IT9019623A1

IT9019623A1 - Sistema di selezione di spettro di infettivita' di poxvirus ricombinante

Info

Publication number: IT9019623A1
Application number: IT019623A
Authority: IT
Inventors: Enzo Paoletti
Original assignee: Health Research Inc
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1991-09-08
Also published as: BE1004212A5; CH682669A5; JP3044062B2; US5453364A; GB9117996D0; CA2011654A1; IE900814L; AU625584B2; CA2011654C; DK157091D0; DE4090351T1; AT400955B; ATA902490A; IT9019623A0; NL9020389A; IE62441B1; JPH04503904A; LU88000A1; GB2245272B; AU5332090A

Description

per l 'espressione di strutture di letture aperte in poxvirus, in particolare in virus vaccini. Il sistema di selezione é basato su un mutante letale condizionale (spettro di infettività) di poxvirus. Si é generato un mutante del ezi one/ri combi nante del virus vaccinia che é capace di placcare su fibroblasti di embrione di pollo primari e su due linee di cellule di scimmia (BSC-40 oppure VERO) ma che é deficente nella replicazione nella linea di cellule umane MRC--5. L'inserimento del gene dello spettro di infettività nel del ezi one/ri combi nante ripristina la possibilità di crescita su cellule MRC-5. Si é costruita una serie di plasmidi che consentono la clonazione 1n un'unica fase, rapida, e l 'espressione di una qualsiasi struttura di lettura aperta quando viene ricombinata con il del ezi one/ri combi nante e viene valutata per la crescita su cellule MCR-5.

L'invenzione é stata realizzata con il sostegno del governo sotto il contratto DAMD17-85-C-5232 assegnata dal Department of thè Army. Il governo ha certi diritti su questa invenzione.

RIFERIMENTO INCROCIATO A DOMANDE SIMILI

Questa domanda é una continuazione in parte della domanda in corso numero di serie 320471 depositata 1'8 marzo 1989.

CAMPO DELL1INVENZIONE

La presente invenzione riguarda virus ricombinanti modificati, riguarda metodi per esprimere prodotti di geni in un ospite usando tali virus ricombinanti modificati e riguarda vaccini che comprendono tali virus ricombinanti modificati.

La presente invenzione riguarda anche poxvirus modificati, in particolare virus di vaccini modificati e riguarda metodi per realizzare e selezionare i medesimi. Più in particolare, l'invenzione riguarda un sistema di selezione per la clonazione e l'espressione di uno schema di lettura aperto in poxvirus ricombinante, in particolare in virus di vaccini ricombinante.

In questa domanda vengono citate diverse pubblicazioni con numeri arabi scritti entro parentesi. Le citazioni complete relative a questi riferimenti si trovano alla fine della descrizione immediatamente prima delle rivendicazioni. Questi riferimenti descrivono lo stato della tecnica al quale si riferisce questa invenzione.

BASE DELL'INVENZIONE

I virus di vaccini e più frequentemente altri poxvirus sono stati usati per l'inserimento e l'espressione di geni estranei. La tecnica fondamentale di inserimento di geni estranei nel poxvirus infettivo vivo comporta la r i combi nazi one tra sequenze di pox-DNA che fiancheggiano un elemento genetico estraneo in un plasmide donatore e sequenze omologhe presenti nel poxvirus di recupero (32).

In modo specifico, i poxvirus ricombinanti vengono costruiti in due fasi note nel settore e analoghe ai metodi per creare ricombinanti sintetici dei virus di vaccini descritti nel brevetto US 4 603 112 la descrizione del quale brevetto é incorporata qui come riferimento.

In primo luogo, la sequenza del gene di DNA da inserire nel virus, in particolare uno schema di lettura aperto proveniente da una sorgente non costituita da pox-v1rus, viene posta in una struttura di plasmide di E. coli in cui é stato inserito DNA omologo ad una sezione di DNA non essenziale del poxvirus. Separatamente, la sequenza del gene di DNA da inserire viene sottoposta a legatura ad un promotore. Il legame gene-promotore é situato nella struttura del plasmide in modo che il legame gene--promotore sia fiancheggiato su entrambe le estremità da DNA omologo rispetto ad una sequenza di DNA che fiancheggia una regione non essenziale del pox-DNA. La struttura di plasmide ottenuta viene quindi ampliata mediante crescita all'interno del batterio E.coli (4) e viene isolata (5,22).

In secondo luogo, il plasmide isolato contenente la sequenza del gene di DNA da inserire viene transinfettata in una coltura di cellule, per esempio fibroplasti di embrione di pollo insieme con i poxvirus. La ricombinazione tra pox-DNA omologo nel plasmide e nel genoma virale rispettivamente dà un poxvirus modificato dalla presenza, in una regione non essenziale del suo genoma, di sequenze di DNA estranee. Il termine DNA "estraneo" sta ad indicare DNA esogeno, in particolare DNA proveniente da una sorgente non costituita da poxvirus, che codifica per prodotti costituiti da geni non prodotti normalmente dal genoma nel quale viene posto il DNA esogeno.

La ricombinazione genetica in generale é lo scambio di sezioni omologhe del DNA tra due filamenti di DNA. In certi virus il RNA può sostituire il DNA. Sezioni omologhe di acido nucleico sono sezioni di acido nucleico (DNA oppure RNA) che hanno la medesima sequenza di basi di nucleotidi.

La ricombinazione genetica può avvenire naturalmente durante la replicazione oppure la fabbricazione di nuovi genomi virali all'interno della cellula ospite infettata. Così, la ricombinazione genetica tra geni virali può avvenire durante il ciclo di replicazione virale che avviene in una cellula ospite che é co infettata con due o più differenti virus oppure con altre strutture genetiche. Una sezione del DNA proveniente da un primo genoma viene usata in modo intercambiabile nella costruzione della sezione del genoma di un secondo virus co-infettante in cui il DNA é omologo con quello del primo genoma virale.

Tuttavia, la ricombinazione può avvenire anche tra sezioni di DNA in differenti genomi che sono non perfettamente omologhi. Se una tale sezione proviene da un primo genoma omologo ad una sezione di un altro genoma tranne che per la presenza all'interno della prima sezione per esempio di un marcatore genetico oppure di un gene che codifica per un determinante antigene inserito in una porzione del DNA omologo, la ricombinazione può avvenire ancora e i prodotti di quella ricombinazione sono quindi rivelabili dalla presenza di quel marcatore genetico o gene nel genoma virale ricombinante.

L'espressione con risultati favorevoli della sequenza genetica di DNA inserito dal virus infettivo modificato richiede due condizioni. In primo luogo l'inserzione deve avvenire in una regione non essenziale del virus affinché il virus modificato rimanga vivo. La seconda condizione per l'espressione del DNA inserito é la presenza di un promotore nella opportuna relazione rispetto al DNA inserito. Il promotore deve essere posto in modo che esso sia situato a monte dalla sequenza di DNA che deve venire espressa. Una r i combi nazi one non alterata, giusta avviene con una sequenza di circa 0,1%.

Una strategia di selezione fondamentale per recuperare quei virus modificati da una ricombinazione riuscita comporta una ibridazione in situ di ricombinanti su filtri di replicazione con un sonda radiomarcata omologa alle sequenze inserite (26,28). Sono state riferite numerose modificazioni per fare aumentare l'efficacia della ricombinazione stessa oppure per facilitare l 'identificazione di ricombinanti. Tra queste modifiche sono incluse: l 'impiego di DNA donatore a singolo filamento (38); l 'identificazione di ricombinanti che esprimono funzioni enzimatiche particolari come incorporazione di Iododeossi ci tidi na in DNA tramite espressione della ti mi di na-ch i nasi del virus Herpes-simplex (28); substrati cromogenici per la ( co ) espress i one di geni estranei insieme con B-galattosidasi (3,29). Selezione per una espressione di timidin-chinasi (20,28); reazioni basati su anticorpi per visualizzare placche ricombinanti (21); l'impiego di ts letale condizionale oppure di mutanti costituitui da farmaci (9,18), selezione di ricombinanti impiegando il gene di resistenza alla neomicina ottenuto da Tn5 e dall'antibiotico G418 (11); oppure pressioni di selezione con acido micofenolico e con il gene gpt di E.coli (2,8).Svantaggiosamente, questi metodi noti per identificare oppure per selezionare poxvirus ricombinante comportano tutti una identificazione a molte fasi fastidiosa dei ricombinanti, l'introduzione di composti radiochimici, substrati cromogenici, prodotti biochimici utili per la selezione come acido micofenolico e bromodeossiuridina che può essere dannosa (mutagena) per il genoma virale stesso, l'impiego di reagenti sierologici che possono introdurre contaminanti e in modo tipico la presenza di un gene esogeno nel ricombinante finale in aggiunta all'elemento genetico estraneo che interessa.Si può quindi comprendere che la realizzazione di un metodo di produzione e di selezione per ricombinanti di poxvirus, in particolare ricombinanti di vaccini, il quale metodo eviti i problemi discussi in precedenza sarebbe un progresso notevolmente desiderabile rispetto allo stato attuale della tecnologia.

Nelle tecniche precedenti sono stati sviluppati metodi che consentono la creazione di virus di vaccini ricombinanti e di virus avipox mediante l'inserimento di DNA proveniente da qualsiasi sorgente (per esempio virale, procariotico, eucariotico, sintetico) in una regione non essenziale del genoma dei vaccini o dell'avipox, ivi comprese sequenze di DNA che codificano per i determinanti antigeni di un organismo patogeno. I virus di vaccini ricombinanti creati mediante questi metodi sono stati usati per indurre una immunità specifica in mammiferi nei confronti di svariati agenti patogeni di mammiferi, tutti come descritti nel brevetto US 4603 112, incorporato qui come riferimento. I virus avipox ricombinanti creati mediante questi metodi sono stati usati per indurre l'immunità specifica in specie avicole (41) e in specie non avicole (42).

Il vaccinia virus non modificato ha una lunga storia di relativa sicurezza e di uso efficace per l'inoculazione contro il vaiolo. Tuttavia, prima di sradicare il vaiolo quando il vaccino non modificato veniva ampiamente somministrato, vi era un rischio modesto ma reale di complicazione sotto forma di infezione da vaccino generalizzata, in particolare da parte di coloro che soffrivano di eczema oppure di una sindrome da immuro soppressione. Un'altra complicazione rara ma possibile che poteva risultare dalla inoculazione del vaccino é la encefalite post vaccinica. La massima parte di queste reazioni si avevano dalla inoculazione di individui con malattie della pelle come eczema oppure con sistemi immunitari compromessi oppure di individui che vivevano insieme con altri che avevano eczema oppure risposte immunologiche compromesse. Il vaccino é un virus vivo e normalmente é innocuo per un individuo sano. Tuttavia, esso può venire trasmesso tra individui per diverse settimane dopo 1<1>inoculazione. Se un individuo con una compromissione della risposta immunitaria normale viene infettato o tramite inoculazione oppure mediante trasmissione per contagio da un individuo inoculato di recente, le conseguenze possono essere gravi.

Mutanti di virus opportunamente modificati che portano geni esogeni che vengono espressi in un ospite come determinante antigene che provoca la produzione da parte dell'ospite di anticorpi verso un agente patogeno ospite con una replicazione ristretta del virus nell'ospite rappresentano vaccini nuovi che evitano gli inconvenienti dei vaccini convenzionali nei quali si impiegano organismi uccisi oppure organismi vivi attenuati. Così, per esempio, la produzione di vaccini da organismi uccisi richiede la crescita di grandi quantità degli organismi a cui si fa seguire un trattamento che distruggerà in modo selettivo la loro caratteristica infettiva senza influire sul loro carattere di antigene. D'altra parte, i vaccini contenente organismi vivi attenuati presentano la possibilità di una regressione dell'organismo attenuato ad uno stato patogeno. Al contrario, quando come vaccino si usa un pox virus ricombinante opportunamente modificato, la possibilità di regressione verso un organismo patogeno viene evitata poiché il poxvirus contiene soltanto il gene che codifica per il determinante antigene dell'organismo che produce la malattia e non quelle porzioni genetiche dell'organismo responsabili della replicazione dell'agente patogeno.

Così, si può valutare che un metodo che conferisce nel settore i vantaggi della inoculazione di virus vivi ma che diminuisce oppure elimina i problemi discussi in precedenza sarebbe un progresso altamente desiderabile rispetto allo stato attuale della tecnologia. Ciò é anche più importante attualmente con la comparsa della malattia nota come sindrome da immuno- deficenza acquisita (AIDS). Le vittime di questa malattia presentano gravi disfunzioni immunologiche e potrebbero venire facilmente danneggiati da un preparato di virus vivi per altri sicuro se essi venissero a contatto con tale virus o direttamente oppure tramite il contatto con una persona recentemente immunizzata con un vaccino che comprende tale virus vivo.

OGGETTI DELL·INVENZIONE

Pertanto un oggetto della presente invenzione é quello di mettere a disposizione un vaccino per indurre una risposta immunologica in un ospite, il quale vaccino presenta i vantaggi di un vaccino con virus vivi e ha pochi inconvenienti oppure non ha nessuno degli inconvenienti di un vaccino con virus vivi oppure di un vaccino con virus uccisi come elencati sopra.

Un secondo oggetto della presente invenzione § quello di mettere a disposizione virus ricombinanti modificati da usare in tali vaccini.

Un ulteriore oggetto di questa invenzione é quello di mettere a disposizione un procedimento per esprimere un prodotto costituito da un gene in un ospite inoculando l'ospite con un virus ricombinante modificato che codifica per il prodotto costituito dal gene ed esprime tale prodotto nell'ospite con replicazione ristretta del virus nell'ospite.

Ancora un oggetto dell'invenzione é quello di mettere a disposizione metodi per esprimere un prodotto costituito da un gene in una cellula sottoposta a coltura in vitro, il quale metodo consiste nell'indurre nella cellula un virus ricombinante modificato contenente DNA che codifica per ed esprime il prodotto costituito dal gene con una replicazione ristretta del virus nella cellula.

Un ulteriore oggetto di questa invenzione é quello di mettere a disposizione virus ricombinanti modificati, i quali virus ricombinanti modificati esprimono prodotti costituiti da geni in un ospite con replicazione ristretta dei virus nell'ospite e quello di mettere a disposizione un metodo per produrre tali virus ricombinanti modificati.

Un ulteriore oggetto di questa invenzione é quello di mettere a disposizione un'identificazione rapida,in una fase,di virus ricombinanti e una rapida selezione per l'espressione degli schemi di lettura aperti estranei nei ricombinanti.

Un ulteriore oggetto di questa invenzione é quello di mettere a disposizione un metodo di produzione e selezione per un poxvirus ricombinante, in particolare virus per vaccini ricombinante e quello di mettere a disposizione le sequenze DNA prodotte oppure coinvolte come intermedi nel metodo.

Ancora un ulteriore oggetto di questa invenzione é quello di mettere a disposizione un sistema di selezione per la clonazione e l'espressione di uno schema di lettura aperto in poxvirus ricombinante, in particolare vaccinia virus ricombinante in cui il virus ricombinante non contiene un gene estraneo diverso da quello dello schema di lettura aperto che interessa.

Questi e altri oggetti e vantaggi della presente invenzione risulteranno più facilmente evidenti considerando la seguente descrizione.In un aspetto, la presente invenzione riguarda un virus ricombinante modificato avente geni dello spettro di infettività cancellati da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta in un ospite, in cui il virus ricombinante modificato contiene DNA che codifica per ed esprime un prodotto costituito da un gene nell'ospite con replicazione ristretta del virus nell'ospite. Il virus secondo la presente invenzione é vantaggiosamente un poxvirus, in particolare un vaccinia-virus.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per esprimere un gene prodotto, in un ospite inoculando l'ospite con un virus ricombinante modificato aventi geni dello spettro di infettività cancellati da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite. Il virus ricombinante modificato contiene DNA che codifica per e che esprime il gene prodotto nell'ospite anche con replicazione ristretta del virus nell'ospite. Il virus usato nel metodo secondo la presente invenzione é vantaggiosamente un poxvirus, in particolare un vaccinia-virus. Il gene prodotto espresso nell'ospite é vantaggiosamente un antigene. PiQ in particolare, l'ospite é un vertebrato e l'antigene provoca una risposta immunologica nel vertebrato.

Ancora in un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un vaccino per Indurre una risposta immunologica in un ospite inoculato con il vaccino, detto vaccino comprendendo una sostanza-veicolo e un virus ricombinante modificato aventi geni di spettro di infettività cancellati da esso in modo che il virus abbia una replicazione ristretta nell'ospite. Il virus ricombinante modificato contiene DNA che codifica per e che esprime un gene nell'ospite anche con una replicazione ristretta del virus nell'ospite. Π virus usato nel vaccino secondo la presente invenzione é vantaggiosamente un poxvirus, in particolare vaccinia-virus.

In un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda un metodo per selezionare un poxvirus ricombinante in un ospite combinando un DNA donatore e un poxvirus modificato in modo da formare un poxvirus ricombinante e identificare il poxvirus ricombinante per la sua capacità di repplicarsi nell'ospite. Ancora in un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda un metodo per clonare ed esprimere uno schema di lettura aperto in un poxvirus ricombinante in un ospite combinando il DNA donatore e un poxvirus modificato in modo da formare un poxvirus ricombinante, per replicare il poxvirus ricombinante nell'ospite e esprimere lo schema di lettura aperto. Secondo la presente invenzione, il poxvirus modificato ha un gene di spettro di infettività cancellato da esso in modo che il poxvirus modificato non si replichi nell'ospite e il DNA donatore contiene uno schema di lettura aperto proveniente da una sorgente non costituita da un poxvirus e il gene dello spettro di nfettività per consentire che il poxvirus ricombinante si replichi nell'ospite.

