JP3292371B2 - ウイルスのヌクレオチド配列 - Google Patents

ウイルスのヌクレオチド配列

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウイルスのヌクレオチド配列に関するもの
で、病気に対する免疫性を付与するワクチンに関連した
ウイルスのヌクレオチド配列を提供することを目的とす
る。
従来技術 ヘルペスウイルスは、大きな二重鎖DNAウイルスで、
エンベロープによって囲まれた20面体カプシドからな
る。このウイルスは、生物学的特性とゲノム構造とにも
とづいてアルファ、ベータ、およびガンマヘルペスウイ
ルスに分類される［Roizman,B et al.（1981）Inter−v
irology 18,201−217］。トリヘルペスウイルスには、
鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を引き
起こすマレック病ウイルス（MDV）（ガンマヘルペスウ
イルス）［総説:Payne,L.N.（ed）Marek's Disease（19
85）,Martinus Nijhoff Publishing,Boston］と、鶏の
呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を引き起こ
す感染性咽頭気管炎ウイルス（ILTV）（アルファウイル
ス）とが含まれる。
最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保
護された遺伝子を同定することを可能とするような、MD
V、ILTVおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性
口内炎ウイルス（VZV）および単純ヘルペスウイルス（H
SV）との間における顕著なアミノ酸配列の相同性（ホモ
ロジー）が発見された。これらには、HSVの糖タンパク
質、gB、gCおよびgHに相同なMDVおよび七面鳥ヘルペス
ウイルス（HVT）のアミノ酸配列、TKおよびリボ核酸還
元酵素遺伝子に相同なILTV、MDVおよびHVTのアミノ酸配
列、そしてgBおよびVZVの遺伝子34および35に相同なILT
Vのアミノ酸配列も含まれる［Backmaster,A et al.（19
88）J.gen.Virol,89,2033−2042］。
MDVの株は３つの血清型に分類されている。１型は病
原性の株とその弱毒株、２型は天然の非病原性株、そし
て３型はHVTが含まれる。10年以上前から、HVTによる種
痘がマレック病に対して顕著な有効性を示すことが知ら
れている。しかし最近になって、HVTによる種痘に対し
て抵抗性を示すMDVが単離されている。このようなウイ
ルス毒性が非常に高いMDVによる鶏の損失は、米国、ヨ
ーロッパおよび中東の地域において発生している。しか
し、HVT、２型MDVおよびMDV高ウイルス毒性株を弱毒化
して得た株からなる混合物を用いることによって、その
ような損失を確実ではないが減少させることが可能であ
る。このような知見、すなわちHVTまたは２型MDVによっ
て共有されないMDV型特異的エピトープが存在するとい
うことは、われわれに抗原的には従来のワクチンよりも
MDVに関係した改良型ワクチンを作ることが可能である
ことを結論させた。［総説:Ross and Biggs in Goldman
J.M.and Epstein M.A.（eds）Leukaemia and Lymphoma
Research,Vaccine Intervention against Virus−Indu
ced Tumour,p13−31,Macmillan,1986］ いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニ
アウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えること
が示される。これらには、HSVのgB［Cantin E.M.et al.
（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,5908−5912］、
HSVのgD［Paoletti,E.et al.（1984）Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.81,193−197］および偽狂犬病ウイルス（PR
V）のgP50、HSVのgDの相同タンパク質（homologue）［M
archioli,C.C.et al.（1987）J.Virol.61.3977−3981］
が含まれる。なぜなら、ウイルスの貫通および感染力に
gBが必須であること、またヘルペスウイルス間で保存さ
れているgBとその相同タンパク質は重要な免疫源である
からである。さらに、感染細胞の表層にgBが存在するこ
とは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重
要な標的となる［Blacklaws,B.A.et al.J.gen.Virol.6
8,1103−1114（1987）;McLaughlin−Taylor,E.et al.
（1988）J.gen.Virol.69,1731−1734］。最近になって
報告されたHSVの糖タンパク質gHもまた感染力にとって
必須なものであり、また重要な免疫源でもある［Desal,
P.J.et al.（1988）J.gen.Virol.69,1147−1156］。ま
た、gCの相同タンパク質であるPRVのgIIIも中和抗体の
主標的および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要である
が、かならずしも必須のタンパク質ではないことが知ら
れている。しかし興味深いことは、サイトメガロウイル
ス（CMV）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞毒
性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出
現である［Kozinowski U.H.et al.（1987）J.Virol.61.
2054−2058］。同様な抗原は、マレック病における潜伏
感染リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重
要な役割を担うことができよう。なぜなら、マレック病
の腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即
時型初期RNA転写産物が検出されるからである。
また、ポックスウイルスワクシニアをベクターとして
用いて作られた多くの組換えワクチンが報告されてお
り、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイルスをベ
クターとして用いた場合も報告されている。よって、肝
炎抗原はHSVで発現されている［Shih,M.F.et al.（198
4）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,5867−5870］。また
ヒト組織プラズミノーゲン活性因子はPRVで発現されて
いる［Thomsen,D.R.et al.（1987）Gene 57,261−26
5］。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘル
ペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝子
組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。肝炎
ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに融
合され、また組換えDNAはHSVのTK遺伝子に挿入される。
組換えDNAと野生型HSVDNAとの同時トランスフェクショ
ンにつづく相同遺伝子組換えによって肝炎抗原を発現す
るTK−ウイルスが得られる。
PRVの場合、UsにマッピングされたgX遺伝子を外来遺
伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略
は、HSVのTK遺伝子をTK欠失PRV突然変異体（TK陽性ウイ
ルス）に挿入することを含むものである。そして、プラ
ズミノーゲン活性因子はHSVのTK遺伝子のクローン化断
片に挿入し、この組換え体を相同遺伝子組換えによって
PRVに導入する。TK−ウイルスを前記のヒト遺伝子を発
現するものとして選別する［前掲、Thomsen et al.］。
同様に、VZVをベクターとして使用する［Lowe et al.
