JP2812759B2 - ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子 - Google Patents
ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、マラリアワクチン抗原をコードする遺伝子
に関する。より詳細には、本発明は、プラスモジウム・
ファルシパルム(Plasmodium falciparum)25kDaオーキ
ネート(ookinete)表面抗原をコードする遺伝子に関す
る。
に関する。より詳細には、本発明は、プラスモジウム・
ファルシパルム(Plasmodium falciparum)25kDaオーキ
ネート(ookinete)表面抗原をコードする遺伝子に関す
る。
従来技術 マラリアによる人類の大きな損失は今も続いている。
アフリカの村落では、1歳から4歳までの子供の全死亡
の約25%がマラリアによる。この死亡率は、局在する寄
生虫のクロロキンに対する感受性にもかかわらず続いて
いる。この場合、蚊の抑制は困難である。この死亡率を
低下させるための今日の最大の希望は、寄生虫の増殖を
抑止することによってこの病気の発生および死亡を少な
くする予防ワクチンである。ヒトマラリアの主たる原因
は、寄生虫プラスモジウム・ファルシバルムである。
アフリカの村落では、1歳から4歳までの子供の全死亡
の約25%がマラリアによる。この死亡率は、局在する寄
生虫のクロロキンに対する感受性にもかかわらず続いて
いる。この場合、蚊の抑制は困難である。この死亡率を
低下させるための今日の最大の希望は、寄生虫の増殖を
抑止することによってこの病気の発生および死亡を少な
くする予防ワクチンである。ヒトマラリアの主たる原因
は、寄生虫プラスモジウム・ファルシバルムである。
マラリアを攻撃する種々のワクチンの価値は、寄生虫
の生活環の理解を通して評価される。ヒトへの感染は、
幼若のマラリア寄生虫すなわち「スポロゾイト(sporoz
oite)」が蚊によってヒトの血流に注入された時に始ま
る。注入後、寄生虫は肝臓細胞に位置を占める。約1週
間後、寄生虫すなわち「メロゾイト(merozoite)」
は、血流に放出される。寄生虫の血流への流入によって
「赤血球」相が始まる。各寄生虫は、増殖成長するため
に赤血球に侵入する。赤血球細胞中でメロゾイトが成熟
した時、これはトロフォゾイト(trophozoite)および
シゾント(schizont)として知られている。シゾント
は、放出されて他の赤血球に侵入する個々のメロゾイト
を形成するために核分裂を起こしている状態をいう。数
回の分裂生殖(schizogonic)サイクルの後、寄生虫の
いくつかは、無性生殖でシゾントになるかわりに、大き
な単核の寄生虫に成長する。これらの寄生虫は有性的な
成長をする。
の生活環の理解を通して評価される。ヒトへの感染は、
幼若のマラリア寄生虫すなわち「スポロゾイト(sporoz
oite)」が蚊によってヒトの血流に注入された時に始ま
る。注入後、寄生虫は肝臓細胞に位置を占める。約1週
間後、寄生虫すなわち「メロゾイト(merozoite)」
は、血流に放出される。寄生虫の血流への流入によって
「赤血球」相が始まる。各寄生虫は、増殖成長するため
に赤血球に侵入する。赤血球細胞中でメロゾイトが成熟
した時、これはトロフォゾイト(trophozoite)および
シゾント(schizont)として知られている。シゾント
は、放出されて他の赤血球に侵入する個々のメロゾイト
を形成するために核分裂を起こしている状態をいう。数
回の分裂生殖(schizogonic)サイクルの後、寄生虫の
いくつかは、無性生殖でシゾントになるかわりに、大き
な単核の寄生虫に成長する。これらの寄生虫は有性的な
成長をする。
マラリア寄生虫の有性生殖には、雌性寄生虫すなわち
「マクロガメトサイト(macrogametocyte)」および雄
性寄生虫すなわち「ミクロガメトサイト(microgametoc
yte)」が関与する。これらガメトサイト(生殖母細
胞)は、ヒト体内ではこれ以上には発達しない。ガメト
サイトが蚊によって摂取されると、複雑な有性的サイク
ルが蚊の中腸で始まる。赤血球細胞は10〜20分後に蚊の
中腸で破壊される。ミクロガメトサイトは鞭毛放出をし
ながら発達を続けて、密なべん毛を有する8個の小配偶
子(microgamete)を放出する。授精が起きて、小配偶
子が大配偶子(macrogamate)に融合する。授精した寄
生虫は、「オーキネート(ookinete)」に発達する接合
子(zygote)として知られている。オーキネートは、蚊
の中腸壁に侵入して、接合子嚢(oocyst)に変体して、
この中で多数の小さいスポロゾイトを形成する。接合子
嚢が壊れると、スポロゾイトは、血リンパを介して蚊の
唾液腺へ移動する。一旦蚊の唾液に入ると、寄生虫は宿
主に注入され得る。
「マクロガメトサイト(macrogametocyte)」および雄
性寄生虫すなわち「ミクロガメトサイト(microgametoc
yte)」が関与する。これらガメトサイト(生殖母細
胞)は、ヒト体内ではこれ以上には発達しない。ガメト
サイトが蚊によって摂取されると、複雑な有性的サイク
ルが蚊の中腸で始まる。赤血球細胞は10〜20分後に蚊の
中腸で破壊される。ミクロガメトサイトは鞭毛放出をし
ながら発達を続けて、密なべん毛を有する8個の小配偶
子(microgamete)を放出する。授精が起きて、小配偶
子が大配偶子(macrogamate)に融合する。授精した寄
生虫は、「オーキネート(ookinete)」に発達する接合
子(zygote)として知られている。オーキネートは、蚊
の中腸壁に侵入して、接合子嚢(oocyst)に変体して、
この中で多数の小さいスポロゾイトを形成する。接合子
嚢が壊れると、スポロゾイトは、血リンパを介して蚊の
