JP3334077B2 - ウイルスワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はウイルスワクチンに関するもの
で、病気に対する免疫性と、このようなワクチンに関連
したウイルスのヌクレオチド配列とを提供することを目
的とする。

【０００２】ヘルペスウイルスは、大きな二重鎖ＤＮＡ
ウイルスで、エンベロープによって囲まれた２０面体カ
プシドからなる。このウイルスは、生物学的特性とゲノ
ム構造とにもとづいてアルファ、ベータ、およびガンマ
ヘルペスウイルスに分類される［Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｉｎｔｅｒ−ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １８，２０１−２１７］。トリヘルペスウイルスに
は、鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を
引き起こすマレック病ウイルス（ＭＤＶ）（ガンマヘル
ペスウイルス）［総説： Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．（ｅ
ｄ）Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９８５），Ｍ
ａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｂｏｓｔｏｎ］と、鶏の呼吸器系上部に感染して致
死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウイル
ス（ＩＬＴＶ）（アルファウイルス）とが含まれる。最
近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護さ
れた遺伝子を同定することを可能とするような、ＭＤ
Ｖ、ＩＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水
痘性口内炎ウイルス（ＶＺＶ）および単純ヘルペスウイ
ルス（ＨＳＶ）との間における顕著なアミノ酸配列の相
同性（ホモロジー）が発見された。これらには、ＨＳＶ
の糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶ
および七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配
列、ＴＫおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なＩＬＴ
Ｖ、ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢお
よびＶＺＶの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶの
アミノ酸配列も含まれる［Ｂａｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ
ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８
９，２０３３−２０４２］。ＭＤＶの株は３つの血清型
に分類されている。１型は病原性の株とその弱毒株、２
型は天然の非病原性株、そして３型はＨＶＴが含まれ
る。１０年以上前から、ＨＶＴによる種痘がマレック病
に対して顕著な有効性を示すことが知られている。しか
し最近になって、ＨＶＴによる種痘に対して抵抗性を示
すＭＤＶが単離されている。このようなウイルス毒性が
非常に高いＭＤＶによる鶏の損失は、米国、ヨーロッパ
および中東の地域において発生している。しかし、ＨＶ
Ｔ、２型ＭＤＶおよびＭＤＶ高ウイルス毒性株を弱毒化
して得た株からなる混合物を用いることによって、その
ような損失を確実ではないが減少させることが可能であ
る。このような知見、すなわちＨＶＴまたは２型ＭＤＶ
によって共有されないＭＤＶ型特異的エピトープが存在
するということは、われわれに抗原的には従来のワクチ
ンよりもＭＤＶに関係した改良型ワクチンを作ることが
可能であることを結論させた。［総説： Ｒｏｓｓ ａ
ｎｄ Ｂｉｇｇｓ ｉｎ Ｇｏｌｄｍａｎ Ｊ．Ｍ．ａ
ｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｍ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｌｅｕｋａ
ｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ａｇ
ａｉｎｓｔ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｕ
ｒ，ｐ１３−３１，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，１９８６］ いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニア
ウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが
示される。これらには、ＨＳＶのｇＢ［Ｃａｎｔｉｎ
Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，５９０８−
５９１２］、ＨＳＶのｇＤ［Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ．ｅ
ｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，１９３−１９７］およ
び偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）のｇＰ５０、ＨＳＶのｇ
Ｄの相同タンパク質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）［Ｍａｒｃ
ｈｉｏｌｉ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６１．３９７７−３９８１］が含まれる。な
ぜなら、ウイルスの貫通および感染力にｇＢが必須であ
ること、またヘルペスウイルス間で保存されているｇＢ
とその相同タンパク質は重要な免疫源であるからであ
る。さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在することは、
体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標
的となる［Ｂｌａｃｋｌａｗｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．
Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１１０３−１１１４
（１９８７）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ，
Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６９，１７３１−１７３４］。最近になって報告さ
れたＨＳＶの糖タンパク質ｇＨもまた感染力にとって必
須なものであり、また重要な免疫源でもある［Ｄｅｓａ
ｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６９，１１４７−１１５６］。また、ｇＣの
相同タンパク質であるＰＲＶのｇＩＩＩも中和抗体の主
標的および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要である
が、かならずしも必須のタンパク質ではないことが知ら
れている。しかし興味深いことは、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞
毒性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな
出現である［Ｋｏｚｉｎｏｗｓｋｉ Ｕ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．２０５４−２
０５８］。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染
リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重要な
役割を担うことができよう。なぜなら、マレック病の腫
瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時型
初期ＲＮＡ転写産物が検出されるからである。また、ボ
ックスウイルスワクシニアをベクターとして用いて作ら
れた多くの組換えワクチンが報告されており、また外来
遺伝子発現のためにヘルペスウイルスをベクターとして
用いた場合も報告されている。よって、肝炎抗原はＨＳ
Ｖで発現されている「Ｓｈｉｈ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．
（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，５８６７−５８７０］。またヒト組
織プラズミノーゲン活性因子はＰＲＶで発現されている
［Υｈｏｍｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）
Ｇｅｎｅ５７，２６１−２６５］。これら両者の場合、
外来遺伝子は非必須的なヘルペス遺伝子のクローン化断
片内に挿入され、相同組換えによってウイルスベクター
に組み込まれる。肝炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイ
ルスプロモーターに融合され、また組換えＤＮＡはＨＳ
ＶのＴＫ遺伝子に挿入される。組換えＤＮＡと野生型Ｈ
ＳＶＤＮＡとの同時トランスフェクションにつづく相同
組換えによって肝炎抗原を発現するＴＫ−ウイルスが得
られる。ＰＲＶの場合、ＵｓにマッピングされたｇＸ遺
伝子を外来遺伝子の挿入部位として用いられる。ここで
