JP2000245489A - ウイルスのヌクレオチド配列 - Google Patents
ウイルスのヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】病気に対する免疫性を付与するワクチンに関連
したウイルスのヌクレオチド配列の提供。 【解決手段】七面鳥(HVT)、マーク病ウイルス(M
DV)、及び感染性気管支炎ウイルス(ILTV)のヘ
ルペスウイルスの各遺伝子が非必須的領域(及び外来遺
伝子挿入部位のファミリー)及び/又は抗原遺伝子暗号
領域(抗原コード領域)として同定。前者には、HSV
(ヘルペス単純ウイルス)のgC遺伝子のHVT相同遺
伝子、MDV又はHVTのTK(チミジンキナーゼ)領
域、ILTVのORF3、ILTV、MDV、又はHV
TのRNA還元酵素(大サブユニット)遺伝子、MDV
のRNA還元酵素(小サブユニット)遺伝子を含む。抗
原コード領域には、HSVのgB、gC及びgH遺伝子
のHVT相同遺伝子、HSVのgB遺伝子のILTV相
同遺伝子、ILTVのORF2、HSV−1の即時型初
期遺伝子IE−175及びIE−68のHVT相同遺伝
子を含む。
したウイルスのヌクレオチド配列の提供。 【解決手段】七面鳥(HVT)、マーク病ウイルス(M
DV)、及び感染性気管支炎ウイルス(ILTV)のヘ
ルペスウイルスの各遺伝子が非必須的領域(及び外来遺
伝子挿入部位のファミリー)及び/又は抗原遺伝子暗号
領域(抗原コード領域)として同定。前者には、HSV
(ヘルペス単純ウイルス)のgC遺伝子のHVT相同遺
伝子、MDV又はHVTのTK(チミジンキナーゼ)領
域、ILTVのORF3、ILTV、MDV、又はHV
TのRNA還元酵素(大サブユニット)遺伝子、MDV
のRNA還元酵素(小サブユニット)遺伝子を含む。抗
原コード領域には、HSVのgB、gC及びgH遺伝子
のHVT相同遺伝子、HSVのgB遺伝子のILTV相
同遺伝子、ILTVのORF2、HSV−1の即時型初
期遺伝子IE−175及びIE−68のHVT相同遺伝
子を含む。
Description
【0001】本発明はウイルスのヌクレオチド配列に関
するもので、病気に対する免疫性を付与するワクチンに
関連したウイルスのヌクレオチド配列を提供することを
目的とする。 従来技術 ヘルペスウイルスは、大きな二重鎖DNAウイルスで、
エンベロープによって囲まれた20面体カプシドからな
る。このウイルスは、生物学的特性とゲノム構造とにも
とづいてアルファ、ベータ、およびガンマヘルペスウイ
ルスに分類される[Roizman,B et al.
(1981)Inter−virology18,20
1−217]。トリヘルペスウイルスには、鶏に発生す
るリンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレ
ック病ウイルス(MDV)(ガンマヘルペスウイルス)
[総説: Payne,L.N.(ed)Marek’
sDisease(1985),Martinus N
ijhoff Publishing,Boston]
と、鶏の呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を
引き起こす感染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)(ア
ルファウイルス)とが含まれる。最近、われわれの研究
室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定す
ることを可能とするような、MDV、ILTVおよび哺
乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性口内炎ウイルス
(VZV)および単純ヘルペスウイルス(HSV)との
間における顕著なアミノ酸配列の相同性(ホモロジー)
が発見された。これらには、HSVの糖タンパク質、g
B、gCおよびgHに相同なMDVおよび七面鳥ヘルペ
スウイルス(HVT)のアミノ酸配列、TKおよびリボ
核酸還元酵素遺伝子に相同なILTV、MDVおよびH
VTのアミノ酸配列、そしてgBおよびVZVの遺伝子
34および35に相同なILTVのアミノ酸配列も含ま
れる[Backmaster,A et al.(19
88)J.gen.Virol,89,2033−20
42]。MDVの株は3つの血清型に分類されている。
1型は病原性の株とその弱毒株、2型は天然の非病原性
株、そして3型はHVTが含まれる。10年以上前か
ら、HVTによる種痘がマレック病に対して顕著な有効
性を示すことが知られている。
するもので、病気に対する免疫性を付与するワクチンに
関連したウイルスのヌクレオチド配列を提供することを
目的とする。 従来技術 ヘルペスウイルスは、大きな二重鎖DNAウイルスで、
エンベロープによって囲まれた20面体カプシドからな
る。このウイルスは、生物学的特性とゲノム構造とにも
とづいてアルファ、ベータ、およびガンマヘルペスウイ
ルスに分類される[Roizman,B et al.
(1981)Inter−virology18,20
1−217]。トリヘルペスウイルスには、鶏に発生す
るリンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレ
ック病ウイルス(MDV)(ガンマヘルペスウイルス)
[総説: Payne,L.N.(ed)Marek’
sDisease(1985),Martinus N
ijhoff Publishing,Boston]
と、鶏の呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を
引き起こす感染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)(ア
ルファウイルス)とが含まれる。最近、われわれの研究
室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定す
ることを可能とするような、MDV、ILTVおよび哺
乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性口内炎ウイルス
(VZV)および単純ヘルペスウイルス(HSV)との
間における顕著なアミノ酸配列の相同性(ホモロジー)
が発見された。これらには、HSVの糖タンパク質、g
B、gCおよびgHに相同なMDVおよび七面鳥ヘルペ
スウイルス(HVT)のアミノ酸配列、TKおよびリボ
核酸還元酵素遺伝子に相同なILTV、MDVおよびH
VTのアミノ酸配列、そしてgBおよびVZVの遺伝子
34および35に相同なILTVのアミノ酸配列も含ま
れる[Backmaster,A et al.(19
88)J.gen.Virol,89,2033−20
42]。MDVの株は3つの血清型に分類されている。
1型は病原性の株とその弱毒株、2型は天然の非病原性
株、そして3型はHVTが含まれる。10年以上前か
ら、HVTによる種痘がマレック病に対して顕著な有効
性を示すことが知られている。
【0002】しかし最近になって、HVTによる種痘に
対して抵抗性を示すMDVが単離されている。このよう
なウイルス毒性が非常に高いMDVによる鶏の損失は、
米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生してい
る。しかし、HVT、2型MDVおよびMDV高ウイル
ス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いるこ
とによって、そのような損失を確実ではないが減少させ
ることが可能である。このような知見、すなわちHVT
または2型MDVによって共有されないMDV型特異的
エピトープが存在するということは、われわれに抗原的
には従来のワクチンよりもMDVに関係した改良型ワク
チンを作ることが可能であることを結論させた。[総
説: Ross and Biggs in Gold
man J.M.and Epstein M.A.
(eds)Leukaemia and Lympho
ma Research,Vaccine Inter
vention against Virus−Ind
uced Tumour,p13−31,Macmil
lan,1986] いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニア
ウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが
示される。これらには、HSVのgB[Cantin
E.M.et al.(1987)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.84,5908−
5912]、HSVのgD[Paoletti,E.e
t al.(1984)Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.81,193−197]およ
び偽狂犬病ウイルス(PRV)のgP50、HSVのg
Dの相同タンパク質(homologue)[Marc
hioli,C.C.et al.(1987)J.V
irol.61.3977−3981]が含まれる。な
ぜなら、ウイルスの貫通および感染力にgBが必須であ
ること、またヘルペスウイルス間で保存されているgB
とその相同タンパク質は重要な免疫源であるからであ
る。さらに、感染細胞の表層にgBが存在することは、
体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標
的となる[Blacklaws,B.A.et al.
J.gen.Virol.68,1103−1114
(1987);McLaughlin−Taylor,
E.et al.(1988)J.gen.Viro
l.69,1731−1734]。最近になって報告さ
れたHSVの糖タンパク質gHもまた感染力にとって必
須なものであり、また重要な免疫源でもある[Desa
l,P.J.etal.(1988)J.gen.Vi
rol.69,1147−1156]。また、gCの相
同タンパク質であるPRVのgIIIも中和抗体の主標
的および細胞毒性T細胞の主標的として重要であるが、
かならずしも必須のタンパク質ではないことが知られて
いる。しかし興味深いことは、サイトメガロウイルス
(CMV)によって感染された細胞のT細胞介在細胞毒
性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出
現である[Kozinowski U.H.et a
l.(1987)J.Virol.61.2054−2
058]。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染
リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重要な
役割を担うことができよう。なぜなら、マレッ ク病の
腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時
型初期RNA転写産物が検出されるからである。
対して抵抗性を示すMDVが単離されている。このよう
なウイルス毒性が非常に高いMDVによる鶏の損失は、
米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生してい
る。しかし、HVT、2型MDVおよびMDV高ウイル
ス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いるこ
とによって、そのような損失を確実ではないが減少させ
ることが可能である。このような知見、すなわちHVT
または2型MDVによって共有されないMDV型特異的
エピトープが存在するということは、われわれに抗原的
には従来のワクチンよりもMDVに関係した改良型ワク
チンを作ることが可能であることを結論させた。[総
説: Ross and Biggs in Gold
man J.M.and Epstein M.A.
(eds)Leukaemia and Lympho
ma Research,Vaccine Inter
vention against Virus−Ind
uced Tumour,p13−31,Macmil
lan,1986] いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニア
ウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが
示される。これらには、HSVのgB[Cantin
E.M.et al.(1987)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.84,5908−
5912]、HSVのgD[Paoletti,E.e
t al.(1984)Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.81,193−197]およ
び偽狂犬病ウイルス(PRV)のgP50、HSVのg
Dの相同タンパク質(homologue)[Marc
hioli,C.C.et al.(1987)J.V
irol.61.3977−3981]が含まれる。な
ぜなら、ウイルスの貫通および感染力にgBが必須であ
ること、またヘルペスウイルス間で保存されているgB
とその相同タンパク質は重要な免疫源であるからであ
る。さらに、感染細胞の表層にgBが存在することは、
体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標
的となる[Blacklaws,B.A.et al.
J.gen.Virol.68,1103−1114
(1987);McLaughlin−Taylor,
E.et al.(1988)J.gen.Viro
l.69,1731−1734]。最近になって報告さ
れたHSVの糖タンパク質gHもまた感染力にとって必
須なものであり、また重要な免疫源でもある[Desa
l,P.J.etal.(1988)J.gen.Vi
rol.69,1147−1156]。また、gCの相
同タンパク質であるPRVのgIIIも中和抗体の主標
的および細胞毒性T細胞の主標的として重要であるが、
かならずしも必須のタンパク質ではないことが知られて
いる。しかし興味深いことは、サイトメガロウイルス
(CMV)によって感染された細胞のT細胞介在細胞毒
性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出
現である[Kozinowski U.H.et a
l.(1987)J.Virol.61.2054−2
058]。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染
リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重要な
役割を担うことができよう。なぜなら、マレッ ク病の
腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時
型初期RNA転写産物が検出されるからである。
【0003】また、ボックスウイルスワクシニアをベク
ターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告
されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイ
ルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よ
って、肝炎抗原はHSVで発現されている[Shih,
M.F.et al.(1984)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.81, 5867
−5870]。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子
はPRVで発現されている[Thomsen,D.R.
et al.(1987)Gene 57,261−2
65]。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘ
ルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝
子組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。肝
炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに
融合され、また組換えDNAはHSVのTK遺伝子に挿
入される。組換えDNAと野生型HSVDNAとの同時
トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによっ
て肝炎抗原を発現するTK−ウイルスが得られる。PR
Vの場合、UsにマッピングされたgX遺伝子を外来遺
伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略
は、HSVのTK遺伝子をTK欠失PRV突然変異体
(TK陽性ウイルス)に挿入することを含むものであ
る。そして、プラズミノーゲン活性因子はHSVのTK
遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同
遺伝子組換えによってPRVに導入する。TK−ウイル
スを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する
[前掲、Thomsen et al.]。同様に、V
ZVをベクターとして使用する[Lowe et a
l.(1987)Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.84,3896−3900]。いくつ
かのヘルペスウイルス遺伝子も毒力(virulenc
e)に関連しており、またインビトロの系における増殖
に必須のものでないことが知られている。これらにはH
SVのTK遺伝子[Jamieson,A.T.et
al.(1974)J.GenVirol.24,46
5−480;Field,H.and Wildy,
P.,(1987)J.Hygiene(Cambri
dge)81,267−277]およびPRVのTK遺
伝子が含まれる。実際、PRVはTK活性の欠失によっ
て容易に減少される[Tatarov,G.(196
8)Zentralbl.Vet.Met.Med 1
5B,848−853]。さらに、PRVのバルサ(B
artha)株の減少はUsにマッピングされた非必須
的糖タンパク質g1の欠失にもとづく[Mettenl
eiter,T.et al.(1987)J.Vir
ol.61,4030−4032]。長い非反復配列の
側面を守る間在繰り返し領域(TRS)に存在するHS
Vマッピングの遺伝子は、病原性に関係している[Ro
sen,A.et al.(1986)VirusRe
search 5,157−175;Thompso
n,R.L.e al.(1983)Virology
131,180−192]。HSVのいくつかの付加
的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須で
あるが、毒力に関係していると報告されている。これら
には、UL24(Sanders,P.G.,(198
2),J.gen.Virol.63,277−29
5)、リボ核酸還元酵素の大サブユニット(Godst
ein D.J.and Weller,S.K.(1
988)J.Virol.62,196−205)、g
C(Draper K.G.et.al.(1984)
J.Virol.51,578−585)、dUTPア
ーゼ(Fisher,F.B.and Presto
n,V.G.(1986)Virology 148,
190−197)、そしてUL55およびUL56(M
acLean,A.R.andBrown,S.M.
