JP3513481B2 - ウイルスワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、病気に対する免疫を与えるウ
イルスワクチンと、このワクチンに含まれるウイルスの
ヌクレオチド配列とに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヘルペスウイルスは大きな二重鎖ＤＮＡ
ウイルスで、エンベロープによって囲まれた２０面体カ
プシドからなる。このウイルスは、生物学的特性とゲノ
ム構造とにもとづいてアルファ、ベータ、およびガンマ
ヘルペスウイルスに分類される［Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｉｎｔｅｒ−ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １８，２０１−２１７］。トリヘルペスウイルスに
は、鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を
引き起こすマレック病ウイルス（ＭＤＶ）（ガンマヘル
ペスウイルス）［総説： Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．（ｅ
ｄ）Ｍａｒｅｋ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９８５），Ｍ
ａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｂｏｓｔｏｎ］と、鶏の呼吸器系上部に感染して致
死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウイル
ス（ＩＬＴＶ）（アルファウイルス）とが含まれる。最
近、われわれの研究室において偶然に多くの保護された
遺伝子を同定することを可能とするような、ＭＤＶ、Ｉ
ＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性口
内炎ウイルス（ＶＺＶ）および単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）との間における顕著なアミノ酸配列の相同性
（ホモロジー）が発見された。これらには、ＨＳＶの糖
タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶおよ
び七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配列、
ＴＫおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なＩＬＴＶ、
ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢおよび
ＶＺＶの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶのアミ
ノ酸配列も含まれる［Ｂａｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８９，
２０３３−２０４２］。

【０００３】ＭＤＶの株は３つの血清型に分類されてい
る。１型は病原性の株とその弱毒株、２型は天然の非病
原性株、そして３型はＨＶＴが含まれる。１０年以上前
から、ＨＶＴによる種痘がマレック病に対して顕著な有
効性を示すことが知られている。しかし最近になって、
ＨＶＴによる種痘に対して抵抗性を示すＭＤＶが単離さ
れている。ウイルス毒性が非常に高いこのＭＤＶによる
鶏の損失は米国、ヨーロッパおよび中東の地域で発生し
ている。しかし、ＨＶＴ、２型ＭＤＶおよびＭＤＶ高ウ
イルス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用い
ることによって、そのような損失を確実ではないが減少
させることが可能である。このような知見、すなわちＨ
ＶＴまたは２型ＭＤＶによって共有されないＭＤＶ型特
異的エピトープが存在するということは、われわれに抗
原的には従来のワクチンよりもＭＤＶに関係した改良型
ワクチンを作ることが可能であることを結論させた［総
説： Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｂｉｇｇｓ ｉｎ Ｇｏｌｄ
ｍａｎ Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｍ．Ａ．
（ｅｄｓ）Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏ
ｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｔｅｒ
ｖｅｎｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄ
ｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｕｒ，ｐ１３−３１，Ｍａｃｍｉｌ
ｌａｎ，１９８６］

【０００４】いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換
えワクシニアウイルス内で発現されたときに保護免疫を
与えることが示される。これらには、ＨＳＶのｇＢ［Ｃ
ａｎｔｉｎＥ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，
５９０８−５９１２］、ＨＳＶのｇＤ［Ｐａｏｌｅｔｔ
ｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，１９３−１
９７］および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）のｇＰ５０、
ＨＳＶのｇＤの相同タンパク質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）
［Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８
７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．３９７７−３９８１］が含
まれる。すなわち、ウイルスの貫通および感染力にｇＢ
が必須であり、また、ヘルペスウイルス間で保存されて
いるｇＢとその相同タンパク質は重要な免疫源である。
さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在することは、体液
性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標的と
なる［Ｂｌａｃｋｌａｗｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．
ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１１０３−１１１４（１９
８７）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．ｅ
ｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
９，１７３１−１７３４］。最近になって報告されたＨ
ＳＶの糖タンパク質ｇＨもまた感染力にとって必須なも
のであり、また重要な免疫源でもある［Ｄｅｓａｌ，
Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６９，１１４７−１１５６］。また、ｇＣの相同
タンパク質であるＰＲＶのｇＩＩＩも中和抗体の主標的
および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要であるが、か
ならずしも必須のタンパク質ではないことが知られてい
る。しかし興味深いことは、サイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞毒性反
応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出現で
ある［Ｋｏｚｉｎｏｗｓｋｉ Ｕ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．
（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．２０５４−２０５
８］。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染リン
パ球および形質転換リンパ球の排除において重要な役割
を担うことができよう。なぜなら、マレック病の腫瘍組
織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時型初期
ＲＮＡ転写産物が検出されるからである。

【０００５】また、ボックスウイルスワクシニアをベク
ターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告
されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイ
ルスをベクターとして用いた場合も報告されている。肝
炎抗原はＨＳＶで発現されている「Ｓｈｉｈ，Ｍ．Ｆ．
ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，５８６７−５８７
０」。また、ヒト組織プラズミノーゲン活性因子はＰＲ
Ｖで発現されている［ユｈｏｍｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ５７，２６１−２６５］。
これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘルペス遺
伝子のクローン化断片内に挿入され、相同組換えによっ
てウイルスベクターに組み込まれる。肝炎ウイルス遺伝
子は、ヘルペスウイルスプロモーターに融合され、また
組換えＤＮＡはＨＳＶのＴＫ遺伝子に挿入される。組換
えＤＮＡと野生型ＨＳＶＤＮＡとの同時トランスフェク
ションにつづく相同組換えによって肝炎抗原を発現する
ＴＫ−ウイルスが得られる。

【０００６】ＰＲＶの場合、Ｕｓにマッピングされたｇ
Ｘ遺伝子を外来遺伝子の挿入部位として用いられる。こ
こで用いれる戦略は、ＨＳＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失Ｐ
ＲＶ突然変異体（ＴＫ陽性ウイルス）に挿入することを
含むものである。そして、プラズミノーゲン活性因子は
ＨＳＶのＴＫ遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組
換え体を相同組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−
ウイルスを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別
する［前掲、Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．］。同様
に、ＶＺＶをベクターとして使用する［Ｌｏｗｅ ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，３８９６−３９００］。い
くつかのヘルペスウイルス遺伝子も毒力（ｖｉｒｕｌｅ
ｎｃｅ）に関連しており、またインビトロの系における
増殖に必須のものでないことが知られている。これらに
はＨＳＶのＴＫ遺伝子［Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｔ．ｅ
ｔａｌ．（１９７４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２４，
４６５−４８０；Ｆｉｅｌｄ，Ｈ．ａｎｄ Ｗｉｌｄ
ｙ，Ｐ．，（１９８７）Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ）８１，２６７−２７７］およびＰＲＶのＴ
Ｋ遺伝子が含まれる。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失に
よって容易に減少される［Ｔａｔａｒｏｖ，Ｇ．（１９
６８）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ １５Ｂ，
８４８−８５３］。さらに、ＰＲＶのバルサ（Ｂａｒｔ
ｈａ）株の減少はＵｓにマッピングされた非必須的糖タ
ンパク質ｇｌの欠失にもとづく［Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔ
ｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６１，４０３０−４０３２］。