Ancora in un altro aspetto l 'invenzione riguarda un plasmide donatore per produrre il poxvirus ricombinante del sistema di selezione. Il plasmide donatore contiene uno schema di lettura aperto proveniente da una sorgente non costituita da un poxvirus e un gene dello spettro di infettività per consentire che il poxvirus ricombinante si replichi nell 'ospite. Vantaggiosamente, il plasmide donatore può anche contenere un promotore a monte del gene dello spettro di infettività del poxvirus, un codone di inizio della traduzione a valle dal promotore seguito da siti di restrizione multipli particolari, da sequenze di segnale di fine della traduzione e da una sequenza di segnale di terminazione di una trascrizione precoce.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Si potrà avere una migliore comprensione della presente invenzione riferendosi ai disegni allegati nei quali:

la figura 1A mostra schematicamente un metodo per la costruzione del ri combi nante/del ezi one/del vaccinla virus vP293;

la figura 1B é una mappa dell 'estremità sinistra del VTK 79 virus vaccinia "rescuing" tramite HindlII K; la figura 1C è una mappa dell'estremità sinistra del ricombinante/delezione/del virus del vaccino vP293 tramite HindIII K;

la figura 2A mostra schematicamente un metodo per clonare il gene di spettro di infettività K1L nel pMP528L- plasmide e il suo inserimento in vP293 per generare virus di vaccini vP457;

la figura 2B é una mappa dell'estremità sinistra di vP293 attraverso Hind111 K;

la figura 2C é una mappa dell’estremità sinistra di vP457 tramite HindIII K;

la figura 3A mostra schematicamente un metodo per la costruzione dei plasmidi pMP528HRH; e pHESl

la figura 3B mostra la sequenza di DNA nel promotore H6 sintetico e i siti di restrizione a valle presenti nel pMP528HRH;

la figura 3C mostra la sequenza di DNA (con siti di restrizione, codoni di arresto e un segnale di terminazione della trascrizione precoce) che sostituisce la sequenza posta tra parentesi della figura 3B nel piasmide pHESl;

la figura 3D mostra la sequenza di DNA (con siti di restrizione, codoni di arresto e un segnale di terminazione della trascrizione precoce) che sostituisce la sequenza posta tra parentesi della figura 3B nella plasmide pHES2;

la figura 3E mostra la sequenza di DNA (con siti di restrizione, codoni di arresto e un segnale di terminazione della trascrizione precoce) che sostituisce la sequenza posta tra parentesi della figura 3B nel plasmide pHES3;

la figura 3F mostra la sequenza di DNA (con siti di restrizione, codoni di arresto e un segnale di terminazione della trascrizione precoce) che sostituisce la sequenza posta tra parentesi della figura 3B nel plasmide pHES4;

la figura 4A mostra schematicamente un metodo per la costruzione dei plasmidi pKES31-34;

la figura 4B mostra le sequenze di DNA degli oligonucleotidi sintetici HRL15-22;

la figura 5 mostra la sequenza di DNA del promotore JJ di vaccini presente in plasmidi pHES31-34. Inoltre, la figura 5 mostra in sequenza posta tra parentesi 1 siti di restrizione, i codoni di arresto e segnali di terminazione della trascrizione precoce presenti in pHES31-34 e i codoni di inizio presenti in pHES31-33;

la figura 6A mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmidi pHES61-64;

la figura 6B mostra le sequenze di DNA degli oligonucleotidi sintetici HRL33-40;

la figura 7 mostra la sequenza di DNA del promotore ATI sintetico presente in pìasmidi pHES61-64. Inoltre la figura 7 mostra nella sequenza posta tra parentesi i siti di restrizione, i codoni di arresto e segnali di terminazione della trascrizione precoce presenti in pHES61-64 e i codoni di inizio presenti in pHES 61-63;

la figura 8 mostra la sequenza di DNA (con siti di restrizione) di 15537 bp situate in vicinanza dell'estremità di sinistra del ceppo Copenhagen di vaccini;

la figura 9 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di ricombinanti vP548 e vP661;

la figura 10 é una mappa dell'estremità sinistra del genoma del virus del vaccino;

la figura 11 mostra schematicamente un metodo per l'esame di geni dello spettro di infettività di vaccini potenziali nel sistema vP293;

la figura 12 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di ricombinanti vP665, vP683, vP706 e vP716;

la figura 13 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di pìasmidi pCP3 e pCP5 e per l'esame di un gene dello spettro di infettività di vaiolo bovino potenziale nel sistema di vaccino.

La figura 14 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di ricombinanti vP664 e vP668;

la figura 15 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di una serie di plasmidi derivati da pMPCTKIA;

la figura 16 mostra le sequenze di DNA di oligonucleotidi sintetici MPSYN238, MPSYN239, MPSYN250-255 e MPSYN271-274;

la figura 17 mostra la sequenza di DNA sintetico contenente siti di restrizione, codoni di arresto e segnali di terminazione della trascrizione precoce presenti in plasmidi pMPCS-1 e pMPCS-4. Inoltre, la figura 17 mostra la regione del promotore H6 sintetico presente in pC0PCS-3H e pC0PCS-5H attraverso pCOPCS-ÌOH. Inoltre, la figura 17 mostra nella sequenza posta tra parentesi i siti di restrizione, i codoni di arresto e i segnali di terminazione della trascrizione precoce presenti in pC0PCS-3H e p-C0PCS-5H attraverso pC0PCA-10H e i codoni di inizio presenti in pC0PCS-6H attraverso pC0PCS-10H;

la figura 18 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmidi pMPLEND^e pMPRENDA;

la figura 19 mostra la sequenza da 13978 bp di DNA da Hindi11 C del genoma Copenhagen del virus di vaccini, ivi comprese sequenze codificanti situate alla sinistra della sequenza presentata nella figura 8; la figura 20 mostra la sequenza completa di DNA per HindlII F situata immediatamente a destra del Hind-III K nella figura 8 ; e

la figura 21 mostra la sequenza di DNA contenuta in HindlII B in vicinanza della terminazione di destra del genoma del vaccinia virus.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE L'invenzione é rivolta a virus ricombinanti modificati aventi geni dello spettro di infettività cancellati da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite e contenente DNA che codifica per ed esprime un gene prodotto nell'ospite con replicazione ristretta di un virus nell'ospite. L'invenzione riguarda anche un sistema di selezione per ricombinanti di poxvirus, in particolare ricombinanti di vaccini e per la clonazione e l 'espressione di uno schema di lettura aperto in poxvirus, in particolare i nvacci ni a-vi rus , impiegando un mutante dello spettro di infettività letale condizionale del poxvirus.

I mutanti dello spettro di infettività di virus del vaiolo del coniglio (24,13) e di vaccinia-virus (6,7,12,17,23,36) sono noti.

I mutanti dello spettro di infettività di virus del vaiolo di coniglio si ritiene che siano mancanti in una certa funzione di controllo richiesta per la replicazione del virus (10). L'analisi genomica successiva di questi mutanti di virus del vaiolo di coniglio hanno dimostrato estese delezioni terminali (fino a 30 Kb) del DNA (19,25).

La mutagenesi con l'acido nitroso del ceppo Copenhagen di vaccinia virus ha consentito a Driellien et al (6) di isolare un mutante dello spettro di infettività mancante nella replicazione nella massima parte delle cellule umane. L'analisi del genoma di questo mutante ha messo in evidenza una estesa delezione di circa 18 Kb verso l'estremità sinistra (6). Ulteriori analisi mediante studi di trasferimento del marcatore hanno mappato la funzione genetica responsabile dello spettro di infettività fino a un frammento EcoRI da 5,2 Kb (14) e alla fine fino ad uno schema di lettura aperto da 855 bp che si sovrappone ai frammenti HindiII M/K (15).

Il gene di spettro di infettività del ceppo WR di virus vaccinici (27,30) é situato tra 24 e 25,2 Kb dall'estremità sinistra del genoma vaccinico. Questo gene dello spettro di infettività trascritto verso sinistra da Hindl11 K in Hindl11 M, é descritto qui come il gene K1L seguendo la nomenclatura raccomandata da Rosei et al. (33).

Un mutante di delezione del gene dello spettro di infettività del ceppo WR vaccinico é stato generato inserendo il gene della resistenza alla neomicina da Tn5 "transposon" e mediante selezione con l'antibiotico G418. Questo ricombinante/delezione, vP293, é mancante di circa 21,7 Kb di DNA iniziando 3,8 Kb dall'estremità sinistra del genoma. vP293 é in grado di formare placche su fibroblasti primari embrionali di pollo (CEF), su due linee di cellule di scimmia (BSC-40 o VERO) ma non é in grado di replicarsi nella linea di cellule umane MRC-5. L'inserimento di un gene dello spettro di infettività, K1L, in vP293 ripristina la capacità di crescita su cellule MRC-5.Si é costruita una serie di plasmidi che oltre al gene dello spettro di infettività K1L contiene un promotore vaccinico iniziale/tardivo, K6, preferibilmente seguito da siti di restrizione multiclonanti di sequenza "polylinker ", codoni di inizio e di terminazione della traduzione e un segnale di terminazione di trascrizione precoce. Questi plasmidi pMP528HRH e pHESl-4, tengono conto della fase singola rapida, clonazione ed espressione di un qualsiasi schema di lettura aperto quando vengono ricombinati con vP293 e vengono valutati per la crescita su cellule MRC-5. L'inserimento di uno schema di lettura aperto estraneo in questi plasmidi seguito dalla ricombinazione con vP293 ripristinerà contemporaneamente la funzione dello spettro di infettività (gene K1L) e introdurrà lo schema di lettura aperto estraneo nel virus di recupero, vP293. I virus ricombinanti vengono identificati dalla loro capacità di formare placche su cellule MRC-5.

I vantaggi di questo sistema comprendono la mancanza di qualsiasi gene esogeno non vaccinico nel ricombinante finale diverso dall'elemento genetico che interessa, nessuna inversione genetica del virus poiché vP293 é un mutante di delezione di K1L, e la rapida identificazione in una fase di ricombinanti. Questa singola fase può anche venire usata per la selezione rapida di espressione del gene estraneo per esempio per la mappatura epitopica.

Si sono costruiti ulteriori plasmidi contenenti il gene dello spettro di infettività K1L in cui il promotore iniziale/tardivo H6 é stato sostituito o con un promotore vaccinico strettamente iniziale oppure con un promotore vaccinico strettamente tardivo. Con tali ulteriori plasmidi si possono studiare le sottigliezze di una regolazione temporanea di espressione di elementi genetici estranei.

I sistemi ristretti dello spettro di infettività della presente invenzione vengono usati vantaggiosamente in vaccini per indurre una risposta immunologica in un ospite inoculato con il vaccino. A questo riguardo, il vaccino comprende una sostanza--veicolo e un virus ricombinante modificato. Il virus ricombinante modificato ha geni dello spettro di infettività cancellati da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite. Inoltre, il virus ricombinante modificato contiene DNA che codifica ed esprime un gene nell'ospite con replicazione ristretta di un virus nell'ospite. Si sono costruiti virus ricombinanti modificati che esprimono prodotti di geni, in particolare antigeni con una replicazione ristretta del virus a causa della delezione dei geni dello spettro di infettività nel virus. In una forma di realizzazione, l'ospite é un vertebrato e 1 'antigene provoca una risposta immunologica nel vertebrato. In un'altra forma di realizzazione l'ospite é una cellula coltivata in vitro. Si può facilmente comprendere che per la restrizione dello spettro di infettività si possono valutare ulteriori virus e ulteriori specie oltre a quelle citate in questa domanda. Inoltre, si può facilmente capire che in poxvirus esistono ulteriori "geni dello spettro di infettività". Inoltre, si può facilmente comprendere che in questi mutanti dello spettro di infettività si può utilizzare una certa varietà di geni estranei.

Si avrà una migliore comprensione della presente invenzione e dei suoi molti vantaggi dagli esempi che seguono riportati a titolo illustrativo.

In alcuni di questi esempi, si é utilizzato il ceppo WR di un virus vaccinico. La sua origine e le condizioni di coltura sono state descritte in precedenza (27). In alcuni di questi esempi si é utilizzato il ceppo "Copenhagen" di virus vaccinico. La sua origine e le condizioni di coltura sono state descritte in precedenza (50). Fibroblasti primari embrionali di pollo (CEF), linee di cellule di scimmia (VERO^/ATCC CCL81/ e BSC40), e la linea di cellule umane MRC-5 (ATCC^ CCL171) sono state sottoposte a coltura in un mezzo essenziale minimo di Eagle (MEM) contenente 5% (VERO e BSC40) oppure 10% (MRC-5, CEF) di siero bovino fetale (FBS).

I plasmidi sono stati costruiti, sono stati vagliati e sono stati fatti crescere mediante procedimenti standard (22,31,32).

Esempio 1 - costruzione del plasmide pMP528PiN e generazione di vP293

Riferendosi alla figura 1A, si é isolato un frammento EcORI/SalI che comprende l'estremità terminale sinistra da 3,8 Kb di DNA vaccinico da pAG5 (30) e lo si é inserito in pUC13 precedentemente tagliato con EcoRI e Sali. Il plasmide risultante, pMP5, é stato sottoposto a digestione con Hindl11 e SaJ.1 ed é stato sottoposto a legatura con un frammento Hind111/Sa_lI da 3,8 Kb contenente sequenze di vaccinia corrispondenti all'estremità destra del frammento vaccinico HindlII K. Il plasmide risultante pMP528 contiene così 3,8 Kb dell'estremità sinistra del genoma vaccinico e 3,8 Kb a partire dall'estremità destra del frammento HindlII K che cancella i 21,7 Kb intermedi tra i siti Sali in corrispondenza di 3,8 e 25,5 Kb dalla estremità sinistra del genoma. Il sito unico Sali in pMP528 é stato cambiato in un sito Smal mediante aggiunta di "linkers<1>' sintetici (disponibili in commercio dalla Collaborative Research, Ine., Bedford, Mass.) che producono pMP528 L. Un frammento Smal da 1,4 Kb contenente il gene per la neomicina-fosfotrasferasi ottenuto da transposon Tn5 (1) é stato isolato da pSV2-neo (35, ATCC# 37149) ed é stato posto sotto il controllo di un promotore vaccinico iniziale (denomato qui come Pi).

Il promotore Pi, ottenuto dalla regione Avai H di vaccinia é stato descritto (37). Più in particolare, questo promotore é derivato dal frammento Avai H (XhoI 6) del ceppo vaccinico WR variante L in cui il promotore dirige la trascrizione da destra verso sinistra. La disposizione nella mappa del promotore é circa 1,3 Kb distante dall'estremità a sinistra di Avai H, circa 12,5 Kb dall'estremità sinistra del genoma vaccinico ed é circa 8,5 Kb a sinistra della giunzione HindlII C/N.

Il promotore é stato localizzato mediante analisi di mappatura di trascrizione standard. La sequenza Pi DNA corrisponde alla regione a monte a partire dallo schema di lettura aperto che codifica per una proteina ricca in glieina 5 kDa recentemente descritta (40). Questo elemento promotore é stato dimostrato che esprime geni estranei in ricombinanti vaccinici in corrispondenza d1 tempi precoci dopo 1<1 >infezione (37).

Una "cassette"I neogene/promotore Pi Smal-terminato é stata sottoposta a legatura nel sito Smal di pMP528L che produce pMP528PiN. Il pMP528Pin contiene 0,4 Kb di sequenze vacciniche derivate dal subclone Sau3A di Avai H contenente la regione del promotore Pi seguito da 1 Kb di sequenze Tn5 provenienti da BglII attraverso i siti Smal. (1).

Il pMP528PiN é stato trans i nfettato in CEF primari ed é stato coinfettato con il virus vaccinico di recupero, VTK 79, mediante procedimenti standard (28). Il virus ricombinante é stato selezionato ed é stato fatto crescere su CEF primari in presenza di 300 ug/ml di G 418 (1,11,35).

Le configurazioni genomiche di vaccini ricombinanti vP293 sono state confermate mediante analisi di ibridazione a macchie di Southern. I vaccini ricombinanti vP293 erano stati cancellati di 21,7 Kb di vaccino come previsto e contenevano il gene estraneo che codifica neo . La mappa di restrizione dell'estremità sinistra del virus di recupero BTK-79 e del virus ricombinante vP293 che esprime il neo gene e selezionato su CEF primari in presenza di G418 viene indicata nelle figure 1B e 1C.

In assenza dell'antibiotico G418, il vP293 ha prodotto placche grandi su CEF primari e forma placche bene su cellule BSC40 o VERO sebbene le placche vP293 evidentemente siano più piccole delle cellule originarie VTK79 su VERO.

In modo significativo, il vP293 non ha dato una replicazione misurabile e non é stato in grado di formare placche sulla linea di cellule umane MRC-5.

Esempio 2: Ricostruzione di vP293 con il gene di spettro di infettività K1L

Per dimostrare che il gene di spettro di infettività, K1L, quando viene ricostituito nel mutante di delezione vP293 del ceppo WR di vaccino consentirebbe al virus di replicarsi su cellule umane, il gene di spettro di infettività, K1L, é stato clonato nel plasmide pMP 528 L ed é stato inserito in vP293.

Riferendosi ora alla figura 2A, la sequenza di DNA del vaccino che costituisce il braccio destro del pMP528 L (figure 1A e 2A) é stata accorciata per eliminare siti di restrizione non desiderati e per facilitare le future fasi di clonazione. Il pMP528L é stato tagliato con EcoRV/HindlII. é stato smussato nell'estremità con il frammento Klenow della polimerasi di E.Coli ed é stata sottoposta ad autolegatura. In questo modo, il braccio destro del plasmide risultante pMP528E é stato ridotto in lunghezza a 0,4Kb di DNA.

Si è preparato un frammento vaccinico BglII (parziale)/Hpal da 891 bp contenente tutta la sequenza codificante e il promotore dal gene di spettro di infettività K1L(15) da pSD452VC un subclone del vaccino del ceppo Copenaghen contenente sequenze provenienti da Hindi11 M e K. Il frammento contenente H1L é stato clonato nella regione "poly1inker " di pUC8 con l'unico scopo di fiancheggiare il gene con opportuni siti di restrizione. Il plasmide risultante pUC8 HR é stato sottoposto a digestione con HindlII e Smal in modo da isolare il frammento contenente K1L. L'estremità HindlII é stata completata con il frammento klenow della DNA-polimerasi di E.Coli e il frammento é stato clonato nel sito Smal di pMP528E. Un plasmide pMP528HR con l'orientamento della lettura del gene di spettro di infettività K1L verso sinistra come mostrato nella figura 2A é stato isolato mediante procedimenti standard.

Procedimenti per la ricombinazione e la ibridazione su filtri di nitrocellulosa sono stati effettuati come é noto nel settore e come descritto in precedenza (28) con le seguenti modifiche.

Il plasmide pMP528HR donatore é stato introdotto mediante elettroporazione o nelle cellule VERO oppure nelle cellule MRC-5 ciascuna coinfettata con vP293. Monostrati subconfluenti di cellule VERO oppure MRC-5 sono stati infettati con un virus di recupero per un'ora. Le cellule sono state raccolte con tripsina e sono state lavate con soluzione salina tamponata Hepes (HeBS) (16) e sono state sottoposte a elettroporazione in presenza di 25 ug di plasmide-DNA in HeBS. Le cellule infettate con il virus sono state sottoposte a elettroporazione in un Bio-Rad Gene Pulser dotato di un dispositivo di amplificazione della capacitanza del generatore di impulsi dei geni Bio-Rad. La sospensione di cellule (0,8 mi) é stata posta su ghiaccio per 10 minuti in una vaschetta del generatore di impulsi per geni Bio-Rad, quindi é stata sottoposta a impulsi a 200 volt (capacitanza 960 uFD) ed é stata posta su ghiaccio ancora per 10 minuti. Le cellule sono state quindi diluite in 8 mi di MEM 53⁄4 FBS, sono state seminate in piastre da 60 mm contenenti corrispondenti monostrati di cellule VERO oppure MRC-5 (4 mi per piastra) e sono state fatte incubare a 37°C durante la notte.