唾液腺へ移動する。一旦蚊の唾液に入ると、寄生虫は宿
主に注入され得る。
マラリアワクチンは、スポロゾイト、無性赤血球、お
よび有性期を含む寄生虫の生活環中の異なる期(stag
e)に対して、開発されてきた。各々の開発によって、
病気が起きる多様な状態におけるマラリアの抑制の可能
性が増えた。スポロゾイトワクチンは、蚊によって引き
起こされる感染を予防するであろう。このタイプの第一
世代のワクチンは、ヒトで試験された。無性赤血球ワク
チンは、病気の重篤性を軽減するのに有用であろう。複
数の候補抗原がクローニングされて、動物およびヒトで
試験された。
よび有性期を含む寄生虫の生活環中の異なる期(stag
e)に対して、開発されてきた。各々の開発によって、
病気が起きる多様な状態におけるマラリアの抑制の可能
性が増えた。スポロゾイトワクチンは、蚊によって引き
起こされる感染を予防するであろう。このタイプの第一
世代のワクチンは、ヒトで試験された。無性赤血球ワク
チンは、病気の重篤性を軽減するのに有用であろう。複
数の候補抗原がクローニングされて、動物およびヒトで
試験された。
有性期ワクチンは、有性期寄生虫を含む血液食に摂取
された時に、蚊による感染を防ぐ抗体を誘導するであろ
う。感染または病気を直接的に予防はしないが、スポロ
ゾイトまたは無性期ワクチンなどの予防ワクチンと組み
合わせた有性期のワクチンは、予防性組成分に抵抗性の
ワクチン誘導突然変異体の伝播の機会を低減するであろ
う。このようにして、予防性組成分の有用な寿命が延長
されよう。ある地理的領域では、有性期のワクチンは、
感染人口を維持するために必要な限界以下に伝播を低減
することができよう。この伝播の低減は、マラリアの抑
制または根絶を助けるために有用であろう。ここに参照
として引用する米国特許第4,632,909号明細書(Carter
およびMiller)は、マラリア寄生虫の配偶子または接合
子の表面に位置する一つまたはそれ以上のタンパク質に
結合する、有性期ワクチンをターゲットとする、モノク
ローナル抗体を開示している。これら抗体は、マラリア
寄生虫の蚊の中腸期の抗原に特異的で、蚊中の寄生虫に
よる病気の伝播を不可能にする。モノクロナール抗体
は、プラスモジウム・ファルシパルム上の255、59およ
び53Kの表面タンパク質およびプラスモヂウム・ガリナ
セルム(Plasmodium gallinacerum)の接合子およびオ
ーキネート上の25Kの表面タンパク質に特異的である。
この発明は、マラリア寄生虫の伝播を阻止する方法を含
む。その方法には、マラリア寄生虫配偶子の表面上の糖
タンパク質に特異的なマラリア寄生虫モノクローナル抗
体を有する蚊の飼養が含まれる。糖タンパク質は、分子
量24〜30Kである。方法は接合子において授精後約3時
間まで有効である。この発明は、マラリアに対する伝播
阻止免疫能を誘導するクローン遺伝子およびマラリアワ
クチンにおいて用いる遺伝子からの想定されるペプチド
のいずれにも関与しない。
された時に、蚊による感染を防ぐ抗体を誘導するであろ
う。感染または病気を直接的に予防はしないが、スポロ
ゾイトまたは無性期ワクチンなどの予防ワクチンと組み
合わせた有性期のワクチンは、予防性組成分に抵抗性の
ワクチン誘導突然変異体の伝播の機会を低減するであろ
う。このようにして、予防性組成分の有用な寿命が延長
されよう。ある地理的領域では、有性期のワクチンは、
感染人口を維持するために必要な限界以下に伝播を低減
することができよう。この伝播の低減は、マラリアの抑
制または根絶を助けるために有用であろう。ここに参照
として引用する米国特許第4,632,909号明細書(Carter
およびMiller)は、マラリア寄生虫の配偶子または接合
子の表面に位置する一つまたはそれ以上のタンパク質に
結合する、有性期ワクチンをターゲットとする、モノク
ローナル抗体を開示している。これら抗体は、マラリア
寄生虫の蚊の中腸期の抗原に特異的で、蚊中の寄生虫に
よる病気の伝播を不可能にする。モノクロナール抗体
は、プラスモジウム・ファルシパルム上の255、59およ
び53Kの表面タンパク質およびプラスモヂウム・ガリナ
セルム(Plasmodium gallinacerum)の接合子およびオ
ーキネート上の25Kの表面タンパク質に特異的である。
この発明は、マラリア寄生虫の伝播を阻止する方法を含
む。その方法には、マラリア寄生虫配偶子の表面上の糖
タンパク質に特異的なマラリア寄生虫モノクローナル抗
体を有する蚊の飼養が含まれる。糖タンパク質は、分子
量24〜30Kである。方法は接合子において授精後約3時
間まで有効である。この発明は、マラリアに対する伝播
阻止免疫能を誘導するクローン遺伝子およびマラリアワ
クチンにおいて用いる遺伝子からの想定されるペプチド
のいずれにも関与しない。
マラリア伝播阻止免疫能をつくるために有用な抗原を
同定する研究は、ここに参照として引用するCarterら
(「マラリア伝播阻止免疫における標的抗原(Target A
ntigens in Malaria Transmission Blocking lmmunit
y)」、Phil.Trans.R.Soc.Land.B 307、201−213、198
4)の論文に開示されている。この論文では、伝播阻止
免疫の起こるマラリア寄生虫の発達相が記述されてい
る。配偶子および新たに授精した接合子上の標的抗原お
よび授精後伝播阻止免疫の標的抗原が、この論文では同
定されている。この論文は、マラリアに対する伝播阻止
免疫能を誘導するクローニングされた遺伝子にもマラリ
アワクチンに用いる遺伝子からの想定されるペプチドの
いずれにも関与しない。
同定する研究は、ここに参照として引用するCarterら
(「マラリア伝播阻止免疫における標的抗原(Target A
ntigens in Malaria Transmission Blocking lmmunit