【０００７】長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し
領域（ＴＲＳ）に存在するＨＳＶマッピングの遺伝子
は、病原性に関係している［Ｒｏｓｅｎ，Ａ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９８６）ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ ５，１
５７−１７５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．ｅ ａｌ．
（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３１，１８０−１９
２］。ＨＳＶのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロ
の系における増殖には非必須であるが、毒力に関係して
いると報告されている。これらには、ＵＬ２４（Ｓａｎ
ｄｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．，（１９８２），Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６３，２７７−２９５）、リボ核酸還元酵素の
大サプユニット（Ｇｏｄｓｔｅｉｎ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ
Ｗｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６２，１９６−２０５）、ｇＣ（Ｄｒａｐｅｒ Ｋ．
Ｇ．ｅｔ．ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，
５７８−５８５）、ｄＵＴＰアーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ，
Ｆ．Ｂ．ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｖ．Ｇ．（１９８
６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８，１９０−１９７）、そ
してＵＬ５５およびＵＬ５６（ＭａｃＬｅａｎ，Ａ．
Ｒ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｍ．（１９８７）Ｊ．ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１３３９−１３５０）が含ま
れる。

【０００８】さらに、ＵｓにおけるＨＳＶマッピングの
いくつかの遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に
非必須である［Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１
９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，５７６−５７９］。
ＷＯ８８／０７０８８（１９８８年９月２２日発行）は
ＨＶＴまたはＭＤＶにもとづいた雑種ウイルスベクター
を開示しており、またそれは非必須部位にある興味深い
遺伝子、例えばプロテインＡをコードする領域またはＴ
Ｋ領域を含むものである。この文脈では、プロテインＡ
は、ヴェリサー（Ｖｅｌｉｃｅｒ）およびクーセンズ
（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）によって開示されたｇＣと同様の
ものとして現われる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は新規なヌクレ
オチド配列を提供する。

【００１０】

【課題を解決する手段】本発明のヌクレオチド配列は、
このヌクレオチド配列に関連した野生型ウイルス内にお
いて前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他の配列
から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、（ａ）
ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、（ｂ）ＨＳＶ
のｇＢ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、（ｃ）ＭＤＶのＴＫ
遺伝子、（ｄ）ＨＳＶ−１の即時型初期遺伝子ＩＥ−１
７５のＭＤＶ相同遺伝子、（ｅ）ＨＳＶ−１の即時型初
期遺伝子ＩＥ−６８のＭＤＶ相同遺伝子、（ｆ）ＨＳＶ
のｇＤ遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子、およびこれらのマイ
ナー変異体である。

【００１１】

【実施の形態】さらに、ＨＶＴのＴＫ配列（以下の記載
においてしばしば配列（ｘ）と表わす）と、ＨＳＶのｇ
Ｃ遺伝子のＭＤＶ類似配列（以下の記載においてしばし
ば配列（ｙ）と表わす）、そしてそれらの配列にマイナ
ーな変異が生じたマイナー変異配列は、あるヘテロ配列
の挿入部位として、あるいはそれ自身が異常ではない毒
性の低いウイルスを得るための欠失部位として利用され
よう。

【００１２】前記（ａ）から（ｆ）、（ｘ）および
（ｙ）に記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列
を発現させるのに必要な停止および開始シグナルおよび
プロモーターを含む他の５'および３'非遺伝暗号配列
（ノンコーデイング配列）と結合したものであろう。そ
のような付加された配列はいわゆる野生型のものか、あ
るいはヘテロなものであろう。特に、プロモーターは前
記（ｄ）および（ｆ）のひとつと結合しているであろ
う。

【００１３】前記した「マイナー変異配列」という言葉
の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産
物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌク
レオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチド
のマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コー
ド）するためにベクターに挿入される配列の場合、配列
にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タン
パク質をコードしていることを意味する。その抗原の持
つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配
列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現され
るような配列内における保守的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａ
ｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ）はこのようなマイナー変異
に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列
のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分の
みが使用される。そのような部分とは、例えば、ＭＤＶ
のｇＢ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の８１６−８
６３、１３７７−１５９５、１３７７−１６３０または
１８２４−１９８５またはＮＤＶのｇＣ遺伝子に相当す
るヌクレオチド配列の１２０３−１２７８、およびそれ
らのマイナー変異に該当する領域である。

【００１４】本発明のさらなる態様はこれらの配列およ
びこれらの配列によりコードされるペプチドによってな
される。挿入部位に相当する配列の場合、ウイウルスの
感染力と複製とに関しては、なんら必須的なものではな
く、また組換えを可能とするような配列と相同な配列の
みが必要とされる。よって、特定の配列への特定のヌク
レオチド配列の挿入は、挿入される場所から下流に向け
てリーデイングフレームを完全に変化させるものとなる
であろう。抗原をコードする配列の場合では、このよう
な変化は好ましくないアミノ酸配列を生ずることを意味
する（フレームシフトがどこに生ずるかに依存する）
が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほとんど同じで
あるので、組換えが容易に行なえるであろう。

【００１５】挿入部位においてヌクレオチドの相同性が
７５％存在した場合、通常その配列はマイナー変異と見
なされるが、少なくとも８０、８５、９０、９５または
９９％の相同性があることが好ましい。このような相同
性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の度合いは上記の配列（ａ）な
いし（ｆ）および（ｘ）のそれぞれの全体に実質的に関
係している。短い配列は、このような長い配列を単離ま
たは同定するためのプローブとして用いられるが、この
場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるため
に高い相同性が必要とされる。

【００１６】よって、本発明はさらに上記配列（ａ）な
いし（ｆ）、（ｘ）および（ｙ）のいずれかの少なくと
も一部分に対して９０％（好ましくは９５％、９９％ま
たは１００％）の相同性を有する少なくとも１３のヌク
レオチド副配列を提供するものである。上記したよう
に、配列（ａ）、（ｂ）および（ｄ）ないし（ｆ）は抗
原発現配列として好適であり、また配列（ｙ）はヘテロ
配列のための挿入部位として好適である。さらに、配列
（ｃ）はＴＫ−突然変異体を生じさせるための欠失に好
適である。これらの配列は、ここで開示された配列情報
と、例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野
生型のＤＮＡとそのプローブとのハイプリダイゼーショ
ンとを含む標準的技術を用いることによって野生型（ｎ
ａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のＨＶＴおよ
びＭＤＶウイルスから容易に単離可能である。上記の配
列（ａ）、（ｂ）および（ｆ）によってコードされた単
離ポリペプチドは、新規なものであり、またＭＤＶ感受
性細胞における上記配列の発現によって生じたマイナー
変異およびグリコシル化されたポリペプチドとともに本
発明のさらな態様を形成する。

