JPH04502852A - ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウィルスワクチンに関するもので、病気に対する免疫性と、このような ワクチンに関連したウィルスのヌクレオチド配列とを提供することを目的とする 。

従来技術 ヘルペスウィルスは、大きな二重鎖ＤＮＡウィルスで、エンベロープによって囲 まれた２０面体カプシドからなる。このウィルスは、生物学的特性とゲノム構造 とにもとづいてアルファ、ベータ、およびガンマヘルペスウィルスに分類される ［Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｂ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８υ夏ｎｔａｒ−ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　１ｇ、　２０１−２１７］、ｈリヘルペスウイルスには、鶏に発生するリ ンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレック病ウィルス（ＭＤＶ）（ ガンマヘルペスウィルス）【総説：　Ｐａｙｎｅ、　Ｌ、Ｎ。

（ｅｄ）　Ｍａｒｅｋ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　（１９Ｊ１５）、　Ｍａｒｔｉｎ ａｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐｔ＋ｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｂｏｓ狽盾獅撃■A鶏の 呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウィ ルス（ＩＬＴＶ）（アルファウィルス）とが含まれる。

最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定する ことを可能とするような、ＭＤＶ、ＩＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウィルス、 特に水痘性口内炎ウィルスｆｆ　Ｚ　Ｖ）および単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ ）との間における顕著なアミノ酸配列の相同性（ホモロジー）が発見された。こ れらには、Ｈ３Ｖの糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶおよび 七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配列、ＴＫおよびリボ核酸還元酵 素遺伝子に相同なＩ　ＬＴＶ％ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢ およびｖｚｖの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶのアミノ酸配列も含まれ る［Ｂａｃｋｍａｓｔｅｒ、＾ｅｔ　ｉｌ、　（１９０）　Ｊ、　ｔｅｎ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　８９．２０３３−２０４２］。

ＭＤＶの株は３つの血清型に分類されている。１型は病原性の株とその弱毒株、 ２型は天然の非病原性株、そして３型はＨＶＴが含まれる。１０年以上前から、 ＨＶＴによる種痘がマレック病に対して顕著な有効性を示すことが知られている 。

しかし最近になって、ＨＶＴによる種痘に対して抵抗性を示すＭＤＶが単離され ている。このようなウィルス毒性が非常に高いＭＤＶによる鶏の損失は、米国、 ヨーロッパおよび中東の地域において発生している。しかし、ＨＶＴ、２型ＭＤ ＶおよびＭＤＶ高ウィつス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いるこ とによって、そのような損失を確実ではないが減少させることが可能である。

このような知見すなわちＨＶＴまたは２型ＭＤＶによって共有されないＭＤＶ型 特異的エピトープが存在するということは、われわれに抗原的には従来のワクチ ンよりもＭＤＶに関係した改良型ワクチンを作ることが可能であることを結論さ せた。［総説：　Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｂｉｇｇｓ　ｉｎ　Ｇｏｌｄｍａｎ　Ｊ、 Ｍ、　ａｎｄ　Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｍ、Ａ、　（ａｄｓ）Ｌｅｔ＋ｋａｅｗ＋ｉａ 　ａ＋ＩｄＬｙ■ｐｈｏｍａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｎｔｅ ｒｖｅｎｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ@Ｖｉｒｔ＋５−１ｎｄ。

ｃｅｄ　Ｔｕｍｏｕｒ、ｐ１３−３１．　Ｍａｃ＋＊１ｌｌａｎ、１９８６］い くつかのヘルペスウィルス抗原は、組換えワクシニアウィルス内で発現されたと きに保護免疫を与えることが示される。これらには、Ｈ３ＶのｇＢ　［Ｃａｎｔ ｉｎＥ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ？）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４．５９０８−５９１２３、ＨRＶ のｇ　Ｄ　［Ｐａｏｌｅｔｔｉ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　W１．１９３ −１９７］および偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）のｇＰ５０、Ｈ５ＶのｇＤの相同 タンパク質（ｈｏｍｅｌｏ（ｗｅ）　［：Ｍｉｒｃｈｉｏｌｉ、　ｃ、ｃ、　ａ ｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１．３９７７|３９１＋１ ］が含まれる。なぜなら、ウィルスの貫通および感染力にｇＢが必須であること 。

またヘルペスウィルス間で保存されているｇＢとその相同タンパク質は重要な免 疫源であるからである。さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在することは、体液 性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標的となる［Ｂｌｉｃｋｌａｗ ｓ、　Ｂ、＾。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　（ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８．１１０３−１１１４　（ １９８７）；　ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔｉｙｌｏｒ、　ＥA　ａｔ　ａｌ。

（１９８ｇ）　Ｊ、　ｔｅａ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９．１７３１−１７３４１． 最近になって報告されたＨ５Ｖの糖タンパク質ｇＨもまた感染力にとって必須な ものであり、また重要な免疫源でもある［Ｄｅｓａｌ、　Ｐ、Ｊ、　ｅｔ　ｉｆ 、　（１９８８）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９．１１４７−１１５６ 上また、ｇＣの相同タンパク質であるＰＲＶのｇＩＩＩも中和抗体の主標的およ び細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要であるが、かならずしも必須のタンパク質 ではないことが知られている。しかし興味深いことは、サイトメガロウィルス（ ＣＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞毒性反応における即時型初期 タンパク質の期待はずれな出現である［Ｋｏｚｉｎｏｗｓｋｉ　Ｕ、Ｈ，ｅｔ　 ａｌ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１゜２０５４−２０５８上同様 な抗原は、マレック病における潜伏感染リンパ球および形質転換リンパ球の排除 において重要な役割を担うことができよう、なぜなら、マレック病の腫瘍組織か ら確立されたリンパ珠芽細胞系において即時型初期ＲＮＡ転写産物が検出される からである。

また、ポックスウィルスワクシニアをベクターとして用いて作られた多くの組換 えワクチンが報告されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウィルスを ベクターとして用いた場合も報告されている。よって、肝炎抗原はＨ５Ｖで発現 されている［５ｈｉｈ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、８１K ５８６７−５８７０上またヒト組織プラズミノーゲン活性因子はＰＲＶで発現さ れている［Ｔｈｏｍｓｅｎ、　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ｍｌ、　（１９ｇ？）　Ｇｅｎｅ 　５７．２６１−２６５］、これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘルペ ス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同組換えによってウィルスベクター に組み込まれる。肝炎ウィルス遺伝子は、ヘルペスウィルスプロモーターに融合 さね、また組換えＤＮＡはＨ３ＶのＴＫ遺伝子に挿入される６組換えＤＮＡと野 生型Ｈ５ＶＤＮＡとの同時トランスフェクションにつづく相同組換えによって肝 炎抗原を発現するＴＫ−ウィルスが得られる。

