JP3727521B2 - ウイルスのヌクレオチド配列 - Google Patents
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Description
【発明の分野】
本発明はウイルスのヌクレオチド配列に関するものであり、特に、病気に対する免疫性を付与するワクチンを作るためのウイルスのヌクレオチド配列に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ヘルペスウイルスは大きな二重鎖DNAウイルスで、エンベロープによって囲まれた20面体カプシドからなる。このウイルスは生物学的特性とゲノム構造とにもとづいてアルファ、ベータおよびガンマヘルペスウイルスに分類される[Roizman,B et al.(1981)Inter−virology18,201−217]。トリヘルペスウイルスには鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレック病ウイルス(MDV)(ガンマヘルペスウイルス)[総説: Payne,L.N.(ed)Marek’s Disease(1985),Martinus Nijhoff Publishing,Boston]と、鶏の呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)(アルファウイルス)とが含まれる。
【0003】
最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定することを可能とするような、MDV、ILTVおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性口内炎ウイルス(VZV)および単純ヘルペスウイルス(HSV)との間における顕著なアミノ酸配列の相同性(ホモロジー)が発見された。これらには、HSVの糖タンパク質、gB、gCおよびgHに相同なMDVおよび七面鳥ヘルペスウイルス(HVT)のアミノ酸配列、TKおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なILTV、MDVおよびHVTのアミノ酸配列、そしてgBおよびVZVの遺伝子34および35に相同なILTVのアミノ酸配列も含まれる[Backmaster,A et al.(1988)J.gen.Virol,89,2033−2042]。
MDVの株は3つの血清型に分類されている。1型は病原性の株とその弱毒株、2型は天然の非病原性株、そして3型はHVTが含まれる。10年以上前から、HVTによる種痘がマレック病に対して顕著な有効性を示すことが知られている。
【0004】
しかし最近になって、HVTによる種痘に対して抵抗性を示すMDVが単離されている。このようなウイルス毒性が非常に高いMDVによる鶏の損失は、米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生している。しかし、HVT、2型MDVおよびMDV高ウイルス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いることによって、そのような損失を確実ではないが減少させることが可能である。このような知見、すなわちHVTまたは2型MDVによって共有されないMDV型特異的エピトープが存在するということは、われわれに抗原的には従来のワクチンよりもMDVに関係した改良型ワクチンを作ることが可能であることを結論させた。[総説: Ross and Biggs in Goldman J.M.and Epstein M.A.(eds)Leukaemia and Lymphoma Research,Vaccine Intervention against Virus−Induced Tumour,p13−31,Macmillan,1986]
【0005】
いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニアウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが示される。これらには、HSVのgB[CantinE.M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,5908−5912]、HSVのgD[Paoletti,E.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,193−197]および偽狂犬病ウイルス(PRV)のgP50、HSVのgDの相同タンパク質(homologue)[Marchioli,C.C.et al.(1987)J.Virol.61.3977−3981]が含まれる。なぜなら、ウイルスの貫通および感染力にgBが必須であること、またヘルペスウイルス間で保存されているgBとその相同タンパク質は重要な免疫源であるからである。さらに、感染細胞の表層にgBが存在することは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標的となる[Blacklaws,B.A.et al.J.gen.Virol.68,1103−1114(1987);McLaughlin−Taylor,E.et al.(1988)J.gen.Virol.69,1731−1734]。
最近になって報告されたHSVの糖タンパク質gHもまた感染力にとって必須なものであり、また重要な免疫源でもある[Desal,P.J.etal.(1988)J.gen.Virol.69,1147−1156]。また、gCの相同タンパク質であるPRVのgIIIも中和抗体の主標的および細胞毒性T細胞の主標的として重要であるが、かならずしも必須のタンパク質ではないことが知られている。しかし興味深いことは、サイトメガロウイルス(CMV)によって感染された細胞のT細胞介在細胞毒性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出現である[Kozinowski U.H.et al.(1987)J.Virol.61.2054−2058]。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重要な役割を担うことができよう。なぜなら、マレック病の腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時型初期RNA転写産物が検出されるからである。
【0006】
また、ボックスウイルスワクシニアをベクターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よって、肝炎抗原はHSVで発現されている[Shih,M.F.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81, 5867−5870]。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子はPRVで発現されている[Thomsen,D.R.et al.(1987)Gene 57,261−265]。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝子組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。
肝炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに融合され、また組換えDNAはHSVのTK遺伝子に挿入される。組換えDNAと野生型HSVDNAとの同時トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによって肝炎抗原を発現するTK−ウイルスが得られる。
