JPH03503122A

JPH03503122A - ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH03503122A
Application number: JP1506254A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ルイス　エイチ．; カスロー，デイビッド　シー．
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1991-07-18
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: AU3763789A; DE68926712T2; EP0418310A1; DE68926712D1; EP0418310A4; IL90134A0; JP2812759B2; AU619312B2; IL90134A; CA1340963C; ATE139537T1; EP0418310B1; WO1989010936A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子発皇辺宣Ｉ皮区立！本発明は、マラリアワクチン抗原をコードする遺伝子に間する。より詳細には、本発明は、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓａ＋ｏｄｉｕｓ＋　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　２５ｋＤａオーキネート（ｏｏｋ　ｉ　ｎｅｔｅ）表面抗原をコードする遺伝子に間する。

従夫技簀マラリアによる人類の大きな損失は今も続いている。

アフリカの付落では、１歳から４歳までの子供の全死亡の約２５％がマラリアによる。この死亡率は、局在する寄生虫のクロロキンに対する感受性にもかかわらず続いている。この場合、蚊の抑制は困難である。この死亡率を低下させるための今日の最大の希望は、寄生虫の増殖を抑止することによってこの病気の発生および死亡を少なくする予防ワクチンである。ヒトマラリアの主たる原因は、寄生虫プラスモジウム・ファルシパルムである。

マラリアを攻撃する種々のワクチンの価値は、寄生虫の生活環の理解を通して評価される。ヒトへの感染は、幼若のマラリア寄生虫すなわち「スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）　Ｊが蚊によってヒトの血流に注入された時に始まる。注入後、寄生虫は肝臓細胞に位置を占める。約１週閏後、寄生虫すなわち「メロゾイト（ａ＋ｅｒｏｚｏｉｔｅ）　Ｊは、血流に放出される。寄生虫の血流への流入によって「赤血球」相が始まる。各寄生虫は、増殖成長するために赤血球に侵入する。赤血球菖胞中でメロゾイトが成熟した時、これはトロフオゾイト（ｔｒｏｐｈｏｚｏ　ｉ　ｔｅ）およびシゾント（ｓｃｈｉｚｏｎｔ）として知られている。シゾントは、放出されて他の赤血球に侵入する個々のメロゾイトを形成するために核分裂を起こしている状態をいう、数回の分裂生殖（ｓｃｈｉｚｏｇｏｎｉｃ）サイクルの後、寄生虫のいくつかは、無性生殖でシゾントになるかわりに、大きな単核の寄生虫に成長する。

これらの寄生虫は有性的な成長をする。

マラリア寄生虫の有性生殖には、雌性寄生虫すなわち「マクロガメトサイト（ｍａｃｒｏｇａｓｅｔｏｃｙｔｅ）　Ｊおよび雄性寄生虫すなわち「ミクロガメトサイト（ｍｉｃｒｏｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ）　Ｊが関与する。これらガメトサイト（生殖母細胞）は、ヒト体内ではこれ以上には発達しない、ガメトサイトが蚊によって摂取されると、複雑な有性的サイクルが蚊の中腸で始まる。赤血球細胞は１０〜２０分後に蚊の中腸で破壊される。ミクロガメトサイトは鞭毛放出をしながら発達を続けて、密なべん毛を有する８個の小配偶子（組ｃｒｏｇａｍｅｔｅ）を放出する。授精が起きて、小配偶子が大配偶子（＊ａｃｒｏｇａｗａｔｅ）に融合する。授精した寄生虫は、「オーキネート（ｏｏｋｉｎｅｔｅ）Ｊに発達する接合子（ｚｙｇｏｔｅ）として知られている。オーキネートは、蚊の中腸壁に侵入して、接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ）に変体して、この中で多数の小さいスポロゾイトを形成する。接合子嚢が壊れると、スポロゾイトは、血リンパを介して蚊の唾液腺へ移動する。一旦蚊の唾液に入ると、寄生虫は宿主に注入され得る。

マラリアワクチンは、スポロゾイト、無性赤血球、および有性期を含む寄生虫の生活環中の異なる期（３ｔａｇｅ）に対して、開発されてきた。各々の開発によって、病気が起きる多様な状態におけるマラリアの抑制の可能性が増えた。スポロゾイトワクチンは、蚊によって引き起こされる感染を予防するであろう。このタイプの第一世代のワクチンは、ヒトで試験された。