La generazione è stata raccolta ed é stata posta in piastre su cellule VERO oppure MRC-5. Il numero di placche ottenute su cellule VERO era da 10 fino a 100 volte maggiore del numero di placche ottenute su cellule MRC-5. Le placche isolate (di diametro uniforme) sono state prelevate dalle colture di cellule MRC-5 e dalle colture di cellule VERO (piastrine sia di dimensioni grandi che piccole). Queste porzioni isolate di placche sono state riseminate su cellule VERO e dopo 3 giorni le placche ottenute sono state asportate su piastre di filtro di nitrocellulosa e sono state preparate per la ibridazione in sito (26). Tutte le placche derivanti dalle cellule MRC-5 e tutte le placche più grandi però non le placche di dimensioni più piccole derivate dalle cellule VERO hanno dato segnali di ibridazione positiva quando sono state esaminate con

32

una sonda marcata con P verso le sequenze codificanti K1L. Questo dato é in accordo con il ripristino di funzioni di spettro di infettività ottenute nella sequenza codificante K1L.

Una porzione isolata ottenuta dalle cellule MRC-5 é stata ulteriormente purificata ed é stata caratterizzata con la sigla vP457. In vP457 il gene K1L é stato ripristinato ed é stato disposto all 'interno della delezione nella sua lettura di orientamento naturale da destra verso sinistra. Le sequenze K1L avevano sostituito la cassetta promotore Pi/gene della neomi ci na-f osf otrasf erasi presente in vP293 come viene mostrato nelle figure 2B e 2C. In confronto al genoma del vaccino della variante L (30,27) il vP457 contiene una delezione da 291bp verso la parte destra del gene K1L e una delezione da 20,2 Kb verso la parte sinistra del gene K1L.

Esempio 3: Costruzione di plasmidi pMP528HRH e pHESI-4

Per dimostrare che la mutazione letale condizionale in vP293 potrebbe venire sfruttata per costruire plasmidi donatori nei quali si potrebbero clonare ulteriori schemi di lettura aperta, si é costruita una serie di plasmidi pMP528HRH e pHESl-4. La ricombinazione di schemi di lettura aperta esogeni presenti in un plasmide contenente il gene di spettro di -infettività K1L in vP293 darebbe un semplice metodo per la generazione di ricombinanti vaccinici in virtù della restrizione dello spettro di infettività.

Un promotore vaccinico, H6, é stato aggiunto a monte a partire dal gene K1L In pMP528HR. Questo promotore iniziale/tardivo é stato precedentemente identificato mediante una mappatura di trascrizione standard e mediante un'analisi della sequenza di DNA. Esso ha la sequenza (posizioni da -125 fino a 3) ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGT TGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATAT CCGTTAAGTTTGTATCGTAATG. La sequenza é quella descritta come posta a monte di uno schema di lettura aperto H6 da Rosei et al. (33).

Riferendosi ora alla figura 3, il ONA corrispondente alle posizioni da-124 fino a -1 (con la posizione -102 cambiata da A a G allo scopo di impedire l'introduzione di eventuali codoni di inizio potenziale) e seguito da siti di restrizione Xhol. KpnI, e Smal é stato sintetizzato chimicamente (figura 3B) ed é stato clonato nel sito Smal del pMP528HR che produce pMP528HRH (figura 3A). Così il pMP528HRH contiene il promotore H6 a monte dal gene K1L che viene espresso sotto il controllo del promotore endogeno K1L. Entrambi hanno un orientamento da destra verso sinistra rispetto alle braccia del vaccino (genoma). Il promotore H6 in pMP528HRH si trova immediatamente a monte dei siti di restrizione unici Xhol. KpnI. e SmaI-Per aumentare ulteriormente l'utilità del sistema una serie di plasmidi pHES 1-4 sono stati derivati da pMP528HRH. Il pHESl é stato costruito mediante il seguente procedimento: il pMP525HRH é stato tagliato con Xhol e Xmal. e gli oligonuc1eotidi HRL1

5'(TCGACCATGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTT TAT)31 e HRL2

51{CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCA TGG)3' sono stati clonati in questo sito. In modo simile sono stati costruiti pHES2, pH£S3 e pHES4. Il pHES2 é stato costruito con gli oligonucleotidi HRL3 5‘(TCGACCATGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTGAGTAAATAAATAATTTT TAT)31 e HRL4

5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCC ATGG)3', il pHES3 é stato costruito con gli oligonucleotidi HRL5

5'(TCGACCATGGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATT TITAT)3* e HRL6

5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCC CATGG) 3‘ e il pHES4 é stato costruito con gli oligonucleotidi HRL7

51(TCGAGGATCCCGGGTACCGAGCTCTAAATAAATAATTTTTAT )3' e HRL8

5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTAGAGCTCGGTACCCGGGATCC )31.

Gli elementi di sequenza di DNA relativi, i siti di rescrizione e i segnali di trascrizione e di traduzione di pMP528HRH e pHESl-4 sono i seguenti:

La sequenza del promotore H6 sintetico {posizioni da-124 fino a -1, con la base alterata in corrispondenza della posizione -102sottolineata) e siti di restrizione a valle presenti in pMP528HRH vengono mostrati nella figura 3B.

La sequenza posta tra parentesi é sostituita in pi asmi di pHESl-4, con siti di restrizione, con codoni di arresto e con un segnale di terminazione della trascrizione iniziale come indicato, come viene mostrato in Fig 3C per pHESl , in fig. 3D per pHES2, in fig. 3E per pHES3, e in fig. 3F per pHES4.

Oltre agli elementi contenuti in pMP528HRH, ciascun plasmide pHESl-3, contiene un codone di inizio della traduzione a valle dal promotore H6 seguito da siti di restrizione multipli particolari, da sequenze del segnale di terminazione della traduzione e da una sequenza di segnale di terminazione della trascrizione iniziale vaccinica specifica (39). Ciascun plasmide, pHESl-3, contiene un codone di inizio della traduzione in uno dei tre schemi di lettura. Pertanto una qualsiasi sequenza di DNA che contiene uno schema di lettura aperto può venire espressa quando viene clonata in uno di questi plasmidi e viene ricombinata nel vacciniavi rus .

Il quarto plasmide, pHE S4 „ non contiene un codone di inizio di traduzione ma contiene in effetti siti di restrizione multipli particolari, sequenze di terminazione della traduzione e una sequenza di segnale di terminazione della trascrizione iniziale. Una sequenza di ONA che contiene uno schema di lettura aperto e un codone di inizio può venire espressa quando viene clonata in pHES4 e viene ricombinata in virus vaccinico.

Esempio 4: Incorporazione del gene LACZ batterico in virus vaccinico e selezione dei virus ricombinanti sulla base di una restrizione dello spettro di infettivita

Per dimostrare l'utilità del sistema di selezione dello spettro di Infettività pHESl-4/-vP293, si é costruito un virus vaccinico ricombinante contenente il gene lacZ di E.Coli che codifica per la B-galattosidasi.

Un frammento BamHI contenente codoni 8 attraverso l'estremità del gene lacZ é stato ottenuto da pMC1871 (34). Questo frammento lacZ BamHI é stato clonato nel sito unico BamHI dei plasmidi pHESl-4.

Si é effettuata una ricomblnazione tra i plasmidi pHESLZl-4 ottenuti transinfettati singolarmente in cellule VERO coinfettate con il mutante di spettro di infettività vP293.

24 ore dopo l'infezione, si é raccolto il virus della discendenza mediante 3 cicli di congelamento/scongelamento e sono stati seminati in piastre su cellule VERO (tabella 1A) oppure su cellule MRC-5 (tabella 1B e 1C).

Monostrati di cellule VERO e MRC-5 (tabella 1A e 1B), colorati con rosso neutro, sono stati trasportati dopo 3 giorni su filtri di nicrocellulosa e sono stati preparati per una ibridazione in situ (26} usando una sonda del gene lacZ marcato 32

con P. I monostrati VERO (dati non mostrati) e MCR-5 (Tabella 1C) sono stati esposti a X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galattopiranoside Boehringer Mannheim) e dopo 8 ore si é valutato lo sviluppo del colore blu.

Quando la discendenza é stata seminata in piastre su cellule VERO e l 'espressione della B-gal attosi dasi é stata esaminata in presenza di X-gal non si sono osservate placche blu in cellule transinfettate con pHESLZI , 2 o 4. In modo significativo, circa il 20% delle placche generate con il plasmide PHESLZ3 hanno dato placche blu in presenza di X-gal (dati non mostrati). Quando la discendenza é stata seminata in piastre su cellule VERO e i virus ricombinanti sono stati selezionati mediante ibridazione in situ, da 12 fino a 22% delle placche hanno dato segnali di ibridazione positivi verso lacZ {tabella 1A). Quando si é analizzata mediante ibridazione di DNA in situ (26) ogni placca su MRC-5 ha dimostrato la presenza del gene lacZ (tabella 1B). Tuttavia, l'attività di B-galattosidasi é stata vista soltanto in quelle placche su MRC-5 che erano derivate da pHESLZ3 (tabella 1C). Soltanto la struttura di plasmide pHESLZ3 aveva il gene lacZ nello schema con il codone di inizio della traduzione .

Tabella 1. Analisi del virus vaccinico/1acZ ricombinante generato con i plasmidi pHESLZl-4 e con il virus vaccinico vP293.

pi asmi de donatore

PHESLZ1 PHESLS2 PHESLZ3 PHESLZ4

A. piastrine totali 1056 637 753 1344 ibridazione

positiva 153 141 95 2c5 percento positivo 14-5 22 12 20

B. piastrine totali 60 56 ND

ibri dazione

60 56 ND 71 positivo

100 100 100 percento positivo

c. pi astrine totali 60 55 59 70

0 0 59 0 X-gal positiva

percento positivo 0 0 100 0 Esempio 5 - Costruzione di plasmidi pHES31-34 e PHES61-64

Per dimostrare che la mutazione letale condizionale di vP293 potrebbe venire utilizzata per la costruzione di ulteriori plasmidi donatori e per ampliare il sistema di selezione dello spettro di infettività basato su vP293 di WL vaccinico, la serie di plasmidi pHES (esempio 3)- é stata ampliata sostituendo il promotore vaccinico iniziale/tardivo H6 con altri promotori temporaneamente regolati. Si sono generati i plasmidi pHES31-34 e la serie di plasmidi pHES 61-64 per regolare l'espressione di geni estranei rispettivamente iniziale oppure tardiva.

E' stata riportata (43) la localizzazione e la sequenza del gene per una proteina da 38 kDa nel virus del vaiolo bovino richiesto per la formazione di pustole rosse (emorragiche) sulla membrana corio allontoidea di pollo (CAM). Questo gene _u, viene espresso notevolmente in corrispondenza di tempi precoci dopo infezione. Il gene JJ é situato in un frammento NcoI-HaelII da 1465 bp.

La regione del genoma del virus vaccinico del ceppo Copenhagen contenente l'equivalente del gene u^ del vaiolo bovino é stato determinata mediante analisi di colorazione di Southern (44) impiegando un DNA di vaiolo bovino clonato come sonda. L'equivalente Copenhagen del gene u^ di vaiolo bovino si mappa in Hi nd III B, e corrisponde alla posizione del gene nel virus vaccinico del ceppo WR di cui si é riferito recentemente (45). Nel vaiolo bovino la regione del promotore £ é situata a valle da un sito Ncol in corrispondenza di -294 (43). Si é esaminata la sequenza del DNA contenente l 'equivalente del gene £ Copenaghen e il promotore (46). L'equivalente del gene _u Copenaghen é non funzionale in quanto come risultato dà la formazione di pustole bianche per il virus vaccinico Copenaghen coltivato su CAM a causa di mutazioni "frameshift" (di alterazione dello schema di lettura) all'interno della regione codificante. La regione a monte é altamente omologa rispetto alla regione del promotore di vaiolo bovino ed é funzionale. Il vaccino ricombinante contenente β-gal attosi dasi di E. coli espresso sotto il controllo del promotore u^ del vaccino Copenaghen forma placche blu in presenza del substrato cromogenico X-gal . Come nel vaiolo bovino, il genoma Copenaghen contiene il sito Ncol a monte della regione del promotore JJ. Per spostare la regione del promotore u^ Copenaghen verso il sistema pHES, si é aggiunto un sito Hind111 al sito NcoI a monte dal promotore mediante legatura con oligonucleotide HRL14 {5' CATGGAAGCTTC 3'; sito Hindl11 sottolineato). Si é isolato un frammento HindlII~C1al da 299 bp contenente la regione del promotore _u derivante dal sito Ncol attraverso il sito Clal in corrispondenza di -6. Il promotore H6 é stato rimosso da pHESl (esempio 3) mediante parziale digestione con HindlII, seguita da digestione con KpnI. Riferendosi ora alla figura 4, si é isolato un frammento di vettore HindlII-Kpnl da 7,8 kb da un gel di agarosio (figura 4A). Per sostituire le sequenze del promotore a valle del sito Clal e delle sequenze "polylinker " attraverso il sito Kpnl, si sono sintetizzati otto oligonucleotidi, HRL15 fino a HRL22 (figura 4B). Coppie di oligonucleotidi sono state avvolte e sono state sottoposte a legatura con il frammento-vettore HindlII-Kpnl da 7,8 kb ottenuto da pHESl e con il frammento promotore HindlII-Kpnl che genera i plasmidi pHES31-34 (figura 4A).

Riferendosi ora alla figura 5, i plasmidi ottenuti, pHES31 fino a pHES34, contengono regioni "polylinker" a valle della regione del promotore £ Copenaghen (figura 5). La sequenza DNA da 0,3 kb che specifica il promotore £ viene indicata in figura 5 soltanto per il plasmide pHES31. La sequenza identica é presente nei pìasmidi pHES32 fino a pHES34. La sequenza posta tra parentesi che segue la regione del promotore in pHES31 é sostituita dalle sequenze poste tra parentesi indicate per pHES32 fino a pHES34. Sono indicati i siti di restrizione. In pHES31 fino a pHES33, la regione di polylinker é situata a valle dal ATG di inizio nei tre differenti schemi di lettura. Il plasmide pHES34 non contiene un ATG di inizio. In tutti i membri della serie pHES31 fino a pHES34, la regione di polylinker é seguita da codoni di arresto della traduzione in tutti e tre gli schemi di lettura, sottolineati, seguiti dalla sequenza TTTTTAT, segnata con una riga al di sopra, che come é stato dimostrato determina la terminazione della trascrizione per geni iniziali in vaccinia {39).

Come con la serie di pìasmidi pHESl fino a pHES4 (esempio 3), la serie di pHES31 fino a pHES34 consente l'espressione delle sequenze codificanti estranee inserite nella regione polylinker. Le sequenze codificanti estranee contengono un codone di inizio e vengono espresse sotto il controllo del promotore u[ vaccinico mediante inserimento in pHES34. Le sequenze codificanti estranee prive di un codone di inizio vengono espresse nell'opportuno schema di lettura mediante inserimento in pHES31, pHES32 o pHES33. Come con la serie originale di pHES, i pHES31 fino a pHES34 contengono il gene dello spettro di intività umano K1L (15). la ricombinazione tra il mutante di delezione vaccinico vP293 (esempio 1) e tutti i derivati plasmidici della serie pHES generano virus vaccinici ricombinanti che vengono selezionati per la loro capacità di crescere sulle cellule umane.

Per adattare ulteriormente il sistema di plasmidi pHES in modo da consentire l'espressione di geni estranei in vaccini rlcombinanti in corrispondenza di tempi tardivi dopo l'infezione, si é scelto il promotore per il gene ATI da 160 kDa di vaiolo bovino (47). La regione da 533 bp immediatamente a monte del gene ATI di vaiolo bovino, quando viene inserita in virus vaccinico, si é dimostrato che dirige elevati livelli di espressione di geni estranei in tempi tardivi dopo l'infezione (48). La regione di DNA di vaiolo bovino da 63 bp che si estende dal sito Bgl11 a monte verso il codone di inizio é sufficiente per agire come promotore per l'espressione di geni estranei in vaccini. Il DNA che determina questa regione del promotore é stato sintetizzato ed é stato inserito nel sistema pHES come descritto dettagliatamente di seguito.

Il promotore H6 é stato rimosso da pHESl (esempio 3) mediante parziale digestione con Hi nd 111 seguita da digestione con BamH I . Riferendosi ora alla figura 6, il frammento di vettore Hi nd I I I -BamHI da 7,8 kb é stato isolato da un gel di agarosio (Figura 6A). Per sostituire le sequenze del promotore H6 con sequenze del promotore ATI di vaiolo bovino e con sequenze legame di BamI a “polyl i nker" , si sono sintetizzati otto ol i gonucl eoti di , da HRL33 fino a HRL40 (figura 6B). Coppie di ol i gonuc 1 eoti di sono state avvolte e sono state sottoposte a legatura con il frammento- vettore Hi ndl I I -BamI da 7,8 kb ottenuto da pHESl che genera i plasmidi pHES61-64. Ciascuna coppia avvolta di ol i gonucl eoti di contiene la regione del promotore ATI di vaiolo bovino sintetico fiancheggia to da siti di restrizione HindlII e BamHI come indicato.

Riferendosi ora alla figura 7, i plasmidi ottenuti, pHES61 fino a pHES 64, contengono regioni polilinker a valle della regione del promotore tardivo ATI di vaiolo bovino (figura 7). La sequenza identica per il promotore ATI di vaiolo bovino che é presente in pHES61 fino a pHES64, viene indicata qui soltanto per HES 61. La sequenza posta tra parentesi che segue la regione del promotore in pHES61 é sostituita con le sequenze poste tra parentesi indicate per pHES62 fino a pHES64. Sono indicati i siti di restrizione. In pHES61 fino a pHES63, la regione polylinker é situata a valle dal codone di inizio ATG nei tre differenti schemi di lettura. Il plasmide pHES64 non contiene un codone di inizio ATG.

Come nella serie di plasmidi pHES contenenti altri promotori, tutti i membri della serie di plasmidi pHES61 fino a pHES64 contengono regioni polylinker seguite da segnali di terminazione della traduzione (sottolineati) e da segnali di terminazione della trascrizione (sovraiineati). Poiché i derivati della serie pHES6ì fino a 64 contengono il gene dello spettro di inferiorità umano K1L vaccinico, i virus della discendenza vaccinici ricombinanti generati dalla ricombinazione di questi plasmidi con vP293 vengono selezionati in base alla loro capacità di crescere su cellule umane.