用いれる戦略は、ＨＳＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失ＰＲＶ
突然変異体（ＴＫ陽性ウイルス）に挿入することを含む
ものである。そして、プラズミノーゲン活性因子はＨＳ
ＶのＴＫ遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え
体を相同組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−ウイ
ルスを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する
［前掲、Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．］。同様に、Ｖ
ＺＶをベクターとして使用する［Ｌｏｗｅ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，３８９６−３９００］。いくつ
かのヘルペスウイルス遺伝子も毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃ
ｅ）に関連しており、またインビトロの系における増殖
に必須のものでないことが知られている。これらにはＨ
ＳＶのＴＫ遺伝子［Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｔ．ｅｔａ
ｌ．（１９７４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２４，４６
５−４８０；Ｆｉｅｌｄ，Ｈ．ａｎｄ Ｗｉｌｄｙ，
Ｐ．，（１９８７）Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ）８１，２６７−２７７］およびＰＲＶのＴＫ遺
伝子が含まれる。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失によっ
て容易に減少される［Ｔａｔａｒｏｖ，Ｇ．（１９６
８）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ １５Ｂ，８
４８−８５３］。さらに、ＰＲＶのバルサ（Ｂａｒｔｈ
ａ）株の減少はＵｓにマッピングされた非必須的糖タン
パク質ｇｌの欠失にもとづく［Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅ
ｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６
１，４０３０−４０３２］。長い非反復配列の側面を守
る間在繰り返し領域（ＴＲＳ）に存在するＨＳＶマッピ
ングの遺伝子は、病原性に関係している［Ｒｏｓｅｎ，
Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒ
ｃｈ ５，１５７−１７５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．
Ｌ．ｅ ａｌ．（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３
１，１８０−１９２］。ＨＳＶのいくつかの付加的な遺
伝子はインビトロの系における増殖には非必須である
が、毒力に関係していると報告されている。これらに
は、ＵＬ２４（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．，（１９８
２），Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６３，２７７−２９
５）、リボ核酸還元酵素の大サプユニット（Ｇｏｄｓｔ
ｅｉｎ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．（１
９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，１９６−２０５）、ｇ
Ｃ（Ｄｒａｐｅｒ Ｋ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．（１９８４）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，５７８−５８５）、ｄＵＴＰア
ーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｂ．ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｏ
ｎ，Ｖ．Ｇ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８，
１９０−１９７）、そしてＵＬ５５およびＵＬ５６（Ｍ
ａｃＬｅａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｍ．
（１９８７）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１３３９
−１３５０）が含まれる。さらに、ＵｓにおけるＨＳＶ
マッピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系に
おける増殖に非必須である［Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，５７６
−５７９］。ＷＯ８８／０７０８８（１９８８年９月２
２日発行）はＨＶＴまたはＭＤＶにもとづいた雑種ウイ
ルスベクターを開示しており、またそれは非必須部位に
ある興味深い遺伝子、例えばプロテインＡをコードする
領域またはＴＫ領域を含むものである。この文脈では、
プロテインＡは、ヴェリサー（Ｖｅｌｉｃｅｒ）および
クーセンズ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）によって開示されたｇ
Ｃと同様のものとして現われる。 本発明の概要 本発明は、ひとつのヌクレオチド配列を提供するもので
あり、このヌクレオチド配列に関連した野生型ウイルス
内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他
の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、
（ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、（ｂ）
ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、（ｃ）ＭＤＶ
のＴＫ遺伝子、（ｄ）ＨＳＶ−１の即時型初期遺伝子Ｉ
Ｅ−１７５のＭＤＶ相同遺伝子、（ｅ）ＨＳＶ−１の即
時型初期遺伝子ＩＥ−６８のＭＤＶ相同遺伝子、（ｆ）
ＨＳＶのｇＤ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、そしてそれら
のマイナー変異体である。さらに、ＨＶＴのＴＫ配列
（以下の記載においてしばしば配列（ｘ）と表わす）
と、ＨＳＶのｇＣ遺伝子のＭＤＶ類似配列（以下の記載
においてしばしば配列（ｙ）と表わす）、そしてそれら
の配列にマイナーな変異が生じたマイナー変異配列は、
あるヘテロ配列の挿入部位として、あるいはそれ自身が
異常ではない毒性の低いウイルスを得るための欠失部位
として利用されよう。前記（ａ）から（ｆ）、（ｘ）お
よび（ｙ）に記載されたそれぞれの配列は、それぞれの
配列を発現させるのに必要な停止および開始シグナルお
よびプロモーターを含む他の５’および３’非遺伝暗号
配列（ノンコーデイング配列）と結合したものであろ
う。そのような付加された配列はいわゆる野生型のもの
か、ああるいはヘテロなものであろう。特に、プロモー
ターは前記（ｄ）および（ｆ）のひとつと結合している
であろう。前記した「マイナー変異配列」という言葉の
意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産物
そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌクレ
オチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドの
マイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コード）
するためにベクターに挿入される配列の場合、配列にと
って必須なこととは配列がタンパク質または糖タンパク
質をコードしていることを意味する。その抗原の持つ抗
原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配列の
保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるよ
うな配列内における保守的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉ
ｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ）はこのようなマイナー変異に含
まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列のな
かで、抗原タンパク質そのものをコードする部分のみが
使用される。そのような部分とは、例えば、ＭＤＶのｇ
Ｂ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の８１６−８６
３、１３７７−１５９５、１３７７−１６３０または１
８２４−１９８５またはＮＤＶのｇＣ遺伝子に相当する
ヌクレオチド配列の１２０３−１２７８、およびそれら
のマイナー変異に該当する領域である。本発明のさらな
る態様はこれらの配列およびこれらの配列によりコード
されるペプチドによってなされる。挿入部位に相当する
配列の場合、ウイウルスの感染力と複製とに関しては、
なんら必須的なものではなく、また組換えを可能とする
ような配列と相同な配列のみが必要とされる。よって、
特定の配列への特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入