無性赤血球ワクチンは、病気の重篤性を軽減するのに有用であろう。複数の候補抗原がクローニングされて、動物およびヒトで試験された。

有性期ワクチンは、有性期寄生虫を含む血液食に摂取された時に、蚊による感染を防ぐ抗体を誘導するであろう。感染または病気を直接的に予防はしないが、スポロゾイトまたは無性期ワクチンなどの予防ワクチンと組み合わせた有性期のワクチンは、予防性組成分に抵抗性のワクチン誘導突然変異体の伝播の機会を低減するであろう、このようにして、予防性組成分の有用な寿命が延長されよう。ある地理的領域では、有性期のワクチンは、感染人口を維持するために必要な限界以下に伝播を低減することができよう。この伝播の低減は、マラリアの抑制または根絶を助けるために有用であろう。ここに参照として引用する米国特許第４．６３２，９０９号明纏書（ＣａｒｔｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ）は、マラリア寄生虫の配偶子または接合子の表面に位置する一つまたはそれ以上のタンパク質に結合する、有性期ワクチンをターゲットとする、モノクローナル抗体を開示している。これら抗体は、マラリア寄生虫の蚊の中腸期の抗原に特異的で、蚊中の寄生虫による病気の伝播を不可能にする。モノクロナール抗体は、プラスモジウム・ファルシパルム上の２５５．５９および５３にの表面タンパク質およびプラスモジウム・ガリナセルム（ＰｌａＳｌｌｏｄｉｕ＠ｇａｌｌｉｎａｃｅｒｕｓ）の接合子およびオーキネート上の２５にの表面タンパク質に特異的である。

この発明は、マラリア寄生虫の伝播を阻止する方法を含む。その方法には、マラリア寄生虫配偶子の表面上の糖タンパク質に特異的なマラリア寄生虫モノクローナル抗体を有する蚊の飼養が含まれる。糖タンパク質は、分子１１２４〜３０にである。方法は接合子において授精後約３時間まで有効である。この発明は、マラリアに対する伝播阻止免疫能を誘導するクローン遺伝子およびマラリアワクチンにおいて用いる遺伝子からの想定されるペプチドのいずれにも関与しない。

マラリア伝播阻止免疫能をつくるために有用な抗原を同定する研究は、ここに参照として引用するＣａｒｔｅｒら（「マラリア伝播阻止免疫における標的抗原（Ｔａｒｇｅｔ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｉｎ　Ｍａｌａｒｉａ　Ｔｒａｎｓａ＋１ｓｓｉｏｎＢＩｏｃｋｉｎ３１ｍｍｕｎｉｔｙ）Ｊ、Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ＋Ｓｏｃ、　Ｌａｎｄ。

Ｂ５０７．２０１−２１３．１９８４）の論文に開示されている。この論文では、伝播阻止免疫の起こるマラリア寄生虫の発達相が記述されている。配偶子および新たに授精した接合そ上の標的抗原および授精後伝播阻止免疫の標的抗原が、この論文では同定されている。この論文は、マラリアに対する伝播阻止免疫能を誘導するクローニングされた遺伝子にもマラリアワクチンに用いる遺伝子からの想定されるペプチドのいずれにも関与しない。

ここで引用するＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔらによる論文（「プラスモジウム・ガリナセウムの接合子の形質変換中に発現される表面タンパク質は伝播阻止抗体の標的である（Ａ　５ｕｒｆａｃｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｄｕｒｉｎ８ｔｈｅＴｒａｎｓｆｏｒａ＋ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｙｇｏｔｅｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓａ＋ｏｄｉｕｍｇａｌｌｉｎａｃｅｕｗ　　ｉｓ　　ａ　　Ｔａｒｇｅｔ　　ｏｆ　　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−ＢｌｏｃｋｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ　、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍ＋１ｕｉｔｙ、　Ｖｏｌ−４５、Ｎｏ、　３、Ｐ、　７７５−７７７、１９８４）では、抗原としての使用に適する特異的タンパク質が開示されている。この論文では、プラスモジウム・ガリナセウムの接合子によって合成される表面タンパク質Ｍ　、２６　、０００である抗原を単離して同定するための有用な材料および工程が明かにされている。抗 −オーキネート血清の性質を有するモノクローナル抗体が授精寄生虫の蚊への感染能を抑制することがいくつかの例において見出された。プラスモジウム・ファルシパルムの接合子およびオーキネートによって合成される同様の２５ｋＤａの表面タンパク質がＶｅｒＩｌｅｕ　ｔｅｎら（「蚊における伝播阻止抗体にアクセスが可能な有性期プラスモジウム・ファルシパルム上の抗原の順次発現（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｓｏｎ　５ｅｘｕａｌ　Ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　Ｐ！ａｓｗｏｄｉｕｍ　ｆａｌｅｉｐａｒｕｍＡｃｃｅｓｓｉｂｌｅ　ｔｏ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏ５ｑｕｉｔｏ）Ｊ、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６２：１４６０−１４７６．１９８５）によって記述されており、ここに参照として引用する。これら論文は、マラリアへの伝播阻止免疫を誘導するためのプラスモジウム・ファルシパルムのクローニングされた遺伝子も、マラリアワクチンに用いる遺伝子からの推論できるペプチドも開示していない。

