JPS61501267A - マラリアワクチンの構造におけるまたは関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリアワクチンの製造におけるまたは関する改良本発明はマラリアワクチン、 該ワクチンに含まれる抗原性物質、およびこのような抗原性物質の製造において 有用な種々の他の物質に関する。

マラリア寄生虫〔プラスモジウムＩ（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍｓｐｐ、）　）は 晴乳動物のホストにおいて複雑な発育パターンを示す。感染は雌の蚊が血液接種 によって覆土を血流に送り込むときから開始し、該覆土は血流から肝臓へ侵入す る。この寄生虫は肝臓内で増殖し、最終的にメロゾイトとして知られている成育 した形態で肝臓から放出され、これによって病気をひきおこす無性生殖赤血球サ イクルが開始される。この寄生虫はメロゾイトとして赤血球細胞に取り込まれる と、トロフ十ゾイト期およびシゾント期を含む種々の段階を経て、ついには血液 細胞を破壊じ、多数の増加したメロゾイトを放出させ、これによってこのサイク ルは永続する。

覆々のマラリア治療薬が開発されているにもかかわらず、マラリアは非常に重要 な医学上の問題をもたらす、特にヒトのマラリアの原因である４種類のプラスモ ジウム種の場合がそうである。プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ　ｌａｓｍ ｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は最も高い罹患率と死亡率をも乙らす種で あると共に、好ましい治療剤クロロキンに対する耐性の点で最も問題となる種で ある。マラリアワクチンの開発のために多くの研究がなされているが、成功例は ほとんどない。この原因は主として、覆土期および種々のエリスロサイト期を含 む寄生虫の複雑なライフサイクルによる。

最近の信頼すべき論文〔コックス（ＣＯＸ）、ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ） 、１９８３年、第３０４巻、第１３頁〕に記載されている次のような見解は一般 に受け入れられているものである。即ち、マラリア寄生虫のイントラーエリスロ サイト期と覆土表面は免疫学的に異なっており、効果的なワクチンは抗原の複雑 なカクテルに基づくことが必要である。寄生虫の覆土期に対して抗体を供給し得 る適当な抗原性物質の製造には特殊な問題が付随する。

本発明者は、一般的に受け入れられているこの見解が誤ったものであり、寄生虫 のイントラーエリスロサイト期と種虫表面が共通の抗体と反応する共通の抗原を 保有することを見出した。この知見は、寄生虫のライフサイクルの著しく異なっ た２つの段階に対して反応性のある抗体を発生させる抗原性物質を調製できるこ とを意味するので特に重要である。このような抗原性物質は寄生虫のイントラー エリスロサイト期で存在する抗原に基づくのが育利であり、これによって寄生虫 のイントラーエリスロサイト形聾に対するワクチン接種において高レベルの効能 が得られ、同時に覆土表面に対して活性を有する抗体が誘発される。

従って本発明には、プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態 と関連して天然に存在するエピトープを含有し、かつ寄生虫のイントラーエリス ロサイト形聾と覆土表面の両方に対して反応性を有する抗体を生体内投与におい て発生する抗原性物質が含まれる。

寄生虫のイントラーエリスロサイトと関連して天然に存在するエピトープは覆土 の表面に分有（ｓｈａｒｅ）される。何故ならば、寄生虫のイントラーエリスロ サイト期と覆土表面の両方は、共通の抗体サイトと反応性を育するエピトープ、 もしくはバラトープを含有する抗原を保有するからである。しかしながら、この ことは、アミノ酸残基構成要素のシーケンスで表されるエピトープが覆土表面と 寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に同一の形態で存在することを必ずしも 意味するものではなく、むしろ、エピトープ中に存在する特定のアミノ酸残基が 各々の場合において共通の抗体サイトに対して特異的な反応性を有することを意 味する。イントラーエリスロサイト期のエピトープと種虫のエピトープは、両者 が完全に同一でなくても同一の活性を分は合う。さらに、エピトープを構成する アミノ酸残基が連続的もしくは非連続的なシーケンスであってもよいことが認め られるであろう。

従って本発明にはさらに、プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイ ト形態と関連して天然に存在する抗原中に存在し、かっ覆土表面に分有されるエ ピトープに対応するアミノ酸残基シーケンスを含有する、マラリアに対するワク チン接種に使用するのに適した抗原性物質が含まれる。

寄生虫のイントラーエリスロサイトと関連して発生するエピトープは本発明によ る抗原性物質を特徴づけるものであり、プラスモジウムの種々の種、特にヒトに 寄生する種、例えばプラスモジウム・ビバックス（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉａｍ　ｖ い象１−）、プラスモジウム・オバーレ（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ａ＋ａｌａｒｉａ ｅ）および特にプラスモジウム・ファルシパルムにおいて発生してもよいが、他 の浦乳類に寄生する種において発生してもよい。エピトープの詳細な構造は種に よって異なっていてもよく、また同一種でも菌株（ｓｔｒａｉｎ）によって異な っていてもよいが、このようなエピトープを含有する天然に存在するイントラー エリスロサイト期抗原はきわめて密接した類似の物質群を構成すると考えられる 。従って、例えば、天然に存在するイントラーエリスロサイト寄生虫抗原の各々 の分子量は２０，０００〜２５，０００ダルトンというきわめて狭い範囲内のも のである。本明細書で使用する分子量は特にことわらない限り、標準分子量マー カーを使用する・ラジウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ）によって測定したものである〔レムリ　（Ｌ ａｅＩＩ＋ｍ１ｉ）、ネイチャー、１９７０年、第２２７巻、第６８０頁参照〕 。

本発明は、天然から単離されるものであろうと、合成的に製造されるものであろ うと、自然に発生するこのような抗原に限定されるものではなく、天然抗原のい ずれかに含まれるエピトープを含有し、異なっｆ二分子量を有する人口的に製造 される物質にも及ぶものである。このような人口的に製造される物質は天然抗原 または合成的に製造されたものから誘導される。しかしながら、以下に述べる理 由により、分子量が２０゜０００〜２５，０００ダルトン、例えば２２．０００ 〜２４．０００ダルトンの天然品および合成品のいずれら特定の利点を有してい るので特に重要である。

本発明にはさらに、（１）プラスモジウム属寄生虫のイントラーエリスロサイト 形態と関連して全体もしくは一部が天然に存在するアミノ酸シーケンスを含み、 （２）寄生虫の覆土期に存在する抗原に分有されるエピトープを保有することを 特徴とする、マラリアに対するワクチン接種用に適した抗原性物質が含まれる。

本発明による抗原性物質はエピトープのこの１つの特定の形感によって特徴づけ られるものであるが、さらに池のエピトープも含んでいてもよい。

以上の記載から明らかなように、プラスモジウム・ファルシパルム種によっても たらされるマラリアをより効果的にコントロールすることも特に重要な目的であ り、本発明の特に重要な特徴は、プラスモジウム・ファルシパルムの多くの覆の 特定のイントラーエリスロサイト期における寄生虫に関連したエピトープの同定 に由来するもので、該エピトープはこのようなプラスモジウム・ファルシパルム 種虫の表面に存在するエピトープと共通の反応性を有する。このイントラーエリ スロサイト期のエピトープをｒ５．１−ＩＪとして表示するが、簡単のために、 本明細書の以下の種々の個所においてこの表示法を用いる。このエピトープはプ ラスモジウム・ファルシパルム寄生虫に対して生ずるモノクローナル抗体の使用 によって同定されるもので、該モノクローナル抗体は今まで調製されたマラリア 寄生虫のイントラーエリスロサイト期に対する他のいずトラーエリスロサイト期 と覆虫表面と両方に対する結合能を有する。このような特異性を有するモノクロ ーナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製に含まれる技術は、現在では周知の ハイブリドーマ分野における常套の技術である。種々のマラリア抗原に対して反 応性を有するモノクローナル抗体を調製するこれらの常套の技術を使用する報告 が文献に含まれている。次に挙げる２つの論文は、イントラーエリスロサイト期 の抗原に対して反応性を有するこのようなモノクローナル抗体に関するもので、 以下に述べるハイブリドーマ５．１弓と密接に関連したハイブリドーマ５．１に よって生産される抗体も含まれる：マクブライドら（Ｍｃ−Ｂｒｉｄｅ　ｅｔ　 ａｌ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８２年。

第２１７巻、第２５５頁：ホールら（Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ）。

モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラシトロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐａｒａｓｔｔｏｌｏｇｙ）。

１９８３年、第７巻、東２４７頁。

しかしながら、これらの２つの論文に開示されている５、１ハイブリドーマによ って生産される抗体の特性に、イントラーエリスロサイト期の抗原だけでなく、 覆土に対しても反応があるということはこれらの論文には言及されていない。さ らに、免疫沈降反応データを提供するホールらの論文に記載されている、５．１ ハイブリド一マ抗体が反応するＩＩ！−標識蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、 これらの抗体を分子量１６０１６０および３５キロダルトンの蛋白質および時に は分子量９３キロダルトンの蛋白質と再現性よく反応するものとして同定した点 で誤っている。反対に、実施例７に示す、より特異的で再現性のあるウェスタン ・プロＺ＋ティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）データは、５．１− １エピトープ−特異抗体が、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が２３キロダルト ンの天然の蛋白質との反応によって特徴づけられることを示す。従って、これら の論文によって提供される情報は、該論文に記載されているハイブリドーマ５． １を繰り返して生産するのには不十分である。さらにこれらの論文には、５．１ ハイブリドーマが特に重要な反応性を存する抗体を生産するということは何んら 示唆されていない。

本発明は、プラスモジウム寄生虫のイントラーエリスロサイト期の抗原中に存在 するエピトープだけでなく、対応するプラスモジウム種虫の表面に存在するエピ トープとも反応性を有するモノクローナル抗体が得られるという従来は全く予想 されなかった知見に基づくものである。このようなイントラーエリスロサイト期 のエピトープの存在が確認され・、プラスモジウム・ファルシパルムのエピトー プ５．１−１の場合において例証されると、当該分野に従来から存在する技術を 用いて、このようなエピトープに対するモノクローナル抗体を分泌する種々のハ イブリドーマを生産してもよい。特にここでは５．１−１エピトープに対して反 応性を有するモノクローナル抗体を生産する５、ｉｌで表示される１種のハイブ リドーマを利用したが、類似の反応性を有するモノクローナル抗体を生産する広 範囲のハイブリドーマも、５．１１エピトープの存在が確認されるならば常套の 技術によって生産してもよい。