【００１７】第二に本発明は、ＴＫ遺伝子において生じ
た挿入または欠失突然変異からなるＭＤＶ突然変異体を
提供するものである。この突然変異は同定された領域の
遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると考
えられる。ＭＤＶ抗原発現遺伝子（ＭＤＶ ａｎｔｉｇ
ｅｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｅ）は、ＭＤＶの
毒性株から単離されてＭＤＶの毒性がそれよりも低い株
に挿入される。この挿入によってもし野生型のウイルス
が生じないとしたら新規なウイルスが生ずることになろ
う。他のヘテロな配列（抗原をコードするもの）は、例
えばＭＤＶ抗原遺伝子配列と同様に含まれよう。あるい
は、ヘテロな配列は、鳥脳脊髄炎（流行性振せん）、鳥
インフルエンザ（鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャ
ッスル病（ＰＭＶ２ないしＰＭＶ７）以外の鳥パラマイ
キソバイラス（ａｖｉａｎ ｐａｒａｍｙｘｏｉｒｕｓ
ｅｓ）、鳥レオウイルス病（腸の病気、鍵しょう炎）、
ニワトリ貧血（ニワトリ貧血剤によって起こる）、胞子
虫症、エッグドロップ症候群（ＥＤＳ７６）、伝染性上
皮腫、感染性気管支炎、感染性粘液嚢症（グンボロ（Ｇ
ｕｍｂｏｒｏ））、封入体肝炎（アデノウイルス）、七
面鳥リンパ増殖性疾患（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒ
ａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ニューキャッスル病、
ニワトリの細網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、
ロタウイルス腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎
（ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）のいずれか一つの
疾患に関係した抗原をコードするものであろう。

【００１８】よって、本発明にもとづくベクターは多価
ワクチンによる保護を可能とする。ウイルスの突然変異
体は、ヘテロな挿入配列を有する必要なしに毒性の低い
ウイルスとしてワクチンに利用される。本発明にもとづ
く欠失または挿入突然変異体の調製の簡易的な方法は、
適当な細胞に、例えばＴＫ領域の共形質転換（ｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、欠失または挿入変異された
ものと全ウイルスＤＮＡまたは全ウイルス（例えば野生
型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のウイルス）を導入すること
である。そのようなウイルスのむき出しとなったＤＮＡ
が感染性を有することはすでに知られており、切断しな
いで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によってＤ
ＮＡを調製するのが好ましい。

【００１９】この方法に用いられる適当な細胞とは、ニ
ワトリ胚繊維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ）、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞であ
り、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団として播
種されることによって好適に増殖する。相同組換えによ
って形質転換ＤＮＡと全ウイルスＤＮＡとを感染細胞内
で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリー
ニングする。このスクリーニングは、例えば適当なプロ
ーブによるハイブリダイゼーショか、あるいは問題とな
っている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用いた
免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。相同
組換えが行なわれるためには、ウイルスＤＮＡは複製さ
れなければならない。現在のところＮＤＶのための細胞
フリーの複製系は知られていないが、もしそのような系
が可能となったら、本発明はそのような系で実施されよ
う。複製および組換えが行なわれる環境は決定的なもの
ではない。

【００２０】免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコー
ドすることに関与した領域として上のようにコードされ
た配列（ａ）、（ｂ）および（ｄ）ないし（ｆ）は、適
当ベクター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウイル
ス、細菌また菌類などのような他のベクター）に挿入さ
れる。ウイルスベクターの場合（特にヘルペスウイルス
ベクターおよび腸炎ウイルスベクター）、抗原をコード
している配列（適当な配列（フランキング配列）が両端
にある）と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクター
ゲノムとの間にそのような挿入がなされる。ＨＶＴがベ
クターであ合、プロモーターは通常、ＨＶＴまたはＭＤ
Ｖベクターであろう。伝染性上腫ウイルスまたは他のウ
イルスがベクターである場合、プロモーターは通常、ベ
クターに対して外来のプロモーターであろう。細菌およ
び菌類の場合、抗原をコードする配列はすでに知られて
いる方法またはこれから発見されるであろう方によって
挿入されよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿
主として用いることが可能である。ヘテロな配列は宿主
ゲノムに挿入されるか、または自律的に複製するプラス
ミドによって運ばれる。宿主に対して外来のプラスミド
は、ヘロな配列（ウイルス抗原をコードする配列）の遺
伝子遺伝子発現の対照群として使用される。

【００２１】フランキング配列は、ヘテロな配列が挿入
される少なからずすべての領域が含れる。もし、すべて
の領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質転
換されたベクターに残るであろう。しかし、そのような
領域には機能的な欠失が生る。もし、その領域の全部で
はなく一部をフランキング配列として用いた場合機能的
な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。よって、
マレック病ワクチンを改善する上で３つの戦略が考えら
れるであろう。すなわち、（１）選択的ＭＤＶ遺伝子を
発現する組換えＨＶＴをつくること、（２）ＭＤＶの高
病原性株の欠失または挿入により、病原性が減少してワ
クチンとして好適なものとなった突然変異株をつくるこ
と、（３）伝染性上皮腫のような他のベクター内で遺伝
子発現する組換えウイルスをつくることである。

【００２２】ＨＶＴまたはＭＤＶがウイルスまたはベク
ターであるワクチンを合成するために、ウイルスをニワ
トリ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。
この場合に用いる培地は１９９培地（ウエルカムまたは
フローラボラトリーズ）のような標準的な培養液を使用
し、この培養液で３７℃、３ないし４日間増殖させる。
細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシド
と４％牛血清を含む培養液に懸濁する。その後、細胞を
アンプルに入れて封をし、そのアンプルを液体窒素保存
する。通常、予防接種（ワクチン投与）は生後１日経過
したニワトリにひよこに対しておこなわれ、約１，００
０プラーク形成単位を筋肉注射することによってワクン
投与が実施される。この後、数日で免疫ができる。