産業界では、プラスモジウム・ファルシパルム２５ｋＤａ表面タンパク質（以下Ｐｆｓ２５と称する〉への伝播阻止免疫を誘導ことを意図したワクチンおよび他の有性期抗原を生産し得る遺伝子を欠いている。産業界では、また、上記の遺伝子から発現され得て、マラリアワクチンを生産するための医薬組成物に用い得る合成ペプチドにも欠いている。そのような遺伝子から派生するワクチンは、他の予防的マラリアワクチンの有用性を延長し、低伝播地域のマラリアの蔓延を少なくするであろう。

ｌ晩り鷹１本発明は、ヒトマラリアワクチンの調製のための抗原を発現する、遺伝子である。遺伝子は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子およびオーキネートの２５　ｋＤａ表面表面タンパクコードするクローニングされたヌクレオチド配列またはその部分を含む。タンパク質をコードする遺伝子の部分は、以下の通りである。

ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＣτＴτＡＣＡＧＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＣＡＴＴ　ＣＡＡ　ＣτＴＡＧＣＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＡＡ、Ｔ　ＡＡＴ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＣＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＴＧＣＡＡＡ　Ａｆｌ；Ａ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＴ　ＧＧＴ　ＣＡ”、ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＡＡＡＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡん鋳ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＧＡＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＴＧＴＡ　Ａ、ＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＴＧＧＡＧＡＴ　　ＴＴＴ　　ＴＣＣ人ＡＡ　　丁ＧＴ　　ＡＴＴ　　ＡＡＡ　　ＡＴＡ　　ＧＡＴ　　ＧＧＡ　　ＡＡＴ　　ＣＣＣＣＴＴ　　ＴＣ`　　ＴＡＣＧＣＴ　ＴＧＴ　ＡＡＡＴＧＴ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　Ｇ買ＴＧＴＡＴＡ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴにＴ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＴＧＴ　にＧτＡＡＣＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴＡＴＡ　　ＴＴＡ　　ＧＡＴ　　ＡＣＡ　　ＡＧＣＡＡＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＴ　　ＡＡＡ　　ＡＣＴ　　ＧＧＡ　　ＧＴＴ　　ＴＧＣＴＣ`　　Ｔｆｌ；ＴＡＡＴ　ＡＴＡ　ＧＧＣＡＡＡ　ＧＴＴ　ＣＣＣＡＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴんり、ＴＧＴ　ＴＣＡＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡＡＣＣＡＡＡ　ＴＧＣＴＣＡ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＴＧＣＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴＣ，ＡＡ　ＡＣＣＴＧＴ　　、患　ＧＣＴ　　ＧＴＴ　　ＧＡＴ　　ＧＧＡ　　ＡＴＴ　　丁ＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＧＴ　　ＧＡＴ　　ＴＧs　　ＡＡＡＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣτ ＣＴ　ＡＴＡτＧＴ　ＡＣτＧＣＴ　ＴＴＴＴＣＡ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＣＴＡ　ＡＧＣＡＴＴ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＣＴＡ　ＴＴＴＴＣＡ　ＧＴＡ　ＴＧＣＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＴＡＡ。