（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,3896−3900］。
いくつかのヘルペスウイルス遺伝子も毒力（virulenc
e）に関連しており、またインビトロの系における増殖
に必須のものでないことが知られている。これらにはHS
VのTK遺伝子［Jamieson,A.T.et al.（1974）J.Gen.Viro
l.24,465−480;Field,H.and Wildy,P.,（1987）J.Hygie
ne（Cambridge）81,267−277］およびPRVのTK遺伝子が
含まれる。実際、PRVはTK活性の欠失によって容易に減
少される［Tatarov,G.（1968）Zentralbl. Vet.Met.Med 15B,848−853］。さらに、PRVのバルサ（B
artha）株の減少はUsにマッピングされた非必須的糖タ
ンパク質glの欠失にもとづく［Mettenleiter,T.et al.
（1987）J.Virol.61,4030−4032］。
長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し領域（TR
S）に存在するHSVマッピングの遺伝子は、病原性に関係
している［Rosen,A.et al.（1986）Virus Research 5,1
57−175;Thompson,R.L.e al.（1983）Virology 131,180
−192］。HSVのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロ
の系における増殖には非必須であるが、毒力に関係して
いると報告されている。これらには、UL24（Sanders,P.
G.,（1982）,J.gen.Virol.63,277−295）、リボ核酸還
元酵素の大サブユニット（Godstein D.J.and Weller,S.
K.（1988）J.Virol.62,196−205）、gC（Draper K.G.e
t.al.（1984）J.Virol.51,578−585）、dUTPアーゼ（Fi
sher,F.B.and Preston,V.G.（1986）Virology 148,190
−197）、そしてＵＬ55およびＵＬ56（MacLean,A.R.and
Brown,S.M.（1987）J.gen.Virol.68,1339−1350）が含
まれる。さらに、UsにおけるHSVマッピングのいくつか
の遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に非必須で
ある［Weber,P.C.et al.（1987）Science 236,576−57
9］。
本発明の概要 本発明は、ひとつのヌクレオチド配列を提供するもの
であり、このヌクレオチド配列に関連した野生型ウイル
ス内において前記ヌクレオチド配列に結合して存在する
他の配列から遊離したもので、このヌクレオチド配列
は、 （ａ）HSVのgB遺伝子のMVT相同遺伝子、 （ｂ）HSVのgC遺伝子のHVT相同遺伝子、 （ｃ）MSVのgH遺伝子のHVT相同遺伝子、 （ｄ）ILTVのTK遺伝子、 （ｅ）HSVのgB遺伝子のILTV相同遺伝子、 （ｆ）ILTVのORF2、 （ｇ）ILTVのORF3、 （ｈ）ILTVのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニッ
ト）、 （ｉ）HVTのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニッ
ト）、 （ｊ）MDVのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニッ
ト）、 （ｌ）HSV−Ｉの即時型初期遺伝子IE175のHVT相同遺伝
子、 （ｍ）HSV−Ｉの即時型初期遺伝子IE68のHVT相同遺伝
子、 そしてそれらの配列にマイナーな変異が生じたマイナー
変異配列である。
前記（ａ）から（ｍ）に記載されたそれぞれの配列
は、それぞれの配列を発現させるのに必要な停止および
開始シグナルおよびプロモーターを含む他の5'および3'
非遺伝暗号配列（ノンコーデイング配列）と結合したも
のであろう。そのような付加された配列はいわゆる自然
発生的なものか、あるいは非対応ものであろう。
特に、プロモーターは前記（ｌ）および（ｍ）のひと
つと結合しているであろう。
前記した「マイナー変異配列」という言葉の意味は、
その配列が本来コードしている遺伝子発現産物そのもの
のあるべき姿を損なうことがないようなヌクレオチド配
列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドのマイナー
置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コード）するため
にベクターに挿入される配列の場合、配列にとって必須
なこととは配列がタンパク質または糖タンパク質をコー
ドしていることを意味する。その抗原の持つ抗原性に悪
影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配列の保存的な
置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるような配列
内における保守的変化（conservative changes）はこの
ようなマイナー変異に含まれるものであろう。特に、抗
原をコードする配列のなかで、抗原タンパク質そのもの
をコードする部分のみが使用される。そのような部分と
は、例えば、HVTのgH遺伝子に相当するヌクレオチド配
列の273−320または867−926およびそれらのマイナー変
異に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれ
らの配列およびこれらの配列によりコードされるペプチ
ドによってなされる。挿入部位に相当する配列の場合、
ウイウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的
なものではなく、また組換えを可能とするような配列と
相同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列へ
の特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所か
ら下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させ
るものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合で
は、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ず
ることを意味する（フレームシフトがどこに生ずるかに
依存する）が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほと
んど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろ
う。
挿入部位においてヌクレオチドの相同性が75％存在し
た場合、通常その配列はマイナー変異と見なされるが、
少なくとも80、85、90、95または99％の相同性があるこ
とが好ましい。このような相同性（homology）の度合い
は上記の配列（ａ）ないし（ｆ）および（ｘ）のそれぞ
れの全体に実質的に関係している。短い配列は、このよ
うな長い配列を単離または同定するためのプローブとし
て用いられるが、この場合は正確なハイブリダイゼーシ
ョンを行なわせるために高い相同性が必要とされる。
よって、本発明はさらに上記配列（ａ）ないし（ｍ）
のいずれかの少なくとも一部分に対して90％（好ましく
は95％、99％または100％）の相同性を有する少なくと
も13のヌクレオチド副配列を提供するものである。
上記したように、配列（ａ）ないし（ｃ）、（ｅ）、
（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）は抗原発現配列として好適
であり、またMDVのTK領域配列は抗原発現遺伝子の挿入
のための非必須的部位部位として好適である。よって、
配列（ｂ）は両方の機能に好適である。
これらの配列は、ここで開示された配列情報と、例え
ばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型のDN
Aとそのプローブとのハイブリダイゼーションとを含む
標準的技術を用いることによって自然発生的な（natura
lly−occurring）のILTV、HVTおよびMDVウイルスから容
易に単離可能である。
抗原ILTVおよびHVT配列、すなわち配列（ａ）から