ＰＲＶの場合、ＵｓにマツピングされたｇＸ遺伝子を外来遺伝子の挿入部位とし て用いられる。ここで用いれる戦略は、Ｈ３ＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失ＰＲＶ突 然変異体（ＴＫ陽性ウィルス）に挿入することを含むものである。そして、ブラ ズミノーゲン活性因子はＨ３ＶのＴＫ遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組 換え体を相同組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−ウィルスを前記のヒト遺 伝子を発現するものとして選別する［前掲、　Ｔｈｏｍｓｅｎ　ｅｔ　ｉｌ、］ 　ａ同様に、ｖｚｖをベクターとして使用する［Ｌｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、　８４．３８９６−３９００１　、いくつかのヘルペスウィルス遺伝子も毒 力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）に関連しており、またインビトロの系における増殖に 必須のものでないことが知られている。これらにはＨ５ＶのＴＫ遺伝子［Ｊａ＋ ａｉｅｓｏｎ、　Ａ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７４）　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２４．４６５−４８０；　Ｆｉｅｌｄ、　Ｈ，ａｎｄ 　Ｗｉｌｄｙ、　Ｐ−＋　（１９ｇ？）　Ｊ、　Ｈｙ（ｉｅ獅■@（Ｃａｎ ｂｒｉｄｇｅ）　８１．２６７−２７７１およびＰＲＶのＴＫ遺伝子が含まれる 。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失によって容易に減少される［Ｔａｔａｒｏｖ、 　Ｇ、　（１９６８）　Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ。

Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ　１５Ｂ、　８４８−８５３コ、さらに、ＰＲＶのパルサ（Ｂ ａｒｔｈａ）株の減少はＵｓにマツピングされた非必須的糖タンパク質ｇ１の欠 失にもとづ（［Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ。

Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１．４０３０−４ ０３２］。

長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し領域（ＴＲ３）に存在するＨ３Ｖマツ ピングの遺伝子は、病原性に関係している［Ｒｏｓｅｎ、　Ａ、　ｅｔ　ｍｌ、 　（２９８６）　ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ　５．　１５７−１７５；　Ｔｈ ｏｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｌ、ｅ　ａｌ、（＋９８３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３１． 　１８０|１９２コ　。

Ｈ３Ｖのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須で あるが、毒力に関係していると報告されている。これらには、ＵＬ２４　（Ｓａ ｎｄｅｒｓ、　Ｐ、Ｇ、、　（１９８２）、　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　 ６３．２７７−２９５）、リボ核酸還元酵素の大サブユニット（Ｇｏｄｓｔｅｉ ｎ　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｅｒ、　Ｓ、に、　（１９８８）　Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　６２．１９６−２０５）Aｇ Ｃ（Ｄｒａｐｅｒ　Ｋ、Ｇ、　ｅｔ、　ａｌ、　（１９０）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、　５１．５７８−５８５）　、ｄＵＴＰアーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｆ、Ｂ、　 ａｎｄ　Ｐｒｅａｔｏｎ、　Ｖ、Ｃ，（１９８６）　Ｖｉｒｏｌｏ（ｙ　１４８ ．１９０−１９７）、そしてＵＬ５５およびＴＪＬ５６　（ＭａｃＬｅａｎ、＾ 、Ｒ，ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ、　Ｓ、Ｍ、　（１９８７）　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　６８．P ３３９−１３５０）が含まれる。さらに、ＵｓにおけるＨ３Ｖマツピングのいく つかの遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に非必須である［Ｗｅｂｅｒ、 　Ｐ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．　５７６− ５７９コ　。

ＷＯ３８１０７０８８（１９８８年９月２２日発行）　はＨＶＴまたはＭＤｖに もとづいた雑種ウィルスベクターを開示しており、またそれは非必須部位にある 興味深い遺伝子、例えばプロティンＡをコードする領域またはＴＫ領領域含むも のである。この文脈では、プロティンＡは、ヴエリサー（Ｖｅｌｉｃｅｒ）およ びクーセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）によって開示されたｇＣと同様のものとして 現われる。

本発明の概要 本発明は、ひとつのヌクレオチド配列を提供するものであり、このヌクレオチド 配列に関連した野生型ウィルス内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在 する他の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、（ａ）Ｈ５Ｖ７） ｇＢ遺伝子のＭＤｖ相同遺伝子、（ｂ）Ｈ５Ｖ（７）ｇＢ遺伝子＋７）ＭＤＶ相 同遺伝子、（ｃ）ＭＤＶのＴＫ遺伝子、 （ｄ）Ｈ３Ｖ−１の即時型初期遺伝子ＩＥ−１７５（７）ＭＤＶ相同遺伝子、（ ｅ）Ｈ３Ｖ−１（７）即時型初期遺伝子ＩＥ−６８（ＤＭＤＶ相同遺伝子、（ｆ ）Ｈ３ＶのｇＤ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、そしてそれらのマイナー変異体であ る。

さらに、ＨＶＴのＴＫ配列（以下の記載においてしばしば配列（ｘ）と表わす） と、Ｈ３ＶのｇＣ遺伝子のＭＤＶ類似配列（以下の記載においてしばしば配列（ ｙ）と表わす）、そしてそれらの配列にマイナーな変異が生じたマイナー変異配 列は、あるヘテロ配列の挿入部位として、あるいはそれ自身が異常ではない毒性 の低いウィルスを得るための欠失部位として利用されよう。

前記（しかも（ｆ）、　（ｘ）および（ｙ）に記載されたそれぞれの配列は、そ れぞれの配列を発現させるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモータ ーを含む他の５”および３°非遺伝暗号配列（ノンコーディング配列）と結合し たものであろう、そのような付加された配列はいわゆる野生型のものか、あある いはヘテロなものであろう。

特に、プロモーターは前記（ｄ）および（ｆ）のひとつと結合しているであろう 。

前記した「マイナー変異配列」という言葉の意味は、その配列が本来コードして いる遺伝子発現産物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌクレオチ ド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドのマイナー置換である。ある抗 原を遺伝暗号化（コード）するためにベクターに挿入される配列の場合、配列に とって必須なこととは配列がタンパク質または糖タンパク質をコードしているこ とを意味する。その抗原の持つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ 酸配列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるような配列内にお ける保守的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｃｈａｎｇｅｓ）はこのようなマ イナー変異に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列のなかで、抗 原タンパク質そのものをコードする部分のみが使用される。そのような部分とは 、例えば、ＭＤＶのｇＢ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の８１６−８６３． １３７７−１５９５．１３７７−１６３０また）：１１８２４−１９８５また） ：！ＮＤＶ（７）ｇＣ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の１２０３−１２７８ 、およびそれらのマイナー変異に該当する領域である。本発明のさらなる態様は これらの配列およびこれらの配列によりコードされるペプチドによってなされる 。挿入部位に相当する配列の場合、ウイウルスの感染力と複製とに関しては、な んら必須的なものではなく、また組換えを可能とするような配列と相同な配列の みが必要とされる。よって、特定の配列への特定のヌクレオチド配列の挿入は、 挿入される場所から下流に向けてリーディングフレームを完全に変化させるもの となるであろう、抗原をコードする配列の場合では、このような変化は好ましく ないアミノ酸配列を生ずることを意味する（フレームシフトがどこに生ずるかに 依存する）が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほとんど同じであるので、組 換えが容易に行なえるであろう。