PRVの場合、UsにマッピングされたgX遺伝子を外来遺伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略は、HSVのTK遺伝子をTK欠失PRV突然変異体(TK陽性ウイルス)に挿入することを含むものである。そして、プラズミノーゲン活性因子はHSVのTK遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同遺伝子組換えによってPRVに導入する。TK−ウイルスを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する[前掲、Thomsen et al.]。
【0007】
同様に、VZVをベクターとして使用する[Lowe et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,3896−3900]。いくつかのヘルペスウイルス遺伝子も毒力(virulence)に関連しており、またインビトロの系における増殖に必須のものでないことが知られている。これらにはHSVのTK遺伝子[Jamieson,A.T.et al.(1974)J.GenVirol.24,465−480;Field,H.and Wildy,P.,(1987)J.Hygiene(Cambridge)81,267−277]およびPRVのTK遺伝子が含まれる。実際、PRVはTK活性の欠失によって容易に減少される[Tatarov,G.(1968)Zentralbl.Vet.Met.Med 15B,848−853]。さらに、PRVのバルサ(Bartha)株の減少はUsにマッピングされた非必須的糖タンパク質g1の欠失にもとづく[Mettenleiter,T.et al.(1987)J.Virol.61,4030−4032]。
長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し領域(TRS)に存在するHSVマッピングの遺伝子は、病原性に関係している[Rosen,A.et al.(1986)VirusResearch 5,157−175;Thompson,R.L.e al.(1983)Virology 131,180−192]。
【0008】
HSVのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須であるが、毒力に関係していると報告されている。これらには、UL24(Sanders,P.G.,(1982),J.gen.Virol.63,277−295)、リボ核酸還元酵素の大サブユニット(Godstein D.J.and Weller,S.K.(1988)J.Virol.62,196−205)、gC(Draper K.G.et.al.(1984)J.Virol.51,578−585)、dUTPアーゼ(Fisher,F.B.and Preston,V.G.(1986)Virology 148,190−197)、そしてUL55およびUL56(MacLean,A.R.andBrown,S.M.(1987)J.gen.Virol.68,1339−1350)が含まれる。さらに、UsにおけるHSVマッピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に非必須である[Weber,P.C.et al.(1987)Science 236,576−579]。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、野生型ウイルスにおいて前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他の配列を実質的に含まないヌクレオチド配列を提供する。
【0010】
【課題を解決する手段】
本発明のヌクレオチド配列は下記の群の中から選択されるる配列およびそのマイナーな変異で生じるマイナー変異配列にある:
(a)HSVのgB遺伝子のMVT相同遺伝子、
(b)HSVのgC遺伝子のHVT相同遺伝子、
(c)MSVのgH遺伝子のHVT相同遺伝子、
(d)ILTVのTK遺伝子、
(e)HSVのgB遺伝子のILTV相同遺伝子、
(f)ILTVのORF2、
(g)ILTVのORF3、
(h)ILTVのリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)、
(i)HVTのリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)、
(j)MDVのリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)、
(l)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE175のHVT相同遺伝子、
(m)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE68のHVT相同遺伝子。
【0011】
【実施の態様】
前記(a)から(m)に記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列を発現させるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモーターを含む他の5’および3’非遺伝暗号配列(ノンコーデイング配列)と結合したものであろう。そのような付加された配列はいわゆる自然発生的なものか、あるいは非対応ものであろう。
特に、プロモーターは前記(1)および(m)のひとつと結合しているであろう。
【0012】
前記した「マイナー変異配列」という言葉の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌクレオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドのマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化(コード)するためにベクターに挿入される配列の場合、配列にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タンパク質をコードしていることを意味する。その抗原の持つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるような配列内における保守的変化(conservative changes)はこのようなマイナー変異に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分のみが使用される。そのような部分とは、例えば、HVTのgH遺伝子に相当するヌクレオチド配列の273−320または867−926およびそれらのマイナー変異に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれらの配列およびこれらの配列によりコードされるペプチドによってなされる。
【0013】
挿入部位に相当する配列の場合、ウイウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的なものではなく、また組換えを可能とするような配列と相同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させるものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合では、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ずることを意味する(フレームシフトがどこに生ずるかに依存する)が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほとんど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろう。
挿入部位においてヌクレオチドの相同性が75%存在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされるが、少なくとも80、85、90、95または99%の相同性があることが好ましい。このような相同性(homology)の度合いは上記の配列(a)ないし(f)および(x)のそれぞれの全体に実質的に関係している。短い配列は、このような長い配列を単離または同定するためのプローブとして用いられるが、この場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高い相同性が必要とされる。