(1987)J.gen.Virol.68,1339
−1350)が含まれる。さらに、UsにおけるHSV
マッピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系に
おける増殖に非必須である[Weber,P.C.et
al.(1987)Science 236,576
−579]。
ターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告
されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイ
ルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よ
って、肝炎抗原はHSVで発現されている[Shih,
M.F.et al.(1984)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.81, 5867
−5870]。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子
はPRVで発現されている[Thomsen,D.R.
et al.(1987)Gene 57,261−2
65]。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘ
ルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝
子組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。肝
炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに
融合され、また組換えDNAはHSVのTK遺伝子に挿
入される。組換えDNAと野生型HSVDNAとの同時
トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによっ
て肝炎抗原を発現するTK−ウイルスが得られる。PR
Vの場合、UsにマッピングされたgX遺伝子を外来遺
伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略
は、HSVのTK遺伝子をTK欠失PRV突然変異体
(TK陽性ウイルス)に挿入することを含むものであ
る。そして、プラズミノーゲン活性因子はHSVのTK
遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同
遺伝子組換えによってPRVに導入する。TK−ウイル
スを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する
[前掲、Thomsen et al.]。同様に、V
ZVをベクターとして使用する[Lowe et a
l.(1987)Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.84,3896−3900]。いくつ
かのヘルペスウイルス遺伝子も毒力(virulenc
e)に関連しており、またインビトロの系における増殖
に必須のものでないことが知られている。これらにはH
SVのTK遺伝子[Jamieson,A.T.et
al.(1974)J.GenVirol.24,46
5−480;Field,H.and Wildy,
P.,(1987)J.Hygiene(Cambri
dge)81,267−277]およびPRVのTK遺
伝子が含まれる。実際、PRVはTK活性の欠失によっ
て容易に減少される[Tatarov,G.(196
8)Zentralbl.Vet.Met.Med 1
5B,848−853]。さらに、PRVのバルサ(B
artha)株の減少はUsにマッピングされた非必須
的糖タンパク質g1の欠失にもとづく[Mettenl
eiter,T.et al.(1987)J.Vir
ol.61,4030−4032]。長い非反復配列の
側面を守る間在繰り返し領域(TRS)に存在するHS
Vマッピングの遺伝子は、病原性に関係している[Ro
sen,A.et al.(1986)VirusRe
search 5,157−175;Thompso
n,R.L.e al.(1983)Virology
131,180−192]。HSVのいくつかの付加
的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須で
あるが、毒力に関係していると報告されている。これら
には、UL24(Sanders,P.G.,(198
2),J.gen.Virol.63,277−29
5)、リボ核酸還元酵素の大サブユニット(Godst
ein D.J.and Weller,S.K.(1
988)J.Virol.62,196−205)、g
C(Draper K.G.et.al.(1984)
J.Virol.51,578−585)、dUTPア
ーゼ(Fisher,F.B.and Presto
n,V.G.(1986)Virology 148,
190−197)、そしてUL55およびUL56(M
acLean,A.R.andBrown,S.M.
(1987)J.gen.Virol.68,1339
−1350)が含まれる。さらに、UsにおけるHSV
マッピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系に
おける増殖に非必須である[Weber,P.C.et
al.(1987)Science 236,576
−579]。
【0004】本発明の概要 本発明は、ひとつのヌクレオチド配列を提供するもので
あり、このヌクレオチド配列に関連した野生型ウイルス
内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他
の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、
(a)HSVのgB遺伝子のMVT相同遺伝子、(b)
HSVのgC遺伝子のHVT相同遺伝子、(c)MSV
のgH遺伝子のHVT相同遺伝子、(d)ILTVのT
K遺伝子、(e)HSVのgB遺伝子のILTV相同遺
伝子、(f)ILTVのORF2、(g)ILTVのO
RF3、(h)ILTVのリボヌクレオチド還元酵素
(大サブユニット)、(i)HVTのリボヌクレオチド
還元酵素(大サブユニット)、(j)MDVのリボヌク
レオチド還元酵素(大サブユニット)、(l)HSV−
Iの即時型初期遺伝子IE175のHVT相同遺伝子、
(m)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE68のHVT
相同遺伝子、そしてそれらの配列にマイナーな変異が生
じたマイナー変異配列である。前記(a)から(m)に
記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列を発現さ
せるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモー
ターを含む他の5’および3’非遺伝暗号配列(ノンコ
ーデイング配列)と結合したものであろう。そのような
付加された配列はいわゆる自然発生的なものか、あるい
は非対応ものであろう。特に、プロモーターは前記
(1)および(m)のひとつと結合しているであろう。
あり、このヌクレオチド配列に関連した野生型ウイルス
内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他
の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列は、
(a)HSVのgB遺伝子のMVT相同遺伝子、(b)
HSVのgC遺伝子のHVT相同遺伝子、(c)MSV
のgH遺伝子のHVT相同遺伝子、(d)ILTVのT
K遺伝子、(e)HSVのgB遺伝子のILTV相同遺
伝子、(f)ILTVのORF2、(g)ILTVのO
RF3、(h)ILTVのリボヌクレオチド還元酵素
(大サブユニット)、(i)HVTのリボヌクレオチド
還元酵素(大サブユニット)、(j)MDVのリボヌク
レオチド還元酵素(大サブユニット)、(l)HSV−
Iの即時型初期遺伝子IE175のHVT相同遺伝子、
(m)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE68のHVT
相同遺伝子、そしてそれらの配列にマイナーな変異が生
じたマイナー変異配列である。前記(a)から(m)に
記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列を発現さ
せるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモー
ターを含む他の5’および3’非遺伝暗号配列(ノンコ
ーデイング配列)と結合したものであろう。そのような
付加された配列はいわゆる自然発生的なものか、あるい
は非対応ものであろう。特に、プロモーターは前記
(1)および(m)のひとつと結合しているであろう。
【0005】前記した「マイナー変異配列」という言葉
の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産
物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌク
レオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチド
のマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化(コー
ド)するためにベクターに挿入される配列の場合、配列
にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タン
パク質をコードしていることを意味する。その抗原の持
つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配
列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現され
るような配列内における保守的変化(conserva
tive changes)はこのようなマイナー変異
に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列
のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分の
みが使用される。そのような部分とは、例えば、HVT
のgH遺伝子に相当するヌクレオチド配列の273−3
20または867−926およびそれらのマイナー変異
に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれら
の配列およびこれらの配列によりコードされるペプチド
によってなされる。挿入部位に相当する配列の場合、ウ
イウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的な
ものではなく、また組換えを可能とするような配列と相
同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への
特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から
下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させる
ものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合で
は、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ず
ることを意味する(フレームシフトがどこに生ずるかに
依存する)が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほと
んど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろ
う。挿入部位においてヌクレオチドの相同性が75%存
在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされる
が、少なくとも80、85、90、95または99%の
相同性があることが好ましい。このような相同性(ho
mology)の度合いは上記の配列(a)ないし
(f)および(x)のそれぞれの全体に実質的に関係し
ている。短い配列は、このような長い配列を単離または
同定するためのプローブとして用いられるが、この場合
は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高
い相同性が必要とされる。
の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産
物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌク
レオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチド
のマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化(コー
ド)するためにベクターに挿入される配列の場合、配列
にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タン
パク質をコードしていることを意味する。その抗原の持
つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配
列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現され
るような配列内における保守的変化(conserva
tive changes)はこのようなマイナー変異
に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列
のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分の
みが使用される。そのような部分とは、例えば、HVT
のgH遺伝子に相当するヌクレオチド配列の273−3
20または867−926およびそれらのマイナー変異
に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれら
の配列およびこれらの配列によりコードされるペプチド
によってなされる。挿入部位に相当する配列の場合、ウ
イウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的な
ものではなく、また組換えを可能とするような配列と相
同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への
特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から
下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させる
ものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合で
は、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ず
ることを意味する(フレームシフトがどこに生ずるかに
依存する)が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほと
んど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろ
う。挿入部位においてヌクレオチドの相同性が75%存
在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされる
が、少なくとも80、85、90、95または99%の
相同性があることが好ましい。このような相同性(ho
mology)の度合いは上記の配列(a)ないし
(f)および(x)のそれぞれの全体に実質的に関係し
ている。短い配列は、このような長い配列を単離または
同定するためのプローブとして用いられるが、この場合
は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高
い相同性が必要とされる。
【0006】よって、本発明はさらに上記配列(a)な
いし(m)のいずれかの少なくとも一部分に対して90
%(好ましくは95%、99%または100%)の相同
性を有する少なくとも13のヌクレオチド副配列を提供
するものである。上記したように、配列(a)ないし
(c)、(e)、(f)、(l)および(m)は抗原発
現配列として好適であり、またMDVのTK領域配列は
抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として
好適である。よって、配列(b)は両方の機能に好適で
ある。これらの配列は、ここで開示された配列情報と、
例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型
のDNAとそのプローブとのハイブリダイゼーションと
を含む標準的技術を用いることによって自然発生的な
(naturally−occurring)のILT
V、HVTおよびMDVウイルスから容易に単離可能で
ある。抗原ILTVおよびHVT配列、すなわち配列
(a)から(c)、(e)、(f)、(l)および
(m)は、適当な宿主、特にHVTまたはMDV内にお
いて現される。ひとつのILTV配列の挿入のための好
適な非必須部位はHSVのgC遺伝子のMSV相同遺伝
子、HVTまたはMDVのTK遺伝子、HVTまたはM
DVリホヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝
子、およびMDVのリボヌクレオチド還元酵素(小サブ
ユニット)遺伝子を含む。第二に本発明は、MDV、H
VTおよびILTVの挿入または欠失突然変異を提供す
るものである。すなわち、(i)HVTの場合、HSV
のgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはTK遺伝子
のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
(ii)MDVの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領
域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子
(小サブユニット)の突然変異またはリボヌクレオチド
還元酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異であり、
(iii)ILTVの場合、TK遺伝子、ORF3また
はリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニット)
の突然変異である。これらの突然変異は同定された領域
の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると
考えられる。
いし(m)のいずれかの少なくとも一部分に対して90
%(好ましくは95%、99%または100%)の相同
性を有する少なくとも13のヌクレオチド副配列を提供
するものである。上記したように、配列(a)ないし
(c)、(e)、(f)、(l)および(m)は抗原発
現配列として好適であり、またMDVのTK領域配列は
抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として
好適である。よって、配列(b)は両方の機能に好適で
ある。これらの配列は、ここで開示された配列情報と、
例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型
のDNAとそのプローブとのハイブリダイゼーションと
を含む標準的技術を用いることによって自然発生的な
(naturally−occurring)のILT
V、HVTおよびMDVウイルスから容易に単離可能で
ある。抗原ILTVおよびHVT配列、すなわち配列
(a)から(c)、(e)、(f)、(l)および
(m)は、適当な宿主、特にHVTまたはMDV内にお
いて現される。ひとつのILTV配列の挿入のための好
適な非必須部位はHSVのgC遺伝子のMSV相同遺伝
子、HVTまたはMDVのTK遺伝子、HVTまたはM
DVリホヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝
子、およびMDVのリボヌクレオチド還元酵素(小サブ
ユニット)遺伝子を含む。第二に本発明は、MDV、H
VTおよびILTVの挿入または欠失突然変異を提供す
るものである。すなわち、(i)HVTの場合、HSV
のgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはTK遺伝子
のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
(ii)MDVの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領
域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子
(小サブユニット)の突然変異またはリボヌクレオチド
還元酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異であり、