挿入部位においてヌクレオチドの相同性が７５％存在した場合、通常その配列は マイナー変異と見なされるが、少なくとも８０．８５．９０．９５または９９％ の相同性があることが好ましい、このような相同性（ｈｏｍｅｌｏｇｙ）の度合 いは上記の配列（ａ）ないしくｆ）および（Ｘ）のそれぞれの全体に実質的に関 係している。短い配列は、このような長い配列を単離または同定するためのプロ ーブとして用いられるが、この場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせ るために高い相同性が必要とされる。

よって、本発明はさらに上記配列（ａ）ないしくｆ）、　（ｘ）および（ｙ）の いずれかの少なくとも一部分に対して９０％（好ましくは９５％、９９％または １００％）の相同性を有する少なくとも１３のヌクレオチド副配列を提供するも のである。

上記したように、配列（ａ）、　（ｂ）および（ｄ）ないしくｆ）は抗原発現配 列として好適であり、また配列（ｙ）はへテロ配列のための挿入部位として好適 である。さらに、配列（ｃ）はＴＫ−突然変異体を生じさせるための欠失に好適 である。

これらの配列は、ここで開示された配列情報と、例えばオリゴヌクレオチドプロ ーブの合成および野生型のＤＮＡとそのプローブとのハイブリダイゼーションと を含む標準的技術を用いることによって野生型（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕ ｒｒｉｎｇ）のＨＶＴおよびＭＤＶウィルスから容易に単離可能である。上記の 配列（ａ）、　（ｂ）および（ｆ）によってコードされた単離ポリペプチドは、 新規なものであり、またＭＤＶ感受性細胞における上記配列の発現によって生じ たマイナー変異およびグリコジル化されたポリペプチドとともに本発明のさらな る態様を形成する。

第二に本発明は、ＴＫ遺伝子において生じた挿入または欠失突然変異からなるＭ ＤＶ突然変異体を提供するものである。

この突然変異は同定された領域の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域に あると考えられる。

ＭＤＶ抗原発現遺伝子（ＭＤＶ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｇｅ ｎｅ）は、ＭＤＶの毒性株から単離されてＭＤＶの毒性がそれよりも低い株に挿 入される。この挿入によってもし野生型のウィルスが生じないとしたら新規なウ ィルスが生ずることになろう。

他のヘテロな配列（抗原をコードするもの）は、例えばＭＤＶ抗原遺伝子配列と 同様に含まれよう。

あるいは、ヘテロな配列は、鳥脳を髄炎（流行性根せん）、鳥インフルエンザ（ 鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャッスル病（ＰＭＶ２ないしＰＭＶ７）以外 の鳥パラマイキソパイラス（ａｖｉａｎ　ｐａｒａ＋ｎｙｘｏｉｒｕｓｅｓ）　 、鳥レオウィルス病（腸の病気、鍵しよう炎）、ニワトリ貧血にワトリ貧血剤に よって起こる）、胞子虫症、エラグドロップ症候群（ＥＤ３７６）、伝染性上皮 腫、感染性気管支炎、感染性粘液嚢症（グンボロ（Ｇｕｍｂｏｒｏ）　）　、封 入体肝炎（アデノウィルス）、七面鳥リンパ増殖性疾患（Ｉｙｍｐｈｏｐｒｏｌ ｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）　、ニューキャッスル病、ニワトリの細 網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウィルス腸炎、七面鳥出血性腸炎 および七面鳥鼻炎（ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）のいずれか一つの疾患に 関係した抗原をコードするものであろう。

よって、本発明にもとづくベクターは多価ワクチンによる保護を可能とする。

ウィルスの突然変異体は、ヘテロな挿入配列を有する必要なしに毒性の低いウィ ルスとしてワクチンに利用される。

本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の調製の簡易的な方法は、適当な細 胞に、例えばＴＫ領領域共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｊｏｎ）　、欠 失または挿入変異されたものと全ウィルスＤＮＡまたは全ウィルス（例えば野生 型（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）のウィルス）を導入することである。そのようなウィ ルスのむき出しとなったＤＮＡが感染性を有することはすでに知られており、切 断しないで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によってＤＮＡを調製するの が好ましい、この方法に用いられる適当な細胞とは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ｅ ＋５ｂｒｙｏ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）　、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊 維芽細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団として播種されるこ とによって好適に増殖する。相同組換えによって形質転換ＤＮＡと全ウィルスＤ ＮＡとを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリーニン グする。このスクリーニングは、例えば適当なプローブによるハイブリダイゼー ションか、あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用 いた免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。

相同組換えが行なわれるためには、ウィルスＤＮＡは複製されなければならない 、現在のところＮＤＶのための細胞フリーの複製系は知られていないが、もしそ のような系が可能となったら、本発明はそのような系で実施されよう、複製およ び組換えが行なわれる環境は決定的なものではない。

免疫学的に利用可能なウィルス抗原をコードすることに関与した領域として上記 のようにコードされた配列（ａ）、　（ｂ）および（ｄ）ないしくｆ）は、適当 なベクター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウィルス、細菌また菌類などの ような他のベクター）に挿入される。ウィルスベクターの場合（特にヘルペスウ ィルスベクターおよび腸炎ウィルスベクター）、抗原をコードしている配列（適 当な配列（フランキング配列）が両端にある）と、上記した適当な宿主細胞内に あるベクターゲノムとの間にそのような挿入がなされる。ＨＶＴがベクターであ る場合、プロモーターは通常、ＨＶＴまたはＭＤＶベクターであろう、伝染性上 皮腫ウィルスまたは他のウィルスがベクターである場合、プロモーターは通常、 ベクターに対して外来のプロモーターであろう、細菌および菌類の場合、抗原を コードする配列はすでに知られている方法またはこれから発見されるであろう方 法によって挿入されよう、サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主として用い ることが可能である。ヘテロな配列は宿主ゲノムに挿入されるか、または自律的 に複製するプラスミドによって運ばれる。宿主に対して外来のプラスミドは、ヘ テロな配列（ウィルス抗原をコードする配列）の遺伝子遺伝子発現の対照群とし て使用される。

フランキング配列は、ヘテロな配列が挿入される少なからずすべての領域が含ま れる。もし、すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質転換さ れたベクターに残るであろう、しかし、そのような領域には機能的な欠失が生ず る。もし、その領域の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場合、 機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。

よって、マレック病ワクチンを改善する上で３つの戦略が考えられるであろう。

すなわち、　（１）選択的ＭＤＶ遺伝子を発現する組換えＨＶＴをつくること、 　（２）ＭＤＶの高病原性株の欠失または挿入により、病原性が減少してワクチ ンとして好適なものとなった突然変異株をつくること、　（３）伝染性上皮腫の ような他のベクター内で遺伝子発現する組換えウィルスをつくることである。