【0014】
よって、本発明はさらに上記配列(a)ないし(m)のいずれかの少なくとも一部分に対して90%(好ましくは95%、99%または100%)の相同性を有する少なくとも13のヌクレオチド副配列を提供するものである。
上記したように、配列(a)ないし(c)、(e)、(f)、(l)および(m)は抗原発現配列として好適であり、またMDVのTK領域配列は抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として好適である。よって、配列(b)は両方の機能に好適である。
これらの配列は、ここで開示された配列情報と、例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型のDNAとそのプローブとのハイブリダイゼーションとを含む標準的技術を用いることによって自然発生的な(naturally−occurring)のILTV、HVTおよびMDVウイルスから容易に単離可能である。
抗原ILTVおよびHVT配列、すなわち配列(a)から(c)、(e)、(f)、
【0015】
(l)および(m)は、適当な宿主、特にHVTまたはMDV内において現される。ひとつのILTV配列の挿入のための好適な非必須部位はHSVのgC遺伝子のMSV相同遺伝子、HVTまたはMDVのTK遺伝子、HVTまたはMDVリホヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝子、およびMDVのリボヌクレオチド還元酵素(小サブユニット)遺伝子を含む。
第二に本発明は、MDV、HVTおよびILTVの挿入または欠失突然変異を提供するものである。すなわち、
(i)HVTの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはTK遺伝子のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
(ii)MDVの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(小サブユニット)の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異であり、
(iii)ILTVの場合、TK遺伝子、ORF3またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異である。
これらの突然変異は同定された領域の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると考えられる。
【0016】
HVT、MD V、およびILTVのそれぞれの突然変異体は、鳥禽(ベクターが複製される)類のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列からなるベクターと同様に、非対応抗原コード配列(hetdlogous antigen−encoding sequences)のためのウイルスベクターとして利用できるであろう。このような配列として、もちろんこれらに限定されるものではないが、(a)ないし(b)、(e)、(f)、(l)および(m)が含まれる。
非対応(heterologous)という言葉は、ここではウイルスゲノムに関係した場所に見出されていない抗原発現配列(antigen−expressing gene)を意味している。すなわち、抗原発現遺伝子はILTVの病原性株から単離可能で、これよりも病原性の低い株のTK領域に挿入れると考えれる。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起こらない場合、非対応と見なされる。
【0017】
また非対応配列は、鳥脳脊髄炎(流行性振せん)、鳥インフルエンザ(鳥禽ペスト)、鳥白血病、ニューキャッスル病(PMV2ないしPMV7)以外の鳥パラマイキソバイラス(avian paramyxoiruses)、鳥レオウイルス病(腸の病気、腱しょう炎)、ニワトリ貧血(ニワトリ貧血剤によって起こる)、胞子虫症、エッグドロップ症候群(EDS76)、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、感染性粘液嚢症(グンボロ(Gumboro))、封入体肝炎(アデノウイルス)、七面鳥リンパ増殖性疾患(lymphoproliferative disease)、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎(rhinotracheitis)のいずれか一つの疾患に関係した抗原をコードするものである。
よって、本発明にもとづくベクターは多価ワクチンによる保護を可能とする。例えば、MDV抗原の遺伝暗号配列(コード配列)を持つILTVを含むワクチンは、ITLおよびマーク病からワクチンを接種された生物を保護する。
さらに、突然変異ILTVウイルスそれ自体は、弱毒化されたウイルスとしてワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿入された非対応配列を持つ必要性はない。
【0018】
本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばTK領域の同時トランスフェクション(co−transfection)、欠失または挿入変異されたものと全ウイルスDNAまたは全ウイルス(例えば野生型(wild type)のウイルス)を導入することである。そのようなウイルスのむき出しとなったDNAが感染性を有することはすでに知られており、切断しないで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によってDNAを調製するのが好ましい。この方法に用いられる適当な細胞とは、ニワトリ胚繊維芽細胞(embryo fibroblast)、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団として播種されることによって好適に増殖する。相同遺伝子組換えによって形質転換DNAと全ウイルスDNAとを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。
相同遺伝子組換えが行なわれるためには、ウイルスDNAは複製されなければならない。現在のところNDV、HVT、またはILTVのための細胞フリーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものではない。
【0019】
免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコードすることに関与したILTVおよびHVT領域は、適当なベクター(例えばHVT、または伝染性上皮腫ウイルス、細菌また菌類などのような他のベクター)に挿入される。ウイルスベクターの場合(特にヘルペスウイルスベクターおよび腸炎ウイルスベクター)、抗原をコードしている配列(適当な配列(フランキング配列)が両端にある)と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクターゲノムとの間にそのような挿入がなされる。宿主にとって内在(endogenous)的なものであるプロモーターは、非対応(ウイルス抗原をコードする)配列の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法またはこれから発見されるであろう方法によって挿入されよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主として用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによって運ばれる。