本発明は、マラリアワクチンの調製に有用な合成タンパク質を含む。クローニングされた遺伝子の合成タンパク質は、以下の通りである。

Ｍｅｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＳｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＶａＩＣｙｓＬｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　工ｌｅ　　Ｇｉｎ　　Ｍｅｅ　　Ｓａｒ　　Ｇｌｙ　　）（ｉｓ　　Ｌａｕ　　にｌ普@　Ｃｙｓ　　ＬｙｓＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＬｙｓ　ＶａＩＬａｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＡｓｐ　ＰｈｅＳａｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ工ｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＡｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｍｅｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ工１ａ　Ｉ、ａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＡｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｕｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　５ｅｒＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｕｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＡｓｐ　Ｇａｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ工ｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　ＰｈｅＳａｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｘ１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ工ｌａ　Ｍｅｅ　ＰｈｅＩｌｅ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＳｅｒ　　ＶａＩ　Ｃｙｓ　　Ｐｈａ　　Ｐｈａ　　工Ｌｅ　　Ｍｅｅ。

本発明は、合成タンパク質を含有する医薬組成物および合成タンパク質を含む抗 −マラリアワクチンの製造法を含む。

ｙ　　　　　ｔ　日第１図は、Ｐｆｓ２５のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を示す図である。

第２図は、無性および有性期ＲＮＡのノーザンプロット分析を示す図である。

第３図は、ＥＧＦ様領域との関連性を強調するように配置したＰｆｓ２５のタンパク質構造を示す図である。

ｔ一本発明は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子およびオーキネートの２５　ｋＤａ表面タンパク質（Ｐｆｓ２５）をコードする単離されてクローニングされた遺伝子である。この遺伝子の決定されたアミノ酸配列は、シグナル配列、疎水性Ｃ末端および４個のタンデム上皮成長因子（ＥＧＦ）種領域から成る。本発明のクロー・ニングされた遺伝子は、したがって、マラリアワクチンの調製に有用な抗原を発現し得る有用な組成物を提供する。抗原もまた、本発明の有用な産生物である。抗原は、マラリアワクチンとして適する医薬組成物の調製のための治癒量で使用し得るポリペプチドである。

プラスモジウム・ファルシパルムの３個の有性期待異性抗原をコードする遺伝子は、今日までまだクローニングされていない。これは、一部は、モノクローナル抗体決定エピトープがジスルフィド結合に依存しており、ペプチドの配列決定に必要な大量の寄生虫および精製タンパク質を得ることが難しいという事実による０本発明の遺伝子は、プラスモジウム・ファルシパルムの接合子からＰ　ｆ　ｓ２５を精製することによって得られる。本発明の好ましい実施態様において、ＮＦ３４プラスモジウム・ファルシパルムの３０７クローンが用いられる。Ｐｆｓ２５を、免疫アフィニティークロマトグラフィーおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて精製する。次いで、タンパク質のミクロ配列決定を、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを作出するために行う。

アミノ末端がブロックされているために、精製したＰｆｓ２５をトリプシンで消化する。得られるペプチドをＨＰＬＣで分画する。この工程から５個のペプチド配列が得られる。これらペプチド配列は、第１［ｍに示される通りである。

高度に同義性をもつオリゴヌクレオチドプローブを、トリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ）配列から構築する。このオリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡの６００ｂｐＤｒａｌ断片（ｐＳＫＲ２）をクローニングする。ＤｒａＩ断片は、１個の長い解読枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を含むが、終止コドンを含まない。したがって、３．５ｋｂＨｉ　ｎｄｍ断片（ｐＮＦ４．１３）をクローニングする。クローニングされた両断片を用いてＰｆｓ２５のヌクレオチド配列を決定することができる。

第１図は、上記の工程から決定されたＰｆｓ２５のアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の上に示されている。遺伝子は、２１７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする一つのエクソンを有する。予想されるコード領域のヌクレオチド配列は大文字で示されており、６５４塩基対から成る。Ｎ末端はブロックされている。したがって、成熟タンパク質の開始点は決定されなかった。実線は、ミクロ配列決定によって決定されたトリプシンペプチドの配列を表す。星印は、放射性標識したペプチドのミクロ配列決定によって決定された配列を表す。点線は、ミクロ配列決定されたペプチドの不確定のアミノ酸残基を表す。二重実線は、オリゴヌクレオチドプローブを構築するために用いるトリプシンペプチド配列を表す。