y)」、Phil.Trans.R.Soc.Land.B 307、201−213、198
4)の論文に開示されている。この論文では、伝播阻止
免疫の起こるマラリア寄生虫の発達相が記述されてい
る。配偶子および新たに授精した接合子上の標的抗原お
よび授精後伝播阻止免疫の標的抗原が、この論文では同
定されている。この論文は、マラリアに対する伝播阻止
免疫能を誘導するクローニングされた遺伝子にもマラリ
アワクチンに用いる遺伝子からの想定されるペプチドの
いずれにも関与しない。
ここで引用するGrotendorstらによる論文(「プラス
モジウム・ガリナセウムの接合子の形質変換中に発現さ
れる表面タンパク質は伝播阻止抗体の標的である(A Su
rfact Protein Expressed During the Transformation
of Zygotes of Plasmodium gallinaceum is a Target o
f Transmission−Blocking Antibodies)」、lnfection
and lmmuity,Vol.45、No.3、P.775−777,1984)では、
抗原としての使用に適す特異的タンパク質が開示されて
いる。この論文では、プラスモジウム・ガリナセウムの
接合子によって合成される表面タンパク質Mr26,000であ
る抗原を単離して同定するための有用な材料および工程
が明かにされている。抗−オーキネート血清の性質を有
するモノクローナル抗体が授精寄生虫の蚊への感染能を
抑制することがいくつかの例において見出された。プラ
スモジウム・ファルシパルムの接合子およびオーキネー
トによって合成される同様の25kDaの表面タンパク質がV
ermeulenら(「蚊における伝播阻止抗体にアクセスが可
能な有性期プラスモジウム・ファルシパルム上の抗原の
順次発現(Sequential Expression of Antigens on Sex
ual Stages of Plasmodium falciparum Accessible to
Transmission−blocking Antibodies in the Mosquit
o)」、J.Exp.Med.162:1460−1476、1985)によって記
述されており、ここに参照として引用する。これら論文
は、マラリアへの伝播阻止免疫を誘導するためのプラス
モジウム・ファルシパルムのクローニングされた遺伝子
も、マラリアワクチンに用いる遺伝子からの推論できる
ペプチドも開示していない。
モジウム・ガリナセウムの接合子の形質変換中に発現さ
れる表面タンパク質は伝播阻止抗体の標的である(A Su
rfact Protein Expressed During the Transformation
of Zygotes of Plasmodium gallinaceum is a Target o
f Transmission−Blocking Antibodies)」、lnfection
and lmmuity,Vol.45、No.3、P.775−777,1984)では、
抗原としての使用に適す特異的タンパク質が開示されて
いる。この論文では、プラスモジウム・ガリナセウムの
接合子によって合成される表面タンパク質Mr26,000であ
る抗原を単離して同定するための有用な材料および工程
が明かにされている。抗−オーキネート血清の性質を有
するモノクローナル抗体が授精寄生虫の蚊への感染能を
抑制することがいくつかの例において見出された。プラ
スモジウム・ファルシパルムの接合子およびオーキネー
トによって合成される同様の25kDaの表面タンパク質がV
ermeulenら(「蚊における伝播阻止抗体にアクセスが可
能な有性期プラスモジウム・ファルシパルム上の抗原の
順次発現(Sequential Expression of Antigens on Sex
ual Stages of Plasmodium falciparum Accessible to
Transmission−blocking Antibodies in the Mosquit
o)」、J.Exp.Med.162:1460−1476、1985)によって記
述されており、ここに参照として引用する。これら論文
は、マラリアへの伝播阻止免疫を誘導するためのプラス
モジウム・ファルシパルムのクローニングされた遺伝子
も、マラリアワクチンに用いる遺伝子からの推論できる
ペプチドも開示していない。
産業界では、プラスモジウム・ファルシパルム25kDa
表面タンパク質(以下Pfs25と称する)への伝播阻止免
疫を誘導ことを意図したワクチンおよび他の有性期抗原
を生産し得る遺伝子を欠いている。産業界では、また、
上記の遺伝子から発現され得て、マラリアワクチンを生
産するための医薬組成物に用い得る合成ペプチドにも欠
いている。そのような遺伝子から派生するワクチンは、
他の予防的マラリアワクチンの有用性を延長し、低伝播
地域のマラリアの蔓延を少なくするであろう。
表面タンパク質(以下Pfs25と称する)への伝播阻止免
疫を誘導ことを意図したワクチンおよび他の有性期抗原
を生産し得る遺伝子を欠いている。産業界では、また、
上記の遺伝子から発現され得て、マラリアワクチンを生
産するための医薬組成物に用い得る合成ペプチドにも欠
いている。そのような遺伝子から派生するワクチンは、
他の予防的マラリアワクチンの有用性を延長し、低伝播
地域のマラリアの蔓延を少なくするであろう。
発明の概要 本発明は、ヒトマラリアワクチンの調製のための抗原
を発現する、遺伝子である。遺伝子は、プラスモジウム
・ファルシパルムの接合子およびオーキネートの25kDa
表面タンパク質をコードするクローニングされたヌクレ
オチド配列またはその部分を含む。タンパク質をコード
する遺伝子の部分は、以下の通りである。
を発現する、遺伝子である。遺伝子は、プラスモジウム
・ファルシパルムの接合子およびオーキネートの25kDa