ＨＶＴまたはＭＤＶがウィルスまたはベクターであるワクチンを合成するために 、ウィルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。この場 合に用いる培地は１９９培地（ウェルカムまたはフローラボラトリーズ）のよう な標準的な培養液を使用し、この培養液で３７℃、３ないし４日間増殖させる。

細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシドと４％牛血清を含む培養 液に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて封をし、そのアンプルを液体窒 素保存する。

通常、予防接種（ワクチン投与）は生後１日経過したニワトリにひよこに対して おこなわれ、約１，０００プラ一ク形成単位を筋肉注射することによってワクチ ン投与が実施される。この後、数日で免疫ができる。

本発明にもとづくワクチンは、ＭＤＶに感染しゃすい鳥（ｆｏｗｌ）　、例えば 商業的に利用される、鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家禽類を保護するた めに用いられるものである。

以下、本発明の好適な実施態体を添付した図を参照しながら実施例にもとづいて 説明する。

第１図は、ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺伝子の位置を示すＭＤＶの 地図である。

第２図は、ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示す もので、ＭＤＶの各ヌクレオチドに添えられた番号が記されている。ＨＶＴのｇ Ｂ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれている。

相同性は垂直の棒によって示されている。そして、ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴ のｇＢ遺伝子と間のアミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。

第３図は、ｇＨ（破線）、ＴＫ（黒塗）および主キャプシドタンパク質（ＭＣ２ １点）の各遺伝子の位置を示すもので、またそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨ で表わしている。

第４図は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子に骸当するヌクレオチド配列のほぼ全体を示すも ので、またその配列に対応するアミノ酸配列な線上に示した。

第５図は、ＨＶＴのＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示すもので、ＨＶＴの各ヌ クレオチドに添えられた番号が記されている。ＭＤＶのＴＫ遺伝子に該当する部 分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれている。相同性は垂直の棒によ って示されている。そして、ＭＤＶのＴＫ遺伝子とＨＶＴのＴＫ遺伝子と間のア ミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。

第６図は、ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す もので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

第７図は、ＶＺＶ６２／Ｈ３Ｖ−１（７）ＩＥ−１７５遺伝子（ＤＨＶＴ相同遺 伝子のヌクレオチド配列部分を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配 列を線上に示した。

第８図は、ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子のヌク レオチド配列の部分を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上 に示した。

第９図は、ＭＤＶのりボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子のヌク レオチド配列の部分を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上 に示した。

第１０図は、ＭＤＶのりボヌクレオチド還元酵素（小サブユニット）遺伝子のヌ クレオチド配列の部分を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線 上に示した。

第１１図は、Ｈ３Ｖ−１のＩＥ−１７５遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子のヌクレオチ ド配列の部分な示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示し た。

第１２図は、Ｈ３Ｖ−１のＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子のヌクレオチド 配列の部分を示すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した 。

第１３図は、ウィルスのゲノムの非必須領域とプラスミドベクターにクローン化 されたＤＮＡの領域との相同組換えの概略を説明するための図である。

第１４図は、第４図および第５図の補足図であって、ヌクレオチドと、ＭＤＶお よびＨＶＴのＴＫ％　ｇＨおよびフランキング遺伝子を含む領域から予想される アミノ酸配列を示している。ひとまとめにされたアミノ酸配列は、ヌクレオチド 配列のこの領域にて確実にコードされ、それは上流ＡＴＧトリプレットが真の遺 伝子挿入部位である場合に限られる。直線上に能率よく配列するために配列のな かに空隙が設けられている。ＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡ配列の間にあるコロン は、２つのウィルス間において保存されたヌクレオチドを示している。ＭＤＶア ミノ酸はＨＶＴとは異なる位置に示される。

第１５図は、ＨｓＶｇＤのＭＤＶ相同遺伝子の部分的なヌクレオチド配列を示す もので、予想されるアミノ酸配列はＭＤＶおよびＨ５Ｖ−１のｇＤ領域間で保存 される大型のＭＤＶヌクレオチド配列と残基である。

実施例ニ一般的アプローチ バクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された鳥ヘルペスウィルスの短 配列を選んで、それを興味ある遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断 片を同定するためのプローブとして用いた。このような同定は制限断片のサザン ブロットハイブリダイゼーションによってなされた。詳しくは、以下に説明する 。

ウィルスの株　ＮＤＶの高い癌誘発性（ｈｉｇｈ　ｏｎｃｏｇｅｏｉｃ）を有す るＲＢＩＢ株（Ｓｃｈａｔ、　Ｋ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｖｉｉｎ　Ｐａｔｈ ｏｌ、　１１．５９３−６０５．１９８２）を米国のコーネル大学Ｂ、カルネツ ク（Ｂ、Ｃａ１ｎｅｋ）教授から入手した。このウィルスの精製は、ニワトリ腎 臓細胞の組織培養中においてプラークを形成させることによって行なった。

ニワトリＳＰＦおよびＲＩＲ内で２度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞（ｃｈｉｃｋ 　ｅ■ｂｒｙｏ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ＠；　ＣＥＦ）内で４回継代した。ニワ トリの遺伝的抵抗性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって高い癌 誘発性が示された。

ウェルカムリサーチ（’ｆｌｅｌｌｃｏｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｃｋｅｎｈａｗ＋、　Ｋｅｗｎｔ）から得たＨＶＴのＦＣ ｌ２６株（ｌｉｔｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｔ　Ｊ、Ｊｅｔ、　Ｒ ｅ＠、　ｓｉ、　５２５−５３８．１９７０）を、ＣＥＦ内で１４回継代した。

つづいて我々の研究室においてアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）およびＣＥＦ内で 増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらにＣＥＦ内で増殖させた０本 実施例のクローニングに用いるウィルスＤＮＡは元の単離かも数えて２４回の継 代がなされたウィルスがら抽出した。

組織培養　ＣＥＦは１９９培養液（ライニルカム社製）を含む回転ボトル中にお いて培養された。なお、この培養液には、ペニシルン、ストレプトマイシン、フ ァンジゾン（Ｆｕｇｉｚｏｎｅ）　（レグド、ティー、エム；　Ｒｅｇｄ、Ｔ、 Ｍ）および前記牛血清が添加されている（Ｒｏｓｓ、　Ｌ、Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、　Ｊ、　（ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２８．３７−４７．１９７５）　ａＣＫ Ｃは１０ｃｍベトリ皿中で培養した（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ、　Ａ、Ｅ、　ａｎｄ 　Ｂｉｇｇｇ　Ｐ、Ｍ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　２１５．５２８−５３０．１９６７）　。