白丸は、考えられるアスパラギン結合グリコジル化の部位を表す。破線は、疎水性領域を示す。２５ｋＤａオ一キネート表面抗原の遺伝子がクローニングされているという第一の最も重要な証拠は、Ｐｆｓ２５のミクロ配列決定された５個のトリプシンペプチドが第１図に示されるようにＰｆ　ｓ２５の決定されたアミノ酸配列中に見出されることである。（”Ｓ）標！ｉＱ＆Ｐｆｓ２５の調製物を、３６Ｓ−メチオニンおよび３５−Ｓシスティンで代謝的に標識しておいた接合子から免疫精製することができる。得られるＰｆｓ２５のトリブシンペブチドをＨＰＬＣで分別して、最も高い放射性活性を含む両分をミクロ配列決定するゆＰｆｓ２５のトリプシンペプチド中のシスティンおよびメチオニンの放射性活性ピークは、第１図に星印で示されるＰｆｓ２５遺伝子の決定されたアミノ酸配列中のこれら残基の位置と完全に合致する。

マラリアワクチンを第１図の遺伝子またはその部分から生産することができる。

遺伝子は、既知の技術を用いて修飾することによって、シグナル配列、疎水性アンカーおよび／または他の遺伝子部分を削除することができる。遺伝子をこのように修飾することによって、ワクチンに用いる適当な抗原を続いて生産する。

当業者には、第１図の配列に表されるいくつかのコドンを他のコドンに置換しても同等の断片を産生じ得ることが理解され得る。同等の断片によって産生されるポリペプチドは、そのアミノ酸配列に対応する変化を有するが、好ましいポリペプチドと同等の機能を有する。例えば、アミノ酸位置１３１のグリシンのグルタミン酸との置換は、ポリペプチドの機能に変化をもたらさない。

第二に、本発明の遺伝子は、プラスモジウム・ファルシパルムの有性期に好ましくは発現される。これは、Ｐｆｓ２５が合成される時期である。ガメトサイトからのｍＲＮＡ（図示せず）および５時間経過のプラスモジウム・ファルシパルムの接合子は、ＮＦ３４の３Ｄ７クローンを用いた第２図の５列に示されるように、ｐＳＫ２とハイブリダイズする多量の約１．４ｋｂ相当物を有している。これに対して、第２図Ａ列に示されるように、３Ｄ７の無性期寄生虫からのｍ　ＲＮ　Ａは、弱いシグナルを示すのみである。無性期寄生虫からの弱いシグナルは、寄生虫の調製中のいくつかのガメトサイトの存在によるものである可能性が最も高い。

例えば、ｐＳＫＲ２は、第２図り列に示されるように、プラスモジウム・ファルシパルムのＬｉｂｅｒｉａｎ分離株のＬＦ４クローンのようなガメトサイトを産生じないプラスモジウム・ファルシパルム寄生虫からのｍＲＮＡとハイブリダイズしない。

第三に、プラスモジウム・ファルシパルムの配偶子、接合子またはオーキネートが代謝的に標識される時、複数の有性期タンパク質は３５Ｓ−メチオニンを組み込み、Ｐｆｓ２５は主たる放射性標識産生物ではない。これに対して、Ｐｆｓ２５は、当業者に標準的な試験によって知られるように、３５Ｓ−システィンを組み込んでいる優勢の産生物である。決定されたアミノ酸配列は１１％のシスティンを含み、これはこれらの結果と対応する。

第四に、決定されたアミノ酸配列からのタンパク質構造は、２５　ｋＤａ表面糖タンパク質の生化学についての上記引用の既報と一致する。決定された配列は、Ｎ末端に推定上のシグナルペプチドおよびＣ末端に短い疎水性アンカーを含む、これは、Ｎ結合筒のための四つの有力なグリコジル化部位を有しており、約２４　ｋＤａのポリペプチドをコードする。決定された配列はまた、１５個のアミノ酸の短い疎水性アンカーおよびＣ末端に有力な細胞質疎水性アンカーおよびＣ末端に有力な細胞質親水性領域の欠失を有する。

シグナル配列と疎水性Ｃ末端との間のシスティンの編成は、第３Ｂ図に示されるようにＥＧＦ　１の領域と同様である。ヒトＥＧＦ前駆体およびヒトＬＤＬレセプターのエクソン中のシスティンの位置に基づいて、第３図に示されるように、三つのシスティン残基がコンセンサス配列Ｙ／Ｆ−ｘ−Ｃｘ−Ｃｘ−ｘ−Ｇ−Ｙ／Ｆに先行し、一つがそれに続＜、ＥＣＦ様領域もまた、ドロソフィリア・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌ　ｉａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のノツチ（ｎｏｔｃｈ）およびケノルハデイテイスーＸレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）のｌ　ｉ　ｎ−１２のような無を推動物においても見出される。