【００２３】本発明にもとづくワクチンは、ＭＤＶに感
染しやすい鳥（ｆｏｗｌ）、例えば的に利用される、
鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家禽類を保護する
ために用いられるものである。以下、本発明の好適な実
施態体を添付した図を参照しながら実施例にもとづいて
説明する。

【００２４】

【実施例】一般的アプローチ バクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。

【００２５】ウイルスの株 ＮＤＶの高い癌誘発性（ｈ
ｉｇｈ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）を有するＲＢ１Ｂ株（Ｓ
ｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ
ｏｌ．１１，５９３−６０５，１９８２）を米国のコー
ネル大学Ｂ．カルネック（Ｂ．Ｃａｌｎｅｋ）教授から
入手した。このウイルスの精製は、ニワトリ腎臓細胞の
組織焙養中においてプラークを形成させることによって
行なった。ニワトリＳＰＦおよびＲＩＲ内で２度継代
し、ひよこ胚繊維芽細胞（ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＣＥＦ）内で４回継代した。
ニワトリの遺伝的抵抗性Ｎ−系統株に接種した場合に生
ずる悪性腫瘍によって高い癌誘発性が示された。ウエル
カムリサーチ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｃｋｅｎｈａｍ，Ｋｅ
ｗｎｔ）から得たＨＶＴのＦＣ１２６株（Ｗｉｔｔｅ
ｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．
３１，５２５−５３８、１９７０）を、ＣＥＦ内で１４
回継代した。つづいて我々の研究室においてアヒル胚繊
維芽細胞（ＤＥＦ）およびＣＥＦ内で増殖させた。そし
て、プラーク精製を行ない、さらにＣＥＦ内で増殖させ
た。本実施例のクローニングに用いるウイルスＤＮＡは
元の単離から数えて２４回の継代がなされたウイルスか
ら抽出した。

【００２６】組織焙養 ＣＥＦは１９９焙養液（ウイエ
ルカム社製）を含む回転ボトル中において培養された。
なお、この培養液には、ペニシルン、ストレプトマイシ
ン、ファンジゾン（Ｆｕｇｉｚｏｎｅ）（レグド．テイ
ー．エム；Ｒｅｇｄ．Ｔ．Ｍ）および前記牛血清が添加
されている（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２８，３７−４７，１９７５）。Ｃ
ＫＣは１０ｃｍペトリ皿中で培養した（Ｃｈｕｒｃｈｉ
ｌｌ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｉｇｇｓ Ｐ．Ｍ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２１５，５２８−５３０，１９６７）。

【００２７】ＭＤＶ−ＤＮＡの単離 ＲＢＩＢ感染細胞
（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＲＢ１Ｂ）を、回転
ボトルのＣＥＦからなる単層に、感染の程度が一細胞あ
たり約０．００１プラーク形成単位（ｐｆｕ）となるよ
うにして植つけて、３７℃で培養した。培養３日目で、
培養液を捨てて新しい焙養液と交換した。交換された新
しい培養液は、２％牛血清を含む１９９培養液である。
そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分画か
らウイルスを単離した（Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．
Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５１，２４５−２５３，１９
８０）。ウイルスＤＮＡは、精製ウイルスをサルコシ
ル、プロテナーゼＫおよびトリス緩衝液でもって一晩、
３７℃で処理し、それをグリセロール勾配でもってゾー
ン遠心（前掲、Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）によっ
て精製した。高分子量のウイルスＤＮＡをエタノールに
よって沈澱させた後、１０ｍＭのトリス／ＩｍＭのＥＤ
ＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。

【００２８】ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング １μｇの
ＭＤＶを制限酵素ＢａｍＨ１によって切断し、これをジ
フォスフォリレートｐＵＣ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１制限
部位に連結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）のＴＧ１株細胞を標準的方法（Ｈａｎａｈａｎ，
Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０，
１９８３）によって形質転換し、この形質転換細胞をア
ンピリシンおよびＸ−ｇａｌ存在下で焙養した。白いコ
ロニーを採取し、ニックトランスレーションされたＭＤ
Ｖ−ＤＮＡとの雑種形成（ハイブリ代是ーション）によ
ってその存在またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Ｃ
ｒｕｎｓｔｅｉｎ Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．
Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７２，３９６１，１９７５）た。陽性コロニーを小
量で焙養し、そしてホルムス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．
Ｓ．）およびクイグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．）の方
法（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ Ｑｕｉｇｌｅｙ，
Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，１９３−２
９７，１９８１）によってプラスミドＤＮＡを単離し
た。挿入部位の大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消
化し、それをアガロース電気泳動することによって調べ
た。その結果、１ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）より
も少ない塩基対からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラス
ミドが得られた。

【００２９】ウイルスＤＮＡのランダムシークエンシン
グ ソニケーション処理したウイルスＤＮＡ断片をジフ
ォスフォリレートＭ１３．ｍｐ１０（アマーシャムイン
ターナショナルＰＬＣ）のＳｍａＩ制限部位にクローン
化し、ＭＤＶ挿入部位を含むプラークをＮＤＶ−ＤＮＡ
に対するハイブリダイゼーションによって同定した。そ
して、その配列を３５Ｓ−ｄＡＴＰを用いたジデオキシ
方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４，５４６３−５４６７）
によって同定した。同様な方法をＭＤＶ−ＤＮＡのクロ
ーン化断片の配列決定に用いた。この場合、プラークは
ｐＵＣ１３含有コロニーを避けるために標識された挿入
部位とのハイブリダイゼーションによって決定した。

【００３０】実施例１ ＭＤＶのｇＢ遺伝子 ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片１
３とハイブリダイズされたＨＳＶおよびＶＺＶのｇＢ遺
伝子に対して相同性を示す（図１参照）。ＭＤＶのＲＢ
１株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片のシ
ークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のＮＨ
３末端から始まる１／３の部分がＩ３を含んでいた。こ
の遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片Ｋ３と同定
された。

【００３１】図１は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子
の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタ
ンパク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（図
３）。これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約
２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初期
翻訳配列は他のヘルペスウイルスのｇＢ遺伝子と共通な
部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広
げることが可能な疎水性配列が存在する（Ｐｅｌｌｅ
ｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３，２４
３−２５３，１９８５）。しかし、ＭＤＶのｇＢ遺伝子
はＨＳＶのｇＢ遺伝子とたった４８％のアミノ酸配列の
相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５１−
１９２０残基、図２）の挿入およびグリコシレーション
によるエクストラ部位の存在など独特の姿を示す。

【００３２】ＨＶＴのｇＢ（図２）に該当する限定され
た配列データ（７０２塩基）とＭＤＶのｇＢの配列とを
比較すると、これら２つの糖タンパク質に関して７６．
９％の核酸の相同性と８７．１％のアミノ酸の相同性と
が認められた。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢに
おけるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したＨＳＶ
のｇＢのドメインと等価な領域（１３２３−１４３３残
基）に特に集中した（前掲、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐ．Ｅ．ｅ
ｔ ａｌ．１９８５）。ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間に
おけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の
領域に集中された。