(iii)ILTVの場合、TK遺伝子、ORF3また
はリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニット)
の突然変異である。これらの突然変異は同定された領域
の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると
考えられる。
【0007】HVT、MD V、およびILTVのそれ
ぞれの突然変異体は、鳥禽(ベクターが複製される)類
のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列から
なるベクターと同様に、非対応抗原コード配列(het
dlogous antigen−encoding
sequences)のためのウイルスベクターとして
利用できるであろう。このような配列として、もちろん
これらに限定されるものではないが、(a)ないし
(b)、(e)、(f)、(l)および(m)が含まれ
る。非対応(heterologous)という言葉
は、ここではウイルスゲノムに関係した場所に見出され
ていない抗原発現配列(antigen−expres
sing gene)を意味している。すなわち、抗原
発現遺伝子はILTVの病原性株から単離可能で、これ
よりも病原性の低い株のTK領域に挿入れると考えれ
る。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起こら
ない場合、非対応と見なされる。また非対応配列は、鳥
脳脊髄炎(流行性振せん)、鳥インフルエンザ(鳥禽ペ
スト)、鳥白血病、ニューキャッスル病(PMV2ない
しPMV7)以外の鳥パラマイキソバイラス(avia
n paramyxoiruses)、鳥レオウイルス
病(腸の病気、腱しょう炎)、ニワトリ貧血(ニワトリ
貧血剤によって起こる)、胞子虫症、エッグドロップ症
候群(EDS76)、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、
感染性粘液嚢症(グンボロ(Gumboro))、封入
体肝炎(アデノウイルス)、七面鳥リンパ増殖性疾患
(lymphoproliferative dise
ase)、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増
殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス腸炎、七
面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎(rhinotrac
heitis)のいずれか一つの疾患に関係した抗原を
コードするものである。よって、本発明にもとづくベク
ターは多価ワクチンによる保護を可能とする。例えば、
MDV抗原の遺伝暗号配列(コード配列)を持つILT
Vを含むワクチンは、ITLおよびマーク病からワクチ
ンを接種された生物を保護する。 さらに、突然変異
ILTVウイルスそれ自体は、弱毒化されたウイルスと
してワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿
入された非対応配列を持つ必要性はない。
ぞれの突然変異体は、鳥禽(ベクターが複製される)類
のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列から
なるベクターと同様に、非対応抗原コード配列(het
dlogous antigen−encoding
sequences)のためのウイルスベクターとして
利用できるであろう。このような配列として、もちろん
これらに限定されるものではないが、(a)ないし
(b)、(e)、(f)、(l)および(m)が含まれ
る。非対応(heterologous)という言葉
は、ここではウイルスゲノムに関係した場所に見出され
ていない抗原発現配列(antigen−expres
sing gene)を意味している。すなわち、抗原
発現遺伝子はILTVの病原性株から単離可能で、これ
よりも病原性の低い株のTK領域に挿入れると考えれ
る。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起こら
ない場合、非対応と見なされる。また非対応配列は、鳥
脳脊髄炎(流行性振せん)、鳥インフルエンザ(鳥禽ペ
スト)、鳥白血病、ニューキャッスル病(PMV2ない
しPMV7)以外の鳥パラマイキソバイラス(avia
n paramyxoiruses)、鳥レオウイルス
病(腸の病気、腱しょう炎)、ニワトリ貧血(ニワトリ
貧血剤によって起こる)、胞子虫症、エッグドロップ症
候群(EDS76)、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、
感染性粘液嚢症(グンボロ(Gumboro))、封入
体肝炎(アデノウイルス)、七面鳥リンパ増殖性疾患
(lymphoproliferative dise
ase)、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増
殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス腸炎、七
面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎(rhinotrac
heitis)のいずれか一つの疾患に関係した抗原を
コードするものである。よって、本発明にもとづくベク
ターは多価ワクチンによる保護を可能とする。例えば、
MDV抗原の遺伝暗号配列(コード配列)を持つILT
Vを含むワクチンは、ITLおよびマーク病からワクチ
ンを接種された生物を保護する。 さらに、突然変異
ILTVウイルスそれ自体は、弱毒化されたウイルスと
してワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿
入された非対応配列を持つ必要性はない。
【0008】本発明にもとづく欠失または挿入突然変異
体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばTK
領域の同時トランスフェクション(co−transf
ection)、欠失または挿入変異されたものと全ウ
イルスDNAまたは全ウイルス(例えば野生型(wil
d type)のウイルス)を導入することである。そ
のようなウイルスのむき出しとなったDNAが感染性を
有することはすでに知られており、切断しないで調製し
た。リン酸カルシウムによる沈澱によってDNAを調製
するのが好ましい。この方法に用いられる適当な細胞と
は、ニワトリ胚繊維芽細胞(embryo fibro
blast)、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽
細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団
として播種されることによって好適に増殖する。相同遺
伝子組換えによって形質転換DNAと全ウイルスDNA
とを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換
え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例
えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、
あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適
当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって
行なわれる。相同遺伝子組換えが行なわれるためには、
ウイルスDNAは複製されなければならない。現在のと
ころNDV、HVT、またはILTVのための細胞フリ
ーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可
能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。
複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものでは
ない。
体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばTK
領域の同時トランスフェクション(co−transf
ection)、欠失または挿入変異されたものと全ウ
イルスDNAまたは全ウイルス(例えば野生型(wil
d type)のウイルス)を導入することである。そ
のようなウイルスのむき出しとなったDNAが感染性を
有することはすでに知られており、切断しないで調製し
た。リン酸カルシウムによる沈澱によってDNAを調製
するのが好ましい。この方法に用いられる適当な細胞と
は、ニワトリ胚繊維芽細胞(embryo fibro
blast)、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽
細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団
として播種されることによって好適に増殖する。相同遺
伝子組換えによって形質転換DNAと全ウイルスDNA
とを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換
え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例
えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、
あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適
当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって
行なわれる。相同遺伝子組換えが行なわれるためには、
ウイルスDNAは複製されなければならない。現在のと
ころNDV、HVT、またはILTVのための細胞フリ
ーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可
能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。
複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものでは
ない。
【0009】免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコー
ドすることに関与したILTVおよびHVT領域は、適
当なベクター(例えばHVT、または伝染性上皮腫ウイ
ルス、細菌また菌類などのような他のベクター)に挿入
される。ウイルスベクターの場合(特にヘルペスウイル
スベクターおよび腸炎ウイルスベクター)、抗原をコー
ドしている配列(適当な配列(フランキング配列)が両
端にある)と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクタ
ーゲノムとの間にそのような挿入がなされる。宿主にと
って内在(endogenous)的なものであるプロ
モーターは、非対応(ウイルス抗原をコードする)配列
の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の
場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法
またはこれから発見されるであろう方法によって挿入さ
れよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主とし
て用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに
挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによ
って運ばれる。 フランキング配列は、非対応配列が
挿入される少なからずすべての領域が含まれる。もし、
すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は
形質転換されたベクターに残るであろう。しかし、その
ような領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域
の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場
合、機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろ
う。よって、ITLVの欠失または挿入突然変異のその
ような構成は、ワクチンの改良につながる。一方、HV
T、鳥類伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組
み込まれたILTVの糖タンパク質(glycopro
teins)または他のILTVタンパク質の発現は、
効果的なワクチンの製造を可能とする。
ドすることに関与したILTVおよびHVT領域は、適
当なベクター(例えばHVT、または伝染性上皮腫ウイ
ルス、細菌また菌類などのような他のベクター)に挿入
される。ウイルスベクターの場合(特にヘルペスウイル
スベクターおよび腸炎ウイルスベクター)、抗原をコー
ドしている配列(適当な配列(フランキング配列)が両
端にある)と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクタ
ーゲノムとの間にそのような挿入がなされる。宿主にと
って内在(endogenous)的なものであるプロ
モーターは、非対応(ウイルス抗原をコードする)配列
の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の
場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法
またはこれから発見されるであろう方法によって挿入さ
れよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主とし
て用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに
挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによ
って運ばれる。 フランキング配列は、非対応配列が
挿入される少なからずすべての領域が含まれる。もし、
すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は
形質転換されたベクターに残るであろう。しかし、その
ような領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域
の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場
合、機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろ
う。よって、ITLVの欠失または挿入突然変異のその
ような構成は、ワクチンの改良につながる。一方、HV
T、鳥類伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組
み込まれたILTVの糖タンパク質(glycopro
teins)または他のILTVタンパク質の発現は、
効果的なワクチンの製造を可能とする。
【0010】ウイルスまたはベクターとしてHVT、M
DVまたはILTVを含むワクチンを合成するするため
に、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細
胞内で増殖させる。この場合に用いる焙地は199培地
(ウエルカムまたはフローラボラトリーズ)のような標
準的な培養液を使用し、この培養液で37℃、3ないし
4日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、
10%ジメチルスルホキシドと4%牛血清を含む培養液
に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、
そのアンプルを液体窒素保存する。通常、予防接種(ワ
クチン投与)は生後1日経過したニワトリのひよこに対
しておこなわれ、約1,000プラーク形成単位を筋肉
注射することによってワクチン投与が実施される。この
後、数日で免疫ができる。本発明にもとづくワクチン
は、MDVに感染しやすい鳥(fowl)、例えば商業
的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家
禽類を保護するために用いられるものである。
DVまたはILTVを含むワクチンを合成するするため
に、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細
胞内で増殖させる。この場合に用いる焙地は199培地
(ウエルカムまたはフローラボラトリーズ)のような標
準的な培養液を使用し、この培養液で37℃、3ないし
4日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、
10%ジメチルスルホキシドと4%牛血清を含む培養液
に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、
そのアンプルを液体窒素保存する。通常、予防接種(ワ
クチン投与)は生後1日経過したニワトリのひよこに対
しておこなわれ、約1,000プラーク形成単位を筋肉
注射することによってワクチン投与が実施される。この
後、数日で免疫ができる。本発明にもとづくワクチン
は、MDVに感染しやすい鳥(fowl)、例えば商業
的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家
禽類を保護するために用いられるものである。
【0011】以下、本発明の好適な実施態様を添付した
図を参照しながら実施例にもとづいて説明する。
図を参照しながら実施例にもとづいて説明する。
【0012】実施例:一般的アプローチ バクテリオファージベクターM13にクローン化された
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。ウイルスの
株 NDVの高い癌誘発性(high oncogen
ic)を有するRB1B株(Schat,K.A.et
al.Avian Pathol.11,593−6
05,1982)を米国のコーネル大学B.カルネック
(B.Calnek)教授から入手した。このウイルス
の精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラ
ークを形成させることによって行なった。ニワトリSP
FおよびRIR内で2度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞
(chick embryo fibroblast
s;CEF)内で4回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗
性N−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって
高い癌誘発性が示された。
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。ウイルスの
株 NDVの高い癌誘発性(high oncogen
ic)を有するRB1B株(Schat,K.A.et
al.Avian Pathol.11,593−6
05,1982)を米国のコーネル大学B.カルネック
(B.Calnek)教授から入手した。このウイルス
の精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラ
ークを形成させることによって行なった。ニワトリSP
FおよびRIR内で2度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞
(chick embryo fibroblast
s;CEF)内で4回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗
性N−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって
高い癌誘発性が示された。
【0013】ウエルカムリサーチ(Wellcome
Research Laboratories,Bec
kenham,Kewnt)から得たHVTのFC12
6株(Witter,R.L.et al.Am.J.
Vet.Res.31,525−538、1970)
を、CEF内で14回継代した。つづいて我々の研究室
においてアヒル胚繊維芽細胞(DEF)およびCEF内
で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらに
CEF内で増殖させた。本実施例のクローニングに用い
るウイルスDNAは元の単離から数えて24回の継代が
なされたウイルスから抽出した。組織培養 CEFは1
99培養液(ウイエルカム社製)を含む回転ボトル中に
おいて培養された。なお、この培養液には、ペニシル
ン、ストレプトマイシン、ファンジゾン(Fugizo
ne)(レグド.テイー.エム;Regd.T.M)お
よび前記牛血清が添加されている(Ross,L.J.