本発明は、単細胞生物のタンパク質におけるＥＧＦ様領域の存在を最初に報告するものである０本発明のタンパク質におけるＥＧＦ様領域の存在は、蚊を含む高等生物に成長因子効果を有することを期待し得る。

伍以下の例は、本発明の遺伝子を得るための方法を提供する。この例は、本発明の好ましい態様を示すものである。

プラスモジウム・ファルシパルムのＮＦ３４分離株の３Ｄ７クローンをインビトロで培養して、上記のようにして接合子を調製した。５時間経過の接合子（１０９）のトリトンＸ−１００抽出物からのＰｆｓ２５を、セファロース４Ｂビーズ（ＣｎＢｒ−活性化）に共有結合させたモノクローナル抗体ＩＣ７を用いて免疫アフィニティーで１１ｔｕｂた。Ｐｆｓ２５を、７０％の３６９−メチオニン、２０％の３５８−システィンおよび１０％の他の３５５−化合物を有し、ＩＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、から市販されているｔｒａｎｓＳ　３５で代謝的に標識しておいた。ビーズはＰｆｓ２５を含み、５％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ）リス（ｐＨ６，８）、０．００２％ブロモフェノールブルーおよび８Ｍ尿素を含む５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に再懸濁させた。これらを６８℃で５分閏加熱した。試料緩衝液に溶出されたタンパク質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに非還元条件で載せた。Ｐｆｓ２５はゲル上で同定された唯一の放射性標識タンパク質であり、受動拡散によってゲルから回収された。凍結乾燥させた試料を０＝　５Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８，５）、６Ｍグアニジン塩酸、６４ａ＋Ｍジチオスレイトールを含む０．：３＋ＭＥＤＴＡ緩衝液で再溶解して、３７℃ で２時閏窒素雰囲気下でインキュベートした。ヨードアセトアミドを最終濃度１７４ｍＭになるように加えて、２５℃で１時閉暗所で反応させた。２−メルカプトエタノールの過剰量、次いで１０倍量の無水エタノールを加えた。還元してアルキル化したタンパク質を一２０℃で４時閉沈澱させた。残ったベレットを５０　ＲＩＭ　Ｎ　Ｈ４ＨＣＯ３（ｐＨ７−９）に再懸濁サセテ、各々６時ｒ：ｆｆ３７℃で培養して、各０．５μｇのＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社ｉりで２回消化し、各回３７℃で６時閉インキュベートした。消化を、試料を６５℃で１０分閏加熱することによって終結させた。トリプシンペプチドを、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＲＰ−３００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

ｌ　ｎｃ　、　）上で０．１％のトリフルオロ酢酸で５０％アセトニトリル勾配を用いて分画した。ペプチドミクロ配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、からの４７０Ａ型気相シーケンサ−上で行った。各サイクルの産生物の４０％を、付された１２ＯＡ型ＰＴＨ分析機上で製造者のプログラムＣ３ＲＰＴＨを用いて分析した。一つのペプチドについて、各サイクルの産生物の残りの６０％の放射性活性を決定した。放射性活性ビーク（☆☆☆）を、サイクル番号１．７．１２および１７に見出した。

二重実線で示されるペプチド配列を、高度に同義性をもつオリゴヌクレオチドプローブを構築するために用いた。５１２同義性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）オリゴヌクレオチドのグループは接合子ＲＮＡの１．４ｋｂバンドとハイブリダイズした。プロリンのコドンを変えることによって、プローブを各１２８同義性の四つのグループに分けて、その一つのグループはゲノムＤＮＡの６００ｂｐＤｒａＩ断片だけでなくＲＮＡの１．４ｋｂバンドとハイブリダイズした。λｇｔｌｏのサイズで選択されたＤｒａＩ断片ライブラリーの２０．０００個のプラークを、このオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。一つのクローンを同定して、ブルースクリプトＳＫ　（ｐＳＫＲ２）にサブクローニングした。ｐＳＫＲ２を用いて、ベクターｐＳＰ６４中のサイズで選択されたライブラリーにおいて３．５ｋｂＨｉｎｄｍ断片を同定した。各クローンの両鏡を、ジデオキシヌクレオチドターミネータ−法によって配列決定した。

