　ＡＡＴＡ　ＡＡsＡ人ＴＴＴＴＴＡＴ）３’ 及びＨＲＬ６５’　（ＣＣＧＧＡＴＡ＾＾ＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴｆ，Ｇ）　３’ を用いて構築し、ｐＨＥＳ４はオリゴヌクレオ：ｆ−″〆ＨＲＬ７５冒ＴＣＧＡＧＧ＾↑ＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴ＾＾＾ＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴ）　３’及びＨＲＬ８５’　（ＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣ）３’を用いて構築した。

ｐＭＰ５２８ＨＲＨとｐＨＥｓ１〜４の関連するＤＮＡ配列要素、制限酵素部位、並びに転写及び翻訳シグナルは以下の通りである。

ｐＭＰ５２８ＨＲＨに存在する合成Ｈ６プロモーターの配列（−１２４番目から −１番目の塩基、変更した−１０２番目の塩基に下線を付した）及び下流の制限酵素部位を図３Ｂに示す。

プラスミドｐＨＥ８１〜４においては、ｐＨＥｓ１については図３０に、ｐＨＥｓ２については図３Ｄに、ｐＨＥＳ３については図３Ｅに、またｐＨＥＳ４については図３Ｆに示すように、括弧内の配列を制限酵素部位、終止コドン及び初期転写終結シグナルで置き換えた。

ｐＭＰ５２８ＨＲＨに含まれる要素に加えて、各々のプラスミドｐＨＥ８１〜３はＨ６プロモーター下流に翻訳開始コドンと、それに続くユニークな多重制限酵素部位、翻訳終結シグナル配列及び特定やワクシニア初期転写終結シグナル配列（３９）を含んでいる。各々のプラスミドｐＨＥ８１〜３は３つの読取り枠の内の１つに翻訳開始コドンを含んでいる。従って、これらのプラスミドの内の１つにクローン化してワクシニアウィルス中に組換えると、解読枠を含む如何なるＤＮＡ配列も発現させることができる。

４番目のプラスミドｐＨＥＳ４は翻訳開始コドンを含んでいないが、ユニークな多重制限酵素部位、翻訳終結配列、及び初期転写終結シグナル配列は含んでいる。ｐＨＥＳ４にクローン化してワクシニアウィルス中に組換えると、解読枠と開始コドンを含むＤＮＡ配列を発現させることができる。

ｐＨＥｓ１〜４　／　ｖ　Ｐ　２９３宿主域選択系の有効性を実証するため、β −ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ＩａｃＺ遺伝子を含んだ組換えワクシニアウィルスを構築した。

コドン８から１ａｃＺ遺伝子の端までを含むＢａｍＨＩフラグメントをｐＭＣ１８７１（３４）から得た。この１ａｃＺ　ＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＨＥＳＩ〜４のユニークなりａｍＨＩ部位にクローン化した。

得られたプラスミドｐＨＥｓＬ２１〜４のそれぞれを宿主域変異株ｖＰ２９３で同時感染したＶＥＲＯ細胞に感染させる組換えを行なった。

感染後２４時間後にプロジエニイウイルスを凍結／融解を３回繰り返して採集し、ＶＥＲＯ細胞（表ＩＡ）もしくはＭＲＣ−５細胞（表ＩＢ及びＩＣ）のいずれかの上に撒いた。

”　ＶＥＲＯ及びＭＲＣ−５細胞単層（表ＩＡ及びＩＢ）をニュートラルレッドで染色し、３日後にニトロセルロースフィルターに移して、ＭＰ標識１ａｃＺ遺伝子プローブを用いるインシトゥハイブリダイゼーシタン（２６）の準備をした。ＶＥＲＯ細胞単層（データは示していない）及びＭＲＣ−５細胞単層（表ＩＣ）をＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇｅｒＭｍｎｎｈｔｉｍ）社製）に暴露し、８時間後に青色の発色度を評価した。

プロジェニイをＶＥＲＯ細胞上に撒いてβ−ガラクトシダーゼの発現をＸ−ｇａｌの存在下でアッセイしたところ、ｐＨＥＳＬＺｌ、２又は４で感染させた細胞には青色プラークは全くみられなかった。重要なことに、プラスミドｐＨＥＳＬＺ３で発生するプラークのおよそ２０％がＸ−ｇａｌの存在下で青色のプラークとなった（データは示していない）。

プロジェニイをＶＥＲＯ細胞上に撒いて組換えウィルスをインシトゥハイプリダイゼーシッンによってスクリーニングしたところ、プラークの１２乃至２２％が１ａｃＺにポジティブなハイブリダイゼーシタンシグナルを与えた（表ＩＡ）。

インシトゥＤＮＡハイブリダイゼーシタン法（２６）で分析したところ、ＭＲＣ −５上のすべてのプラークについて１ａｃＺ遺伝子の存在が確認された（表ＩＢ）。しかしながら、β−ガラクトシダーゼ活性は、ｐＨＥＳＬＺ３に由来するＭＲＣ−５上のプラークにしかみられなかった（表ＩＣ）。フレーム中に翻訳開始コドンと共に１ａｃＺ遺伝子を有していたのはプラスミド構造体ｐＨＥＳＬＺ３だけであった。

表　１プラスミドｐＨＥｓＬ２１−４及びマＰ２９３及びワクシニアウィルスＡ、全プラーク数　１０５６　６３７　７９３　１３４４ハイブリツド形成陽性　＋５３　１４１　９５　２６９陽性％　１４．５　２２　１２　２０Ｂ、全プラーク数　６０５６　未検出　７１ハイブリツド形成陽性　６０５６　未検出　７１陽性％　１００　１００　＋００Ｃ２全プラーク数　６０　５５　５９　７０Ｘ−ｇａｌ陽性　０　０　５９　０ｖＰ２９３における条件致死変異がさらに別のドナープラスミドの構築にも利用できることを実証し、かつワクシニアＷＲｖＰ２９３に基づく宿主域選択系を拡張することを目的として、Ｈ６初期／後期ワクシニアプロモーターを他の特定時期の制御プロモーターで置換えることによってｐＨＥＳプラスミド系列（例３）を拡張した。外来遺伝子のそれぞれ初期もしくは後期発現を制御するために、プラスミドｐＨＥｓ３１〜３４及びプラスミド系列ｐＨＥ８６１〜６４を作成した。

ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）上での（出血性）赤痘の形成に必要とされるカラボックスウィルス（ｃｏｗｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ）中の３８ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の位置並びベンハーゲン株ツクシニアウィルスゲノム領域をサザンブロッティング法（４４）で決定した。このとき、クローン化したカラボックスＤＮＡをプローブとして用いた。

と対応する。

有するＤＮへの塩基配列が決定されている（４６）。コペンハーゲン株の凹遺伝子対応遺伝子は非機能的で、コード領域内でのフレームシフト変異のためＣＡＭ上で増殖するコペンハーゲンワクシニアウィルスは結果的に０痘を形成する。上流領域はカラボックスプロモーター領域との相同性が高く、機能的である。コペンハーゲンヮクラクトシダーゼ遺伝子を含有する組換えワクシニアは、発色性基質であるＸ−ｇａ　ｌの存在下で青色プラークを形成する。カラボックスと同様に、コペンハーゲンゲノすために、自己アニールしたオリゴヌクレオチドＨＲＬＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターをｐＨＥＳｌ（例１）から除去した。今度は図４を参照する。アリンカー配列を置き換えるために、８種類のオリゴヌクレオチドＨＲＬ１５からＨＲＬ２２までを合成した（図４Ｂ）。オリゴヌクレオチド対をアニールし、ｐＨＥｓラグメントに連結して、ｐＨＥｓ３１〜３４を作成した（図４Ａ）。

今度は図５を参照する。得られたプラスミドｐＨＥ　Ｓ３１からｐＨＥｓ３４はコペンハーゲン旦プロモーター領域下流にポリリンカー領域を含んでいる（図５）。旦プロモーターを特定する０、３ＫｂのＤＮＡ配列は、図５においては、プラスミドｐＨＥｓ３１についてだけ示しである。同一の配列がプラスミドｐＨＥＳ３２からｐＨＥｓ３４までに存在する。ｐＨＥｓ３１のプロモーター領域に続く括弧内の配列は、プラスミドｐＨＥｓ３２乃至ｐＨＥＳ３４について示す括弧内の配列で置き換えられている。制限酵素部位についても示しである。ｐＨＥｓ３１からｐＨＥｓ３３については、ポリリンカー領域は開始ＡＴＧコドン下流の３つの異なる読取り枠内に位置している。プラスミドｐＨＥＳ３４は開始ＡＴＧコドンを含んでいない。ｐＨＥｓ３１からｐＨＥｓ３４までの系列のすべてのプラスミドにおいて、ポリリンカー領域の後には、３つのすべての読取り枠内において翻訳終止コドン（下線部）が続き、その後には、上線を付した配列　ＴＴＴＴＴ八丁が続へ。この配列はワクシニアにおける初期遺伝子の転写終結を特定することが判明している（３９）。

プラスミドｐＨＥｓ１〜ｐＨＥＳ４系列（例３）と同様に、ｐＨＥｓ３１〜ｐＨＥｓ３４系列はポリリンカー領域に挿入された外来コード配列を発現させる。開始コドンを含有する外来コード配列は、ｐＨＥｓ３４に挿入発現される。開始コドンをもたない外来コード配列は、ｐＨＥｓ３１、ｐＨＥｓ３２又はｐＨＥｓ３３に挿入することによって適当な読取り枠中で発現される。元のｐＨＥＳ系列と同様に、ｐＨＥｓ３１〜ｐＨＥｓ３４系列はＫＩＬヒト宿主域遺伝子（１５）を含んでいる。ワクシニア欠失変異株ｖＰ２９３　（例１）とｐＨＥＳ系列のすべてのプラスミド誘導体との組換えによって組換えワクシニアウィルスが生じるが、これらの組換えウィルスはヒト細胞中での増殖能によって選択される。

組換えワクシニア中での外来遺伝子の感染後後期における発現にｐＨＥＳプラスミド系をさらに適用するために、カラボックスの１６０　ｋＤａＡＴ　Ｉ遺伝子に対するプロモーターを選んだ（４７）。カラボックスＡＴＩ遺伝子のすぐ上流に位置する５３３塩基対領域は、ワク、シニアウイルスに挿入した場合、感染後の後期に外来遺伝子の高レベルな発現を支配することが判明している（４８）。

上流ＢｇｌｌＩ部位から開始コドンまでの６３塩基対のカウボックスＤＮＡ領域は、ワクシニア中での外来遺伝子の発現プロモーターとして十分に機能する。このプロモーター領域を特定するＤＮＡを合成して、以下にその詳細を記す通り、ｐＨＥＳ系に挿入した。

Ｈｊｎｄｍによる部分消化とそれに続＜ＢａｍＨＩ消化によって、Ｈ６プロモーターをｐＨＥｓ１　（例３）から除去した。今度は図６を参照する。７．　８ＫｂのＨｉｎルから単離する（図６Ａ）。Ｈ６プロモーター配列を、カウボックスＡＴＩプロモーター配列及びポリリンカー配列へのＢａｍＨＩ連結部位で置き換えるために、ＨＲＬ３３からＨＲＬ４０までの８種類のオリゴヌクレオチドを合成した（図６Ｂ）。オリゴヌクレオチド対をアニールし、ｐＨＥｓ１由来の７，８ＫｂのＨｉｎｄｍ一旦ａｍＨＴベクターフラグメントに連結して、ｐＨＥｓ６１〜６４を作成した。オリゴヌクレオチドの個々のアニール対は、図に示す通り、ＨｉｎｄｌＩ及びＢａｍＨ１制限酵素部位で挟まれた６３塩基対の合成カウボックスＡＴｌプロモーター領域を含んでいた。

今度は図７を参照する。得られたプラスミドｐＨＥｓ６１からｐＨＥｓ６１は、カウボックスＡＴＩ後期プロモーター領域下流のポリリンカー領域を含んでいた（図７）。カウボックスＡＴＩプロモーターと同一の配列がｐＨＥｓ６１〜ｐＨＥＳ６４に存在するが、図にはｐＨＥｓ６１についてだけ示しである。ｐＨＥｓ６１のプロモーター領域に続く括弧内の配列は、プラスミドｐＨＥＳ６２乃至ｐＨＥＳ６４について示した括弧内の配列で置き換えられている。制限酵素部位についても示しである。ｐＨＥｓ６１からｐＨＥｓ６１については、ポリリンカー領域は開始ＡＴＧコドン下流の３つの異なる読取り枠内に位置している。プラスミドｐＨＥＳ６４は開始ＡＴＧコドンを含んでいない。

他のプロモーターを含んでいるｐＨＥＳプラスミド系列と同様に、ｐＨＥｓ６１〜ｐＨＥｓ６４のプラスミド系列のすべてのプラスミドが、ポリリンカー領域、それに続く翻訳終結シグナル（下線部）及び転写終結シグナル（上線部）を含んでいる。ｐＨＥｓ６１〜ｐＨＥＳ５４系誘導体はワクシニアＫＩＬヒト宿主域遺伝子を含んでいるので、これらのプラスミドとＶＰ２９３との組換えによって生じる組換えワクシニアブロジエニイウィルスは、ヒト細胞上での増殖能によって選択される。

１５５３７塩基対のＤＮＡ配列を左から右方向に示す。

−ＩＩＩ　Ｋ（４５５１塩基対；　１０９８２〜１５５３２番目）の配列全体に及んでいる。分かり易くするために、図８に示す通り、コード配列及び制限酵素部位を塩基の位置で呼ぶ。従来の命名法では、ワクシニア解読枠（ＯＲＦ）■　Ｃの左端（ワクシニアゲノムの左側末端）付近で大きな差異を有しているので、ワクシニアＨｉｎｄｕ　Ｃフラグメント内に位置するＯＲＦは、本明細書中では、Ｈ３ｎｄｍＣ／Ｎ接合部から始めて右から左へと番号付けて命名した。この命名法によれば、ＯＲＦ　ＣＩＬはコペンハーゲンワクシニアＤＮＡ中のＨｉｎｄｍ　Ｃフラグメント内の最も右側のＯＲＦ開始点である（図８参照）。

今度は図９を参照する。ＫＩＬ遺伝子を除去すればそのウィルスはヒトの細胞上での複製能を失う結果になるとの予想の下に、コペンハーゲンウイルスからＫＩＬヒト宿主域遺伝子（１５）を欠失させるためのプラスミドを構築した。図８に示した配列の左側やおよそ２．５ＫｂのＤＮＡを含みかつそこから右方向に１２９９８番目の塩基まで伸びるコペンハーゲンＫｐｎＩフラグメントＤを、ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位にクローン化してｐ　ＳＤ４３５を得た（図９）。（注記：図９において、ワクシニアコペンハーゲン挿入部を含有するｐＳＤ系列のプラスミドは、場合によっては、「ｖＣ」という記号の付いた形で記載されている。従って、ｐＳＤ４３５はｐＳＤ４３５ＶＣに等しい。「ｖＣコという記号は図１０においては除かれている。）　ＫｐｎＤフラグメントはＫＩＬ遺伝子（１１０３０〜１０１７９番目）を含んでいる。ＫＩＬ遺伝子及びそのフランキング領域の取扱操作を容易にするために、Ｈｉｎｄｎｒ　Ｍ内のｓｐｈ　Ｉ部位（９４７８番目）からＨｉｎｄＩｌｒ　Ｋ内のＣＩａＩ部位（１１７３１番目）までの配列を含むｐＳＤ４３５のサブクローンであるｐ　ＳＤ４５２を構築した（図９）。

ＫＩＬ遺伝子は斜線部分で示してあり、転写の方向は矢印で示しである。２箇所のＨｐａＩ部位（９５６１番目と１０１５５番目）を含むｐＳＤ４５２をＨｐａｌで部分消化して線状化し、ＫＩＬ遺伝子の直ぐ下流のＨｐａＩ部位（１０１５５番目）に１”リンカ−を連結した。得られたプラスミドをＢｇｌｎで切断し、自己連結してｐＳＤ４５３を作成した。ｐＳＤ４５３においては、ＫＩＬ遺伝子とそのプロモーターは欠失している。欠失部位は三角印で示しである（図９）。

ワクシニア１１ｋＤａ後期プロモーター（黒く塗りつぶした太い矢印部分’）　（４９）の制御下に置かれたβ−ガラクトシダーゼのコード配列（刻点部分、遺伝子の方向は矢印で示す）を含むフラグメントを、ｐＳＤ４５３のＵ９）。ｐＳＤ４５３ＢＧを、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のチミジンキナーゼマイナス（−）誘導体であるｖＰ４１．０（５０）との組換え用ドナープラスミドとして用いた。プロジェニイウィルスをＸ−ｇａｌの存在下でアッセイした。青色プラークを採取し、ＶＥＲＯ細胞上で増殖させることによって精製した。予想された通り、得られた組換え体ｖＰ５４８は、）２Ｐ標識ＫＩＬ配列でプローブした時にＫＩＬ遺伝子が失われていることが判明した。驚くべきことに、ｖＰ５４８はＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成した。

ｖＰ５４８中におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の存在がＭＲＣ−５細胞上でのプラーク形成能力の助けとなるか否かをテストするために、ドナープラスミドｐＳＤ４５３との組換えによってｖＰ５４８から１１ｋＤａ／β−ガラクトシダーゼカセツトを除去した。得られたワクシニア欠失組換え体ｖＰ６６１もＭＲＣ −５細胞上でプラークを形成した。