フランキング配列は、非対応配列が挿入される少なからずすべての領域が含まれる。もし、すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質転換されたベクターに残るであろう。しかし、そのような領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場合、機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。
よって、ITLVの欠失または挿入突然変異のそのような構成は、ワクチンの改良につながる。一方、HVT、鳥類伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組み込まれたILTVの糖タンパク質(glycoproteins)または他のILTVタンパク質の発現は、効果的なワクチンの製造を可能とする。
【0020】
ウイルスまたはベクターとしてHVT、MDVまたはILTVを含むワクチンを合成するするために、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。この場合に用いる焙地は199培地(ウエルカムまたはフローラボラトリーズ)のような標準的な培養液を使用し、この培養液で37℃、3ないし4日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、10%ジメチルスルホキシドと4%牛血清を含む培養液に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、そのアンプルを液体窒素保存する。
通常、予防接種(ワクチン投与)は生後1日経過したニワトリのひよこに対しておこなわれ、約1,000プラーク形成単位を筋肉注射することによってワクチン投与が実施される。この後、数日で免疫ができる。
本発明にもとづくワクチンは、MDVに感染しやすい鳥(fowl)、例えば商業的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家禽類を保護するために用いられるものである。
以下、本発明の好適な実施態様を添付した図を参照しながら実施例にもとづいて説明する。
【0021】
【実施例】
一般的アプローチ
バクテリオファージベクターM13にクローン化された鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同定するためのプローブとして用いた。このような同定は制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによってなされた。詳しくは、以下に説明する。
ウイルスの株 NDVの高い癌誘発性(high oncogenic)を有するRB1B株(Schat,K.A.et al.Avian Pathol.11,593−605,1982)を米国のコーネル大学B.カルネック(B.Calnek)教授から入手した。このウイルスの精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラークを形成させることによって行なった。ニワトリSPFおよびRIR内で2度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞(chick embryo fibroblasts;CEF)内で4回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗性N−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって高い癌誘発性が示された。
【0022】
ウエルカムリサーチ(Wellcome Research Laboratories,Beckenham,Kewnt)から得たHVTのFC126株(Witter,R.L.et al.Am.J.Vet.Res.31,525−538、1970)を、CEF内で14回継代した。つづいて我々の研究室においてアヒル胚繊維芽細胞(DEF)およびCEF内で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらにCEF内で増殖させた。本実施例のクローニングに用いるウイルスDNAは元の単離から数えて24回の継代がなされたウイルスから抽出した。
組織培養 CEFは199培養液(ウイエルカム社製)を含む回転ボトル中において培養された。なお、この培養液には、ペニシルン、ストレプトマイシン、ファンジゾン(Fugizone)(レグド.テイー.エム;Regd.T.M)および前記牛血清が添加されている(Ross,L.J.M.et al.J.gen.Virol.28,37−47,1975)。 CKCは10cmペトリ皿中で培養した(Churchill,A.E.and Biggs P.M.,Nature,215,528−530,1967)。
【0023】
MDV−DNAの単離 RBIB感染細胞(cell associatedRB1B)を、回転ボトルのCEFからなる単層に、感染の程度が一細胞あたり約0.001プラーク形成単位(pfu)となるようにして植つけて、37℃で培養した。培養3日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換された新しい培養液は、2%牛血清を含む199培養液である。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分画からウイルスを単離した(Lee,Y.S.et al.J.gen.Virol.51,245−253,1980)。ウイルスDNAは、精製ウイルスをサルコシル、プロテナーゼKおよびトリス緩衝液でもって一晩、37℃で処理し、それをグリセロール勾配でもってゾーン遠心(前掲、Lee,Y.S.etal.)によって精製した。高分子量のウイルスDNAをエタノールによって沈澱させた後、10mMのトリス/ImMのEDTAからなるTE緩衝液(pH7.5)に懸濁した。
ILTV−DNAの単離
(a)感染CKCを採集し、播種後2〜3日経過したPBSで洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこない、氷冷TE感傷液に再懸濁した。非イオン性の
界面活性剤であるNP40(最終濃度1%)を添加して攪拌し、氷うえで15分間、インキュベートした。RNアーゼ処理後、試料を2000r.p.m.5分間遠心した。
遠心後、上清を採り、SDS(最終濃度1%)およびプロテナーゼK(最終濃度0.5mg/ml)を加えて37℃、30分間、インキューベートした。この混合物を2図のフェノール/クロロホルム処理、および1図のクロロホルム処理をおこない、続いて、1/10容量の3M酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することによってDNAを沈澱させた。
【0024】
(b)また、ウイルスDNAを以下の方法によりウイルス感染細胞の培養液化ら単離下。感染後2〜3日目のそのウイルス感染細胞の培養駅を厚め、3000r.p.m.、5分間、4℃の条件でベンチトップ遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び19,000r.p.m.の回転数により超遠心(ソーバル)を4℃、1時間の条件でおこなった。この超遠心処理によって得られたウイルスペレットをTE緩衝液に再懸濁し、RNアーゼンでRNAの消化をおこなった。そして、既に述べたようにしてSDSおよびプロテアーゼK処理をおこなって、ウイルスをこわした。
最後に破壊されたウイルスから既に述べた方法によりDNAを抽出した。