【００３３】実施例２ ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭＤＶのｇＨ遺伝子 ＨＳＶのｇＨ遺伝子に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３
クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれ
われの初期の研究において同定された（前掲、Ｂｕｃｋ
ｍａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８８）。このクローン
は、プローブとして用いた場合、ＨＶＴの６ｋｂからな
るＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）す
る（図３）。シークエンス（配列決定）によって、この
断片がカルボキシ末端を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝子
を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残りの部分
を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．２ｋｂ）は
ＨｉｎｄＩＩＩ部位と重なり合うＨＶＴのクローン化Ｈ
ｐａＩ断片とハイブリダイゼーションされた。図４は、
ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）とフ
ランキング配列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ遺伝
子と、ＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶに含まれるその相
同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）は、そ
れぞれ２０、２４および２０であった（アミノ酸が最大
重なり合った数６３０、６４４および１５３からそれぞ
れ推定した）。

【００３４】実施例３ ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶのＴＫ遺伝子 ＨＶＴのＴＫ遺伝子の全遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）
は、前記した３．２ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片
を含むものである（図３）。遺伝子全体およびフランキ
ング領域の配列は図５に示した。同様に、ＭＤＫのＴＫ
遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからなるＢａｍＨ１Ｋ２
断片を含むものである。ＭＤＫのＴＫ遺伝子の完全な配
列を図１４に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＴＫ配列の
比較空、２つの遺伝子は６０％のアミノ酸の同一性を有
することがわかった。これとは対照的に、ＨＶＴのＴＫ
遺伝子とＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶのＴＫ遺伝子間
の同一性はそれぞれたったの３０、２７および２４％で
あった（アミノ酸が最大重なり合った数３２０、３３２
および１９３からそれぞれ推定した）。ＨＶＴおよびＭ
ＤＶのＴＫ遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、リン
酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真核生物のタ
ンパク質のためのＡＴＰおよび（または）ＣＴＰ結合部
位の特徴を示した（Ｇｅｎｔｒｙ，Ｇ．Ａ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＡＳｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６
８１５−６８１９）。これらの保守的な配列は外来遺伝
子の発現および挿入のための好適な部位として、またＴ
Ｋ−欠失突然変異体を産生するのに好適である。

【００３５】実施例４ ＭＤＶ（ｇＰ５７−６５）（ｇＣ相同遺伝子）のＡ抗原
遺伝子 Ａ抗原遺伝子は、ＨＳＶの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードす
る）として、また非必須領域として用いられる。このＡ
抗原遺伝子は、ＭＤＶのＢａｍＨ１Ｂ断片の中に置かれ
ており（Ｉｓｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ＭＤ
ＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されてい
る（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌｉｃｅｒ，Ａｂ
ｓｔｒａｃｔ ＯＰ１８．５１，ＶＩＩ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ９−１４ Ａｕｇｕｓｔ，（１９８７）Ｅｄｍ
ｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２
３７４−２３７９）。前記したランダムなシークエンス
決定に関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物
であるＭ１３クロー（Ｎｏ．１３０）を同定した。よっ
て、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＢ１Ｂ株から
得られた２．３ＫｂｐのＥｃｏＲ１／ＰｖｕＩＩ断片を
同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な方法
により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によって裂かれたｐＵＣ
１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢ１ＢのＡ
抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは図６に示し
た。ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗原領域は非必須遺伝子で
あり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位として好適で
あり、その中に相同組換えによって他の遺伝子が挿入さ
れよう。このことはいくつかの証拠から支持される。そ
れらの証拠を以下に示す。

【００３６】（１）われわれの研究において、他のＲＢ
１ＢのＡ抗原が単離され、かつ配列決定された。これは
３'からＡ抗原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらな
った（Ｔ'ｓ ４５ ｂａｓｅｓ ３'ｔｏ ｔｈｅ Ａ
ａｎｔｉｇｅｎ ＡＴＧ ｃｏｄｏｎ）余分な（エク
ストラ）Ｔ残基を有する。このエクストロラＴは遺伝子
に機能的なＡ抗原をコードさせるのを不可能にするよう
なフレームシフト変異を引き起こす。この遺伝子は複製
ＭＤＶからクローン化可能であるので、その結果Ａ抗原
はウイルスにとって非必須的なものであることになる。 （２）同様な研究から、ＭＤＶのＡ抗原はＨＳＶのｇＣ
およびＰＲＶのｇｐＩＩＩ糖タンパク質と相同であるこ
とが明らかになった。これら２つの相同遺伝子は非必須
的なものと考えられている（ＨＳＶ相対体にとって、ロ
センタルらの文献：Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２４３８−２４４７を見よ。 （３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ
抗原が欠如していると判定された株（ｃｈｕｒｃｈｉｌ
ｌ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｌ．４，
５５７−５６４，１９６９）またはより感度の高い２次
元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す株が
報告されている（Ｖａｎ Ｚａａｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２１，１３３−１４６）。さ
らに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタン
パク質にある外来エピトープを示すための好適な場所
（ｌｏｃａｔｉｏｎ）であろう。これによってＡ抗原遺
伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしている
オリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろう。

【００３７】ＨＶＴベクターに遺伝子を導入するための
戦略 ２つの可能性が描かれる、すなわち、（１）ベクターの
非必須的な遺伝子への挿入、または（２）バクターの該
当する遺伝子に対する外来遺伝子の置換でる。これは、
ＭＤＶとＨＶＴの同じ遺伝子間の場合のような、実質的
に相同を領域にのみ可能と思える。