M.et al.J.gen.Virol.28,37
−47,1975)。 CKCは10cmペトリ皿中
で培養した(Churchill,A.E.and B
iggs P.M.,Nature,215,528−
530,1967)。MDV−DNAの単離 RBIB
感染細胞(cell associatedRB1B)
を、回転ボトルのCEFからなる単層に、感染の程度が
一細胞あたり約0.001プラーク形成単位(pfu)
となるようにして植つけて、37℃で培養した。培養3
日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換
された新しい培養液は、2%牛血清を含む199培養液
である。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞
質分画からウイルスを単離した(Lee,Y.S.et
al.J.gen.Virol.51,245−25
3,1980)。ウイルスDNAは、精製ウイルスをサ
ルコシル、プロテナーゼKおよびトリス緩衝液でもって
一晩、37℃で処理し、それをグリセロール勾配でもっ
てゾーン遠心(前掲、Lee,Y.S.etal.)に
よって精製した。高分子量のウイルスDNAをエタノー
ルによって沈澱させた後、10mMのトリス/ImMの
EDTAからなるTE緩衝液(pH7.5)に懸濁し
た。 ILTV−DNAの単離 (a)感染CKCを採集し、播種後2〜3日経過したP
BSで洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこな
い、氷冷TE感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活
性剤であるNP40(最終濃度1%)を添加して攪拌
し、氷うえで15分間、インキュベートした。RNアー
ゼ処理後、試料を2000r.p.m.5分間遠心し
た。遠心後、上清を採り、SDS(最終濃度1%)およ
びプロテナーゼK(最終濃度0.5mg/ml)を加え
て37℃、30分間、インキューベートした。この混合
物に2回のフェノール/クロロホルム処理、および1回
のクロロホルム処理をおこない、続いて、1/10容量
の3M酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することに
よってDNAを沈澱させた。
Research Laboratories,Bec
kenham,Kewnt)から得たHVTのFC12
6株(Witter,R.L.et al.Am.J.
Vet.Res.31,525−538、1970)
を、CEF内で14回継代した。つづいて我々の研究室
においてアヒル胚繊維芽細胞(DEF)およびCEF内
で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらに
CEF内で増殖させた。本実施例のクローニングに用い
るウイルスDNAは元の単離から数えて24回の継代が
なされたウイルスから抽出した。組織培養 CEFは1
99培養液(ウイエルカム社製)を含む回転ボトル中に
おいて培養された。なお、この培養液には、ペニシル
ン、ストレプトマイシン、ファンジゾン(Fugizo
ne)(レグド.テイー.エム;Regd.T.M)お
よび前記牛血清が添加されている(Ross,L.J.
M.et al.J.gen.Virol.28,37
−47,1975)。 CKCは10cmペトリ皿中
で培養した(Churchill,A.E.and B
iggs P.M.,Nature,215,528−
530,1967)。MDV−DNAの単離 RBIB
感染細胞(cell associatedRB1B)
を、回転ボトルのCEFからなる単層に、感染の程度が
一細胞あたり約0.001プラーク形成単位(pfu)
となるようにして植つけて、37℃で培養した。培養3
日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換
された新しい培養液は、2%牛血清を含む199培養液
である。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞
質分画からウイルスを単離した(Lee,Y.S.et
al.J.gen.Virol.51,245−25
3,1980)。ウイルスDNAは、精製ウイルスをサ
ルコシル、プロテナーゼKおよびトリス緩衝液でもって
一晩、37℃で処理し、それをグリセロール勾配でもっ
てゾーン遠心(前掲、Lee,Y.S.etal.)に
よって精製した。高分子量のウイルスDNAをエタノー
ルによって沈澱させた後、10mMのトリス/ImMの
EDTAからなるTE緩衝液(pH7.5)に懸濁し
た。 ILTV−DNAの単離 (a)感染CKCを採集し、播種後2〜3日経過したP
BSで洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこな
い、氷冷TE感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活
性剤であるNP40(最終濃度1%)を添加して攪拌
し、氷うえで15分間、インキュベートした。RNアー
ゼ処理後、試料を2000r.p.m.5分間遠心し
た。遠心後、上清を採り、SDS(最終濃度1%)およ
びプロテナーゼK(最終濃度0.5mg/ml)を加え
て37℃、30分間、インキューベートした。この混合
物に2回のフェノール/クロロホルム処理、および1回
のクロロホルム処理をおこない、続いて、1/10容量
の3M酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することに
よってDNAを沈澱させた。
【0014】(b)また、ウイルスDNAを以下の方法
によりウイルス感染細胞の培養液化ら単離下。感染後2
〜3日目のそのウイルス感染細胞の培養駅を厚め、30
00r.p.m.、5分間、4℃の条件でベンチトップ
遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び19,
000r.p.m.の回転数により超遠心(ソーバル)
を4℃、1時間の条件でおこなった。この超遠心処理に
よって得られたウイルスペレットをTE緩衝液に再懸濁
し、RNアーゼンでRNAの消化をおこなった。そし
て、既に述べたようにしてSDSおよびプロテアーゼK
処理をおこなって、ウイルスをこわした。最後に破壊さ
れたウイルスから既に述べた方法によりDNAを抽出し
た。 MDV−DNAのクローニング 1μgのMDVを制限
酵素BamH1によって切断し、これをジフォスフォリ
レートpUC13DNAのBamH1制限部位に連結し
た。一方、使用する大腸菌(E.coli)のTG1株
細胞を標準的方法(Hanahan,D.J.Mol.
Biol.166,557−580,1983)によっ
て形質転換し、この形質転換細胞をアンピリシンおよび
X−gal存在下で培養した。白いコロニーを採取し、
ニックトランスレーションされたMDV−DNAとの雑
種形成(ハイブリ代是−ション)によってその存在また
はMDV挿入部位について調べた(Crunstein
M.and Hogness,D.S.Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.72,396
1,1975)た。陽性コロニーを小量で培養し、そし
てホルムス(Holmes,D.S.)およびクイグレ
イ(Quigley,M.)の方法(Holmes,
D.S.and Quigley,M.,Anal.
Biochem.114,193−297,1981)
によってプラスミドDNAを単離した。挿入部位の大き
さは、組換えDNAをBamH1消化し、それをアガロ
ース電気泳動することによって調べた。その結果、1な
いし18キロ塩基対(kbp)よりも少ない塩基対から
なるMDV挿入部位を有するプラスミドが得られた。
によりウイルス感染細胞の培養液化ら単離下。感染後2
〜3日目のそのウイルス感染細胞の培養駅を厚め、30
00r.p.m.、5分間、4℃の条件でベンチトップ
遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び19,
000r.p.m.の回転数により超遠心(ソーバル)
を4℃、1時間の条件でおこなった。この超遠心処理に
よって得られたウイルスペレットをTE緩衝液に再懸濁
し、RNアーゼンでRNAの消化をおこなった。そし
て、既に述べたようにしてSDSおよびプロテアーゼK
処理をおこなって、ウイルスをこわした。最後に破壊さ
れたウイルスから既に述べた方法によりDNAを抽出し
た。 MDV−DNAのクローニング 1μgのMDVを制限
酵素BamH1によって切断し、これをジフォスフォリ
レートpUC13DNAのBamH1制限部位に連結し
た。一方、使用する大腸菌(E.coli)のTG1株
細胞を標準的方法(Hanahan,D.J.Mol.
Biol.166,557−580,1983)によっ
て形質転換し、この形質転換細胞をアンピリシンおよび
X−gal存在下で培養した。白いコロニーを採取し、
ニックトランスレーションされたMDV−DNAとの雑
種形成(ハイブリ代是−ション)によってその存在また
はMDV挿入部位について調べた(Crunstein
M.and Hogness,D.S.Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.72,396
1,1975)た。陽性コロニーを小量で培養し、そし
てホルムス(Holmes,D.S.)およびクイグレ
イ(Quigley,M.)の方法(Holmes,
D.S.and Quigley,M.,Anal.
Biochem.114,193−297,1981)
によってプラスミドDNAを単離した。挿入部位の大き
さは、組換えDNAをBamH1消化し、それをアガロ
ース電気泳動することによって調べた。その結果、1な
いし18キロ塩基対(kbp)よりも少ない塩基対から
なるMDV挿入部位を有するプラスミドが得られた。
【0015】ILTV−DNAのクローニング I
LTV−DNAのEcoR1およびBg1IIライブラ
リーを既に述べたようなpUCBに含まれるウイルスD
NAのクリーニング消化(Cloning Diger
ts)によって得た。ウイルスDNAのランダムシーク
エンシング ソニケーション処理したウイルスDNA断
片をジフォスフォリレートM13.mp10(アマーシ
ャムインターナショナルPLC)のSmaI制限部位に
クローン化し、MDV挿入部位を含むプラークをNDV
−DNAに対するハイブリダイゼーションによって同定
した。そして、その配列を35S−dATPを用いたジ
デオキシ方法(Sanger,F.et al.Pro
c.Natl.Acad.Sci.74,5463−5
467)によって同定した。同様な方法をMDV−DN
Aのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プ
ラークはpUC13含有コロニーを避けるために標識さ
れた挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定
した。
LTV−DNAのEcoR1およびBg1IIライブラ
リーを既に述べたようなpUCBに含まれるウイルスD
NAのクリーニング消化(Cloning Diger
ts)によって得た。ウイルスDNAのランダムシーク
エンシング ソニケーション処理したウイルスDNA断
片をジフォスフォリレートM13.mp10(アマーシ
ャムインターナショナルPLC)のSmaI制限部位に
クローン化し、MDV挿入部位を含むプラークをNDV
−DNAに対するハイブリダイゼーションによって同定
した。そして、その配列を35S−dATPを用いたジ
デオキシ方法(Sanger,F.et al.Pro
c.Natl.Acad.Sci.74,5463−5
467)によって同定した。同様な方法をMDV−DN
Aのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プ
ラークはpUC13含有コロニーを避けるために標識さ
れた挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定
した。
【0016】実施例1: MDVのgB遺伝子 HVTのM13クローンは、MDVのBamH1断片1
3とハイブリダイズされたHSVおよびVZVのgB遺
伝子に対して相同性を示す(図1参照)。MDVのRB
1株のBBamH1ライブラリーから得たこの断片のシ
ークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のNH
3末端から始まる1/3の部分がI3を含んでいた。こ
の遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片K3と同定
された。図1は、2.6kpの長さからなる遺伝子の位
置を示す地図である。その遺伝子から転写されたmRN
Aの長さは2.6kpと推測される。翻訳されたタンパ
ク質の長さはアミノ酸、865個に相当した(図2
0)。これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約
20のアミノ酸も含まれる。MDV−gB遺伝子の初期
翻訳配列は他のヘルペスウイルスのgB遺伝子と共通な
部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広
げることが可能な疎水性配列が存在する(Pelle
t,P.E.et al.J.Virol.53,24
3−253,1985)。しかし、MDVのgB遺伝子
はHSVのgB遺伝子とたった48%のアミノ酸配列の
相同性しか認められず、23個のアミノ酸(1851−
1920残基、図2−図19)の挿入およびグリコシレ
ーションによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示
す。HVTのgB(図2−図19)に該当する限定され
た配列データ(702塩基)とMDVのgBの配列とを
比較すると、これら2つの糖タンパク質に関して76.
9%の核酸の相同性と87.1%のアミノ酸の相同性と
が認められた。MDVのgBと比較してHVTのgBに
おけるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したHSV
のgBのドメインと等価な領域(1323−1433残
基)に特に集中した(前掲、Pellet P.E.e
t al.1985)。MDVおよびHVTのgB間に
おけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の
領域に集中された。
3とハイブリダイズされたHSVおよびVZVのgB遺
伝子に対して相同性を示す(図1参照)。MDVのRB
1株のBBamH1ライブラリーから得たこの断片のシ
ークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のNH
3末端から始まる1/3の部分がI3を含んでいた。こ
の遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片K3と同定
された。図1は、2.6kpの長さからなる遺伝子の位
置を示す地図である。その遺伝子から転写されたmRN
Aの長さは2.6kpと推測される。翻訳されたタンパ
ク質の長さはアミノ酸、865個に相当した(図2
0)。これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約
20のアミノ酸も含まれる。MDV−gB遺伝子の初期
翻訳配列は他のヘルペスウイルスのgB遺伝子と共通な
部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広
げることが可能な疎水性配列が存在する(Pelle
t,P.E.et al.J.Virol.53,24
3−253,1985)。しかし、MDVのgB遺伝子
はHSVのgB遺伝子とたった48%のアミノ酸配列の
相同性しか認められず、23個のアミノ酸(1851−
1920残基、図2−図19)の挿入およびグリコシレ
ーションによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示
す。HVTのgB(図2−図19)に該当する限定され
た配列データ(702塩基)とMDVのgBの配列とを
比較すると、これら2つの糖タンパク質に関して76.