Esempio 6 COSTRUZIONE DI RICOMBINANTI vP548 e vP661 La sequenza da 15537 bp di DNA situata in vicinanza dell'estremità sinistra del genoma Copenaghen viene mostrato da sinistra verso destra nella figura 8. La sequenza comprende 7218 bp tra il sito SAJI più a destra in HindlIIC e il collegamento C/N e si estende attraverso tutte le sequenze per HindIII N (1544 bp; posizione 7219 -8762), Mudili M (2219 bp; posizioni 8763 - 10981) e HindlII K (4551 bp; posizioni 10982 - 15532). Per chiarezza, le sequenze codificanti e i siti di restrizione vengono localizzati con le posizioni delle basi come indicato in figura 8. Mediante la nomenclatura convenzionale, gli schemi di lettura aperta vaccinici (ORFs) sono designati mediante numerazione da sinistra verso destra entro ciascun frammento HindlII C (33). Poiché i differenti ceppi vaccinici contengono differenze significative verso l'estremità sinistra di HindlII C (il terminale sinistro del genoma vaccinico) , i ORFs situati entro il frammento vaccinico HindlII C sono designati qui effettuando la numerazione da destra verso sinistra partendo in corrispondenza della giunzione HindIIT C/N. In base a questa nomenclatura, il ORF C1L é il ORF più a destra che inizia nel frammento Hiad.111 C del DNA vaccinico Copenhagen (vedere figura 8).

Riferendosi ora alla figura 9, si sono costruiti plasmidi per sopprimere il gene di spettro di infettività umano K1L (15) dal virus copenhagen prevedendo che 11al1ontamento del gene K1L avrebbe portato come risultato alla perdita della capacità del virus così ottenuto a replicarsi in cellule umane. Il frammento D di kj>nl copenhagen, che comprende circa 2,5 kb di DNA verso la sinistra della sequenza presentata in figura 8 e si estende verso destra attraverso la posizione 12998, é stato clonato nel sito ΚρηI del pUC18, dando come risultato p$D435 (figura 9). (nota: nella figura 9 i plasmidi nella serie pSD contenenti gli inserti copenhagen vaccinici compaiono con la designazione "VC" facoltativa. Così il pSD435 é equivalente a pSD435 VC. La designazione "VC" viene tralasciata nella figura 10). Il frammento kjan D contiene il gene klL (posizione 11030-10179). Per facilitare la manipolazione del gene KlL e della sua regione a fianco, si é costruito un subclone di pSO 435 che comprende sequenze tra il sito Sphl (posizione 9478) in HindiII M e il sito C1al in HindIII K (posizione 11731) (figura 9). Il gene KlL viene indicato da un parte tratteggiata, la direzione di trascrizione viene indicata con una freccia. Il pSD452 che contiene due siti HpaI (posizione 9561, 10155) é stato reso lineare mediante parziale digestione con Hpal e i Balli linkers sono stati sottoposti a legatura nel sito Hpal (posizione 10155) immediatamente a valle dal gene K1L. Il plasmide ottenuto é stato tagliato con Bgl 11 ed é stato sottoposto a auto-legatura generando il pSD453. In pSD453, il gene K1L e il suo promotore sono cancellati. Il sito di delezione viene indicato da un triangolo (figura 9). Un frammento contenente le sequenze codificanti della beta-gai attosi dasi (blocco tratteggiato, direzione del gene indicato da una freccia) sotto il controllo del promotore tardivo kDa 11 vaccinico (freccia scura) (49) é stato inserito nel sito JLgJII del pSD453, generando il pSD453BG (figura 9). Il pSD453BG é stato usato come plasmide donatore per la ri combi nazi one con vP410, un derivato minus di ti mi di na-chi nasi del virus vaccinico del ceppo Copenhagen (50). I virus della discendenza sono stati esaminati in presenza di X-gal. Le placche di colore blu sono state prelevate e sono state purificate mediante crescita su cellule VERO. Come previsto, il ricombinante ottenuto, vP548 si é presentato mancante del gene KìL quando é stato sottoposto a sonda con sequenze Kll 32 P-marcate. Sorprendentemente il vP548 formava placche su cellule MRC-5.

Per esaminare se la presenza del gene per la beta-gaiattosidasi in vP548 era attiva nella sua capacità di formare placche su cellule MRC-5, la cassetta 11 kDa/beta-galattosidasi é stata rimossa da vP548 mediante ricombinazione con un plasmide donatore pSD453. Il ricombinante di delezione vaccinico risultante, vP661, formava anch'esso placche su cellule MRC-5.

Esempio 7 IDENTIFICAZIONE DEL GENE DELLO SPETTRO DI INFETTIVITÀ' C7L DAL CEPPO COPENHAGEN DI VIRUS VACCINICO

I risultanti descritti nell'esempio 6 suggeriscono che il K1L non é il solo gene dello spettro di infettività vaccinico in grado di conferire capacità di crescita su cellule umane. Si é esaminata la possibilità che regioni eliminate del virus vaccinico vP293 (esempio 3) e il virus vaccinico mutante di delezione di 18 kb di variazione dell'ospite (14) sono state cancellate per un altro gene che come klL conferisce la capacità di crescere su cellule umane. La figura IO presenta la mappa di restrizione dell'estremità sinistra del genoma del virus vaccinico che mostra le posizione dei geni dello spettro di infettività potenziali. Le mappe HindlII e EcoRI dell'estremità sinistra del genoma del virus vaccinico vengono mostrate nella parte superiore. Vengono indicati soltanto i siti EcoRI relativi. La misura delle delezioni dello spettro di infettività in mutanti di delezione del virus vaccinico vP293 (esempio 3) e la delezione dello spettro di infettività di 18kb (145), come anche la regione cancellata comune ad entrambi i mutanti di delezione vengono mostrate da linee scure. La regione con la sequenza da 15537 bp (figura 8) dal sito SaiL più a destra attraverso il frammento Hiudì11 K é ingrandita. Sono indicati soltanto i siti di restrizione relativi. Le posizioni del geni qui discussi sono Indicate all'interno di spazi aperti. Le posizioni di frammenti usati per esaminare i geni per la loro capacità dello spettro di infettività sono indicate al di sopra di avvallamenti. Le posizioni di inserti vaccinici in plasmidi qui descritti insieme con relativi siti di restrizione vengono anch'essl indicate. Codice: S - SaLI: E = EcoRI: H = Hindl11: Bg = Bg111: kp = ΚρπI; B = BamHI: Sp = SpHI: C = CIal; Hp = Hoal.

Come indicato nella figura 10, la regione di delezione comune alla delezione dello spettro di infettività 18 kb e la delezione in vP293 si estende da un punto indentermiato in EcoRI C verso il sito SaiI in Hindl11 K {posizione 11412). Si é determinato che una funzione dello spettro di infettività mappata al frammento EcoRI K (pos.

7550-12875) (14) e un gene dello spettro di infettività, K1L (posizioni 11030-10179), é stata indentificata in un frammento Bgl11 D da 846 bp (posizione 10271-11116) a partire da EcoRI K (15). Il frammento Bgl11 A (posizione 8645-10270) da EcoRI K non ha ripristinato la crescita in cellule umane. Tuttavia in queste analisi i geni dello spettro di infettività possibili nel frammento EcoRI K che sono situati tra i siti EcoRI (pos. 7749) e BglII (pos.

8644) oppure tra i siti BglII (pos. 11116) sarebbero stati tralasciati. Sarebbero stati tralasciati anche i geni che incrociano i siti EcoRI (pos. 7749), Bolli (pos 8644) o CIal (pos. 11731) di EcoRI K, oppure la giunzione EcoRI (posizione 1295) tra EcoRI C e J.

L'analisi della traduzione degli amminoacidi delle sequenza da 15,5 kb qui descritta rivela 4 geni potenziali che non sarebbero stati esaminati in precedenza (14,15). Tutti e quattro gli schemi di lettura aperti sono orientati da destra verso sinistra. Le posizioni di questi quattro ORFs, C7L (pos 131 4 - 863), N 2 L (pos 7943 - 741 6), MI L {pos 9329 - 7985) e K2L (pos 12367 - 11258) sono indicati in figura 10. Il primo ATG nel M1L ORF é situato in corrispondenza della posizione 9403. Poiché questa posizione é a monte (e verso la destra di) posizioni pubblicate per i siti di inizio della trascrizione per M1L (51) e all 'interno delle sequenze codificanti per il gene M2L, si può interpretare il ATG in corr i spondenza della posizione 9329 come il vero inizio di traduzione del gene M1L.

Tra i quattro geni potenziali, il M1L inizialmente sembrava il candidato più probabile come gene dello spettro di infettività. La sonda DNA marcata con 32 P per l 'incrocio con KÌL reagisce debolmente con le sequenze M1L su una macchia di Sothern (44) (dati non mostrati). La sequenza dei geni M1L nel ceppo Copenhagen di vaccini qui descritti differisce in corrispondenza del terminale amminico dalla sequenza M1L pubblicata nel ceppo WL di vaccini (51). L'inserimento di due basi (posizione 9307, 9312) nella presente sequenza rispetto alla sequenza pubblicata porta come risultato a mutazioni di alterazione dello schema di lettura. Nella sequenza qui descritta, la traduzione inizia in corrispondenza di ATG nella posizione 9329. Nella sequenza riportata (51) la traduzione potenziale da questo ATG sarebbe terminata da un codone di arresto dello schema di lettura in corrispondenza della posizione 9278 e la traduzione di M1L inizierebbe in corrispondenza della posizione 9247. Nella sequenza qui descritta, la traduzione dalla posizione 9329 é continua verso il codone di arresto di MIL precedentemente riportato (posizione 7987). Il risultato netto che é il gene M1L qui descritto contiene 27 amminoacidi extra in corrispondenza del terminale amminico e anche due sostituzioni di amminoacidi rispetto al gene M1L riportato (51). La sequenza per il gene WR N2L é stata anche pubblicata (51). Il gene N2L Copenhagen qui descritto ha 4 sostituzioni di amminoacidi rispetto alla sequenza pubblicata.

L'analisi al computer della proteina codificata dal M1L ORF di virsu vaccinico Copenaghen qui descritto rivela un livello di somiglianza con la proteina K1L del virus vaccinico Copenhagen più elevato rispetto a qualsiasi altra proteina presente nelle basi di dati d1 PIR oppure Swiss-Prot (dati non mostrati). Questi dati, combinati con i dati derivati dall'analisi a macchie di Southern, suggerisce che il prodotto costituito dal gene MIL potrebbe svolgere una funzione dello spettro di infettività simile a quella del prodotto costituito dal gene K1L.

Pertanto, dei quattro geni potenziali dello spettro di infettività umani, il gene M1L é stato esaminato in primo luogo nel sistema di selezione dello spettro di infetta vP293 di virus vaccinico in modo da valutare la sua capacità a consentire la crescita di virus vaccinici su cellule umane. Per ricombinare il gene per MIL e successivi geni nel sistema di selezione vP293, si sono utilizzati come piasmidi-vettori pMP528 (esempio 1) e il suo derivato mMP528E (esempio 2). Il pMP528 é il plasmlde di delezione originale vaccinico dal quale é stato derivato il ricombinante vaccinico vP293. Il pMP528 contiene un sito SaJI in corrispondenza della giunzione di delezione tra le braccia laterali vacciniche derivate da regioni DNA vacciniche C/HindlII K. In pMP528E il braccio sul fianco destro derivato da HindTττ κ DNA vaccinico é stato accorciato e il sito Smal é stato sostituito al posto del sito originale SaLI in corrispondenza della giunzione di delezione HindIII C/HindIII K.

L'esame dei geni dello spettro di infettività vaccinici potenziali nel sistema vP293 viene presentato schematicamente nella figura 11. La mappa HindlII dell'estremità sinistra del genoma del virus vaccinico viene indicata sulla linea superiore. Le posizioni dei geni vengono indicate all'interno di spazi chiusi, la direzione di trascrizione é indicata con frecce. La posizione di frammenti vaccinici usati per esaminare l'attività dello spettro di infettività di geni viene indicata mediante avvallamenti.

Un frammento di DNA che si estende dall'estremità 3' di M2L (posizione 9384, 55 basi a monte del codone di inizio M1L) attraverso il sito Seal (posizione 7906) a valle del MIL é stato sottoposto a legatura in pMP528E tagliato con Smal (fig. 11). Il plasmide ottenuto, pMP528 m, é stato usato come plasmide donatore per la ricombinazione con un virus vaccinico vP293. Sebbene l'analisi con una sonda di DNA 32P-marcato per il gene MIL a rivelato che le sequenze M1L sono state inserite in vaccini, il virus di discendenza non forma placche su cellule MRC-5.

Poiché la dimensione della regione di promotore necessaria per l'inizio di una trascrizione del gene M1L non é nota, é possibile che le 55 basi a monte delle sequenze codificanti M1L nel plasmide pMP528m non erano sufficienti per determinare la trascrizione del gene M1L. Pertanto, si é esaminato un frammento più grande del DNA del virus vaccinico del ceppo Copenaghen contenente geni interi per M2L, M1L e N2L. Un frammento Hpal da 2849 bp (posizioni 7307-10155) é stato ottenuto mediante parziale digestione con Hpal di pSD420, un clone S a L I del DNA del virus vaccinico Copenhagen (posizione 1-10477). Questo frammento Hpal contiene i geni interi per M2L (pos 10043 - 9381 ), M1L (pos 9329 - 7985) e N2L (pos 7943 - 7416). Il frammento Hpal é stato clonato in pMP528E tagliato con Smal (fig. il). Il plasmide ottenuto, designato con pMPm12n2 in Fig 3 é stato usato come plasmide donatore per la ri combi nazi one con vP293. Sebbene l'analisi con sonde di DNA P-marcato hanno indicato che i tre geni si erano inseriti in vaccini, la discendenza virale ricombinante non ha formato placche sulle cellule MRC-5. Ciò ha indicato che M1L e N2L non erano il gene (i geni) dello spettro di infettività presunto. Non si era previsto che M2L fosse il gene di variazione dell 'ospite poiché il gene per M2L é completamente contenuto nel frammento Bgl 11 A di EcoR I K precedentemente esami nato (15).

I geni dello spettro di infettività umani di virus vaccinici possibili rimasti erano K2L che é mancante nel mutante dello spettro di infettività da 18kb ed é tagliato in vP293, e C7L, un ORF in HindlII C che circonda la giunzione EcoRI C/J e ha la capacità di codificare per una proteina da 18 kDa .

II gene K2L qui descritto corrisponde al "ORF K1L1' precedentemente riportato (52) per vaccini del ceppo WR, differendo per due sostituzioni di amminoacidi. Il mutante di delezione di virus vaccinico vP293 contiene la massa delle sequenze codificanti per K2L immediatamente a destra della giunzione di delezione in HindlII K (equivalente al sitoSalI nella posizione 11412). Per esaminare il gene K2L (posizione 12367-11258) per la sua capacità di consentire la crescita virale vaccinica su cellule umane, l'estremità 3' del gene K2L vaccinico é stata ripristinata verso il plasmide pMP528.

Pol i l i nkers si nteti ci MPSYN52

(5' ATTATTTTTATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT ') - ΜΡΞΥΝ53

(5' AGAATTC.GA£CTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT

sono stati avvolti e sono stati sottoposti a legatura nel sito SspI (posizione 11117) a valle del gene K2L in un subclone di pìasmide di Copenhagen Hindl11 K, e si é isolato un frammento Xhol/SaiI contenente l'estremità 3' del gene K2L. Il pìasmide pMP528 é stato tagliato con Sali e il frammento Xhol/SalI contenente l'estremità 3' del gene K2L é stato inserito nell'orientamento corretto (figura 11). Il pìasmide ottenuto, pMP528K2, é stato usato come pìasmide donatore per la ricobminaz1one con virus vaccinico vP293. Ancora una volta, la discendenza virale vaccinica ricombinante non era in grado di formare placche su cellule MRC-5 il che sta ad indicare che il K2L non era un gene dello spettro di infettività umano.

IL gene C7L vaccinico Copenhagen qui descritto corrisponde esattamente sul livello degli amminoacidi con il gene da 18 kDa del MR precedentemente riportato (40). Per esaminare il gene C7L (posizione 1314-863) per la sua capacità dello spettro di infettività, il pìasmide pSD420 é stato tagliato con BamHI e Bql11 e un frammento da 1040 bp che si estende dal sito BamHI in corrispondenza della posizione 624 al sito BglII in corrispondenza della posizione 1764. E' stato isolato questo frammento Bg-111/.BamHI che contiene il gene intero per C7L, é stato legato in pMP528K2 che era stato tagliato con BamHI (figura 11). Quando il plasmide risultante, pMP528C7L, é stato usato come plasmide donatore per la ricombinazione con virus vaccinico vP293, si é prodotta una discendenza virale che forma placche su cellule MRC-5. Ciò ha indicato che il C7L, come il K1L, era un gene dello spettro di infettività in grado di determinare una crescita su cellule umane. Poiché il gene di C7L circonda la giunzione EcoRI C-/J, esso non era stato esaminato in precedenza (14). ESEMPIO 8 DELEZIONE DEL GENE C7L OTTENUTO DAL CEPPO COPENHAGEN DI VIRUS VACCINICO

Poiché come il K1L, il gene C7L di virus vaccinico era in grado di ripristinare la capacità del mutante di delezione vP293 vaccinico del ceppo WR a formare placche su cellule umane, si é esaminato l'effetto di delezione del gene C7L dal ceppo Copenhagen di vaccini sia come delezione singola che come delezione doppia con l'altro gene dello spettro di infettività.

La costruzione di plasmidi per la delezione del gene per C7L e la generazione di ricombinanti vaccinici cancellati per C7L sono presentati schematicamente nella figura 12. Una mappa HindTII dell'estremità sinistra del genoma vaccinico viene presentata sulla linea superiore. Il gene C7L é indicato da uno spazio tratteggiato, la direzione di trascrizione é indicata con una freccia. Il frammento di BamH I -Bai 11 DNA (posizione 725-1 764) derivato dal pi asmi de-pSD420 é stato smussato all 'estremità con il frammento Klenow di polimerasi di E. Coli ed é stato sottoposto a legatura in pl)C18 che era stato tagliato con P vu 11. generando un plasmide pMP4208B (figura 12). Il pMP42QBB é stato reso lineare con EcoRV che taglia all 'interno delle sequenze codificanti per C7L e si é inserito un frammento di DNA terminato con Smal da 3,2 kb costituito dal promotore vaccinico da 11 kDa (freccia scur a/ beta-gai attosidasi (spazio scuro, direzione del gene indicata da una freccia). Il plasmide ottenuto pMPC7LKBG contiene la cassetta promotore/beta-gal attosi dasi da 11 kDa in un orientamento da sinistra verso destra rispetto alle sequenze vacciniche. La ricombinazione é stata effettuata impiegando un plasmide donatore pMPC7LKBG e un virus vaccinico Copenhagen di recupero, vP410, ottenendo come risultanto un ricombinante vaccinico, vP665, che é stato indentifcato come una placca blu i n presenza di X-gal .