【００３８】実施例５ ＨＶＴまたはＭＤＶの非必須的遺伝子への挿入 （ａ）ベクターのＴＫ遺伝子座における挿入 （１） ＨＶＴまたはＭＤＶを鳥ペルペスウイルスの遺
伝子挿入と発現とに用いることが可能である。例えば、
挿入された遺伝子に関連したプロモータとして（例え
ば、ｇＢ遺伝子発現を効果的におこなうための即時型初
期プロモーターとして）、利用可能である。 （２） ＨＶＴまたはＭＤＶは鳥ペルペスウイルスの遺
伝子とは関連していない遺伝子の挿入及び発現のための
一般的なベクターとして利用可能であり、最適な発現名
ためにプロモータの操作が必要とされる。遺伝子挿入に
用いられる既知の方法と実質的に同一である（前掲 Ｓ
ｈｅｈｅｔ ａｌ．１９８４） 前記のようにして得られたＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡ
は、抽出中においてＤＮＡの切断がおこらないような予
防策を講じることによって感染性をそこなわず保持する
ことができる。ウイルスＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱
物（ストウ及びウイルキーの方法（前掲 Ｓｔｏｗ ＆
Ｗｉｌｋｉｅ Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３３，４７
７，１９８６）をＣＥ．Ｆの単層焙養に添加した。１時
間、３７℃の条件で吸着させた後、培養駅を添加し、融
合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで１〜２日間培養し
た。単層をトリプシン処理し、２〜４％牛血清含有の１
９９倍地（ウエルカム）と培養駅の一部を置き換えた
（１：１または２：１）。そして、プラーク形成が観察
されるまで３７℃で培養した。このプラーク形成は通
常、４〜５日後に認められる。１ｍｇのＨＶＴ−ＤＮＡ
あたり、約５０プラークが得られるであろう。

【００３９】組換えウイルスの相同組換えおよび単離の
ために、目的とする遺伝子を前記したような１０：１な
いし２：１のＴＫまたはｇＣおよび野生型ウイルスと共
形質点検したような非必須位的遺伝子へ、挿入する。あ
るいは、完全な野生株を共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ）に用いることが可能である。ＨＶＴのＦｃ−１２
６株のＴＫ遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに
もちいられる制限酵素は、ＢａｎＩＩ，Ｂｓｐ１２８
６，ＤｒａＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｃＩＩ，Ｈｐａ
Ｉ，ＮｈｅＩおよびＮｓｐｂＩＩおよびＳｐｈＩであ
る。これらの制限酵素による切断（消化）部位は、ＴＫ
遺伝子の発現を妨害する外来ＤＮＡの挿入部位として用
いられ、ＴＫ遺伝子部分がこれらの酵素（またＥｃｏＫ
も利用可）の組合せによる二重消化によって取り除かれ
て不活性化される。これらの酵素のいくつかは、プラス
ミドベクターに消化部位をもち、このような部位にウイ
ルスＤＮＡ断片がクローン化される。よって、ベクター
を切断することなしにクローン化されたＤＮＡを直線化
するために制限酵素による部分消化の手法が用いられよ
う。

【００４０】前記下制限酵素群には、フランキング遺伝
子活性を阻害するようなものは含まれておらず、ＨＳＶ
−１相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果た
す。ウイルスの組換えは、「プラークリフト（ｐｌａｑ
ｕｅｌｉｆｔｓ）」によって検知することが可能であ
る。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感
染細胞と放出されたウイルスをとニトロセルロースとを
移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞か
らの変性ＤＮＡと、ウイルスとをハイブリダイゼーショ
ンするもので、細胞のＤＮＡはヴィラレアル５の文献に
（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ １９６，１８３−１８５．１９７７）プローブと雑
種形成されたウイルスを単離することにもちいることが
可能である。例えば、「プラークリフト」に用いられる
ニトロセルロースに抗体処理をほどこし、つづいて抗グ
ロブリ抗体に結合したフォトスファターゼまたは標識プ
ロテインＡのような適当な検知システムを用いることに
よってこの結合した抗体の存在を検出することができ
る。適当なプロモーターをおもつ目的とする遺伝子は、
まず最初にクローン化ＴＫ遺伝子に挿入される。次に、
この組換えＤＮＡをひよこ胚繊維芽細胞またはニワトリ
腎臓細胞中にベクターの感染性ＤＮＡとともにトランス
フェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ）させ
る。そして、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）含有
培地で増殖させることによってＴＫウイルスを選別する
（Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａ
ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４，１５９−２７０，１９８
４）。

【００４１】別の方法として、プラークは、ニトロセル
ローズ上での「プラークリフト」および関連標識プロー
ブとのハイブリダイゼーションにもちいられる目的とす
る遺伝子の存在についてスクリーニングされる。また、
プラークは、モノクローナル抗体または抗ペプチド抗体
を用いたエプトープ発現についてスクリーニングされ
る。このような戦術の主な利点は、前記選別方法が目的
とする遺伝子を含むウイルスの組換え体を得るチャンス
を増大させることである。また、最適な発現のためのプ
ロモータを選ぶことがかのうとなることである。よって
即時型初期プロモータの利用は、潜伏感染細胞における
発現を可能とする。

【００４２】（ｂ）ベクターに存在する他の非必須的部
位への挿入 Ａ抗原遺伝子（ＨＶＴおよびＭＤＶ相同遺伝子）は、生
体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）およびガラ不器内（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）系でのウイルス増殖にとって必須的なものではな
いので、外来遺伝子の挿入および発現のための好適な部
位となろう。さらに、Ａ抗原は、もっとも豊富な抗原の
一つで分泌されるものであることから、外来タンパク質
の免疫特性を強化することに利用されるよう、このＡ抗
原遺伝子座におけるウイルス組換え体の単離は、目的と
する遺伝子の少なくとも一部分がｇＣ遺伝子にあるクレ
ームにまず挿入され、そして感染性ウイルスＤＮＡとと
もにトランスフェクションされることによって達成され
る、配列特異的プローブまたは特異的抗体によるウイル
スプラークのスクリーニングは、組換体の単離を可能と
する。また、抗原コード配列（ａｎｔｉｇｅｎ ｅｎｃ
ｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＨＶＴまたはＭＤＶ
のリビヌグレオチドリダクターゼ（大サブユニット）に
挿入することが可能である（図８および図９参照）。

【００４３】実施例６ ＨＶＴにおけるＭＤＶ遺伝子の相同遺伝子に対するＭＤ
Ｖ遺伝子置換 置換は、図５に示したクローン化されたＭＤＶ配列と感
染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの同時トランスフェクション（ｃ
ｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって達成される。
ＭＤＶのＲＢＩＢ株から誘導されたｇＢおよびｇＣ遺伝
子をＨＶＴに含まれるものと置換することは、ＭＤＶの
ｇＨ遺伝子の糖タンパク質遺伝子および即時形初期遺伝
子の置換としての効果があるであろう。ＭＤＶ配列とエ
プトープとを発現する組換え体は、ＭＤＶ−特異的モノ
クローン抗体または前記したＭＤＶのユニーク配列抗ペ
プキド抗体を用いることによって検出できる。この方法
の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、
相対的単純な方法であるということである。しかし、実
質的に相同遺伝子は除く。