9%の核酸の相同性と87.1%のアミノ酸の相同性と
が認められた。MDVのgBと比較してHVTのgBに
おけるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したHSV
のgBのドメインと等価な領域(1323−1433残
基)に特に集中した(前掲、Pellet P.E.e
t al.1985)。MDVおよびHVTのgB間に
おけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の
領域に集中された。
【0017】実施例2: HVTのgH遺伝子およびM
DVのgH遺伝子 HSVのgH遺伝子に相同な配列を含むHVTのM13
クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれ
われの初期の研究において同定された(前掲、Buck
master et al.1988)。このクローン
は、プローブとして用いた場合、HVTの6kbからな
るHindIII断片とハイブリダイズ(雑種形成)す
る(図20)。シークエンス(配列決定)によって、こ
の断片がカルボキシ末端を含むおよそ1/4のgH遺伝
子を含むことが明らかになった。gH遺伝子の残りの部
分を有する隣接するHindIII断片(3.2kb)
はHindIII部位と重なり合うHVTのクローン化
HpaI断片とハイブリダイゼーションされた。図21
−図28は、HVTのgH遺伝子の遺伝暗号領域(コー
ド領域)とフランキング配列とを示すものである。HV
TのgH遺伝子と、HSV1、VZVおよびEBVに含
まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性
(%)は、それぞれ20、24および20であった(ア
ミノ酸が最大重なり合った数630、644および15
3からそれぞれ推定した)。
DVのgH遺伝子 HSVのgH遺伝子に相同な配列を含むHVTのM13
クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれ
われの初期の研究において同定された(前掲、Buck
master et al.1988)。このクローン
は、プローブとして用いた場合、HVTの6kbからな
るHindIII断片とハイブリダイズ(雑種形成)す
る(図20)。シークエンス(配列決定)によって、こ
の断片がカルボキシ末端を含むおよそ1/4のgH遺伝
子を含むことが明らかになった。gH遺伝子の残りの部
分を有する隣接するHindIII断片(3.2kb)
はHindIII部位と重なり合うHVTのクローン化
HpaI断片とハイブリダイゼーションされた。図21
−図28は、HVTのgH遺伝子の遺伝暗号領域(コー
ド領域)とフランキング配列とを示すものである。HV
TのgH遺伝子と、HSV1、VZVおよびEBVに含
まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性
(%)は、それぞれ20、24および20であった(ア
ミノ酸が最大重なり合った数630、644および15
3からそれぞれ推定した)。
【0018】実施例3: HVTのTK遺伝子とMDV
のTK遺伝子 HVTのTK遺伝子の全遺伝暗号領域(1053bp)
は、前記した3.2kbpからなるHindIII断片
を含むものである(図20)。遺伝子全体およびフラン
キング領域の配列は図29−38に示した。同様に、M
DKのTK遺伝子はMDVの3.6kbpからなるBa
mH1K2断片を含むものである。MDKのTK遺伝子
の完全な配列を図63に示した。MDVおよびHVTの
TK配列の比較空、2つの遺伝子は60%のアミノ酸の
同一性を有することがわかった。これとは対照的に、H
VTのTK遺伝子とHSV1、VZVおよびEBVのT
K遺伝子間の同一性はそれぞれたったの30、27およ
び24%であった(アミノ酸が最大重なり合った数32
0、332および193からそれぞれ推定した)。HV
TおよびMDVのTK遺伝子から予想されるアミノ酸配
列は、ジン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真
核生物のタンパク質のためのATPおよび(または)C
TP結合部位の特徴を示した(Gentry,G.A.
Proc.Natl.Acad.ASci.U.S.
A.82,6815−6819)。これらの保守的な配
列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位と
して、またTK−欠失突然変異体を産生するのに好適で
ある。
のTK遺伝子 HVTのTK遺伝子の全遺伝暗号領域(1053bp)
は、前記した3.2kbpからなるHindIII断片
を含むものである(図20)。遺伝子全体およびフラン
キング領域の配列は図29−38に示した。同様に、M
DKのTK遺伝子はMDVの3.6kbpからなるBa
mH1K2断片を含むものである。MDKのTK遺伝子
の完全な配列を図63に示した。MDVおよびHVTの
TK配列の比較空、2つの遺伝子は60%のアミノ酸の
同一性を有することがわかった。これとは対照的に、H
VTのTK遺伝子とHSV1、VZVおよびEBVのT
K遺伝子間の同一性はそれぞれたったの30、27およ
び24%であった(アミノ酸が最大重なり合った数32
0、332および193からそれぞれ推定した)。HV
TおよびMDVのTK遺伝子から予想されるアミノ酸配
列は、ジン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真
核生物のタンパク質のためのATPおよび(または)C
TP結合部位の特徴を示した(Gentry,G.A.
Proc.Natl.Acad.ASci.U.S.
A.82,6815−6819)。これらの保守的な配
列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位と
して、またTK−欠失突然変異体を産生するのに好適で
ある。
【0019】実施例4:MDV(gP57−65)(g
C相同遺伝子)のA抗原遺伝子 A抗原遺伝子は、HSVの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源(主要グリコポリペプチド産物をコードす
る)として、また非必須領域として用いられる。このA
抗原遺伝子は、MDVのBamH1B断片の中に置かれ
ており(Isfort et al.1987)、MD
VのGA株に関してはヌクレオチド配列が決定されてい
る(Coussens and Velicer,Ab
stract OP18.51,VII Intern
ational Congress of Virol
ogy9−14August,(1987)Edmon
ton,Canada;J.Virol.62,237
4−2379)。前記したランダムなシークエンス決定
に関する研究過程において、A抗原遺伝子発現産物であ
るM13クローン(No.130)を同定した。よっ
て、このクローンをA抗原を含むMDVのRB1B株か
ら得られた2.3KbpのEcoR1/PvuII断片
を同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な方
法により、SmaI/EcoR1によって裂かれたpU
C13ベクターにクローン化した。MDVのRB1Bの
A抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは図39−4
4に示した。MDVおよびHVTのA抗原領域は非必須
遺伝子であり、よってMDVおよびHVT内の部位とし
て好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の
遺伝子が挿入されよう。このことはいくつかの証拠から
支持される。それらの証拠を以下に示す。 (1)われわれの研究において、他のRB1BのA抗原
が単離され、かつ配列決定された。これは3’からA抗
原ATGコドンまでのTが45塩基つらなった(T’s
45 bases 3’to the A anti
gen ATGcodon)余分な(エクストラ)T残
基を有する。このエクストロラTは遺伝子に機能的なA
抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシ
フト変異を引き起こす。この遺伝子は複製MDVからク
ローン化可能であるので、その結果A抗原はウイルスに
とって非必須的なものであることになる。 (2)同様な研究から、MDVのA抗原はHSVのgC
およびPRVのgpIII糖タンパク質と相同であるこ
とが明らかになった。これら2つの相同遺伝子は非必須
的なものと考えられている(HSV相対体にとって、ロ
センタルらの文献:Rosenthal et al.
J.Virol.61,2438−2447を見よ。 (3)MDVの株であって寒天ゲル分散試験によってA
抗原が欠如していると判定された株(churchil
l,A.E.et al.J.gen.Virol.
4,557−564,1969)またはより感度の高い
2次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す
株が報告されている(Van Zaane,D.et
al.Virology 121,133−146)。
さらに、A抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Aタ
ンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所
(location)であろう。これによって、A抗原
遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしてい
るオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろ
う。
C相同遺伝子)のA抗原遺伝子 A抗原遺伝子は、HSVの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源(主要グリコポリペプチド産物をコードす
る)として、また非必須領域として用いられる。このA
抗原遺伝子は、MDVのBamH1B断片の中に置かれ
ており(Isfort et al.1987)、MD
VのGA株に関してはヌクレオチド配列が決定されてい
る(Coussens and Velicer,Ab
stract OP18.51,VII Intern
ational Congress of Virol
ogy9−14August,(1987)Edmon
ton,Canada;J.Virol.62,237
4−2379)。前記したランダムなシークエンス決定
に関する研究過程において、A抗原遺伝子発現産物であ
るM13クローン(No.130)を同定した。よっ
て、このクローンをA抗原を含むMDVのRB1B株か
ら得られた2.3KbpのEcoR1/PvuII断片
を同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な方
法により、SmaI/EcoR1によって裂かれたpU
C13ベクターにクローン化した。MDVのRB1Bの
A抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは図39−4
4に示した。MDVおよびHVTのA抗原領域は非必須
遺伝子であり、よってMDVおよびHVT内の部位とし
て好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の
遺伝子が挿入されよう。このことはいくつかの証拠から
支持される。それらの証拠を以下に示す。 (1)われわれの研究において、他のRB1BのA抗原
が単離され、かつ配列決定された。これは3’からA抗
原ATGコドンまでのTが45塩基つらなった(T’s
45 bases 3’to the A anti
gen ATGcodon)余分な(エクストラ)T残
基を有する。このエクストロラTは遺伝子に機能的なA
抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシ
フト変異を引き起こす。この遺伝子は複製MDVからク
ローン化可能であるので、その結果A抗原はウイルスに
とって非必須的なものであることになる。 (2)同様な研究から、MDVのA抗原はHSVのgC
およびPRVのgpIII糖タンパク質と相同であるこ
とが明らかになった。これら2つの相同遺伝子は非必須
的なものと考えられている(HSV相対体にとって、ロ
センタルらの文献:Rosenthal et al.
J.Virol.61,2438−2447を見よ。 (3)MDVの株であって寒天ゲル分散試験によってA
抗原が欠如していると判定された株(churchil
l,A.E.et al.J.gen.Virol.