表面タンパク質をコードするクローニングされたヌクレ
オチド配列またはその部分を含む。タンパク質をコード
する遺伝子の部分は、以下の通りである。
本発明は、マラリアワクチンの調製に有用な合成タン
パク質を含む。クローニングされた遺伝子の合成タンパ
ク質は、以下の通りである。
パク質を含む。クローニングされた遺伝子の合成タンパ
ク質は、以下の通りである。
本発明は、合成タンパク質を含有する医薬組成物およ
び合成タンパク質を含む抗−マラリアワクチンの製造法
を含む。
び合成タンパク質を含む抗−マラリアワクチンの製造法
を含む。
図面の簡単な説明 第1図は、Pfs25のヌクレオチドおよび予想されるア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
第2図は、無性および有性期RNAのノーザンプロット
分析を示す図である。
分析を示す図である。
第3図は、EGF様領域との関連性を強調するように配
置したPfs25のタンパク質構造を示す図である。
置したPfs25のタンパク質構造を示す図である。
発明の詳細な説明 本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子
およびオーキネートの25kDa表面タンパク質(Pfs25)を
コードする単離されてクローニングされた遺伝子であ
る。この遺伝子の決定されたアミノ酸配列は、シグナル
配列、疎水性C末端および4個のタンデム上皮成長因子
(EGF)様領域から成る。本発明のクローニングされた
遺伝子は、したがって、マラリアワクチンの調製に有用
な抗原を発現し得る有用な組成物を提供する。抗原もま
た、本発明の有用な産生物である。抗原は、マラリアワ
クチンとして適する医薬組成物の調製のための治癒量で
使用し得るポリペプチドである。
およびオーキネートの25kDa表面タンパク質(Pfs25)を
コードする単離されてクローニングされた遺伝子であ
る。この遺伝子の決定されたアミノ酸配列は、シグナル
配列、疎水性C末端および4個のタンデム上皮成長因子
(EGF)様領域から成る。本発明のクローニングされた
遺伝子は、したがって、マラリアワクチンの調製に有用
な抗原を発現し得る有用な組成物を提供する。抗原もま
た、本発明の有用な産生物である。抗原は、マラリアワ
クチンとして適する医薬組成物の調製のための治癒量で
使用し得るポリペプチドである。
プラスモジウム・ファルシパルムの3個の有性期特異
性抗原をコードする遺伝子は、今日までまだクローニン
グされていない。これは、一部は、モノクローナル抗体
決定エピトープがジスルフィド結合に依存しており、ペ
プチドの配列決定に必要な大量の寄生虫および精製タン
パク質を得ることが難しいという事実による。本発明の
遺伝子は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子か
らPfs25を精製することによって得られる。本発明の好
ましい実施態様において、NF54プラスモジウム・ファル
シパルムの3D7クローンが用いられる。Pfs25を、免疫ア
フィニティークロマトグラフィーおよびSDS−PAGEを用
いて精製する。次いで、タンパク質のミクロ配列決定
を、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするため
のオリゴヌクレオチドプローブを作出するために行う。
アミノ末端がブロックされているために、精製したPfs2
5をトリプシンで消化する。得られるペプチドをHPLCで
分画する。この工程から5個のペプチド配列が得られ
る。これらペプチド配列は、第1図に示される通りであ
る。
性抗原をコードする遺伝子は、今日までまだクローニン
グされていない。これは、一部は、モノクローナル抗体
決定エピトープがジスルフィド結合に依存しており、ペ
プチドの配列決定に必要な大量の寄生虫および精製タン
パク質を得ることが難しいという事実による。本発明の
遺伝子は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子か
らPfs25を精製することによって得られる。本発明の好
ましい実施態様において、NF54プラスモジウム・ファル
シパルムの3D7クローンが用いられる。Pfs25を、免疫ア
フィニティークロマトグラフィーおよびSDS−PAGEを用
いて精製する。次いで、タンパク質のミクロ配列決定
を、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするため
のオリゴヌクレオチドプローブを作出するために行う。
アミノ末端がブロックされているために、精製したPfs2
5をトリプシンで消化する。得られるペプチドをHPLCで
分画する。この工程から5個のペプチド配列が得られ
る。これらペプチド配列は、第1図に示される通りであ
る。
高度に同義性をもつオリゴヌクレオチドプローブを、
トリプシンペプチド(tryptic peptide)配列から構築
する。このオリゴヌクレオチドを用いてゲノムDNAの600
bpDraI断片(pSKR2)をクローニングする。DraI断片
は、1個の長い解読枠(open reading frame)を含む
が、終止コドンを含まない。したがって、3.5kbHindIII
断片(pNF4.13)をクローニングする。クローニングさ
れた両断片を用いてPfs25のヌクレオチド配列を決定す
ることができる。
トリプシンペプチド(tryptic peptide)配列から構築
する。このオリゴヌクレオチドを用いてゲノムDNAの600
bpDraI断片(pSKR2)をクローニングする。DraI断片
は、1個の長い解読枠(open reading frame)を含む
が、終止コドンを含まない。したがって、3.5kbHindIII
断片(pNF4.13)をクローニングする。クローニングさ
れた両断片を用いてPfs25のヌクレオチド配列を決定す