【００４４】実施例７ ＭＤＶのＴＫ−突然変異体を得るための戦略欠失突然変
異 欠失を、遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能
である。たとえば、ヌクレオシド結合に必要な遺伝子の
ドメンに対してである。これらは、制限酵素による二重
消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって達
成される。ここで用いられる制限硬派、ＢａｌＩ，Ｎｄ
ｅＩ．ＳｐｈＩまたはＥｃｏＫである。二重消化後、適
当な断片を再結合させ、つづいてウイルスＤＮＡとの共
トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ）または、ウイルス感染細胞へのトランスフェクショ
ンを実施する。制限酵素の選択などによる異種配列の挿
入に関しては、図７および図８を参照してもらいたい。
ＴＫ−ウイルスは、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ
（前掲Ｒｏｓｓ，Ｎ．１９８５）または、ＦＭＡＵ
（前掲、Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ａｔ ｅｌ．１９８４）
の存在下において選別される。よって、ハイブリダイゼ
ーションによって、プラーク精製クローンにおけるＫ遺
伝子の欠失部位の不存在に関して調べた。ＭＤＶの欠失
突然変異体それ時代をワクチン合成のための弱毒化ウイ
ルスとしていもちいること、また挿入されたヘテロな抗
原遺伝子配列をもつ物としてもちいることが可能であ
る。

【００４５】挿入突然変異 ヘルペスウイルスプロモーターまたは他の適当な配列ま
たはシグナル塩基による調整下にある機能的竈−ガラク
トリダーゼ遺伝子は、ＴＫ活性によって重要なＴＫ遺伝
子のドメインにまず誘導される。そして、組換体ＤＮＡ
は感染性ウイルスＤＮＡと同時トランスフェクションす
るか、もしくはウイルス感染制帽にトランスフェクショ
ンして、総同組換えを起こす。アセロビルまたはＦＭＡ
Ｕ存在下における選別はＴＫ−挿入特全変異体を生じさ
せるであろう。もし、竈−ガラクトシダーゼが導入され
たとしたら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存在下で青い色の
プラークが生じることによって検出される。必要に応じ
てＴＫ遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターに
サブクローン化することができる。

【００４６】実施例８ ＨＶＴへのＭＤＶのＲＢＩＢ株ｇＤに存在する遺伝子の
挿入 ＨＶＴのＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵ−ＣＢに
フロー化し、ｐＴＫ１Ｂと呼ばれるプラスミドを作る。
このプラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラス
ミド分を切断する制限エンドをするヌクレアーゼＲｓｒ
ＩＩ（図５のヌクレオチド一１９７、酵素認識部位（Ｇ
ＧＡＣＣＧ）によって直線か摺る。こによって、「粘着
性（ｓｔｉｃｋｙ）」端末が生じ、この生じた端末を通
常の方法（参考文献：媒Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）によっ
て修復する。ＲＢ１ＢのｇＢ遺伝子を独自に２つのプラ
スミド上にクローン化し、それぞれＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ
１−Ｉ３およびＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｋ３と命名し
た。一のフラスミド上にある完全な複製ｇＢ遺伝子を生
じさせるために、両方のプラミドをＢａｍＨ１で切断
し、そして断片を連結（リゲーション）し、目的通りに
作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。しか、前記したように、完全なｇＢ配
列は実質的にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片上にられた。Ｍ
ＤＶのｇＢ遺伝子をコードする配列およびその操作に関
するさらなる情報はロスらの文献（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａ
ｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１７８９−１８０
４，１９８９）に開示された単一組換えプラスミドをＥ
ｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、末端を修復して、そ
のプラスミドを、前記のように合成されたＰＴＫ１Ｂに
クローン化した。また、ＭＤＶのｇＢオープンリーディ
ングフレームは、ＨｉｎｃＩＩおよびＮａｅＩによる消
化によって、プラスミドＭＳＢ２７から切り出され、部
分的にＨｐａＩによって切断されたＨＶＴのＴＫプラス
ミドｐＴＫ１Ｂに連結される。ＴＫとｇＢの両配列を含
む組換体プラスミドはハイブリダイゼーションによって
同定され、さらにサザンブロットによって分析される。
そして、組換体プラスミドはＨＶＴウイルス（ウイルス
ＤＮＡを含む細胞に誘導され、ＴＫ遺伝子のｇＢ遣伝子
を導入することにより、相同組換えがおこなわれる。Ｈ
ＶＴウイルス組換え体はアシクロビルまたはＦＭＡＵに
よって選別され、あるいは標識ｇＢプローブによって検
出される。

【００４７】実施例９ ＨＶＴに挿入されるＲＢ１ＢのｇＣ（Ａ抗原）遺伝子 末端が鈍くなった（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）ＰＴＫ１
Ｂを実施例８に示されるようにして合成した。ＲＢ１Ｂ
のｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼＥｃｏＲ１およ
びＨｉｎｄＩＩＩ（ｐｕＣ１３ポリリンカーに含まれる
部位）これによって生じた粘善性末端標準的なプロトコ
ールに基づいて再び修復した。末端を修復されたｇＢ断
片を実施例８に示したようにして直線化された末端修復
ｐＴＫ１Ｂにフローン化した（クローニングは、制限酵
素によって得られるフローンの分析放射性同位元素標識
断片によるプロービンブ、またはＤＮＡシークエンシン
グ、またはこれらの組合せによって変化にとんだもので
ある。ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢ１ＢのｇＣ遺
伝子をもつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱
またはエレクトロンポレーション（電気穿孔）によって
ＨＶＴ−感染細胞にトランスフェクションさせた。ｇＣ
遺伝子の両端をクロスオーバー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅ
ｒ）させたＨＶＴウイルスとＨＶＴのＴＫプラスミドの
フランキング配列との間の相同組換えは、ＲＢ１Ｂのｇ
Ｃ遺伝子をＨＶＴのウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組
換え体は、前記の用にして、ＴＫ−として選別され、ま
たはプロービングによって同定される。類似の方法とし
て、すでに述べられ、かつ図に示されたそれらの遺伝子
などを、ここで開示したＨＶＴの非必須的ゲノムに挿入
するためのフローニング戦略を適用するために用いられ
るものであり、またはＨＶＴ中の抗原遺伝子を作るため
に利用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺伝
子の位置を示すＭＤＶの地図。

【図２】 ＭＤＶのＲＢ１Ｂ株に存在するｇＢ遺伝子の
ヌクレオチド配列。ＭＤＶの各ヌクレオチドに添えられ
た番号が記されている。ＨＶＴのｇＢ遺伝子に該当する
部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれてい
る。相同性は垂直の棒によって示されている。そして、
ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇＢ遺伝子との間のアミ
ノ酸の違いは線の上の線によって示されている。