4,557−564,1969)またはより感度の高い
2次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す
株が報告されている(Van Zaane,D.et
al.Virology 121,133−146)。
さらに、A抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Aタ
ンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所
(location)であろう。これによって、A抗原
遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしてい
るオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろ
う。
【0020】HVTおよびILTVベクターへ遺伝子を
導入するための戦略 2つの可能性がある、すなわち、(1)ベクターの非必
須的遺伝子への挿入、(2)ベクターの該当する得電子
との置換。これは、MDVおよびHVTのいくつかの遺
伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能で
ある。
導入するための戦略 2つの可能性がある、すなわち、(1)ベクターの非必
須的遺伝子への挿入、(2)ベクターの該当する得電子
との置換。これは、MDVおよびHVTのいくつかの遺
伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能で
ある。
【0021】実施例5:HVT,ILTVまたはMDV
の非必須的遺伝子への挿入 (a)ベクターのTK遺伝子座への挿入 (1)HVT,ILTVまたはMDVは鳥ペルペスウイ
ルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして
用いられることが可能であろう。特にMDVのRB1B
株のgB,gC,gHまたはgCは、ILTVに挿入さ
れる。また、ILTVのgBおよびDS−17はHVT
またはMDVに挿入される。これらは、挿入された遺伝
子と結合したプロモーター、非対応(heterolo
gous)プロモーター、或はこれらの異なるクラスに
ある遺伝子(例えば、gB遺伝子発現に好適な即時型初
期プロモーター)を用いるであろう。 (2)ILTVは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無
関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベ
クターとして利用可能であり、また、最適な発現のため
のプロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に
用いられる方法は、HSVへの肝炎抗原の挿入に関する
既知の方法(前掲、Shih et al.1984)
に基づく。既に述べた方法に因って得られたMDVおよ
びHVTのDNAは、DNA抽出中にDNAの切断が起
こらないような予防策を講じることによって、間宣誓を
そこなわず、DNAを保護することができる。ストウお
よびウイルキーの方法(前掲、Stow &Wilki
e J.gen.Virol.33,477,197
6)によって得られたウイルスDNAのリン酸カルシウ
ム沈澱物をCEFからなるサブコンフルエント(sub
−confluent)な単層に添加した。1時間、3
7℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した
状態(コンフルエントな状態)となるまで1〜2日間培
養した。コンフルエントな状態からなる199培地(ウ
エルカム)と、前記培養液の一部を置き換えた(1:1
または2:1)。そして、プラークが形成されるまで、
37℃で培養した。通常、このプラーク形成は4〜5日
後に見られるようになる。1μgのHVT−DNAあた
り、約200のプラークが得られ、また1μgのMDV
−DNAあたり、約50のプラークが得られるであろ
う。組換えウイルスの相同遺伝子組換えおよび単離のた
めに、目的とする遺伝子を前記したような10:1ない
し2:1のTKまたはgCおよび野生型ウイルスと共形
質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、
完全な野生株を共感染(co−infection)に
用いることが可能である。HVTのFc−126株のT
K遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられ
る制限酵素は、BanII、Bsp1286、DraI
II、EcoRI、HincII、HpaI、NheI
およびNspbIIおよびSphIである。これらの制
限酵素による切断(消化)部位は、TK遺伝子の発現を
妨害する外来DNAの挿入部位として用いられ、TK遺
伝子部分がこれらの酵素(またEcoKも利用可)の組
合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化さ
せる。これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクター
に消化部位をもち、このような部位にウイルスDNA断
片がクローン化される。よって、ベクターを切断するこ
となしにクローン化されたDNAを直線化するために制
限酵素による部分消化の手法が用いられよう。
の非必須的遺伝子への挿入 (a)ベクターのTK遺伝子座への挿入 (1)HVT,ILTVまたはMDVは鳥ペルペスウイ
ルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして
用いられることが可能であろう。特にMDVのRB1B
株のgB,gC,gHまたはgCは、ILTVに挿入さ
れる。また、ILTVのgBおよびDS−17はHVT
またはMDVに挿入される。これらは、挿入された遺伝
子と結合したプロモーター、非対応(heterolo
gous)プロモーター、或はこれらの異なるクラスに
ある遺伝子(例えば、gB遺伝子発現に好適な即時型初
期プロモーター)を用いるであろう。 (2)ILTVは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無
関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベ
クターとして利用可能であり、また、最適な発現のため
のプロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に
用いられる方法は、HSVへの肝炎抗原の挿入に関する
既知の方法(前掲、Shih et al.1984)
に基づく。既に述べた方法に因って得られたMDVおよ
びHVTのDNAは、DNA抽出中にDNAの切断が起
こらないような予防策を講じることによって、間宣誓を
そこなわず、DNAを保護することができる。ストウお
よびウイルキーの方法(前掲、Stow &Wilki
e J.gen.Virol.33,477,197
6)によって得られたウイルスDNAのリン酸カルシウ
ム沈澱物をCEFからなるサブコンフルエント(sub
−confluent)な単層に添加した。1時間、3
7℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した
状態(コンフルエントな状態)となるまで1〜2日間培
養した。コンフルエントな状態からなる199培地(ウ
エルカム)と、前記培養液の一部を置き換えた(1:1
または2:1)。そして、プラークが形成されるまで、
37℃で培養した。通常、このプラーク形成は4〜5日
後に見られるようになる。1μgのHVT−DNAあた
り、約200のプラークが得られ、また1μgのMDV
−DNAあたり、約50のプラークが得られるであろ
う。組換えウイルスの相同遺伝子組換えおよび単離のた
めに、目的とする遺伝子を前記したような10:1ない
し2:1のTKまたはgCおよび野生型ウイルスと共形
質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、
完全な野生株を共感染(co−infection)に
用いることが可能である。HVTのFc−126株のT
K遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられ
る制限酵素は、BanII、Bsp1286、DraI
II、EcoRI、HincII、HpaI、NheI
およびNspbIIおよびSphIである。これらの制
限酵素による切断(消化)部位は、TK遺伝子の発現を
妨害する外来DNAの挿入部位として用いられ、TK遺
伝子部分がこれらの酵素(またEcoKも利用可)の組
合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化さ
せる。これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクター
に消化部位をもち、このような部位にウイルスDNA断
片がクローン化される。よって、ベクターを切断するこ
となしにクローン化されたDNAを直線化するために制
限酵素による部分消化の手法が用いられよう。
【0022】前記した酵素群には、フランキング遺伝子
活性を阻害するようなものは含まれておらず、HSV−
1相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。
ウイールスの組換えは、「プラークリクフト(plaq
uelifts)」によって検知することが可能であ
る。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感
染細胞と、放出されたウイルスとをニトロセルロースに
移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞か
らの変性DNAと、ウイルスとをハイブリダイゼーショ
ンするもので、細胞のDNAはヴィラレアル5の文献
(Villareal,L.et al.Scienc
e 196,183−185,1977)に記載された
好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウイ
ルスは、単層培養回収できる。同様の方法が目的とする
エプトープを発現する組換えウイルスを単離することに
用いることが可能である。例えば、「プラークリフト」
に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、
つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロテイ
ンあのような適当な検知システムを用いることによっ
て、この結合した抗体の存在を検出することができる。
そして、アシクロビル(acyclovir)(前掲、
Ross,N.1985) (Schat,K.A.e
t.al.Antiviral Research4,
159−270,1984)またはFMAUを含む培地
で増殖させることによってTK−ウイルスを選別する。
適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン
化TK遺伝子(図45−55)に挿入する。次に、この
組換えDNAをひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎
臓細胞中にベクターの感染DNAと同時トランスフェク
ション(co−transfection)させる。こ
の戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子
を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大させる
ことである。また、最適な発現に適したプロモーターの
選択が可能となることである。よって、即時型プロモー
ターの利用は、潜伏性(latently)感染細胞に
おける発現を可能とする。(b)ベクターのgC遺伝子
座における挿入、A抗原CHSVのgC遺伝子HVTお
よびMDV相同遺伝子)は生体内(in vivo)お
よびガラス器内(in vitro)系(gCに関する
セッション参照)でのウイルス増殖にとって必須なもの
ではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現
のための好適な部位となるであろう。さらに、A抗原
は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるもの
であることから、外来タンパク質の免疫特性を強化する
ことに利用できる。 このA抗原遺伝子座におけるウ
イルス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも
一部がgC遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そし
て間宣誓ウイルスDNAとともに形質転換されることに
よって達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗
体によるウイルスプラークのスクリーニングは、組換え
体の単離を可能とする。
活性を阻害するようなものは含まれておらず、HSV−
1相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。
ウイールスの組換えは、「プラークリクフト(plaq
uelifts)」によって検知することが可能であ
る。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感
染細胞と、放出されたウイルスとをニトロセルロースに
移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞か
らの変性DNAと、ウイルスとをハイブリダイゼーショ
ンするもので、細胞のDNAはヴィラレアル5の文献
(Villareal,L.et al.Scienc
e 196,183−185,1977)に記載された
好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウイ
ルスは、単層培養回収できる。同様の方法が目的とする
エプトープを発現する組換えウイルスを単離することに
用いることが可能である。例えば、「プラークリフト」
に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、
つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロテイ
ンあのような適当な検知システムを用いることによっ
て、この結合した抗体の存在を検出することができる。
そして、アシクロビル(acyclovir)(前掲、
Ross,N.1985) (Schat,K.A.e
t.al.Antiviral Research4,
159−270,1984)またはFMAUを含む培地
で増殖させることによってTK−ウイルスを選別する。
適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン
化TK遺伝子(図45−55)に挿入する。次に、この
組換えDNAをひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎
臓細胞中にベクターの感染DNAと同時トランスフェク
ション(co−transfection)させる。こ
の戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子
を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大させる
ことである。また、最適な発現に適したプロモーターの
選択が可能となることである。よって、即時型プロモー
ターの利用は、潜伏性(latently)感染細胞に
おける発現を可能とする。(b)ベクターのgC遺伝子
座における挿入、A抗原CHSVのgC遺伝子HVTお
よびMDV相同遺伝子)は生体内(in vivo)お
よびガラス器内(in vitro)系(gCに関する
セッション参照)でのウイルス増殖にとって必須なもの
ではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現
のための好適な部位となるであろう。さらに、A抗原
は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるもの
であることから、外来タンパク質の免疫特性を強化する
ことに利用できる。 このA抗原遺伝子座におけるウ
イルス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも
一部がgC遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そし
て間宣誓ウイルスDNAとともに形質転換されることに
よって達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗
体によるウイルスプラークのスクリーニングは、組換え
体の単離を可能とする。
【0023】実施例6:HVTにおけるILTV遺伝子
とその相同遺伝子との置換 実施例5に示した方法によって、置換はクローン化され
たILTV配列と感染性HVT−DNAとの同時トラン
スフェクションによって達成される。ILTVから誘導
された遺伝子をHVTのそれに対応するものと置換する
ことが効果的であろう。ILTV配列とエピトープとを
発現する組換え体は、ILTV特異的モノクローン抗体
または、既に述べたユニークILTV配列に対する抗ペ
プチド抗体を用いることによって検出できる。この方法
の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、
相対的に単純な方法から成るということである。しか
し、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。
とその相同遺伝子との置換 実施例5に示した方法によって、置換はクローン化され
たILTV配列と感染性HVT−DNAとの同時トラン
スフェクションによって達成される。ILTVから誘導
された遺伝子をHVTのそれに対応するものと置換する
ことが効果的であろう。ILTV配列とエピトープとを
発現する組換え体は、ILTV特異的モノクローン抗体
または、既に述べたユニークILTV配列に対する抗ペ
プチド抗体を用いることによって検出できる。この方法
の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、