MDV−DNAのクローニング 1μgのMDVを制限酵素BamH1によって切断し、これをジフォスフォリレートpUC13DNAのBamH1制限部位に連結した。一方、使用する大腸菌(E.coli)のTG1株細胞を標準的方法(Hanahan,D.J.Mol.Biol.166,557−580,1983)によって形質転換し、この形質転換細胞をアンピリシンおよびX−gal存在下で培養した。白いコロニーを採取し、ニックトランスレーションされたMDV−DNAとの雑種形成(ハイブリ代是−ション)によってその存在またはMDV挿入部位について調べた(Crunstein M.and Hogness,D.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,3961,1975)た。陽性コロニーを小量で培養し、そしてホルムス(Holmes,D.S.)およびクイグレイ(Quigley,M.)の方法(Holmes,D.S.and Quigley,M.,Anal.Biochem.114,193−297,1981)によってプラスミドDNAを単離した。挿入部位の大きさは、組換えDNAをBamH1消化し、それをアガロース電気泳動することによって調べた。その結果、1ないし18キロ塩基対(kbp)よりも少ない塩基対からなるMDV挿入部位を有するプラスミドが得られた。
【0025】
ILTV−DNAのクローニング
ILTV−DNAのEcoR1およびBg1IIライブラリーを既に述べたようなpUCBに含まれるウイルスDNAのクリーニング消化(Cloning
Digerts)によって得た。
ウイルスDNAのランダムシークエンシング ソニケーション処理したウイルスDNA断片をジフォスフォリレートM13.mp10(アマーシャムインターナショナルPLC)のSmaI制限部位にクローン化し、MDV挿入部位を含むプラークをNDV−DNAに対するハイブリダイゼーションによって同定した。そして、その配列を35S−dATPを用いたジデオキシ方法(Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463−5467)によって同定した。
同様な方法をMDV−DNAのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プラークはpUC13含有コロニーを避けるために標識された挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定した。
【0026】
実施例1
MDVのgB遺伝子
HVTのM13クローンは、MDVのBamH1断片13とハイブリダイズされたHSVおよびVZVのgB遺伝子に対して相同性を示す(第1図参照)。MDVのRB1株のBBamH1ライブラリーから得たこの断片のシークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のNH3末端から始まる1/3の部分がI3を含んでいた。この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片K3と同定された。第1図は、2.6kpの長さからなる遺伝子の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたmRNAの長さは2.6kpと推測される。翻訳されたタンパク質の長さはアミノ酸、865個に相当した(図20)。
これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約20のアミノ酸も含まれる。MDV−gB遺伝子の初期翻訳配列は他のヘルペスウイルスのgB遺伝子と共通な部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広げることが可能な疎水性配列が存在する(Pellet,P.E.et al.J.Virol.53,243−253,1985)。
しかし、MDVのgB遺伝子はHSVのgB遺伝子とたった48%のアミノ酸配列の相同性しか認められず、23個のアミノ酸(1851−1920残基、図2−19)の挿入およびグリコシレーションによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示す。
HVTのgB(図2−19)に該当する限定された配列データ(702塩基)とMDVのgBの配列とを比較すると、これら2つの糖タンパク質に関して76.9%の核酸の相同性と87.1%のアミノ酸の相同性とが認められた。MDVのgBと比較してHVTのgBにおけるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したHSVのgBのドメインと等価な領域(1323−1433残基)に特に集中した(前掲、Pellet P.E.et al.1985)。MDVおよびHVTのgB間におけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集中された。
【0027】
実施例2
HVTのgH遺伝子およびMDVのgH遺伝子
HSVのgH遺伝子に相同な配列を含むHVTのM13クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれわれの初期の研究において同定された(前掲、Buckmaster et al.1988)。このクローンは、プローブとして用いた場合、HVTの6kbからなるHindIII断片とハイブリダイズ(雑種形成)する(図20)。
シークエンス(配列決定)によって、この断片がカルボキシ末端を含むおよそ1/4のgH遺伝子を含むことが明らかになった。gH遺伝子の残りの部分を有する隣接するHindIII断片(3.2kb)はHindIII部位と重なり合うHVTのクローン化HpaI断片とハイブリダイゼーションされた。第4図は、HVTのgH遺伝子の遺伝暗号領域(コード領域)とフランキング配列とを示すものである。HVTのgH遺伝子と、HSV1、VZVおよびEBVに含まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性(%)は、それぞれ20、24および20であった(アミノ酸が最大重なり合った数630、644および153からそれぞれ推定した)。
【0028】
実施例3
HVTのTK遺伝子とMDVのTK遺伝子
HVTのTK遺伝子の全遺伝暗号領域(1053bp)は、前記した3.2kbpからなるHindIII断片を含むものである(図20)。
遺伝子全体およびフランキング領域の配列は図29−38に示した。同様に、MDKのTK遺伝子はMDVの3.6kbpからなるBamH1K2断片を含むものである。MDKのTK遺伝子の完全な配列を図63 に示した。MDVおよびHVTのTK配列の比較空、2つの遺伝子は60%のアミノ酸の同一性を有することがわかった。これとは対照的に、HVTのTK遺伝子とHSV1、VZVおよびEBVのTK遺伝子間の同一性はそれぞれたったの30、27および24%であった(アミノ酸が最大重なり合った数320、332および193からそれぞれ推定した)。HVTおよびMDVのTK遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、ジン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真核生物のタンパク質のためのATPおよび(または)CTP結合部位の特徴を示した(Gentry,G.A.Proc.Natl.Acad.ASci.U.S.A.82,6815−6819)。これらの保守的な配列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位として、またTK−欠失突然変異体を産生するのに好適である。
【0029】
実施例4
MDV(gP57−65)(gC相同遺伝子)のA抗原遺伝子
A抗原遺伝子は、HSVの相同遺伝子として同定されたことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子であり、免疫源(主要グリコポリペプチド産物をコードする)として、また非必須領域として用いられる。このA抗原遺伝子は、MDVのBamH1B断片の中に置かれており(Isfort et al.1987)、MDVのGA株に関してはヌクレオチド配列が決定されている(Coussens and Velicer,Abstract OP18.51,VII International Congress of Virology9−14August,(1987)Edmonton,Canada;J.Virol.62,2374−2379)。