ハイブリドーマセルライン５．ｉｌを生産するのに使用する手順を利用して、５ ．１−１エピトープと反応性を有するモノクローナル抗体を分泌する別のハイブ リドーマを生産してもよく、この手順には、血液から得みれたプラスモジウム・ ファルシパルム寄生虫を用いて免疫処置されたＢａ１ｂ／ｃマウスからの膵臓細 胞とＮ５−１／１−Ａｇ４−１（ＮＳｉ）骨髄腫細胞との間の融合も含まれる〔 コーラ−ら（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ヨーロピアン―ジャーナルｅオプ・ イムノロジー（Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎＪ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）、　１９７６年、第６巻、第２９２頁参照〕。この手順は以下の実施例 １において詳述する。Ｓ、ｔ−ｔハイブリドーマとは別のハイブリドーマによっ て生産される抗体に対するエピトープ特異性に関する類似性は、覆土、および天 然の５．１−１エピトープ含有抗原性物質に関して本明細書に記載した特性を有 する血液誘導抗原性物質の両方に対する反応性によって決定してもよい。従って 覆土との反応性は例えば実施例３に記載のように、間接免疫蛍光法により、空気 乾燥もしくはゲルタールアルデヒド固定した覆土への染色性能によって調べても よい。分子量が２０．０００〜２５，０００ダルトンの適当なタイプの血液誘導 抗原性物質（５、１−１エピトープの分子量は２３．０００ダルトン）との反応 性は例えば実施例４に記載のようにして調べてもよい。

エピトープ５．ｉｌに対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリド ーマが調製されたならば、所望により該ハイブリドーマを類似のエピトープ特異 性を有する別のハイブリドーマの調製に利用してもよい。このような別のハイブ リドーマによって生産される５、ｉｌエピトープに対して特異的なモノクローナ ル抗体は抗原性物質の単離あるいは別の目的、例えばアジュバント特性との関係 で有用である。このような別のハイブリドーマは例えば、既存のハイブリドーマ 、例えば５．ｉｌハイブリドーマによって生産された抗体を用いて精製された５ 、ｉｌエピトープを含有する抗原性物質を用いて免疫処置されたＰａｔｈ／ｃマ ウスの膵臓細胞の融合によって得てもよく、適当な一つの方法は実施例５に記載 の５．ｉｌ−セファローズ免疫吸着剤を用いる方法である。ハイブリドーマ５． １１から分泌される抗体と同一の抗原結合サイトを有しかつ異なった重鎖アイソ タイプを存する抗体を分泌するハイブリドーマは、ハイブリドーマ５．１１がら 例えばダンフら（Ｄａｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ）の論文〔シトメトリー（Ｃｙ−ｔｏ ｍｅｔｒｙ）、　１９８２年、第２巻、第３９５頁〕またはオイら（Ｏｉ　ｅｔ 　ａｌ）の論文〔ネイチ＋−、１９８４年。

第３０７巻、第１３６頁〕に記載のような蛍光活性細胞ソーターを用いることに よる変異体細胞（ｓｏｍａｔｆｃｖａｒｉａｎｔ　ｃｅｌｌｓ）に対するスクリ ーニングおよびその後の単離によって調製してもよい。このような別のハイブリ ドーマによって生産される抗体のエピトープ特異性の類似性は前述の方法によっ て確認してもよい。特に重要なハイブリドーマ５．１−１の変異体はアイソタイ プ（重ｔａ）変異体である。

５、ｉｌエピトープとは異なったエピトープであって、プラスモジウムの別の菌 株もしくは種におけるイントラーエリスロサイト期の抗原中に存在するエピトー プに対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマセルラインは、エピトープ５ ．１−１に対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマと類似の関係において 有用である。特にこのようなハイブリドーマは、５゜１−１エピトープ以外のエ ピトープであって、覆土表面に分有されるエピトープを含有する別の抗原性物質 の生産において有用である。このような分有されたエピトープが存在するという 本発明者の知見によれば、イントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特 異的な抗体を生産するハイブリドーマは、エピトープ５．１１に対して特異的な 抗体を分泌するハイブリドーマの調製に関して述べた技術と類似の技術によって 調製してもよい。但し、この場合には免疫化剤として、５、ｉｌエピトープとは 異なったエピトープを含有するプラスモジウムの別の菌株もしくは種を使用する 。

特に、融合用の適当な免疫細胞は、サイズ範囲が上述のような２０，０００〜２ ５，０００ダルトンであるＳＤＳ精製寄生虫蛋白質を用いる免疫化によって生産 してもよく、また、所望のハイブリドーマは、該ハイブリドーマがこのような抗 原および覆土と共に生産するモノクローナル抗体の反応性によって選択してもよ い。

従って本発明には、プラスモノラム寄生虫のイントラーエリスロサイト期に存在 しかっ覆土表面に分有されるエピトープに対して特異的な抗体を生産するハイブ リドーマセルライン、およびこのような抗体自体も含まれる。特に本発明には、 ここで述べたようなエピトープ５．１１に対して特異的な抗体を生産するノ）イ ブリドーマセルライン、例えばハイブリドーマセルライン５．１川、およびこの ような抗体自体も含まれる。

このようなハイブリドーマは実質上純粋なフオーム、即ち異なった特異性の抗体 を生産する他のハイブリドーマを実質上含まないフオームのものが好ましい。ま た抗体自体も実質上純粋なフオーム、即ち異なった特異性の抗体を実質上含まな いフオームのものが好ましい。

エピトープ５．１１に対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマを例証する ハイブリドーマセルライン５．１−１は１９８４年１０月１日に、イングランド 。

ソールズベリー、ポートンダウンにあるフルス・センター・フォー・アプライド ・マイクロバイオ口、ジー・アンド・リサーチ（Ｐ　ＨＬ　Ｓ　Ｃｅｎｔｒｅ　 ｆｏｒ　Ａ　ｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｌｏｇ）’　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）のナショナル・コレクシタン・才ブ・アニマル・セル・カルチャー（Ｎａｔ ｉｏ−ｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅｓ）に受入れ番号８４０９１８０１として寄託された。

セルライン５．１−１の一般的な特性に関しては、特に該セルラインが誘導され ろＮＳ川用髄腫と比較して以下に述べる。セルライン５．１刊はＨＡＴ培地（即 ち、例えば実施例１に記載のようにして、ヒポキサンチン１３．６１ス９／Ｑ１ アミノプリテン０．１７６腐９．Ｑおよびチミジン３．８８．ｖ９／ｇを添加し た補充培地）内において生長し、マウス［ｇＧｌを分泌する。非選択培地（即ち 、ＨＡＴ培地もしくはこれに類似する培地でない培地）における該セルラインの アピアランスおよび生長特性はＮ　Ｓ　−１骨髄腫セルラインのそれらと類似す る。

本発明によるハイブリドーマからの抗体の生産およびそれらの利用、特に抗原性 物質の生産における利用に関する以下の説明は、簡単にするｒこめに、エピトー プ５．１−１に対して特異的な抗体および該エピトープを含有する抗原性物質の 生産についておこなう。しかしながら、一般的な用語を用いる説明も同様にして 、５．１−１のような他のイントラーエリスロサイト期のエピトープであって覆 土とエピトープを分有する他のエピトープに対して特異的な抗体およびこのよう な池のエピトープを含有する抗原性物質の生産に適用できる。

前述のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的な抗体を 分泌するハイブリドーマ、例えばハイブリドーマセルライン５．１−１は、種々 の形格の栄養培地内で生長させることによって保存してもよい。従って本発明に は、前述のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的な抗 体を分泌するハイブリドーマの細胞を含有する細胞培養系、例えばハイブリドー マセルライン５．１−１を該セルライン用の栄養培地に含む系も含まれる。この ような保存細胞培養系は生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）のものが便利であり、この ような培地は実質上合成培地であるが、もちろん血清のような天然源から得られ る成分を含んでいてもよい。このような培地としては血清サブルメント、例えば 牛の胎児血清を１０〜２０％ｖ／ｖ、例えば１０〜１５％ｖ／ｖ含有するＲＰＭ Ｉ１６４０が例示される。あるいは、血清濃度をこれらの値よりも低くするよう に細胞を調整するか、もしくは血清を含有しないイスコブ・モディフィケーショ ン（Ｉ　ｓｃｏｖｅｍｏｄｉｆ　１ｃａｔｉｏｎ）を利用してもよい〔イスコブ およびメルカー（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル ・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉａｉ ｎｓ）、　１９７８年、第１４７巻、第９２３頁〕。

培地には抗生物質サブルメント、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンを 使用するのが好ましい。他のサブルメント、例えばピルビン酸ナトリウムおよび グルタミン等の使用も好ましい。ＲＰＭ１１６４０の代わりに、細胞培養に一般 的に使用されている培地や当該分野の文献に記載されている種々の他の培地、例 えば血清サブルメントを含有するイーグル最小必須培地のドゥルベッコ（Ｄ　ｕ ｌｂｅｃｃｏ）のモディフィケーション等を使用してもよい。静的なｗｉ胞培養 物は２４〜７２時間ごとに新鮮な培地で希釈することによって２〜６　ｘ　１０ 　’ｃｅｌｌｓ／Ｊの密度に保存するのが便利であり、十分な細胞が発生したと きに採取をおこなう。例えばセルライン５．１−１は静的培養において少なくと も２力月間は安定に生長することが判明したが、組織培養における生長を長期間 にわたって持続させる場合にはハイブリドーマ細胞を周期的に再クローン化する （ｒｅ−ｃｌｏｎｅ）のが望ましい。５．１−１ハイブリドーマ細胞は液体窒素 中において良好な保存安定性を示す。

前記のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的な抗体を 分泌するハイブリドーマ、例えばハイブリドーマセルライン５１−１による抗体 の生産は生体外培地もしくは生体内培地内での培養によっておこなってもよい。

従って本発明には、ＦＪ記のイントラーエリスロサイト期のエピトープ龜対して 特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞、例えばハイブリドーマセルライン ５．１−１を生体外培地もしくは生体内培地内で培養させ、次いで該培地から抗 体を分離することを含む抗体生産方法が含まれる。

生体外法を選択するか、生体内法を選択するかは種々のファクターに依存する。

抗体を必要とする用途が化学的というよりも免疫学的な用途であり動物体内での 増殖からのマウスもしくは他の動物のイムノグロブリン汚染物の存在が望ましく ない場合には生体外培養が望ましい。しかしながら、生体内培養は、生体外培養 に比べてｌｌＱあたり非常に高濃度の抗体が一般に得られるという利点がある（ 血清および／または腹水中）。

生体内培養はマウス、特にＢａ１ｂ／ｃマウスの体内でおこなうのが好ましいが 、マウスの他の種族もしくは他の動物、例えばラットの体内において、照射およ び／または免疫反応抑制剤を用いておこなってもよい。

抗体を生体外系で生産する場合、使用する培地は細胞保存培養系に関連して先に 述べｆこ培地と同様のものを使用すればよいが、血清濃度はできるだけ低く、例 えば５〜１０％Ｖ／Ｖにするのか好ましい。あるいは、モディフィケーノヨンの ないイスコブ血清の使用を考慮してもよい。