例６の結果は、ヒト細胞上での増殖能を付与することのできるワクシニア宿主域遺伝子がＫＩＬだけに限られないかもしれないことを示唆している。ワクシニアウィルスｖＰ２９３　（例３）及び宿主域１８Ｋｂ欠失変異株ワクシニアウィルス（１４）の欠失領域が、ＫＩＬと同様にヒトの細胞上での増殖能を付与するようなその他の遺伝子を欠いていた可能性を調べた。図１０は、潜在的宿主域遺伝子の位置を示すワクシニアウィルスゲノムの左端の制限酵素地図を示したものである。ワクシニアウィルスゲノムの左端のＨ４ｎｄｍ地図及びＥｃｏＲＩ地図を最上段に示す。関連するＥｃｏＲＩ部位だけが示しである。ワクシニアウィルス欠失変異株ｖＰ２９３　（例３）及び１８Ｋｂ宿主域欠失株（１４）中での宿主域欠失部の範囲、並びに２つの欠失変異株に共通する欠失領域を太線で示す。最も右側の５ａｌ１部位からＨｉｎｄｌＩＩ　Ｋフラグメントまでの１５５３７塩基対の配列決定領域（図８）を拡大した。関連する制限酵素部位だけが示しである。ここで問題とする遺伝子の位置は四角で囲って示しである。宿主域能力に対する遺伝子を試験するのに用いたフラグメントの位置は、凹型記号で示しである。ここで問題とするプラスミド中のワクシニア挿入部の位置は、関連する制限酵素部位の位置と共に示しである。

記号：５＝ＳａｌＩ　；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　；Ｈ＝Ｈｉｎｄｍ；Ｂｇ＝Ｂｇ　Ｉ　ｎ　；Ｋｐ＝Ｋｐｎ　Ｉ　；　Ｂ＝ＢａｍＨＩ　；５ｐ＝ＳｐｈＩ；　Ｃ＝Ｃ１ａｌ；Ｈｐ＝Ｈｐａ１０図１０に示すように、１８Ｋｂ宿主域欠失部とＶＰ２９３中の欠失部とに共通する欠失領域は、ＥｃｏＲＩ　Ｃ内の未決定点からＨｉｎｄｎＩ　Ｋ内の５ａｌ１部位（１（１４）に位置付けられ、また、宿主域遺伝子ＫＩＬ（１０番目）は、ヒトの細胞上での増殖を回復しなかった。

いはＢｇＩＩＩ部位（１１１１６１１１６番目ａＩ部位との間（１１７３１１７３１番目するＥｃｏＲＩ　Ｋ７ラグメント内の潜在的宿主域遺伝子が失われていたかもし４９番目）、Ｂｇ１１１部位（８６４４番目）もしくはｐ番目）を横切る遺伝子が失われていたのかもしれない。

ここで述べた１５．５Ｋｂの配列のアミノ酸翻訳分析の結果、以前（１４，１５）には試験されていなかった４つの潜在的遺伝子が明らかになった。４つの解読枠すべてが右から左に配向していた。これら４つのＯＲＦ、即ち、Ｃ７Ｌ　（１３１４〜８６３番目）　、Ｎ２Ｌ　（７９４３〜７４１６番目）　、ＭＩＬ　（９３２９〜７９８５番目）及びに２Ｌ　（１２３６７〜１１２５８番目）の位置を図１０に示す。ＭＩＬのＯＲＦ内にある最初のＡＴＧは９４０３番目に位置する。この位置は、ＭＩＬに対する転写開始部位として文献に記載されている位置（５１）よりも上流（右側）で、しかもＭ２Ｌ遺伝子のコード配列内にあるので、９３２９番目のＡＴＧがＭＩＬ遺伝子の真の翻訳開始点であると解釈することもできる。

当初、上記４つの潜在的遺伝子の内で宿主域遺伝子として最も見込みがありそうなのはＭＩＬであるように思われた。ＫＩＬに対する１２ｐ標識ＤＮＡプローブとＭＩＬ配列とのサザンプロット上での交差反応は弱かった（データは示していない）。

本明細書中に記載したワクシニアコペンハーゲン株中のＭＩＬ遺伝子配列は、文献に記載されているワクシニアウィルスのＭＩＬ配列（５１）とアミノ末端が異なっている。文献に記載された配列と比較すると、本明細書中に記載した配列では２つの塩基（９３０７番目と９３１２番目）が挿入されており、フレームシフト変異を起こしている。本明細書中に記載した配列においては、翻訳は９３２９番目のＡＴＧから始まる。文献に記載された配列（５１）においては、このＡＴＧから始まる潜在的翻訳は９２７８番目の枠内終止コドンによって終結し、ＭＩＬの翻訳は９２４７番目から始まる。本明細書中に記載した配列においては、９３２９番目のＡＴＧから始まる翻訳は、文献に記載されたＭＩＬの終止コドン（７９８７番目）まで続く。結局、本明細書中に記載したＭＩＬ遺伝子は、文献記載のＭＩＬ遺伝子（５１）と比べると、アミノ末端側に２７個の余分のアミノ酸を含んでおり、２つのアミノ酸が置換されている。ＷＲ株のＮ２°Ｌ遺伝子の配列についても報告されている（５１）。本明細書中に記載したコペンハーゲン株のＮ２Ｌ遺伝子は、文献記載の配列と比べると、４個のアミノ酸置換を有している。

本明細書中に記載したワクシニアウイルスコペンハーゲン株のＭ　１．　ＬのＯＲＦによってコードされるタンパク質をコンピューター解析すると、ＰＩＲデータベース又はスイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−？ｕ）データベースに存在するどんなタンパク質よりもワクシニアウイルスコペンハーゲン株のＫＩＬタンパク質（１５）との類似性が高かった。この結果をサザンプロット分析から得られた結果と照らし合わせると、ＭＩＬ遺伝子産物がＫＩＬ遺伝子産物と類似の宿主域機能部として働く可能性を示唆している。

従って、４つの潜在的ヒト宿主域遺伝子の中で、まず最初にＭＩＬ遺伝子について、ヒトの細胞上でワクシニアウィルスを増殖させる能力があるか否かをアッセイするための試験をワクシニアウィルスｖＰ２９３宿主域選択系中で行なった。

ＭＩＬ遺伝子とそれに続く遺伝子をｖＰ２９３選択系中に組換えるために、ｐＭＰ　５２８（例１）及びその誘導体ｐＭＰ５２８Ｅ　（例２）をベクタープラスミドとして利用した。ｐＭＰ　５２８は、ワクシニア組換え体ｖＰ２９３を誘導するちととなったワクシニア欠失プラスミドである。ｐＭＰ５２８は、ワクシニアＤＮＡ領域ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ／Ｈｉｎｄｕ　Ｋに由来するワクシニアフランキング腕間の欠失接合部に５ａ１１部位を含んでいる。ｐＭＰ５２８Ｅにおいては、ワクシニアＨｆｎｄｍ　Ｋ　ＤＮＡ由来の右側のフランキング腕が短くなっており、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＴｆｉＣ／　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍＫ欠失接合部にあった元の５ａｌＩ部位がＳｍａ！部位に置き換っている。

ｖＰ２９３系中の潜在的宿主域遺伝子について行なった試験法を図１１に図示する。ワクシニアウィルスゲノムの左端のＨ４ｎｄｎ［地図を最上段に示す。遺伝子の位置は四角で囲み、転写の方向は矢印で示した。遺伝子の宿主域活性の試験に用いたワクシニアフラグメントの位置は、凹型記号で示しである。

Ｎ２Ｌの３′末端（９３８４番目、ＭＩＬ開始コドンたｐＭＰ　５２８　Ｅに連結した（図１１）。得られたプラスミドｐＭＰ　５２８ｍを、ワクシニアウィルスｖＰ２９３との組換え用ドナープラスミドとして用いた。ＭＩＬ遺伝子に対する１２ｐ標識ＤＮＡプローブを用いた分析から、ＭＩＬ配列がワクシニアに挿入されていることは判明したが、プロジエニイウイルスはＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成しなかった。

ＭＩＬ遺伝子の転写開始に必要とされるプロモーター領域のサイズが判明していないので、ｐＭＰ５２８ｍ中に存在するＭＩＬコード配列の上流５５塩基ではＭＩＬ遺伝子の転写を特定するのに十分でない可能性がある。

従って、Ｍ２ＬＳＭＩＬ及びＮ２Ｌのすべての遺伝子を含むワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＤＮＡのより“大きなフラグメントで試験した。ワクシニアウイルスコフラグメントは、Ｎ２Ｌ　（１００４３〜９３８１００４３〜９３８１番目９〜７９８５番目）及びＮ２Ｌ　（７９４３〜７４１６番目）のすべての遺伝子を含んでいた。こ５２８Ｅにクローン化した（図１１）。得られたプラスミドｐＭＰｍ１２ｎ２を、ワクシニアウィルスＶＰ２９３との組換え用ドナープラスミドとして用いた。３２ｐ標識ＤＮＡプローブを用いた分析から上記３つの遺伝子がワクシニアに挿入されていることが判明したが、組換えプロジエニイウイルスはＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成しなかった。この事実は、ＭＩＬ及びＮ２Ｌが推定していたような宿主域遺伝子ではないことを示している。

以前試験されたＥｃｏＲＩ　ＫのＢｇｌＩ［ＡフラグメントにはＭ２Ｌ遺伝子全体が含まれているので（１５）、Ｎ２Ｌが宿主域遺伝子であるとは考えられない。

ワクシニアウィルスのヒト宿主域遺伝子としての可能性の残るものはに２ＬとＣ７Ｌであった。Ｋ２Ｌは１８Ｋｂ宿主域変異株から失われており、ｖＰ２９３中ではｋＤａタンパク質をコードする能力を有している。

本明細書中で記載するに２Ｌ遺伝子は、ＷＲ株のワクシニアについて以前報告されたＦＯＲＦ　ＫＩＬＪ　（５２）に対応するものであるが、２つのアミノ酸が置き換っている点で異なる。ワクシニアウィルス欠失変異株ｖＰ２コードする配列の大半を含んでいる。Ｋ２Ｌ遺伝子（１２３６７〜１１２５８番目）がヒトの細胞上でワクシニアウィルスを増殖させる能力を有するか否かを試験するために、ワクシニアに２Ｌ遺伝子の３′末端をプラスミドｐＭＰ５２８に復元した。合成ポリリンカーＭＰＳＹ（５′Ａ丁ＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴ３’　）とＭＰＳＹＮ５３（５’　ＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣ＾＾ＧＣＴＴＡＴＡ＾ＡＡＡＴＡＡＴ３’　）位（１１１７７１１７７番目し、Ｋ２Ｌの３′末端を含い方向に挿入した（図１１）。得られたプラスミドｐＭＰ５２８に２を、ワクシニアウィルスｖＰ２９３との組換え用ドナープラスミドとして用いた。この場合も、組換えプロジェニイワクシニアウイルスはＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成せず、Ｋ２Ｌが宿主域遺伝子でないことを示していた。

本明細書中で記載するＣ７Ｌ遺伝子は、アミノ酸レベルでは、以前報告されたＷＲ株の１８　ｋＤａ遺伝子（４０）と正確に対応する。Ｃ７Ｌ遺伝子（１３１４〜８６３番目）の宿主域能力について試験するために、プラスミドｐｓＤ４２０をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで切断して、７２４番目のＢａｍＨＩ部位から１７６４番目のＢｇ１１１部位までの１０４０塩基対のフラグメントを単離した。こ結した（図１１）。得られたプラスミドｐＭＰ　５２８　Ｃ７Ｌを、ワクシニアウィルスｖＰ２９３との組換え用ドナープラスミドとして用いたところ、プロジエニイウイルスはＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成した。この結果は、Ｃ７ＬがＫＩＬと同様にヒトΦ細胞上での増殖を特定し得る宿主域遺伝子であることを示している。Ｃ７Ｌ遺伝子はＥｃｏＲＩ　Ｃ／Ｊ接合部にまたがっているので、これまで試験されていなかった（１４）。

ワクシニアウィルスのＣ７Ｌ遺伝子は、ＫＩＬと同様に、ＷＲ株のワクシニアウィルス欠失変異株のヒトの細胞上でのプラーク形成能を回復することができるので、ワクシニアコペンハーゲン株からＣ７Ｌ遺伝子を単独で欠失させた場合ともう一つの宿主域遺伝子ＫＩＬと共に二に重欠失させた場合の両方について、欠失の影響を調べた。

Ｃ７Ｌ遺伝子の欠失用プラスミドの構築法、並びにＣ７Ｌを欠失したワタシニア組換え体の作成法を図１２に段に示した。Ｃ７Ｌ遺伝子は斜線部分で示し、転写方向を矢印で示した。プラスミドｐｓＤ４２０から得られたＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ　ＤＮＡフラグメント（７２５〜１７６４番目）を大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とし、ＰｖｕＩＩで切断しておいたｐＵＣ１８に連結して、プラスミドｐＭＰ４２０８Ｂを作成した（図１２）、ｐＭＰ４２０ＢＢをＥｃｏＲＶ’ｔ’線状化しくＣ７Ｌのコード配列が切断される）、ワクシニア１１ｋＤａプロモーター（黒く塗りつぶした太い矢印部分）／β−ガラクトシダーゼ（刻点部分、転写方向を矢印で示す）カセットからなる３、２ＫｂのＳｍａ　１を両端にもつＤＮＡに挿入した。得られたプラスミドｐＭＰＣ７ＬＫＢＧは、ワクシニア配列に対して左から右方向に配向した１１ｋＤａプロモーター／ β−ガラクトシダーゼカセットを含んでいる。ドナープラスミドｐＭＰＣ７ＬＫＢＧ及び救援コペンハーゲンワクシニアウイルスｖＰ４１０と、を用いて組換えを行ない、ワクシニア組換え体ｖＰ６６５を得た。このｖＰ６６５はＸ−ｇａｌ存在下で青色のプラークとして同定された。

ｐＭＰ４２０８ＢからＣ７Ｌ遺伝子を欠失させるために、Ｃ７Ｌ遺伝子中のユニークな５ａｃ１部位（９９９番目）で切断し、次いでＢａ１３１エキソヌクレアーゼで消化することによって、プラスミドｐＭＰ４２０ＢＢを線状化した。４６量体の合成オリゴヌクレオチドＭＰＹＮ２３４（５’　ＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＡＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＴＡＣＣ３を用いて、二本鎖鋳型上で変異導入（５３）を行なった。

得られたプラスミドｐＭＰＣ７Δ中には、Ｃ７Ｌ遺伝子が欠失しており（欠失部位を三角印で示す、図１２）、左側の１４０塩基対及び右側の４００塩基対のワクシニアフランキング腕が残っている。ｐＭＰＣ７Δをトナープラスミドとして用いて、中断したＣ７Ｌ遺伝子／１１ｋＤａプロモーター／β−ガラクトシダーゼ配列をｖＰ６６５から除去し、ｖＰ７０６を得た。このｖＰ７０６はＸ−ｇａｌ存在下で無色のプラークとして同定された。ＶＰ６６５とｖＰ７０６は双方ともＭＲ，Ｃ−５細胞上で増殖した。この結果は、これらの組換え体がＫＩＬ宿主域遺伝子を依然として含んでいることから予想できる。

ＫＩＬ遺伝子とＣ７Ｌ遺伝子を双方とも欠くウィルスを作成するために、ＫＩＬ欠失ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ６６１との組換え用ドナープラスミドとしてｐＭＰＣ７ＬＫＢＧを用いた。得られたプラスミドｖＰ６８３はＸ−ｇａｌ存在下で青色のプラークとして選択された。ドナープラスミドｐＭＰＣ７Δとの組換えによって、Ｃ７Ｌ遺伝子をワクシニア組換えウィルスｖＰ６８３から欠失させた。得られた二重欠失組換えワクシニアウィルスｖＰ７１６はＸ−ｇａｌ存在下で無色のプラークとして同定された。ｖＰ６３８とｖＰ７１６は共にＭＲＣ− ５細胞上で増殖せず、ヒト細胞上でのワクシニアの増殖を阻止するにはＫＩＬとＣ７Ｌの２つの遺伝子の欠失で十分なことを示している。

表２は、ワクシニアウィルス遺伝子がワクシニアウィルス欠失変異株ｖＰ２９３に宿主域機能を回復させる能力について比較したものである。比較の対象としたのは、表記の遺伝子を組換えによってワクシニアウィルスｖＰ２９３に再導入した後のヒト又はサルの細胞上での相対的な複製能力である。

表　２ウィルス　挿入遺伝子　力価（ｐｌｕ／１ｆ）ＶＥＲＯＭＲＣ−５ｖＰ２９３　ＭＩＬ　１．７ｘｌＯ’　０ｖＰ２９３　Ｋ２Ｌ　２．５ｘｌＯ’ 　０ｖＰ２９３　Ｎ２Ｌ、ＭＩＬ、Ｎ２Ｌ　１．５１１０’　０マＰ２９３　ＫＩＬ　１．７ｘｌＯ’　４．７１１［１’ｖＰ２９３　Ｃ７Ｌ　１．４１１０’ 　５．９１１０″例９−７７ｋＤａ産物をコードするカウボ・ンクス遺伝子ワタシニアウイルスと異なり、カラボックスウィルスはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上で増殖できる。ＣＨＯ細胞上でのワクシニアウィルスの複製を可能にするカラホックスゲノムの領域が既に同定されている（５４）。かかるカラボックス遺伝子及びプロモーターは２，３ＫｂのＨｐａＩフラグメントに位置付けられる。該遺伝子は予想上７７ｋＤａの翻訳産物をコードする。

カラボックス遺伝子は、ＤＮＡレベルにおいてもタンパク質レベルにおいても、ワクシニアウィルス中の２つのヒト宿主域遺伝子ＫＩＬ（５４）及びＣ７Ｌ　（本明細書で記載）のいずれとも余り相同性は示さない。