される場所から下流に向けてリーデイングフレームを完
全に変化させるものとなるであろう。抗原をコードする
配列の場合では、このような変化は好ましくないアミノ
酸配列を生ずることを意味する（フレームシフトがどこ
に生ずるかに依存する）が、挿入部位の場合は相同性の
度合いはほとんど同じであるので、組換えが容易に行な
えるであろう。挿入部位においてヌクレオチドの相同性
が７５％存在した場合、通常その配列はマイナー変異と
見なされるが、少なくとも８０、８５、９０、９５また
は９９％の相同性があることが好ましい。このような相
同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の度合いは上記の配列（ａ）
ないし（ｆ）および（ｘ）のそれぞれの全体に実質的に
関係している。短い配列は、このような長い配列を単離
または同定するためのプローブとして用いられるが、こ
の場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるた
めに高い相同性が必要とされる。よって、本発明はさら
に上記配列（ａ）ないし（ｆ）、（ｘ）および（ｙ）の
いずれかの少なくとも一部分に対して９０％（好ましく
は９５％、９９％または１００％）の相同性を有する少
なくとも１３のヌクレオチド副配列を提供するものであ
る。上記したように、配列（ａ）、（ｂ）および（ｄ）
ないし（ｆ）は抗原発現配列として好適であり、また配
列（ｙ）はヘテロ配列のための挿入部位として好適であ
る。さらに、配列（ｃ）はＴＫ−突然変異体を生じさせ
るための欠失に好適である。これらの配列は、ここで開
示された配列情報と、例えばオリゴヌクレオチドプロー
プの合成および野生型のＤＮＡとそのプローブとのハイ
プリダイゼーションとを含む標準的技術を用いることに
よって野生型（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎ
ｇ）のＨＶＴおよびＭＤＶウイルスから容易に単離可能
である。上記の配列（ａ）、（ｂ）および（ｆ）によっ
てコードされた単離ポリペプチドは、新規なものであ
り、またＭＤＶ感受性細胞における上記配列の発現によ
って生じたマイナー変異およびグリコシル化されたポリ
ペプチドとともに本発明のさらなる態様を形成する。第
二に本発明は、ＴＫ遺伝子において生じた挿入または欠
失突然変異からなるＭＤＶ突然変異体を提供するもので
ある。この突然変異は同定された領域の遺伝子コード配
列または遺伝子非コード領域にあると考えられる。ＭＤ
Ｖ抗原発現遺伝子（ＭＤＶ ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｅ）は、ＭＤＶの毒性株から単離
されてＭＤＶの毒性がそれよりも低い株に挿入される。
この挿入によってもし野生型のウイルスが生じないとし
たら新規なウイルスが生ずることになろう。他のヘテロ
な配列（抗原をコードするもの）は、例えばＭＤＶ抗原
遺伝子配列と同様に含まれよう。あるいは、ヘテロな配
列は、鳥脳脊髄炎（流行性振せん）、鳥インフルエンザ
（鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャッスル病（ＰＭ
Ｖ２ないしＰＭＶ７）以外の鳥パラマイキソバイラス
（ａｖｉａｎ ｐａｒａｍｙｘｏｉｒｕｓｅｓ）、鳥レ
オウイルス病（腸の病気、鍵しょう炎）、ニワトリ貧血
（ニワトリ貧血剤によって起こる）、胞子虫症、エッグ
ドロップ症候群（ＥＤＳ７６）、伝染性上皮腫、感染性
気管支炎、感染性粘液嚢症（グンボロ（Ｇｕｍｂｏｒ
ｏ））、封入体肝炎（アデノウイルス）、七面鳥リンパ
増殖性疾患（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ
ｄｉｓｅａｓｅ）、ニューキャッスル病、ニワトリの
細網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイル
ス腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎（ｒｈｉｎ
ｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）のいずれか一つの疾患に関係
した抗原をコードするものであろう。よって、本発明に
もとづくベクターは多価ワクチンによる保護を可能とす
る。ウイルスの突然変異体は、ヘテロな挿入配列を有す
る必要なしに毒性の低いウイルスとしてワクチンに利用
される。本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の
調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばＴＫ領域
の共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、欠
失または挿入変異されたものと全ウイルスＤＮＡまたは
全ウイルス（例えば野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のウ
イルス）を導入することである。そのようなウイルスの
むき出しとなったＤＮＡが感染性を有することはすでに
知られており、切断しないで調製した。リン酸カルシウ
ムによる沈澱によってＤＮＡを調製するのが好ましい。
この方法に用いられる適当な細胞とは、ニワトリ胚繊維
芽細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ニワ
トリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞であり、これら
はペトリ皿に単層からなる細胞集団として播種されるこ
とによって好適に増殖する。相同組換えによって形質転
換ＤＮＡと全ウイルスＤＮＡとを感染細胞内で互いに組
換え、そして目的とする組換え体をスクリーニングす
る。このスクリーニングは、例えば適当なプローブによ
るハイブリダイゼーションか、あるいは問題となってい
る領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用いた免疫ア
ッセイによる検知手段によって行なわれる。相同組換え
が行なわれるためには、ウイルスＤＮＡは複製されなけ
ればならない。現在のところＮＤＶのための細胞フリー
の複製系は知られていないが、もしそのような系が可能
となったら、本発明はそのような系で実施されよう。複
製および組換えが行なわれる環境は決定的なものではな
い。免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコードするこ
とに関与した領域として上記のようにコードされた配列
（ａ）、（ｂ）および（ｄ）ないし（ｆ）は、適当なベ
クター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウイルス、
細菌また菌類などのような他のベクター）に挿入され
る。ウイルスベクターの場合（特にヘルペスウイルスベ
クターおよび腸炎ウイルスベクター）、抗原をコードし
ている配列（適当な配列（フランキング配列）が両端に
ある）と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクターゲ
ノムとの間にそのような挿入がなされる。ＨＶＴがベク
ターである場合、プロモーターは通常、ＨＶＴまたはＭ
ＤＶベクターであろう。伝染性上皮腫ウイルスまたは他
のウイルスがベクターである場合、プロモーターは通
常、ベクターに対して外来のプロモーターであろう。細
菌および菌類の場合、抗原をコードする配列はすでに知
られている方法またはこれから発見されるであろう方法
によって挿入されよう。サルモネラ菌の非毒性株をその
ような宿主として用いることが可能である。ヘテロな配
列は宿主ゲノムに挿入されるか、または自律的に複製す
るプラスミドによって運ばれる。宿主に対して外来のプ
ラスミドは、ヘテロな配列（ウイルス抗原をコードする
配列）の遺伝子遺伝子発現の対照群として使用される。
フランキング配列は、ヘテロな配列が挿入される少なか
らずすべての領域が含まれる。もし、すべての領域が用
いられるとしたら、その領域の配列は形質転換されたベ
クターに残るであろう。しかし、そのような領域には機
能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全部ではなく一
部をフランキング配列として用いた場合、機能的な欠失
と同様の構造的欠失が生ずるであろう。よって、マレッ
ク病ワクチンを改善する上で３つの戦略が考えられるで
あろう。すなわち、（１）選択的ＭＤＶ遺伝子を発現す
る組換えＨＶＴをつくること、（２）ＭＤＶの高病原性
株の欠失または挿入により、病原性が減少してワクチン
として好適なものとなった突然変異株をつくること、
（３）伝染性上皮腫のような他のベクター内で遺伝子発
現する組換えウイルスをつくることである。ＨＶＴまた
はＭＤＶがウイルスまたはベクターであるワクチンを合
成するために、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のよう
な適当な細胞内で増殖させる。この場合に用いる培地は
１９９培地（ウエルカムまたはフローラボラトリーズ）
のような標準的な培養液を使用し、この培養液で３７
℃、３ないし４日間増殖させる。細胞をトリプシン処理
し、１０％ジメチルスルホキシドと４％牛血清を含む培
養液に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて封を
し、そのアンプルを液体窒素保存する。通常、予防接種
（ワクチン投与）は生後１日経過したニワトリにひよこ
に対しておこなわれ、約１，０００プラーク形成単位を
筋肉注射することによってワクチン投与が実施される。
この後、数日で免疫ができる。本発明にもとづくワクチ
ンは、ＭＤＶに感染しやすい鳥（ｆｏｗｌ）、例えば商
業的に利用される、鶏、七面鳥、あひる、がちょうなど
の家禽類を保護するために用いられるものである。以
下、本発明の好適な実施態体を添付した図を参照しなが
ら実施例にもとづいて説明する。