抗体を生産する適当な組織培養法としては、スピナー・コンテナ内での大規模な 培養法および当該分野で周知の大規模な培養法が例示される。生体内法には同系 交配のＢａ１ｂ／ｃマウスの腹膜的接種によって固体状腫瘍もしくは腹水腫瘍を 生じさせることか含まれる。

接種前に、ブリスタンのような薬剤を用いて被処理動物の免疫反応を抑制して腹 水の分泌を誘発させてもよい。腫瘍を適当を期間増殖させた後、所望により、腹 水腫瘍の場合は生きた動物から腹水を捕集した後、該動物を殺して腹水および／ または血清を採取して抗体を単離する。腹水腫瘍は多量の流体を提供するが、こ の技術の価値は腹水および／または血清中に存在する抗体の濃度に左右される。

生体外法もしくは生体内法によって得られる抗体の単離は、沈殿、透析、免疫吸 着剤の使用を含むクロマトグラフィー、および膜フィルターの使用を含む当該分 野の文献に記載された方法によっておこなうのが便利である。

従って本発明には、前記のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対 して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞、例えばハイブリドーマセルラ イン５．ｉｌを動物、特にマウスに接種して固体状らしくは腹水腫瘍を該動物体 内で増殖さけ、次いで該動物の血清および／または腹水から抗体を単離すること を含む、モノクローナル抗体の生産方法が含まれる。

前述のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的な抗体を 分泌するハイブリドーマ、例えばハイブリドーマセルラインｓ、ｉ−ｔによって 生産されるモノクローナル抗体は、マラリア寄生虫のイントラーエリスロサイト 期に対して生ずるモノクローナル抗体の中では、覆土製剤に対して強い陽性反応 を示すという異常な特性を有する。従って、ハイブリドーマセルラインｉ５．１ −１の場合は、抗体含有腹水の希釈度がｌ／１０８のこのような製剤を用いても 活性がみられたが、イントラーエリスロサイト期に対して生じた種々の池のモノ クローナル抗体は希釈度が１／１０２のときでも覆土と反応しなかった。エピト ープ５゜ｉｔに対して特異的な抗体は、異なり７こ領域からのプラスモジウム・ ファルシパルム単離物のすべてではないが、大部分の場合、イントラーエリスロ サイト期に対して同様の高活性を示す。空気乾燥覆土およびグルタルアルデヒド 固定覆土のいずれもこのようなモノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光法によ って染色される。後者の調製法は抗体を表面デテルミナントに結合させるだけな ので、５．１−１エピトープに対して特異的な抗体を示す鮮明な顕微鏡イメージ は、抗体が結合すエピトープが覆土表面に存在するという宵力な証拠である。対 照的に、イントラー二すスロサイト寄生虫の間接免疫蛍光法によって、エピトー プが寄生虫および／または寄生虫保有空胞膜並びに寄生虫から誘導される感染赤 血球中のイングルージョン（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）と連合することが示されｆ こ。しかしながら、このようなことが起こる場合、通常は感染赤血球の表面とは 連合しない。

藺述のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的な抗体を 分泌するハイブリドーマ、例えばハイブリドーマセルライン５．１何から得られ るモノクローナル抗体は免疫診断剤として極めて重要である。イントラーエリス ロサイト期のものと反応した５、ｉ−ｔエピトープに対して特異的な抗体の免疫 蛍光パターンによって、天然に存在する５、ｉｌエピトープ含含有原（このよう な抗原は広範囲の生化学的研究から寄生虫内で合成されることが知られている） が寄生虫保有空胞へ移送され、従ってホストの赤血球のシトツルを通ることが示 されｒこ。５１−１エピトープを含有する天然抗原は寄生虫が寄生した赤血球に よって分泌され、さらに、この抗原は侵入する覆土によって放出される。この現 象は、多くの抗体が５．１−１エピトープ含有抗原に対するヒトの免疫血清中に 見出されるということと矛盾しない。従って、Ｓ、１−ｔエピトープに対して特 異的な抗体と共に循環する抗原の検出は、例えばＥＬＩＳＡによる初期診断に対 するルートを提供する。診断試薬として使用する場合、抗体は適当な希釈剤もし くはキャリヤー、例えば燐酸塩緩衝剤で処理した生理食塩水中で通常は配合され る。従って本発明には、前述のようなイントラー二すスロサイト期のエピトープ に対して特異的なモノクローナル抗体、例えばハイブリドーマセルライン５．１ −１によって分泌される抗体および生理学的に許容され得る希釈剤もしくはキャ リヤーを含有する組成物が含まれる。

その他の可能な用途には、このような組成物形容の抗体を受動免疫化に用いる場 合（もつとも抗原性物質を用いる能動免疫化が好ましい）、および特定のアイソ タイプの抗体をこのような組成物の形態で用いて、以下に説明するように、アジ ュバント効果を発揮させる場合が含まれる。

しかしながら、前述のようなイントラーエリスロサイト期のエピトープに対して 特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ、例えばハイブリドーマセルライン５゜ １川から得られるモノクローナル抗体の主要な用途は、該抗体が特異的なエピト ープを含有する抗原性物質の調製である。モノクローナル抗体は２つの主要な方 法によって該エピトープを含有する抗原性物質の調製に使用してもよい。第一に 、抗体は天然から得られるこのような抗原性物質の調製に使用してもよい。抗体 の所望の物質の検出のみに使用してもよいし、またその単離および／または精製 に使用するのがより効果的である。従って一つの特別な観点によれば、本発明に は、（１）２０．（ＩＱＯ〜２５．ＧＯＱダルトン、例えば２２゜０００〜２４ ，０００ダルトンの分子量を存し、（２）寄生虫のイントラーエリスロサイト形 態と関連して天然に発生しおよび（３）寄生虫の覆土期に存在する抗原性物質を 分有するエピトープを保有することを特徴とする、プラスモジウム属寄生虫の免 疫原性蛋白質抗原である抗原性物質、あるいは、該エピトープに対応するアミノ 酸残基を含むアミノ酸残基シーケンスの全部もしくは一部を有する、該抗原性物 質から誘導される抗原性物質が含まれる。

５．１−１エピトープに対して特異的な抗体およびプラスモジウム・ファルシパ ルム単離物（タイ国産、に１）を用いることによって、５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て評価された分子量が２３，０００ダルトン（この測定法の精度範囲：２２，０ ００〜２４．０００ダルトン）である天然に存在する抗原性物質を同定すること が可能である。分子量の測定はレムリの論文（ネイチャー、１９７０年、第２２ ７巻、第６８Ｇ頁）に記載の方法によっておこなった。従って先に述べた抗原性 物質には特に、分子量が２３，０００ダルトンであり、寄生虫の覆土期に存在す る抗原性物質を分有するエピトープを含有するプラスモジウム・ファルシパルム から誘導される抗原性物質が含まれる。

このような抗原性物質は、抗原を高濃度で含有する寄生虫の色素含有成熟イント ラーエリスロサイト期のものを実質的な割合で含有する赤血球製剤を用いて、プ ラスモジウム・ファルシパルム感染赤血球を開裂させることによって得るのが便 利で、該抗原性物質はトロフォゾイトおよびシゾントに最、も富む。開裂後、放 出された寄生虫から蛋白質を抽出し、分離させ、目的物は、５．１−１エピトー プに対して特異的な抗体を用いて分離された蛋白質のなかから検出するのが便利 である。赤血球の開裂は例えば４℃でサポニンを約０゜１％の濃度で用いておこ ない、次いで界面活性剤、例えばＳＤＳのようなイオン性界面活性剤を用いて抽 出してもよい。蛋白質の分離は５ＤＳ−ＰＡＧＥによっンブロツティングをおこ なうのが便利である。分子量７り＜２３，０００ダルトンの抗原性物質は、５． １−１エピトープに対して特異的な抗体を用いるＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって単一 バンドとして同定される。

分子量が２３，０００ダルトンの抗原性物質はニトロセルロースから容易に単離 されないので、５．１−１エピトープに対して特異的な抗体を含む親和性クロマ トグラフィー法を利用して、５．１−１エピトープ含有抗原性物質の単離をおこ なうのが好ましい。しかしながら、このような方法によっては、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ法によって測定される分子量が２３．０００ダルトンではなくて２２，０００ ダルトン（この測定法の精度範囲＋２．１．ＯＯＱ〜２３，０００ダルトン）の 抗原性物質が得られろことが見出されたが、明らかにこれは精製段階におけるあ る程度の特異的な開裂に起因する。従って、前述の抗原性物質には、プラスモジ ウム・ファルシパルムから誘導可能な分子ｆｆ１２２，０００ダルトンの抗原性 物質であって、寄生虫の覆土期に存在する抗原性物質に分有されるエピトープを 含有する抗原性物質が特に含まれる。分子量が２０．．０００〜２５，０００ダ ルトンで、エピトープ５．１−１とは異なったエピトープを含有する他の天然に 存在する抗原性物質も幾分低分子量の類似の誘導生成物をもたらすことが予期５ ．１−１エピトープに対して特異的な抗体を担持物質に付着させて、抗原性物質 が接触する不動化固相を得るのが便利である。従って本発明には、固体状担持物 質上に不動化された不溶化形態であって、前述のような分有されたエピトープに 対して特異的なモノクローナル抗体、例えばハイプリドーマ５．ｉｌによって分 泌されるようなエピトープ５．１−１に対して特異的な抗体が含まれる。

固体相は免疫吸着剤のベースとして遺した種々のポリマー物質をいずれかの形態 で含んでいてもよい。このような物質は蛋白質のゲル濾過クロマトグラフィーに 関連する文献に開示されており、デキストラン、寒天もしくはアガロースを基礎 とする炭水化物およびポリアクリルアミドを基礎とする物質が含まれ、架橋をお こなって分子の大きさと形状に応じた所望の分子排除度を付与するのが便利であ る。このような物質としては市販のアガロースを基礎とするセファロース（Ｓ　 ｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストランを基礎とするセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａ ｄｅｘ）およびアリルデキストランを基礎としてアクリルアミド誘導体で架橋さ れたセファクリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ）が例示される。セファロース４Ｂの 商品名で市販されているアガロース物質は好適な例の一つである。抗体は、親和 性クロマトグラフィーにおいて使用する不溶性固体相に蛋白質もしくはその他の 物質を付着させる種々の文献記載法のいずれかによって担持物質に付着させても よい。文献記載の化学反応によって共有結合付着がもたらされるが、非変性法を 用いることによって不安定な付着物質の破壊は最小限にすることができる。適当 な結合剤には１，４−ビス−（２゜３−エポキシプロボキシ）−ブタン型の結合 剤、特に臭のような非誘導化（ｎｏｎ−ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ）担持物質の使 用に対して適している。あるいは、反応性官能基を有する種々の誘導化担持物質 を、それらの特性に応じて別の架橋剤の存在下らしくは不存在下に使用してもよ い。