前記したランダムなシークエンス決定に関する研究過程において、A抗原遺伝子発現産物であるM13クローン(No.130)を同定した。よって、このクローンをA抗原を含むMDVのRB1B株から得られた2.3KbpのEcoR1/PvuII断片を同定するのに用いた。
そして、この断片を標準的な方法により、SmaI/EcoR1によって裂かれたpUC13ベクターにクローン化した。MDVのRB1BのA抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは図39−44に示した。
【0030】
MDVおよびHVTのA抗原領域は非必須遺伝子であり、よってMDVおよびHVT内の部位として好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の遺伝子が挿入されよう。このことはいくつかの証拠から支持される。それらの証拠を以下に示す。
(1)われわれの研究において、他のRB1BのA抗原が単離され、かつ配列決定された。これは3’からA抗原ATGコドンまでのTが45塩基つらなった(T’s 45 bases 3’to the A antigen ATGcodon)余分な(エクストラ)T残基を有する。このエクストロラTは遺伝子に機能的なA抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシフト変異を引き起こす。この遺伝子は複製MDVからクローン化可能であるので、その結果A抗原はウイルスにとって非必須的なものであることになる。
【0031】
(2)同様な研究から、MDVのA抗原はHSVのgCおよびPRVのgpIII糖タンパク質と相同であることが明らかになった。これら2つの相同遺伝子は非必須的なものと考えられている(HSV相対体にとって、ロセンタルらの文献:Rosenthal et al.J.Virol.61,2438−2447を見よ。
(3)MDVの株であって寒天ゲル分散試験によってA抗原が欠如していると判定された株(churchill,A.E.et al.J.gen.Virol.4,557−564,1969)またはより感度の高い2次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す株が報告されている(Van Zaane,D.et al.Virology 121,133−146)。
さらに、A抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Aタンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所(location)であろう。これによって、A抗原遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしているオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろう。
HVTおよびILTVベクターへ遺伝子を導入するための戦略
2つの可能性がある、すなわち、
(1)ベクターの非必須的遺伝子への挿入、
(2)ベクターの該当する得電子との置換。
これは、MDVおよびHVTのいくつかの遺伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能である。
【0032】
実施例5
HVT,ILTVまたはMDVの非必須的遺伝子への挿入
(a)ベクターのTK遺伝子座への挿入
(1)HVT,ILTVまたはMDVは鳥ペルペスウイルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして用いられることが可能であろう。特にMDVのRB1B株のgB,gC,gHまたはgCは、ILTVに挿入される。また、ILTVのgBおよびDS−17はHVTまたはMDVに挿入される。これらは、挿入された遺伝子と結合したプロモーター、非対応(heterologous)プロモーター、或はこれらの異なるクラスにある遺伝子(例えば、gB遺伝子発現に好適な即時型初期プロモーター)を用いるであろう。
(2)ILTVは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベクターとして利用可能であり、また、最適な発現のためのプロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に用いられる方法は、HSVへの肝炎抗原の挿入に関する既知の方法(前掲、Shih et al.1984)に基づく。
既に述べた方法に因って得られたMDVおよびHVTのDNAは、DNA抽出中にDNAの切断が起こらないような予防策を講じることによって、間宣誓をそこなわず、DNAを保護することができる。
【0033】
ストウおよびウイルキーの方法(前掲、Stow &Wilkie J.gen.Virol.33,477,1976)によって得られたウイルスDNAのリン酸カルシウム沈澱物をCEFからなるサブコンフルエント(sub−confluent)な単層に添加した。1時間、37℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した状態(コンフルエントな状態)となるまで1〜2日間培養した。コンフルエントな状態からなる199培地(ウエルカム)と、前記培養駅の一部を置き換えた(1:1または2:1)。そして、プラークが形成されるまで、37℃で培養した。通常、このプラーク形成は4〜5日後に見られるようになる。1μgのHVT−DNAあたり、約200のプラークが得られ、また1μgのMDV−DNAあたり、約50のプラークが得られるであろう。組換えウイルスの相同遺伝子組換えおよび単離のために、目的とする遺伝子を前記したような10:1ないし2:1のTKまたはgCおよび野生型ウイルスと共形質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、完全な野生株を共感染(co−infection)に用いることが可能である。
【0034】
HVTのFc−126株のTK遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられる制限酵素は、BanII、Bsp1286、DraIII、EcoRI、HincII、HpaI、NheIおよびNspbIIおよびSphIである。これらの制限酵素による切断(消化)部位は、TK遺伝子の発現を妨害する外来DNAの挿入部位として用いられ、TK遺伝子部分がこれらの酵素(またEcoKも利用可)の組合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化させる。
これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消化部位をもち、このような部位にウイルスDNA断片がクローン化される。よって、ベクターを切断することなしにクローン化されたDNAを直線化するために制限酵素による部分消化の手法が用いられよう。
【0035】
前記した酵素群には、フランキング遺伝子活性を阻害するようなものは含まれておらず、HSV−1相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。ウイールスの組換えは、「プラークリクフト(plaquelifts)」によって検知することが可能である。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感染細胞と、放出されたウイルスとをニトロセルロースに移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞からの変性DNAと、ウイルスとをハイブリダイゼーションするもので、細胞のDNAはヴィラレアル5の文献(Villareal,L.et al.Science 196,183−185,1977)に記載された好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウイルスは、単層培養回収できる。