ＭＤＶ−ＤＮＡの単離　ＲＢＩＢ感染細胞（ｃｅｌｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　 ＲＢＩＢ）を、回転ボトルのＣＥＦからなる単層に、感染の程度が一細胞あたり 約０．００１プヲ一ク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）となるようにして植つけて、３７ ℃で培養した。培養３日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換さ れた新しい培養液は、２％牛血清を含む１９９培養液である。そして、ゾーン遠 心法によって感染細胞の細胞質分画からウィルスを単離した（Ｌｅｅ、　Ｙ、Ｓ 、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｔｌ、　Ｖｉｒｏｌ、　５１．２４５−２５３． １９８０）　、ウィルスＤＮＡは、精製ウィルスをサルコシル、プロテナーゼに およびトリス緩衝液でもって一晩、３７℃で処理し、それをグリセロール勾配で もってゾーン遠心（前掲、Ｌｅｅ、　Ｙ、Ｓ、　ｅｔ　ｍｌ、　）によって精製 した。高分子量のウィルスＤＮＡをエタノールによって沈澱させた後、１０ｍＭ のトリス／ＩｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。

ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング　ｉ　μ、　ｇのＭＤＶを制限酵素ＢａｍＨ１に よって切断し、これをジフォスフォリレートｐＵｃ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１制限 部位に連結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＴＧＩ株細胞を標準 的方法（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６、５５ ７−５８０．１９８３）によって形質転換し、この形質転換細胞をアンピリジン およびＸ−ｇａｌ存在下で培養した。白いコロニーを採取し、ニックトランスレ ーションされたＭＤＶ−ＤＮＡとの雑種形成（ハイプリ代走−ション）によって その存在またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ　Ｍ、　ａ ｎｄ　Ｈｏｇｎｅａｓ、　Ｄ、Ｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　７２．３９６１．１X７５）　ｆ’− 陽性コロニーを小量で培養し、そしてホルムス（Ｈｏｌｓｅｓ、　Ｄ、Ｓ、）お よびクイグレイ（Ｑｕｉ（］ｔ７．　Ｍ、）の方法（）ｌｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ 、　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ、　Ｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、@１１ ４、１９３−２９７．１９８１）によってプラスミドＤＮＡを単離した。挿入部 位の大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消化し、それをアガロース電気泳動す ることによって調べた。その結果、工ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも少 ない塩基対からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラスミドが得られた。

ウィルスＤＮＡのランダムシーフェンシング　ソニケーション処理したウィルス ＤＮＡ断片をジフォスフォリレートＭ１３．ｍｐｌｏ　（アマ−ジャムインター ナショナルＰＬＣ）のＳｍａ　Ｉ制限部位にクローン化し、ＭＤＶ挿入部位を含 むプラークをＮＤＶ−ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定した 。

そして、その配列を３５５−ｄＡＴＰを用いたジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ、 　Ｆ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４ ．５４６３−５４６７）によって同定した。

同様な方法をＭＤＶ−ＤＮＡのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、 プラークはｐＵｃ１３含有コロニーを避けるために標識された挿入部位とのハイ ブリダイゼーションによって決定した。

実施例１：ＭＤＶのｇＢ遺伝子 ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片工３とハイブリダイズされ たＨ３ＶおよびｖｚｖのｇＢ遺伝子に対して相同性を示す（第１図参照）０ＭＤ ＶのｇＢＩ株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片のシーフェンシング が示すことによれば、その遺伝子のＮＨ３末端から始まる１／３の部分が工３を 含んでいた。この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片に３と同定された。

第１図は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子の位置を示す地図である。その遺伝 子から転写されたｍＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタンパ ク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（第３図）、これはシグナル配列ド メインの部分を構成する約２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初 期翻訳配列は他のヘルペスウィルスのｇＢ遺伝子と共通な部分、例えばシスティ ン残基の列および脂質二重層を広げることが可能な疎水性配列が存在する（Ｆｅ ｌｌｅｔ、　Ｐ、Ｅ、　ｅｔ　ｍｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５３．２４３−２ ５３．１９８５）　、　Ｌかし、ＭＤＶのｇＢ遺伝子はＨ３ＶのｇＢ遺伝子とた った４８％のアミノ酸配列の相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５ １−１９２０残基、第２図）の挿入およびグリコシレージョンによるエクストラ 部位の存在など独特の姿を示す、ＨＶＴのｇＢ（第２図）に誼当する限定された 配列データ（７０２塩基）とＭＤＶのｇＢの配列とを比較すると、これら２つの 糖タンパク質に関して７６．９％の核酸の相同性と８７．１％のアミノ酸の相同 性とが認められた。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢにおけるアミノ酸置換 は、ウィルス中和に関連したＨ５ＶのｇＨのドメインと等価な領域（１３２３− １４３３残基）に特に集中した（前掲、Ｐｅ１ｌｅｔ　Ｐ、Ｅ。

ｅｔ　ａｌ、　１９８５）　、　ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間におけるアミノ酸 置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集中された。

実施例２：　ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭＤＶのｇＨ遺伝子Ｈ５ＶのｇＨ遺伝子 に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３クローンは、遺伝子同定およびマツピングに 関するわれわれの初期の研究において同定された（前掲、Ｂｕｃｋ＋５ａｓｔｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８ｇ）　、このクローンは、プローブとして用いた場合 、ＨＶＴの６ｋｂからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）す る（第３図）。シーフェンス（配列決定）によって、この断片がカルボキシ末端 を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝子を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残 りの部分を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３，２ｋｂ）はＨｉｎｄＩＩＩ 部位と重なり合うＨＶＴのクローン化ＨｐａＩ断片とハイブリダイゼーションさ れた。

第４図は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）とフランキング配 列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ遺伝子と、Ｈ３ＶＩ、ＶＺＶおよびＥＢＶ に含まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）は、それぞれ ２０．２４および２０であった（アミノ酸が最大重なり合った数６３０．６４４ および１５３からそれぞれ推定した）。

実施例３：　ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶのＴＫ遺伝子ＨＶＴのＴＫ遺伝子の全 遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）は、前記した３、２ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩ Ｉ断片を含むものである（第３図）、遺伝子全体およびフランキング領域の配列 は第５図に示した。同様に、ＭＤＫのＴＫ遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからな るＢａｍＨＩＫ２断片を含むものである。ＭＤＫのＴＫ遺伝子の完全な配列を第 １４図に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＴＫ配列の比較室、２つの遺伝子は６０ ％のアミノ酸の同一性を有することがわかった。これとは対照的に、）（ＶＴ（ ７）ＴＫ遺伝子とＨ３ＶＩ、ＶＺＶおよびＥＢＶ（７）ＴＫ遺伝子間の同一性は それぞれたったの３０．２７および２４％であった（アミノ酸が最大重なり合っ た数３２０．３３２および１９３からそれぞれ推定した）、ＨＶＴおよびＭＤＶ のＴＫ遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、リン酸化に関連したいくつかのウ ィルスおよび真核生物のタンパク質のためのＡＴＰおよび（または）ＣＴＰ結合 部位の特徴を示した（Ｇｅｎｔｒｙ、　Ｇ、＾、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、　ＡＳｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８２．６８１５−６８１９）　、これらの 保守的な配列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位として、またＴ Ｋ−欠失突然変異体を産生ずるのに好適である。