例えば、ファーマシア社（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａ）から市販されているＣＮＢ ｒ−活性化セファロース４．８は特に有用である。

親和性クロマトグラフィー精製法の場合、感染赤血球は好適な原料物質を提供し 、この場合、赤血球の開裂と寄生虫の蛋白質抽出は、過度の蛋白質分解や変性を 回避する適当な界面活性剤含有媒体と接触さ°せることによって簡単におこなう ことができる。界面活性剤としては非イオン性洗剤が好ましく、例えば誘導化エ チレンオキシド縮合物型のものが挙げられ、オクチルフェノールエチレンオキシ ド縮合物であるノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ　４０が特に重要であり、その 適当な濃度は通常０．０１〜５％ｖ／ｖ、例えば１％ｖ／ｖである。

適当な媒体は２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン１．３−ジオールヒド ロクロリド（トリス−ＨＣｅ）５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８，０）、エチレンジアミ ンＮ　、　Ｎ　’−テトラアセテート（ＥＤＴＡ）５ｍＭ、エチレングリコール ビス−（アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ’−テトラアセテート（ＥＤＴＡ）５ｍ Ｍ、ヨードアセトアミド５ｍＭ、フェニルメチルスルフォニルフルオライド１ｍ Ｍおよびトシル−し−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）０．１ｍＭから成 り、ノニデットＰ４０を１％ｖ／ｖ含有する。蛋白質抽出物は親和性クロマトグ ラフィーカラムに付して処理して所望の蛋白質を精製形態で得る。このような処 理には特異的に結合しない蛋白質を例えば先に使用した緩衝液と同様の緩衝ｅ、 （但し、界面活性剤を含有せず）を用いて洗浄除去し、次いでカラム上でのコン プレックスを崩壊させる試薬を用いて特異的に結合した蛋白質を溶離させる操作 が含まれる。蛋白質の免疫原性を保護する適当な条件には、尿素を例えば８Ｍの 濃度で使用することが含まれる。溶出液から蛋白質を回収する適当な方法には濃 縮と透析か含まれる。

従って本発明には、プラスモジウム寓寄生虫のイントラーエリスロサイト形態と 共に天然に存在する抗原中に存在するアミノ酸残基シーケンスであって覆土表面 に分有されるエピトープに対応するシーケンスを有する抗原性物質もしくはその 前駆体を、該イントラーエリスロサイト期のエピトープに対して特異的なモノク ローナル抗体を保有する面体状担持物質に吸収させ、次いで該支持物質から抗原 性物質を溶出させることを含む、マラリアに対するワクチン接種に使用するのに 適した該抗原性物質の製造方法が含まれる。

分子量が２３．０００および２２，０００ダルトンの抗原性物質についてさらに 説明するが、これらの物質に関して述べる特性のいずれかもしくはこれらの組合 わせは、航述の特性のほかに、これらの物質の特性化に関して得られる。

両方の物質は蛋白質性、即ち必ずしも排他的というわけではないが、実質上蛋白 質の形態である。５．１−１エピトープは必ずしもこれらの物質に含有される唯 一のエピトープではないが、それらの第一級アミノ酸シーケンス中に存在し、そ の発生に対してポスト翻訳プロセブシング（ｐｏｓｔ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を必要としない。このこ７とは、ラビットの網赤 血球溶解物によって生体外で作られた一次翻訳生成物が以下に説明するように５ ．１−１エピトープに対して特異的な抗体によって免疫吸着されるという事実に よって示される。これらの物質は寄生虫によってコード化されており、以下に述 べるように、（ａ）　”　Ｓ−メチオニンを用いる生きた寄生虫内での代謝ラベ リングおよび（ｂ）プラスモジウム・ファルシパルムの全ｍＲＮＡの生体外翻訳 による３５Ｓ−メチオニンを含んでいる。分子量２３．０００ダルトンの抗原性 物質はプラスモジウム・ファルシパルムのエリスロサイトサイクルを通して、合 成される全蛋白質の約０．１％として合成されるが、サイクルの最後において、 成熟ンゾントの崩壊後、寄生虫から消失するが、退化したものと考えられる。こ の物質は細胞サイクルを通して蓄積され、エリスロサイトサイクルの末期（成熟 したトロフォゾイトおよびシゾント）においてのみ、５．１−１エピトープに対 して特異的な抗体を用いるウェスタンプロットの免疫検出法および免疫蛍光法に よって検出可能な濃度で存在する。これらの物質は風土病の流行する地域に生活 する住民の血清に強く認められるもので、このことは５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ エスタンブロツテングによってこのような血清を調べると該物質が検出されるこ とによって証明される。５．１−１エピトープを含有するより低分子量の種々の 他の抗原性物質も、本然に存在する分子ｆｉ２３，０００ダルトンの抗原性物質 の処理によって調製してもよい。さらに以下に述べるように、５．１−１エピト ープもしくは他のこのようなエピトープを含有する抗原性物質を蛋白質のような キャリヤーに付着させて、それらの免疫原性を高めることが望ましい場合がしば しばあり、これによって天然に存在する物質よりも高分子量の物質を調製しても よい。従って、前述の分子量が２０，０００〜２５，０００ダルトンのものは好 ましいものであるが、本発明による抗原性物質のサイズはさらに広範囲に及ぶも のである。

５．１−１エピトープ含有抗原性物質の調製に、５．１−１エピトープに対して 特異的な抗体を使用する第２の方法には、エピトープを含有するペプチドもしく は蛋白質を合成するための遺伝子工学的手法の利用が含まれる。従って、１つの 特別な観点によれば、本発明には（１）プラスモジウム属の寄生虫のイントラー エリスロサイト形態に関連して全体もしくは一部が天然の抗原中に存在するアミ ノ酸シーケンスを含有し、（２）該寄生虫の覆土期に存在する抗原に分有される エピトープを保有することを特徴とする、免疫原性の合成ペプチドらしくは蛋白 質である抗原性物質が含まれる。

遺伝子工学的手法を用いる一つのアプローチには、プラスモジウム・ファルシパ ルムのｍＲＮＡの使用が含まれ、ラビットの網赤血球抽出物中でのｍＲＮ　Ａお よびその翻訳はベルハム（Ｐ　ｅｌｈａｍ）とジャックソン（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ ）の方法によっておこなう〔ヨーロピアン・ジャーナル・才ブ・バイオケミスト リー（Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎＪ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ）、　１９７６年、第６７巻。

第２４７頁参照〕。この方法によらて得られる生成物は、生体内で製造された生 成物を特に５．１司抗体親和性クロマトグラフィーを用いて処理する場合と同様 にして処理してもよい。この場合、親和性クロマトグラフィー法によって、分子 量が２４，５００ダルトン（この方法による測定精度：２３，５００〜２５，５ ００ダルトン）の物質が得られる。この物質は生体内で処理されて分子量が２３ ，０００の物質にならなければならない。ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳によって処理もし くは修正されない蛋白質か得られることが知られているので、５゜１−１１相性 クロマトグラフイーカラムに分子量２４゜５００ダルトンの蛋白質が特異的に結 合するということは、エピトープ含有抗原性物質の第−吸アミノ酸シーケンスに よってエピトープが決定されることを示す。

遺伝子工学的手法を用いる第２のアプローチは、前述の天然に存在するアミノ酸 シーケンスの残基に対応するｃＤＮＡ分子のクローニングを含むもので、これに よって本発明の範囲に含まれる合成抗原性物質を調製することができる。このよ うなアプローチはプラスモジウム・ノウレジ（Ｐ　Ｉａｓｍｏｄｉｕｍ　Ｋ　ｎ ｏｖｌｅｓｉ）の抗原に対してエリスら（Ｅｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）によって 適用されており（ネイチャー、１９８３年、第３０２巻、第５３６頁参照）、本 発明にもこのアプローチを適用し、次いで寄生虫の覆土期に分有されたエピトー プを含有するイントラーエリスロサイト期の抗原の存在を確認してもよい。

本発明者は遺伝子工学的手法を用い、プラスモジウム・ファルシパルム単離物（ タイ国産；に１）を出発原料とすることによって、５．１−１エピトープを含有 する天然に存在するプラスモジウム・ファルシパルムのイントラーエリスロサイ ト期の抗原に対する構造遺伝子のすべてではないがその大部分に対応すると考え られるＤＮＡシーケンスをその一次翻訳生成物の形で同定しｒこ。このポリヌク レオチドンーケンスに対応するアミノ酸シーケンスはこの抗原を定義する。天然 の一次翻訳生成物の分子量は約２４，５００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ って測定した値）であるか、このシーケンスの個々のアミノ酸残基の総和による 分子量は１７．０００ダルトンより大きくない。天然に存在する物質を蛋白質性 ではあるがグリコシレート化する（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）ことは可能である が、遺伝子工学的手法によって得られる物質の場合は不可能である。しかしなが ら、このことが分子量の不一致の主要な原因でないことは、遺伝子工学的手法に よって得られる物質自体の分子量が約２４．０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 法による測定値）であるという事実によって示される（先に述べたように、この ような大きさの値に対する５ＤＳ−ＰＡＧＥ法の精度は±ｔ　、ｏ　ｏ　ｏダル トンであるので、天然の一次翻訳生成物の分子量と遺伝子工学的に得られた抗原 の分子量の差が５００ダルトンであるということは両者の真のサイズ差を意味し ない）。

分子量の測定値と計算値との間の不一致は、プラス残基から成るシーケンス（第 ５図の下線の部分）：　Ａｓｎ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓ ｐ　−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｐ　−（Ｓ　ｅｒ　−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ）−Ａｓｎ−Ｇｌ ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏから構成されると考えら れる。このシーケンスはサーカム覆土（ｃｉｒｃｕｍ　−５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）蛋白質中に存在するタンデムに（ｔａｎｄｅｍｌｙ）ｉり返され１こテトラマ ーとのホモロジーを有する。このテトラマーはアミノ酸残基Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌ ａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏから成り、アミノ酸残基のシーケンスはこの繰り返 されたテトラマーから成り、このシーケンスのバリエーションはＡｌａがＶａｌ によって置換され、また第２のＡｓｎがＡｓｐによって置換され、シーケンスＡ ｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏが構成されていることで、これは覆土形感に含有 されたエピトープを構成すると考えられる。イントラーエリスロサイトエピトー ブと種虫エピトープとの間には類似性はあるが、これらは同一ではない。