同様の方法が目的とするエプトープを発現する組換えウイルスを単離することに用いることが可能である。例えば、「プラークリフト」に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロテインあのような適当な検知システムを用いることによって、この結合した抗体の存在を検出することができる。そして、アシクロビル(acyclovir)(前掲、Ross,N.1985)
(Schat,K.A.et.al.Antiviral Research4,159−270,1984)またはFMAUを含む培地で増殖させることによってTK−ウイルスを選別する。適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン化TK遺伝子(図45−55)に挿入する。
【0036】
次に、この組換えDNAをひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎臓細胞中にベクターの感染DNAと同時トランスフェクション(co−transfection)させる。
この戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大させることである。また、最適な発現に適したプロモーターの選択が可能となることである。よって、即時型プロモーターの利用は、潜伏性(latently)感染細胞における発現を可能とする。
(b)ベクターのgC遺伝子座における挿入、A抗原CHSVのgC遺伝子HVTおよびMDV相同遺伝子)は生体内(in vivo)およびガラス器内(in vitro)系(gCに関するセッション参照)でのウイルス増殖にとって必須なものではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現のための好適な部位となるであろう。
さらに、A抗原は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるものであることから、外来タンパク質の免疫特性を強化することに利用できる。
このA抗原遺伝子座におけるウイルス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも一部がgC遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そして間宣誓ウイルスDNAとともに形質転換されることによって達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗体によるウイルスプラークのスクリーニングは、組換え体の単離を可能とする。
【0037】
実施例6
HVTにおけるILTV遺伝子とその相同遺伝子との置換
実施例5に示した方法によって、置換はクローン化されたILTV配列と感染性HVT−DNAとの同時トランスフェクションによって達成される。
ILTVから誘導された遺伝子をHVTのそれに対応するものと置換することが効果的であろう。ILTV配列とエピトープとを発現する組換え体は、ILTV特異的モノクローン抗体または、既に述べたユニークILTV配列に対する抗ペプチド抗体を用いることによって検出できる。
この方法の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、相対的に単純な方法から成るということである。しかし、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。
【0038】
実施例7
ILTVのTK−突然変異体を得るための戦略欠失突然変異
欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能である。例えば、ATPおよびCTP結合部位をリン酸化するような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに対してである。これは、制限酵素による二重消化(double digestion)によって達成される。ここで用いられる制限酵素は、SnaB1またはBc1Iである。
二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづいて、ウイルスDNAとの同時トランスフェクションまたは、ウイルス感染細胞へのトランスフェクションを実施する。制限酵素の選択などによる図45−55、図56およびプラスミドpILBgの地図(図67)を参照してもらいたい。
TK−ウイルスはアシクロビル(acuclovir)(前掲、Ross,N.1985)または、FMAU(前掲、Schat,K.a.et al.1984)の存在下よって、ハイブリダイゼーションによって、プラーク精製クーロンにおけるK遺伝子の欠失う部位の不存在に関して調べた。
ILTVの欠失う突然変異対それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウイルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺伝子配列をもつものとして用いることが可能である。
【0039】
挿入突然変異
ヘルペスウイルスプロモーターまたは他の適当な配列なたはシグナル塩基による調整下にある機能的β−ガラクトリダーゼ遺伝子は、TK活性によって重要なTK遺伝子のドメインにまず誘導される。そして、組換え体DNAは間宣誓ウイルスだNと共形質転換するか、もしくはウイルス感染細胞にトランスフェクションして、相同遺伝子組換えをおこす。アセロビルまたはFMAU存在下における選別はTK−挿入突然変異体を生じさせるであろう。もし、β−ガラクトリダーゼが導入されたとしたら、突然変異体はX−gal存在下で青い色のプラークが生じることによって検出される。
必要に応じてTK遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクローン化することができる。
【0040】
実施例8
HVTへのMDVのRBIB株に存在するgD遺伝子の挿入
(本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す)
HVTのTK遺伝子をプラスミドベクターpUCBにフロー化し、pTK1Bと呼ばれるプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばTK遺伝子のみをもつプラスミドを切断する制限エンドヌクレアーゼRsrII(図29−38のヌクレオチド配置197,酵素認識部位(GGACCG)によって直線化する。
これによって、「粘着性(sticky)」端末が生じ、この生じた端末を通常の方法(参考文献:″Molecula rCloning:a Laborator yManual″,ed.Maniatis T.,FritschE.F.,and Sambrook J.Cold Spring Harbor Laboratory,1982)によつて修復する。
【0041】
RB1BのgB 遺伝子を独自に2つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれRB1B−BamH1−I3およびRB1B−BamH1−K3と命名した。一つのプラスミド上にある完全な複製gB遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドをBamH1で切断し、そして切断を連結(レゲーション)した。目的通りに作られた組換え体をプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。しかし、前記したように、完全なgB配列は実質的にEcoRI/SalIで切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記のように合成されたPTK1Bにクローン化した。また、MDVのgBオープンリーディングフレームは、HincIIおよびNaeIによる消化によって、プラスミドMSB27から切り出され、部分的にHpaIによって切断されたHVTのTKプラスミドpTK1Bに連絡される。TKとgBの両配列を含む組換え体プラスミドはハイブリダイゼーションによって同定され、さらにサザンブロットによって分析される。そして、組換え体プラスミドはHVTウイルス(ウイルスDNA)を含む細胞に誘導され、TK遺伝子へgB遺伝子を誘導することにようる相同遺伝子組換えがおこなわれる。JVTウイルス組換え体はアシクロビルまたはFMAUによって選別され、或は標識gBプローブによって検出される。