今度は図１３を参照する。本ワクシニア系中で７７ｋＤＩカウボツクス遺伝子を発現させるための準備として、カラボックスＤＮＡをＨｐａＩで消化し、上記遺伝子とそのプロモーターを含有する２、３Ｋｂフラグメントをアガロースゲルから単離した。該遺伝子の両側をポリリンナショナル・バイオチクノロシーズ社（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｅｅｂ＋＋ｏｌａｇｉｅ＋、Ｉｎｃ、）製、コネティカット州ニューヘブン　（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ））に連結して、ｐＣＰ３を得た（図１３）。ワクシニアに挿入するため、以下に述べる通り、コペンハーゲンベクタープラスミドｐｓＤ４９４ＶｃのＡＴＩ領域中にこのカラボックス遺伝子をクローン化した。

文献に記載されているカウボックスＡＴ！コード配列の５′末端のＤＮＡ配列（４））に従って合成したプライマーを用いて適当なワクシニアＷＲクローンの配列を決定することによって、ワクシニアウィルスに存在するカラボックスＡＴＩ領域遺伝子対応ワクシニア遺伝子の位置付けをした。ＡＴ！遺伝子が１６０ｋＤａのタンパク質をコードするカラボックスと異なり、ＷＲワクシニアの対応遺伝子は９４ｋＤａのタンパク質をコードする（４８参照）。ＷＲ株とは異なり、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン株はＡＴＩ対応遺伝子の５′末端及びその直前の遺伝子の３′末端を含めて４．ＩＫｂの欠失部を含んでいる。２つのＯＲＦの残存部分が枠内で一緒になって、９６６塩基対のハイブリッドＯＲＦを形成している。コペンハーゲンベクタープラスミドｐ　Ｓ　Ｄ　４９４　Ｖ　ＣＩｔ、コペンハーゲンＨｉｎｄＩ［Ｉ　ＡのＸｂａｌ／Ｂｇｌｎプラスミドサブクローンであり、コペンハーゲン株中に存在するカラボックスＡＴＩ対応遺伝子の融合によって形成されたハイブリッドＯＲＦとその上流に位置する隣接部とがポリリンカー領域で置き換っている。該ポリリンびＨｐａｌを特定する配列である　５ ′Ａ６＾ＴＣ丁ＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣ３’　からなる。ｐＳＤ“４９４ＶＣは、ポリリンカー領域の左側の０．７ＫｂのフランキングワクシニアＤＮＡと、ポリリンカー領域の右側の１．３ＫｂのフランキングワクシニアＤＮＡとを含んでいる。

カウボックス７７ｋＯｒ遺伝子とそのプロモーターを含カー領域に連結して、プラスミドｐＣＰ５を得た（図１３）。７７ｋＤａカウボツクス遺伝子を含有するｐＣＰ５とコペンハーゲンワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えによって組換えウィルスｖＰ６９５が生じたが、この組換えウィルスは予想通りＣＨＯ細胞上でのプラーク形成能を有していた。

７７ｋＤｘカウボツクスＣＨＯ宿主域遺伝子がヒトの細胞上でのワクシニアの増殖を特定する能力をも有するか否かを試験するために、７７ｋＤａカウボツクス遺伝子を含有するプラスミドｐＣＰ５とヒト細胞上でプラーク形成しないＷＲワクシニア宿主域欠失変異株ｖＰ２９３との間で組換えを行なった。組換えプロジエニイウイルスｖＰ６９８はＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成した。

この結果は、７ＴｋＤａカウボツクス遺伝子がＣＨＯ宿主域遺伝子であるだけでなく、ワクシニア遺伝子に２Ｌ及びＣ７Ｌと同様のヒト宿主域遺伝子でもあることを示している（図１３）。

カウボックスウイルス７７ｋＤａ遺伝子がＣＨＯ細胞及びヒトＭＲＣ−５細胞上でのワクシニアウィルスの増殖を特定することができるという観察結果に鑑みて、２つのワタシニアヒト宿主域遺伝子Ｃ７Ｌ及びＫＩＬがその他の種に由来する細胞上でのワクシニアウィルスのインヴイト口複製能に対して果たす役割を決定することに興味があった。また、ワクシニアにコードされている他の遺伝子が、他の種に由来する細胞上でのワクシニアウィルスの増殖に特に必要とされるか否かを決定することにも興味があった。最初に、コペンハーゲンワクシニアウイルスＣ７Ｌ及びＫＩＬ欠失変異株系列について、ブタ腎臓由来の細胞系であるＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でのプラーク形成能を試験した。

６０ａｍシャーレ上のＶＥＲＯ，ＭＲＣ−５及びＬＬＣ−ＰＫＩ細胞の集密的細胞単層を、２００μｌのイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）＋２％新生ウシ血清中でのウィルスの１０倍連続稀釈で感染させた。１時間吸着させた後接種液を除去して、０．７％シーケム・エルイー−アガロース（Ｓｅａｋｅｍ　Ｌｔ　Ａｇａｒｏｓｅｌ　と１０％新生ウシ血清を含む５　ｍｌのイーグルＭＥＭを細胞単層上に上層した。

シャーレを３７℃でインキユベートした。感染４日後に、０．０４％のニュートラルレッドを含有する０、６％のアガロース５　ｍｌからなる追加層を加えて、細胞単“層を染色した。染色して６日後にプラークを観察した。

表３Ａに示す通り、コペンハーゲン欠失変異株は、ヒトＭＲＣ−５細胞と同様のプラーク形成能をブタ腎臓ＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上においても示した。ＫＩＬもしくはＣ７Ｌのいずれかを欠くがもう一方のヒト宿主域遺伝子は保有する組換えウィルス（ＫＩＬを欠くものはｖＰ６６１、Ｃ７Ｌを欠くものはｖＰ７０６）は、ＭＲＣ−５細胞及びＬＬＣ−ＰＫＩ細胞の両方でプラークを形成した。ＫＩＬとＣ７Ｌを両方とも欠く組換えウィルス（ＶＰ７１６）は、ＭＲＣ−５細胞上でもＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でもプラークを形成しなかった。従っ”ｒ、ＬＬＣ−ＰＫＩ細胞系上でのインヴイトロプラーク形成能を基準にして評価すると、２つのワクシニアヒト宿主域遺伝子ＫＩＬ及びＣ７Ｌはブタ宿主域遺伝子でもある。ヒト細胞系ＭＲＣ−５で観察されるように、ＫＩＬもしくはＣ７Ｌのいずれかがワクシニアゲノムに存在すればブタ腎１１ＬＬｃ−ＰＫＩ細胞上でのコペンハーゲンワクシニアウイルスのプラーク形成には十分である。組換えワクシニアウィルスｖＰ７１６　（ＫＩＬ−、Ｃ７Ｌ−）はＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でプラークを形成しないので、ワクシニアヒト宿主域遺伝子の場合と同様に、ＫＩＬとＣ７Ｌがワクシニアウィルスのコペンハーゲン株にコードされた唯一のワクシニアブタ宿主域遺伝子である。

これらの結果は、ＷＲワクシニア欠失変異株ｖＰ２９３に挿入された宿主域遺伝子を含有するワクシニアウィルス組換え体を用いて確認された（表３Ｂ）。予想通り、Ｃ７ＬからＫＩＬまでに及ぶ幅広い欠失部を含むｖＰ２９３はＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でのプラーク形成能を欠いていた。ｖＰ２９３にＫＩＬ遺伝子を挿入すれば、得られたワクシニア組換え体（ｖＰ４５７）がＬＬＣ−ＰＫ１細胞上で増殖するのに十分である。しかしながら、ヒトＭＲｃ−５細胞について観察されるように、ＭＩＬ遺伝子をＷＲ欠失変異株ｖＰ２９３に挿入しても、得られたウィルス（ｖＰ５９６）がＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でプラーク形成するには不十分である（表３Ｂ）。

ワクシニアウィルスのＣ７Ｌ又はに’ｌＬ遺伝子又はカラボックスウィルスの７７ｋＤａ遺伝子のいずれがをＷＲ欠失変異株ｖＰ２９３に挿入すれば、ヒトＭＲＣ−５細胞上でのプラーク形成能が回復する（表３Ｂ）。同様に、Ｃ７Ｌ遺伝子又はカウボックス７７ｋＤｘ遺伝子のいずれかを含むｖＰ２９３系のワクシニアウィルス組換え体（Ｃ７Ｌを含むものはｖＰ６３８．７７ｋＤａ遺伝子を含むものはｖＰ６９８）は、Ｉ、ＬＣ−ＰＫＩ細胞上でプラークを形成する。従って、カウボックス７７ｋＤａ遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（５４）及びヒト細胞に対する宿主域遺伝子であるだけでなく、ブタの細胞に対する宿主域遺伝子でもある。

マＰ４１Ｇ　＋　＋　＋　− マＰ６６１　ＫＩＬ　＋　＋　＋　− −ｖＰ７Ｏｆ＋Ｃ７Ｌ＋＋十− ｖＰ７］６　ＫＩＬ、Ｃ７Ｌ　＋　− ｖＰ４５７ＫＩＬ＋＋＋− マＰ５９６　ＭＡＬ　＋　− ｖＰ６３８　ＣＡＬ　＋　＋　＋　− 例１０−コペンハーゲン欠失変異株の通例の増殖条件下（３日、ノープル・ディフコｆＮｏｂｌ＋Ｄｉｌｃｏ）寒天上層）では、ＷＲ欠失変異株ｖＰ２９３はヒトＭＲＣ−５細胞単層上でプラークを形成しない。しかし、インキュベーション時間を延長するか或いは寒天上層を変更すると、ｖＰ２９３はＭＲＣ−５細胞率層上で小さなプラークを形成できるようになる。特に、寒天の代わりに０．６％乃至１％のシーケム・アガロースもしくは低融点アガロースを上層に使用すると、ＭＲＣ−５細胞上でのｖＰ２９３の小プラーク形成に都合がよい。

ＫＩＬ遺伝子を含有するｐＨＥＳ系プラスミド（例３）とｖＰ２９３との組換えによって生ずる組換えワクシニアプロジエニイはＭＲＣ−５単層上で大きなプラークを形成するが、この大きなプラークはバックグランドとしてのｖＰ２９３の小プラークとは明瞭に区別できる。従って、ｖＰ２９３とコペンハーゲン系列のヒト宿主域欠失変異株について、液体の上層のもとでＭＲＣ−５及びＶＥＲＯ細胞に限定的に感染する能力を調べた。

一対ずつのＴ−７５フラスコに、５Ｘ１０６個のＭＲＣ−５又はＶＥＲＯ細胞を植えた。２日後、集密的細胞単層に、０．５ｍｌのＭＥＭ＋新生ウシ血清（ＮＣ８）中の表３に示すワクシニアウィルスを細胞当Ｖ）Ｏ，０１ｐｆｕの感染多重度（フラスコ当りの投入力価は１０３ｐｆｕ）で感染させた。１時間吸着させた後、個々のフラスコに１０ｍ１の培地を加えた。直ちに、多対のフラスコの一方を凍結した（ｌｈｐｉ試料）。残りのフラスコを３７℃で感染後９６時間（９６ｈｐｉ）インキュベートし、しかる後に凍結した。３度凍結と融解を繰り返すことによってすべての試料からウィルスを採集し、ＶＥＲＯ細胞上細胞値を検定した。

ＭＲＣ−５及びＶＥＲＯは細胞当り０．０１ｐｆｕの感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。９６時間インキュベートした後（９６ｈｐ　ｉ）　、ウィルスを採集して、ＶＥＲＯ細胞上細胞値を検定した。ヒト宿主域遺伝子の一方を欠失したコペンハーゲン変異株であるｖＰ６６１（Ｃ７Ｌ＋、ＫＩＬＮとｖＰ７０６　（Ｃ７Ｌ−、ＫＩＬ＋）は、ＭＲＣ−５細胞上でもＶＥＲＯ細胞上°でもほぼ等しい増殖率（３〜４１ｏｇ＋。、即ち数千から敵方）を示し、対照としてのｖＰ４１０　（Ｃ７Ｌ　、ＫＩＬ　）と同等であった。ヒト宿主域遺伝子を両方とも欠失するコペンハーゲン変異株であるｖＰ７１６　（Ｃ７Ｌ−、ＫＩＬＩとｖＰ６６８　（Ｃ７Ｌ−〜ＫＩＬ−）　、並びにＷＲ欠失変異株ｖＰ２９３　（２１，７Ｋｂ欠失）は、ＶＥＲＯ細胞上細胞値Ｐ４１０、ｖＰ６６１及びｖＰ７０６とほぼ等しい増殖率を示した。欠失変異株ウィルスｖＰ７１６、ｖＰ６６８及びｖＰ２９３の増殖は、ヒトのＭＲＣ−５細胞上で確かに陽性ではあったが、ＶＥＲＯ細胞上細胞値殖率に比べると劇的に減少している。ここで用いた条件の下では、ワクシニアヒト宿主域遺伝子ＫＩＬとＣ７Ｌを両方とも欠失する３種類のワクシニアウィルスｖＰ７１６、ｖＰ６６８及びｖＰ２９３は、産生能力はあるが、ヒ）ＭＲＣ−５細胞の感染力は非常に制限されている（９６時間の感染でおよそ１０倍の増殖率）。

表４に示すこれらの結果は、３６時間の感染で２．３倍の増殖率という以前の報告（６）と一致している。

９６　ｈｐｉ’の力価　ウィルスの増殖２ウイルス　欠失　ＶＥＲＯＭＲＣ−５ＶＥＲＯＭＲＣ−５ｖＰ４１０　１．９ｘＩＯ’　１．０ｘｌＯ６５５８８６２５ＧマＰ６６１　ＫＩＬ　３．８！１０’　１．１！ｌ［ｌ’　９２６８　３２３５ｖＰ７０６　Ｃ７Ｌ　２．３ｘｌＯ’　８．６ｔ１０６１００００　３４４０ｖＰ７１６　Ｃ７Ｌ、ＫＩＬ　Ｉ、３ｘｌＯ’　３．４ｘｌＯ’　４３７５　ＩＩｖＰ６６８　［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］　８．０！１０６６．４ｘｌＯ’　２８５？　２１ｖＰ２９３　［ＷＲ２１，７ｋｂ１　６．９！１０６６．４！１０’　３８３３　７１投入力価＝１０３ ’　９６　ｂｐｉ　（感染後の時間）における力価の］　ｈｐｉ　（吸着終了時）の力価に対する比ＭＲＣ−５以外のヒトの細胞上でヒト宿主域遺伝子Ｃ７Ｌ及びＫＩＬを欠失したワクシニアウィルスが限定的な増殖をすることができるか否かを決定するため、ＭＲＣ−５及びＶＥＲＯ細胞と対照して、さらに３種類のヒトの細胞系上でのコペンハーゲンワクシニアウィルス変異株ｖＰ６６８　（Ｃ７ＬからＫＩＬまでを欠失）の増殖をアッセイした（表５）。

感染に先立って、６０ｍｍシャーレに１．５Ｘ１０６個／シャーレの細胞を植えた。０．５ｍｌのＭＥＭ＋新生ウシ血清（ＮＣ８）中のワクシニアウィルスｖＰ４１０又はｖＰ６６８を、それぞれの細胞系の細胞単層を含む１対ずつのシャーレに、細胞当り０．０１ｐｆｕのｍｏｉで加えた。１時間吸着させた後、個々のシャーレに４ｍｌの培地を加え、半数のシャーレを凍結した（ｌｈｐｉ試料）。

残りのシャーレを３７℃で感染後９６時間（９６ｈｐ　ｉ）インキユベートシ、シかる後に凍結した（９６ｈｐｉ試料）。３度凍結と融解を繰り返すことによってすべての試料を採集し、ＶＥＲＯ細胞上細胞値を検定した。２つのシャーレを各時点まで感染させて、力価を平均した。各ウィルスの増殖率は、９６ｈｐｉで得られた力価のｈｐｉにおける力価に対する比で表した。

表　５コペンハーゲンワクシニアウイルスマＰ４１０及びｖＰ６６８サルＶＥＲｏ　７０２＋２　１３＋０３　１１１．６ヒトＭＲＣ−５７３３３１００，１４ＷＩＳ）１　１９４８０　０．４　０．００２ＨｅＬｘ　５００００　０．４　０．　ＯＯ［１８Ｄｅｌ＋ｏＨ９６６０２，８０，０３１使用細胞系：　ＶＥＲＯ＝サル腎臓ＡＴＣＣＣＣＬ　８１；ＭＢＣ−５＝ヒト胚性肺ＡＴＣＣＣＣＬ　１７１；ｔｌｃＬａ　＝ヒト子宮頚上皮腫ＡＴＣＣＣＣＬ　２；ＷＩＳＨ＝ヒト羊膜（）ＩｅＬａｖ−カー）　ＡＴＣＣＣＣＬ　２２５；Ｄｅｌｔｏロ＝ヒト包皮ＡＴＣＣＣＣＬ　５４２各細胞に対する収率％マＰ６６ｇ／ｖＰ４］　０は、マＰ６６８の増殖率（９６ｈｐｉ／］　ｂｐｉ）をｖＰ４１０の増殖率（９６ｈｐｉ／Ｉ　ｈｐｉ）で割った比×１００ｖＰ６６８ウィルスは、ＭＲＣ−５細胞上で９６時間インキュベートしたとき一桁の増殖率しか示さなかった。