イントラーエリスロサイト期のエピトープの１８個のアミノ酸残基においては、 ブラケット中に１５個の残基が含まれていないことが持に重要で、３個の残基Ｓ 　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒはシーケンスのいずれかの側の７個の残基から 成るシーケンスと８個の残基から成るシーケンスとの間にほぼ近接並置する。従 って、これらの３個の残基を池の残基、特に当該分野においてこれらに関連する ものとして一般に考えられている他の残基によって置換することが可能であるの で、例えばＡｌａによるＳｅｔの置換およびＡｓｐによるＧｌｕの置換を考慮し てもよい。Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ 　ｌａ　−Ａｓｐシーケンスと、Ａｓｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒｏ 　−Ａｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｒｏシーケンスを分離するアミノ 酸残基グループ、特に３個の残基の存在は望ましいものと考えられるが、この３ 個の残基のシーケンスを完全に除去することら可能である。

しかしながら、全アミノ酸シーケンスは５．１１エピトープのみを含有するもの ではなく、またシーケンス中に他のエピトープが存在することは、プラスモジウ ム・ファルシパルムの覆土（Ｓ、ｔ−ｔエピトープを分有する）およびこの寄生 虫のイントラーエリスロサイト形態の両方に対するワクチン接種において抗原性 物質に最大の効能を付与する点で有用であると考えられる。従って、前記のアミ ノ酸シーケンスの大部分を含有する抗原性物質は生体内に投与されると、複数種 の抗体の形成を誘発し、このうちのいくつかは５．１−■エピトープに対して特 異的であって、寄生虫の覆土およびイントラーエリスロサイト形態の両方と反応 し、また他の抗体は寄生虫のイントラー二すスロサイト形襟と反応し、これによ って抗原性物質含有ワクチンの使用によってもたらされる保護作用が高められる ことになる。

従って、前述のアミノ酸シーケンスの一部のみを含有する抗原性物質を利用する ことも可能であるが、５゜ｉ−ｔエピトープを保有する場合であっても、シーケ ンスの縮小が大きいと、完全シーケンス中に存在する他の有用なエピトープのサ イトが失なわれる可能性がある。従って一般に、本発明による合成抗原性物質は ある程度縮小したアミノ酸シーケンスを含んでいてもよいが（例えば、シーケン スのＮ−および／またはＣ−末端に位置する特定の残基を欠く場合）、特に重要 なこのような抗原性物質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定値が２０，０００　ダ ルトンもしくは２２，０００ダルトン以下でない分子量、例えば前述の２２，０ ００〜２４，０００　ダルトンの範囲の分子量を有する。

前述の完全アミノ酸シーケンスを含有する抗原性物質よりも小さな抗原性物質と しては、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定値が２２，０００　ダルトンおよび２３ ゜０００　ダルトンの分子量を存する蛋白質が例示されるが、このような蛋白質 は以下に述べるようにクローンλＡｇ５　、　Ｉ　（９）中に存在する遺伝子の 発現において分子量２４，０００　ダルトンの蛋白質と共に得られた。全アミノ 酸シーケンスの一部を含有する抗原性物質の別の例としては、以下に述べるよう に、別のクローンλＡｇ、５．１　（８）中に存在する遺伝子の部分シーケンス に対応するアミノ酸シーケンスの全体もしくは一部を含有するものが挙げられる 。このより小さなアミノ酸シーケンスは、全シーケンスのうちの６９側のＣ−末 端アミノ酸に対応するもので、全シーケンスの９４番目のアミノ酸残基に対応す るＮ−末端グリシン残基およびＣ−末端ヒスチジン残基を宵する。全シーケンス の一部を含有する別のより小さな抗原性物質としては、５．１−１エピトープの 特異性と関係があるものとして先に述べた１５ａｌのアミノ酸残基に対応し、好 ましくは分離アミノ酸残基グループ、例えば３個の残基、特に天然に存在するＳ 　ｓｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒを併用するペプチドが挙げられる。

分子量が２０，０００　〜２５，０００　ダルトンの範囲の抗原は完全に免疫原 性であるが、５．ｌＬエピトープに対応するペプチドのようなより小さな抗原性 物質を使用する場合、これらの物質の分子量は、免疫原として十分に機能するた めには小さすぎるような値であってもよい。このことは合成の抗原性物質に関し てだけでなく、天然に存在する抗原の開裂によって得られる物質に関しても適用 できることである。従って、本発明による抗原性物質には、全アミノ酸シーケン スの全部もしくは特に一部に対応する蛋白質らしくはペプチドを適当なキャリヤ ー、特に蛋白質キャリヤー、例えば天然蛋白質であるウシの血清アルブミンおよ び特にオバルブミン、キーホール・リムペット（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ） のヘモシアニン、並びにポリリジンのような合成ポリペプチド等が含まれる。

前述の遺伝子工学的手法を用いる第２のアプローチを適用するための最初の要件 は、天然に存在する抗原性物質に対して全体もしくは一部として生産するのに必 要な遺伝子コーディングの全部らしくは二部の分離と同定である。当業者にとっ て明らかなように、この問題に関してはいくつかのアプローチが可能である。

即ち、プラスモジウムのゲノムＤ　Ｎ　Ａを利用し、これを適当なフラグメント に切断して発現ベクター、例えばλｇｔｌｌもしくはその誘導体のようなファー ジベクターに直接組み入れることも可能である。しかしながら、ＲＮＡを用いフ ァージベクターに組み入れられたｃＤＮＡを得る以下の方法によって覆土表面に 自存されたエピトープを保有する天然に存在するイントラーエリスロサイト期の プラスモジウム・ファルシパルム抗原に対する構造遺伝子コーディングの全部で はないが、そのほとんどに対応する遺伝子生成物の分離が可能となり、このよう な方法は、プラスモジウムの他の種の類似抗原に対する遺伝子コーディングの分 離にも適用できる。

寄生虫のエリスロサイト期からの全メツセンジャーＲＮＡはｃＤＮＡに変換され 、エンドヌクレアーゼによって得られる分子は、選択されたファージベクターの 単独のＥｃｏＲＩサイトに組み入れられ、生体外におけるλキャブジッド内に包 み込まれる。使用するのに特に便利なベクターは、ヤングら（Ｋｅｍｐ　ｅｔ　 ａｌ、）によって報告されているλｇｔｌｌ−Ａｍｐ３として知られているλｇ ｔｌｌの誘導体であり〔プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オプ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニーニスニー（Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ 　ｏｒｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｌ！ｌｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ ｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ＵＳＡ）。

１９８３年、第８０巻、第１１９４頁参照コ、このベクターはファージの　１ａ ｅＺと　Ｊエサイトとの間に、アンピシリン耐性を付与する遺伝子を有する。ｃ ＤＮＡ分子が組み入れられるＥｃｏＲＩサイトはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ ζ）をコード化する遺伝子内に存在するのでＣＤＮＡは転写されて翻訳される。

ｃＤＮＡフラグメウトを保有するファージはエシェリヒア・コリ（Ｅ　−ｃｏｌ ＋）ホストの感染に使用される。

便利なホストはヤング（Ｙ　ｏｕｎｇ）とデービス（Ｄ　ａｖｉｓ）によって報 告されているエシェリヒア・コリＹ１０９０である［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）、１９８３年、第２２２巻、第７７８頁参照］。この方法によって得られる ファージプラクを次いでスクリーン処理に付し、重要なペプチド／蛋白質を発現 するクローンを同定する。

このようなスクリーンをおこなう便利なアプローチには、これらの抗原性物質中 に含まれるエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体の使用が含まれる。

例えば、プラスモジウム・ファルシパルムの５．１１エピトープの場合、ハイブ リドーマ５．ｉｌによって生産される抗体または他のハイブリドーマによって生 産される類似の特異性を有するいずれかの池のモノクローナル抗体をプローブと してクローンのスクリーンモノクローナル抗体をプローブとして直接使用する方 法の代替法として、このような抗体を問題となる抗原の精製に使用して、天然に 存在するエピトープ含有抗原に対して特異的なポリクローナル抗体製剤を得ても よい。

前述の方法は実施例においてさらに詳述するが、これによって特に重要な２Ｎの ファージクローンが分離される。これらのクローンは本発明者によってλＡｇ− ５，１（８）およびλＡｇ５．１　（９）として指定されており、後者はエシェ リヒア・コリＹ１０９０リソゲン／λＩＨ９）としてスコツトランドのアバティ ーンにあるナショナル・コレクションズ・、オブ・インダストリアル・アンド・ マリーン・バクテリア（Ｎ　ａｔｉｏｎａｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｒ　Ｉ 　ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉａ）に１９８ ４年９月１４日寄託されｆこ（受は入れ番号：ＮＣＩＢ　１２０１６　）。この リソゲンはヤングとデービスの論文（前記論文）に記載の菌株ニジエリ１００、 　ａｍｐＲＸケンプのヤン論文参照）によって溶原化され、該ファージは以下に 述べるようにプラスモジウム・ファルシパルムＤＮＡをその′単一のＥｃｏＲＩ サイトに組み入れて含有する。リケゾン細胞は通常のエシェリヒア・コリ形聾を 示すが、溶原化によって通常付与される対温敏感性を有し、存在する余分のＤＮ Ａによって付与される特性を兼備する。

２種のクローンλＡｇ５．１　（８）とλＡｇ５　、１　（９）における組み入 れ（ｉｎｓｅｒｔ）は常法、即ちエシェリヒア・コリリソゲンの形態でファージ を生長させ、リーシスを誘発させ、ファージを精製してＤ　Ｎ　Ａを抽出し、Ｄ 　Ｎ　Ａを開裂させてＥｃｏＲＩサイト間のフラグメントを分離し、次いでこれ らのフラグメントを配列させることによって調べた。クローンλＡｇ５　、　＋ 　（８）およびクローンλＡｇ５．１　（９）における組み入れをそれぞれ第４ 図および第５図に示す。各々の場合、ＥｃｏＲ■サイトを構成するＧＡＡＴＴＣ ヌクレオチドンーケンスにはＮ−およびＣ−末端に下線を付すが、これらのシー ケンスの各部分はλｇｔ　１１−　Ａｍｐ３ファージから誘導されるので、イン サート自体には全体で一組のＧＡＡＴＴＣヌクレオチドが含まれる。

両方のクローンは５．１１ハイプリドーマによって生産された抗体と反応し、従 ってＳ、ｔ−ｔエピトープを含有する蛋白質を発現し、クローンλＡｇ５　、１ 　（８）中のインサートはその非常に広い部分と、クローンλＡｇ５．１　（９ ）のヌクレオチドシーケンスの一部とをオーバラップさせる。寄生虫のイントラ ーエリスロサイト期に存在して覆土表面に分有されるエピトープを含有する天然 に存在するイントラーエリスロサイト期のプラスモジウム・ファルシパルム抗原 に対する構造　゛遺伝子のすべてではないが、その大部分は、５′末端に隣接す るＡＴＧコドンから始まって３′末端に隣接するＣＡＣコドンで終了するλＡｇ ５　、１　（９）クローンインサート中のヌクレオチドシーケンスに対応する。