【０００３】実施例：一般的アプローチ バクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。ウイルスの
株 ＮＤＶの高い癌誘発性（ｈｉｇｈ ｏｎｃｏｇｅｎ
ｉｃ）を有するＲＢ１Ｂ株（Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１１，５９３−６
０５，１９８２）を米国のコーネル大学Ｂ．カルネック
（Ｂ．Ｃａｌｎｅｋ）教授から入手した。このウイルス
の精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織焙養中においてプラ
ークを形成させることによって行なった。ニワトリＳＰ
ＦおよびＲＩＲ内で２度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞
（ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｓ；ＣＥＦ）内で４回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗
性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって
高い癌誘発性が示された。ウエルカムリサーチ（Ｗｅｌ
ｌｃｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｂｅｃｋｅｎｈａｍ，Ｋｅｗｎｔ）から得たＨＶ
ＴのＦＣ１２６株（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａ
ｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３１，５２５−５３
８、１９７０）を、ＣＥＦ内で１４回継代した。つづい
て我々の研究室においてアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）
およびＣＥＦ内で増殖させた。そして、プラーク精製を
行ない、さらにＣＥＦ内で増殖させた。本実施例のクロ
ーニングに用いるウイルスＤＮＡは元の単離から数えて
２４回の継代がなされたウイルスから抽出した。組織焙
養 ＣＥＦは１９９焙養液（ウイエルカム社製）を含む
回転ボトル中において培養された。なお、この培養液に
は、ペニシルン、ストレプトマイシン、ファンジゾン
（Ｆｕｇｉｚｏｎｅ）（レグド．テイー．エム；Ｒｅｇ
ｄ．Ｔ．Ｍ）および前記牛血清が添加されている（Ｒｏ
ｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．２８，３７−４７，１９７５）。ＣＫＣは１０ｃｍ
ペトリ皿中で培養した（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．
ａｎｄ Ｂｉｇｇｓ Ｐ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，２１
５，５２８−５３０，１９６７）。ＭＤＶ−ＤＮＡの単
離 ＲＢＩＢ感染細胞（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄＲＢ１Ｂ）を、回転ボトルのＣＥＦからなる単層に、
感染の程度が一細胞あたり約０．００１プラーク形成単
位（ｐｆｕ）となるようにして植つけて、３７℃で培養
した。培養３日目で、培養液を捨てて新しい焙養液と交
換した。交換された新しい培養液は、２％牛血清を含む
１９９培養液である。そして、ゾーン遠心法によって感
染細胞の細胞質分画からウイルスを単離した（Ｌｅｅ，
Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５１，
２４５−２５３，１９８０）。ウイルスＤＮＡは、精製
ウイルスをサルコシル、プロテナーゼＫおよびトリス緩
衝液でもって一晩、３７℃で処理し、それをグリセロー
ル勾配でもってゾーン遠心（前掲、Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．）によって精製した。高分子量のウイルスＤ
ＮＡをエタノールによって沈澱させた後、１０ｍＭのト
リス／ＩｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７．
５）に懸濁した。ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング １μ
ｇのＭＤＶを制限酵素ＢａｍＨ１によって切断し、これ
をジフォスフォリレートｐＵＣ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１
制限部位に連結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）のＴＧ１株細胞を標準的方法（Ｈａｎａｈａｎ，
Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０，
１９８３）によって形質転換し、この形質転換細胞をア
ンピリシンおよびＸ−ｇａｌ存在下で焙養した。白いコ
ロニーを採取し、ニックトランスレーションされたＭＤ
Ｖ−ＤＮＡとの雑種形成（ハイブリ代是ーション）によ
ってその存在またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Ｃ
ｒｕｎｓｔｅｉｎ Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．
Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７２，３９６１，１９７５）た。陽性コロニーを小
量で焙養し、そしてホルムス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．
Ｓ．）およびクイグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．）の方
法（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ Ｑｕｉｇｌｅｙ，
Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，１９３−２
９７，１９８１）によってプラスミドＤＮＡを単離し
た。挿入部位の大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消
化し、それをアガロース電気泳動することによって調べ
た。その結果、１ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）より
も少ない塩基対からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラス
ミドが得られた。ウイルスＤＮＡのランダムシークエン
シング ソニケーション処理したウイルスＤＮＡ断片を
ジフォスフォリレートＭ１３．ｍｐ１０（アマーシャム
インターナショナルＰＬＣ）のＳｍａＩ制限部位にクロ
ーン化し、ＭＤＶ挿入部位を含むプラークをＮＤＶ−Ｄ
ＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定し
た。そして、その配列を３５Ｓ−ｄＡＴＰを用いたジデ
オキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４，５４６３−５
４６７）によって同定した。同様な方法をＭＤＶ−ＤＮ
Ａのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プ
ラークはｐＵＣ１３含有コロニーを避けるために標識さ
れた挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定
した。 実施例１： ＭＤＶのｇＢ遺伝子 ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片１
３とハイブリダイズされたＨＳＶおよびＶＺＶのｇＢ遺
伝子に対して相同性を示す（第１図参照）。ＭＤＶのＲ
Ｂ１株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片の
シークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のＮ
Ｈ３末端から始まる１／３の部分がＩ３を含んでいた。
この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片Ｋ３と同
定された。第１図は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子
の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタ
ンパク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（第３
図）。これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約
２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初期
翻訳配列は他のヘルペスウイルスのｇＢ遺伝子と共通な
部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広
げることが可能な疎水性配列が存在する（Ｐｅｌｌｅ
ｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３，２４
３−２５３，１９８５）。しかし、ＭＤＶのｇＢ遺伝子
はＨＳＶのｇＢ遺伝子とたった４８％のアミノ酸配列の
相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５１−
１９２０残基、第２図）の挿入およびグリコシレーショ
ンによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示す。Ｈ
ＶＴのｇＢ（第２図）に該当する限定された配列データ
（７０２塩基）とＭＤＶのｇＢの配列とを比較すると、
これら２つの糖タンパク質に関して７６．９％の核酸の
相同性と８７．１％のアミノ酸の相同性とが認められ
た。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢにおけるアミ
ノ酸置換は、ウイルス中和に関連したＨＳＶのｇＢのド
メインと等価な領域（１３２３−１４３３残基）に特に
集中した（前掲、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．
１９８５）。ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間におけるアミ
ノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集中
された。 実施例２： ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭＤＶのｇＨ遺
伝子 ＨＳＶのｇＨ遺伝子に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３
クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれ
われの初期の研究において同定された（前掲、Ｂｕｃｋ
ｍａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８８）。このクローン
は、プローブとして用いた場合、ＨＶＴの６ｋｂからな
るＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）す
る（第３図）。シークエンス（配列決定）によって、こ
の断片がカルボキシ末端を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝
子を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残りの部
分を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．２ｋｂ）
はＨｉｎｄＩＩＩ部位と重なり合うＨＶＴのクローン化
ＨｐａＩ断片とハイブリダイゼーションされた。第４図
は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）
とフランキング配列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ
遺伝子と、ＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶに含まれるそ
の相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）
は、それぞれ２０、２４および２０であった（アミノ酸
が最大重なり合った数６３０、６４４および１５３から
それぞれ推定した）。