【0042】
実施例9
HVTに挿入されるRB1BのgC(CA抗原)遺伝子
末端が鈍くなった(blunt ended)PTK1Bを実施例8に示されるようにして合成した。RB1BのgC遺伝子を制限エンドヌクレマーゼEcoRIおよびHindIII(puC13ポリリンカーに含まれる部位)によって、プラスミドpMB419(実施例4)から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復されたgC断片を実施例8に示したようにして直線化された末端修復pTK1Bにクローン化した(クローニングは、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位元素標識断片によるプロービング、またはDNAセークエンシング、または、これらの組合せによって変化に富んだものである。)
【0043】
HVTの中にクローン化されたRB1BのgC遺伝子をもつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱またはエレクトロポレーション(電気穿孔)によってHVT−感染細胞にトランスフェクションさせた。gC遺伝子の両端をクロスオーバー(cross−over)させたHVTウイルスとHVTのTKプラスミドのフランキング配列との間の相同遺伝子組換えは、RB1BのgC遺伝子をHVTウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組換え体は前記のようにして、TK−として選別され、またはプロービングによって同定される。類似の方法として、既に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺伝子などをここで開示したILTVの非必須的ゲノムに挿入するためのクローニング戦略を提供するために用いられるものであり、またはILTV中の抗原遺伝子を作るために利用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 BamH1部位の分布とgBおよびTK遺伝子の位置を示すMDVの地図。
【図2】 MDVのRB1B株に存在するgB遺伝子のヌクレオチド配列。MDVの各ヌクレオチドを参照して番号を付けた。HVTのgB遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下側に記載されている。相同性は垂直の棒によって示されている。MDVのgB遺伝子とHVTのgB遺伝子と間のアミノ酸の違いは上側に示されている。
【図3】 図2の続き。
【図4】 図3の続き。
【図5】 図4の続き。
【図6】 図5の続き。
【図7】 図6の続き。
【図8】 図7の続き。
【図9】 図8の続き。
【図10】 図9の続き。
【図11】 図10の続き。
【図12】 図11の続き。
【図13】 図12の続き。
【図14】 図13の続き。
【図15】 図14の続き。
【図16】 図15の続き。
【図17】 図16の続き。
【図18】 図17の続き。
【図19】 図18の続き。
【図20】 gH(破線)、TK(黒塗)および主キャプシドタンパク質(MCP、点)の各遺伝子の位置を示す図。それぞれのHindIII部位をHで表わしている。
【図21】 HVTgH遺伝子の大部分のヌクレオチド配列。対応するアミノ酸配列を上部に示す。
【図22】 図21の続き。
【図23】 図22の続き。
【図24】 図23の続き。
【図25】 図24の続き。
【図26】 図25の続き。
【図27】 図26の続き。
【図28】 図27の続き。
【図29】 HVT TK遺伝子のヌクレオチド配列。番号はHVTヌクレオチドを参照。HVT TK遺伝子の部分の配列は下に記載。相同性は垂直棒で示す。MDV TKとHVT TKのアミノ酸の違いは上部に示す。
【図30】 図29の続き。
【図31】 図30の続き。
【図32】 図31の続き。
【図33】 図32の続き。
【図34】 図33の続き。
【図35】 図34の続き。
【図36】 図35の続き。
【図37】 図36の続き。
【図38】 図37の続き。
【図39】 MDVのRBIB株のgC遺伝子のヌクレオチド配列。対応するアミノ酸は上部に示す。
【図40】 図39の続き。
【図41】 図40の続き。
【図42】 図41の続き。
【図43】 図42の続き。
【図44】 図44の続き。
【図45】TK遺伝子のクラスターを含むILTVゲノムの5400塩基対のヌクレオチドと、予想されるアミノ酸配列を示す図。主要なオープンリーディングフレーム(ORFs)を作ると予想されるアミノ酸配列はストランド用配列の下に、また、相補ストランド用配列のの上に単一文字コートで示してある。
【図46】 図45の続き。
【図47】 図46の続き。
【図48】 図47の続き。
【図49】 図48の続き。
【図50】 図49の続き。
【図51】 図50の続き。
【図52】 図51の続き。
【図53】 図52の続き。
【図54】 図53の続き。
【図55】 図54の続き。
【図56】 ILTVゲノムのTKを含む部分での遺伝子体系を示す図。ILTV DNAのEcoR1(pILEc1)とBg1IT(pILBg2)産生断片を含む互いに重なるPUC13プラスミドクローンを示している。
【図57】 ILTV gB遺伝子のヌクレオチド配列の一部。
【図58】 ILTV リボヌクレオチド還元酵素のヌクレオチド配列の一部(大きなサブユニット)。
【図59】 VZV62/HSV−1 IE175遺伝子のHTV相同体のヌクレオチド配列。
【図60】 HTVリボヌクレオチド還元酵素(大きなサブユニット)遺伝子のヌクレオチド配列の一部
【図61】 MDVリボヌクレオチド還元酵素(大きなサブユニット)遺伝子のヌクレオチド配列の一部
【図62】 図61の続き
【図63】 MDVリボヌクレオチド還元酵素(小さいサブユニット)遺伝子のヌクレオチド配列の一部
【図64】 HSV−1 IE−175遺伝子のMDV相同体のヌクレオチド配列の一部。
【図65】 HSV−1 IE−68遺伝子のMDV相同体の一部。
【図66】 ウイルス性ゲノムの非必須領域およびプラスミドベクター内でクロー発生させたDNAの相同領域での相同的遺伝子組み換え法を示す概念図。
【図67】 TK遺伝子およびORFs3、5の制限部位と位置とを示すpILBg2プラスミドの地図。
Claims (5)
- 感染性咽頭気管支炎ウイルス(ILTV)遺伝子の非必須領域中に天然ではILTV中に存在しないDNAを存在させることによって変質させた合成による組み換えILTVであって、
上記の非必須領域がチミジンキナーゼ(TK)遺伝子であることを特徴とする組み換えILTV。 - 上記DNAがタンパク質の産生によって宿主中に発現される請求項1に記載の組み換えILTV。
- 上記タンパク質が抗原である請求項2に記載の組み換えILTV。
- 天然ではILTV中に存在しない上記DNAが七面鳥ヘルペスウイルス(HVT)、マレック病ウイルス(MDV)、感染性咽頭気管支炎ウイルス(ILTV)、鳥感染性気管支炎(IBV)、感染性粘液嚢症(IBDV)、ニューキャッスル病、鳥インフルエンザ、鳥白血病、鳥レオウイルス病またはロタウイルス腸炎から得られたものであり且つ抗原またはその抗原の抗原性部分をコードする請求項1〜3のいずれか一項に記載の組み換えILTV。
- 天然ではILTV中に存在しない上記のDNAがマレック病ウイルス(MDV)のgB、gC、gD、IE175またはIE68遺伝子または七面鳥ヘルペスウイルス(HVT)のgB、gHまたはIE175遺伝子である請求項4に記載の組み換えILTV。
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