（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）は、適当
な宿主、特にHVTまたはMDV内において現される。ひとつ
のILTV配列の挿入のための好適な非必須部位はHSVのgC
遺伝子のMSV相同遺伝子、HVTまたはMDVのTK遺伝子、HVT
またはMDVリホヌクレオチド還元酵素（大サブユニッ
ト）遺伝子、およびMDVのリボヌクレオチド還元酵素
（小サブユニット）遺伝子を含む。
第二に本発明は、MDV、HVTおよびILTVの挿入または欠
失突然変異を提供するものである。すなわち、 （ｉ）HVTの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域の突然変
異またはTK遺伝子のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の
突然変異であり、 （ii）MDVの場合、HSVのgC遺伝子に相同な領域の突然変
異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニ
ット）の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝
子（大サブユニット）の突然変異であり、 （iii）ILTVの場合、TK遺伝子、ORF3またはリボヌクレ
オチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異で
ある。
これらの突然変異は同定された領域の遺伝子コード配
列または遺伝子非コード領域にあると考えられる。
HVT、MD Ｖ、およびILTVのそれぞれの突然変異体
は、鳥禽（ベクターが複製される）類のなかで遺伝子発
現されることが望まれる他の配列からなるベクターと同
様に、非対応抗原コード配列（hetelogous antigen−en
coding sequences）のためのウイルスベクターとして利
用できるであろう。このような配列として、もちろんこ
れらに限定されるものではないが、（ａ）ないし
（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）が含まれ
る。
非対応（heterologous）という言葉は、ここではウイ
ルスゲノムに関係した場所に見出されていない抗原発現
配列（antigen−expressing gene）を意味している。す
なわち、抗原発現遺伝子はILTVの病原性株から単離可能
で、これよりも病原性の低い株のTK領域に挿入れると考
えれる。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起
こらない場合、非対応と見なされる。
また非対応配列は、鳥脳脊髄炎（流行性振せん）、鳥
インフルエンザ（鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャ
ッスル病（PMV2ないしPMV7）以外の鳥パラマイキソバイ
ラス（avian paramyxoiruses）、鳥レオウイルス病（腸
の病気、腱しょう炎）、ニワトリ貧血（ニワトリ貧血剤
によって起こる）、胞子虫症、エッグドロップ症候群
（EDS76）、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、感染性粘
液嚢症（グンボロ（Gumboro））、封入体肝炎（アデノ
ウイルス）、七面鳥リンパ増殖性疾患（lymphoprolifer
ative disease）、ニューキャッスル病、ニワトリの細
網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス
腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎（rhinotrach
eitis）のいずれか一つの疾患に関係した抗原をコード
するものである。
よって、本発明にもとづくベクターは多価ワクチンに
よる保護を可能とする。例えば、MDV抗原の遺伝暗号配
列（コード配列）を持つILTVを含むワクチンは、ITLお
よびマーク病からワクチンを接種された生物を保護す
る。
さらに、突然変異ILTVウイルスそれ自体は、弱毒化さ
れたウイルスとしてワクチンに利用される潜在的可能性
があり、また挿入された非対応配列を持つ必要性はな
い。
本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の調製の
簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばTK領域の同時ト
ランスフェクション（co−transfection）、欠失または
挿入変異されたものと全ウイルスDNAまたは全ウイルス
（例えば野生型（wild type）のウイルス）を導入する
ことである。そのようなウイルスのむき出しとなったDN
Aが感染性を有することはすでに知られており、切断し
ないで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によって
DNAを調製するのが好ましい。この方法に用いられる適
当な細胞とは、ニワトリ胚繊維芽細胞（embryo fibrobl
ast）、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞で
あり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団として
播種されることによって好適に増殖する。相同遺伝子組
換えによって形質転換DNAと全ウイルスDNAとを感染細胞
内で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリ
ーニングする。このスクリーニングは、例えば適当なプ
ローブによるハイブリダイゼーションか、あるいは問題
となっている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用
いた免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。
相同遺伝子組換えが行なわれるためには、ウイルスDN
Aは複製されなければならない。現在のところNDV、HV
T、またはILTVのための細胞フリーの複製系は知られて
いないが、もしそのような系が可能となったら、本発明
はそのような系で実施されよう。複製および組換えが行
なわれる環境は決定的なものではない。
免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコードすること
に関与したILTVおよびHVT領域は、適当なベクター（例
えばHVT、または伝染性上皮腫ウイルス、細菌また菌類
などのような他のベクター）に挿入される。ウイルスベ
クターの場合（特にヘルペスウイルスベクターおよび腸
炎ウイルスベクター）、抗原をコードしている配列（適
当な配列（フランキング配列）が両端にある）と、上記
した適当な宿主細胞内にあるベクターゲノムとの間にそ
のような挿入がなされる。
宿主にとって内在（endogenous）的なものであるプロ
モーターは、非対応（ウイルス抗原をコードする）配列
の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の
場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法
またはこれから発見されるであろう方法によって挿入さ
れよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主とし
て用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに
挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによ
って運ばれる。
フランキング配列は、非対応配列が挿入される少なか
らずすべての領域が含まれる。もし、すべての領域が用
いられるとしたら、その領域の配列は形質転換されたベ
クターに残るであろう。しかし、そのような領域には機
能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全部ではなく一
部をフランキング配列として用いた場合、機能的な欠失
と同様の構造的欠失が生ずるであろう。
よって、ITLVの欠失または挿入突然変異のそのような
構成は、ワクチンの改良につながる。一方、HVT、鳥類
伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組み込まれ
たILTVの糖タンパク質（glycoproteins）または他のILT
Vタンパク質の発現は、効果的なワクチンの製造を可能