【図３】 図２の続きである。

【図４】 図３の続きである。

【図５】 図４の続きである。

【図６】 図５の続きである。

【図７】 図６の続きである。

【図８】 図７の続きである。

【図９】 図８の続きである。

【図１０】 図９の続きである。

【図１１】 図１０の続きである。

【図１２】 図１１の続きである。

【図１３】 図１２の続きである。

【図１４】 図１３の続きである。

【図１５】 図１４の続きである。

【図１６】 図１５の続きである。

【図１７】 図１６の続きである。

【図１８】 図１７の続きである。

【図１９】 図１８の続きである。

【図２０】 ｇＨ（波線）、ＴＫ（黒塗）および主キャ
プシドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の位置を示
すもので、またそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨで表
している。

【図２１】 ＨＶＴのｇＨ遺伝子に該当するヌクレオチ
ド配列のほぼ全体を示すもので、またその配列に対応す
るアミノ酸配列を線上に示した。

【図２２】 図２１の続きである。

【図２３】 図２２の続きである。

【図２４】 図２３の続きである。

【図２５】 図２４の続きである。

【図２６】 図２５の続きである。

【図２７】 図２６の続きである。

【図２８】 図２７の続きである。

【図２９】 ＨＶＴのＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列。
ＨＶＴの各ヌクレオチドに添えられた番号が記されてい
る。ＭＤＶのＴＫ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド
配列のところには下線が引かれている。相同性は垂直の
棒によって示されている。そして、ＭＤＶのＴＫ遺伝子
とＨＶＴのＴＫ遺伝子との間のアミノ酸の違いは線の上
の線によって示されている。

【図３０】 図２９の続きである。

【図３１】 図３０の続きである。

【図３２】 図３１の続きである。

【図３３】 図３２の続きである。

【図３４】 図３３の続きである。

【図３５】 図３４の続きである。

【図３６】 図３５の続きである。

【図３７】 図３６の続きである。

【図３８】 図３７の続きである。

【図３９】 ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＣ遺伝子
のヌクレオチド配列。その配列に対応するアミノ酸配列
を線上に示した。

【図４０】 図３９の続きである。

【図４１】 図４０の続きである。

【図４２】 図４１の続きである。

【図４３】 図４２の続きである。

【図４４】 図４３の続きである。

【図４５】 ＶＺＶ６２／ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５遺
伝子のＨＶＴ相同遺伝子のヌクレオチド配列部分。その
配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図４６】 ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サ
ブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すも
ので、その配列に対応するアミノ酸配列を線上に示し
た。

【図４７】 ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サ
ブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すも
ので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示
した。

【図４８】 図４７の続きである。

【図４９】 ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サ
ブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すも
ので、またその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示
した。

【図５０】 ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５遺伝子のＭＤＶ
相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもので、ま
たその配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図５１】 ＨＳＶ−１のＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相
同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもので、また
その配列に対応するアミノ酸配列を線上に示した。

【図５２】 ウイルスのゲノム非必須領域とプラスミド
ベクターにクローン化されたＤＮＡ領域との相同組換え
の概略を説明するための図である。

【図５３】 図２１〜図２８および図２９〜図３８の補
足図であって、ヌクレオチドと、ＭＤＶおよびＨＶＴの
ＴＫ、ｇＨおよびフランキング遺伝子を含む領域から予
想されるアミノ酸配列を示している。ひとまとめにされ
たアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列のこの領域にて確
実にコードされ、それは上流ＡＴＧトリプレットが真の
遺伝子挿入部位である場合に限られる。直線上に能率よ
く配列するために配列の中に空隙が設けられている。Ｍ
ＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡ配列の間にあるコロンは、２
つのウイルス間において保存されたヌクレオチドを示し
ている。ＭＤＶアミノ酸はＨＶＴとは異なる位置に示さ
れる。

【図５４】 図５３の続きである。

【図５５】 図５４の続きである。

【図５６】 図５５の続きである。

【図５７】 図５６の続きである。

【図５８】 図５７の続きである。

【図５９】 図５８の続きである。

【図６０】 図５９の続きである。

【図６１】 図６０の続きである。

【図６２】 図６１の続きである。

【図６３】 図６２の続きである。

【図６４】 図６３の続きである。

【図６５】 図６４の続きである。

【図６６】 図６５の続きである。

【図６７】 図６６の続きである。

【図６８】 図６７の続きである。

【図６９】 図６８の続きである。

【図７０】 図６９の続きである。

【図７１】 図７０の続きである。

【図７２】 図７１の続きである。

【図７３】 図７２の続きである。

【図７４】 図７３の続きである。

【図７５】 図７４の続きである。

【図７６】 図７５の続きである。

【図７７】 図７６の続きである。

【図７８】 図７７の続きである。

【図７９】 図７８の続きである。

【図８０】 ＨｓＶｇＤのＭＤＶ相同遺伝子の部分的な
ヌクレオチド配列。予想されるアミノ酸配列はＭＤＶお
よびＨＳＶ−１のｇＤ領域間で保存される太型のＭＤＶ
ヌクレオチド配列と残基である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スコット，サイモン デビッド イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー（番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド 内 (72)発明者 ビンズ，マシュー マッキンリー イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー（番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド 内 (56)参考文献 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，1988年 ７月17 日，Ｖｏｌ．62，Ｎｏ．７，ｐ．2373− 2379 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/38 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＭＤＶのｇＣ遺伝子の下記ヌクレオチド
   配列のコード部分からなるＤＮＡ断片： 【式１】 【式２】 【式３】
2. 【請求項２】 請求項１のヌクレオチド配列の５'また
   は３'非コード部分の少なくとも一部をさらに含む請求
   項１に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のＤＮＡ断片を
   含む組換え発現ベクター。
4. 【請求項４】 ベクターがヘルペスウイルスまたはポッ
   クスウイルスの中から選択される請求項３に記載の組換
   え発現ベクター。
5. 【請求項５】 ベクターがマレック病ウイルス（ＭＤ
   Ｖ）である請求項４に記載の組換え発現ベクター。
6. 【請求項６】 マレック病ウイルス（ＭＤＶ）が七面鳥
   ヘルペスウイルスある請求項５に記載の組換え発現ベク
   ター。
7. 【請求項７】 ウイルスベクターが鶏痘ウイルスである
   請求項４に記載の組換え発現ベクター。
8. 【請求項８】 上記ＤＮＡにヘテロなプロモーターが挿
   入されている請求項３〜７のいずれか一項に記載の組換
   え発現ベクター。
9. 【請求項９】 プロモーターがベクターに対して内因性
   のものである請求項８に記載の組換え発現ベクター。
10. 【請求項１０】 プロモーターが前初期遺伝子である請
    求項８に記載の組換え発現ベクター。