相対的に単純な方法から成るということである。しか
し、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。
【0024】実施例7:ILTVのTK−突然変異体を
得るための戦略欠失突然変異 欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能で
ある。例えば、ATPおよびCTP結合部位をリン酸化
するような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに
対してである。これは、制限酵素による二重消化(do
uble digestion)によって達成される。
ここで用いられる制限酵素は、SnaB1またはBc1
Iである。二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづ
いて、ウイルスDNAとの同時トランスフェクションま
たは、ウイルス感染細胞へのトランスフェクションを実
施する。制限酵素の選択などによる図45−55、図5
6およびプラスミドpILBgの地図(図67)を参照
してもらいたい。TK−ウイルスはアシクロビル(ac
uclovir)(前掲、Ross,N.1985)ま
たは、FMAU(前掲、Schat,K.a.et a
l.1984)の存在下よって、ハイブリダイゼーショ
ンによって、プラーク精製クーロンにおけるK遺伝子の
欠失う部位の不存在に関して調べた。ILTVの欠失う
突然変異対それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウイ
ルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺
伝子配列をもつものとして用いることが可能である。挿入突然変異 ヘルペスウイルスプロモーターまたは他の適当な配列な
たはシグナル塩基による調整下にある機能的β−ガラク
トリダーゼ遺伝子は、TK活性によって重要なTK遺伝
子のドメインにまず誘導される。そして、組換え体DN
Aは間宣誓ウイルスだNと共形質転換するか、もしくは
ウイルス感染細胞にトランスフェクションして、相同遺
伝子組換えをおこす。アセロビルまたはFMAU存在下
における選別はTK−挿入突然変異体を生じさせるであ
ろう。もし、β−ガラクトリダーゼが導入されたとした
ら、突然変異体はX−gal存在下で青い色のプラーク
が生じることによって検出される。必要に応じてTK遺
伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクロ
ーン化することができる。
得るための戦略欠失突然変異 欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能で
ある。例えば、ATPおよびCTP結合部位をリン酸化
するような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに
対してである。これは、制限酵素による二重消化(do
uble digestion)によって達成される。
ここで用いられる制限酵素は、SnaB1またはBc1
Iである。二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづ
いて、ウイルスDNAとの同時トランスフェクションま
たは、ウイルス感染細胞へのトランスフェクションを実
施する。制限酵素の選択などによる図45−55、図5
6およびプラスミドpILBgの地図(図67)を参照
してもらいたい。TK−ウイルスはアシクロビル(ac
uclovir)(前掲、Ross,N.1985)ま
たは、FMAU(前掲、Schat,K.a.et a
l.1984)の存在下よって、ハイブリダイゼーショ
ンによって、プラーク精製クーロンにおけるK遺伝子の
欠失う部位の不存在に関して調べた。ILTVの欠失う
突然変異対それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウイ
ルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺
伝子配列をもつものとして用いることが可能である。挿入突然変異 ヘルペスウイルスプロモーターまたは他の適当な配列な
たはシグナル塩基による調整下にある機能的β−ガラク
トリダーゼ遺伝子は、TK活性によって重要なTK遺伝
子のドメインにまず誘導される。そして、組換え体DN
Aは間宣誓ウイルスだNと共形質転換するか、もしくは
ウイルス感染細胞にトランスフェクションして、相同遺
伝子組換えをおこす。アセロビルまたはFMAU存在下
における選別はTK−挿入突然変異体を生じさせるであ
ろう。もし、β−ガラクトリダーゼが導入されたとした
ら、突然変異体はX−gal存在下で青い色のプラーク
が生じることによって検出される。必要に応じてTK遺
伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクロ
ーン化することができる。
【0025】実施例8:HVTへのMDVのRBIB株
に存在するgD遺伝子の挿入 (本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す) HVTのTK遺伝子をプラスミドベクターpUCBにフ
ロー化し、pTK1Bと呼ばれるプラスミドを作る。こ
のプラスミドを、例えばTK遺伝子のみをもつプラスミ
ドを切断する制限エンドヌクレアーゼRsrII(図2
9−38のヌクレオチド配置197,酵素認識部位(G
GACCG)によって直線化する。これによって、「粘
着性(sticky)」端末が生じ、この生じた端末を
通常の方法(参考文献:″Molecula rClo
ning:a Laborator yManua
l″,ed.Maniatis T.,Fritsch
E.F.,and Sambrook J.Cold
Spring HarborLaboratory,
1982)によつて修復する。RB1BのgB 遺伝子
を独自に2つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれ
RB1B−BamH1−I3およびRB1B−BamH
1−K3と命名した。一つのプラスミド上にある完全な
複製gB遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドを
BamH1で切断し、そして切断を連結(レゲーショ
ン)した。目的通りに作られた組換え体をプラスミドD
NAの制限酵素分析によって同定した。しかし、前記し
たように、完全なgB配列は実質的にEcoRI/Sa
lIで切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記の
ように合成されたPTK1Bにクローン化した。また、
MDVのgBオープンリーディングフレームは、Hin
cIIおよびNaeIによる消化によって、プラスミド
MSB27から切り出され、部分的にHpaIによって
切断されたHVTのTKプラスミドpTK1Bに連絡さ
れる。TKとgBの両配列を含む組換え体プラスミドは
ハイブリダイゼーションによって同定され、さらにサザ
ンブロットによって分析される。そして、組換え体プラ
スミドはHVTウイルス(ウイルスDNA)を含む細胞
に誘導され、TK遺伝子へgB遺伝子を誘導することに
ようる相同遺伝子組換えがおこなわれる。JVTウイル
ス組換え体はアシクロビルまたはFMAUによって選別
され、或は標識gBプローブによって検出される。
に存在するgD遺伝子の挿入 (本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す) HVTのTK遺伝子をプラスミドベクターpUCBにフ
ロー化し、pTK1Bと呼ばれるプラスミドを作る。こ
のプラスミドを、例えばTK遺伝子のみをもつプラスミ
ドを切断する制限エンドヌクレアーゼRsrII(図2
9−38のヌクレオチド配置197,酵素認識部位(G
GACCG)によって直線化する。これによって、「粘
着性(sticky)」端末が生じ、この生じた端末を
通常の方法(参考文献:″Molecula rClo
ning:a Laborator yManua
l″,ed.Maniatis T.,Fritsch
E.F.,and Sambrook J.Cold
Spring HarborLaboratory,
1982)によつて修復する。RB1BのgB 遺伝子
を独自に2つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれ
RB1B−BamH1−I3およびRB1B−BamH
1−K3と命名した。一つのプラスミド上にある完全な
複製gB遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドを
BamH1で切断し、そして切断を連結(レゲーショ
ン)した。目的通りに作られた組換え体をプラスミドD
NAの制限酵素分析によって同定した。しかし、前記し
たように、完全なgB配列は実質的にEcoRI/Sa
lIで切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記の
ように合成されたPTK1Bにクローン化した。また、
MDVのgBオープンリーディングフレームは、Hin
cIIおよびNaeIによる消化によって、プラスミド
MSB27から切り出され、部分的にHpaIによって
切断されたHVTのTKプラスミドpTK1Bに連絡さ
れる。TKとgBの両配列を含む組換え体プラスミドは
ハイブリダイゼーションによって同定され、さらにサザ
ンブロットによって分析される。そして、組換え体プラ
スミドはHVTウイルス(ウイルスDNA)を含む細胞
に誘導され、TK遺伝子へgB遺伝子を誘導することに
ようる相同遺伝子組換えがおこなわれる。JVTウイル
ス組換え体はアシクロビルまたはFMAUによって選別
され、或は標識gBプローブによって検出される。
【0026】実施例9:HVTに挿入されるRB1Bの
gC(CA抗原)遺伝子 末端が鈍くなった(blunt ended)PTK1
Bを実施例8に示されるようにして合成した。RB1B
のgC遺伝子を制限エンドヌクレマーゼEcoRIおよ
びHindIII(puC13ポリリンカーに含まれる
部位)によって、プラスミドpMB419(実施例4)
から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的
なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復さ
れたgC断片を実施例8に示したようにして直線化され
た末端修復pTK1Bにクローン化した(クローニング
は、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位
元素標識断片によるプロービング、またはDNAセーク
エンシング、または、これらの組合せによって変化に富
んだものである。) HVTの中にクローン化されたRB1BのgC遺伝子を
もつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱または
エレクトロポレーション(電気穿孔)によってHVT−
感染細胞にトランスフェクションさせた。gC遺伝子の
両端をクロスオーバー(cross−over)させた
HVTウイルスとHVTのTKプラスミドのフランキン
グ配列との間の相同遺伝子組換えは、RB1BのgC遺
伝子をHVTウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組換え体
は前記のようにして、TK−として選別され、またはプ
ロービングによって同定される。類似の方法として、既
に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺
伝子などをここで開示したILTVの非必須的ゲノムに
挿入するためのクローニング戦略を提供するために用い
られるものであり、またはILTV中の抗原遺伝子を作
るために利用される。
gC(CA抗原)遺伝子 末端が鈍くなった(blunt ended)PTK1
Bを実施例8に示されるようにして合成した。RB1B
のgC遺伝子を制限エンドヌクレマーゼEcoRIおよ
びHindIII(puC13ポリリンカーに含まれる
部位)によって、プラスミドpMB419(実施例4)
から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的
なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復さ
れたgC断片を実施例8に示したようにして直線化され
た末端修復pTK1Bにクローン化した(クローニング
は、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位
元素標識断片によるプロービング、またはDNAセーク
エンシング、または、これらの組合せによって変化に富
んだものである。) HVTの中にクローン化されたRB1BのgC遺伝子を
もつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱または
エレクトロポレーション(電気穿孔)によってHVT−
感染細胞にトランスフェクションさせた。gC遺伝子の
両端をクロスオーバー(cross−over)させた
HVTウイルスとHVTのTKプラスミドのフランキン
グ配列との間の相同遺伝子組換えは、RB1BのgC遺
伝子をHVTウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組換え体
は前記のようにして、TK−として選別され、またはプ
ロービングによって同定される。類似の方法として、既
に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺
伝子などをここで開示したILTVの非必須的ゲノムに
挿入するためのクローニング戦略を提供するために用い
られるものであり、またはILTV中の抗原遺伝子を作
るために利用される。
【0027】本発明は下記記載の各項目を含む。
【0028】[第1項]ヌクレオチド配列であって、前
記配列は前記配列と結合した野生株ウイルス内において
前記配列に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以
下のグループから選ばれることによって成り立つ: (a)HSVのgB遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(b)HSVのgC遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(c)HSVのgH遺伝子と相同なHVTの遺伝子、ま
たはその273−320または867−926の部分、
(d)ILTVのTK遺伝子、(e)HSVのgB遺伝
子と相同なILTVの遺伝子、(f)ILTVのORF
2、(g)ILTVのORF3、および(h)ILTV
のリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝
子、(i)HTVのリボヌクレオチド還元酵素(大サブ
ユニット)遺伝子、(j)MDVのリボヌクレオチド還
元酵素(小サブユニット)遺伝子、(k)MDVのリボ
ヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝子、
(l)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE−68と相同
なHVTの遺伝子、そして(m)HSV−Iの即時型初
期遺伝子IE−175と相同なHVTの遺伝子。 [第2項]第1項記載にもとづく配列であって、前記配
列は遺伝暗号部分と(または)、前記配列の少なくとも
5’もしくは3’側の非遺伝暗号部分とによって構成さ
ることを特徴とする。 [第3項]第1項または第2項(c配列を除く)記載に
もとづく配列と適当な宿主で複製可能なDNAとを含む
ことを特徴とするプラスミドベクター。 [第4項]第3項記載にもとづくプラスミドベクターで
あって、前記ベクターはMDV−、HVT−、またはI
LTV−感受性細胞に適当なベクターであることを特徴
とする。 [第5項]MDV、HVT、またはILTの挿入または
欠失突然変異体であって以下の特徴を有する:、 (i)HVTの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域
の突然変異またはTK遺伝子のリボヌクレオチド還元酵
素遺伝子の突然変異であり、(ii)MDVの場合、H
SVのgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌ
クレオチド還元酵素遺伝子(小サブユニット)の突然変
異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニ
ット)の突然変異であり、また(iii)ILTVの場
合、TK遺伝子、ORF3またはリボヌクレオチド還元
酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異である。 [第6項]第5項記載の突然変異体ウイルスであって、
非必須的部分の遺伝子は前記突然変異の領域に挿入まれ
ることを特徴とする。 [第7項]第6項記載の突然変異体ウイルスであって、
前記相同な遺伝子は抗原、またはHVT、MDV、IL
TV、IBV、IBD、ニューキャッスル病もしくはエ
イメリア(Eimeria)と結合した前記抗原の部分
をコードすることを特徴とする。 [第8項]第1項記載のHVTのgH遺伝子の部分のい
ずれか一つによってコードされたことを特徴とするペプ
チド。 [第9項]第5項記載にもとづく突然変異体を調製する
ための方法であって、前記方法は、(i)(a)前記領
域の欠失または挿入突然変異体コピーと、(b)MD
V、HVT、またはILTVから得られた全ウイルスD
NAまたは全HVT、MDVまたはILTVウイルスの
いずれか一方と相同遺伝子組換えを行なうこと、そして
(ii)組換え体ウイルスを単離することからなる。 [第10項]第11項記載の方法であって、前記(i)
において前記突然変異体コピーと、全ウイルスDNAま
たは全ウイルスのいずれか一方とを適当な細胞に導入す
るもので、また前記細胞内に取り込また前記DNAの複
製過程中に前記組換えが起こることを特徴とする。 [第11項]第5項記載にもとづく突然変異体ILTウ
イルスとILTV感受性細胞とを含むワクチンであっ
て、前記ウイルスは少なくとも前記突然変異の結果によ
り弱毒化されていることを特徴とする。 [第12項]第5項、第6項、または第7項記載にもと
づく突然体と、感受性細胞とを含み、MDV、HVT、
またはILTVに対して効果的であることを特徴とする