とする。
ウイルスまたはベクターとしてHVT、MDVまたはILTVを
含むワクチンを合成するするために、ウイルスをニワト
リ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。こ
の場合に用いる培地は199培地（ウエルカムまたはフロ
ーラボラトリーズ）のような標準的な培養液を使用し、
この培養液で37℃、３ないし４日間増殖させる。つぎ
に、細胞をトリプシン処理し、10％ジメチルスルホキシ
ドと４％牛血清を含む培養液に懸濁する。その後、細胞
をアンプルに入れて密閉し、そのアンプルを液体窒素保
存する。
通常、予防接種（ワクチン投与）は生後１日経過した
ニワトリのひよこに対しておこなわれ、約1,000プラー
ク形成単位を筋肉注射することによってワクチン投与が
実施される。この後、数日で免疫ができる。
本発明にもとづくワクチンは、HDVに感染しやすい鳥
（fowl）、例えば商業的に利用される鶏、七面鳥、あひ
る、がちょうなどの家禽類を保護するために用いられる
ものである。
以下、本発明の好適な実施態様を添付した図を参照し
ながら実施例にもとづいて説明する。
第１図は、BamH1部位の分布とgBおよびTK遺伝子の位
置を示すMDVの地図である。
第２図は、MDVのRB1B株に存在するgB遺伝子のヌクレ
オチド配列を示すもので、MDVの各ヌクレオチドに添え
られた番号が記されている。HVTのgB遺伝子に該当する
部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれてい
る。相同性は垂直の棒によって示されている。そして、
MDVのgB遺伝子とHVTのgB遺伝子と間のアミノ酸の違いは
線の上の線によって示されている。
第３図は、gH（破線）、TK（黒塗）および主キャプシ
ドタンパク質（MCP、点）の各遺伝子の位置を示すもの
で、またそれぞれのHind III部位をＨで表わしている。
第４図は、HVTのgH遺伝子に該当するヌクレオチド配
列のほぼ全体を示すもので、またその配列に対応するア
ミノ酸配列を線上に示した。
第５図は、HVTのTK遺伝子のヌクレオチド配列を示す
もので、HVTの各ヌクレオチドに添えられた番号が記さ
れている。MDVのTK遺伝子に該当する部分のヌクレオチ
ド配列のところには下線が引かれている。相同性は垂直
の棒によって示されている。そして、MDVのTK遺伝子とH
VTのTK遺伝子と間のアミノ酸の違いは線の上の線によっ
て示されている。
第６図は、MDVのRBIB株に存在するgC遺伝子のヌクレ
オチド配列を示すもので、またその配列に対応するアミ
ノ酸配列を線上に示した。
第７図は、TK遺伝子クラスターを含むILTVゲノムの54
00塩基対からなるヌクレオチドおよび予想されるアミノ
酸配列を示すものである。メインのオープンリーデイン
グフレーム（ORF）産物のための予想されたアミノ酸配
列は、ヌクレオチド配列の下にアルファベットの頭文字
で表わした。このアミノ酸配列の上に位置するヌクレオ
チド配列がそれぞれのアミノ酸に対応するコドンを示し
ている。また、TATAボックスの位置は下線で示した。OR
F4はILTのTK遺伝子配列である。
第８図は、ILTVのTK含有部分における遺伝子の配置を
示すものである。ILTVDNAを生じさせるEcoR1（pILEc1）
およびBal II（pILBg2）部位を含み、かつオーバーラッ
プされたpUC13プラスミドクローンが示されている。オ
ープンリーデイングフレーム（ORF）は矢印によって示
された転写方向を持つオープンボックスとして示されて
いる。
第９図は、ILTVのgB遺伝子のヌクレオチド配列の部分
を示すものである。
第10図は、ILTVのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
ユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもの
である。
第11図は、VZV62/HSV−１のIE−175遺伝子のHVT相同
遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すものである。
第12図は、HVTのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
ユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもの
である。
第13図は、MDVのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
ユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示すもの
である。
第15図は、HSV−１のIE−175遺伝子のMDV相同遺伝子
のヌクレオチド配列の部分を示すものである。
第16図は、HSV−１のIE−68遺伝子のMDV相同遺伝子の
ヌクレオチド配列の部分を示すものである。
第17図は、ウイルスゲノムの非必須領域と、プラスミ
ドベクターにクローン化されたDNAの相同領域との相同
遺伝子組換えを示すものである。そして、 第18図は、プラスミドpILBg2の地図であり、この地図
は制限部位とTK遺伝子、ORF3およびORF5の位置とを示し
ている。
実施例：一般的アプローチ バクテリオファージベクターM13にクローン化された
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。
ウイルスの株NDVの高い癌誘発性（high oncogenic）
を有するRB1B株（Schat,K.A.et al.Avian Pathol.11,59
3−605,1982）を米国のコーネル大学B.カルネック（B.C
alnek）教授から入手した。このウイルスの精製は、ニ
ワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラークを形成さ
せることによって行なった。ニワトリSPFおよびRIR内で
２度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞（chick embryo fibro
blasts;CEF）内で４回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗
性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって
高い癌誘発性が示された。
ウエルカムリサーチ（Wellcome Research Laboratori
es,Beckenham,Kewnt）から得たHVTのFC126株（Witter,
R.L.et al.Am.J.Vet.Res.31,525−538、1970）を、CEF
内で14回継代した。つづいて我々の研究室においてアヒ
ル胚繊維芽細胞（DEF）およびCEF内で増殖させた。そし
て、プラーク精製を行ない、さらにCEF内で増殖させ
た。本実施例のクローニングに用いるウイルスDNAは元
の単離から数えて24回の継代がなされたウイルスから抽
出した。
組織培養CEFは199培養液（ウイエルカム社製）を含む
回転ボトル中において培養された。なお、この培養液に
は、ペニシルン、ストレプトマイシン、ファンジゾン
（Fugizone）（レグド．テイー．エム;Regd.T.M.）およ
び前記牛血清が添加されている（Ross,L.J.M.et al.J.g
en.Virol.28,37−47,1975）。
CKCは10cmペトリ皿中で培養した（Churchill,A.E.and
Biggs P.M.,Nature,215,528−530,1967）。
MDV−DNAの単離 RBIB感染細胞（cell associated RB
lB）を、回転ボトルのCEFからなる単層に、感染の程度
が一細胞あたり約0.001プラーク形成単位（pfu）となる
ようにして植つけて、37℃で培養した。培養３日目で、
培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換された新
しい培養液は、２％牛血清を含む199培養液である。そ
して、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分画から
ウイルスを単離した（Lee,Y.S.et al.J.gen.Virol.51,2
45−253,1980）。ウイルスDNAは、精製ウイルスをサル
コシル、プロテナーゼＫおよびトリス緩衝液でもって一
晩、37℃で処理し、それをグリセロール勾配でもってゾ
ーン遠心（前掲、Lee,Y.S.et al.）によって精製した。
高分子量のウイルスDNAをエタノールによって沈澱させ
た後、10mMのトリス/ImMのEDTAからなるTE緩衝液（pH7.