ることができる。
第1図は、上記の工程から決定されたPfs25のアミノ
酸配列を示す。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列
の上に示されている。遺伝子は、217個のアミノ酸のポ
リペプチドをコードする一つのエクソンを有する。予想
されるコード領域のヌクレオチド配列は大文字で示され
ており、654塩基対から成る。N末端はブロックされて
いる。したがって、成熟タンパク質の開始点は決定され
なかった。実線は、ミクロ配列決定によって決定された
トリプシンペプチドの配列を表す。星印は、放射性標識
したペプチドのミクロ配列決定によって決定された配列
を表す。点線は、ミクロ配列決定されたペプチドの不確
定のアミノ酸残基を表す。二重実線は、オリゴヌクレオ
チドプローブを構築するために用いるトリプシンペプチ
ド配列を表す。白丸は、考えられるアスパラギン結合グ
リコシル化の部位を表す。破線は、疎水性領域を示す。
25kDaオーキネート表面抗原の遺伝子がクローニングさ
れているという第一の最も重要な証拠は、Pfs25のミク
ロ配列決定された5個のトリプシンペプチドが第1図に
示されるようにPfs25の決定されたアミノ酸配列中に見
出されることである。(35S)標識Pfs25の調製物を、35
S−メチオニンおよび35Sシステインで代謝的に標識して
おいた接合子から免疫精製することができる。得られる
Pfs25のトリプシンペプチドをHPLCで分別して、最も高
い放射性活性を含む画分をミクロ配列決定する。Pfs25
のトリプシンペプチド中のシステインおよびメチオニン
の放射性活性ピークは、第1図に星印で示されるPfs25
遺伝子の決定されたアミノ酸配列中のこれら残基の位置
と完全に合致する。
酸配列を示す。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列
の上に示されている。遺伝子は、217個のアミノ酸のポ
リペプチドをコードする一つのエクソンを有する。予想
されるコード領域のヌクレオチド配列は大文字で示され
ており、654塩基対から成る。N末端はブロックされて
いる。したがって、成熟タンパク質の開始点は決定され
なかった。実線は、ミクロ配列決定によって決定された
トリプシンペプチドの配列を表す。星印は、放射性標識
したペプチドのミクロ配列決定によって決定された配列
を表す。点線は、ミクロ配列決定されたペプチドの不確
定のアミノ酸残基を表す。二重実線は、オリゴヌクレオ
チドプローブを構築するために用いるトリプシンペプチ
ド配列を表す。白丸は、考えられるアスパラギン結合グ
リコシル化の部位を表す。破線は、疎水性領域を示す。
25kDaオーキネート表面抗原の遺伝子がクローニングさ
れているという第一の最も重要な証拠は、Pfs25のミク
ロ配列決定された5個のトリプシンペプチドが第1図に
示されるようにPfs25の決定されたアミノ酸配列中に見
出されることである。(35S)標識Pfs25の調製物を、35
S−メチオニンおよび35Sシステインで代謝的に標識して
おいた接合子から免疫精製することができる。得られる
Pfs25のトリプシンペプチドをHPLCで分別して、最も高
い放射性活性を含む画分をミクロ配列決定する。Pfs25
のトリプシンペプチド中のシステインおよびメチオニン
の放射性活性ピークは、第1図に星印で示されるPfs25
遺伝子の決定されたアミノ酸配列中のこれら残基の位置
と完全に合致する。
マラリアワクチンを第1図の遺伝子またはその部分か
ら生産することができる。遺伝子は、既知の技術を用い
て修飾することによって、シグナル配列、疎水性アンカ
ーおよび/または他の遺伝子部分を削除することができ
る。遺伝子をこのように修飾することによって、ワクチ
ンに用いる適当な抗原を続いて生産する。
ら生産することができる。遺伝子は、既知の技術を用い
て修飾することによって、シグナル配列、疎水性アンカ
ーおよび/または他の遺伝子部分を削除することができ
る。遺伝子をこのように修飾することによって、ワクチ
ンに用いる適当な抗原を続いて生産する。
当業者には、第1図の配列に表されるいくつかのコド
ンを他のコドンに置換しても同等の断片を産生し得るこ
とが理解され得る。同等の断片によって産生されるポリ
ペプチドは、そのアミノ酸配列に対応する変化を有する
が、好ましいポリペプチドと同等の機能を有する。例え
ば、アミノ酸位置131のグリシンのグリタミン酸との置
換は、ポリペプチドの機能に変化をもたらさない。
ンを他のコドンに置換しても同等の断片を産生し得るこ
とが理解され得る。同等の断片によって産生されるポリ
ペプチドは、そのアミノ酸配列に対応する変化を有する
が、好ましいポリペプチドと同等の機能を有する。例え
ば、アミノ酸位置131のグリシンのグリタミン酸との置
換は、ポリペプチドの機能に変化をもたらさない。
第二に、本発明の遺伝子は、プラスモジウム・ファル
シパルムの有性期に好ましくは発現される。これは、Pf
s25が合成される時期である。ガメトサイトからのmRNA
(図示せず)および5時間経過のプラスモジウム・ファ
ルシパルムの接合子は、NF54の3D7クローンを用いた第
2図の5列に示されるように、pSK2とハイブリダイズす
る多量の約1.4kb相当物を有している。これに対して、
第2図A列に示されるように、3D7の無性期寄生虫から
のmRNAは、弱いシグナルを示すのみである。無性期寄生
虫からの弱いシグナルは、寄生虫の調製中のいくつかの
ガメトサイトの存在によるものである可能性が最も高
い。例えば、pSKR2は、第2図L列に示されるように、
プラスモジウム・ファルシパルムのLiberian分離株のLF
4クローンのようなガメトサイトを産生しないプラスモ
ジウム・ファルシパルム寄生虫からのmRNAとハイブリダ
イズしない。
シパルムの有性期に好ましくは発現される。これは、Pf