デトロイト（ヒト包皮）細胞系についての感染９６時間後（９６ｈｐｊ）のｖＰ６６８の増殖率は、ウィルス吸着後（ｌｈｐｉ）の力価の２．８倍であった。ＷＩ　ＳＨ（ヒト羊膜）及びＨｅＬａ　（ヒト子宮頚上皮腫）細胞系については、ｖＰ６６８ウィルスの９６ｈｐ　ｉの増殖率は１ｈｐｉの吸着後の値よりも低く、これらの細胞系上でコペンハーゲンワクシニア宿主域欠失変異株のウィルス複製が全く起こらないことを示していた。対照ウィルスｖＰ４１０の増殖率から分かるように、すべての細胞系がワクシニアウィルスに対して許容性であった。様々なヒトの細胞系について宿主域変異株の増殖を支持する能力に差があることは他の研究書違によっても明らかにされている（６）。

ワクシニアウィルスの宿主域変異株は組換えワクチンベクターとして有効であると考えられる。かかる°や一イルスベクターは上述の通り問題とする種、例えばヒト又はブタ中での複製能を欠いているので、複製能の低下又は欠如によって安全性が増大するはずである。複製能の低下又は欠如は、ワクチン投与した個体中でのワクチン投与に起因する逃亡感染（＋ｕｎａｖａＨ１ｎｌｃｃｊｉｏｎ）の機会を効果的に低下させ、かつワクチン投与した個体から投与していない個体への伝染或いは環境汚染を減少させる。

このため、これらの宿主域変異株はワクチンベクターとして有用である。ｖＰ２９３欠失変異株（例３）には外来の遺伝的要素が存在する。このためさらに、擬狂犬病（ｐｓｕｅｄｏｒａｂｉｅ＠）ウィルス遺伝子を含む組換え体（適切なブタワクチン）、並びに狂犬病ウィルス糖タンパク質を発現する組換え体（家畜用だけでなくヒトに対しても適切である）も構築したので、本明細書中で説明する。

容易に理解できるはずであるが、これらの宿主域変異株には種々の外来遺伝子を使用できる。さらに、本願明細書中に記載された種以外の種についても、本明細書中に記載した方法によって、これらのワクシニア変異株の宿主域の制限枠内に加えることができるということも容易に理解できるはずである。

さらに、ポックスウィルスにさらに別の宿主域遺伝子が存在するということも容易に理解できるはずである。

例えば、特に免疫抑制した動物中で、ワクシニアＭＶＡワクチン株か弱毒化されることが報告されている。ＭＶＡにおいてＫＩＬヒト宿主域遺伝子が部分的に欠失していることが最近報告されている（５５）。今回、ＭＶＡゲノムを解析したところ、ＫＩＬ遺伝遺伝子種告されているような欠失があることは確認したが、ＭＶＡワクシニアウィルスがヒトの細胞上ではプラーク形成しないにもかかわらず、第二のヒト宿主域遺伝子Ｃ７ＬがＭＶＡ中に存在することが示唆された。ＭＶＡにおけるＣ７Ｌ遺伝子上流のプロモーター領域は、本明細書中で示したコペンハーゲン株の上流領域と同一である。ＭＶＡについて、予想されるＣ７Ｌ翻訳産物のアミノ酸配列はコペンハーゲン株のものと同一である。これは、ＷＲ株及びコペンハーゲン株においてはＫＩＬ宿主域遺伝子と機能的に等価なようにみえるＣ７Ｌヒト宿主域遺伝子が、それ自身では、ヒトの細胞上でのＭＶＡの増殖を特定する能力がないことを示している。さらに、ＭＶＡ中の欠損ＫＩＬ遺伝子をコペンハーゲン株由来のインククトなＫＩＬ遺伝子で置き換えても、ハイブリッドワクシニアウィルス組換え体にはヒト細胞上での増殖能は付与されない。

ＭＶＡワクシニアウィルスはサルの細胞上で増殖する能力にも欠けており、いまだに同定のされていない一個もしくは複数の宿主域遺伝子の存在を示唆している。本明細書中で用いた方法を用いることによって、これらの制限に必要とされる遺伝子を決定することができるはずである。

さらに、アビボックス及びスワインボックス（ｌｖｉｎｅｐ。

りのような他のポックスウィルスが複製に関してそれぞれ鳥類及びブタに宿主を制限されていることはよく知られている。このように宿主が制限されていることは、ポ”　ツクスウイルスに多数の宿主域遺伝子が存在することをはっきりと示している。これらの遺伝子を本明細書中に開示した方法によって決定すれば、宿主域構築ポックスウィルスベクターのレパートリ−を増大させることかで各種コペンハーゲンワクシニア欠失変異株に挿入する外来抗原のモデルとして狂犬病糖タンパク質を選び、これらの欠失の相対的効果を対照して分析した。狂犬病糖タンパク質遺伝子（１８，４２）を合成ワクシニアＨ６プロモーターの制御下においた。この発現カセットをコペンハーゲンＴＫ欠失ベクタープラスミドｐＳＤ５１３■Ｃに挿入した。ｐＳＤ５１３ＶＣはコペンノ＼−ゲンワクシニアＨ４ｎｄＩＩＩ　Ｊフラグメントのサブクローンであり、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のコード配列（５６）がポリリンカー領域で置き換わっている。ポリリンカー領域は、制限酵素部位ＳｍａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩＳ旦ｓｔＩ、ＮａｒＩ及びＢａｍＨＩを特定する以下の配列５’　ＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣ３’からなる。得られた狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有するプラスミドをｐＲＷ８４２と名付けた。ｐＲＷ８４２においては、ワクシニアＴＫ遺伝子のコード配列は、ワクシニアフランキング腕に対して左から右方向に配向したＨ６プロモーター／狂犬病糖タンパク質遺伝子カセットで置き換わっている。ｐ　ＲＷ８４２とワクシニアウィルスとの組換えは、Ｈ６プロモーター制御下の狂犬病塘タンパク質遺伝子を含むＴＫ−ウィルスをもたらす。

片方もしくは両方のヒト宿主域遺伝子を欠失した一群のコペンハーゲンワクシニアウイルスとｐＲＷ８４２との組換えを行なった。その結果得られた、狂犬病糖タンパク質遺伝子を含む一群のワクシニア組換え体を表６に示す。サルの細胞（Ｖ　Ｅ　ＲＯ）を狂犬病糖タンパク質遺伝子を含む一群のワクシニア組換え体に感染させた。狂犬病糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（４２）を用いて免疫沈降実験を行なった。すべての組換え体が該遺伝子を発現した。

表　６狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有するコペンハーゲン欠失変異株親つイ　ドナープ　組換え　狂犬病糖タンルス　ラスミド　ウィルス　欠失　バク質の発現マＰ４１０　ｐＲＷ８４２　マＰ７４４　７１　÷ｖＰｆ＋６１　ｐＲＷ８４２　ｖＰ７４５　ＴＫ、ＫＩＬ　＋ｖＰ７０６　ｐＲＷ８４２　ｖｐ７４６　ＴＫ、Ｃ７Ｌ　＋ｖＰ７１６　ｐＲＷ８４２　ｖＰ７５０　ＴＫ、Ｃ７Ｌ、ＫＩＬ　＋ｖＰ６６８　ｐＲＷ８４２　ｖＰ７５２　ＴＫ、［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩ　＋ワクシニア組換え体ｖＰ７５０はＣ７Ｌ−、ＫＩＬ−バックグラウンドに狂犬病糖タンパク質遺伝子を含んでいる。ｖＰ７５２は［Ｃ７Ｌ−Ｋ　Ｉ　Ｌ］欠失バ・ツクグラウンドに狂犬病糖タンパク質遺伝子を含んでいる。２つのヒト宿主域遺伝子が共にこれらのワクシニア組換え体から欠けているので、これらの組換え体によるヒトの細胞の生産的な感染は予想できない。ヒト宿主域遺伝子の不存在下で狂犬病遺伝子がヒトの細胞上で発現されるか否かを試験するために、ＭＲＣ−５細胞を、ｖＰ７５０及びｖＰ７５２を含めた全ワクシニア狂犬病組換え体に感染させた。一群の組換え体のすべてについて、感染細胞の表面上に免疫蛍光が検出された。

ヒト宿主域遺伝子及びブタ宿主域遺伝子を包含する領域［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩの欠失したコペンハーゲンヮクシニア欠失変異株ｖＰ６６８を基本ベクターとして選んだ。ｖＰ６６８はヒトのＭＲＣ−５細胞上でもブタ腎臓のＬＬＣ−ＰＫＩ細胞上でもプラークを形成しない（表３参照）。単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）の遺伝子ｇＢ　（５７）　、ｇ　Ｃ（５８）及びｇＤ（５９）とそれぞれ相同性を有する擬狂犬病遺伝子ｇｎ、ｇｍ及びｇｐをｖＰ５５８ベクターに挿入した。

以下にその詳細を述べる。

を含有するプラスミドｐＰＲ９，２５は、ＰＲＶ糖タンパク質ｇｎの全遺伝子を含んでいる。ｇｎ遺伝子を含有する複数のｐＰＲ９，２５部分（５７）を、ｐＢＲ３２２、ｐｕｃ　１８及びＭ１３ファージにサブクローン化した。

ｇｎ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した（４６）。

ＰＲＶのｇ■遺伝子のコード配列をコペンハーゲンヮクシニアベクタープラスミドｐＴＰ１５（５０）に挿入した。得られたプラスミドｐＰＲ１８においては、ｇ■遺伝子はＨ６ワクシニアプロモーターの制御下のコペンハーゲンワクシニア赤血球凝集素（ＨＡ）欠失塵に位置している。プラスミドｐＰＲ１８とコペンハーゲンヮクシニア欠失変異株ｖＰ６６８との組換えによって、ワクシニア腕換え体ｖＰ７２６を得た。ｖＰ７２６においては、ＰＲＶのｇ■遺伝子はワクシニアＨ６初期／後期プロモーターの制御下のＨＡ欠失座に挿入されている。該遺伝子の５′及び３′の外側にあるＰＲＶ由来のＤＮＡはすべて除去されていた。初期ワクシニア転写の終結を特定する配列（３９）がＰＲＶ　ｇｎコード配列の下流に挿入されている。

Ｂ、コペンハーゲンワクシニアウイルスＡＴＩ欠失座へのＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子の挿入ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０に対する遺伝子がコードドア　（６１）に位置している。プラスミドｐＰＲ７，１はｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にクローン化されたＰＲＶのＢａｍＨＩフラグメント７を含んでいる。ＰＲＶのｇｐ５０に対する全遺伝子を含有しているｐＰＲ７，１の５ｔｕＩ／ＮｄｅＩサブフラグメントをｐｒＢＩ２５にサブクローン化して、プラスミドｐＰＲ２２を作成した。ｇｐ５０遺伝子のヌクレオチド配列を決定した（４６）。

ＰＲＶのｇｐ５０のコード配列はＩ３Ｌのすぐ上流の配列（６２，６３）に相当する初期／中期ワクシニアプロモーターの制御下に置かれている。このプロモーター要素は、以前、ワクシニアウィルス組換え体中で外来遺伝子を発現させるために使用されている（３１．６４）。合成オリゴヌクレオチドプライマーＰ　５０　Ｐ　Ｐ　Ｂ　Ａ　Ｍ　（５’ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧ３’　）及びＰ５０ＰＰＡＴ　Ｇ　（５’　ＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧ３’　）、並びに鋳型としてコペンハーゲンＨｉｎｄｍ　ＩのサブクローンであるｐＭＰＩＶＣを用いて、１３Ｌ解読枠（６２）上流のプロモーター配列に対応するＤＮＡをＰＣＲ法（６５）で合成しさせた。３′ 末端は平滑末端のまま残した。

ＰＲＶ　ｇｐ５０：Ｉ−ド配列をプラスミドｐＰＲ２２から切取った。プラスミドｐＰＲ２２をＮ５ｉｌで消化した。これによって、ＡＴＧの上流７塩基対が切断され、３′突出端ができる。２ｍＭの各ｄＮＴＰ　（デオキシヌクレオチド三リン酸）存在下で７４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて３′突出端を平滑末端とした。得られたＤＮ単離した。

１２６塩基対の１３Ｌプロモーターフラグメント（Ｂ■Ｈ１／平滑末端）と、１．３Ｋｂのｇｐｓｏ遺伝子含ＳＫプラスミド（ストラータジーン（Ｓｌｒａ１ｇｅｎｅ１社、カリフォルニア州うジョラ（ＬＩ　Ｊｏｌｌｇ））のＢａｍＨＩ消化ベクターに連結した。得られたプラスミドをＰＢＳＰＲＶ５０Ｉ３と名付けた。ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子に連結したＩ３Ｌプロモーターを保有する発現カセットを、ＢａｍＨＩ消化とそれに続＜　Ｓｍａ　Ｉ部分消化によって切取また。１．　４　ｋｂｐｃ７）Ｉ３Ｌブｃｙモー９−／ＰＲＶｇｐ５０遺伝子保有フラグメントを単離して、大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とした。

ｐｓＤ５４１はコペンハーゲン欠失プラスミドであるが、コペンハーゲンＨｉｎｄｍ　Ａのサブクローンを鋳型として用いたＰＣＲ法（６５）によってＡＴＩ欠失領域（ｐ　ＳＤ４９４ＶＣを参照）に対するフランキング腕が腕を作成するためのプライマーとして、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６７（５’　ＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣ丁ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣ３′）及びＭＰＳＹＮ２６８（５’　ＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡ＾ＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＧ＾丁Ｃ３′）を用いた。欠失部の左側の４２０塩基対のワクシニア腕を作成するためのプライマーとして、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６９（５’　ＴＡＡ丁ＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴ＾＾ＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧ＾＾ＴＡＴＡＣＴ　３’）ＭＰＳＹＮ２７０（５’　丁Ａ丁ＣＴＣＧＡＡ丁ＴＣＣＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣ３−を用いた。このようにしてできた左側と右側のワクシニア腕を混合し、さらにＰＣＲ法で伸長させて、制限酵素部位置１ユ■、Ｓｍａ　Ｉ及びＸｈｏｌを特定するポリリンカー領域で隔てられた左側及び右側ワクシニアフランキング腕からなるＤＮＡフラグメントを作成した。

ラスミドはｐｓＤ５４１である。

１３Ｌプロモーター／　Ｐ　ＲＶ　ｇ　ｐ　５０遺伝子を含有する１、４Ｋｂの平滑末端フラグメントを、Ｓｍａｌで消化したコペンハーゲンベクタープラスミドｐｓＤ５４１に挿入した。得られたプラスミドｐＡＴＩｐ５０においては、ＰＲＶｇｐ５０遺伝子は１２６塩基対のワクシニア１３Ｌプロモーター要素の制御下のコペンハーケンヮクシニアＡＴＩ欠失座に位置する。ｐＡＴＩｐ５０において、該遺伝子の３′の外側にあるＰＲＶ由来のＤＮＡはすべて除去されていた。

ＰＲＶ　ｇｐ５０のＡＴＧのすぐ上流に７塩基対の余分のＰＲＶ配列が残っていた。初期ワクシニア転写終結配列（３９）は、ＰＲＶ　ｇｐ５０コード配列の下流に位置している。プラスミドｐＡ、Ｔ１ｐ５０とコペンハーゲンワクシニア欠失変異株ｖＰ５５８との組換えを行なった。

Ｃ，コペンハーゲンワクシニアウィルスＴＫ欠失座ＰＲＶ糖タンパク質ｇ■のコード配列はＰ　Ｒ−ＶゲノムのＢａｍＨＩフラグメント２及び９に位置する（５８）。

プラスミドｐＰＲ９，９及びｐＰＲ７，３５は、それぞｐＰＲ９，９から、ＰＲＶ　ｇｍの５′末端を含有する５ｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを単離した。

ｐＰＲ７，３５から、ｇｍ遺伝子の残りの部分を含有するＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを連結することによって、ＰＲＶｇ■の全遺伝子をｐＩＢＩ２５の中に集合させて、プラスミドｐＰＲ１７を得た。ｇｍのヌクレオチド配列を決定した（４６）。

ＰＲＶ　ｇｍ遺伝子をコペンハーゲンヮクシニアＵブー　ロモーター要素の制御下に置いて、プラスミドｐＰＲ２（−１２０番目）で、及びＰＲＶ　ｇｍ遺伝子の下流をモーター／ＰＲＶ　ｇｍ遺伝子を保有する１、５Ｋｂの平ゲンベクタープラスミドＩ）ＳＤ５１３ＶＣに連結して、ｐＰＲＶＩ　Ｉ　ＩＶＣＴＫを得た。ｐＰＲＶＩ　Ｉ　ＩＶＣＴＫにおいては、ワクシニアＴＫコード配列が、１２０塩基対のコペンハーゲンワクシニアＵプロモーター要素の制御下の右から左方向に挿入されたＰＲＶ　ｇｍ遺伝子に置き換っている。ｇｍ遺伝子の５′及び３ ′の外側にあるＰＲＶ由来の配列はすべて除去されていた。プラスミＦｐ　ＰＲＶ　１１　Ｉ　ＶＣＴＫとコペンハーゲンワクシニア欠失変異株ｖＰ６６８との組換えを行なった。

Ｄ、ワクシニア組換え体ｖＰ７２６中でのＰＲＶ　ｇｎの発現コペンハーゲンワクシニア組換え体ｖＰ７２６中でのＰＲ，Ｖ　ｇｎ（７）発現を、ＶＥＲＯｌＬＬＣ−ＰＫｌ及びＭＲＣ−５細胞で試験した。ｖＰ７２６は、ｖＰ６６８バックグラウンド［Ｃ７ＬからＫＩＬまでを欠失］中にＰＲＶ　ｇＩＩを含んでおり、従って、ブタ腎臓ＬＬＣ−ＰＫＩ及びヒトＭＲＣ−５細胞には生産的な感染はしないものと予想される。しかしながら、ＰＲＶ　ｇＩＩに特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光分析の結果から、意外にも、ブタ、サル及びヒトの細胞中でＰＲＶ　ｇｎ遺伝子産物が発現することが明らかになった。