5）に懸濁した。
ILTV−DNAの単離 （ａ）感染CKCを採集し、播種後２〜３日経過したPBSで
洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこない、氷冷
TE感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活性剤である
NP40（最終濃度１％）を添加して攪拌し、氷うえで15分
間、インキュベートした。RNアーゼ処理後、試料を2000
r.p.m.5分間遠心した。
遠心後、上清を採り、SDS（最終濃度１％）およびプ
ロテナーゼＫ（最終濃度0.5mg/ml）を加えて37℃、30分
間、インキューベートした。この混合物を２図のフェノ
ール／クロロホルム処理、および１図のクロロホルム処
理をおこない、続いて、1/10容量の3M酢酸ナトリウムを
含むエタノール処理することによってDNAを沈澱させ
た。
（ｂ）また、ウイルスDNAを以下の方法によりウイルス
感染細胞の培養液化ら単離下。感染後２〜３日目のその
ウイルス感染細胞の培養駅を厚め、3000r.p.m.、５分
間、４℃の条件でベンチトップ遠心機により遠心処理し
た。遠心後、上清を再び19,000r.p.m.の回転数により超
遠心（ソーバル）を４℃、１時間の条件でおこなった。
この超遠心処理によって得られたウイルスペレットをTE
緩衝液に再懸濁し、RNアーゼンでRNAの消化をおこなっ
た。そして、既に述べたようにしてSDSおよびプロテア
ーゼＫ処理をおこなって、ウイルスをこわした。
最後に破壊されたウイルスから既に述べた方法により
DNAを抽出した。
MDV−DNAのクローニング １μｇのMDVを制限酵素Bam
H1によって切断し、これをジフォスフォリレートpUC13D
NAのBamH1制限部位に連結した。一方、使用する大腸菌
（E.coli）のTG1株細胞を標準的方法（Hanahan,D.J.Mo
l.Biol.166,557−580,1983）によって形質転換し、この
形質転換細胞をアンピリシンおよびＸ−gal存在下で培
養した。白いコロニーを採取し、ニックトランスレーシ
ョンされたMDV−DNAとの雑種形成（ハイブリ代是ーショ
ン）によってその存在またはMDV挿入部位について調べ
た（Crunstein M.and Hogness,D.S.Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.72,3961,1975）た。陽性コロニーを小量で培養
し、そしてホルムス（Holmes,D.S.）およびクイグレイ
（Quigley,M.）の方法（Holmes,D.S.and Quigley,M.,An
al.Biochem.114,193−297,1981）によってプラスミドDN
Aを単離した。挿入部位の大きさは、組換えDNAをBamH1
消化し、それをアガロース電気泳動することによって調
べた。その結果、１ないし18キロ塩基対（kbp）よりも
少ない塩基対からなるMDV挿入部位を有するプラスミド
が得られた。
ILTV−DNAのクローニング ILTV−DNAのEcoR1およびBg1 IIライブラリーを既に述
べたようなpUCBに含まれるウイルスDNAのクリーニング
消化（Cloning Digerts）によって得た。
ウイルスDNAのランダムシークエンシング ソニケー
ション処理したウイルスDNA断片をジフォスフォリレー
トM13.mp10（アマーシャムインターナショナルPLC）のS
ma I制限部位にクローン化し、MDV挿入部位を含むプラ
ークをNDV−DNAに対するハイブリダイゼーションによっ
て同定した。そして、その配列を35S−dATPを用いたジ
デオキシ方法（Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.7
4,5463−5467）によって同定した。
同様な方法をMDV−DNAのクローン化断片の配列決定に
用いた。この場合、プラークはpUC13含有コロニーを避
けるために標識された挿入部位とのハイブリダイゼーシ
ョンによって決定した。
実施例1:MDVのgB遺伝子 HVTのM13クローンは、MDVのBamH1断片I3とハイブリダ
イズされたHSVおよびVZVのgB遺伝子に対して相同性を示
す（第１図参照）。MDVのRB1株のBBamH1ライブラリーか
ら得たこの断片のシークエンシングが示すことによれ
ば、その遺伝子のNH3末端から始まる1/3の部分がI3を含
んでいた。この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断
片K3と同定された。第１図は、2.6kpの長さからなる遺
伝子の位置を示す地図である。その遺伝子から転写され
たmRNAの長さは2.6kpと推測される。翻訳されたタンパ
ク質の長さはアミノ酸、865個に相当した（第３図）。
これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約20のア
ミノ酸も含まれる。MDV−gB遺伝子の初期翻訳配列は他
のヘルペスウイルスのgB遺伝子と共通な部分、例えばシ
ステイン残基の列および脂質二重層を広げることが可能
な疎水性配列が存在する（Pellet,P.E.et al.J.Virol.5
3,243−253,1985）。しかし、MDVのgB遺伝子はHSVのgB
遺伝子とたった48％のアミノ酸配列の相同性しか認めら
れず、23個のアミノ酸（1851−1920残基、第２図）の挿
入およびグリコシレーションによるエクストラ部位の存
在など独特の姿を示す。HVTのgB（第２図）に該当する
限定された配列データ（702塩基）とMDVのgBの配列とを
比較すると、これら２つの糖タンパク質に関して76.9％
の核酸の相同性と87.1％のアミノ酸の相同性とが認めら
れた。MDVのgBと比較してHVTのgBにおけるアミノ酸置換
は、ウイルス中和に関連したHSVのgBのドメインと等価
な領域（1323−1433残基）に特に集中した（前掲、Pell
et P.E.et al.1985）。MDVおよびHVTのgB間におけるア
ミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集
中された。
実施例2:HVTのgH遺伝子およびMDVのgH遺伝子 HSVのgH遺伝子に相同な配列を含むHVTのM13クローン
は、遺伝子同定およびマッピングに関するわれわれの初
期の研究において同定された（前掲、Buckmaster et a
l.1988）。このクローンは、プローブとして用いた場
合、HVTの6kbからなるHind III断片とハイブリダイズ
（雑種形成）する（第３図）。シークエンス（配列決
定）によって、この断片がカルボキシ末端を含むおよそ
1/4のgH遺伝子を含むことが明らかになった。gH遺伝子
の残りの部分を有する隣接するHind III断片（3.2kb）
はHind III部位と重なり合うHVTのクローン化Hpa I断片
とハイブリダイゼーションされた。第４図は、HVTのgH
遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）とフランキング配
列とを示すものである。HVTのgH遺伝子と、HSV1、VZVお
よびEBVに含まれるその相同遺伝子との間におけるアミ
ノ酸の同一性（％）は、それぞれ20、24および20であっ
た（アミノ酸が最大重なり合った数630、644および153
からそれぞれ推定した）。
実施例3:HVTのTK遺伝子とMDVのTK遺伝子 HVTのTK遺伝子の全遺伝暗号領域（1053bp）は、前記
した3.2kbpからなるHind III断片を含むものである（第
３図）。遺伝子全体およびフランキング領域の配列は第
５図に示した。同様に、MDKのTK遺伝子はMDVの3.6kbpか
らなるBamH1K2断片を含むものである。MDKのTK遺伝子の
完全な配列を第14図に示した。MDVおよびHVTのTK配列の
比較空、２つの遺伝子は60％のアミノ酸の同一性を有す
ることがわかった。これとは対照的に、HVTのTK遺伝子
とHSV1、VZVおよびEBVのTK遺伝子間の同一性はそれぞれ
たったの30、27および24％であった（アミノ酸が最大重
なり合った数320、332および193からそれぞれ推定し
た）。HVTおよびMDVのTK遺伝子から予想されるアミノ酸
配列は、リン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび
真核生物のタンパク質のためのATPおよび（または）CTP
結合部位の特徴を示した（Gentry,G.A.Proc.Natl.Acad.