ワクチン。 [第13項]ILTV、HVT、またはMDに対して効
果的な種痘ベクターであって、前記ベクターは家禽内で
複製可能な微生物を含むもので、前記微生物は配列
(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(l)また
は(m)のいずれか一つまたは複数にもとづいた異種で
複製可能なDNAを含むILTVまたはHVTベクター
を有することを特徴とする。 [第14項]キャリアメジウムと第13項記載にもとづ
くベクターとからなることを特徴とするワクチン。 [第15項]第14項記載にもとづくワクチンであっ
て、前記キャリアメジウムはILTV−、HVT−、ま
たはMDV−感受性細胞を含むもので、また前記ベクタ
ーはILTV、HVT、またはMDVであることを特徴
とする。 [第16項]病気治療のための家禽への種痘方法であっ
て、前記方法は前記家禽に、第11項、第12項、第1
4項、および第15項のいずれか一項記載の非毒性免疫
量のワクチンを接種をすることを特徴とする。 [第17項]第16項記載にもとづく方法によって種痘
されたことを特徴とする家禽。
記配列は前記配列と結合した野生株ウイルス内において
前記配列に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以
下のグループから選ばれることによって成り立つ: (a)HSVのgB遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(b)HSVのgC遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(c)HSVのgH遺伝子と相同なHVTの遺伝子、ま
たはその273−320または867−926の部分、
(d)ILTVのTK遺伝子、(e)HSVのgB遺伝
子と相同なILTVの遺伝子、(f)ILTVのORF
2、(g)ILTVのORF3、および(h)ILTV
のリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝
子、(i)HTVのリボヌクレオチド還元酵素(大サブ
ユニット)遺伝子、(j)MDVのリボヌクレオチド還
元酵素(小サブユニット)遺伝子、(k)MDVのリボ
ヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝子、
(l)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE−68と相同
なHVTの遺伝子、そして(m)HSV−Iの即時型初
期遺伝子IE−175と相同なHVTの遺伝子。 [第2項]第1項記載にもとづく配列であって、前記配
列は遺伝暗号部分と(または)、前記配列の少なくとも
5’もしくは3’側の非遺伝暗号部分とによって構成さ
ることを特徴とする。 [第3項]第1項または第2項(c配列を除く)記載に
もとづく配列と適当な宿主で複製可能なDNAとを含む
ことを特徴とするプラスミドベクター。 [第4項]第3項記載にもとづくプラスミドベクターで
あって、前記ベクターはMDV−、HVT−、またはI
LTV−感受性細胞に適当なベクターであることを特徴
とする。 [第5項]MDV、HVT、またはILTの挿入または
欠失突然変異体であって以下の特徴を有する:、 (i)HVTの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域
の突然変異またはTK遺伝子のリボヌクレオチド還元酵
素遺伝子の突然変異であり、(ii)MDVの場合、H
SVのgC遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌ
クレオチド還元酵素遺伝子(小サブユニット)の突然変
異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子(大サブユニ
ット)の突然変異であり、また(iii)ILTVの場
合、TK遺伝子、ORF3またはリボヌクレオチド還元
酵素遺伝子(大サブユニット)の突然変異である。 [第6項]第5項記載の突然変異体ウイルスであって、
非必須的部分の遺伝子は前記突然変異の領域に挿入まれ
ることを特徴とする。 [第7項]第6項記載の突然変異体ウイルスであって、
前記相同な遺伝子は抗原、またはHVT、MDV、IL
TV、IBV、IBD、ニューキャッスル病もしくはエ
イメリア(Eimeria)と結合した前記抗原の部分
をコードすることを特徴とする。 [第8項]第1項記載のHVTのgH遺伝子の部分のい
ずれか一つによってコードされたことを特徴とするペプ
チド。 [第9項]第5項記載にもとづく突然変異体を調製する
ための方法であって、前記方法は、(i)(a)前記領
域の欠失または挿入突然変異体コピーと、(b)MD
V、HVT、またはILTVから得られた全ウイルスD
NAまたは全HVT、MDVまたはILTVウイルスの
いずれか一方と相同遺伝子組換えを行なうこと、そして
(ii)組換え体ウイルスを単離することからなる。 [第10項]第11項記載の方法であって、前記(i)
において前記突然変異体コピーと、全ウイルスDNAま
たは全ウイルスのいずれか一方とを適当な細胞に導入す
るもので、また前記細胞内に取り込また前記DNAの複
製過程中に前記組換えが起こることを特徴とする。 [第11項]第5項記載にもとづく突然変異体ILTウ
イルスとILTV感受性細胞とを含むワクチンであっ
て、前記ウイルスは少なくとも前記突然変異の結果によ
り弱毒化されていることを特徴とする。 [第12項]第5項、第6項、または第7項記載にもと
づく突然体と、感受性細胞とを含み、MDV、HVT、
またはILTVに対して効果的であることを特徴とする
ワクチン。 [第13項]ILTV、HVT、またはMDに対して効
果的な種痘ベクターであって、前記ベクターは家禽内で
複製可能な微生物を含むもので、前記微生物は配列
(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(l)また
は(m)のいずれか一つまたは複数にもとづいた異種で
複製可能なDNAを含むILTVまたはHVTベクター
を有することを特徴とする。 [第14項]キャリアメジウムと第13項記載にもとづ
くベクターとからなることを特徴とするワクチン。 [第15項]第14項記載にもとづくワクチンであっ
て、前記キャリアメジウムはILTV−、HVT−、ま
たはMDV−感受性細胞を含むもので、また前記ベクタ
ーはILTV、HVT、またはMDVであることを特徴
とする。 [第16項]病気治療のための家禽への種痘方法であっ
て、前記方法は前記家禽に、第11項、第12項、第1
4項、および第15項のいずれか一項記載の非毒性免疫
量のワクチンを接種をすることを特徴とする。 [第17項]第16項記載にもとづく方法によって種痘
されたことを特徴とする家禽。
【図1】BamH1部位の分布とgBおよびTK遺伝子
の位置を示すMDVの地図である。
の位置を示すMDVの地図である。
【図2】MDVのRB1B株に存在するgB遺伝子のヌ
クレオチド配列を示す図で、MDVの各ヌクレオチドに
添えられた番号が記されている。HVTのgB遺伝子に
該当する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引
かれている。相同性は垂直の棒によって示されている。
そして、MDVのgB遺伝子とHVTのgB遺伝子と間
のアミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。
クレオチド配列を示す図で、MDVの各ヌクレオチドに
添えられた番号が記されている。HVTのgB遺伝子に
該当する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引
かれている。相同性は垂直の棒によって示されている。
そして、MDVのgB遺伝子とHVTのgB遺伝子と間
のアミノ酸の違いは線の上の線によって示されている。
【図3】図2の続きである。
【図4】図3の続きである。
【図5】図4の続きである。
【図6】図5の続きである。
【図7】図6の続きである。
【図8】図7の続きである。
【図9】図8の続きである。
【図10】図9の続きである。
【図11】図10の続きである。
【図12】図11の続きである。
【図13】図12の続きである。
【図14】図13の続きである。
【図15】図14の続きである。
【図16】図15の続きである。
【図17】図16の続きである。
【図18】図17の続きである。
【図19】図18の続きである。
【図20】gH(破線)、TK(黒塗)および主キャプ
シドタンパク質(MCP、点)の各遺伝子の位置を示す
図で、またそれぞれのHindIII部位をHで表わし
ている。
シドタンパク質(MCP、点)の各遺伝子の位置を示す
図で、またそれぞれのHindIII部位をHで表わし
ている。
【図21】HVTのgH遺伝子に該当するヌクレオチド
配列のほぼ全体を示す図で、また、その配列に対応する
アミノ酸配列を線上に示した。
配列のほぼ全体を示す図で、また、その配列に対応する
アミノ酸配列を線上に示した。
【図22】図21の続きである。
【図23】図22の続きである。
【図24】図23の続きである。
【図25】図24の続きである。
【図26】図25の続きである。
【図27】図26の続きである。
【図28】図27の続きである。
【図29】HVTのTK遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図で、HVTの各ヌクレオチドに添えられた番号が記
されている。MDVのTK遺伝子に該当する部分のヌク
レオチド配列のところには下線が引かれている。相同性
は垂直の棒によって示されている。そして、MDVのT
K遺伝子とHVTのTK遺伝子との間のアミノ酸の違い
は線の上の線によって示される。
す図で、HVTの各ヌクレオチドに添えられた番号が記
されている。MDVのTK遺伝子に該当する部分のヌク
レオチド配列のところには下線が引かれている。相同性
は垂直の棒によって示されている。そして、MDVのT
K遺伝子とHVTのTK遺伝子との間のアミノ酸の違い
は線の上の線によって示される。
【図30】図29の続きである。
【図31】図30の続きである。
【図32】図31の続きである。
【図33】図32の続きである。
【図34】図33の続きである。
【図35】図34の続きである。
【図36】図35の続きである。
【図37】図36の続きである。
【図38】図37の続きである。
【図39】MDVのRBIB株に存在するgC遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す図で、またその配列に対応する
アミノ酸配列を線上に示した。
ヌクレオチド配列を示す図で、またその配列に対応する
アミノ酸配列を線上に示した。
【図40】図39の続きである。
【図41】図40の続きである。
【図42】図41の続きである。
【図43】図42の続きである。
【図44】図43の続きである。
【図45】TK遺伝子クラスターを含むILTVゲノム
の5400塩基対からなるヌクレオチドおよび予想され
るアミノ酸配列を示す図である。メインのオープンリー
ディングフレーム(ORF)産物のための予想されたア
ミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下にアルファベット
の頭文字で表した。このアミノ酸配列の上に位置するヌ
クレオチド配列がそれぞれのアミノ酸に対応するコドン
を示している。また、TATAボックスの位置は下線で
示した。OFR4はILTのTK遺伝子配列である。
の5400塩基対からなるヌクレオチドおよび予想され
るアミノ酸配列を示す図である。メインのオープンリー
ディングフレーム(ORF)産物のための予想されたア
ミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下にアルファベット
の頭文字で表した。このアミノ酸配列の上に位置するヌ
クレオチド配列がそれぞれのアミノ酸に対応するコドン
を示している。また、TATAボックスの位置は下線で
示した。OFR4はILTのTK遺伝子配列である。
【図46】図45の続きである。
【図47】図46の続きである。
【図48】図47の続きである。
【図49】図48の続きである。
【図50】図49の続きである。
【図51】図50の続きである。
【図52】図51の続きである。
【図53】図52の続きである。
【図54】図53の続きである。
【図55】図54の続きである。
【図56】LTVのTK含有部分における遺伝子の配列
を示す図である。ILTVDNAを生じさせるEcoR
1(pILEc1)およびBa1II(pILBg2)
部位を含み、かつオーバーラップされたpUC13プラ
スミドクローンが示されている。オープンリーディング
フレーム(ORF)は矢印によって示された転写方向を
持つオープンボックスとして示される。
を示す図である。ILTVDNAを生じさせるEcoR
1(pILEc1)およびBa1II(pILBg2)
部位を含み、かつオーバーラップされたpUC13プラ
スミドクローンが示されている。オープンリーディング
フレーム(ORF)は矢印によって示された転写方向を
持つオープンボックスとして示される。
【図57】ILTVのgB遺伝子のヌクレオチド配列の
部分を示す図である。
部分を示す図である。
【図58】ILTVのリボヌクレオチド還元酵素(大サ
ブユニット)の相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を
示す図である。
ブユニット)の相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を
示す図である。
【図59】VZV62/HSV−1のIE−175遺伝
子のHTV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す
図である。
子のHTV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す
図である。
【図60】リボヌクレオチド還元酵素(大サブユニッ
ト)のHTV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
ト)のHTV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
【図61】リボヌクレオチド還元酵素(大サブユニッ
ト)のMDV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
ト)のMDV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
【図62】図61の続きである。
【図63】リボヌクレオチド還元酵素(小サブユニッ
ト)のMDV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
ト)のMDV相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す図である。
【図64】HSV−1のIE−175遺伝子のMDV相
同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す図である。
同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す図である。
【図65】HSV−1のIE−68遺伝子のMDV相同
遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す図である。
遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す図である。
【図66】ウィルスゲノムの非必須領域と、プラスミド
ベクターにクローン化されたDNAの相同領域との相同
遺伝子組換えを示す図である。
ベクターにクローン化されたDNAの相同領域との相同
遺伝子組換えを示す図である。
【図67】プラスミドpILBg2の地図である。この
地図は制限部位とTK遺伝子、OFR3およびOFR5
の位置を示している。
地図は制限部位とTK遺伝子、OFR3およびOFR5
の位置を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 31/12 A61P 31/12 37/04 37/04 (72)発明者 ロッス,ルイース ジョセフ ノーマン イギリス国 PE17 2DA ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー (番地なし) インスティチュート フォ ア アニマル ヘルス リミテッド内 (72)発明者 スコット,サイモン デビッド イギリス国 PE17 2DA ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー (番地なし) インステイチュート フォ ア アニマル ヘルス リミテッド内 (72)発明者 ビンズ,マシュー マッキンリー イギリス国 PE17 2DA ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー (番地なし) インスティチュート フォ ア アニマル ヘルス リミテッド内
Claims (1)
- 【請求項1】ヌクレオチド配列であって、前記配列は前
記配列と結合した野生株ウイルス内において前記配列に
隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグルー
プから選ばれることによって成り立つ: (a)HSVのgB遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(b)HSVのgC遺伝子と相同なHVTの遺伝子、
(c)HSVのgH遺伝子と相同なHVTの遺伝子、ま
たはその273−320または867−926の部分、
(d)ILTVのTK遺伝子、(e)HSVのgB遺伝
子と相同なILTVの遺伝子、(f)ILTVのORF
2、(g)ILTVのORF3、および(h)ILTV
のリボヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝
子、(i)HTVのリボヌクレオチド還元酵素(大サブ
ユニット)遺伝子、(j)MDVのリボヌクレオチド還
元酵素(小サブユニット)遺伝子、(k)MDVのリボ
ヌクレオチド還元酵素(大サブユニット)遺伝子、
(l)HSV−Iの即時型初期遺伝子IE−68と相同
なHVTの遺伝子、そして(m)HSV−Iの即時型初
期遺伝子IE−175と相同なHVTの遺伝子。
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