及び三重ＰＲＶ組換え体の構築複数のＰＲＶ遺伝子を保有するワクシニア組換え体を構築するための組換えを行なった。組換えは、ドナープラスミドｐＡＴＩｐ５０　（ＰＲＶ　ｇｐ５０、ＡＴＩ欠失欠失色ｐＰＲＶＩ　Ｉ　ＩＶＣＴＫ　（ＰＲＶｇｍ、ＴＫ欠失座）、及び［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］欠失バックグラウンド中のＨＡ欠失座にＰＲＶ　ｇＩＩを保有するコペンハーゲンワクシニア組換え体である救援ウィルスｖＰ７２６を用いて行なった。これらの組換え体から、それぞれＰＲＶ遺伝子ｇｎ＋ｇｐ５０及びｇＩＩ＋ｇＩ［Ｉの二重挿入部分を保有するワクシニア組換え体が得られる。

これらのワクシニア二重ＰＲＶ組換え体の一方を適当なプラスミドとの組換え用救援ウィルスとして用いると、ＰＲＶ遺伝子ｇｎ＋ｇｐ５０＋ｇｍを保有する三重組換え体が得らに基づく宿主域選択系の構築コペンハーゲンワクシニアウイルスに基づく宿主域選択系（ＣＯＰＣ３）を構築するために、左側のＣ７Ｌから右側のＫＩＬまでの遺伝子をコードする領域を包含するＤＮＡを欠失させるためのプラスミドを構築した（図８）。このような欠失部を含むワクシニアウィルスは、宿主域遺伝子Ｃ７Ｌ　（例７）及びＫＩＬ（＋５）が欠失しているので、ヒトの細胞上で増殖できないものと予想される。Ｃ６ＬからＫＩＬまでの領域を欠失させるためのプラスミドも構築した。Ｃ６ＬからＫＩＬまでの欠失はヒト宿主域遺伝子Ｃ７Ｌが除去されていないので、このような欠失部を含むワクシニアウィルスはヒトの細胞上で増殖すると予想される。

今度は図１４を参照する。コペンハーゲンワクシニアウイルスＤＮＡの５ａｌｌクローン（図８及び図１０）を保有するプラスミドｐｓＤ４２０　（図１４）を調製した。ｐｓＤ４２０をＸｂａＩで切断（６８５番目）し、続いて大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とし、さらにＢｇｌｍで切断（１７６４番目）することによって、コペンハーゲン株ワクシニアウィルスのＨｉｎｄｍ　Ｃ領域に由来するフラグメントを得た。

得られる１０７９塩基対のフラグメントをアガロースゲルから単離した。ｐｓＤ４５１　（図９及び図１４）は、でのコペンハーゲンワクシニアＤＮＡを保有するプラスミドである。ｐｓＤ５４１をＢｇｌＩＩ　（１１１１６１１１６番目ｃｏＲＶ　（１１８３４１８３４番目することによって、コペンハーゲン株ワクシニアウィルスのＨｉｎｄＩ［ＩＫ領領域由来するフラグメントを得た。７１８塩基対の制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。

Ｈｉｎｄｍで切断し、大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とし、かつＳｍａ　Ｉで切断しておいたｐＵＣ８（図１４）に、上記２つのフラグメントを連結した。得られたプラスミドをｐＭＰ５８１ｃＫと名付ケタ。ｐＭＰ５８１ｃＫ　（図１４）はｃ７Ｌ遺伝子（黒く塗り潰した部分、転写方向は矢印で示す）を保有］１［Ｋに由来する右側ワクシニア腕（１，１１１６〜１１８３４番目）とに挟まれたユニークなりｇ１１１部位を含んでいる。該左側ワクシニア腕はＣ７Ｌの全遺伝子（１３１４〜８６３番目のコード配列）を含んでいる。

コペンハーゲンワクシニアゲノムと比較すると、上記２つの腕は９３５１塩基対の欠失部（１３１５〜１１１１５番角印で示しである。

欠失接合部の余剰ＤＮＡを除去するため、ｐＭＰ５８ＩＣＫをＢｇｌｌＩで切断し、続いてＢ　ａ　Ｉ　３１．　ｘ、キソヌクレアーゼで消化した。４９量体の合成オリゴヌクレオ′チドＭＰＳＹＮ２２８（５’　ＴＴＴＣＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＴＡＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＣ３’　）を用いて、二本鎖鋳型上で変異導入（５３）を行なった。得られたプラスミドｐＭＰｃＴＫ１Δはワクシニアヒト宿主域遺伝子Ｃ７Ｌを保有している。これは、１５１３〜１１１６５番目の塩基が欠失しており、しかもＣ６ＬからＫＩＬまでの１１個の遺伝子（図８）が欠失している。Ｍ２Ｌ欠失座に大腸１１ｊｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えコペンハーゲンヮクシニアウィルスであるｖＰ４５８とプラスミドｐＭＰｃＴＫ１Δとの組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ６６４を作成した。

ｖＰ６６４はインタクトなＣ７Ｌ遺伝子を保有しているので、予想通り、ヒトの細胞上でプラークを形成した。

Ｃ７Ｌのコード配列（１３１４〜８６３番目）と欠失部の余剰ＤＮＡを除去するため、ｐＭＰ５８１ｃＫをＮｃｏＩで切断し、続いてＢａ１３１エキソヌクレアーゼで消化した。４４量体の合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹ　Ｎ　２３３　（５’　ＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＡＴＡＣＴ、ＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴ＾＾ＴＡＴＴＴＡＴＴ３’　）を用いて、二本鎖鋳型上で変異導入（５３）を行なった。得られたプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δは、８６２〜１１１６３番目の塩基が欠失しており、しかもＣ７ＬからＫＩＬまでの１２個の遺伝子が欠失している。

プラスミドｐＭＰｃｓＫ１ΔとｖＰ４５８との組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ６６８を作成した。ＶＰ６６８は宿主域遺伝子ＫＩＬとＣ７Ｌ遺伝子が両方とも欠失しているので、予想通り、ヒトの細胞上でプラークを形成することができなかった。

欠失接合部に合成ポリリンカーを加えることによって、プラスミドｐＭＰｃＴＫ１Δから一連のプラスミドを得た。ｃｏｐｃｓ系列のプラスミドの構築の概要を図１５〜図１７に示す。これらのプラスミドの構築に使用した合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、すべて、図１５〜図１７に示しである。

プラスミドｐＭＰｃＴＫ１Δ（図１４）をＤｒａｌ消化に付し、線状ＤＮＡをアガロースゲルから単離した。

合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３８／ＭＰＳＹＮ２３９をアニールし、ｐＭＰｃＴＫ１Δの欠失接合部に右から左方向に連結して、プラスミドｐＭＰＣ８ −１を得た。

ポリリンカー領域に入る小さな解読枠に左側（ＡＴＧは１４８５番目）から終止コドンを加えるために、ｐＭＰＣ３−１をＰｓｔＩで切断した。７２量体の合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２４９（５’　ＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡ＾＾ＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣ３’　）を用いて、変異導入（５３）を行なった。得られたプラスミドｐｃＯＰｃｓ−４（図１７では、別名ｐＭＰＣ８−４で記載されている”Ｘは、ポリリンカー領域に出入りする解読枠を全く有していない。

ポリリンカー領域にワクシニアＨ６プロモーターを加えるために、ｐＭＰｃｓ− １をＨｆｎｄｆｆｌ及びＡｓｐ７１８で切断した。修飾Ｈ６プロモーター（例３）からなる合成Ｈｉｎｄｍ／Ａｓｐ７１８フラグメントを挿入し、プラスミドｐｃＯＰｃｓ−３Ｈを得た（プロモーター配列を図１７に示す）。その後ｐｃＯＰｃｓ−３Ｈから得たプラスミドｐｃＯＰｃｓ−５）（乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０Ｈは、すべて、図１７でｐｃＯＰｃｓ−３Ｈについて示したＨ６プロモーター領域を含んでいる。ｐｃＯＰｃ５−３Ｈのプロモーター領域に続く括弧内の配列は、ｐＣＯＰＣＳ−５Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０Ｈについて示した括弧内の配列で置き換えられている。プラスミドｐＣＯＰＣＳ−６Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０Ｈ（７）ＡＴＧ開始コドンには下線を付した。ｐｃＯＰｃｓ　−３８からｐＣＯＰＣＳ−５８までは、ポリリンカー領域の上流にＡＴＧ開始コドンを含んでいないことに留意されたい。プラスミドｐｃＯＰｃｓ−６Ｈ乃至ｐｃＯＰｃｓ−１０ＨのＡＴＧから始まる翻訳枠を示しである。上述のｐＭＰＣ８−１由来の小解読枠に終止コドンを加えるために、ＭＰＳＹＮ２４９を使用してｐｃＯＰｃｓ−３Ｈに同じような変異導入を行なって、プラスミドｐｃＯＰｃｓ　−５Ｈを得た。

プラスミドｐＣＯＰＣ５−５ＨのＨ６プロモーター下流の、ポリリンカー制限酵素部位に対するすべての読取り枠内にＡＴＧ開始コドンを加えるために、Ｈ６プロフラグメントをアガロースゲルから単離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２５０／ＭＰＳＹＮ２５１をアニールし、上記ｐＣＯＰＣ８−５Ｈベクターに挿入して、プラスミドｐＣＯＰＣ３−６８を得た。

合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２５２／ＭＰＳＹＮ２５３をアニールし、上記ｐＣＯＰＣ８−５Ｈベクターに挿入して、プラスミドｐＣＯＰＣ８−７８を得た。

合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２５４／ＭＰＳＹＮ２５５をアニールし、上記ｐｃＯＰｃｓ−５Ｈベクターに挿入して、プラスミドｐｃＯＰｃｓ−８８を得た。

ｐｃＯＰｃｓ　−６Ｈ，ｐｃＯＰｃｓ　−７８及びｐｃ。

ＰＣ８−８Ｈは、Ｈ６プロモーターとＡＴＧコドン及びそれに続く３つの異なる読取り枠内の制限酵素部位を含んでいる。これらのプラスミドにコードされた１番目と２番目のアミノ酸は以下の通りである。ｐｃＯＰｃｓ　−６ＨではＭｅ　ｔ／Ｖａ　ｌ、ｐｃＯＰｃｓ　−７ＨではＭｅｔ／Ｇ１７．そしてｐｃＯＰｃｓ −８ＨではＭｅｔ／Ｇｌ　ｙ　ｏ　Ｍ　ｅ　ｔ　／　Ｇ　１　ｙ対はある状況下（６６）で翻訳ポリペプチドのミリスチン化（ｍＨｉｓ１７１ｔロｏｎ）を特定する可能性があるので、プラスミドｐｃＯＰｃｓ　−６Ｈを修飾して、ｐｃＯＰｃｓ−６）（と同様にＭ　ｅ　ｔ　／　Ｇ　ｌ　ｙ対で翻訳が開始されないようなＡＴＧ開始コドンを別の２つ°　の読み取り枠内に含むプラスミドを得た。ｐｃＯＰｃｓ−６ＨをＮｒｕＩ及びＡｓｐ７１８で切断して、ベクターフラグメントをアガロースゲルから単離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２７１／ＭＰＳＹＮ２７２をアニールし、ｐｃＯＰｃｓ−６Ｈベクターに挿入して、プラスミドｐｃＯＰｃｓ−９Ｈを得た。

合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２７３／ＭＰＳＹＮ２７４をアニールし、ｐｃＯＰｃｓ−６Ｈベクターに挿入して、プラスミドｐｃｏｐｃｓ−１０Ｈを得た。これらのプラスミドにコードされた１番目と２番目のアミノ酸は以下の通りである。ｐｃＯＰｃｓ　−９８ではＭｅｔ／Ｓｅｒ、そしてｐｃＯＰｃｓ−１０ＨではＭｅｔ／Ｔｈｒ。

最終的なｃｏｐｃｓ系列において、コード配列とプロモーターからなるＤＮＡを発現するにはｐｃＯＰｃｓ　−４に挿入し、ＡＴＧを含むコード配列を発現するにはｐＣＯＰＣＳ−５Ｈに挿入し、そしてＡＴＧ開始コドンを含まないコード配列を適当な読取り枠内で発現させる（こはｐＣＯＰＣＳ−６ＨからｐＣＯＰＣＳ　−１０Ｈ系列の一つもしくはそれ以上に挿入する。得られたプラスミドをコペンハーゲンワクシニアウイルス欠失変異株と組換えて、ワクシニアウィルスのヒト細胞上でのプラーク形成能を回復させる。

コペンハーゲンワクシニアウイルスｖ　Ｐ　６６８　／　Ｃ０ＰＣＳプラスミド宿主域選択系を使用した組換えによって生まれる組換えワクシニアプロジエニイのヒトＭＲＣ−５細胞上でのプラーク形成能によって、組換え体の速やかな同定が可能となる。ｖ　Ｐ　６６８　／　ＣＯＰ　ＣＳ系は、多様な用途を有するワクシニア組換え体の作成に使用できる。

ｃｏｐｃｓ系列の一員でポリリンカー領域の上流にプロモーターを含まないプラスミドであるｐｃＯＰｃｓ　−４をｌエユｎで切断した。狂犬病糖タンパク質遺伝子の全コード配列（１８，４２）を含んだｗｎフラグメントをｐｃＯＰｃｓ− ４に右から左方向に挿入して、プラスミドｐｃＯＰｃｓ−ＲＡＢを得た。ｐｃＯＰｃｓ−ＲＡＢにおいては、ポリリンカー領域は狂犬病遺伝子の上流に位置している。種々の合成プロモーター領域又はワクシニアウィルスもしくは他のポックスウィルス由来のプロモーターを、ｐｃＯＰｃｓ−ＲＡＢの狂犬病糖タンパク質遺伝子上流のポリリンカー領域に挿入した。得られたプラスミドをワタシニアコペンハーゲン欠失変異株ＶＰ６６８との組換えに使用する。組換えプロジエニイを、ＭＲＣ−５上でのプラーク形成能によって選択する。組換えプロジェニイウイルス中における狂犬病糖タンパク質遺伝子の発現をモノクローナル抗体を用いて定翼することによって、プロモーターの相対的な強さがア・ソセイできる。付加的な用途もｖＰ２９３宿主域選択系に匹敵組織培養細胞上での増殖能を破壊せずに、ワクシニアウィルスから大量のＤＮＡを欠失させることができる。

ワクシニアゲノムの安定性を増大させ、かつ溶菌性（マｉ「ｕｌｅｎｃｅ）に関連しているかも知れない非必須遺伝子を除去するために、一つのワクシニアウィルス組換え体内で左端の３２．７ＫｂのＤＮＡと右端の１４．９ＫｂのＤＮＡを遺伝子工学的に欠失させた。

ワクシニアウィルスのゲノムは二本鎖ＤＮＡで構成される。各末端で、相補鎖のＤＮＡがＤＮＡ鎖と架橋して、不完全塩基対の末端ループを形成する（６７）。

ゲノムは末端ループのすぐ内側に一連の縦に並んだ反復配列を含んでいる。ＷＲゲノムをクローン化したものが、７０塩基対の反復単位が１３個縦に並んだものをゲノムの各末端付近に含んでおり、７０塩基対の反復単位の１７個縦に並んだ追加ブロックから４３５塩基対の非反復ＤＮＡによって隔てられていると報告されている（６８）。末端ループと反復ＤＮＡは末端部分のワクシニア末端裏返し反復を形成する。ＷＲゲノムをクローン化したもの（６０）について推定されている末端裏返し反復は数多くの遺伝子を含んでいるが、これらの遺伝子は末端裏返し反復の左側反復部分及び右側反復部分の双方に含まれているのでワクシニアゲノムに２コピーずつ存在する。

ここで使用したコペンハーゲンワクシニアウイルスのプラークからクローニングされた株（ＶＣ−２）抽出したＤＮＡを制限酵素で切断してアガロースゲル上で分析すると、末端フラグメントは不均一性を呈する。末端フラグメントは単一バンドとしては泳動されずに梯子状のバンドとして検出され、各バンドは約ＩＫｂ分離している。

ＶＣ−２又は不均一な末端を含んでいるようなその誘導体からプラーク単離物として誘導されたワクシニアウィルス組換え体の約８０％は、制限酵素分析によって不均一な末端を含んでいることが判明している。ワクシニア組換え体の残りの２０％においては、末端の不均一性が消失して、制限酵素で切断されたＤＮＡ末端フラグメントは独立バンドとして現れる。独立した末端を有するウィルスから新たに誘導した組換え体は、常に、独立した末端を有することが観察された。

保存ウィルス株ＶＣ−２の末端は不均一であるので、独立した末端を有するＶＣ −２誘導体であるｖＰ４５２から得られる末端フラグメントをプラスミドにクローン化することにした。ｖＰ４５２はワクシニア遺伝子ＴＫ（チミジンキナーゼ）及びＨＡ（赤血球凝集素）（５０）を欠失している。ｖＰ４５２からＤＮＡを抽出してｘｈＯ！で消化し、アガロースゲルから約７Ｋｂの２モル／ｌ末端バンドを単離した。単離したフラグメントをＢＡＬ−３１による限定消化に付し、次いで大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とした。この平滑化しｒｐｓＤ５２２Ｖｃを得た（図１８）。