【０００４】実施例３： ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶ
のＴＫ遺伝子 ＨＶＴのＴＫ遺伝子の全遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）
は、前記した３．２ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片
を含むものである（第３図）。遺伝子全体およびフラン
キング領域の配列は第５図に示した。同様に、ＭＤＫの
ＴＫ遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからなるＢａｍＨ１
Ｋ２断片を含むものである。ＭＤＫのＴＫ遺伝子の完全
な配列を第１４図に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＴＫ
配列の比較空、２つの遺伝子は６０％のアミノ酸の同一
性を有することがわかった。これとは対照的に、ＨＶＴ
のＴＫ遺伝子とＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶのＴＫ遺
伝子間の同一性はそれぞれたったの３０、２７および２
４％であった（アミノ酸が最大重なり合った数３２０、
３３２および１９３からそれぞれ推定した）。ＨＶＴお
よびＭＤＶのＴＫ遺伝子から予想されるアミノ酸配列
は、リン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真核
生物のタンパク質のためのＡＴＰおよび（または）ＣＴ
Ｐ結合部位の特徴を示した（Ｇｅｎｔｒｙ，Ｇ．Ａ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＡＳｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８２，６８１５−６８１９）。これらの保守的な配列は
外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位とし
て、またＴＫ−欠失突然変異体を産生するのに好適であ
る。 実施例４：ＭＤＶ（ｇＰ５７−６５）（ｇＣ相同遺伝
子）のＡ抗原遺伝子 Ａ抗原遺伝子は、ＨＳＶの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードす
る）として、また非必須領域として用いられる。このＡ
抗原遺伝子は、ＭＤＶのＢａｍＨ１Ｂ断片の中に置かれ
ており（Ｉｓｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ＭＤ
ＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されてい
る（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌｉｃｅｒ，Ａｂ
ｓｔｒａｃｔ ＯＰ１８．５１，ＶＩＩ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ９−１４ Ａｕｇｕｓｔ，（１９８７）Ｅｄｍ
ｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２
３７４−２３７９）。前記したランダムなシークエンス
決定に関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物
であるＭ１３クローン（Ｎｏ．１３０）を同定した。よ
って、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＲＢ１Ｂ株
から得られた２．３ＫｂｐのＥｃｏＲ１／ＰｖｕＩＩ断
片を同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な
方法により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によって裂かれたｐ
ＵＣ１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢ１Ｂ
のＡ抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは第６図に
示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗原領域は非必須遺伝
子であり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位として好
適であり、その中に相同組換えによって他の遺伝子が挿
入されよう。このことはいくつかの証拠から支持され
る。それらの証拠を以下に示す。 （１）われわれの研究において、他のＲＢ１ＢのＡ抗原
が単離され、かつ配列決定された。これは３’からＡ抗
原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらなった（Ｔ’ｓ
４５ ｂａｓｅｓ ３’ｔｏ ｔｈｅ Ａ ａｎｔｉ
ｇｅｎ ＡＴＧｃｏｄｏｎ）余分な（エクストラ）Ｔ残
基を有する。このエクストロラＴは遺伝子に機能的なＡ
抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシ
フト変異を引き起こす。この遺伝子は複製ＭＤＶからク
ローン化可能であるので、その結果Ａ抗原はウイルスに
とって非必須的なものであることになる。 （２）同様な研究から、ＭＤＶのＡ抗原はＨＳＶのｇＣ
およびＰＲＶのｇｐＩＩＩ糖タンパク質と相同であるこ
とが明らかになった。これら２つの相同遺伝子は非必須
的なものと考えられている（ＨＳＶ相対体にとって、ロ
センタルらの文献：Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２４３８−２４４７を見よ。 （３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ
抗原が欠如していると判定された株（ｃｈｕｒｃｈｉｌ
ｌ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
４，５５７−５６４，１９６９）またはより感度の高い
２次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す
株が報告されている（Ｖａｎ Ｚａａｎｅ，Ｄ．ｅｔ
ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２１，１３３−１４６）。
さらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタ
ンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所
（ｌｏｃａｔｉｏｎ）であろう。これによって、Ａ抗原
遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしてい
るオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろ
う。 ＨＶＴベクターに遺伝子を導入するための戦略 ２つの可能性が描かれる、すなわち、（１）ベクターの
非必須的な遺伝子への挿入、または（２）バクターの該
当する遺伝子に対する外来遺伝子の置換でる。これは、
ＭＤＶとＨＶＴの同じ遺伝子間の場合のような、実質的
に相同を領域にのみ可能と思える。 実施例５：ＨＶＴまたはＭＤＶの非必須的遺伝子への挿
入 （ａ）ベクターのＴＫ遺伝子座における挿入 （１） ＨＶＴまたはＭＤＶを鳥ペルペスウイルスの遺
伝子挿入と発現とに用いることが可能である。例えば、
挿入された遺伝子に関連したプロモータとして（例え
ば、ｇＢ遺伝子発現を効果的におこなうための即時型初
期プロモーターとして）、利用可能である。 （２） ＨＶＴまたはＭＤＶは鳥ペルペスウイルスの遺