s25が合成される時期である。ガメトサイトからのmRNA
(図示せず)および5時間経過のプラスモジウム・ファ
ルシパルムの接合子は、NF54の3D7クローンを用いた第
2図の5列に示されるように、pSK2とハイブリダイズす
る多量の約1.4kb相当物を有している。これに対して、
第2図A列に示されるように、3D7の無性期寄生虫から
のmRNAは、弱いシグナルを示すのみである。無性期寄生
虫からの弱いシグナルは、寄生虫の調製中のいくつかの
ガメトサイトの存在によるものである可能性が最も高
い。例えば、pSKR2は、第2図L列に示されるように、
プラスモジウム・ファルシパルムのLiberian分離株のLF
4クローンのようなガメトサイトを産生しないプラスモ
ジウム・ファルシパルム寄生虫からのmRNAとハイブリダ
イズしない。
第三に、プラスモジウム・ファルシパルムの配偶子、
接合子またはオーキネートが代謝的に標識される時、複
数の有性期タンパク質は35S−メチオニンを組み込み、P
fs25は主たる放射性表記産生物ではない。これに対し
て、Pfs25は、当業者に標準的な試験によって知られる
ように、35S−システインを組み込んでいる優勢の産生
物である。決定されたアミノ酸配列は11%のシステイン
を含み、これはこれらの結果と対応する。
接合子またはオーキネートが代謝的に標識される時、複
数の有性期タンパク質は35S−メチオニンを組み込み、P
fs25は主たる放射性表記産生物ではない。これに対し
て、Pfs25は、当業者に標準的な試験によって知られる
ように、35S−システインを組み込んでいる優勢の産生
物である。決定されたアミノ酸配列は11%のシステイン
を含み、これはこれらの結果と対応する。
第四に、決定されたアミノ酸配列からのタンパク質構
造は、25kDa表面糖タンパク質の生化学についての上記
引用の既要と一致する。決定された配列は、N末端に推
定上のシグナルペプチドおよびC末端に短い疎水性アン
カーを含む。これは、N結合糖のための四つの有力なグ
リコシル化部位を有しており、約24kDaのポリペプチド
をコードする。決定された配列はまた、15個のアミノ酸
の短い疎水性アンカーおよびC末端に有力な細胞質疎水
性アンカーおよびC末端に有力な細胞質親水性領域の欠
失を有する。
造は、25kDa表面糖タンパク質の生化学についての上記
引用の既要と一致する。決定された配列は、N末端に推
定上のシグナルペプチドおよびC末端に短い疎水性アン
カーを含む。これは、N結合糖のための四つの有力なグ
リコシル化部位を有しており、約24kDaのポリペプチド
をコードする。決定された配列はまた、15個のアミノ酸
の短い疎水性アンカーおよびC末端に有力な細胞質疎水
性アンカーおよびC末端に有力な細胞質親水性領域の欠
失を有する。
シグナル配列と疎水性C末端との間のシステインの編
成は、第3B図に示されるようにEGF1の領域と同様であ
る。ヒトEGF前駆体およびヒトLDLレセプターのエクソン
中のシステインの位置に基づいて、第3図に示されるよ
うに、三つのシステイン残基がコンセンサス配列Y/F−
x−C x−C x−x−G−Y/Fに先行し、一つがそれに続
く。EGF様領域もまた、ドロソフィリア・メラノガステ
ル(Drosophilia melanogaster)のノッチ(notch)お
よびケノルハディティス・エレガンス(Caenorhabditis
elegans)のlin−12のような無脊椎動物においても見
出される。本発明は、単細胞生物のタンパク質における
EGF様領域の存在を最初に報告するものである。本発明
のタンパク質におけるEGF様領域の存在は、蚊を含む高
等生物に成長因子効果を有することを期待し得る。
成は、第3B図に示されるようにEGF1の領域と同様であ
る。ヒトEGF前駆体およびヒトLDLレセプターのエクソン
中のシステインの位置に基づいて、第3図に示されるよ
うに、三つのシステイン残基がコンセンサス配列Y/F−
x−C x−C x−x−G−Y/Fに先行し、一つがそれに続
く。EGF様領域もまた、ドロソフィリア・メラノガステ
ル(Drosophilia melanogaster)のノッチ(notch)お
よびケノルハディティス・エレガンス(Caenorhabditis
elegans)のlin−12のような無脊椎動物においても見
出される。本発明は、単細胞生物のタンパク質における
EGF様領域の存在を最初に報告するものである。本発明
のタンパク質におけるEGF様領域の存在は、蚊を含む高
等生物に成長因子効果を有することを期待し得る。
例 以下の例は、本発明の遺伝子を得るための方法を提供
する。この例は、本発明の好ましい態様を示すものであ
る。
する。この例は、本発明の好ましい態様を示すものであ
る。
プラスモジウム・ファルシパルムのNF54分離株の3D7
クローンをインビトロで培養して、上記のようにして接
合子を調製した。5時間経過の接合子(109)のトリト
ンX−100抽出物からのPfs25を、セファロース4Bビーズ
(CnBr−活性化)に共有結合させたモノクローナル抗体
1C7を用いて免疫アフィニティーで精製した。Pfs25を、
70%の35S−メチオニン、20%の35S−システインおよび
10%の他の35S−化合物を有し、ICN Radiochemicals、l
nc.から市販されている(transS35で代謝的に標識して
おいた。ビーズはPfs25を含み、5%SDS、62.5mMトリス
(pH6.8)、0.002%プロモフェノールブルーおよび8M尿
素を含むSDS−PAGE試料緩衝液に再懸濁させた。これら
を68℃で5分間加熱した。試料緩衝液に溶出されたタン
パク質を12%SDSポリアクリルアミドゲルに非還元条件
で載せた。Pfs25はゲル上で同定された唯一の放射性標
識タンパク質であり、受動拡散によってゲルから回収さ
れた。凍結乾燥させた試料を0.5Mトリス塩酸(pH8.