ｐＳＤ５２２ＶＣ（７）ＤＮＡ配列決定により、ＷＲ’７クシニアの場合と同様に、コペンハーゲンワクシニア組換え体ｖＰ４５２の末端に直列した反復単位が含まれていることが判明した。プラークをクローン化したＷＲ単離物について報告されている７０塩基対の直列反復単位からなるブロックに加えて、ＷＲ単離物の場合と異なり、ｖＰ４５２の末端は上記７０塩基対の直列反復単位の内側のコード配列に近い位置に５４塩基対からなる直列反復単位を含んでいる。図１９に、５４塩基対の直列反復単位の最も内側の繰り返し部分（１〜５４番目）から始まるコペンハーゲンゲノムの一部の配列を列挙した。図１９に示す１３９７８塩基対の配列は、ｐＳＤ５２２ＶＣ１並びにｐＵｃｓ系プラスミド中にクローン化したＶＣ−２コペンハーゲンＤＮＡの各種クローンからえられたものである。この配列は、直列反復配列の最後のブロックの右側のＨｉｎｄｌｌＩ　Ｃ内にコード配列を含んでいる。図１９に示した配列は、図８に示したコペンハーゲンＤＮＡの配列の起点である５ａｌＩ部位で終わる。

ｖＰ４５２の末端に由来するワクシニア反復ＤＮＡは含有するがワクシニアコード配列は欠失しているようなプラスミドを作成するために、ｐ　ＳＤ５２２ＶＣを旦ユ離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６１　（５’ＣＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡ　３’）及びＭ　Ｐ　Ｓ　Ｙ　Ｎ　２６２　（５’　ＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧ＾ＡＴ３’）をアニールし、ベクターフラグメントｐＳＤ５２２ｖＣに連結して、ｐＭＰＶＣＥＮＤを得り。ｐ　Ｍ　Ｐ　Ｖ　ＣＥ　Ｎ　Ｄ　ｉｔ、１）ＳＤ５２２ＶＣ（７）末端（ゲノム末端からおよそ５０塩基対）から始まり、直列反復配列のすべてのブロックを通って、図１９の３３８いる。３０５番目のＣｌａＩ部位にまたがる小さな０ＲＦ（２９２〜３３６番目）を合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６１／ＭＰＳＹＮ２６２中に再構成した。この操作によってＢｇｌｎ部位が導入され、将来のクローニング段階が簡単になる。ｐＭＰＶＣＥＮＤ　（ワクシニアＤＮＡの内側から末端方向に向けて進行するＯＲＦを全く含まない）を、ワクシニアの左端及び右端を共に欠失するように設計したプラスミドを作成する際のベクタープラスミド及び外部腕として使用した。

左側末端付近では、リボヌクレオチドレダクターゼの小サブユニットをコードする遺伝子（Ｈｉｎｄｍ　Ｆには存在する）　（７０）に至るすべての遺伝子が欠失していた。コペンハーゲンＨｊｎｄｍ　Ｆの配列を決定し、図ｍＫのすぐ右側に位置している。図２０に示したＤＮＡ配列は、図８に示した配列（Ｈｉｎｄｍ　Ｋの全配列を含んでいる）に隣接する。リボヌクレオチドレダクターゼの小サブユニットはＯＲＦ　Ｆ４　（３５０６〜２５４７番目、図２０）にコードされている。

ＶＰ６６８欠失部（Ｃ７ＬからＫＩＬまで）のすぐ右側の１０個の遺伝子（Ｋ２ＬからＦ４Ｌまで）が非必須領域であるか否かを試験するために、プラスミドｐＭＰＣＴＦＲΔを構築した。ｐｓＤ５２１Ｖｃは、旦部位（図２０．５６６３番目）までの配列を含有するコペンハーゲンＨｉｎｄｎ［Ｆのサブクローンである。Ｆ４の右側のフランキング腕を得るために、ｐｓＤ５２１ＶＣの３５２７番目（Ｆ４コード配列の上流）をＣ１ａＩで切断し、２８４１番目（Ｆ４コード配列内）を乱ＩＩＩＩで切断した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２５６　（５ ’　ＣＧＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＧＣＡＴＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＧＡ３′）及びＭ　Ｐ　Ｓ　Ｙ　Ｎ　２５７　（５’　ＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＴＡＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴ丁ＴＧＴＡＣＡ丁３′）をアニールし、ベクターフラグメントｐＳＤ５２１ＶＣのＣｌａＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間に連結した。得られたプラスミドｐＭＰ２５６／２５７においては、Ｆ４のＯＲＦ上流にプロモーター領域が再現されており、ＢｇｌＩ［部位に連結している。右側ワクシニアフランキング腕を得るために、ｐＭＰ２５６／２５７をＢｇｌｎとＥｃｏＲＩで切断して、Ｆ４遺伝子上流のワクシニア配列を含有する２、３Ｋｂフラグメントを単離した。ＨｉｎｄＩＩｒ　Ｃ由来の左側ワクシニアフランキング腕を、Ｃ７Ｌ遺伝子と左側の１４０塩基対のワクシニアＤＮＡとを含有するプラスミドｐＰＯＰＣ３−４（例１４）から得た。ｐＰＯＰｃｓ−４をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断して、３．５Ｋｂのベクターフラグメントを上記２，３ＫｂのＨｊｎｄｍ　Ｆ由来右側腕含有フラグメントに連結した。得られたプラスミドｐＭＰＣＴＦＲΔは、２０個の遺伝子（Ｃ６Ｌ−Ｆ４Ｌ）の欠失部の両脇にあるＨｉｎｄｍ　Ｃ由来の左側ワクシニア腕とＨｉｎｄｍ　Ｆ由来の右側腕を含んでいる。

ｐＭＰＣＴＦＲΔをｖＰ６６８　（例９）との組換え用ドナープラスミドとして使用し、組換えウィルスをＭＲＣ−５上での増殖によって選択した。ワクシニアウイルスプロジエニイｖＰ７４９　（Ｃ６Ｌ−Ｆ４Ｌ欠失）が回収され、欠失領域に存在するすべての遺伝子が非必須領域であることが実証された。

ワクシニアの左端からＦ４Ｌまでを含むすべての遺伝子を欠失させるために、プラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔフラグメントを単離することによって、ＨｆｎｄｌｌＩ　Ｆの右側フラグメント腕を得た。ｖＰ４５２の末端の直列反復配列ＤＮＡを含むｐＭＰＶＣＥＮＤＡ　（図１８）を−断した。上記２つのフラグメントを連結してｐＭＰＬＥＮＤΔを得た。ｐＭＰＬＥＮＤΔにおいて、左側ワクシニア腕は直列反復単位からなり、右側ワクシニア腕はＨｉｎｄｎＩ　Ｆ由来のＤＮＡからなっている。プラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔにおいては、コペンハーゲンゲノムの最も左側の３８個の遺伝子（Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ）が欠失していている。この欠失は、Ｈｉｎｄｍ　Ｃ（図１９の３４０番目から最後まで、即ち１３６３８塩基体）、並びにＨｉｎｄｎＩ　Ｆ　（図２０の１〜２５０６番目）領域に由来し、合計すると３２６８１塩基対になる。

ゲノムの右側の遺伝子を欠失させるために、ワクシニア出血性（旦）領域（例５）及びこの領域の右側のすべての遺伝子を欠失させるためのフランキングワクシニア腕を与えるようなプラスミドｐＭＰＲＥＮＤΔを構築した。ゲノム中量も右側の）（ｉｎｄｍフラグメントであるＨｉｎｄｍ　Ｂの配列を、この領域の様々なｐＵＣ系クローンの配列を決定することにによって、決定した（図２１）。ゲノムの左側領域と右側領域から得られた配列を比較することによって、末端反復配列が図１９の８１０４番目まで広がっていることが判明した。従って、ここで解析したワクシニアウィルスのコペンハーゲン株の末端裏返し反復は、直列反復ブロックに加えて８．ＩＫｂのコード領域で構成されている。Ｈｉｎｄｍ　Ｃ内の最も左側の９個の解読枠であるＣ２３ＬからＣ１５Ｌまでの解読枠は、ＨｉｎｄｎＩ［Ｂ内の最も右側の９個の解読枠であるＢ２９ＲからＣ２１Ｒまでの解読枠と対応する。

図２１は、Ｈｉｎｄｍ　Ａ／Ｂ接合部から始まって非反復ＤＮＡ配列の起点の最も右側の解読枠（Ｂ２ＯＲ）まで続くコペンハーゲンＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｂの配列を含んでいる。末端反復の右側コピーは図２１の１７１３２７１３２番目るが、この点はＢ２０Ｒ解読枠の端の２１１４塩基対前方である。

ｐＳＤ４７７ＶＣは、出血性（旦）領域（解読枠Ｂ１３Ｒ及びＢ１４Ｒ）を含有するコペンハーゲンワクシニアＨｉｎｄｍ　Ｂ（図２１．９７１３〜１１２９９番目）のｐｔｙｃ系Ｎｃｏｌ／ＮｒｕＩサブクローンである。ｐＳＤ４７８ＶＣ（図１８）は、ｐＳＤ４７７■Ｃの誘導で置き換えられている。この目的のためにアニールした合成オリゴヌクレオチド対は、５Ｄ４１量体　（５’　ＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴ　３’）　及び５Ｄ３９量体（５″ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＴＣ＾ＧＡＴＣＴＡＧＴ＾Ａ丁３’）であった。Ｕ領域の左側のフランキングワクシニア腕を得るために、ｐＳＤ４７１８ＶＣをＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア配列の接合部において切断し、°大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とし、ＢｇｌＩＩで切断した。ワクシニア旦プロモーター領域及びＵ領域の左側のフランキング配列を含有する０、３Ｋｂフラグメントを単離した。ｐＭＰＶＣＥＮＤをＨｉｎｄｍで切断し、大腸菌ポリメラーゼフレノウフラグメントで平滑末端としてＢｇｌｍで切断して得たベクターフラグメントに、上記０．３Ｋｂフラグメントを連結した。得られたプラスミドｐＭＰＲＥＮＤΔは、Ｂ１３Ｒ（旦）プロモーター領域を含めたＢ１３Ｒ解読枠上流のＨｉｎｄＩＩＩ　Ｂ　ＤＮＡに由来する左側ワクシニア腕を含んでいる。ｐＭＰＲＥＮＤΔにおける右側ワクシニア腕は、直列反復ブロックで構成されており、左側末端欠失プラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔに存在する左側ワタリニア腕と同一である。ｐＭＰＲＥＮＤΔの２つの腕は、１７個の解読枠（Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ）の欠失部の両脇に位置する。右端欠失プラスミドｐＭＰＲＥＮＤΔにおいて、上記フランキングワクシニア腕間に存在する欠失部の全体２４から１７１４５番目、続いて図１９の８０９０から３４０番目の配列と同一の欠失配列をもつ末端裏返し反復領域）。欠失プラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔ及びｐＭＰＲＥＮＤΔの構築法は図１８に図示しである。黒く埋めた部分はｖＰ４５２由来の直列反復からなるコペンハーゲンワクシニアＤＮＡを示しており、中抜きの部分はそれ以外のコペンハーゲンワクシニアＤＮＡを示している。ｐＭＰＣＴＦＲΔ、ｐｓＤ４７８ＶｃＳ　ｐＭＰＬＥＮＤΔ及びｐＭＰＲＥＮＤΔの欠失部は三角印で示しである。

ゲノムの両端において多量のＤＮＡを欠失した組換えワクシニアウィルスを作成する上で、選択的圧力を利用するために、２種類の選択マーカーを使用した。

一つは、ワクシニアＣ７Ｌヒト宿主域遺伝子（例７）で、ヒトＭＲＣ−５細胞上で組換えウイルスブロジエニイを選択する。もう一つは、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする大腸菌遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子）で、マイコフェノール酸を用いて組換えワクシニアウイルスプロジエニイを選択する（２．８）。

ワクシニアＣ７Ｌ遺伝子とそのプロモーターのみを含有する移動可能なフラグメントを作成するために、ｐＣＯＰＣ３−４を、Ｃ７Ｌ遺伝子の３′末端付近（図８のレオチドＭ　Ｐ　Ｓ　Ｙ　Ｎ　２５８　（５’　ＣＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧ３′）及びＭＰＳＹＮ２５９　（５’　ＧＡＴＣＣ＾＾＾ＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴ＾＾ＴＣ３’）を使用して、Ｃ７Ｌ遺伝子の末端を再構成した。

即ち、上記合成オリゴヌクレオチドをアニールし、上記ベクターフラグメントに連結して、プラスミドｐＭＰ２ドｐＭＰＬＥＮＤΔ及びｐＭＰＲＥＮＤΔへの挿入にす°るための、Ｃ７Ｌ遺伝子とそのプロモーターを含有する６６０塩基対のフラグメントを単離した。

コード配列下流のＡｈａｌ［［部位（７２）にＢａｍＨＩリンカ−を加えることによって、プラスミドｐＳＶｇｐ　ｔラグメントを得た。

ワクシニアゲノムのそれぞれ左端及び右端付近に欠失部を含んでいるプラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔ及びｐＭＰＲＥＮＤΔを、Ｂｇｌｌｌで切断した。上記Ｃ７Ｌ遺伝子含有Ｂｇｌｌｌ／ＢａｍＨＩフラグメント並びに上記Ｅｃｏｇｐ　を遺伝子含有ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを上記プラスミドベクターに挿入して、合計４種類のプラスミドを作成した（表７）。ｐＭＰＬΔＣ７及びｐＭＰＲ ΔＣ７においては、Ｃ７Ｌ遺伝子はそのプロモーターの制御下に置かれていることに留意されたい。Ｅｃ旦ｇｐｔ遺伝子は、ｐＭＰＬｇｐｔにおいてはＦ４Ｌプロモーターの制御下に、ｐＭＰＲｇｐｔにおいてはＢ１３Ｒ（ｕ）プロモーターの制御下に置かれている。表７に示す通り、これらのプラスミドと救援ウィルスとの間の組換えを行なった。Ｃ７Ｌ遺伝子を導入した組換え体をＭＲＣ−５細胞上に撒いて組換えワクシニアウイルスプロジェニイを選択した。Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子を導入した組換え体をマイコフェノール酸存在下で増殖させて組換えワクシニアウイルスプロジエニイを選択した。ＭＲＣ−５上細胞での増殖による選択は、好適には、Ｃ７Ｌ及びＫＩＬを両方とも欠失したｖＰ６６８のような救援ウィルスを用いて行なう。

表　７基質　選択　生成プラスミド　マーカー　プラスミド　欠失部ｐＭＰＬＥＮＤΔ　Ｃ７Ｌ　ｐＭＰＬΔＣ７Ｃ２３Ｌ−ＦＣ２３Ｌ−Ｆ４ＬｐΔ　Ｅｃｏｇｐｌ　ｐｌＪＰＬｇｐｆ　Ｃ２３Ｌ−ＦＣ２３Ｌ−Ｆ４ＬｐΔ　ＣＡＬ　ｐＭＰＲΔＣ７ＢＩ３Ｒ−Ｂ２９ＲｐＭＰＬＥＮＤΔ　Ｅｃｏｇｐｊ　ｐＭＰＲｇｌ　Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９ＲＢ、コペンハーゲンワクシニアウイルスと欠失プラスミドを用いたインビボ組換えワクシニア救援ウィルス　プラスミド　欠失変異株マＰ６６８（ＴＫ”、［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＬ−）　ｐＭＰＬΔＣ７（［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］−、ＣＡＬ令）　マＰ７８９ｖＰ６１７　（ＴＫ−、ＡＴＩ−、Ｈ＾−）　ＰＭＰＲｇｐｌ（［ＢＩ３Ｒ−８２９Ｒ］−、Ｅｃｏｇｐｔ’）　ｖＰ７５９マＰ６１７（ＴＫ−、＾Ｔｌ−，ＨＡ −）　ｐＭＰＬｇｐｌ　（［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］−、Ｅｃｏｇｐｆ中）　マＰ７９１ｙＰ７２３　（ＴＫ−、＾Ｔｌ−、Ｈ＾−，ｕ’ｌ　ｐＭＰＬｇｐｌ　（［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］−、Ｅｃｏｇｐじ）　ｖＰ７９６ｖＰ７９６　（ＴＫ−、ＡＴＶ、Ｈ＾°。

ＩＣ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］−、Ｅｃｏｇｐｔ’）　ｐＭＰＲΔＣ７（［ＢＩ３Ｌ−Ｂ２９Ｒヒ、Ｃ７し）　ｖＰ８１１Ｅｃｏｇｐｔ選択マーカーを保有する左端欠失プラスミドｐＭＰＬｇｐｔと救援ウィルスｖＰ７２３（ＡＴＩ及びＵ対応領域に加えてＴＫ及びＨＡ遺伝子も欠失している）との間の組換えによって、組換えワクシニアウィルス欠失変異株ｖＰ７９６を得た。ＤＮＡ制限酵素分析によれば、ｖＰ７９６はＴＫＳＨＡＳＡＴ　Ｉ及びＵ領域に加えて（Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ）領域をも欠失している。

ｖＰ７９６の左端付近の３８遺伝子の欠失部にはＣ７Ｌ及びＫＩＬが両方とも含まれているので、ｖＰ７９６をｐＭＰＲΔＣ７（Ｃ７Ｌ含有右端欠失プラスミド）との組換え用救援ウィルスとして使用した。両端付近に欠失部を含有する救援ワクシニア組換え体ｖＰ８１１をＭＲＣ−５細胞上での増殖によって選択した。

引　用　文　献１、　ベック　（Ｂｅｃｋ、Ｅ暑、ルードビッヒ　（Ｌｕｄｖｉｇ、　Ｇ、　）、オイエルスバルト（Ａｕｅｒｓｖｍｌｄ、　Ｅ、　Ａ、　）、ライス　（Ｒｅ　ｉ　Ｉｓ。

Ｂ、）及びシャーレル（Ｓｃｈｘｌｌｅｒ、　Ｈ，）、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９巻、３２７−３３６頁　（１９８２）２、　ボイル（Ｂｏｙ　ｌ　ｃ、　Ｄ、　Ｂ、　ｌ及びクーパー（Ｃｏｕｐａｒ、　Ｂ、　Ｅ。