伝子とは関連していない遺伝子の挿入及び発現のための
一般的なベクターとして利用可能であり、最適な発現名
ためにプロモータの操作が必要とされる。遺伝子挿入に
用いられる既知の方法と実質的に同一である（前掲 Ｓ
ｈｅｈｅｔ ａｌ．１９８４） 前記のようにして得られたＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡ
は、抽出中においてＤＮＡの切断がおこらないような予
防策を講じることによって感染性をそこなわず保持する
ことができる。ウイルスＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱
物（ストウ及びウイルキーの方法（前掲 Ｓｔｏｗ ＆
Ｗｉｌｋｉｅ Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３３，４７
７，１９８６）をＣＥ．Ｆの単層焙養に添加した。１時
間、３７℃の条件で吸着させた後、培養駅を添加し、融
合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで１〜２日間培養し
た。単層をトリプシン処理し、２〜４％牛血清含有の１
９９倍地（ウエルカム）と培養駅の一部を置き換えた
（１：１または２：１）。そして、プラーク形成が観察
されるまで３７℃で培養した。このプラーク形成は通
常、４〜５日後に認められる。１ｍｇのＨＶＴ−ＤＮＡ
あたり、約５０プラークが得られるであろう。組換えウ
イルスの相同組換えおよび単離のために、目的とする遺
伝子を前記したような１０：１ないし２：１のＴＫまた
はｇＣおよび野生型ウイルスと共形質点検したような非
必須位的遺伝子へ、挿入する。あるいは、完全な野生株
を共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に用いることが
可能である。ＨＶＴのＦｃ−１２６株のＴＫ遺伝子への
外来抗原遺伝子を挿入することにもちいられる制限酵素
は、ＢａｎＩＩ，Ｂｓｐ１２８６，ＤｒａＩＩＩ，Ｅｃ
ｏＲＩ，ＨｉｎｃＩＩ，ＨｐａＩ，ＮｈｅＩおよびＮｓ
ｐｂＩＩおよびＳｐｈＩである。これらの制限酵素によ
る切断（消化）部位は、ＴＫ遺伝子の発現を妨害する外
来ＤＮＡの挿入部位として用いられ、ＴＫ遺伝子部分が
これらの酵素（またＥｃｏＫも利用可）の組合せによる
二重消化によって取り除かれて不活性化される。これら
の酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消化部位を
もち、このような部位にウイルスＤＮＡ断片がクローン
化される。よって、ベクターを切断することなしにクロ
ーン化されたＤＮＡを直線化するために制限酵素による
部分消化の手法が用いられよう。前記下制限酵素群に
は、フランキング遺伝子活性を阻害するようなものは含
まれておらず、ＨＳＶ−１相同遺伝子がウイルスの増殖
に重要な役割を果たす。ウイルスの組換えは、「プラー
クリフト（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔｓ）」によって検知す
ることが可能である。このプラークリフトは、寒天培地
にへばりついた感染細胞と放出されたウイルスをとニト
ロセルロースとを移すことによって、そのニトロセルロ
ース上で、細胞からの変性ＤＮＡと、ウイルスとをハイ
ブリダイゼーションするもので、細胞のＤＮＡはヴィラ
レアル５の文献に（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ，Ｌ．ｅｔ ａ
ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６，１８３−１８５．１９７
７）プローブと雑種形成されたウイルスを単離すること
にもちいることが可能である。例えば、「プラークリフ
ト」に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこ
し、つづいて抗グロブリ抗体に結合したフォトスファタ
ーゼまたは標識プロテインＡのような適当な検知システ
ムを用いることによってこの結合した抗体の存在を検出
することができる。適当なプロモーターをおもつ目的と
する遺伝子は、まず最初にクローン化ＴＫ遺伝子に挿入
される。次に、この組換えＤＮＡをひよこ胚繊維芽細胞
またはニワトリ腎臓細胞中にベクターの感染性ＤＮＡと
ともにトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ）させる。そして、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏ
ｖｉｒ）含有培地で増殖させることによってＴＫウイル
スを選別する（Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ
ｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４，１５９−２７
０，１９８４）。別の方法として、プラークは、ニトロ
セルローズ上での「プラークリフト」および関連標識プ
ローブとのハイブリダイゼーションにもちいられる目的
とする遺伝子の存在についてスクリーニングされる。ま
た、プラークは、モノクローナル抗体または抗ペプチド
抗体を用いたエプトープ発現についてスクリーニングさ
れる。このような戦術の主な利点は、前記選別方法が目
的とする遺伝子を含むウイルスの組換え体を得るチャン
スを増大させることである。また、最適な発現のための
プロモータを選ぶことがかのうとなることである。よっ
て即時型初期プロモータの利用は、潜伏感染細胞におけ
る発現を可能とする。 （ｂ）ベクターに存在する他の非必須的部位への挿入 Ａ抗原遺伝子（ＨＶＴおよびＭＤＶ相同遺伝子）は、生
体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）およびガラ不器内（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）系でのウイルス増殖にとって必須的なものではな
いので、外来遺伝子の挿入および発現のための好適な部
位となろう。さらに、Ａ抗原は、もっとも豊富な抗原の
一つで分泌されるものであることから、外来タンパク質
の免疫特性を強化することに利用されるよう、このＡ抗
原遺伝子座におけるウイルス組換え体の単離は、目的と
する遺伝子の少なくとも一部分がｇＣ遺伝子にあるクレ
ームにまず挿入され、そして感染性ウイルスＤＮＡとと
もにトランスフェクションされることによって達成され
る、配列特異的プローブまたは特異的抗体によるウイル
スプラークのスクリーニングは、組換体の単離を可能と
する。また、抗原コード配列（ａｎｔｉｇｅｎ ｅｎｃ
ｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＨＶＴまたはＭＤＶ
のリビヌグレオチドリダクターゼ（大サブユニット）に
挿入することが可能である（図８および図９参照）。 実施例６：ＨＶＴにおけるＭＤＶ遺伝子の相同遺伝子に
対するＭＤＶ遺伝子置換置換は、図５に示したクローン
化されたＭＤＶ配列と感染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの同時ト
ランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ）によって達成される。ＭＤＶのＲＢＩＢ株から誘導
されたｇＢおよびｇＣ遺伝子をＨＶＴに含まれるものと
置換することは、ＭＤＶのｇＨ遺伝子の糖タンパク質遺
伝子および即時形初期遺伝子の置換としての効果がある
であろう。ＭＤＶ配列とエプトープとを発現する組換え
体は、ＭＤＶ−特異的モノクローン抗体または前記した
ＭＤＶのユニーク配列抗ペプキド抗体を用いることによ
って検出できる。この方法の利点は、プロモーターの操