Per eliminare il gene C7L da pMP420BB, il plasmide é stato reso lineare tagliandolo in corrispondenza del sito unico Sacl (pos. 999) nel gene C7L, seguito da digestione con esonucleasi Bal31. Si é effettuata una mutagenesi (53) sullo stampo a doppio filamento impiegando un oligonucleotide 46-mer sintetico

MPSYN234 (51 TGTCAT-TTAACACTATACTCATATACTGAATGGATGAACGAATACC Nel plasmide ottenuto, pMPC7À » il gene C7L é cancellato (sito di delezione indicato da un triangolo figura 12), lasciando braccia vacciniche laterali da 140 bp verso la sinistra e da 400 bp verso destra. Il pMPC7£é stato usato come plasmide donatore per rimuovere le sequenze interrotte gene C7L/promotore 11 kDa/beta-galattosidasi da vP665, generando il vP706 che é stato indentificato come una placca incolore in presenza di X-gal. Sia il vP665 che il vP706 crescono su cellule MRC-5. Ciò é previsto poiché questi ricombinanti contengono ancor ail gene dello spettro di infettività K1L.

Per creare un virus privo dei geni per K1L e per C7L, il pMPC7LKBG é stato usato come plasmide donatore per la r1combinazione con il ricombinante di virus vaccinico privato di K1L, vP661. Il virus ottenuto, vP683, é stato selezionato sotto forma di una placca di colore blu in presenza di X-gal. Il gene C7L é stato cancellato dal virus ricombinante vaccinico vP683 mediante ricombinazione con un

plasmide donatore pMPC73⁄4 . Il virus vaccinico

ricombinante a doppia delezione così ottenuto,

vP716, é stato selezionto sotto forma di una placca

incolore in presenza di X-gal. Sia vP683 che vP716

non erano in grado di formare placche su cellule

MRC-5, il che sta ad indicare che la delezione dei

due geni K1L e C7L, é sufficiente per impedire la

crescita di virus vaccinici su cellule umane.

La tabella 2 confronta la capacità di geni di

virus vaccinici a ripristinare le funzioni dello

spettro di infettività in un mutante di delezione

del virus vaccinico, vP293. Ciò che viene

confrontato é la capacità relativa di replicarsi su

cellule umane oppure su cellule di scimmia dopo che

i geni indicati sono stati di nuovo introdotti in

virus vaccinici vP293 mediante ricombinazione

titolo . (pfu/ml)

Virus 9eni i ns£.ri ti VERO MRC-5

VP29 3 M1L 1.7 X IO5 0 VP293 K2L 2.5 X IO5 0 VP293 H2L, M1L, N2L 1.5 x 10s 0 VP293 K1L 1.7 X IO5 4.7 X IO3 VP293 C7L 1.4 X IO5 5.9 x IO3

Esempio 9- GENE DI VAIOLO BOVINO CHE CODIFICA UN PRODOTTO DA 77 kDa

A differenza del virus vaccinia, il virus del vaiolo bovino é in grado di crescere su cellule ovariche di criceto cinese (CHO). Si é identificata una regione del genoma di vaiolo bovino che consente una replicazione del virus vaccinico sulle cellule CHO (54). Il gene di vaiolo bovino e il promotore si mappano in un frammento Hpal da 2,3 kb. Il gene codifica un prodotto di traduzione previsto di 77 kDa. Il gene di vaiolo bovino non ha alcuna omologia significativa in corrispondenza del livello di DNA oppure di proteina verso l'uno o l'altro dei due geni dello spettro di infettività umani di virus vaccinia; K1L (54) oppure C7L qui descritti.

Riferendosi ora alla figura 13, come premessa per esprimere il gene di vaiolo bovino da 77 kDa nei sistemi di vaccini della presente invenzione, il DNA di vaiolo bovino é stato sottoposto a digestione con HPaI e da un gel di agarosio si sono isolati il frammento da 2,3 kb contenente il gene e il suo promotore. Per fiancheggiare il gene con polylinkers, il frammento Hpal di vaiolo bovino é stato sottoposto a legatura in pIB125 sottoposto a digestione con Smal (International Biotechnologies, Ine. New Haven, CT), che genera pCP3 (figura 13).

Per l 'inserimento in vaccini, il gene di vaiolo bovino é stato clonato nella regione di delezione ATI del plasmide vettore Copenhagen pSD494VC come descritto di seguito.

L'equivalente vaccinico della regione del gene ATI di vaiolo bovino nel ceppo WR vaccinico é stato inizialmente localizzato mediante analisi della sequenza di opportuni cloni WR vaccinici impiegando inneschi sintetizzati secondo la sequenza DNA pubblicata in corri spondenza dell'estremità 5' della sequenza codificante ATI di vaiolo bovino (47). In contrasto al vaiolo bovino, il cui gene ATI codifica una proteina da 160 kDa, il gene della controparte vaccinica WR codifica una proteina da 94 kDa (vedere anche 48). Al contrario di WR, il ceppo Copenaghen di virus vaccinico, contiene una delezione da 4,1 Kb che comprende l'estremità 5' del gene equivalente ATI e l 'estremità 3' del gene che lo precede immediatamente. Gli altri dei due ORF sono collegati nello schema in modo da produrre un ORF ibrido da 966 bp. Il plasmide vettore Copenaghen pSD494 VC é un subclone di plasmide Xbal /Bql I I di copenhagen HindlII A in cui il ORF ibrido formato dalla fusione del gene della controparte ATI di vaiolo bovino in Copenaghen e nella sua zona vicina a monte sono sostituiti con una regione di polylinker. La regione di polylinker é costituita dalla sequenza 5' /AGATCTCCCGGGAAGCTTGGATCCGAGCTCCTCGAGGAATTCGTTAAC 3 1 che determina i siti di restrizione Bq1II, Smal, HindlII. BamHI. SstI, Xhol, EcoRI e Hpal.. Il pSD494 VC contieNE 0,7 kb di DNA vaccinico sui fianchi verso la sinistra della regione di polylinker e 1,3 kb di DNA vaccinico laterale verso la destra della regione polylinker.

Da pCP3 si é isolato un frammento EcoRI-BamHI da 2,3 kb contenente il gene da 77 kDa di vaiolo bovino e il suo promotore. Questo frammento é stato sottoposto a legatura nella regione polylinker del pSD494 VC tagliato con EcoRI e JìamHI, generando il plasmide pCP5 (figura 13). Come previsto, la ricombinazione tra pCP5 contenente il gene del vaiolo bovino da 77 kDa e il virus vaccinico Copenaghen vP410 ha prodotto un virus ricombinante, vP695, che era in grado di formare placche su cellule CHO.

Per esaminare se il gene dello spettro di infettività CHO di vaiolo bovino da 77 kDa era anche in grado di determinare la crescita di virsu vaccinico su cellule umane, si é effettuata una ricombi nazione tra plasmide pCP5 contenente il gene da 77 kOa di vaiolo bovino e vP293, il mutante di delezione dello spettro di infettività vaccinico WR che non forma placche su cellule umane. Il virus discendente ricombinante, vP698, ha formato placche su cellule MRC-5. Ciò sta ad indicare che oltre ad essere un gene dello spettro di inività CHO, il gene di vaiolo bovino da 77 kDa, come i geni vaccinici ,K1L e C7L, é anch'esso un gene dello spettro di ttività umano (figura 13).

In base all'osservazione che il gene da 77 kDa del virus di vaiolo bovino é in grado di determinare la crescita di virus vaccinico sia su cellule CHO che su cellule MRC-5 umane, era interessante determinare i ruoli di C7L e K1L, i due geni dello spettro di infetta umani vaccinici, sulla capacità del virus vaccinico di replicarsi in vitro su cellule derivate da altre specie. Inoltre era interessante determinare se altri geni codificati dal vaccino erano necessari in modo specifico per la crescita di virus vaccinico su cellule provenenti da altri specie. Inizialmente, la serie di mutanti di delezione C7L e K1L di virus vaccinici Copenhagen sono stati esaminati per la loro capacità di formare placche su cellule LLC-pKI, una linea di cellule derivata da rene di maiale.

I monostrati confluenti di cellule VERO, MRC-5 e LLC-PKI in piastre da 60 mm sono stati infettati con diluizioni in serie di 10 volte di virus in un volume da 200 ul di Eagles MEM 2% di siero di vitello appena nato. Dopo un periodo di assorbimento di un'ora l'inoculo é stato rimosso e i monostrati sono stati stratificati con 5 mi di MEM di Eagles contenente 0,7% di Seakem Le Agarose e 10% di siero di vitello appena nato. Le piastre sono state fatte incubare a 37°C. Al quarto giorno dopo l'infezione, i monostrati sono stati colorati aggiungendo uno strato ulteriore costituito da 5 mi di agarosio allo 0,6% contenente lo 0,04% di rosso neutro. Sei ore dopo la colorazione si sono osservate placche. Come viene mostrato nella tabella 3A, i mutanti di delezione Copenhagen presentano identiche capacità di formazione di placche su cellule LLC-P-K1 di rene di maiale in confronto a cellule umane MRC-5. I virus ricombinanti che sono stati cancellati per K1L ( v P 661 ) oppure per C7L (vP706), mentre conservavano l'altro gene dello spettro di infettività umano, hanno formato placche sia su cellule MRC-5 che su cellule LLC-PKI. Il virus ricombinante cancellato per K1L e per C7L (vp716) non ha formato placche né su cellule MRC-5 ne su cellule LLC-PK1. Così in base al criterio di capacità di formare placche in vitro sulla linea di cellule LLC-PK1, entrambi i geni dello spettro di infettivià umani vaccinici K1L e C7L sono anch'essi geni dello spettro di infettivià di suini. Come é stato osservato con la linea di cellule umane MRC-5, la presenza di K1L oppure C7L nel genoma vaccinico, é sufficiente a consentire la formazione di placche di virus vaccinico copenhgen su cellule LLC-PK1 di rene di maiale. Come nel caso di geni dello spettro di infità umano vaccinico, K1L e C7L, soltanto i geni dello spettro di infettività suino vaccinici codificati nel ceppo Copenhagen di virus vaccinici poiché il virus vaccinico ricombinante vP716 (K1L ; C7L ) non hanno formato placche su cellule LLC-PK1.

Questi risultati sono stati confermati impiegando ricombinanti di virus vaccinici contenenti i geni dello spettro di infettività inseriti nel mutante di delezione vaccinico di WR, vP293 (tabella 3B). Come previsto, il vP293 che contiene una ampia delezione che circonda il C7L attraverso la regione K1L, non ha la capacità di formare placche su cellule LLC-PK1. L'inserimento del gene per K1L in vP293 é sufficiente a consentire la crescita del ricombinante vaccinico risultante (vP457) su cellule LLC-PK1. Tuttavia, come é stato osservato con cellule umane MRC-5, l'inserimento del gene M1L nel mutante di delezione WR, vP293, non é sufficiente a consentire la formazione di placche del virus risultante {vP596) su cellule LLC-PK1 (tabella 3B).

Quando il gene C7L oppure K1L di virus vaccinico oppure il gene da 77 kda del virus del vaiolo bovino viene inserito nel mutante di delezione di WR, vP 293, si ripristina la capacità di formare placche su cellule umane MRC-5 {tabella 3B). In modo simile, i ricombinanti di virus vaccinici basati su vP293 contenenti o C7L (vP638) oppure il gene di 77 kDa di vaiolo bovino (vP698) forma placche su cellule LLC-PK1. Così il gene da 77 kDa di vaiolo bovino, oltre ad essere un gene dello spettro di infettività per cellule ovariche di criceto cinese (54) e per cellule umane é inoltre un gene dello spettro di infettività per cellule di maiale.

Esempio 10 - CRESCITA DI MUTANTI DI DELEZIONE COPENHAGEN SU LINEE DI CELLULE UMANE

In condizioni usuali di crescita (3 giorni, strato d1 agar Noble Difco), un mutante di delezione WR vP293 non formava placche su monostrati di cellule MRC-5 umane. Tuttavia, facendo aumentare il tempo di incubazione oppure modificando lo strato di agar VP293 si possono formare piccole placche su monostrati di cellule MRC-5. Specificamente, l 'uso di 0,6% fino a 1% di agarosio di Seakem oppure di un agarosio avente un basso punto di fusione per lo

strato, invece di agar, favorisce la formazione di piccole placche di virus vP293 su cellule MRC-5. Una discendenza di vaccini ricombinanti generata mediante ricombinazione tra vP293 e plasmidi a base di pHES contenenti il gene KTL (esempio 3) forma placche grandi su un monostrato MRC-5 che sono chiaramente distinguibili dal fondo di placche piccole vP293. Pertanto, si é esaminata la possibilità di vP293 e del virus di Copenhagen di mutanti di delezione della regione ospite umana a provocare un'infezione ristretta in cellule di MRC-5 e in cellule VERO sotto uno strato di liquido.

In matracci T-75 in doppio si é effettuata la semina con 5 x 10^ cellule MRC-5 oppure cellule VERO. Dopo due giorni, si sono infettati i monostrati confluenti ad un "moi" di 0,01 PFU per cellula (titolo di materiale introdotto 10 Pfu per ogni matraccio) di virus vaccinico come indicato nella tabella 3, con un volume di 0,5 mi di MEM siero di vitello appena nato (NCS). Dopo un periodo di adsorbimento di un'ora, in ogni matraccio si sono aggiunti 10 mi del mezzo. Un matraccio di ciascuna serie é stato fatto congelare immediatamente (campione da 1 hpi: un'ora dopo l'infezione). I rimanenti matracci sono stati sottoposti a incubazione a 37°C fino a 96 ore dopo l'infezione e, quindi, sono stati congelati. Si sono raccolti virus da tutti i campioni effettuando 3 cicli di congelamento e di scongelamento e si sono titolati su cellule VERO.

Si sono infettate cellule di MRC-5 e cellule VERO con un grado di infezione di 0,01 pfu per cellula. Dopo un'incubazione di 96 ore (96 hpi) si sono raccolti in virus e si sono titolati con cellule VERO. I mutanti Copenhagen contenenti delezioni di gene vP661 (C7L+, K.1L ) dello spettro di infettività umano e vP706 (C7L ; K1L ) hanno manifestato una moltiplicazione circa uguale (3 fino 4 1°9^Q) sia sulle cellule MRC-5 che sulle cellule VERO, equivalente al controllo vP410 (C+7L fino a K1L+). Mutanti copenhagen sottoposti a delezione per geni dello spettro di infettività umano vP716 (C7L , K1L ) e vP668 (/C7L fino a K1L/ ) e anche il mutante di delezione WRvp293 (delezione 21,7 kb) hanno messo in evidenza una molteplicazione su cellule VERO circa equivalente a quella di vP410, vP661 e vP706. Una moltiplicazione di virus mutanti di delezione vP716, vP668 e vP293 era definitamente positiva su cellule MRC-5 umane, sebbene fosse drasticamente ridotta in confronto ad una moltiplicazione di questi virus su cellule VERO. Nelle condizioni qui adottate, tutti e tre i virus vaccinici, vP716, vP668 e vP293, che sono deleti per entrambi i geni dello spettro di infettività umano vaccinico K1L e C7L sono in grado di provocare un'infezione, però notevolmente ristretta, di cellule MRC-5 umane (una moltiplicazione di circa 10 volte durante un periodo di infezione di 96 ore). Questi risultati, riportati nella tabella 4, concordano con comunicazioni precedenti riguardanti una moltiplicazione di 2,3 volte nel corso di un periodo di infezione inferiore di 36 ore (6).

TABELLA 4 CRESCITA DI MUTANTI DI DELEZIONE VACCINICI SU CELLULE VERO E SU CELLULE MRC-5

Titolo a 96 hpi Moltiplicazione di virus

delezioni VERO MRC-5 VERO MRC-S

vP410 1.9 x IO7 1.0 x IO6 5538 6250

vP661 X1L 3.8 x IO7 1.1 x IO7 9268 3235

vP706 C7L 2.3 x IO7 8.6 x IO6 10000 3440

vP716 C7L, K1L 1.3 x IO7 3.4 x IO4 4375 11

vP668 [C7L - K1L ] 8.0 x IO6 6.4 x IO4 2857 21

vP293 [WR 21.71cb] 6.9 x IO6 6.4 x IO3 3833 7 1titolo di introduzione di materiale 103

2

rapporto tra il titolo a 96 hpi (ore dopo l'infezione) e titolo a 1 hpi (fine del periodo di adsorbimento).

Per determinare se virus vaccinici deleti per 1 geni dello spettro di infettività umano C7L e H1L fossero capaci di una moltiplicazione limitata su linee di cellule umane diverse da MRC-5, si § esaminata (tabella 5) la moltiplicazione di mutante di virus vaccinico Copenhagen vP668 /delezione C7L fino a H1L) su ulteriori 3 linee di cellule umane in confronto a cellule di MRC-5 e a cellule VERO.

Si sono seminate cellule in piatte da 60 mm a una concentrazione di 1,5 x 10 cellule per piatta, 2 giorni prima dell'infezione. Si sono aggiunti virus vaccinici vP410 e vP668 a una dose di 0,01 pfu per cellula in un volume di 0,5 mi di MEM+5% di siero di vitello appena nato (NCS) a piatte in doppio contenenti monostrati di ciascuna linea di cellule. Dopo un periodo di adsorbimento di un'ora, si sono aggiunti 4 mi di mezzo a ciascuna piatta e si sono fatte congelare metà delle piatte (campioni di 1 hpi). Si sono sottoposte ad incubazione le rimanenti piatte a 37°C fino a 96 hpi, quindi si sono fatte congelare (campioni da 96 hpi). Tutti i campioni sono stati raccolti effettuando 3 cicli di congelamento e di scongelamento e si sono titolati i virus su cellule VERO. Si sono infettate due piatte per ciascun tempo e si sono calcolati i titoli come valore medio. La moltiplicazione di ciascun virus su ciascuna linea di cellule viene espressa come il rapporto tra il titolo ottenuto a 96 hpi e il titolo a 1 hpi .

Tabella 5 Moltiplicazione dei virus vaccinici Copenhagen vP410 e vP668 su linee di cellule di scimmia e su linee di cellule umane^

^Linee di cellule usate: VERO: cellule di rene di scimmia ATCC CCL 81; MRC-5: cellule di polmone di embrione umano aATCC CCL171; HELA:cellule di carcinoma di epitelioide della cervice umana ATCC CCL2; WISH: amnione umano (marcatore HELA) ATCC CCL 25; Detroit: cellule di prepuzio umano ATCC CCL54.

2

resa percento vP669/vP410 per ciascuna linea di cellule é il rapporto tra la moltiplicazione di vP663 (96 HPI/1 hpi) e la moltiplicazione di vP410 (96 hpi/Ihpi)x 100.