実施例４：ＭＤＶ　（ｇＰ５７−６５）（ｇＣ相同遺伝子）のＡ抗原遺伝子Ａ抗 原遺伝子は、Ｈ３Ｖの相同遺伝子として同定されたことからワクチンの開発にと って大変興味深い遺伝子であり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコード １−る）として、また非必須領域として用いられる。このＡ抗原遺伝子は、ＭＤ ＶのＢａｍＨＩＢ断片の中に置かれており（Ｉｓｆｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　１９ １１？）　、ＭＤＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されている（Ｃ ｏｕａｓｅｎａ　ａｎｄ　Ｖｅｌｉｃｅｒ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＯＰｌｇ、５１ ．　Ｖｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　９−１４＾普iｏａｔ、　（ １９８７）　Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、　Ｃａｎａｄａ；Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２． ２３７４−２３７９）　、前記したランダムなシーフェンス決定に関する研究過 程において、Ａ抗原遺伝子発現産物であるＭ１３クローン（Ｎｏ、　１３０）を 同定した。よって、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＲ８１８株から得られ た２、３ＫｂｐのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１／　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ　Ｉ断片を同定するのに 用いた。そして、この断片を標準的な方法により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によっ て裂かれたｐＵｃ１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢＩＢのＡ抗原の 配列と予想されるアミノ酸配列とは第６図に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗 原領域は非必須遺伝子であり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位として好適で あり、その中に相同組換えによって他の遺伝子が挿入されよう、このことはいく つかの証拠から支持される。それらの証拠を以下に示す。

（１）われわれの研究において、他のＲＢＩＢのＡ抗原が単離され、かつ配列決 定された。これは３′からＡ抗原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらなった（ Ｔ’ａ　４５　ｈａ＠ｅｓ　３°ｔｏ　ｔｈｅ　Ａ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＡＴＧ　 ｃｏｄｏｎ）余分な（エクストラ）Ｔ残基を有する。このエクストロラＴは遺伝 子に機能的なＡ抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシフト変異 を引き起こす。この遺伝子は複製ＭＤＶからクローン化可能であるので、その結 果Ａ抗原はウィルスにとって非必須的なものであることになる６ （２）同様な研究から、ＭＤＶ（７）Ａ抗原はＨ８ｖのｇＣおよびＰＲＶ（７） ｇｐＩＩＩ糖タンパク質と相同であることが明らかになった。これら２つの相同 遺伝子は非必須的なものと考えられている（Ｈ３Ｖ相対体にとって、ロセンタル らの文献：　Ｒｏａｅｎｔｈａｌ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１． ２４３８−２４４７を見よ。

（３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ抗原が欠如していると判 定された株（ｃｈａｒｃｈｉｌｌ、　Ａ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｎ、 　Ｖｉｒｏｌ、　４．５５７−５６４．１９６９）またはより感度の高い２次元 免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す株が報告されている（石Ｚａｉ ｎｅ、　Ｄ、　ｅｔ　ｉｆ、　Ｖｉｒｏｌｏ（ｙ　１２１．１３３−１４６）　 。

さらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタンノ（り質にある外来エ ピトープを示すための好適な場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）であろう、これによって 、Ａ抗原遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしているオリゴヌクレ オチドをコードすることが可能であろう。

ＨＶＴベクターに遺伝子を導入するための戦略２つの可能性が描かれる、すなわ ち、　（１）ベクターの非必須的な遺伝子への挿入または（２）バクターの該当 する遺伝子に対する外来遺伝子の置換でる。

これは、ＭＤＶとＨＶＴの同じ遺伝子間の場合のような、実質的に相同を領域に のみ可能と思える。

実施例５：ＨＶＴまたはＭＤＶの非必須的遺伝子への挿入（ａ）ベクターのＴＫ 遺伝子座における挿入（１）　ＨＶＴまたはＭＤＶを鳥ベルペスウイルスの遺伝 子挿入と発現とに用いること力呵能である０例えば、挿入された遺伝子に関連し たプロモータとして（例えば、ｇＢ遺伝子発現を効果的におこなうための即時型 初期プロモーターとして）、利用可能である。

（２）　ＨＶＴまたはＭＤＶは烏ペルペスウイルスの遺伝子と＃ま関連してし＼ ない遺伝子の挿入及び発現のための一般的なベクターとして利用可能であり、最 適な発現名ためにプロモータの操作が必要とされる。

遺伝子挿入に用いられる既知の方法と実質的に同一である（前掲　５ｈｅｈ　ｅ ｔ　ａ１ウィルキーの方法（前掲　Ｓｔｏｗ　＆　Ｗｉｌｋｉｅ　Ｊ、　ｇｅｎ 、　Ｖｉｒｏｌ、　３３，４７７．１９８６）をＣＥＦの単層培養に添加した。

１時間、３７℃の条件で吸着させた後、培養駅を添加し、融合（ｃｏｎｆｌｕｅ ｎｔ）するまで１〜２日間培養した。単層をトリプシン処理し、２〜４％牛血清 含有の１９９倍地（ウェルカム）と培養駅の一部を置き換えた（１：１または２ ：１）、そして、プラーク形成が観察されるまで３７℃で培養した。このプラー ク形成は通常、４〜５日後に認められる。１ｍｇのＨＶＴ−ＤＮＡあたり、約５ ０プラークが得られるであろう。

組換えウィルスの相同組換えおよび単離のために、目的とする遺伝子を前記した ような１０：１ないし２：１のＴＫまたはｇＣおよび野生型ウィルスと共形質点 検したような非必須的遺伝子へ、挿入する。あるいは、完全な野生株を共感染（ ｃｏ−ｉｙ＋ｆｅｃｔｉｏｎ）に用いることが可能である。

ＨＶＴのＦｃ−１２６株のＴＫ遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することにもち いられる制限酵素は、ＢａｎＩＩ、Ｂｓｐ１２８６．ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ 、　Ｈｉ　ｎｃ　Ｉ　Ｉ、　Ｈｐａ　Ｉ、　Ｎｈｅ　ＩおよびＮ５ｐｂＩＩおよ び５ｐｈＩである。これらの制限酵素による切断（消化）部位は、ＴＫ遺伝子の 発現を妨害する外来ＤＮＡの挿入部位として用いられ、ＴＫ遺伝子部分がこれら の酵素（またＥｃｏＫも利用可）の組合せによる二重消化によって取り除かれて 不活性化される。

これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消化部位をもち、このような 部位にウィルスＤＮＡ断片がクローン化される。よって、ベクターを切断するこ となしにクローン化されたＤＮＡを直線化するために制限酵素による部分消化の 手法が用いられよう。