作を必要としないことと、相対的単純な方法であるとい
うことである。しかし、実質的に相同遺伝子は除く。 実施例７：ＭＤＶのＴＫ−突然変異体を得るための戦略
欠失突然変異欠失を、遺伝子のどの場所にでも生じさせ
ることが可能である。たとえば、ヌクレオシド結合に必
要な遺伝子のドメンに対してである。これらは、制限酵
素による二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏ
ｎ）によって達成される。ここで用いられる制限硬派、
ＢａｌＩ，ＮｄｅＩ．ＳｐｈＩまたはＥｃｏＫである。
二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづいてウイル
スＤＮＡとの共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）または、ウイルス感染細胞へのトラ
ンスフェクションを実施する。制限酵素の選択などによ
る異種配列の挿入に関しては、第７図および第８図を参
照してもらいたい。ＴＫ−ウイルスは、アシクロビル
（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ （前掲Ｒｏｓｓ，Ｎ．１９８
５）または、ＦＭＡＵ（前掲、Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ａ
ｔ ｅｌ．１９８４）の存在下において選別される。よ
って、ハイブリダイゼーションによって、プラーク精製
クローンにおけるＫ遺伝子の欠失部位の不存在に関して
調べた。ＭＤＶの欠失突然変異体それ時代をワクチン合
成のための弱毒化ウイルスとしていもちいること、また
挿入されたヘテロな抗原遺伝子配列をもつ物としてもち
いることが可能である。挿入突然変異 ヘルペスウイル
スプロモーターまたは他の適当な配列またはシグナル塩
基による調整下にある機能的β−ガラクトリダーゼ遺伝
子は、ＴＫ活性かによって重要なＴＫ遺伝子のドメイン
にまず誘導される。そして、組換体ＤＮＡは感染性ウイ
ルスＤＮＡと同時トランスフェクションするか、もしく
はウイルス感染制帽にトランスフェクションして、総同
組換えを起こす。アセロビルまたはＦＭＡＵ存在下にお
ける選別はＴＫ−挿入特全変異体を生じさせるであろ
う。もし、β−ガラクトシダーゼが導入されたとした
ら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存在下で青い色のプラーク
が生じることによって検出される。必要に応じてＴＫ遺
伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクロ
ーン化することができる。 実施例８：ＨＶＴへのＭＤＶのＲＢＩＢ株ｇＤに存在す
る遺伝子の挿入 ＨＶＴのＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵ−ＣＢに
フロー化し、ｐＴＫ１Ｂと呼ばれるプラスミドを作る。
このプラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラス
ミド分を切断する制限エンドをするヌクレアーゼＲｓｒ
ＩＩ（第５図のヌクレオチド一１９７、酵素認識部位
（ＧＧＡＣＣＧ）によって直線か摺る。これによって、
「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」端末が生じ、この生じた端
末を通常の方法（参考文献：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）
によって修復する。ＲＢ１ＢのｇＢ遺伝子を独自に２つ
のプラスミド上にクローン化し、それぞれＲＢ１Ｂ−Ｂ
ａｍＨ１−Ｉ３およびＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｋ３と命
名した。一つのフラスミド上にある完全な複製ｇＢ遺伝
子を生じさせるために、両方のプラスミドをＢａｍＨ１
で切断し、そして断片を連結（リゲーション）し、目的
通りに作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって同定した。しかし、前記したように、完全
なｇＢ配列は実質的にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片上に得
られた。ＭＤＶのｇＢ遺伝子をコードする配列およびそ
の操作に関するさらなる情報はロスらの文献（Ｒｏｓｓ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１７８
９−１８０４，１９８９）に開示された単一組換えプラ
スミドをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、末端を修
復して、そのプラスミドを、前記のように合成されたＰ
ＴＫ１Ｂにクローン化した。また、ＭＤＶのｇＢオープ
ンリーディングフレームは、ＨｉｎｃＩＩおよびＮａｅ
Ｉによる消化によって、プラスミドＭＳＢ２７から切り
出され、部分的にＨｐａＩによって切断されたＨＶＴの
ＴＫプラスミドｐＴＫ１Ｂに連結される。ＴＫとｇＢの
両配列を含む組換体プラスミドはハイブリダイゼーショ
ンによって同定され、さらにサザンブロットによって分
析される。そして、組換体プラスミドはＨＶＴウイルス
（ウイルスＤＮＡを含む細胞に誘導され、ＴＫ遺伝子の
ｇＢ遣伝子を導入することにより、相同組換えがおこな
われる。ＨＶＴウイルス組換え体はアシクロビルまたは
ＦＭＡＵによって選別され、あるいは標識ｇＢプローブ
によって検出される。 実施例９：ＨＶＴに挿入されるＲＢ１ＢのｇＣ（Ａ抗
原）遺伝子 末端が鈍くなった（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）ＰＴＫ１
Ｂを実施例８に示されるようにして合成した。ＲＢ１Ｂ
のｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼＥｃｏＲ１およ
びＨｉｎｄＩＩＩ（ｐｕＣ１３ポリリンカーに含まれる
部位）これによって生じた粘善性末端標準的なプロトコ
ールに基づいて再び修復した。末端を修復されたｇＢ断
片を実施例８に示したようにして直線化された末端修復
ｐＴＫ１Ｂにフローン化した（クローニングは、制限酵
素によって得られるフローンの分析放射性同位元素標識
断片によるプロービンブ、またはＤＮＡシークエンシン
グ、またはこれらの組合せによって変化にとんだもので
ある。ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢ１ＢのｇＣ遺
伝子をもつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱
またはエレクトロンポレーション（電気穿孔）によって
ＨＶＴ−感染細胞にトランスフェクションさせた。ｇＣ
遺伝子の両端をクロスオーバー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅ
ｒ）させたＨＶＴウイルスとＨＶＴのＴＫプラスミドの
フランキング配列との間の相同組換えは、ＲＢ１Ｂのｇ
Ｃ遺伝子をＨＶＴのウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組
換え体は、前記の用にして、ＴＫ−として選別され、ま
たはプロービングによって同定される。類似の方法とし
て、すでに述べられ、かつ図に示されたそれらの遺伝子
などを、ここで開示したＨＶＴの非必須的ゲノムに挿入
するためのフローニング戦略を適用するために用いられ
るものであり、またはＨＶＴ中の抗原遺伝子を作るため
に利用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺
伝子の位置を示すＭＤＶの地図である。