Ｈｌ）、ジーン６５巻、１２３−１２８頁　（１９８１１）３、チャクラパルティ（Ｃｔａｋｒｘｂａ＋ｔｉ、Ｓ、）、ブレツクリング（Ｂｒｅｃｈｌｉｎｇ、　Ｋ、　）及びモス（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）、モレキュラー〇アンド拳セルラー拳バイオロジー（ｊｌｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）　５巻、３４０３−３４０９頁　（１９８５）４、クレーウェル（Ｃ１ｃｖｅ１１．　Ｄ、　Ｂ、　）、ジャーナルーオブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂｘｃｊｅｒｉｏｌ、）１１０巻、６６７−６７６頁（１９７２）５、　クレーウェル（Ｃ１ｅｖｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、　）及びヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｒ，）＋プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブーサイエンシズ・オブ拳ザ・ニーｅニスｅニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎｉ１．　Ａｃｘｄ、　Ｓｅｉ。

ＵＳＡ）　６２巻、＋１５９−１１６６頁　（１９６９）６、ドリリエン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、Ｒ，）、コーレン（Ｋｏｅｈｒｃｎ。

Ｆ、）及びシーン（Ｋｉｒｎ、Ａ）、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１１１巻、４８８−４９９頁　（１９Ｂ＋）７、ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、　Ｒ）、スペナー（Ｓｐｅｂｎｅｒ、Ｄ、）及びシーン（Ｋｉｒ＋＋、＾、）、ジャーナル・オブ・ピロロジー（１，Ｖｉｒｏｌ、）　２ａ巻、８４３−８５０頁　（１９７８）８、　フォーフナ−（Ｆａｌｋｎｅｒ、　Ｆ、　Ｇ、　）及びモス（Ｍｏｔｓ。

Ｂ、）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−６２巻、＋８４９−１８５４頁　（１９８Ｂ）９、ファジィ（Ｆｘｌｈｉ、　２．　）、スリダール（Ｓ＋１ｄｈａ＋、　Ｐ、）、パチャ（？ｃｈａ、　Ｒ，Ｆ、　）及びコンディツト（Ｃｏｎｄｉｔ、　Ｒ，Ｃ，ｌ。

ピロロジー　１５５巻、　９７−１０５頁　（１９８６）１０、ツェナー（Ｆｅｎｎｅｒ、　Ｆ、）及びサムプルツク（Ｓａａ＋ｂｒｏｏｋ、Ｊ、Ｆ、）、ピロロジ−２８巻、６０Ｇ−６０９頁＋＋、　フランテ（Ｆ＋ａｎｋｅ、　Ｃ，＾、）、ライス（Ｒｉｃｅ、　Ｃ，Ｍ、）、ストラウス（Ｓｊｒｘｎｓｓ、　Ｊ、　Ｈ，）及びルビイ（Ｈｒｕｂ７．　Ｄ、　Ｅ、　）。

モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー５巻。

１９１８−１９２４頁　［１９８５１１２、ガンジェミイ（Ｇａｎｇｅｍｉ、　Ｊ、　Ｄ、　）及びシャープ（Ｓｈａｒｐ、　Ｄ、　Ｇ、　）、ピロロジ−８５巻、２６２−２７０頁　（１９７８１１３、ジェンメル（Ｇｅｍｍｓ　ｌ　ｌ、＾、）及びツェナー（Ｆｅｎｎｅｌ。

Ｆ、）、ピロロジ−１１巻、２＋９−２３５頁＋１９６０１１４、　ジラード（Ｇｉｌｌａ＋ｄ、　Ｓ、）、スペナー（Ｓｐｅｈｎｅｒ、　Ｄ、　）及びドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、　Ｄ、）、　ジャーナル参オブ・ピロロジ−５３巻、３１６−３１８頁　（１９８５）＋５．　ジラード（Ｇｉｌｌａ＋ｄ、　Ｓ、）、スベナー（Ｓｐｅｈｎｅｒ、　Ｄ、　）、ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、　Ｒ，）及びシーン（にｉｎｎ、　＾、）、プロシーデングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー拳ニス・ニー８３巻、５５７３−５５７７頁　（１９８６）１６、グラハム（Ｇｒ＊ｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、ｌ、パン・デル・ニブ−（Ｖｌｌｌ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ａ、Ｊ、）　、ピロロジ −５４巻、５３６−５３９頁１７、ルビイ（Ｈｒｕｂ７．　Ｄ、　Ｅ、　）、リン（Ｌ７ｎｎ、　Ｄ、Ｌ、）、コンディツト（Ｃｏｎｄ目、Ｒ１）及びケイプ（Ｋｘｆｅｓ、　Ｊ、　Ｒ，）。

ジャーナル・オブ・ジェネラル・ピロロジー（Ｊ、　ＧｅｎＶｉｒｏｌ、）　４７巻、４８５−４８８頁　（１９８０）１８、　キーニイ　（Ｋｉｅｎ７．　Ｍ、Ｐ、）、レース（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，）、ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、　Ｒ，）、スベナー（Ｓｐｅｈｎｅ　ｒ、　Ｄ、　）、スコリー（Ｓｋｏｒ７．　Ｓ、　）、シュミット（Ｓｃｂ＋ａｉ目、Ｄ、）、ライフタ−（Ｖｉｃｔｏｒ、　Ｔ　）、コブロフスキイ（Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ、　Ｈ，）及びレコック（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）、ネイチャー（ロンドン）（Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ））３１２巻、１６３−１６６頁　（１９８４）１９、レイク（Ｌｘｋｅ、Ｊ、　Ｒ，）及びクーパー（Ｃｏｏｌ−ｅ＋、　Ｐ。

Ｄ、）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ピロロジ−４８巻、＋３５−１４７頁　（１９８０１２０、マケット（Ｍｍｃｋｅｌｆ、　Ｍ、　）、スミス（Ｓｍ　ｉ　＋ｈ、　Ｇ、　Ｌ、　）及びモス（Ｂ、Ｍｏ５ｓ）、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー７９巻、７４１５−７４１９頁　（１９８２）２１、マヶット（ＬｅｋｅＮ、Ｍ、）及びアラシド　（Ａｒｒｓｎｄ。

ＬＲ，）、イー・エム・ビー・オー　［ＥＭＢＯ）　４巻、　３２２９−３２３５頁　（１９８５）２２、マニアティス（Ｍｍｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）、フリッブ（Ｆｒｉｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、）及びサムプルツク（１，Ｓａｍｂ＋ｏｏｋ）、ｒモレキスター・クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル　（Ｍｏｌｅｃｕｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ、　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　Ｊ　（コールド会スプリング・ハーバ−拳ラボラトリ４　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏ＋　１ａｂｏｒａｌｏＢ）刊、ニューヨーク）　（１９８２）２３、　マイア（Ｍａｙｒ、　Ａ、）、ホフシュタインーミンツエル（Ｈｏｃｈｓ＋ｅｉｎ−Ｍｉｎ＋ｚｅｌ、　Ｖ、　）及びスティックル（Ｓｌｉｃｋｌ。

Ｈｌ）、インフエクション（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）　３巻、　６−１４頁２４、マクレイン（ＭｃＣｌａｉｎ、　Ｍ、　Ｅ、　）、オーストラリアン−ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド拳メディカルーサイエンス（ＡＩＩＩＩｊＥｘｐ、Ｂｉｏｌ、　Ｍａｄ、Ｓｃｉ、）４３巻、３］−４４頁　（１９６５）２５、マイヤ（ＭｏＹｅｌ、　Ｒ，Ｗ、）及びロセ（Ｒ＋Ｎｂ！、　Ｃ，Ｔ、　）、ピロロジー　１０２巻、１１９−１３２頁　（＋９８０）２６、　ナカノ（Ｎｘｋａｎｏ、Ｅ、）、パニカリ（Ｐｘｎｉｃｉｌｉ、　Ｄ、）及びバオレツテイ（Ｐａｏｌｅｌｌｉ、Ｅ、）、　プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー７９巻、１５９３−１５９６頁　（１９ｇ２）２７、　パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、）、ディビス（Ｄｉｖｉｓ、　Ｓ、　Ｗ、　）、マーサー（Ｍ口ｃｅ＋、Ｓ、Ｒ，）及びパオレッティ（Ｅ。

Ｐλｏｌｅｌｌｉ）　、ジャーナル・オブ・ピロロジ−３７巻。

＋０００−１０１０頁（１９８１）２８、パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、）及びバオレッティ（Ｐａｏｌｅ目ｉ、　Ｅ、）、プロシーディングズ・オブ・ザーナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニーφニス・ニー７９巻、４９２７−４９３１頁　（１９８２）２９、パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、）、グゼレスキ（Ｇｒｚｅｌｅｃｋｉ、　Ａ、　）及びホワン（Ｃ，Ｈｕｔｎｇ）、ジーン４７巻。

＋９３−１９９頁（＋９８６１３０、バーカス（Ｐｅｒｋｏｓ、　Ｍ、Ｅ、）、バニカリ（Ｐｌｎｉｃａｌｉ。

Ｄ、）、マーサー（Ｍｅ＋ｃｅｒ、Ｓ、）及びバオレッティ（ＰａｏｌｃＮｉ、Ｅ、）、ピロロジー　１５２巻、２８５−２９７頁３１、バーカス（Ｐｅｒｋｏｓ、　Ｍ、Ｅ、）、ピッチｍ；（Ｐｉｃｃｉｎｉ。

Ａ、）、リビンスカス（Ｌｉｐｉｎ＋ｋａｓ、　Ｂ、　Ｒ，）、パオレッティ（Ｐｌｏｌｒｌｔｉ、Ｅ、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２９巻、　９８１−９８４頁（１９８５）３２、ピッチｍ；（Ｐｉｃｃｉｎｉ、　Ａ、　）、バーカフ、　（Ｐｅｒｋｏｓ。

Ｍ、　Ｅ、　）及びバオレッテ４　（ＰｘｏｌｅＮｉ、Ｐ、）、　メソッズＱ” イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ＋ｙａｏｌｏｇｙＨ５３巻、５４５−５６３頁、ニー（Ｗｕ、　Ｒ，）及びグロスマン（Ｇ＋ｏｓｓｍｉｎ、　Ｌ、　）編、アカディミック・ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ＋ｅ＋＋）社（１９ｇ？）３３、ローゼル（Ｒｏｓｅｌ、　］、　Ｌ、　）、アール（Ｅａ「ｌ、　Ｐ、Ｌ、）、ワイアー（Ｗｅｉｒ、Ｊ、Ｐ、）及びモス（Ｂ、Ｍｏ５ｓｌ、　ジャーナル・オブ・ピロロジ−６０巻、４３６−４４９頁　（１９８６）３４、　シャピラ（Ｓｈａｐｉｎｌ、　Ｓ、　Ｋ、　）、チａ　（Ｃｈｏｕ、Ｊ、　）、リシａ−（Ｒｉｃｂａｕｄ、　Ｆ、　Ｖ、　）及びカサダバンｆＣａｓａｄａｂａｎＭ、］、）、ジジン２２５．　７］−８２頁（１９８３）３５、サザン（Ｓｏｕｌｈｅ＋ｎ、　Ｐ、Ｈ，）及びバーブ（Ｐ、Ｂｃ＋ｇ）。

ジャーナル・オヴ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネテックス（１，Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｌ、）　］巻。

３２７−３４１頁（１９８２）３６、　タガヤ（Ｔａｇａｙａ、１．）、キタムラ（Ｋｉｌａｍｕ＋ａ、　Ｔ、）及びサノ（Ｙ、５ａｎｏ）、ネイチャー（ロンドン）１９２巻。

３８１−３８２頁　（＋９６１）３７、ワックスマン（Ｗａｃｈｓｍａｎ、　Ｍ、ｌ、オーレリアン（Ａｕｒｅｌｉａｎ、　Ｌ）　、スミス（Ｓｍｉｔｈ、　ｃ、　ｃ、　）、リピンスカス（Ｌｉｐｉｎａｋａｓ、　Ｂ、　Ｒ，）、バーカス（Ｐｅｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、）及びパオレッティ（Ｐａｏｌｅｌｌｉ、　Ｅ、）、ジャーナル・オブ・イン７エクシヨナル・ディシーズ（］、ｌｎ１．　Ｄｉｓ、）　１５５巻。

＋１８８−１１９７頁　（１９８７）３８、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｅ、Ｍ、）、ホラジス（Ｈｏｄｇｅｓ。

Ｗ、　Ｍ、　）及びルビー（ｔｌ＋ｕｂ７．　Ｄ、　Ｅ、　）、ジーン４９巻、　２０７−２１３頁（１９８６）３９、ニーエン（Ｙｕｅｎ、　Ｌ、）及びモス（Ｍｏｓｔ、　Ｂ、Ｌ　プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル俸アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー８４巻、６４１７−６４２１頁　（１９８７）４０、　コｙトワルｆＫｏ＋ｖｘｌ、　Ｇ、Ｊ、）及びモス（ｆｌｏｓｓ、Ｂ、）。

ピロロジー　１６７巻、５２４−５３７頁　（１９８８）４１、ティラー（Ｔａｙｌｏ＋、］、）、ウウニインベルブＷｅｉｎｂｅＢ、　Ｒ，）、カワオダ（Ｋａｖｔｏｄａ、　Ｙ、　）、ウェブスター（Ｗｅｂｉｌｅｒ、　Ｒ，Ｇ、　）及びパオレッティ（ＰａｏｌｃＮｉ、Ｅ、）。

ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）６巻、５０４−５０８頁　（１９８８）４２、ティラー（Ｔａｙｌｏ＋、］、）、ウウニインベルブＷｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，）、ランゲット（Ｌａｎｇｎｅ＋、Ｂ）、デスメトル（Ｄｃｓｍｅ＋ｔ＋ｅ、　Ｐ、　）及びパオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｆｉ、　Ｅ、）。

ワクチン６巻、４９７−５Ｎ頁　（１９８８）４３、ピックアップ（Ｐｉｃｋｕｐ、　Ｄ、　］、　）、インクｆｌｎｋ、　Ｂ。

Ｓ、）、ツウ（Ｈｕ、　Ｗ、）、レイ（ＲＡＴ、　Ｃ，Ａ、　）及びジョクリク（Ｊｏｋｌｉｋ、　Ｗ、に、）、　プロシーティンクス・オフーサ・ナショナル・ア力デミイーオブ・サイエンシズ・オブψザ・ニー・ニス・ニー８３巻、７６９８−７７０２頁　（＋９８６１４４、サザン（Ｓｏｕｔｈｅ「ｎ、　Ｅ、Ｍ、）、ジャーナルーオブーモレキュラー・バイオロジー　（］、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）９８巻。

５０３−５１７頁（１９７５）４５゜　コツトラオル（Ｋｏｊｖｍｌ、　Ｇ、１．）及びモス（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）。

ジャーナル・オブ・ピロロジ−６３巻、　６００−６０６　（１９８９）４６、タボール（Ｔａｂｏｏ、　Ｓ、　）及びリチャードソン（Ｒｉｃｈａ＋ｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，）、プロシーデイングズ・オブ参ナショナル・アカデミイ・オブφ サイエンシズ・ニーニスニー８４巻、４７６７−４７７１頁　（１９８７）４７、パテル（Ｐａｌｅｌ、　Ｄ、　Ｄ、　）及びピックアップ（Ｐ　ｉ　ｃ　ｋ　ｕ　ｐ。

Ｄ、Ｊ、）、イー・エム・ビー・オー６巻、　３７８７−３７９４頁４８、パテル（Ｐａｊｅｌ、　Ｄ、　Ｄ、　）、レイ（Ｒｘｙ、　Ｃ，Ａ、　）、トラッカー（Ｄ＋ｕｃｋｅ＋、　Ｒ，Ｐ、　）及びピックアップ（Ｐｉｃｋｕｐ、　Ｄ、Ｌ）。

プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ奉オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー８５巻、９４３１−９４３５頁　（＋９８８１４９、パーツレット（ＢｅＮｈｏｌｅｌ、　Ｃ，）、ドリリアン（Ｄ＋１ｌｌｉｅｎ、Ｒ，）及びウィッテク（ＷｉＮｅｋ、Ｒ，）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー８２巻、２０９６−２＋００頁　（１９８５）５０、　グオ（ＧｕＯ，Ｐ、　）、ゴーベル（Ｇｏｅｂｅｌ、Ｓ）　、デービス（Ｄａｖｉｔ、　Ｓ、　）、パーカス（Ｐｅｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、）、ランゲット（ＬｇｎｇｕｅＬ　Ｂ、　）、デスメトル（Ｄｅｓｍｅｔｔｒｅ、　Ｐ、　）、アレン（Ａｌ　ｆｅｎ、　Ｇ、　）及びパオレッティ（ＰａｏｌｅＮｉ、Ｅ）、ジャーナル・オプ・ピロロジ −６３巻、４１８９−４１９８頁　（１９８９）５１、タミン（Ｔａｍｉｎ、　Ａ、　）、ヴイラリール（Ｖｉｌｌａｒ＋ｅａｌ。