第２図には、無性および有性期ＲＮＡのノーザンプロット分析が示されている。

全細胞性ＲＮＡ（２０μ８７列）を、ＬＦ４の無性寄生虫（Ｌ）、３Ｄ７の無性寄生虫（Ａ）または５時閏経過の３Ｄ７の接合子（Ｓ）から調製して、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動してからナイロン膜に移した。

フィルターを、無作為に入れたｐＳＫＲ２挿入物（比活性１０９ｃ、ｐ、ｍ、μ ｇ−’）と５５℃で一晩ハイブリダイズさせて、記述のように洗浄した。サイズマーカーは、０．２４〜９．５ｋｂＲＮＡ段階物（１ａｄｄｅｒ、ＢＲＬ製）を用いる。

第３Ａ図は、ＥＧＦ様領域の関連性を強調するように配置されたＰｆｓ２５のタンパク質構造を示している。ボックスは、システィン残基および他の同一のまたは間遠するアミノ酸を表す。第３Ｂ図は、Ｐｆｓ２５．１ｉｎ１２、ノツチ、ＥＧＦおよびヒトＬＤＬレセプターからのＥＧＦ様反復コンセンサス配列を示す。

ボックスは、システィン残基を表す。二重ボックスは、コンセンサス配列の中心部を表す。アルファベット文字は、次のアミノ酸を表す。Ｃ：　ＣｙｓやＤ：Ａｓｐ、Ｅ：Ｇｌｕ、Ｆ：ＰｈｅＳＧ：Ｇｌｙ、Ｉ：１１　ｅ、に：　Ｌｙｓ、Ｌ：　Ｌｅｕ、Ｎ：　Ａｓｎ％Ｔ：Ｔｈｒ、Ｙ：　Ｔｙｒ、ｘ：他のアミノ酸および非特定数のアミノ酸。

ａａｔｔｇｔｔｇｔｇａａａ　ａｇａａａａａａａ　ｃａａａａａａａａａ　ａａａａａａａａａａｃｔｃａｔａ　ｅｅｔｔａｔａ　ｔｔｔ狽狽狽狽≠狽狽モ狽狽狽狽≠≠≠■ ＦＩＧ、　１ＦＩＧ、　２ −４．４四）ＣＪ、（Ｊ（、コ四＝＝＝コロ＝＝＝コ手続補正書（方式）％式％３　補正をする者事件との関係　　　　特許出願人アメリカ合衆国５　補正命令の日付発送日　　平成　３年　１月　２２日６　補正の対象特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人の欄、委任状及び明細言及プ請ｔｚ４ヂ９翻帆友７　補正の内容国際調査報告１即拳肖＾＋Ｉ酎コ【鄭−ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１６１８１＄＋＃ＨＭＪＩ＋８ＰｈＩ−〇−１＋Ｉ＋６内内−レＰＣＴ／ＵＳ８９１０１６１８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ブラスモジウム・ファルシバルムの接合子およびオーキネートの２５ｋＤａ表面タンパク質またはその部分をコードするクローニングされた遺伝子から実質的に成る、ヒトマラリアワクチンを調製するための抗原を発現する、遺伝子。
２．コード領域が下記のヌクレオチドセグメントである、請求項１に記載の遺伝子。【配列があります】
３．該ヌクレオチドセグメントが該接合子およびオーキネートの２５ｋＤａ表面タンパク質をコードし、該表面タンパク質がシグナル配列、疎水性Ｃ末端および四つのタンデム上皮成長因子様領域を有する、請求項２に記載の遺伝子。
４．請求項３に記載の該表面タンパク質を含有する、マラリアワクチン。
５．クローニングされた遺伝子によって産生されるブラスモジウム・ファルシバルムの接合子およびオーキネートの２５ｋＤａ表面タンパク質またはその部分から実質的に成る、ヒトマラリアワクチンを調製するための、合成ペプチド。
６．該表面タンパク質が以下の想定されるアミノ酸部分を有する、請求項５に記載の遺伝子。【配列があります】
７．請求項６に記載の該表面タンパク質から成る、マラリアワクチン。
８．クローニングされた遺伝子によって産生されるブラスモジウム・ファルシバルムの接合子およびオーキネートの２５ｋＤａ表面タンパク質またはその部分から実質的に成り、該タンパク質がより高等な生物に有効な成長因子を提供するのに治癒的に有効な濃度にある、医薬組成物。