Il virus vP668 presenta una moltiplicazione logaritmica su cellule MRC-5 durante un periodo di incubazione di 96 ore. La resa del virus vP668 96 ore dopo l'infezione (hpi) di una linea di cellule di Detroit (prepuzio umano) é 2,8 volte il titolo che si trova dopo adsorbimento del virus (1HPI). Nel caso di linee di cellule WISH (amnione umano) e di cellule HELA (carcinoma di epitellioide di cervice umana), la resa di virus vP668 a 96 hpi era inferiore a quella osservata dopo l'adsorbimento ad 1 hpi, e ciò stava ad undicare che non si aveva avuta alcuna replicazione virale del mutante vP668 di delezione dello spettro di infettività vaccinico su queste linee di cellule. Si sono potute usare tutte le linee di cellule per virus vaccinici, come indicato dalla moltiplicazione di virus di controllo vP410. Inoltre, si sono trovate altre differenze nella possibilità di diverse linee di cellule umane a favorire la crescita del loro mutante nella regione ospite (6).

Esempio 11. MUTANTI DELLO SPETTRO DI INFETTIVITÀ' DI VIRUS VACCINICI COME VETTORI VACCINICI

Mutanti dello spettro di infettività di virus vaccinici sono in grado di realizzare vantaggi come vettori di vaccini ricombinanti. Una diminuzione di replicazione oppure l'assenza di replicazione farà aumentare la percezione di sicurezza, poiché il vettore virale manca di replicazione nelle specie considerate, per esempio l'uomo o il maiale, come descritto sopra. Ciò farà diminuire, vantaggiosamente, la possibilità che avvenga un'infezione senza ritorno dovuta ad una vaccinazione nell'individuo vacinato e, inoltre, farà diminuire la trasmissione da individuo vaccinato a individuo non vaccinato oppure la contaminazione ambientale.

A questo scopo, questi mutanti dello spettro di infettività sono utili vettori di vaccini. Il mutante di delezione vP293 (esempio 3) accoglie un elemento genetico estraneo. Inoltre, a questo scopo, si sono qui costruiti e vengono qui descritti ricombinani contenenti geni di virus della pseudorabbia (un vaccino di maiale pertinente) e ricombinanti che esprimono glicoproteina di virus della rabbia (che é importante non soltanto nel caso di applicazioni nel settore veterinario ma anche nel caso di applicazioni nel settore umano). Si può facilmente comprendere che si possono impiegare svariati geni estranei in questi mutanti dello spettro di infettività. Inoltre, si può facilmente comprendere che si possono valutare ulteriori specie oltre quelle citate in questa domanda di brevetto per la restrizione della variazione dell'ospite di questi mutanti vaccinici adottando i metodi della presente invenzione qui descritti.

Inoltre, si può facilmente comprendere che ulteriori geni dello spettro di infettività esistono in poxvirus. Per esempio, viene riferito che il ceppo vaccino MVA vaccinico é attenuato, in particolare in animali immuno-soppressi. Recentemente, é stato riferito che il gene dello spettro di infettività umano K1L ha subito una parziale delezione in MVA (55). La presente analisi del genoma MVA conferma la delezione riferita nel gene K1L, ma indica che il secondo gene della variazione dell'ospite umano C7L é presente in MVA, anche se il virus vaccinico MVA non placca su cellule umane. La regione del promotore a monte del gene C7L in MVA é identica alla regione a monte nel virus Copenhagen qui presentato. La sequenza di amminoacidi del prodotto di traslazione C7L putativo per MVA é identica a quella del virus Copenhagen. Ciò indica che il gene dello spettro di infettività umano C7L, che, sia nel virus WR che nel virus Copenhagen si rivela funzionalmente equivalente al gene dello spettro di infettività umano K1L, é incapace di per sé, di specificare una crescita di virus vaccinico MVA su cellule umane. Inoltre, la sostituzione del gene K1L carente in MVA con il gene KUM intatto da Copenhagen non conferisce al rlcombinante virus vaccinico ibrido la possibilità di crescere su cellule umane.

Il virsu vaccinico MVA viene anche compromesso nella sua possibilità di crescere su cellule di scimma, suggerendo l'esistenza di altro gene (altri geni) dello spettro di infettivà ancora non identificato. Effetuando approcci simili a quelli qui usati sarà possibile definire il gene necessario per queste restrizioni.

Inoltre, si comprende bene che altri poxvirsu per esempio vaiolo ovino o vaiolo suino sono ospiti ristretti per ciò che riguarda la replicazione di specie ovine e rispettivamente di specie suine. Queste restrizioni di ospiti indicano chiaramente la resistenza di un certo numero di geni dello spettro di infettività nei poxvirus. La definizione di questi geni mediante approcci definiti in questa descrizione può far aumentare la gamma di vettori di poxvirus costruiti nella variazione dell'ospite. Esempio 12 - Inserimento di gene di glicoproteina della rabbia nel sito di delezione TK di diversi mutanti di delezione di vaccino di Copenhagen

La glicoproteina della rabbia é stata scelta come un antigene estraneo modello per l'inserimento in diversi mutanti di delezione di vaccino Copenhagen per consentire un'analisi comparativa degli effetti relativi di queste delezioni. Il gene per la glicoproteina della rabbia (18,42) é stato posto sotto il controllo del promotore HS di vaccino sintetico. Questa "cassetta" di esrpressione é stata inserita nel plasmide pSD513VC vettore di delezione TK Copenhagen. pSD513VC é un subclone del frammento Hindl11 J del vaccino Copenhagen nel quale le sequenze codificanti per il gene (TK) della timidina chinasi sono sotituite con una regione di polinker. La regione di "polilnker" é costituita dalla sequenza

5' CCCGGGAGATCTCTCGAGCTGCAGGGCGCCGGATCC 31

che specifica i siti di restrizione Smal, BglII, Xhol. PstI e BamH I■ Il plasmide ottenuto che contiene il gene della glicoproteina della rabbia é stato denominato pRW842. Nel pRW842, le sequenze codificanti per il gene TK vaccino sono sostituite dalla cassetta del gene della glicoproteina H6 promotore/rabbia che é orientato in un orientamento sinistra verso destra rispetto ai bracci che fiancheggiano il vaccino. Una ricombinazione tra pRW842 e un eventuale virus vaccino dà come risultato un virus TK meno che contiene il gene della glicoproteina della rabbia sotto il controllo del promotore H6.

SI é effettuata la ricombinazione tra pRW842 e la serie di virus vaccini Copenhagen contenenti delezioni di uno o di entrambi i geni dello spettro di infettività umano. La serie ottenuta di ricombinanti vaccini che contengono il gene della glicoproteina della rabbia é riportata nella tabella 6. Celle di scimmia (VERO) sono state infettate con la serie di ricombinanti vaccini contenenti il gene della rabbia. Si sono effettuate immuno-precipitazioni usando un anticorpo monoclonale specifico per la gl i coprotei na della rabbia (42). Tutti i ricombinanti esprimono il gene.

TABELLA 6. Mutanti di delezione Copenhagen contenenti gene della glicoproteina della rabbia

irus plasmi de virus delezioni espressione della glicoproteina parenterale donatore ricotbinante :<tel la rabbia

VP410 pRW342 vP744 TK

VP661 - pRW842 VP745 TK, K1L

vP706 pRW842 VP746 TK, C7L

VP716 pRM842 VP750 TK, C7L, K1L

vP668 pRW842 VP752 TK, (C7L - X1L]

Il ri combi nante vaccino VP750 contiene il gene della glicoproteina della rabbia in una base C7L~,

K1L vP752 contiene il gene della rabbia in una base di delezione / C 7 L attraverso K1L/. Poiché entrambi i geni di variazione dell'ospite umano mancano in entrambi questi ricombinanti vaccini, non ci si dovrà aspettare un'* i nf ezi one produttiva di cellule umane con questi ricombinanti. Per esaminare se il gene della rabbia può venire espresso in cellule umane in assenza dei geni dello spettro di infettività umano, si sono infettate cellule MRC-5 con l'intera serie di ricombinanti della rabbia vaccini, ivi compresi vP75Q e vP752. In tutti gli elementi della serie, si é rivelata immunof1uorescenza sulla superfìcie di cellule infettate.

Esempio 13 Clonazione ed espressione di geni (PRV) della pseudorabbia in una base vP668

Come vettore fondamentale si é scelto vP668, il mutante di delezione del vaccino Copenhagen, che contiene una delezione che si estende attraverso la regione che comprende i geni dello spettro di infettività umano e porcino /C7L fino a H1L/. vP668 non placca su cellule MRC-5 umane o su cellule LLC-PK1 di rene di maiale (vedi tabella 3). Geni della pseudorabbia gli, gIII e gp50, che contengono omologia nei confronti dei geni (HSV) del virus del herpes simplex gB{57), gC{58) e gD(59), rispettivamente, sono stati inseriti nel vettore vP668 come indicato dettagliatamente qui di seguito. A. Inserimento del gene gli della glicoproteina PRV nel sito di delezione HA del virus vaccino Copenhagen Si é fatto digerire PRV di DNA con BamHI e i frammenti ottenuti sono stati clonati in pBR322 tagliato con BamHI. Il plasmide pR9.25, contenente il frammento 1 PRV BamHI^j60) contiene tutto il gene per la glicoproteina PRV gli. Porzioni di PR9.25 contenenti il gene per gli (57) sono state subclonate ottenendo il fago pBR322, pUC18 e H13. Si é determinata la sequenza di nucleotidi per il gene glI (46).

Le sequenze codificanti per il gene PRV gli sono state inserite nel plasmide pT15 vettore del vaccino Copenhagen (50). Nel plasmide ottenuto, pPR18, il gene gli é situato nel sito di delezione della emoagglutinina (HA) del vaccino Copenhagen sotto il controllo del promotore vaccino H6. La ricombinazione tra plasmide pPR18 e mutante di delezione del vaccino Copenhagen vP668 ha dato come risultato il ricombinante vaccino vP726. In vP726, il gene PRV gli é inserito nel sito di delezione HA sotto il controllo del promotore del vaccino H6 primo/ultimo. Tutti i PRV DNA 5' e 3' estranei al gene sono stati rimossi. Una sequenza che specifica la fine della prima trascrizione di vaccino (39) é stata inserita a valle partendo dalle sequenze codificanti PRV gli.

B. Inserimento del gene gp5Q PRV nel sito di delezione ATI di virsu vaccino Copenhagen

Il DNA che codifica il gene per la glicoproteina PRV gp50 é situato sul frammento BamHI del genoma PRV (61). Il plasmide pPR7.1 contiene il frammento PRV BamHI 7 clonato nel sito BamHI di pBR3222. Un sottoframmento Stul/Ndeldi pPR7.1 contenente l'intero gene per PRV gp50 é stato subclonato ottenendo PIB125 che genera il plasmide PPR22. Si é determinata la sequenza di nucleotidi per i1 gene gp50 (46).

Le sequenze codificanti per PRV gp50 sono state poste sotto il controllo del promotore vaccino primo/vaccino intermedio equivalente alle immediate sequenze a monte di I3L (62,63). Questo elemento promotore é stato usato precedentemente per esprimere geni estranei in ricombinanti di virus vaccino (31,64). Si é sintetizzato DNA corrispondente a sequenze di promotori a monte a partire dalla struttura di lettura aperta 13L (62) mediante una reazione di catene di polimerasi (65) usando "innéschi" di o1igonucleotidi sintetici ATCATCGGATCCCGGTGGTTTGCGATTCCG 3·) and P50PPATG (5* .GATTAAACCTAAATAATTG 3') and pMPIVC,

un subclone di HindlII I, Copenhagen come stampo ("tempiate"). Il frammento ottenuto é stato fatto digerire con BamHI per generare un'estremità coesiva BamHI in corrispondenza dell'estremità 5' della sequenza di promotori. L'estremità 3' é rimasta una estremità smussata.

Le sequenze codificanti PRV gp50 sono state recise dal plasmide pPR22. Il plasmide pPR22 é stato fatto digerire con NsiI che taglia 7 bp a monte dal ATG ed ha come risultato una sporgenza 3'. La sporgenza 3‘ é stata smussata alle estremità con polimerasi T4 DNA in presenza di 2 mM dNTPs. Il DNA ottenuto é stato fatto digerire parzialmente con Bgl11, e si é isolato un frammento 1.3 kb smussato/jì^l11 contenente il gene PRV gp50. -Il frammento di promotore 126 bp 13L (BamHI/smussato) e il gene 1.3 kb gp50 contenente il frammento (smussato/BalII) sono stati legati in un plasmide pBS-SK (Stratagene, La Jolìa, CA) vettore fatto digerire con BamHI. Il plasmide ottenuto é stato denominato pBSPRV50I3. La cassetta di espressione contenente il promotore 13L legato al gene PRV gp50 é stata rimossa mediante digestione con BamHI seguita da parziale digestione con SmaI. Un frammento 1.4 kbp contenente il promotore 13L/gene PRV gp50 é stato isolato e é stato smussato alle estremità usando il frammento di Klenow di

E.Co1i polimerasi.

pSD541 é un plasmide di delezione Copenhagen nel quale sono stati generati bracci di affiancatura

per la regione di delezione ATI (vedi pSD494VC) mediante reazione di catene di polimerasi (PCR) (65) usando subcloni di Hind111 A Copenhagen come "tempìate". Si sono usati oligonucleotidi sintetici MPSYN267

•(5' GGGCTGAAGCTTGCGGCCGCTCATTAGACAAGCGAATGAGGGAC 3')

MPSYN26.a^(51 AGATCTCCCGGGCTCGAGTAATTAATTAATTTTTATTACACCAGAAAAGACGGCTTGAGA TC 3').

come "inneschi" per costruire il braccio del vaccino

420 bp verso la destra della delezione. Si sono

usati oligonucleotid1 sintetici

MPSYN269 (5' -TAATTACTCGAGCCCGGGAGATCTAATTTAATTTAATTTAT ATAACTCATTTTTTGAATA TACT 3’) '’ MPSYN270 (5·

TATCTCGAATTCCCGCGGCTTTAAATGG ACGGAACTCTTTTCCCC 31).

per ottenere il braccio di vaccino 420 bp verso la sinistra della delezione. I bracci di vaccino sinistro e destro formati come indicato sopra sono

stati mescolati tra di loro e sono stati estesi con un'ulteriore reazione di catene di polimerasi per generare un frammento di DNA costituito da braccia

di vaccini di fiancheggiamento sinistri e destri separati da una regione di polylinker che specifica siti di restrizione Bg 111 , Sma I e Xho I. Il frammento PCR-generato é stato tagliato con H i nd 111 e EcoR I ottenendo così "Monconi appiccicosi" e è stato legato ottenendo pUC8 tagliato con Hi nd I I I e EcoRI. Il plasmide ottenuto é p S D 541.

Il frammento con estremità smussate 1.4 kb contenente il promotore 13L/gene PRVgb50 é stato inserito nel plasmide vettore Copenhagen p S 0541 fatto digerire con Smal . Nel plasmide ottenuto PAT I p5Q , il gene PRVgp50 é situato nel sito di delezione ATI del vaccino Copenhagen sotto il controllo di un elemento promotore 13L di vaccino 126 bp. In PATIp50 tutto il DNA PRV 3' estraneo al gene é stato rimosso. 7 pb di sequenze PRV estranee rimangono immediatamente a monte del PRVgp50 ATG. Una prima sequenza di terminazione di trascrizione di vaccini (39) è situata a valle partendo da sequenze codificanti P R V g p50. Si é effettuata una ri combi nazi one tra plasmide PATp5Q e mutante vP668 di delezione di vaccino Copenhagen.

C. Inserimento del gene glll di glicoproteina PRV nel sito di delezione T K d e 1 v i j· u s vaccino Copenhagen

Le sequenze codificanti per la mappa glll di glicoproteina PRV verso frammenti BamHI 2 e 9 del genoma PRV (58). I plasmidi pR9.9 e pPR7.35 contengono frammenti di PRV BamHI 2 e 9, rispettivamente clonati nel sito BamHI di p8R322. Un frammento Sphl/BainHI contenente l'estremità 5‘ del gene PRV glll é stato isolato da pPR9.9. Un frammento NcoI/BamHI contenente il resto del gene glll é stato isolato da pBR7.35. Tutto il gene PRVglII é stato assemblato legando i due frammenti in modo da ottenere pPV25, e si é ottenuto un plasmide pIB125. Si é determinata la sequenza di nucleotidi del genere glll (46).

Il gene PRVglIIé stato posto sotto il controllo di un elemento promotore £ di vaccino Copenhagen ottenendo come risultanto un plasmide pPR24 (la sequenza del promotore u del vaccino é descritta nell'esempio 5, figura 5). Una cassetta di espressione contenente un elemento promotore u di vaccino 120 bp e contenente l'intero gene PRVgpIII é stata recisa dal plasmide pPR24 mediante digestione con SnaBI (nella posizione -120 a monte partendo dal codone di iniziazione e con DraI a valle partendo dal gene PRVglII. Il frammento con estremità smussate 1.5 kb contenente il promotore u/gene PRVgpIII é stato isolat e é stato legato formando un plasmide psD513VC vettore Copenhagen fatto digerire con SmaI e si é ottenuto cosi pPRVIIIVCTK. Nel pPRVIIIVCTK, si sostituiscono le sequenze codificanti TK del vaccino con il gene PRVglII inserito in un orientamento destra verso sinistra sotto il controllo dell'elemento promotore u, di vaccino Copenhagen 120 bp. Si sono rimosse tutte le sequenze PRV 5' e 3' estranee al gene g111. Si é effettuata una ricombinazione tra plasmide pPRVIIIVCTK e mutante di delezione del vaccino Copenhagen vP668. D . Espressione di PRV gli in ricombinante vaccipo X212L·

Si é esaminata l'espressione di PRVglI in ricombinante vP726 di vaccino Copenhagen in cellule VERO, LLC-PK1 e MRC-5. vP726 contiene PRVglI in una base vP668 /delezione C7L attraverso K1L?, e, così, non ci si doveva aspettare di avere un'infezione produttiva in rene di maiale LLC-PK1 e in cellule MRC-5 umane. Tuttavia, un'analisi di immunof1uorescenza effettuata usando un anticorpo monoclonale specifico nei confronti di PRCgpII ha dimostrato sorpnrendentemente l'espressione del prodotto del gene PRVgpII in cellule di maiale in cellule di scimmia e in cellule umane.