Ｅ、　Ｃ，）、ウエインリッヒ（Ｗｅｉｎ＋ｉｃｈ、Ｓ、Ｌ、）及びルビー（Ｈｒｕｂ７．　Ｄ、　Ｅ、　）、ピロロジー　１６５巻、１４１−１５０頁　（１９８Ｂ）５２、ボースネル（Ｂｏｕ＋５ｎｅｌｌ、＆ｉ、Ｅ、Ｇ、）、フォールズ（Ｆｏｕｌｄｓ、１．　］、　）、キャンベル（Ｃｓｍｐｂｅｌｌ、　Ｊ、１．）及びビンス（Ｍ、Ｍ、Ｂ１ｎｎ５）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ピロロジ−６９巻、２９９５−３００３頁　（１９８８）５３．７：／デキ４　（Ｍｘｎｄｅｃｋｉ、　Ｗ、）、プロシーディング・ナショナル・アカデミイ・オブ修すイエンシズ・ニーニスニー８３巻、？＋７７−７１８１頁　（１９８６１５４、スペナー（Ｓｐｅｈｎｅ＋、　Ｄ、　）、ジラード（Ｇｉｌｌａ＋ｄ、Ｓ、）、ドリリアン（Ｄ＋１ｌｌｉｅｎ、　Ｒ，）及びカーノ（Ｋｉｒｎ、　Ａ、）。

ジャーナル・オブ・ピロロジ−６２巻、＋２９７−１３０４頁（＋９８８１５５、アルテンバーガー（＾ｌＨｎｂｕｒｇｅ＋、　Ｗ、）、ニーター（ＳＩｌｔｅｔ、　Ｃ，Ｐ、　）及びアルテンバーガー（ＡＨｅｎｂｕ＋ｇｅｔ、　１．　）。

アーカイブス・オブ・ピロロジー（Ａｒｃｈ、　Ｖｉ＋ｏ１．）　１０５巻、＋５−２７頁　（１９８９）５６、ルビー（Ｈｒｕｂ７．　Ｄ、　Ｅ、　）、マキ（Ｍｘｋｉ、　Ｒ，Ａ、）、ミラー（Ｍｉｌｌｅ＋、　Ｄ、Ｂ、）及びボール（Ｂｔｌｌ、　Ｌ、Ａ、）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニーニスニー８３巻。

３４１１−３４１５　頁（１９８３）５７、ロビンス（Ｒａｂｂｉ＋＋＋、　Ａ、　Ｋ、　）、ドーネイ（Ｄｏｉｎｇ、　Ｄ。

Ｊ、）、シーセン（ＷＮｈｅｎ、　Ｍ、Ｗ、）、ウィーク−（Ｗｈｅａｌ！。

Ｍ、　Ｅ、　）、ゴールド（Ｇｏｌｄ、　Ｃ，）、ワトソン（Ｗａｊｓｏｎ、　Ｒ。

Ｊ、）、ホランド（Ｈｏｌｌｕ＋ｄ、　Ｌ、　Ｅ、　）、ウィード（Ｗｅｅｄ、Ｓ。

Ｄ、）、レヴイン（Ｌｅｙｉｎｅ、　Ｍ、）、グロリオソ（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ。

Ｊ、　Ｃ，）及びエンクイスト（Ｅ＋＋ｑｕｉｓ１．　Ｌ、　Ｗ、　）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−６１巻、２６９１−２７０１頁（１９ｇ？）５８、ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ａ、　Ｋ、　）、ワトソン（Ｌｊｓｏｎ、　Ｒ。

Ｊ、）、ウィーリイ−（Ｗｈｅｘ１７．　Ｍ、　Ｅ、）、ヘイズ（Ｈａｙｓ。

Ｗ、　Ｗ、　）及びエンクイスト（Ｌ、Ｗ、、　Ｅｎｑａｉｓｆ）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−５８巻、３３９−３４７頁　（１９１１６）５９、シーセン（ＷＮｈｅｎ、　Ｍ、Ｗ、）及びシーセン（ＷＮｈｅｎ。

Ｌ、Ｍ、に、）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−５１巻、５７−６２頁　（１９８４）６０、メチンレイター（Ｍｅ＋ｅｎｌｅｉｔｅ＋、　Ｔ、　Ｃ，）、ルカクス（Ｌｕｋａｃｓ、　Ｎ、）、シエール（Ｔｂｉｅｌ、　Ｈ，１，）、シュレールス（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ、　Ｃ，）及びシバ（Ｈ，Ｊ、　Ｒ１１ｂａ）、ピロロジ− １５２巻、６６−７５頁　（＋９８６）６１、ペトロフスキーｆＰｅ口Ｏマｓｋｉｍ、Ｅ、Ａ、）、テイミンス（Ｔｉｍｍｉｎｓ、　Ｊ、Ｇ、）　、アーメントラウト（Ａｒｍｓｎｔ＋ｏｕｔ、Ｍ、　Ａ、　）、マルチオリ（Ｍｉｒｃｈｉｏｌｉ、　Ｃ，Ｃ，）、ヤンセイ（Ｙａｎｃｅ７．　Ｊｒｌ、Ｒ，１，）及びポスト（Ｐｏｓｔ、Ｌ、　Ｅ、　）、ジャーナル争オブ・ピロロジ−５９巻、２＋６ −２２３頁　（１９８６）６２、　シュミット（Ｓｅｈｍｉ　ｔｔ、　１．　Ｆ、Ｃ，）及びスタネンベルグ（Ｈｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｇ、　）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−６２巻、１８８９−１．８９７頁　（１９８８＋６３、ボス（Ｖｏｓ、　Ｊ、Ｃ，）及びスタネンベルグ（Ｈｕｎ＋＋ｔｎｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｇ、　）、イー−エム・ビー・オー７巻。

３４８７−３４９２頁　（＋９８８）６４、ブツシャ−（Ｂｕｃｈｅ＋、　Ｄ、）、ボップル（Ｐｏｐｐｌｅ。

Ｓ、）、バール（Ｂａｃｋ、　Ｍ、）、ミカエル（Ｍｉｋｈａｉｌ、Ａ、）、ゴング（Ｇｏｄ、Ｙ、　Ｆ、　）、ライタカ（Ｗｈｉｓｋｅ「、　Ｃ，）、１＜オレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　Ｅ、）及びシャット（Ｊｕｄｄ、　Ａ、）。

ジャーナル・オブ・ピロロジ−６３巻、３６２２−３６３３頁６５、　サイキ（Ｓｘｉｋｉ、　Ｒ，Ｋ、　）、シェルフアンド（Ｇｅｌｌｘｎｄ。

Ｄ、Ｈ，）、ストラフエル（ｌｆｏｊｆｅｌ、　Ｓ、　）、シャーフ（Ｓｃｈｓｒｆ、Ｓ、］、）、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｂｉ、Ｒ）、ホーン（Ｈｏｒｎ。

Ｇ、　Ｔ、　）、ムリス（Ｍｕｆｆｉｎ、　Ｋ、Ｂ、）及びアーリック（Ｅｒｌｉｃｈ、Ｈ，Ａ、）、　サイエンス　２３９巻、４８７−４９１頁６６、カブラン（Ｋ＊ｐｌｘｎ、　ＪｏＭ、）、マートン（Ｍｘ＋ｄｏｎ。

Ｇ、）、ビシタップ（Ｂ口ｈｏｐ、Ｊ、Ｍ、）及びバルムス（Ｖｇ「ｍｕｓ、　Ｈ，Ｅ、）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー８巻、２４３５− ２４４１頁　（１９８８）６７、バローディ（Ｂｓｒｏｕｄ７．Ｂ、Ｍ、）、ベンカテサン（Ｖｅｎｔａｊｅｓａｎ、Ｓ、）及びモス（Ｍｏｓｓ、　Ｂ、）＋　セル（Ｃｅｌｌ）２８巻、３＋５−３２４頁　（＋９８２）６８、ライチック（Ｗｉ目ｅｋ、　Ｒ，）及びモス（Ｍｏｓｓ、　Ｂ、）、セル２１巻、２１１−２８４頁　（１９８０）６９、ライチック（Ｗｉ口ｅｋ、　Ｒ，）、ミニーシー（Ｍｏｌｌｓｒ。

Ｈ，Ｋ）、メナ（Ｍｅｎｎａ、　Ａ、　）及びワイラー（Ｗ７１ｃ＋、Ｒ，）、　エフ・イー・ビー・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｕｅ’＋＜）　９０巻。

４１−４６頁（１９７８）７０、スラボー（Ｓｌｘｂｓｕｇｈ、　Ｍ、）、ローズマン（Ｒａｓｅｍａｎ。

Ｎ、）、デービス（Ｄｓｗｉｔ、Ｒ，）及びマンュース（ＭＮｈｅｖｓ。

Ｃ０）、ジャーナル・オブ・ピロロジ−６２巻、５１９−５２７頁（１９８８１７１、ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，）及びベルブ（Ｂｅｒｇ、ｐ、）。

サイエンス　２０９巻、１４２２−１４２７頁　（１，９８［１）７２、プラット（Ｐｅａ口、Ｄ、）及びスブラマニ（Ｓｕｂｒｘｍｍｎｉ、　Ｓ、　）、　二ニークレイツク−７シツズａ　リサーチ（Ｎｕ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１１巻、８１１１７−８８２３頁（１９８３）Ｐａｔ工口Ｇ、　２Ｂ　Ｈ１間■ ＦＩＧ、　３Ａ囚Ｂａｒｎ）ＩＩ　ＨＲＬ３４Ｈ１ｎｄＩＩＩ　繍μ亦＞　ＨＲＬ３５ｐＨＥＳ　ｌ　−一一一一一一一一一一９　□＞　ｐＨＥＳ６２ＢａｕｎＨＩ　ＨＲＬ３６ＢａｍＨＩ　ＨＲＬ３Ｂ特表千４−５０３９０４　（３２）曽　ロ　ヘ　Ｎ　か　−−＋＃− 一　−−〜　−−−八　Ｐ −１−ｈ　−−−調　−−ｈ −φ　１１５　ψ 彎　豐　！！　：　ｇ　ｅ　Ｌｍ　Ｃ；　紮　＝か　め　−１％　Ｍ　１０　ｄ　−〜　智　ロ　ひた　繋　ま　５！！！　。　。　、　；：　？ｌＩ　Ｎ＋　＋４　＋　ＰＩＭ　Ｃ；　Ｍに　Ｘ　；　ＺＸ＝、。

ＰＩ　１％ｉ　〜　へ　−−鶴　雫　賃　−〜−−−−−−−　−〜ｆ　ｌ／ｌ　＋＋　に　＋＋ｌｌｌ１１　−　−　＋＋　＋＋　Ｐ’１特表千４ −５０３９０４　（３Ｂ）ＦＩＧ。１４ＦＩＧ、　＋５Ｄｒａｌ　ＭＰＳＹＮ２３８ＰｓｔＩ　ＭＰＳＹＮ２４９ｐＭＰｃｓ−１−＞　−＞　ｐｃＯＰｃｓ−４８１ｎｄＩＩＩ　Ｈ６Ｐｓｔｌ　ＭＰＳＹＮ２４９ｐｃＯＰｃｓ−３Ｈ−＞　＞　ｐｃＯＰｃｓ−５ＨＮｒｕＩ　ＭＰＳＹＮ２５ＯＮｒｕＩ　ＭＰＳＹＮ２５２ＮｒｕＩ　ＭＰＳＹＮ２５４ＮｒｕＩ　ＭＰＳＹＮ２７１Ｎｒｕｌ　ＭＰＳＹＮ２７３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．宿主中で組換えボックスウイルスを選択する方法にして、該方法が組換えボックスウイルスを生じさせるためにドナーＤＮＡと修飾ボックスウイルスを組み合わせ、かつ組換えボックスウイルスを宿主中でのその複製能力によって同定することを含んでなるもので、上記修飾ボックスウイルスは宿主中で該修飾ボックスウイルスが複製しないように宿主域遺伝子を欠失しており、上記ドナーＤＮＡは（ａ）非ボックス由来の解読枠及び（ｂ）上記組換えボックスウイルスが宿主中で複製できるようにする１つ以上の宿主域遺伝子を含んでいることを特徴とする方法。２．請求項１記載の方法において、前記ボックスウイルスがワクシニアであることを特徴とする方法。３．請求項１記載の方法において、前記非ボックス由来の解読枠がβ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子であることを特徴とする方法。４．請求項１記載の方法において、宿主がヒトの細胞系であることを特徴とする方法。５．請求項４記載の方法において、前記ヒトの細胞系がＭＲＣ−５であることを特徴とする方法。６．請求項２記載の方法において、前記ボックスウイルス宿主域遺伝子がワクシニア宿主域遺伝子ＫｌＬ及びＣ７Ｌであることを特徴とする方法。７．請求項１記載の方法において、前記組換えボックスウイルスを生じさせるためのドナーＤＮＡと修節ボックスウイルスを組み合わせを、ドナーＤＮＡと修飾ボックスウイルスとの組換えによって行なうことを特徴とする方法。８．組換えボックスウイルス中の解読枠を宿主中でクローニング及び発現させる方法にして、該方法が組換えボックスウイルスを生じさせるためにドナーＤＮＡと修飾ボックスウイルスを組み合わせ、宿主中で組換えボックスウイルスを複製させ、かつ解読枠を発現させることを含んでなるもので、上記修飾ボックスウイルスは宿主中で該修飾ボックスウイルスが複製しないように宿主域遺伝子を欠失しており、上記ドナーＤＮＡは（ａ）非ボックス由来の解読枠及び（ｂ）上記組換えボックスウイルスが宿主中で複製できるようにする１つ以上の宿主域遺伝子を含んでいることを特徴とする方法。９．請求項８記載の方法において、前記ボックスウイルスがワクシニアであることを特徴とする方法。１０．請求項８記載の方法において、前記非ボックス由来の解読枠がβ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子であることを特徴とする方法。１１．請求項８記載の方法において、宿主がヒトの細胞系であることを特徴とする方法。１２．請求項１１記載の方法において、前記ヒトの細胞系がＭＲＣ−５であることを特徴とする方法。１３．請求項９記載の方法において、前記ボックスウイルス宿主域遺伝子がワクシニア宿主域遺伝子ＫｌＬ及びＣ７Ｌであることを特徴とする方法。１４．請求項８記載の方法において、前記組換えボックスウイルスを生じさせるためのドナーＤＮＡと修飾ボックスウイルスを組み合わせを、ドナーＤＮＡと修飾ボックスウイルスとの組換えにようて行なうことを特徴とする方法。１５．ボックスウイルス宿主域遺伝子と非ボックス由来の解読枠とを含むドナープラスミド。１６．請求項１５記載のドナープラスミドにおいて、前記ボックスウイルス宿主域遺伝子の上流にプロモーターをさらに含むことを特徴とするドナープラスミド。１７．請求項１６記載のドナープラスミドにおいて、前記プロモーターの下流に翻訳開始コドン、それに続いて、ユニークな多重制限酵素部位、翻訳終結シグナル配列、及び初期転写終結シグナル配列をさらに含むことを特徴とするドナープラスミド。１８．請求項１５記載のドナープラスミドにおいて、前記ボックスウイルス宿主域遺伝子がワクシニア宿主域遺伝子Ｋ１Ｌ及びＣ７Ｌであることを特徴とするドナープラスミド。１９　．宿主中で遺伝子産物を発現させるための修飾組換えウイルスにして、該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子を欠失しており、かつ該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの制限された複製の下で宿主中での遺伝子産物をコードしかつ発現するＤＮＡを含んでいることを特徴とする修飾組換えウイルス。２０．請求項１９記載のウイルスにおいて、前記ウイルスがドックスウイルスであることを特徴とするウイルス。２１．請求項２０記載のウイルスにおいて、前記ボックスウイルスがワクシニアであることを特徴とするウイルス。２２．請求項１９記載のウイルスにおいて、前記遺伝子産物が抗原であることを特徴とするウイルス。２３．請求項２２記載のウイルスにおいて、前記宿主が脊椎動物であって、かつ前記抗原が該脊椎動物中での免疫反応を誘起するものであることを特徴とするウイルス。２４．請求項２３記載のウイルスにおいて、前記抗原が、狂犬病糖タンパク質抗原及び擬狂犬病糖タンパク質抗原からなる群から選択したものであることを特徴とするウイルス。２５．請求項１９記載のウイルスにおいて、前記宿主がインヴィトロで培養した細胞であることを特徴とするウイルス。２６．宿主中で遺伝子産物を発現させる方法にして、該方法が宿主に修飾組換えウイルスを接種することを含んでなるもので、該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子を欠失しており、かつ該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの制限された複製の下で宿主中での遺伝子産物をコードしかつ発現するＤＮＡを含んでいることを特徴とする方法。２７．請求項２６記載の方法において、前記ウイルスがボックスウイルスであることを特徴とする方法。２８．請求項２７記載の方法において、前記ボックスウイルスがワクシニアであることを特徴とする方法。２９．請求項２６記載の方法において、前記遺伝子産物が抗原であることを特徴とする方法。３０．請求項２９記載の方法において、前記宿主が脊椎動物であって、かつ前記抗原が該脊椎動物中での免疫反応を誘起するものであることを特徴とする方法。３１．請求項３１記載の方法において、前記抗原が、狂犬病糖タンパク質抗原及び擬狂犬病糖タンパク質抗原からなる群から選択したものであることを特徴とする方法。３２．インヴィトロで培養した細胞中で遺伝子産物を発現させる方法にして、該方法が宿主に修飾組換えウイルスを導入することを含んでなるもので、該修飾組換えウイルスは細胞中での該ウイルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子を欠失しており、かつ該修飾組換えウイルスは細胞中での該ウイルスの制限された複製の下で細胞中での遺伝子産物をコードしかつ発現するＤＮＡを含んでいることを特徴とする方法。３３．ワクチン接種した宿主中で免疫反応を誘起させるためのワクチンにして、該ワクチンはキャリアーと修飾組換えウイルスを含んでなるが、該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの複製が制限されるように宿主域遺伝子を欠失しており、かつ該修飾組換えウイルスは宿主中での該ウイルスの制限された複製の下で宿主中での遺伝子産物をコードしかつ発現するＤＮＡを含んでいることを特徴とするワクチン。