ASci.U.S.A.82,6815−6819）。これらの保守的な配列は
外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位とし
て、またTK−欠失突然変異体を産生するのに好適であ
る。
実施例4:MDV（gP57−65）（gC相同遺伝子）のＡ抗原遺
伝子 Ａ抗原遺伝子は、HSVの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードす
る）として、また非必須領域として用いられる。このＡ
抗原遺伝子は、MDVのBamH1B断片の中に置かれており（I
sfort et al.1987）、MDVのGA株に関してはヌクレオチ
ド配列が決定されている（Coussens and Velicer,Abstr
act OP18.51,VII International Congress of Virology
9−14 August,（1987）Edmonton,Canada;J.Virol.62,2
374−2379）。前記したランダムなシークエンス決定に
関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物である
M13クローン（No.130）を同定した。よって、このクロ
ーンをＡ抗原を含むMDVのRB1B株から得られた2.3KbpのE
coR1/Pvu II断片を同定するのに用いた。そして、この
断片を標準的な方法により、Sma I/EcoR1によって裂か
れたpUC13ベクターにクローン化した。MDVのRB1BのＡ抗
原の配列と予想されるアミノ酸配列とは第６図に示し
た。MDVおよびHVTのＡ抗原領域は非必須遺伝子であり、
よってMDVおよびHVT内の部位として好適であり、その中
に相同遺伝子組換えによって他の遺伝子が挿入されよ
う。このことはいくつかの証拠から支持される。それら
の証拠を以下に示す。
（１）われわれの研究において、他のRB1BのＡ抗原が単
離され、かつ配列決定された。これは3'からＡ抗原ATG
コドンまでのＴが45塩基つらなった（T's 45 bases 3'
to the A antigen ATG codon）余分な（エクストラ）Ｔ
残基を有する。このエクストロラＴは遺伝子に機能的な
Ａ抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレーム
シフト変異を引き起こす。この遺伝子は複製MDVからク
ローン化可能であるので、その結果Ａ抗原はウイルスに
とって非必須的なものであることになる。
（２）同様な研究から、MDVのＡ抗原はHSVのgCおよびPR
Vのgp III糖タンパク質と相同であることが明らかにな
った。これら２つの相同遺伝子は非必須的なものと考え
られている（HSV相対体にとって、ロセンタルらの文献:
Rosenthal et al.J.Virol.61,2438−2447を見よ。
（３）MDVの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ抗
原が欠如していると判定された株（churchill,A.E.et a
l.J.gen.Virol.4,557−564,1969）またはより感度の高
い２次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示
す株が報告されている（Van Zaane,D.et al.Virology 1
21,133−146）。
さらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａ
タンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場
所（location）であろう。これによって、Ａ抗原遺伝子
内にあるフレーム内のエピトープをコードしているオリ
ゴヌクレオチドをコードすることが可能であろう。
HVTおよびILTVベクターへ遺伝子を導入するための戦略 ２つの可能性がある、すなわち、 （１）ベクターの非必須的遺伝子への挿入、 （２）ベクターの該当する得電子との置換。
これは、MDVおよびHVTのいくつかの遺伝子間において
実質的に相同な領域においてのみ可能である。
実施例5:HVT,ILTVまたはMDVの非必須的遺伝子への挿入 （ａ）ベクターのTK遺伝子座への挿入 （１）HVT,ILTVまたはMDVは鳥ペルペスウイルスの遺伝
子の挿入および発現のためのベクターとして用いられる
ことが可能であろう。特にMDVのRB1B株のgB,gC,gHまた
はgCは、ILTVに挿入される。また、ILTVのgBおよびDS−
17はHVTまたはMDVに挿入される。これらは、挿入された
遺伝子と結合したプロモーター、非対応（heterologou
s）プロモーター、或はこれらの異なるクラスにある遺
伝子（例えば、gB遺伝子発現に好適な即時型初期プロモ
ーター）を用いるであろう。
（２）ILTVは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無関係
な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベクタ
ーとして利用可能であり、また、最適な発現のためのプ
ロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に用い
られる方法は、HSVへの肝炎抗原の挿入に関する既知の
方法（前掲、Shih et al.1984）に基づく。
既に述べた方法に因って得られたMDVおよびHVTのDNA
は、DNA抽出中にDNAの切断が起こらないような予防策を
講じることによって、間宣誓をそこなわず、DNAを保護
することができる。
ストウおよびウイルキーの方法（前掲、Stow ＆ Wilk
ie J.gen.Virol.33,477,1976）によって得られたウイル
スDNAのリン酸カルシウム沈澱物をCEFからなるサブコン
フルエント（sub−confluent）な単層に添加した。１時
間、37℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集
した状態（コンフルエントな状態）となるまで１〜２日
間培養した。コンフルエントな状態からなる199培地
（ウエルカム）と、前記培養駅の一部を置き換えた（1:
1または2:1）。そして、プラークが形成されるまで、37
℃で培養した。通常、このプラーク形成は４〜５日後に
見られるようになる。１μｇのHVT−DNAあたり、約200
のプラークが得られ、また１μｇのMDV−DNAあたり、約
50のプラークが得られるであろう。組換えウイルスの相
同遺伝子組換えおよび単離のために、目的とする遺伝子
を前記したような10:1ないし2:1のTKまたはgCおよび野
生型ウイルスと共形質転換したような非必須的遺伝子
へ、挿入する。或は、完全な野生株を共感染（co−infe
ction）に用いることが可能である。
HVTのFc−126株のTK遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入
することに用いられる制限酵素は、Ban II、Bsp1286、D
ra III、EcoR I、Hinc II、Hpa I、Nhe IおよびHspb II
およびSph Iである。これらの制限酵素による切断（消
化）部位は、TK遺伝子の発現を妨害する外来DNAの挿入
部位として用いられ、TK遺伝子部分がこれらの酵素（ま