前記下制限酵素群には、フランキング遺伝子活性を阻害するようなものは含まれ ておらず、ＨＳＶ−１相同遺伝子がウィルスの増殖に重要な役割を果たす。

ウィルスの組換えは、　［プラークリフト　（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔｓ）　Ｊに よって検知することが可能である。このプラークリフトは、寒天培地にへばりつ いた感染細胞と放出されたウィルスをとニトロセルロースとを移すことによって 、そのニトロセルロース上で、細胞からの変性ＤＮＡと、ウィルスとをハイブリ ダイゼーションするもので、細胞のＤＮＡはヴイラレアル５の文献に（Ｖｉｌｌ ａｒｅａｌ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｅｔｅｎｃｅ　１９６．１８３−１８５ ．１９７７）プローブと鍍種形成されたウィルスを単離することにもちいること が可能である０例えば、　［プラークリフト」に用し１られるニトロセルロース に抗体処理をほどこし、つづいて抗グロプリ抗体に結合したフオトスファターゼ または標識プロティンＡのような適当な検知システムを用しすることによってこ の結合した抗体の存在を検出することができる。

適当なプロモーターをおもり目的とする遺伝子は、まず最初にクローン化ＴＫ遺 伝子に挿入される０次に、この組換えＤＮＡをひよこ胚線維芽細胞また＃よニワ トリ贅臓細胞中にベクターの感染性ＤＮＡとともにトランスフェクション（ｃｏ −ｔｒａｎｆｅｅｔｉｏｎ）させる、そして、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉ ｒ）含有培地で増殖させることによってＴＫウィルスを選別する（Ｓｃｈａｔ、 　Ｋ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４．１５ ９−２７０．１９８４）　。

別の方法として、プラークは、ニトロセルローズ上での「プラークリフト」およ び関連標識プローブとのハイブリダイゼーションにもちいられる目的とする遺伝 子の存在についてスクリーニングされる。

また、プラークは、モノクローナル抗体または抗ペプチド抗体を用νまたニブト ープ発現についてスクリーニングされる。

このような戦術の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子を含むウィルス の組換え体を得るチャンスを増大させることである。また、最適な発現のための プロモータを選ぶことがかのうとなることである。よって即時型初期プロモータ の利用は、潜伏感染細胞における発現を可能とする。

（ｂ）ベクターに存在する他の非必須的部位への挿入Ａ抗原遺伝子（ＨＶＴおよ びＭＤＶ相同遺伝子）は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）およびガラス器内（ｉｎ　 ｖｉｖｏ）系でのウィルス増殖にとって必須的なもので）まなし１ので、外来遺 伝子の挿入および発現のための好適な部位となろう。さらに、Ａ抗原ｔｉ、もっ とも豊富な抗原の一つで分泌されるものであることから、外来タンノ（り質の免 疫特性を強化することに利用されるよう、とのＡ抗原遺伝子座におけるウィルス 組換え体の単離は、目的とする遺伝子の少なくとも一部分がｇＣ遺伝子にあるク レームにまず挿入さ札そして感染性ウィルスＤＮＡとともにトランスフェクショ ンされることによって達成される、配列特異的プローブまたは特異的抗体による ウィルスプラークのスクリーニングは、組換体の単離を可能とする。

また、抗原コード配列（ａｎｔｉｇｅｎ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）をＨＶＴまたはＭＤＶのりビヌグレオチドリダクターゼ（大サブユニット）に 挿入することが可能である（図８および図９参照）。

実施例６：ＨＶＴにおけるＭＤＶ遺伝子の相同遺伝子に対するＭＤＶ遺伝子置換 置換は、図５に示したクローン化されたＭＤＶ配列と感染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの 同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって達成さ れる。ＭＤＶのＲＢＩＢ株から誘導されたｇＢおよびｇＣ遺伝子をＨＶＴに含ま れるものと置換することは、ＭＤＶのｇＨ遺伝子の糖タンパク質遺伝子および即 時形初期遺伝子の置換としての効果があるであろう。

ＭＤＶ配列とニブトープとを発現する組換え体は、ＭＤＶ−特異的モツクローン 抗体または前記したＭＤＶのユニーク配列抗ペプキド抗体を用し嘔ことによって 検出できる。

この方法の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、相対的単純な方 法であるということである。しかし、実質的に相同遺伝子は除く。

実施例７：ＭＤＶのＴＫ−突然変異体を得るための戦略欠失突然変異欠失を、遺 伝子のどの場所にでも生じさせることが可能である。たとえば、ヌクレオシド結 合に必要な遺伝子のドメンに対してである。これらは、制限酵素による二重消化 （ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって達成される。ここで用し鳴れる 制限硬派、Ｂａ１１．ＮｄｅＩ、５ｐｈＩまたはＥｃｏＫである。二重消化後、 適当な断片を再結合させ、つづいてウィルスＤＮＡとの共トランスフェクション （ＣＯ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または、ウィルス感染細胞へのトランスフ ェクションを実施する。

制限酵素の選択などによる異種配列の挿入に関しては、第７図および第８図を参 照してもらいたい。

ＴＫ−ウィルスは、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ　（前掲Ｒｏｓｓ、　Ｎ 、　１９８５）または、ＦＭＡＵ　（前掲、５ｃｂａ　ｔ　＋　Ｋ−＾、　ａｔ 　ｅｌ、　１９８４）の存在下において選別される。よって、ハイブリダイゼー ションによって、プラーク精製クローンにおけるに遺伝子の欠失部位の不存在に 関して調べた。

ＭＤＶの欠失突然変異体それ時代をワクチン合成のための弱毒化ウィルスとして いもちいること、また挿入されたヘテロな抗原遺伝子配列をもつ物としてもちい ることが可能である。

挿入突然変異　ヘルペスウィルスプロモーターまたは他の適当な配列またはシグ ナル塩基による調整下にある機能的β−ガラクトリダーゼ遺伝子は、ＴＫ活性か によって重要なＴＫ遺伝子のドメインにまず誘導される。そして１組換体ＤＮＡ は感染性１ノイルスＤＮＡと同時トランスフェクションするか、もしくはウィル ス感染制帽にトランスフェクションして、総量組換えを起こす、アセロビルまた はＦＭＡＵ存在下における選別はＴＫ−挿入突然変異体を生じさせるであろう、 もし、β−ガラクトシダーゼが導入されたとしたら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存 在下で青い色のプラークが生じることによって検出される。

必要に応じてＴＫ遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクローン 化することができる。

実施例８：ＨＶＴへのＭＤＶのＲＢＩＢ株ｇＤに存在する遺伝子の挿入ＨＶＴの ＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵＣＢにフロー化し、ｐＴＫＩＢと呼ばれる プラスミドを作る。このプラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラスミド 分を切断する制限エンドをするヌクレアーゼＲｓｒＩＩ（第５図のヌクレオチド −１９７、酵素認識部位（ＧＧＡＣＣＧ）によって直線か摺る。これによって、 　［粘着性（ｓ　ｔ　Ｉ　ｃｋｙ）Ｊ端末が生じ、この生じた端末を通常の方法 （参考文献：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　＋９８２）によって修復する。