E. Costruzione di ricombinanti PRV doppi e tripli nella base di virus di vaccino Copenhagen vP668. Si è effetuata una ri combi naz i one per costruire ricombinanti di vaccini che contengono geni DRV multipli. Si sono effettuate ri combi nazi oni usando plasmidi donatori PATI5Q (PRV gp50, sito di delezione di ATI) e pPRVIIIVCTK {PRV g 111 , sito di delezione TK) e virus di recupero vP726, il ricombinante del vaccino Copenhagen che contiene PRVglI nel sito di delezione HA in una base di delezione ZX7L attraverso K1L-7. Queste ri combi nazi oni generano ricombinanti vaccini che contengono doppi inserimenti di geni PRV gli gp50 e gli gplll, ri spetti vamente. Si usa uno di questi ricombinanti PRV doppi di vaccini come virus di recupero per la ri combi nazi one con l 'opportuno plasmide allo scopo di generare il ricombinante triplo che contiene i geni PRV gli gp50 gIII. Esempi o 14 - cos t r u z i one di un si s te ma di se 1 e z i o n e di variazione dell 'ospite a base di virus va c c i n o del ceppo Copenaghen

Per costruire un sistema di selezione di variazione dell 'ospite a base di virus vaccino Copenaghen (COPCS) si sono costruiti plasmidi per sottoporre a delezione DNA che comprende la regione che codifica i geni da C7L sulla sinistra fino a K1L sulla destra (figura 8). Non ci si può aspettare che virus vaccini contenenti questa delezione crescano su cellule umane, poiché entrambi i geni dello spettro di infettività C7L (esempio 7) e K1L (15) sono stati sottoposti a delezione. Si sono anche costruiti plasmidi per sottoporre a delezione la regione che si estende da C6L fino a K1L. Poiché la delezione C6L fino a K1L non rimuove il gene dello spettro di infettività umano, C7L, ci si dovrà aspettare che virus vaccini che contengono questa delezione crescano su cellule umane.

Riferendosi ora alla figura 14, si é preparato un plasmide pSD420 (figura 14) contenente un clone SaiI di DNA del virus vaccino Copenaghen (figura 8, 10). Un frammento proveniente dalla regione HindlII C di virus di vaccino del ceppo Copenaghen é stato derivato da p$D420 mediante scissione con XbaI (pos.

685) seguita da formazione di estremità smussate con il frammento di Klenow di polimerasi di E.Coli e scissione con Bg1I (pos 1764). Il frammento 1079 bp così ottenuto é stato isolato da un gel di agarosio. pSD451 (figura 9,14) é un plasmide contenente DNA del vaccino Copenaghen tra il sito SphI in Hind111 M (pos 9478) e il sito KpnI in Hind111 K (pos 12998). Un frammento proveniente dalla regione Hindi11 K del virus del vaccino ceppo Copenaghen é stato derivato da pS0451 mediante scissione con BglII (pos 11116) e EcoRV (pos 11834). Il frammento di restrizione 718 bp é stato isolato da un gel di agarosio. Entrambi i frammenti sono stati legati ottenendo pUC8 che é stato scisso con Hind111. é stato smussato alle estremità con il frammento di Klenow di polimerasi di E.coli e é stato scisso con Sm_al (fig 14). Il plasmide ottenuto é stato denominato pMP581CK. pMP581CK (figura 14) contiene 11 gene C7L (blocco solido, direzione di trascrizione indicata dalla freccia). pMP581CK contiene un sito BglII unico affiancato con un braccio di vaccino sinistro (pos.

685-1764) derivato da Hind III C e con un braccio di vaccino destro (pos 11116-11834) derivato da HindlII K. Il braccio di vaccino sinistro contiene l'intero gene per C7L (sequenze codificanti pos 1314-863). Rispetto al genoma di vaccino Copenaghen, i due bracci sono separati da una delezione 9351 pp (pos 1315-11115). Il sito di delezione tra sequenze Hind111 C e sequenze Hindl11 K é indicato da un triangolo nella figura 14.

Per rimuovere DNA in eccesso in corrispondenza della giunzione di delezione, si é tagliato pMP581CK con BoiII, e quindi si é effettuata una digestione con esonucleasi B a131. Si é effettuata una mutagenesi (53) sullo stampo a doppia elica usando un oligonucleotide 49mer sintetico MPSYN228.

MPSYN228. (5'

TTTCTTAATAAATATTATTTTTATTTAAATTCGTAGCGATATATAAAAC 3')

Il plasmide ottenuto, pMPCTKIA conserva 11 gene di variazione dell'ospite umano del vaccino, C7L. Esso viene sottoposto a delezione tra le posizioni 1513-111165 e viene sottoposto a delezione per 7 geni C6L fino a K1L (figura 8). Una ricombinazione tra plasmide pMPCTKlA e vP458, un virus di vaccino Copenaghen ricombinante contenente il gene _E. coli lacZ nel sito di delezione M2L, ha generato il ricombinante del vaccino vP664. Come ci si poteva aspettare, il vP664 é in grado di placcare su celle umane poiché esso conserva un gene C7L intatto.

Per rimuovere le sequenze codificanti (pos 1314-863) per C7L e DNA in eccesso in corrispondenza della giunzione di delezione, si é tagliato pMP581 CK con Ncol, e quindi si é effettuata la digestione con esonucleasi BA131. Si é effettuata una mutagenesi (53) sullo stampo a doppia elica usando un oligonucleotide 44mer sintetico MPSYN233

(5 ' TGTCATTTÀACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT 3^_ Il plasmide ottenuto pMPCSKlA viene sottoposto a delezione tra le posizioni 862-11163 e viene sottoposto a delezione per 12 geni da C7L fino a K1L. La ricombinazione tra plasmide pMPCSKlAe vP458 ha generato il ricombinante del vaccino vP668. Come ci si aspettava, vP668 non é in grado di placcare su cellule umane, poiché entrambi i geni d1 variazione dell'ospite K1L e C7L sono stati sottoposti a delezione.

Si é derivata una serie di pìasmidi da pMPCTKlA mediante addizione di DNA polylinkér sintetico in corrispondenza della giunzione di delezione. La costruzione di pìasmidi nella serie COPCS é riassunta nelle figure 15-17.

Le sequenze di DNA per tutti gli oligonucleotidi sintetici usati nella costruzione di questi pìasmidi sono presentate nelle figure 15-17.

Si é sottoposto il plasmide pMPCTKl (Fig 14) a parziale digestione con Dral e si é isolato DNA lineare da un gel di agarosio. Oligonucleotidi sintetici MPSYN238/MPSYN239 sono stati "annealed" a e sono stati legati ottenendo pMPCTKlA, in un orientamento destra verso sinistra in corrispondenza della giunzione di delezione, ottenendo così il piasmide pMPCS-1.

Per aggiungere un codone terminale ad una struttura di lettura aperta che entra nella regione di polylinker dalla sinistra (ATG pos.1484), si é tagliato pMPCS-ì con PstI. Si é effettuata una mutagenesi (53) usando un MPSYN249 di oligonucleotide 72 mer sintetico.

^TTTGTTTTATATATCGCTACGAATTTAAATAAAAATTATTTATTTATAGATCTAGAGTC GACCCGGGTACC 31)

Il plasmide ottenuto, pCOPCS-4 (rappresentato nella figura 17 con la sua denominazione alternativa, pMPCS-4) non ha strutture di lettura aperte che entrano nella regione dei polileganti oppure che lasciano la regione dei polylinker.

Per addizionare il promotore H6 vaccinico alla regione deipolylinker si è tagliato pMPCS-1 con HindlII e Asp718. Si è inserito un frammento di DNA sintetico HnidIII/Asp718 costituito dal promotore H6 modificato (Esempio 3), ottenendo il plasmide pC0pcS-3H (sequenza di promotori indicata nella Figura 17). Tutti i successivi plasmidi, pC0PCS-5H fino a pC0PCS-10H, derivati da pC0PCS-3H contengono la regione dei promotori H6 che è indicata nella Figura 17 per pC0PCS-3H. La sequenza posta traparen--tesi successiva alla regione dei promotori in pC0PCS-3H viene sostituita dalle sequenze poste trsr.parentesi indicate per pC0PCS-5H fino a pC0PCS-10H. I codoni di iniziazione ATG per i plasmidi pC0PCS-6H fino a pC0PCS-10H sono sottolineati. Da notare che pC0PCS-3H e pC0PCS-5H non contengono codoni di iniziazione ATG a monte a partire dalla regione dei "polylinker". Viene indicata una struttura di traslazione che inizia dal ATG in plasmidi pC0PCS-6H fino a pC0PCS-10H. Per addizionare un codone di arresto alla struttura di lettura aperta piccola da pMPCS-1 indicata sopra, si è effettuata l'equivalente mutagenesi usando MPSYN249 su pC0PCS-3H e si è ottenuto così il plasmide PC0PCS-5H.

Per addizionare un codone di iniziazione ATG a pC0PCS-5H a valle a partire dal promotore H6 in tutte le strutture di lettura relative ai siti di restrizione di "polylinker",si è tagliato pC0PCS-5H in corrispondenza del sito NruI nel promotore H6 e in corrispondenza del sito BglII nella regione dei "polylinker". Si è isolato un frammento vettore da un gel di agarosio. Oligonucleotidi sintetici JÌPSYN2S0/MPSYN251 sono stati "annealed" e sono stati inseriti nel vettore pC0PCS-5H ottenendo così un plasmide pC0PCS-6H.

Oligonucleotidi sintetici MPSYN252/MPSYN253· sono stati "annealed" e inseriti nel vettore pC0PCS-5H ottenendo così il plasmide pC0PCS-7H.

Oligonucleotidi sintetici MPSYy254/MPSYN?gs sono stati "annealed" e inseriti nel vettore pC0PCS-5H, ottenendo così il plasmide pC0PCS-8H.

pCOPCS-fiH, PC0PCS-7H e pC0PCS-8H

contengono il promotore H6 con un codone di iniziazione ATG seguito da siti di restrizione nelle tre differenti strutture di lettura. Il primo amminoacido e il secondo amminoacido codificati in questi plasmidi sono i seguenti:

pCOPCS-6H met/val; pCOPCS-7H met/gly e .j?COPCS-8H net/gly..

Po.ichè il motivo met/gly, in certi contesti (66) può specificare una miristilazione del polipeptide translato, il plasmide pC0PCS-6H è stato modificato per generare plasmidi contenenti codoni di iniziazione ATG nelle altre due strutture di lettura che, come il pC0PCS-6H, non iniziano una traslazione con il motivo met/gly. Si è tagliato pC0PCS-6H con Neul e con Asp718 e siè isòlatoil frammento vettore da un gei di agarosio. Si sono ./‘ànnealéd" oligonucleotidi sintetici MPSYN271/MPSYN272 e si sono inseriti nel vettore pC0PCS-6H ottenendo così il plasmide pC0PCS-9H.

Gli oligonicleotidi sintetici,MPSYN273/MPSYN274. sono stati "annealed" e sono stati inseriti nel vettore pC0PCS-6H, ottenendo come risultato il plasmide pC0PCS-10H. I primi due amminoacidi codificati in questi plasmidi sono i seguenti:

pC0PCS-9H aet/ser e pCOPCS-lOH met/thr.

Nella serie di COPCS finale, si sono inseriti DNA costituito da una sequenza codificante con un promotore per l'espressione in pCOPPCS-4; sequenze codificanti che contengono un ATG vengono inserite^ per l'espressione in pC0PCS-5H; e sequenze codificanti senza un codone di iniziazione ATG vengono inserite per l'espressione nell'opportuna stuttura dì lettura in una o più delle serie pCOPCS-6H fino a pC0PCS-10H. I plasmidi ottenuti vengono ricombinati con mutante di delezione del virus vaccinico Copenhagen vP668, ripristinando la possibilità che virus vaccinici placchino su cellule umane .

Esempio 15 -UTILITÀ' DEL SISTEMA COPCS PER ANALIZZARE

LA RESISTENZA DI PROMOTORI

La possibilità di una discendenza di vaccini ricombinati generata mediante ricombinazione usando il sistema di selezione di gettro di infettività virus vaccinico Copenhagen vP668/plasmide COPCS per placcare su cellule MRC-5 umane consente una rapida identificazione dei ricombinanti. Il sistema VP668/COPCS piuò venire usato per generare ricombinanti vaccinici per una varietà di scopi.

Il plasmide pCOPCS-4, un membro della serie COPCS che non contiene un promotore a monte partendo dalla sua regione di "polylinker" è stato tagliato con BglIII. Un frammento di BglII contenen te la completa sequenza codificante per il gene di glicoproteina della rabbia (18,42) è stato inserito in pCOPCS-4 in un orientamento destra verso sinistra, ottenendo il plasmide pCOPCS-RAB.

Nel pCOPCS-RAB, la regione dei "polylinker"è situata a monte a partire del gene della rabbia. Una varietà di regioni di promotori sintetici e di promotori derivati da virus vaccinici o da altri poxvirus è stata inserita nella regione di polileganti di pCOPCS-RAB, a monte partendo dal gene di glicoproteina della rabbia. I plasmidi così ottenuti vengono usati in ricombinazione con mutante di delezione Copenhagen di virus vaccinico VP668. Le discendenze ricombinanti vengono scelte sulla base della loro possibilità di placcare su cellule di MRC-5. Si può esaminare la resistenza dei promotori relativa quantificando l'espressione del gene di glicoproteina della rabbia nel virus didiscendenza■ ricombinante, usando un anticorpo monoclonale. Ulteriori vantaggi sono paragonabili al sistema -di selezione dello spettro di infettività vP293.

Esempio 16 - DELEZIONE DELLE ‘RIPETIZIONI_ TERMI-NALI INVERTITE DI VIRUS VACCINICO_ Notevoli quantità di DNA possono venire sottoposte a delezione da virus vaccinico senza annullare la sua possibilità di crescere in coltura di tessuti. Per fare aumentare la stabilità del genoma vaccinico e per rimuovere geni non essenziali che possono essere virulenti, si è cóstruita una delezione all'interno di un singolo ricombinante di virus vaccinico di 32,7 kb di DNA dalla porzione terminale sinistra e di 14,9 kb di DNA dalla porzione terminale destra.

Il genoma del virus vaccinico è costituito da DNA a doppia elica. In corrispondenza di ciascuna porzione terminale, il DNA di eliche complementari è reticolato da un'elica di DNA che forma un^Ripiegamento terminale incompletamente appaiato con basi (67). Immediatamente all'interno del ripiegamento terminale , il genoma contiene serie di unità ricorrenti in tandem. E' stato descritto che una versione clonata del genoma WR contiene 13 coppie in tandem di un'unità ricorrente 70 bp in prossimità di ciascuna estremità del genoma, separate con 435 bp di DNA non ripetitivo da un ulteriore blocco di 17 coppie in tandem dell'unità ricorrente 70 bp (68).Il ripiegamento terminale e il DNA ripetitivo formano le porzioni distali della ripetizione terminale invertita di vaccino. La ripetizione terminale invertita, che è stata valutata a 10 kb per la versione clonata di WH (69), contiene numerosi geni che, poiché sono contenuti nella coppia sinistra e nella doppia destra della ripetizione terminale invertita, sono presenti in due coppie nel genoma vaccinico.

Quando si fa digerire DNA estratto dallo "stock" clonato su placche . virus vaccinico Copenhagen (VC-2) qui utilizzato con endonucleasi di restrizione e lo si analizza su gel di agarosio, i frammenti terminali presentano una eterogeneità. Invece di presentarsi come un singolo nastro, i frammenti terminali si presentano sotto forma di una scala, i cui pioli sono separati da circa 1 kb. Effettuando un'analisi di restrizione, si è trovato che circa 80% dei ricombinanti di virus vaccinico derivati sotto forma di elementi isolati di

placche da VC-2 oppure da suoi derivati che a loro volta contengono porzioni terminali eterogenee, contengono porzioni „ terminali eterogenee. Nel rimanente 20% di ricombinanti vaccinici, l'eterogeneità delle porzioni terminali è andata persa e i frammenti di restrizione di DNA terminali si presentano sotto forma di bande separate . Quando nuovi ricombinanti sono - derivati da virus dotati di porzioni terminali separate,. si osserva sempre che questi ricombinanti contengono porzioni terminali separate.

Poiché le porzioni terminali di virus di "stock" VC-2 erano eterogenee, abbiamo scelto per effettuare la clonazione in un plasmide il frammento terminale proveniente dal virus ricombinante vP452, ossia un derivato del VC-2 che contiene porzioni terminaliseparate>. Il vP452 viene sottoposto a delezione per geni vaccinici TK (timidina chinasi) e HA (emoagglutinina) (50). Si è estratto DNA da vP452 e lo si è fatto digerire con Xhol, e si è isolato la banda terminale 2 molare di circa 7 kb da un gel di agarosio. Si è sottoposto il frammento isolato ad una digestione limitata con esonucleasi BAL-31, e quindi si è effettuata la smussatura delle estremità con il frammento di Klenow di polimerasi A E.coli . Il frammento dotato di estremità smussate è stato clonato nel sito Smal di pUC8, ottenendo pSD522VC (Figura 18)..

L'analisi della sequenza del DNA cipSD522VC mette in evidenza che, come nel caso di vaccini WR, le porzioni terminali di ricombinante vaccinico Copenhagen vP452 contengono unità di ripetizione in tandem. Oltre ai blocchi di unità di ripetizione in tandem 70 bp riportati per l'isolato WR clonato su placche, le porzioni terminali di vP452, diversamente dal WR isolato, contengono unità di ripetizione in tandem costituite da 54 »· pb situate internamente rispetto unità di ripetizione in tandem da 70 bp e prossime a sequenze codificanti . La Figura 19 riporta la sequenza di una porzione del genoma Copenhagen, iniziando con la copia più interna dell' unità di ripetizione - in tandem 54 bp (pos.l - 54). La sequenza dai3978 bp illustrata nella Figura 19 è stata derivata da pSD522VC e da diversi cloni di DNA Copenhagen VC-2 in plasmidi a base di pUC. Essa comprende sequenze codificanti in HindlII C verso destra del blocco finale di ripetizioni in tandem. La sequenza presentata nella Figura 19 termina in corrispondenza del sito Sali che è l'inizio- della sequenza di DNA Copenhagen presentata nella Figura 8.

Per generare un plasmide contenente il DNA ripetitivo vaccinico derivato dalla parte ■terminale di vP452 ma sottoposto a delezione per sequenze codificanti vacciniche, si è fatto digerire pSD522VC con Clal e con HindlII, e si è isolato un frammento da 7 kb.

Si sono "annealed'^ oligonucleotidi sintetici

. MPSYN261 (5*

CGATTCAGACACACGCTTTGAGTTTTGTTGAATCGAGATCTA 3») e MPSYN262 (5* AGCTTAGATCTCGATTCAACAAAACTCAAAGCGTGTGTCTGAAT 3') e si sono legati nel frammento vettore pSD522VC, formando così il pMPVCEND. Il pMPVCEND contiene DNA vaccinico dall'estremità di pSD522VC (circa 50 bp partendo dall'estremità del genoma) attraverso tutti i blocchi di ripetizioni in tandem, terminando in corrispondenza del sito Clal in posizione 338 della Figura 19. Un piccolo ORF (posizioni 292-336) che - ha incrociato ; il sito Clal in corrispondenza della posizione 305, è stato ricostruito negli oligonucleotidi sintetici MPSYN261/MPSYN262, che inoltre introducono un sito BglII per facilitare future fasi di clonazione. Si è usato pMPVCEND, che non contiene ORF che procedono da DNA vaccinico interno verso la porzione terminale, come vettore plasmide e come braccio esterno nella formazione di plasmidi destinati a sottoporre a del&zione geni dalle parti terminali sinistra· e ' "destra di vaccini.