たEcoKも利用可）の組合せによる二重消化によって取り
除かれて、不活性化させる。
これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消
化部位をもち、このような部位にウイルスDNA断片がク
ローン化される。よって、ベクターを切断することなし
にクローン化されたDNAを直線化するために制限酵素に
よる部分消化の手法が用いられよう。
前記した酵素群には、フランキング遺伝子活性を阻害
するようなものは含まれておらず、HSV−１相同遺伝子
がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。ウイルスの組
換えは、「プラークリクフト（plaquelifts）」によっ
て検知することが可能である。このプラークリフトは、
寒天培地にへばりついた感染細胞と、放出されたウイル
スとをニトロセルロースに移すことによって、そのニト
ロセルロース上で、細胞からの変性DNAと、ウイルスと
をハイブリダイゼーションするもので、細胞のDNAはヴ
ィラレアル５の文献（Villareal,L.et al.Science 196,
183−185,1977）に記載された好適なプローブとする。
プローブと雑種形成されたウイルスは、単層培養回収で
きる。
同様の方法が目的とするエプトープを発現する組換え
ウイルスを単離することに用いることが可能である。例
えば、「プラークリフト」に用いられるニトロセルロー
スに抗体処理をほどこし、つづいて結合したフォスファ
ターゼまたは標識プロテインあのような適当な検知シス
テムを用いることによって、この結合した抗体の存在を
検出することができる。そして、アシクロビル（acyclo
vir）（前掲、Ross,N.1985）（Schat,K.A.et.al.Antivi
ral Research 4,159−270,1984）またはFMAUを含む培地
で増殖させることによってTK−ウイルスを選別する。適
当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン化
TK遺伝子（代７図）に挿入する。次に、この組換えDNA
をひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎臓細胞中にベ
クターの感染DNAと同時トランスフェクション（co−tra
nsfection）させる。
この戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺
伝子を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大さ
せることである。また、最適な発現に適したプロモータ
ーの選択が可能となることである。よって、即時型プロ
モーターの利用は、潜伏性（latently）感染細胞におけ
る発現を可能とする。
（ｂ）ベクターのgC遺伝子座における挿入、Ａ抗原CHSV
のgC遺伝子HVTおよびMDV相同遺伝子）は生体内（in vi
vo）およびガラス器内（in vitro）系（gCに関するセ
ッション参照）でのウイルス増殖にとって必須なもので
はないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現の
ための好適な部位となるであろう。
さらに、Ａ抗原は、豊富にある抗原の一つであり、ま
た分泌されるものであることから、外来タンパク質の免
疫特性を強化することに利用できる。
このＡ抗原遺伝子座におけるウイルス組換え体の単離
は目的とする遺伝子の少なくとも一部がgC遺伝子にある
クレームにまず挿入され、そして間宣誓ウイルスDNAと
ともに形質転換されることによって達成される。配列特
異的プローブまたは特異的抗体によるウイルスプラーク
のスクリーニングは、組換え体の単離を可能とする。
実施例6:HVTにおけるILTV遺伝子とその相同遺伝子との
置換 実施例５に示した方法によって、置換はクローン化さ
れたILTV配列と感染性HVT−DNAとの同時トランスフェク
ションによって達成される。
ILTVから誘導された遺伝子をHVTのそれに対応するも
のと置換することが効果的であろう。
ILTV配列とエピトープとを発現する組換え体は、ILTV
特異的モノクローン抗体または、既に述べたユニークIL
TV配列に対する抗ペプチド抗体を用いることによって検
出できる。
この方法の利点は、プロモーターの操作を必要としな
いことと、相対的に単純な方法から成るということであ
る。しかし、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。
実施例7:ILTVのTK−突然変異体を得るための戦略欠失突
然変異 欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能
である。例えば、ATPおよびCTP結合部位をリン酸化する
ような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに対し
てである。これは、制限酵素による二重消化（double d
igestion）によって達成される。ここで用いられる制限
酵素は、SnaB1またはBc1 Iである。二重消化後、適当な
断片を再結合させ、つづいて、ウイルスDNAとの同時ト
ランスフェクションまたは、ウイルス感染細胞へのトラ
ンスフェクションを実施する。制限酵素の選択などによ
る第７図、第８図およびプラスミドpILBgの地図（第18
図）を参照してもらいたい。TK−ウイルスはアシクロビ
ル（acuclovir）（前掲、Ross,N.1985）または、FMAU
（前掲、Schat,K.a.et al.1984）の存在下よって、ハイ
ブリダイゼーションによって、プラーク精製クーロンに
おけるＫ遺伝子の欠失う部位の不存在に関して調べた。
ILTVの欠失う突然変異対それ自体をワクチン合成のた
めの弱毒化ウイルスとして用いること、また挿入された
ヘテロな抗原遺伝子配列をもつものとして用いることが
可能である。
挿入突然変異 ヘルペスウイルスプロモーターまたは他
の適当な配列なたはシグナル塩基による調整下にある機
能的β−ガラクトリダーゼ遺伝子は、TK活性によって重
要なTK遺伝子のドメインにまず誘導される。そして、組
換え体DNAは間宣誓ウイルスだＮと共形質転換するか、
もしくはウイルス感染細胞にトランスフェクションし
て、相同遺伝子組換えをおこす。アセロビルまたはFMAU
存在下における選別はTK−挿入突然変異体を生じさせる
であろう。もし、β−ガラクトリダーゼが導入されたと
したら、突然変異体はＸ−gal存在下で青い色のプラー
クが生じることによって検出される。
必要に応じてTK遺伝子とそれを囲む配列を他の適当な
ベクターにサブクローン化することができる。
実施例8:HVTへのMDVのRBIB株に存在するgD遺伝子の挿入 （本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す） HVTのTK遺伝子をプラスミドベクターpUCBにフロー化
し、pTK1Bと呼ばれるプラスミドを作る。このプラスミ
ドを、例えばTK遺伝子のみをもつプラスミドを切断する
制限エンドヌクレアーゼRsr II（第５図のヌクレオチド
配置197,酵素認識部位（GGACCG）によって直線化する。
これによって、「粘着性（sticky）」端末が生じ、この
生じた端末を通常の方法（参考文献：″Molecular Clon