ＲＢＩＢのｇＢ遺伝子を独自に２つのプラスミド上にクローン化し、それぞれＲ ＢＩＢ−ＢａｍＨｌ−Ｉ３およびＲＢＩＢ−ＢａｍＨｌ−に３と命名した。一つ のプラスミド上にある完全な複製ｇＢ遺伝子を生じさせるために、両方のプラス ミドをＢａｍＨｌで切断し、そして断片を連結（リゲーション）し、目的通りに 作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。しかし 、前記したように、完全なｇＢ配列は実質的にＥｃｏＲＩ／５ａｌＩ断片上に得 られた。ＭＤＶのｇＢ遺伝子をコードする配列およびその操作に関するさらなる 情報はロスらの文献（Ｒｏ■ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｔａｌ、　７ ０．１７８９−１８０４．１９８９）に開示された単一組換えプラスミドをＥｃ ｏＲＩおよび５ａｌＩで切断し、末端を修復して、そのプラスミドを、前記のよ うに合成されたＰＴＫＩＢにクローン化した。

また、ＭＤＶのｇＢオープンリーディングフレームは、Ｈｉ　ｎ　ｃ　Ｉ　Ｉお よびＮａｅＩによる消化によって、プラスミドＭＳＢ２７から切り出さね、部分 的にＨｐａＩによって切断されたＨＶＴのＴＫプラスミドｐＴＫＩＢに連結され る。ＴＫとｇＢの両配列を含む組換体プラスミドはハイブリダイゼーションによ って同定され。さらにサザンプロットによって分析される。そして、組換体プラ スミドはＨＶＴウィルス（ウィルスＤＮＡを含む細胞に誘導され、ＴＫ遺伝子の ｇＢ遺伝子を導入することにより、相同組換えがおこなわれる。ＨＶＴウィルス 組換え体はアシクロビルまたはＦＭＡＵによって選別され、あるいは標識ｇＢＢ ａ−ブによって検出される。

実施例９：ＨＶＴに挿入されるＲＢＩＢのｇＣ（Ａ抗Ｗ）遺伝子末端が鈍くなっ た（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｅｄ）　ＰＴＫ　Ｉ　Ｂを実施例８に示されるようにし て合成した。ＲＢＩＢのｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼＥｃｏＲ１および Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　（ｐｕｃ１３ポリリンカーに含まれる部位）これによっ て生じた粘善性末端標準的なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復 されたｇＢ断片を実施例８に示したようにして直線化された末端修復ｐＴＫＩＢ にクローン化した（クローニングは、制限酵素によって得られるクローンの分析 放射性同位元素標識断片によるブロービング、またはＤＮＡシークエンシング、 またはこれらの組合せによって変化にとんだものである。

ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢＩＢのｇＣ遺伝子をもつプラスミドを、リン 酸カルシウムによる沈澱またはエレクトロンボレーション（電気穿孔）によりて ＨＶＴ−感染細胞にトランスフェクションさせた０ｇＣ遺伝子の両端をクロスオ ーバー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）させたＨＶＴウィルスとＨＶＴのＴＫプラスミ ドのフランキング配列との間の相同組換えは、ＲＢＩＢのｇＣ遺伝子をＨＶＴの ウィルスゲノムへ運ぶ、ウィルス組換え体は、前記の用にして、ＴＫ−とじて選 ５１１され、またはブロービングによって同定される。類似の方法として、すで シこ述べられ、力１つ図に示されたそれらの遺伝子などを、ここで開示したＨＶ Ｔの非ｌ、須的ゲノムに挿入するためのフローニング戦略を適用するために用し λられるものであり、またはＨＶＴ中の抗原遺伝子を作るために利用される。

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（２）別紙のとおり委任状および訳文を提出します。

国際調査報告 ｌｅ＋−畦・ＭＩＡ―圃−１・　ＰＣＴ／ＧＢ　８９１０１０７６Ｉ■拳ｌｌ１ １−−Ｐ膠１ムーＡｌｌｌＩ＋１＠内−−・ＰＣＴ／ＧＢ８９１０１０７６ＩＲ −帥一−＾坤−ｍ−Ｎ・ＰＣＴ／ＧＢ　８９１０１０７６国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヌクレオチド配列であって、前記配列は前記配列と結合した野生株ウイルス 内において前記配列に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグループ から選ばれることによって成り立つ： （ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＭＤＶの遺伝子、または前記相同遺伝子の８ １６−８６３、１３７７−１５９５、１３７７−１６３０、１８２４−１９８５ 部分、（ｂ）ＨＤＶのｇＨ遺伝子と相同なＭＤＶの遺伝子、（ｃ）ＭＤＶのＴＫ 遺伝子、 （ｄ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−１７５と相同なＭＤＶの遺伝子、（ ｅ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−６８と相同なＭＤＶの遺伝子、（ｆ） ＨＳＶのｇＤ遺伝子と相同なＭＤＶの遺伝子、ＨＳＶのｇＣと相同なＭＤＶの遺 伝子の４８３−６３３、８４３−９３３、１２０３−１２７８の部分、または， それらのマナー変異。 ２．請求の範囲第１項記載にもとづく配列であって、前記配列は遺伝暗号部分と （または）、前記配列の少なくとも５′もしくは３′側の非遺伝暗号部分とによ って構成さることを特徴とする。 ３．請求の範囲第１項または第２項（ｃ配列を除く）記載にもとづくプラスミド ベクターを含む配列であって、前記プラスミドベクターはＭＤＶ−、またはＨＶ Ｔ−感受性細胞のトランスフェクションに適当であることを特徴とする。 ５．請求項第５項記載の雑種ウイルスベクターであって、前記ベクターは異種的 な挿入として配列（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）より構成され、ＭＤ ＶまたはＨＶＴ感受性細胞のトランスフェクションに適当であることを特徴とす る。 ６．請求の範囲第５項記載のウイルスベクターであって、前記配列はＨＶＴの非 必須的部分に挿入まれることを特徴とする。 ７．請求の範囲第６項記載のウイルスベクターであって、前記非必須的部分はＨ ＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域、またはリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニ ット）遺伝子もしくはＴＫ遺伝子であることを特徴とする。 ８．（ａ）、（ｂ）、（ｆ）配列、または前記配列（ａ）、またはＨＳＶのｇＣ 遺伝子に相同なＭＤＶの遺伝子の４８３−６３３、８４３−９３３、１２０３− １２７８配列の何れか一つによって遺伝情報が指定されることを特徴とするペプ チド。 ９．ＴＫ−であることによって突然変異となったことを特徴とするＭＤＶウイル ス。 １０．請求の範囲第５項ないし第７項のいずれか一項記載にもとづくＭＤＶ−感 受性細胞とウイルスベクターとから構成されるワクチン、または請求の範囲第９ 項にもとづく突然変異ＭＤＶウイルスであって、前記ウイルスは少なくとも部分 的に突然変異の結果として弱毒化されることを特徴とする。 １１．病気治療のための家禽への種痘方法であって、前記方法は前記家禽に非毒 性免疫量のワクチンを接種をすることを特徴とする。 １２．請求の範囲第１１項記載にもとづく方法によって種痘されたことを特徴と する家禽。