5)、6Mグアニジン塩酸、64mMジチオスレイトールを含
む0.3mMEDTA緩衝液で再溶解して、37℃で2時間窒素雰
囲気下でインキュベートした。ヨードアセトアミドを最
終濃度174mMになるように加えて、25℃で1時間暗所で
反応させた。2−メルカプトエタノールの過剰量、次い
で10倍量の無水エタノールを加えた。還元してアルキル
化したタンパク質を−20℃で4時間沈澱させた。残った
ペレットを50mM NH4HCO3(pH7.9)に再懸濁させた、各
々6時間37℃で培養して、各0.5μgのTPCK処理トリプ
シン(シグマ社製)で2回消化し、各回37℃で6時間イ
ンキュベートした。消化を、試料を65℃で10分間加熱す
ることによって終結させた。トリプシンペプチドを、逆
相HPLC(RP−300、Applied Biosystems、lnc.)上で0.1
%のトリフルオロ酢酸で50%アセトニトリル勾配を用い
て分画した。ペプチドミクロ配列決定を、Applied Bios
ystems,lnc.からの470A型気合シーケンサー上で行っ
た。各サイクルの産生物の40%を、付された120A型PTH
分析機上で製造者のプログラムC3RPTHを用いて分析し
た。一つのペプチドについて、各サイクルの産生物の残
りの60%の放射性活性を決定した。放射性活性ピーク
(☆☆☆)を、サイクル番号1、7、12および17に見出
した。
クローンをインビトロで培養して、上記のようにして接
合子を調製した。5時間経過の接合子(109)のトリト
ンX−100抽出物からのPfs25を、セファロース4Bビーズ
(CnBr−活性化)に共有結合させたモノクローナル抗体
1C7を用いて免疫アフィニティーで精製した。Pfs25を、
70%の35S−メチオニン、20%の35S−システインおよび
10%の他の35S−化合物を有し、ICN Radiochemicals、l
nc.から市販されている(transS35で代謝的に標識して
おいた。ビーズはPfs25を含み、5%SDS、62.5mMトリス
(pH6.8)、0.002%プロモフェノールブルーおよび8M尿
素を含むSDS−PAGE試料緩衝液に再懸濁させた。これら
を68℃で5分間加熱した。試料緩衝液に溶出されたタン
パク質を12%SDSポリアクリルアミドゲルに非還元条件
で載せた。Pfs25はゲル上で同定された唯一の放射性標
識タンパク質であり、受動拡散によってゲルから回収さ
れた。凍結乾燥させた試料を0.5Mトリス塩酸(pH8.