従って本発明には、次のヌクレオチドシーケンス：ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＴ Ａ　ＴＣＡ　ＧＴＡＴＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ　 ＡＴ’ＣＡＴＴ　ＴＴＣＡＡＴ　ＡＡＡＧＡＡ　ＴＣＣＴＴＡ　ＧＣＣＧＡＡ　 ＡＡＡＡＣＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＡＡＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ 　ＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡＴＣＡ 　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＡＴＡＧＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＣＧＡＴ　Ｔ ＴＡ　ＡＴＡＴＣＴ　ＧＡＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＴ　 ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＣＣＡＣＴＴＣＡ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴ ＡＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＴＣＣＡＣＣＧＴＡ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　Ｇ ＧＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴＧＧＴ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＴＡＣＡＡＴＡＣＴ　 ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＣＣＣＡ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＴＡ　ＧＧ Ａ　ＴＣＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＡＡＴＧＣＴ　ＡＡＣＣＣＡ 　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＡＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡＣＣ Ａ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＣＡＡＧＴＴ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　 ＧＡＴ　ＧＴＴＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡＧＧＴ　ＧＡ ＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＴＡ　ＡＧＴ　ＧＧＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＣＡＣを 含有するＤＮＡもしくは該シーケンスの一部分を含有するＤＮＡが含まれる。

ＤＮＡはもちろん２本のストランドとして存在するが、本明細書で採用する表示 法は１本のストランドのみを示す普通の表示法であり、第２ストランドの構造は 第１ストランドの構造によってディクテート（ｄｉｃ−ｔａｔｅ）されるので、 １本のストランドのみを示す。さらに、特定のアミノ酸は１つ以上のトリプレッ トによってコード化されるので、そのコーディングが前記のシーケンスの全部も しくは一部と等しい別のＤＮＡにも本発明は及ぶものである。実際、本発明者が 利用したｃＤＮＡを得るのに用いたＫ１分離物中に含まれる菌株とは異なった別 のプラスモジウム・ファルシパルム菌株に、５．１何エピトープに対応する同一 のアミノ酸残基をコード化する等しいコドンを含有するが構造が前述のものとは 幾分異なっｒ：　Ｄ　Ｎ　Ａを含ませることが可能である。しかしながら、この ことは通常は天然のコドンシーケンス含有ＤＮＡを利用するよりははるかに簡単 なことである。

全体よりも小さい特に重要なヌクレオチドノーケンスは一次翻訳生成物である蛋 白質中に存在するアミノ酸シーケンスの一部分のみを有する前記の抗原性物質に 対応する。シーケンス全体を含有しないこのようなり　Ｎ　Ａは、例えば分子量 が２２．０００〜２４，０００ダルトンの抗原性物質もしくはエピトープを構成 する前述のアミノ酸シーケンス、即ち全体で少なくとも５個、特に少なくとも１ ０個、就中１５個もしくはそれ以上の前記コドンを含有するシーケンスもしくは シーケンスの組み合せ、例えば、ヌクレオチドシーケンスＡＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡ ＣＣＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＴＧＡＴ　ＴＯＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＡＡＴ　ＧＧＡＧＡ Ａ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＣＡ（第５図の下線部分）もしくは同一 のアミノ酸残基をコード化する他のシーケンス等に相当してもよい。このシーケ ンスにおいては、特に、コドンＧＡＴとＡＡＴを接合するヌクレオチドＴＣＴ　 ＧＡＡ　ＴＣＣは所望により３個のアミノ酸残基Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌａ　−Ｓｅ ｒ、特に全体で３個の残基をコード化する３個の別のコドンによって置換されて いてもよく、ま１こ、これらのヌクレオチドを完全に削除してもよい。以下に述 べるように所望の抗原性物質をコード化するヌクレオチドシーケンスは、該物質 の発現に関連する種々の機能を果す他のヌクレオチドと結合させて一般に用いら れる。

所望の抗原性物質を発現させるためには、構造遺伝子に相当するヌクレオチドシ ーケンスもしくはその一部分を適当なりローユングビヒクル中に存在させること が必要である。従って本発明には、クローニングビヒクルシーケンスおよび前記 のヌクレオチドシーケンスもしくはその一部分を含有する組換えＤＮＡ、例えば クローンλＡｇ５　、１　（８）およびλＡｇ５．１　（９）中に存在する組換 えＤＮＡが含まれる。

広範囲のこのようなりローニングビヒクル、例えばエシェリヒア・コリプラスミ ド、およびコスミドおよび特にファージを含む他のバクテリアホストに用いるプ ラスミドを用いてもよい。特に重要なものはラムダファージ、例えばファージλ ｇｔｚもしくはλｇｔｌｌ−Ａｍｐ３のようなそのモディフィケーションである 。

構造遺伝子含有クローニングビヒクルもしくはその一部分はｃＤＮＡもしくは先 に述べたゲノムライブラリーを出発原料として調製してもよく、あるいはより簡 便には、別のクローニングビヒクル、例えば蛋白質の発現を高めるクローニング ビヒクルに組み入れられてもよい構造遺伝子ＤＮＡの原料として、寄託されたク ローンλＡｇ５．１　（９）を使用してもよい。

クローニングビヒクルおよび構造遺伝子、もしくはその一部分を含有する組換え ＤＮＡに関して、所望の抗原性物質を発現させるためには、組換えＤ　Ｎ　Ａに 適当な発現制御シーケンス、即ち転写、翻訳ストップおよびスタートシグナルを もたらすプロモーターおよびターミネータ−ＤＮＡシーケンス、および所望によ り発現を有利におこなう池の調節サイトを保有させるべきである。有益な効果を もたらす付加的な調節フオームの例は、ホストの培養の初期段階における遺伝子 のＡｍｐ３ファージ中に存在し、エシェリヒア・コリＹ１０９０菌株はｌａｃ　 ｒ−遺伝子を含有する。

転写を制御するシーケンスは通常ホスト／クローニングビヒクルＤＮＡによって 得られる。例えば転写の促進は、λｇｔ　１１−　Ａｍ＋）３フアージの場合に おいて普通はβ−ガラクトシダーゼの転写を制御するＤＮＡによっておこなわれ る。しかしながら、翻訳のスタートとストップシグナルを付与するシーケンスは 通常はクローニングビヒクルもしくはプラスモジウム・ファルシパルムから誘導 される。これに関連しては、前述の２種のクローンλＡｇ５．１　（８）とλＡ ｇ５　、１　（９）との間には相違がある。何故ならば両方のクローンはプラス モジウム・ファルシパルムから誘導される翻訳ストップシグナル（ＴＡＡ）を有 しているが、λＡｇ５　、１（９）クローンはえＡｇ５．１　（８）クローンと 異なり、プラスモジウム・ファルシパルムから誘導されるスタートシグナル（Ａ ＴＧ）をも有するので、これによって池のペプチド物質と融合しないプラスモジ ウム・ファルシパルム蛋白質かも１こらされるからである。

従って大発明による組換えＤＮＡはプラスモジウム・ファルシパルム蛋白質らし くはペプチドをコート化するＤＮＡのほかに、さらにその５′末端位に翻訳のス タートングナルを付与する（５’−３’）ヌクレオチドシーケンスＣＴ　Ｔ　Ｔ 　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ’ＡＴＴＣＡＡＡ もしくはその一部分を有し、および／またはその３′末端位に翻訳のスタートン グナルを付与する（５′→３′）ヌクレオチドシーケンスＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧ ＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＣＧＴ ＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴ ＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧもしくはその一部 分（例えば、ポリＡシーケンスの全部もしくは一部を欠いたもの）を有するのが 好適である。

クローニングビヒクルから発現によって蛋白質を生産するためには、該ビヒクル をホスト内に含ませる必要がある。ホストとしてはイーストおよび他の菌類（４ ｕｎｇｉ）もしくは曙乳類の細胞の利用を考慮してもよいが、バクテリア、例え ばプソイドモナス（Ｐ　５ｅｕｄｏ−凹二臣）らしくはバシルス（Ｂ　ａｃｉｌ ｌｕｓ）の菌株、特にエシェリヒア・コリＹ１０９０のようなエシェリヒア・コ リの菌株が好適である。選択される特定のホストは使用する特定のクローニング ビヒクルに依存するが、適当な組み合わせのクローニングビヒクルとホストを選 択すれば、当該分野で周知の技術を用いることによって後者は前者によって容易 に形質転換される［あるいはファージクローニングビヒクルの場合にはトランス フェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）もしくは溶原化される］。従って本発明には、 先に定義したヌクレオチドシーケンスもしくはその一部分を含有する前記のクロ ーニングビヒクルを含有するホスト細胞が含まれろ。

本発明による抗原性物質を生産するためには、前記のホストを適当な状条件下で 培養させ、クローニングビヒクルからの発現をおこなわせる。この選択される条 件はホストクローニングビヒクルの組み合わせに適しているので、例えばエシェ リヒア・コリＹ１０９０ファージリソゲンに対しては、空気中、約３０℃でＬ− 肉汁のような培地［ディフコ・バクト（Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ）トリプトンｌ ｏｇ；ディフコ・バクトイ−スト抽出物５ｇ　；　ＮａＣＱ　５ｇ　；水１１２ まで；　ｐＨ７，２１において培養をおこなってもよい。プラスモジウム・ファ ルシパルムＤ　Ｎ　Ａ含有ファージベクターがｌａｃオペレーターを宵してホス トがしり」−遺伝子を有する場合には、前述のように、遺伝子は最初はスイッチ オフさせ、所望によりイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを培地へ添 加することに上って発現を誘発させてもよく、該培地はｌａｃリプレッサーを不 活性化させ、従って遺伝子をスイッチオンさせる。蛋白質／ペプチドを分離させ るためには、培地および／またはホスト細胞を適当な手段で処理する。例えば、 バクテリアリソゲンを使用する場合にはホスト細胞を採取後、例えば硫酸ドデシ ルナトリウムのような適当な界面活性剤を用いて破壊させ、生成物を例えば分取 ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離するが、別の常套の方法、例えば、大規模生産に 適した方法を利用してもよい。所望のプラスモジウム・ファルシパルム抗原性物 質が、β−ガラクトシダーゼ含有融合生成物が得られるクローンλＡｇ５．１（ ８）の場合のように、融合蛋白質として発現される場合には、該融合蛋白質を開 裂させるか、あるいはそのままで使用してらよい（免疫原性を高めるためにはサ イズを大きくすることが有効な場合がある）。