ing:a Laboratory Manual″,ed.Maniatis T.,Fritsch
E.F.,and Sambrook J.Cold Spring Harbor Laboratory,
1982）によって修復する。
RB1BのgB 遺伝子を独自に２つのプラスミド上にクー
ロン化し、それぞれRB1B−BamH1−I3およびRB1B−BamH1
−K3と命名した。一つのプラスミド上にある完全な複製
gB遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドをBamH1
で切断し、そして切断を連結（レゲーション）した。目
的通りに作られた組換え体をプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。しかし、前記したように、完全
なgB配列は実質的にEcoR I/Sal Iで切断し、両端を修復
してそのプラスミドを前記のように合成されたPTK1Bに
クローン化した。また、MDVのgBオープンリーディング
フレームは、Hinc IIおよびNae Iによる消化によって、
プラスミドMSB27から切り出され、部分的にHpa Iによっ
て切断されたHVTのTKプラスミドpTK1Bに連絡される。TK
とgBの両配列を含む組換え体プラスミドはハイブリダイ
ゼーションによって同定され、さらにサザンブロットに
よって分析される。そして、組換え体プラスミドはHVT
ウイルス（ウイルスDNA）を含む細胞に誘導され、TK遺
伝子へgB遺伝子を誘導することにようる相同遺伝子組換
えがおこなわれる。JVTウイルス組換え体はアシクロビ
ルまたはFMAUによって選別され、或は標識gBプローブに
よって検出される。
実施例9:HVTに挿入されるRB1BのgC（CA抗原）遺伝子 末端が鈍くなった（blunt ended）PTK1Bを実施例８に
示されるようにして合成した。RB1BのgC遺伝子を制限エ
ンドヌクレマーゼEcoR IおよびHind III（puC13ポリリ
ンカーに含まれる部位）によって、プラスミドpMB419
（実施例４）から切断した。これによって生じた粘着性
末端を標準的なプロトコールに基づいて再び修復した。
末端を修復されたgC断片を実施例８に示したようにして
直線化された末端修復pTK1Bにクローン化した（クロー
ニングは、制限酵素による獲られるクローンの分析放射
性同位元素標識断片によるプロービング、またはDNAセ
ークエンシング、または、これらの組合せによって変化
に富んだものである。） HVTの中にクローン化されたRB1BのgC遺伝子をもつプ
ラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱またはエレク
トロポレーション（電気穿孔）によってHVT−感染細胞
にトランスフェクションさせた。gC遺伝子の両端をクロ
スオーバー（cross−over）させたHVTウイルスとHVTのT
Kプラスミドのフランキング配列との間の相同遺伝子組
換えは、RB1BのgC遺伝子をHVTウイルスゲノムへ運ぶ。
ウイルス組換え体は前記のようにして、TK−として選別
され、またはプロービングによって同定される。類似の
方法として、既に述べられ、かつ図に示された並列情報
は、それらの遺伝子などをここで開示したILTVの非必須
的ゲノムに挿入するためのクローニング戦略を提供する
ために用いられるものであり、またはILTV中の抗原遺伝
子を作るために利用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロッス，ルイース ジョセフ ノーマン イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー （番地なし） インスティチュー ト フォア アニマル ヘルス リミテ ッド内 (72)発明者 スコット，サイモン デビッド イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー （番地なし） インスティチュー ト フォア アニマル ヘルス リミテ ッド内 (72)発明者 ビンズ，マシュー マッキンリー イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティ ンドン ホートン ホートン ラボラト リー （番地なし） インスティチュー ト フォア アニマル ヘルス リミテ ッド内 (56)参考文献 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，Ｖｏｌ．28，Ｎｏ．８, （1984），Ｐ．923−933 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．１, （1985），Ｐ．243−253 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，Ｎｏ．16 （1987），Ｐ．5908−5912 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 - 7/08 A61K 39/00 - 39/44 C07K 1/00 - 19/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HVTヌクレオチド配列の下記の配列ａ、ｂ
    およびｃのヌクレオチド部分を含むHVTgB遺伝子をコー
    ドするDNA断片：
  2. 【請求項２】上記gB遺伝子配列と、その少なくとも5'お
    よび／または3'非遺伝暗号部分とを含む請求項１に記載
    のDNA断片。
  3. 【請求項３】請求項１または２に記載のDNA断片と、適
    当な宿主で複製を可能にするDNA部分とを有するプラス
    ミドベクター。
  4. 【請求項４】MDV−、HVT−またはILTV−感受性細胞のト
    ランスフェクションに適した請求項３に記載のプラスミ
    ドベクター。
  5. 【請求項５】請求項１または２に記載のDNA断片を含む
    ウイルス性ベクター。
  6. 【請求項６】ベクターとして使用するウイルスがMDVの
    抗原型１、２または３、ILTVまたはポックスウイルスで
    ある請求項５に記載のウイルス性ベクター。
  7. 【請求項７】ベクターとして使用するウイルスが鶏痘ウ
    イルスである請求項５に記載のウイルス性ベクター。
  8. 【請求項８】MDVのgC、リボヌクレオチド還元酵素（小
    サブユニット）またはリボヌクレオチド還元酵素（大サ
    ブユニット）に挿入された請求項１または２に記載のDN
    A断片を含むMDVウイルス。
  9. 【請求項９】ILTVのTK、ORF2、ORF3またはリボヌクレオ
    チド還元酵素（大サブユニット）に挿入された請求項１
    または２に記載のDNA断片を含むILTVウイルス。
  10. 【請求項１０】HVTのgC、リボヌクレオチド還元酵素
    （大サブユニット）またはTKに挿入された請求項１また
    は２に記載のDNA断片を含むHVTウイルス。
  11. 【請求項１１】請求項１または２に記載のDNA断片を含
    むポックスウイルス。
  12. 【請求項１２】請求項１または２に記載のDNA断片を含
    む鶏痘ウイルス。
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