In prossimità della parte terminale sinistra, si sono sottoposti a delezione tutti i geni fino al gene che codifica la piccola subunità di ribonucleotide riduttosi , che risiede in HndlII F (70). Si è determinata la sequenza per HindlII F Copenhagen ^ la si è rappresentata nella Figura 20. HindlII F vaccinico è situato immediatamente alla destra di HindlII K. La sequenza di DNA rappresentata nella Figura 20 è contigua rispetto alla sequenza presentata nella Figura 8, che comprende l'intera sequenza per HindlII K. La piccola subunità per la ribonucleotide reduttasi è codificata con ORF F4 (posizioni 3506-2547, Figura 20).

Per esaminare se i 10 geni (K2L fino a F4L) immediatamente alla destra della delezione vP668 (C7L fino a K1L) erano non essenziali, si è costruito un plasmide pMFCTFRÀ* nel modo che segue. pSD521VC è un subclone di HindlII F Copenhagen, contenente sequenze derivate dalla giunzione HindlII K/F (giunzione di Figura 8/Figura 20) appendici A/C fino al sito BamHI unico di HindlII F (Figura 20) posizione 5663).,Per ottenere un bracciodifiancheggiamento verso la destra di F4, si è tagliato pSD521VC con Clal in corrispondenza della posizione 3576, a monte dalle sequenze codificanti F4, e lo sì è tagliato con BglII in corrispondenza della posizione 2841, all'interno delle sequenze codificanti F.4L. Si sono "armealed"*·oligonucleotidi sintetici

"MPSYN256 (5*

CGATGTÀCAAAAAATCCAAGTACAGGCATATAGATAACTGA 3') e MPSYN257 (5’ GATCTCAGTTAXCTATATGCCTGTACTTGGATTTTTTGTACAT 3 ') e si sono legati nel plasmide vettore PSD521VC tra i siti Clal e BglII. Nel plasmide ottenuto, pMP256/257 , la regione di promotori a monte del F4 ORF viene ricreata, legata a un sito B&1II. Per ottenere un braccio di fiancheggiamento di vaccino destro, si è tagliato pMP256/257 con BglII e con EcoRI, e si è isolato un frammentoda 2.3 kb contenente sequenze di vaccini a monte dal gene F4. Si è ottenuto il braccio di fiancheggiamento di vaccino sinistro a partiredaHindiII C dal plasmide pCOPCS-4 (Esempio 14)/

che contiene il gene per C7L e ulteriori 140

bp di DNA vaccinico verso sinistra. Si è tagliato pCOPCS-4 con BglII e con EcoRI, e si è legato

il frammento vettore 3.5 kb con il frammento 2.3

kb contenente il braccio destro da HindlII F.

Il plasmide ottenuto pMPCTFRA·' contiene un braccio vaccinico sinistro da HindlII C e un braccio destro da HindlII F che fiancheggia una delezione di 20

geni j_ C6L -F 4L_7. Si è usato pMPCTFRA come plasmide donatore per la ricombinazione con vP668 (Esempio 9)

e si è selezionato il virus ricombinante mediante crescita su celle MRC-5. Si è isolata la discendenza vaccinica vivente vP749 (delezione C6L - F4L),dinx>-straido così che tutti i geni nella regione Sottoposta

a delezione sono non essenziali.

Per sottoporre a delezione tutti i geni dall'estremità sinistra del vaccino fino a F4L

e comprendendo F4L,siè costruito il plasmidepMPLENDA (FIG. 18) nel modo seguente. Si è ottenuto un braccio di fiancheggiamento destro da HindlII F mediante digestione di pMPCTFRA con Smal e con BglII, seguita

da isolamento del frammento 2.3 kb. |Si è fatto digerire pMPVCEND (Figura 18), che contiene ripetizioni in tandem di DNA dalla porzione terminale di vP452, con HindlII e quindi si sono smussate le estremità con frammento di Klenow di polimerasi E. coli e tagliando con BglII. I due frammenti sono stati legati tra di loro, generando così pMPLEND^ . Nel pMPLEND^ , il braccio di vaccino sinistro è costituito da unità di ripetizicnein tandem e il braccio di vaccino destro è costituito da DANA derivato da HindlII F. Nel plasmide pMPLEND^ i 38 geni più a sinistra [_ C23L - F4L_7 del genoma Copenhagen vengono sottoposti a delezione, totalizzando — -- 32.681 bp (da HindlII C: Figura 19, posizione 340 fino all'estremità (sottoposti a delezione 13.638 bp); da HindlII C, M, N e K; tutti della Figura 8 (15.537 bp) e da HindlII F: Figura 20 posizione 1 - 3506).

Allo scopo di sottoporre a delezione geni ottenuti dall'estremità destra del genoma, si è costruito il plasmide pMPLEND^ per realizzare braccia di vaccino di fiancheggiamento per la delezione della regione (u) emorragica del vaccino (Esempio 5) e tutti i geni verso la destra di questa regione. La sequenza di HindlII B, il frammento di HindlII più a destra nel genoma è stata determinata ponendo in sequenza diversi cloni a base di pUC di questa regione (Figura 21). Un confronto delle sequenze derivate dalle regioni sinistra e destra del genoma mette in evidenza che la ripetizione terminale si estende alla

_ posizione 8104 della Figura 19. Così, la ripetizione terminale invertita del ceppo Copenhagen di virus vaccini analizzati è costituita da 8 ,1 kb di regione codificante oltre ai blocchi di ripetizioni in tandem. I 9 ORF / più a sinistra in HindlII C, ossia gli ORF-* C23L fino a C15L, corrispondono ai 9 ORF più a destra in HindlII B ossia gli ORF da B29R fino a B21R. La Figura 21 rappresenta la sequenza per HindlII B Copenhagen iniziando in corrispondenza della giunzione HindlII A/B e continuando verso destra fino al ORF più a destra che inizia in sequenze di DNA uniche (B20R). La copia destra della ripetizione terminale inizia in corrispondenza della posizione 17.132 della Figura 21, 14 bp prima della estremità del B20R ORF.

psD477VC è un subclone NcoI/NruI a base di pUC di vaccino Copenhagen HindlII B (Figura 21, posizioni 9713 - 11299) che contiene la regione (u) emorragica (ORF B13R e B14R). pSD478VC (Figura 18) è unn derivato di pSD477VC nel quale l ' intera regione u (posizioni 10.024 - 11.014, Figura 21 ) e sostituita da una regione di clonazione multipla che comprende un sito BglII . La 'coppiadi bligonucleotidi sintetici che saio stati "annealed" per questo scopo era costituita da --SD4liner (51 CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3*) - .SD39mer (5* AACGGATCCCTCGAGCCCGGGGAGCTCAGATCTAGTAAT 3'3⁄4Γ

Per ottenere un braccio di vaccino fiancheggiante verso la sinistra della regione u, il pSD478VC è stato tagliato con EcoRI in corrispondenza della giunzione di sequenze pUC/vaccino, è stato smussato alle estremità con frammento di Klenow di polimerasi E. coll e è stato tagliato con BglII. Si è isolato un frammento 0,3 kb contenente la regione del promotore u vaccinico e sequenze di fiancheggiamento verso la sinistra della regione u. Questo frammento è stato legato con un frammento vettore ottenuto tagliando pMPVCEND con HindlII , smussando l'estremità con frammento di Klenow di polimerasi E. coli e tagliando con BglII. Il plasmide ottenuto, pMPRENDA -f , contiene un braccio di vaccino sinistro derivato da HindlII B DNA a monte del B13R ORF e che comprende la regione del promotore B13R (u) . Il braccio di vaccino destro nel pMPRENDfc è costituito da blocchi di nipe3⁄4iz.ipnjL-i:ii in tandem ed è identico al braccio di vaccino sinistro presente nel plasmide di delezione dell'estremità sinistra, pMPLEND^ . I due bracci di pMPREND £ fiancheggiano una delezione di 17 ORF f_ B13R B29R 7- La grandezza totale della delezione tra i bracci di vaccino fiancheggianti nel plasmide di delezione di estremità destra, pMPREND^ è 14.873 bp , tutte da HindlII B (sequenza presentata nelle posizioni della Figura 21 da 10.024 a 10145; continuando nella ripetizione terminale invertita, con sequenza sottoposta a delezione equivalente a quella presentata nella Figura 19, posizioni 8090 fino a 340). La strategia per la costruzione di plasmidi di Selezione pMPLEND^ e pMPREND^J viene presentata schematicamente nella Figura 18. Blocchi chiusi indicano DNA di vaccino Copenhagen costituito dalle ripetizioni in tandem derivate dalla porzione terminale di vP452; blocchi aperti indicano altri DNA di vaccino Copenhagen. La posizione delle delezioni in plasmidi

'pMPCTFRà, pSD478VC, pMFLENDÀ e con pMPRENDA è indicata da triangoli.

Per trarre vantaggio dalla pressione selettiva nella generazione di virus vaccinici ricombinanti sottoposti a delezione per notevoli quantità di DNA in corrispondenza di entrambe le estremità del genoma, si sono usati due marcatori selezionabili. Il primo marcatore è il gene dello spettro di infettività umano vaccino C7L (Esempio 7) con selezione di progenie di virus ricombinante su cellule MRC-5 umane.

Il secondo è il gene E. coli che codifica il gene per la guanina fosforibosil transferasi (gene Ecogpt) con selezione di progenie di virus vaccinico ricombinante usando acido micofenolico (2,8).

Per creare un frammento mobile contenente soltanto il gene vaccinico C7L e il suo promotore, si è tagliato pCOPCS-4 con Ncol in prossimità dell'estremità 3' del gene C7L (posizione 870, FIGURA 8) e con BamHI 148 bp a valle partendo dalle sequenze codificanti C7L. L'estremità del gene C7L è stata ricostruita usando oligonucleotidi sintetici, MPSYN258 (5'

CATGGATTAATTAATTTTTTTG 3') e MPSYN259 (5* GATCCAAAAAAATTAATTAATC 3'), che sono stati "annealed" e sono stati legati con il frammento vettore producendo il plasmide pMP258/259. Si è tagliato pMP258/259 con BglII e con BamHI e si è isolato un frammento 660 bp contenente il gene C7L e il suo promotore per l'inserimento nei plasmidi di delezione terminale sinistra e di delezione terminale destra, rispettivamente, pMPLENDAe pMPRENDÀ .

Si è derivato un frammento 670 bp BglII/BamHI contenente il gene Ecogpt dal plasmide pSV2gpt (ATCC ^37145) (71) mediante l'addizione di un legante BamHI in corrispondenza del sito AhaiII a valle dalle sequenze codificanti (72).

Plasmidi pMPLENDA e pMPRENDft, contenenti delezioni di vaccini in prossimità dell'estremità sinistra e destra del genoma di vaccini, rispettivamente, sono stati tagliati con BglII. I frammenti BglII/BamHI contenenti il gene C7L e il gene Ecogpt sono stati inseriti nei vettori di plasmidi, producendo in totale quattro plasmidi (Tabella 7). Da notare che il gene C7L è sotto il controllo del

suo particolare promotore sia in pMPL/iC7 che in pMPR/\C7. Il gene Ecogpt è sotto il controllo del promotore

F4L in pMPLgpt ed è sotto il controllo del promotore B13R (u) in pMPRgpt. Si è effettuata la ricombinazione tra questi plasmidi e virus di recupero, come indicato nella Tabella 7. Si è selezionata una progenie di virus vaccinici ricombinanti da ricombinazioni che introducono il gene C7L seminando

in piastre su cellule MRC-5; si è scelta una progenie da ricombinazioni che introducono il gene

Ecogpt mediante crescita in presenza di acido micofenolico. Da notare che si effettua la selezione per la crescita su cellule MRC-5, vantaggiosamente, usando un virus di recupero, per esempio vP668, che è stato sottoposto a delezione per C7L e per K1L.

u. Mediante analisi di restrizione di DNA, si sottopone a delezione il vP796 per la regione

/C23L fino a F4L 7e anche per le regioni TK, HA, ATI e u. Poiché la delezione di 38 geni in prossimità dell’estremità sinistra di vP796 comprende C7L e K1L, si è usato vP796 come virus di recupero per la ricombinazione con pMPRàC7, il plasmide di delezione dell'estremità destra contenente C7L. Si sono selezionate le delezioni contenenti ricombinanti di vaccini così ottenute in prossimità delle porzioni terminali, vP811, mediante crescita su cellule MRC-5.

Claims

RIVENDICAZIONI 1 un metodo per selezionare un poxvirus ricombinante in un ospite , detto metodo consistendo nel : combinare DNA donatore e un poxvirus modificato in modo da formare un poxvirus ricombinante , detto poxvirus modificato avendo geni dello spettro di infettività sottoposti a delezione da esso in modo che il poxvirus modificato non replica nell ' ospite , e detto DNA donatore comprendendo (a) uno schema di lettura aperta da una sorgente di non-pox e (b) almeno un gene dello spettro di infettività <■ >R<er> consentire che il poxvirus ricontoinante replichi nell'ospite; e identificare il poxvirus ricombinante sulla base della sua possibilità di replicare nell ' ospite . 2^} Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 1 , nel quale il poxvirus è vaccina . f 3Λ Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 1, nel quale lo schema di lettura aperta dalla sorgente non-pox è un gene E. coli lacZ che codifica per la B galattosidasì . ^4?^Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 1 , nel quale l ' ospite è una linea di cellule umane C 55}Λ Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 4, nel quale la linea di cellule umane è MRC-5 6.‘Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 2, nel quale il gene dello spettro di infettività del poxvirus è un gene dello spettro di infettività vaccinico K1L e C7L. '7^ Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 1, nel quale il DNA donatore e il poxvirus modificato vengono combinati per formare il poxvirus ricombinante mediante ricombinazione del DNA donatore e del poxvirus modificato. (JTj Un metodo per clonare e per esprimere uno schema di lettura aperta in un poxvirus ricombinante in un ospite, detto metodo consistendo nel: combinare DNA donatore e un poxvirus modificato per formare un poxvirus ricombinante, detto poxvirus modificato avendo un gene dello spettro di infettività sottoposto a delezione da esso in modo che il poxvirus modificato non replica nell'ospite, e detto DNA donatore comprendendo (a) uno schema di lettura aperta da una sorgente non-pox e (b) il gene dello spettro di infettività per consentire che il poxvirus ricombinante replichi nell ' ospite ; replicare il poxvirus ricombinante nell ' ospite ; e esprimere lo schema di lettura aperta. 9.) Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 8, nel quale il poxvirus è virus vaccinia. Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 8 , in cui lo schema di lettura aperta dalla sorgente di non-pox è un gene E . coli lacZ che codifica per la B ' galattosidasi . u ll .) Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 8 , in cui l ' ospite è una linea di cellule umane . 12. Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 11 , in cui la linea di cellule umane è MRC-5 ^ίβΤ^υη metodo come rivendicato nella rivendicazione 9, in cui il gene dello spettro di infettività poxvirus è genere un gene dello spettro di infettività vaccinisi K1L e C7L. ^4^ Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 8 , in cui il DNA donatore e il poxvirus modificato vengono combinati per formare il poxvirus ricombinante mediante ricombinazione del DNA donatore e del poxvirus modificato. Un plasmide donatore che comprende un gene dello spettro di infettività poxvirus e uno schema di lettura aperta da una sorgente di non-pox. ,'Γί6.)Un plasmide donatore come rivendicato nella rivendicazione 15, che comprende inoltre un promotore a monte del gene dello spettro di infettività poxvirus . (Ì7. Un plasmide donatore come rivendicato nella rivendicazione 16, che comprende inoltre un codone di inizio di traslazione a valle del promotore seguito da siti di restrizione multipla unici, sequenze di segnali di terminazione di traslazione e una sequenza di segnali di terminazione di trascrizione iniziale. 718. Un plasmide donatore come rivendicato nella rivendicazione 15, in cui il gene dello spettro di infettività poxvirus è il gene dello spettro di infettività vaccinia K1L e C7L. Un virus ricombinante modificato per esprimere un gene prodotto in un ospite, detto virus ricombinante modificato avendo geni dello.spettro di infettività sottoposti a delezione da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite e detto virus ricombinante modificato compren- dendo DNA che codificaper il gareprodotto ed esprime il gene prodotto,nell'ospite con replicazione ri- stretta del virus nell'ospite. fév) Un virus come rivendicato nella rivendi- cazione 19 nel quale detto virus è un poxvirus. (3⁄4 Un virus come rivendicato nella rivendica- zione 20, in cui detto poxvirus è vaccinia. 22.)Un virus come rivendicato nella rivendi- cazione 19, nel quale il gene prodotto è un anti- gene '3⁄4 Un virus come rivendicato nella rivendica- zione 22, nel quale l'ospite è un vertebrato e 1'an- tigene induce una risposta imnjunologica nel vertebrato. '24^ Un virus come rivendicato nella rivendica- zione 23, in cui 1'antigene è scelto dal gruppo co- stituito da antigene di glicoproteina della rabbia e antigene di glicoproteina della pseudorabbia. '25. Un virus come rivendicato nella rivendi- cazione 19, nel quale l'ospite è una cella coltivata in vitro. Un metodo per esprimere un gene prodotto in un ospite, detto metodo consistendo nell'inoculare l'ospite con un virus ricombinante modificato, detto virus ricombinante modificato avendo geni dello spettro di infettività deleti da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite e detto virus ricombinante modificato comprendendo DNA che codifica ed esprime il gene prodotto nell'ospite con replicazione ristretta del virus nell'ospite. (h.)Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 26, in cui detto virus è un poxvirus. ^28.) Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 27, in cui detto poxvirus è vaccinia. ■Ì9. Un metodo come rivendicato nella rivendica-S. zione 26, in cui il gene prodotto è un antigene. ,30..Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 29, in cui l'ospite è un vertebrato e 1'antigene provoca una risposta immunologica nel vertebrato. <31. Un metodo come rivendicato nella rivendicazione 30, in cui 1*antigene è scelto dal gruppo costituito da antigene di glicoproteina della rabbia e antigene di glicoproteina della pseudorabbia. Un metodo per esprimere un gene prodotto in una coltivata in vitro, detto metodo consistendo nell·introdurre nella cellulaun virus ricombinante modificato, detto virus ricombinante modificato avendo geni dello spettro di infettività deleti da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nella cellula e detto virus ricombinante modificato comprendendo DNA che codifica ed esprime il gene prodotto nella cellula con replicazione ristretta del virus nella cellula. f33;. Un vaccino per indurre una risposta immanologica in un ospite inoculato con detto vaccino, detto vaccino comprendendo una sostanza di supporto e un virus ricombinante modificato, detto virus ricombinante modificato avendo geni dello spettro di infettività deleti da esso in modo che il virus ha una replicazione ristretta nell'ospite e detto virus ricombinante modificato comprendendo DNA che codifica ed esprime il gene prodotto nell'ospite con replicazione ristretta del virus nell'ospite.