先に述べたように、クローンλＡｇ５．１　（８）を使用する場合とλＡｇ５． ｌ　（９）を使用する場合とでは異なったタイプの生成物か得られる。例えば、 λＡｇ５．１　（８）クローンはβ−ガラクトシダーゼと分子量が７，７００　 ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定値）のプラスモジウム・ファルシパル ム蛋白質との融合蛋白質を生産し、一方、λＡｇ５　、１　（９）クローンはβ −ガラクトシダーゼと融合しない３種類の蛋白質、即ち分子量が２２，０００． ２３，０００　および２４．０００　ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定 値）のプラスモジウム・ファルシパルム蛋白質を生産する。分子量が２２．ＯＯ Ｑ　および２３，０００　ダルトンの蛋白質はエシェリヒア・コリによる分子量 ２４．０００　ダルトンの蛋白質の処理生成物と考えられる。これに関連しては 、先に述べたように天然から分離された分子量２３．０００　ダルトンの５．１ ’−１エピトープ含有抗原性物質が精製処理において分子量２２．０００　ダル トンの蛋白質に変換されたということは重要である。さらに、クローンλＡｇ５ 　、　Ｉ　（９）中に存在する構造遺伝子シーケンスの５′末端は一組の２３ト リブレツトを有しており、該トリブレットは２２位のアラニン残基の後で分裂し 、これによってクローンλＡｇ５　、　Ｉ　（９）遺伝子中に存在する対応する 蛋白質上りら幾分小さな蛋白質が形成される。

本明細書に記載しｒこ抗原性物質を遺伝子工学的手法によって合成的に生産する 方法とは別に、例えばより小さなペプチドに相当する物質を、ペブリド合成の分 野における標準的な方法を用いる化学的合成法によって調製してもよい。

ここで説明した遺伝子工学的手法は、プラスモジウムの他の種の抗原であって寄 生虫のイントラーエリスロサイト形籾と関連して天然に存在しかつ寄生虫の覆土 期に存在する抗原性物質に含有されるエピトープを保有する抗原の全部もしくは 一部を含有する抗原性物質の生産にももちろん適用してもよく、従って本発明は 、プラスモジウム・ファルシパルムに関してここで説明した手法を他の核種に適 用して誘導される生成物にも及ぶものである。

本発明による抗原性物質は、プラスモジウム属寄生虫によって感染される危険性 のあるを椎物動ホストが罹青しやすいマラリアに対する免疫性を誘発するワクチ ンに配合する場合に特に有用である。該物質はプラスモジウム・ファルシパルム に対する予防のためにヒトに利用する場合に特に重要である。ワクチンに使用す る場合、該抗原性物質は純粋な形で調製するのが好ましく、該物質は他の蛋白質 らしくはペプチドを１０重量％以下、特に１重量％以下含有する混合物とするの が好ましい。多くの用途に対して、抗原性物質は発熱性不純物を実質上含有しな いのか望ましい。特に天然から分離した物質の場合にはヒトらしくは他の動物の オリジン（ｏｒｉｇｉｎ）、例えば血清蛋白質、ヘモグクビンおよび血液グルー プ物質を実質上除去するように精製処理をおこなうのが好ましい。遺伝子工学的 手法によるエシェリヒア・コリのクローンによって合成されたハイブリッド蛋白 質の場合は、発熱性の汚染バクテリア蛋白質を実質上除去するように精製処理を おこなうのが好ましい。このようなハイブリッド蛋白質の精製は、ノニデットＰ ４０（１％）のような界面活性剤溶液中での溶解度が小たいために大部分がバク テリア蛋白質から沈殿として分離させることによって促進させることができるの で便利である。沈殿物は次いて界面活性剤硫酸ドデシルナトリウム（５％）溶液 に溶解させ、物質の純度は蛋白質の場合は５ＤＳ−ＰＡＧＥ法によって確認し、 ペプチドの場合は高性能液体クロマトグラフィーによって確認する（類似の純度 確認法を本発明の範囲内に含まれる池の抗原性物質に適用してもよい）。抗原性 物質は天然から分離したものであろうと、別の方法によって得たものであろうと 、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法における主要な蛋白質バンドもしくは高性能液体クロマト グラフィーにおけるペプチドピークに少なくとも相当し、かつ実質上池の蛋白質 バンドもしくはペプチドピークを含まない程度の純度が好ましい。

本発明による抗原性物質はその調製時の副生成物を実質土倉まない状態でワクチ ンに使用するのが好ましいが、該抗原性物質は単独または他のこのような抗原性 物質もしくはこのような場合において有用な池の異なっｆこ抗原性物質と併用し てワクチンに配合してもよい。特に、生体内投与において抗体を生産し、および ／またはプラスモジウムの一つの種の種々の菌株および／またはその種々の種に 対する細胞免疫性を誘発する抗原性物質を単独でワクチンに含有させるのが有利 である。さらに、ワクチンが寄生虫のライフサイクルの種々の段階に対して免疫 応答をもたらして保護免疫性を付与するのが一般に好ましく、本発明による抗原 性物質はこの点に関して特に有用であるが、この目的のにめの付加的な物質を含 有させるのも有効である。

従って本発明には、前記の抗原性物質および生理学的に許容される希釈剤もしく はキャリヤーを含有する薬剤組成物が含まれる。特に重要な希釈剤もしくはキャ リヤーは液状媒体、例えば滅菌処理されて発熱物質を含まない食塩溶液（ｓａｌ ｉｎｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）である。抗原性物質は溶液もしくは懸濁液にしても よく、あるいは生理学的に許容される洗剤の添加によって可溶化させてもよい。

ワクチンには所望により、抗原性物質に対する免疫応答を刺激するためのアジュ バント、例えば、ワクチンに分離した成分として配合してをよいサボニルミニウ ム等のアジュバントを含有させてもよい。免疫応答を刺激する別の方法は、抗原 性物質を２つのパートにインコーホレート（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ）　Ｌ、、 一方のパートに抗体生産特性を保有させ、他方のパートがこのようは生産を促進 するようにする方法である。抗体誘発物質の分子量が比較的小さい場合には、先 に述べたように、該物質をキャリヤー蛋白質もしくは他の物質に結合させてその 免疫原性を刺激してもよい。あるいは、ハルトら（Ｈａｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、） らの論文（ネイチャー。

１９８３年、第３０２巻、第２５６頁）に記載されているように、特定のアイソ タイプの抗体を用いて抗原性物質の免疫原性を改良することも可能である。さら に、英国特許第２００４７４４号明細書に記載されているように、抗原性物質を ＭＭＣ抗原に結合させて免疫原性を高めてもよい。

ワクチンは抗原性蛋白質の最終濃度が０．２〜５Ｂ／ｍ１２、好ましくは０　、 ５〜２　ｍｇ／ｍ（２、例えばＩ　ｍｇ／ｍＱになるように配合するのが好適で ある。配合後、好ましくは単位投与形１３（即ち、単位投与物、またはマルティ ブルもしくはサブミニブト投与物を別々に含有した形態）に配合した後、ワクチ ンは滅菌容器内に入れ、密封し、低温、例えば４℃のもとで保存するか、または 凍結乾燥してもよい。抗原性蛋白質を前述の濃度で含有するワクチンのを椎動物 ホストにおける投与量は０．１〜２ｍ（２、好ましくは０　、２〜１　ｍｉ２． 例えば、０　、５　ｃｎ（ｌである。ワクチンは常套のいずれの方法によって投 与してもよいが、非経口投与（例えば皮下もしくは筋向注射）が特に有効であり 、滅菌処理し、発熱物質を含まないフォーミュレーションを用いるのが好ましい 。処置はワクチンの一回投与または投与後一定時間経過後におこなう複数回投与 であっても上い。

従って本発明には、前述の本発明による抗原性物質を捕乳動物ホストに有効Ｍ投 与することを含む、マラリアから該ホストを保護するための該ホストの処置方法 が含まれる。

本発明を以下の実施例によって説明する。

実施例１ エピトープ５．１−１と反応性のあるモノクローナル抗体を製造するハイブリド ーマセルラインの発生使用した手順はペリジら、ネイチャ〜、１９８１年、　。

第２８９巻、第３０１頁のプロトコールを変更したらのである。

タイ国から入手した、Ｋ１と命名されたプラスモジウム、ファルシパルム（タイ トングとビーレ、トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイアティ・才 ブ・トロピカルメディシン・アンド・ハイジーン、１９８１年、第７５＠、第２ ７２頁）をトラーガーとイエンセン、サイエンス、１９７６年、第１９３巻、第 ６７３頁の手順に従いインビトロで生長させ、血液サイクルのすべての無性期、 すなわちリングフオーム（ｒｉｎｇ　ｆｏｒｍｓ）、トロホゾイテ、シゾントと メロゾイト　”を含む非同時性の培養を行なった。

雌のＢａ１ｂ／ｃマウスにホスト赤直球から分離した有機体で腹腔内に免疫性を 与えるがその際２週間の間隔をおいて２〜４回与えられる不完全フロインドアジ ュバントに組み入れた１００〜２００μｇの全タンパク質を服用する。寄生虫を ラッカーマンら、ダブリュ・エッチ・オー・プレチン、１９６７年、第３７巻、 第４３１頁のサポニン処理を改良することによって、すなわち室温で１５分間Ｏ １１％サポニンで溶解している感染赤血球を使用することによって得る。この手 順により自由な寄生虫と赤血球ゴーストと赤血球膜にとらえられた寄生虫を含む 試料が得られ、そしてこの手順は無血清培養培地で洗うことによって除かれるヘ モグロビンを比較的自由に使用できる。

最後の腹腔内注射後２〜１６週間で、マウスにアジュバントのない生理的食塩水 中にある以外は寄生虫の試料と同じものを静脈内に注射するが、その際１００Σ ・ｇのたんばく質を服用する。３日後マウスを殺してそれから得た牌臓細胞を、 オイとへルゼンベルグ、セレクティッド・メソッド・イン・セルラー・イムノロ ジー、１９８０年、第３５１頁（ミソノニルとンイギ編集、フリーマン出版、サ ンフランシスコ）の手法を使用し１　二　１から１０　：　１の比でＮＳ−／１ −Ａｇ４−１　（ＮＳ−１）骨髄腫細胞（コーラ−ら、ヨーロピアン・ジャーナ ル・才ブ・イムノロジー、１９７６年、第６巻、第２９２頁）と融合した。融合 ２週間後、プラスモジウムに対する抗体を作り出すハイブリドーマ培養菌を、フ ォラ−とオーネイル、ダブりニー・エッチ・オー・プレチン、１９７１年、第４ ５巻、第５２４頁の手順に従い、感染血液のアセトン固定塗抹漂本を使用し、免 疫蛍光検定（ＩＰＡ）により同定する。