5)、6Mグアニジン塩酸、64mMジチオスレイトールを含
む0.3mMEDTA緩衝液で再溶解して、37℃で2時間窒素雰
囲気下でインキュベートした。ヨードアセトアミドを最
終濃度174mMになるように加えて、25℃で1時間暗所で
反応させた。2−メルカプトエタノールの過剰量、次い
で10倍量の無水エタノールを加えた。還元してアルキル
化したタンパク質を−20℃で4時間沈澱させた。残った
ペレットを50mM NH4HCO3(pH7.9)に再懸濁させた、各
々6時間37℃で培養して、各0.5μgのTPCK処理トリプ
シン(シグマ社製)で2回消化し、各回37℃で6時間イ
ンキュベートした。消化を、試料を65℃で10分間加熱す
ることによって終結させた。トリプシンペプチドを、逆
相HPLC(RP−300、Applied Biosystems、lnc.)上で0.1
%のトリフルオロ酢酸で50%アセトニトリル勾配を用い
て分画した。ペプチドミクロ配列決定を、Applied Bios
ystems,lnc.からの470A型気合シーケンサー上で行っ
た。各サイクルの産生物の40%を、付された120A型PTH
分析機上で製造者のプログラムC3RPTHを用いて分析し
た。一つのペプチドについて、各サイクルの産生物の残
りの60%の放射性活性を決定した。放射性活性ピーク
(☆☆☆)を、サイクル番号1、7、12および17に見出
した。
二重実線で示されるペプチド配列を、高度に同義性を
もつオリゴヌクレオチドプローブを構築するために用い
た。512同義性(degeneracy)オリゴヌクレオチドのグ
ループは接合子RNAの1、4kbバンドとハイプリダイズし
た。プロリンのコドンを変えることによって、プローブ
を各128同義性の四つのグループに分けて、その一つの
グループはゲノムDNAの600bpDraI断片だけでなくRNAの
1.4kbバンドとハイブリダイズした。λgt10のサイズで
選択されたDraI断片ライブラリーの20、000個のプラー
クを、このオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニン
グした。一つのクローンを同定して、ブルースクリプト
SK(pSKR2)にサブクローニングした。pSKR2を用いて、
ベクターpSP64中のサイズで選択されたライブラリーに
おいて3.5kb HindIII断片で同定した。各クローンの両
鎖を、ジデオキシヌクレオチドターミネーター法によっ
て配列決定した。
もつオリゴヌクレオチドプローブを構築するために用い
た。512同義性(degeneracy)オリゴヌクレオチドのグ
ループは接合子RNAの1、4kbバンドとハイプリダイズし
た。プロリンのコドンを変えることによって、プローブ
を各128同義性の四つのグループに分けて、その一つの
グループはゲノムDNAの600bpDraI断片だけでなくRNAの
1.4kbバンドとハイブリダイズした。λgt10のサイズで
選択されたDraI断片ライブラリーの20、000個のプラー
クを、このオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニン
グした。一つのクローンを同定して、ブルースクリプト
SK(pSKR2)にサブクローニングした。pSKR2を用いて、
ベクターpSP64中のサイズで選択されたライブラリーに
おいて3.5kb HindIII断片で同定した。各クローンの両
鎖を、ジデオキシヌクレオチドターミネーター法によっ
て配列決定した。
第2図には、無性および有性期RNAのノーザンブロッ
ト分析が示されている。全細胞性RNA(20μg/列)を、L
F4の無性寄生虫(L)、3D7の無性寄生虫(A)または
5時間経過の3D7の接合子(S)から調製して、1%ア
ガロース/ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動して
からナイロン膜に移した。フィルターを、無作為に入れ
たpSKR2挿入物(比活性109c.p.m.μg-1)と55℃で一晩
ハイブリダイズさせて、記述のように洗浄した。サイズ
マーカーは、0.24〜9.5kbRNA段階物(ladder、BRL製)
を用いる。
ト分析が示されている。全細胞性RNA(20μg/列)を、L
F4の無性寄生虫(L)、3D7の無性寄生虫(A)または
5時間経過の3D7の接合子(S)から調製して、1%ア
ガロース/ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動して
からナイロン膜に移した。フィルターを、無作為に入れ
たpSKR2挿入物(比活性109c.p.m.μg-1)と55℃で一晩
ハイブリダイズさせて、記述のように洗浄した。サイズ
マーカーは、0.24〜9.5kbRNA段階物(ladder、BRL製)
を用いる。
第3A図は、EGF様領域の関連性を強調するように配置
されたPfs25のタンパク質構造を示している。ボックス
は、システイン残基および他の同一のまたは関連するア
ミノ酸を表す。第3B図は、Pfs25、lin−12、ノッチ、EG
FおよびヒトLDLレセプターからのEGF様反復コンセンサ
ス配列を示す。ボックスは、システイン残基を表す。二
重ボックスは、コンセンサス配列の中心部を表す。アル
ファベット文字は、次のアミノ酸を表す。C:Cys、D:As
p、E:Glu、F:Phe、G:Gly、I:Ile、K:Lys、L:Leu、N:As
n、T:Thr、Y:Tyr、x:他のアミノ酸および非特定数のア
ミノ酸。
されたPfs25のタンパク質構造を示している。ボックス
は、システイン残基および他の同一のまたは関連するア
ミノ酸を表す。第3B図は、Pfs25、lin−12、ノッチ、EG
FおよびヒトLDLレセプターからのEGF様反復コンセンサ
ス配列を示す。ボックスは、システイン残基を表す。二
重ボックスは、コンセンサス配列の中心部を表す。アル
ファベット文字は、次のアミノ酸を表す。C:Cys、D:As
p、E:Glu、F:Phe、G:Gly、I:Ile、K:Lys、L:Leu、N:As
n、T:Thr、Y:Tyr、x:他のアミノ酸および非特定数のア
ミノ酸。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−501267(JP,A) Journal of Experi mental Medicine,Vo l.162(1985)p.1460−1476
Claims (6)
- 【請求項1】下記のアミノ酸配列を有するタンパク質ま
たはそのタンパク質に結合する抗体が認識するその抗原
性部分をコードする組換えDNA分子。 - 【請求項2】タンパク質が、ヒトマラリアワクチンを生
産する抗原を発現するための、シグナル配列、疎水性C
−末端および4つのタンデム上皮成長因子様領域を有す
るプラスモジウム・ファルシパルムの接合子およびオー
キネートの25kDa表面タンパク質またはその抗原性部分
である、請求項1に記載の組換えDNA分子。 - 【請求項3】下記のDNA配列を含んでなる組換えDNA分
子。 - 【請求項4】請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNA
分子を含む、発現ベクター。 - 【請求項5】請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNA
分子を含む、宿主。 - 【請求項6】請求項1〜3のいずれか一項に記載に記載
のDNA分子を含む、組換え細菌プラスミド。
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