【図２】 ＭＤＶのＲＢ１Ｂ株に存在するｇＢ遺伝子
のヌクレオチド配列を示すもので、ＭＤＶの各ヌクレオ
チドに添えられた番号が記されている。ＨＶＴのｇＢ遺
伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下
線が引かれている。相同性は垂直の棒によって示されて
いる。そして、ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇＢ遺伝
子との間のアミノ酸の違いは線の上の線によって示され
ている。

【図３】 図２の続きである。

【図４】 図３の続きである。

【図５】 図４の続きである。

【図６】 図５の続きである。

【図７】 図６の続きである。

【図８】 図７の続きである。

【図９】 図８の続きである。

【図１０】 図９の続きである。

【図１１】 図１０の続きである。

【図１２】 図１１の続きである。

【図１３】 図１２の続きである。

【図１４】 図１３の続きである。

【図１５】 図１４の続きである。

【図１６】 図１５の続きである。

【図１７】 図１６の続きである。

【図１８】 図１７の続きである。

【図１９】 図１８の続きである。

【図２０】 ｇＨ（波線）、ＴＫ（黒塗）および主キ
ャプシドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の位置を
示すもので、またそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨで
表している。

【図２１】 ＨＶＴのｇＨ遺伝子に該当するヌクレオ
チド配列のほぼ全体を示すもので、またその配列に対応
するアミノ酸配列を線上に示した。

【図２２】 図２１の続きである。

【図２３】 図２２の続きである。

【図２４】 図２３の続きである。

【図２５】 図２４の続きである。

【図２６】 図２５の続きである。

【図２７】 図２６の続きである。

【図２８】 図２７の続きである。

【図２９】 ＨＶＴのＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列
を示すもので、ＨＶＴの各ヌクレオチドに添えられた番
号が記されている。ＭＤＶのＴＫ遺伝子に該当する部分
のヌクレオチド配列のところには下線が引かれている。
相同性は垂直の棒によって示されている。そして、ＭＤ
ＶのＴＫ遺伝子とＨＶＴのＴＫ遺伝子との間のアミノ酸
の違いは線の上の線によって示されている。

【図３０】 図２９の続きである。

【図３１】 図３０の続きである。

【図３２】 図３１の続きである。

【図３３】 図３２の続きである。

【図３４】 図３３の続きである。

【図３５】 図３４の続きである。

【図３６】 図３５の続きである。

【図３７】 図３６の続きである。

【図３８】 図３７の続きである。

【図３９】 ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＣ遺伝
子のヌクレオチド配列を示すもので、またその配列に対
応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図４０】 図３９の続きである。

【図４１】 図４０の続きである。

【図４２】 図４１の続きである。

【図４３】 図４２の続きである。

【図４４】 図４３の続きである。

【図４５】 ＶＺＶ６２／ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５
遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子のヌクレオチド配列部分を示
すもので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上
に示した。

【図４６】 ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大
サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す
もので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に
示した。

【図４７】 ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大
サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す
もので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に
示した。

【図４８】 図４７の続きである。

【図４９】 ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小
サブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す
もので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に
示した。

【図５０】 ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５遺伝子のＭＤ
Ｖ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもので、
またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図５１】 ＨＳＶ−１のＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相
同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもので、また
その配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図５２】 ウイルスのゲノム非必須領域とプラスミ
ドベクターにクローン化されたＤＮＡ領域との相同組換
えの概略を説明するための図である。

【図５３】 図２１〜図２８および図２９〜図３８の
補足図であって、ヌクレオチドと、ＭＤＶおよびＨＶＴ
のＴＫ、ｇＨおよびフランキング遺伝子を含む領域から
予想されるアミノ酸配列を示している。ひとまとめにさ
れたアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列のこの領域にて
確実にコードされ、それは上流ＡＴＧトリプレットが真
の遺伝子挿入部位である場合に限られる。直線上に能率
よく配列するために配列の中に空隙が設けられている。
ＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡ配列の間にあるコロンは、
２つのウイルス間において保存されたヌクレオチドを示
している。ＭＤＶアミノ酸はＨＶＴとは異なる位置に示
される。

【図５４】 図５３の続きである。

【図５５】 図５４の続きである。

【図５６】 図５５の続きである。

【図５７】 図５６の続きである。

【図５８】 図５７の続きである。

【図５９】 図５８の続きである。

【図６０】 図５９の続きである。

【図６１】 図６０の続きである。

【図６２】 図６１の続きである。

【図６３】 図６２の続きである。

【図６４】 図６３の続きである。

【図６５】 図６４の続きである。

【図６６】 図６５の続きである。

【図６７】 図６６の続きである。

【図６８】 図６７の続きである。

【図６９】 図６８の続きである。

【図７０】 図６９の続きである。

【図７１】 図７０の続きである。

【図７２】 図７１の続きである。

【図７３】 図７２の続きである。

【図７４】 図７３の続きである。

【図７５】 図７４の続きである。

【図７６】 図７５の続きである。

【図７７】 図７６の続きである。

【図７８】 図７７の続きである。

【図７９】 図７８の続きである。

【図８０】 ＨｓＶｇＤのＭＤＶ相同遺伝子の部分的
なヌクレオチド配列を示すもので、予想されるアミノ酸
配列はＭＤＶおよびＨＳＶ−１のｇＤ領域間で保存され
る太型のＭＤＶヌクレオチド配列と残基である。

フロントページの続き (72)発明者 スコット，サイモン デビッド イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー（番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド 内 (72)発明者 ビンズ，マシュー マッキンリー イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー（番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド 内 審査官 上條 肇 (56)参考文献 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，1988年８ 月，Ｖｏｌ．69，Ｎｏ．８，ｐ．2033− 2042 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/38 C12N 15/86 - 15/869 C07K 14/055 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
   断片： G R R K Y D A L V A - GGGACGACGCAAATATGATGCTCTAGTAGCATN F V L G R A C G R P I Y L R E GTTTGTCTTGGGCAGAGCATGTGGGAGACCAATTTATTTACGTGAA Y A N C S T N E P F G T TATGCCAACTGCTCTACTAATGAACCATTTGGAACT C K L K S L G W W D R R Y A TGTAAATTAAAGTCCCTAGGATGGTGGGATAGAAGATATGCAA M T S Y I D R D E L K L I I TGACGAGTTATATCGATCGAGATGAATTGAAATTGATTAT A A P S R E L S G L Y T R TGCAGCACCCAGTCGTGAGCTAAGTGGATTATATACGCG L I I I N G E P I S S D TTTAATAATTATTAATGGAGAACCCATTTCGAGTGACA I L L T V K TATTACTGACTGTTAAA
2. 【請求項２】 ベクターの非必須的部分に請求項１に記
   載のＤＮＡ断片が挿入されていることを特徴とするベク
   ター。
3. 【請求項３】 ベクターがウイルスである請求項２に記
   載のベクター。
4. 【請求項４】 上記ＤＮＡに対してヘテロなプロモータ
   ーをさらに含む請求項２または３に記載のベクター。
5. 【請求項５】 ベクターがマレック病ウイルス（ＭＤ
   Ｖ）である請求項３に記載のベクター。
6. 【請求項６】 マレック病ウイルス（ＭＤＶ）が七面鳥
   ヘルペスウイルスある請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 ウイルスベクターがポックスウイルス、
   特に鶏痘ウイルスである請求項３に記載のベクター。
8. 【請求項８】 ＭＤＶまたはＨＶＴ感受性細胞のトラン
   スフェクションに適した、請求項１に記載のＤＮＡ断片
   を含むことを特徴とするプラスミドベクター。