上記手順を使用し、５個の別々の融合によって総数５９０のハイブリッド培養物 となり、その１３７１ｍがＩＦＡで探知できる抗プラスモジウム抗体を分泌した 。

これら１３７のハイブリッド培養物から選んだ２２個のハイブリドーマは、支持 細胞（０，２ｍ＋２中マイクロカルチャー当り１〜２Ｘ１０’）として宵性生殖 の胸腺細胞を付加して限界希釈クローニングを使用することによって連続的にク ローンを発生させた。培養物を１０日後にハイブリドーマコロ二が存在するかど うか顕微鏡で検査し、細胞の単一クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）だけを含んでい る培養物から表面に浮いている物質を抗マラニア抗体が存在するとしてスクリー ンした。普通、初期のハイブリドーマライン当り４〜６のクローンを選んで、ま ず１ｍＱのクラスタートレイ（ｃｌｕｓｔｅｒ−ｔｒａｙ）培養へ、次にフラス コ培養（ｌｏｍり）へ展開する。クローン発生ハイブリドーマセルラインのすべ ての培地をＩＦＡにより研究したところ、色々なタイプの反応様式か同定された 。２２のセルラインから１つのハイブリドーマセルラインを覆土試料に対する培 養培地によって示された強い反応を基に選び、ナンバー５．１１と名づけ、その セルラインはハイブリッド培養５　、　ｌ　＊のクローニングによって得ること ができたものである。

（＊）このハイブリッド培養物はサポニンのない血液寄生虫をフロイント不完全 アジュバントの１００〜２００μｇのタンパク質を４回復腔内注射により与え次 いで最後の腹腔的注射から９週間後にシゾント（ｌＯＯμｇタンパク質）を静脈 内注射したマウスから得られた膵臓細胞を利用した融合から得た。

この融合により、培養物が得られ、その５０％が育生可能なハイブリッドを含ん でいたがこの内２つだけが抗マラリア抗体を作り出しただけであった。

ハイブリドーマセルライン５．１−１はｌＯ〜１５％ｖ／ｖの胎児の子牛の血清 （Ｆ　ＣＳ−セララブ　ラボラトリーズ（Ｓ　ｅｒａｌａｂ　Ｌ　ａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）提供）を含有するＲＰＭＩ　１６４０（ギブコ（Ｇ　１ｂｃｏ）提 供）にピルビン酸ナトリウムＩｍＭ　１グルタミン酸２ｍＭ、ペニシリン５°０ ０　ｕｎｉｔｓ／ｍＱおよびストレプトマイノン５００ｍＣｇ／ｍｃ（ギブコ提 供）を追加し、重炭酸ナトリウムを０２％Ｗ／Ｖのａ度で加え、７，４のｐＨに した培地中３７℃で培養保存した。細胞を２〜６　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｉ ２の濃度で２４〜７２時間ごとに新鮮な培地へ薄めることによって静止細胞培養 中で保持し、−但十分な細胞が発生した時取り入れた。上記培養の雰囲気を８５ 〜８９％の相対湿度をした空気中５〜６％のＣｏｔ濃度で保存した。

セルライン５．１−１は少なくとも２ケ月間の間静止培養中での継代成長に対し て安定であることがわかったが、組織培養における成長がより長い期間＊８保存 できるのならば定期的に再びクローンを発生させることが望ましい。

（＊＊）実施例２中に記載されたように作られた腹水溶液中に存在する５、１− １ハイブリドーマ細胞はＢａ１ｂ／ｃマウス体中でインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ） に継代してもよい。

カルチャー−コレクション（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に供託さ れた細胞を０．２ｍ１２の培地と支持細胞とし胸腺細胞を含有するミクロカルチ ャーへ限界希釈して一但クローンを発生させた。貯蔵用試料（および供託用試料 ）の準備のために、培地中の細胞の懸濁液を５分間２５０ｇで遠心分離にかける 。細胞ペレットを１体積ＤＭＳ○、４体積ＦＣ９そして５体積のＲＰＭ１１６４ ０から成る寒剤中、約２　Ｘ　１０　”／ｍＱを越えない細胞濃度で、室温で＠ 濁する。凍結した細胞アリコート（ａｌ−ｉｑｕｏｔｓ）を小さな（約１５Ｘ１ ５Ｘ１５ｃｍ’）断熱性のよいポリスチレンの箱の中に置いた２ＩＩｌｅのプラ スチックバイアル中に密閉する。これを−２０℃３時間−６０℃で一晩推持し、 徐々に冷やして細胞を凍らせる。

そしてバイアルを液体窒素へ移し貯蔵する（１〜５×１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｍ １２の濃度で９０％ｖ／ｖＦｃｓ−１０％Ｖ／Ｖジメチルスルホキシドよりなる 寒剤でもよい）。

凍結保存された細胞を再成するには、アリコートを３７°Ｃ定温器中ですばやく 解凍し、細胞を約１０ｍｄの無血清培地中で洗い、約５　ｘ　１０　’　ｃｅｌ ｌｓ／ｍｄの濃度で２０％ＦＣＳを含むＲＰＭ１１６４０培地中におく。この段 階で胸腺支持細胞を加えることが育盛でめる。細胞がよく分裂し始めると、１〜 ２日後が典型的であるが、培養物を前述したように保存し、および／または増殖 させる。

実施例１に述べたように組織培養で作られた５１−１ハイブリドーマは、Ｂａ１ ｂ／ｃマウスへ腹腔内接種することにより腫瘍として成長する。各マウスは、０ ゜５ｍ（ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；アルド リッチ　ケミカル社）を最初に与えてから２〜７日後に（血清が欠けている事以 外は）実施例１で述べた培養培地中にある約３ＸＩＯ’の洗浄細胞を与えられる 。腹水流動体を腫瘍が大きくなると毎日集める。抗体は５０％飽和硫酸アンモニ ウムを使用して沈殿させ、続いて０．００５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８、０） および０．１８Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８０）の指数関数的ａ度勾配をした緩 衝液で、ノエチルアミノエチルセルロース（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥ ５２）に供しイオン交換クロマトグラフィーにかけることにより、１（１％流動 体から調製される。

（２）インビトロ 実施例１で述べｒ；ように組織培養によって調製された５、１−１細胞を、ｌＯ ％ｖ／ｖのＦｅ２を含んている実鬼例１で述べ１このと同様のＲＰＭ１１６４０ −基本培地中で培養し、培養は５０ｍＱの培地を含む組織培養フラスコ中で行な われる。上記細胞の培地が酸性に変化すると、細胞をすて、表面に浮いている物 質を取り入れて（Ｎ　Ｈａ：Ｌ　Ｓ　Ｏａ沈殿とＤＥ５２クロマトグラフィー操 作を含む先の（１）に述べた同様の方法により抗体を調製する。

実施例３ 種々の系のプラスモジウム・パルシファルムの血液形態での５．１−１エピトー プ含有抗原の分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ） ハイブリドーマ５．１−１により調製されｒこモノクローナル抗体をダブりニー ・エッチ・オー・レファレンス・バンク・オブ・マラリア・ストレインズ（ＷＨ ＯＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｂａｎｋ　ｏｒ　Ｍａｌａｒｉａ　Ｓ　ｔｒａｉ’ｎｓ ）ジエネテイクス大学、ニシンバラ大学、スコツトランドから人手した培養適合 した単離体（クローンを含んでいる）およびマクブライドら、トランザクション ズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイアティ・オブ・トロピカル・メディンノ・アン ド・ハイノン、１９８４年に述べられている方法を使用し、ヒトのも者かみ直接 手に入れた臨床試料の両方を含む色々な地域の色々な種類のプラスモジウム・フ ァルシパルムに対してマクブライドら、サイエンス、１９８２年、第２１７巻、 第２５４頁に迅べられている手順に従い試験した。各試料をトレーガ−とイエセ ン、同誌の手法に従い、培養し、１遍間の間隔をおいて取り入れた寄生虫を使用 し、少なくとも２回（Ｆ、Ａ（〕ｔラーとオネイル、同誌）により試験を行なっ た；同種の単ＭＫＩが平行して育生され、コントロールとして含まれている。試 験には、培養物から感染血液をＲＰＭＩ１６４０培地あるいは生理的食塩水中で 洗って同じ培地中に希釈して、２０μＱ部当り１０’〜１０５個のシゾント（お よび別の時期の１０５〜１０’（ＩＮのシゾント）を得た。各部を多点ガラスス ライド壁土で乾燥した。前記（２）で得られたハイブリドーマ培養流動体を同種 の単離Ｋｌと最適の反応をする抗体の８０倍過剰の濃度で希釈しないで使用した 。さらに、抗体５．ｉｌを含む高力価腹水流動体をいくつかの試料について１０ １分のＩＯないし１に連続的に希釈して試験をした。背景の蛍光は免疫吸着剤精 製したウサギの抗血清と複合しているフルオレスセインイソチオシアネートをマ ウス免疫グロブリン（マイルズーイエーダ（Ｍ　１ｌｅｓ　−Ｙ　ｅｄａ））に 使用し、エバンズブル−（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ）［リン酸塩緩衝生理的食塩水 （Ｐ　Ｂ　Ｓ　）］で逆染色することにより最も小さくなる。ステンドグラスを ５０％グリセロールＰＢＳ中に据えつけ反応をｘ５００倍の倍率で記録した。も し、生長の適当な時期の寄生虫（着色したトロホゾイテ、シゾント）が反応する と試料はプラスに記録された（いくつかの試料は明らかにほんの少数のプラスに 反応する有機物しか含んでいなかったにもかかわらず）。前記背景を着色する寄 生虫が全くない試料はマイナスに記録される。

ハイブリドーマ５．ｉｌによって作られたモノクローナル抗体は色々な地域から 集められた範囲のプラスモジウム・ファルシパルム単離体の全部ではないがたい ていのものに対して、そして、試験を行なったたいていの野性味に対しても選択 的反応性を示す。結果を表−１と表−２に示す。表−１に含まれる単離体は風土 性の地域範囲を代表するものであり、そして色々な抗原型の混合物を含むという よりむしろ同種のものからなり表現型的に安定であるように見えるすべての試料 である。

表−■ ５．ｌ−１工ピトープ特異性抗体とプラスモジウム・ファルシパルムの培養適合 単離体の反応性表−２ ：５．ｌ−１エピトープ特異性抗体と、プラスモジウム・ファルシパルムの野性 菌株とその反応性 プラスモジウム・ファルシパルム顕微鏡試料の間接免疫蛍光染色法は、また、ハ イブリドーマ５．１弓によって作られたモノクローナル抗体の挙動をタイ国で採 取されたゲルタールアルデヒド固定覆土、およびプラスモジウム・ファルシパル ム、単離Ｋｌのトレーガ−とイエンセン、同誌の手順、すなわち寄生生血（ｐａ ｒａｓｉｔａｅｍｉａ）　５％でステ４１５分間アセトン中固定に従い調製され た非同時性のインビトロ培養物の空気乾燥した薄い血液塗末標本とを比較するた めに使用された。染色はホールら、モレキュラー・バイオケミカル・パラシトロ ジー、１９８３年、第７巻、第２４７頁の手順に従い湿った部屋の中で室温で行 なった。スライドを３０分間モノクローナル抗体と供に培養し、航述したのと同 じマイルズーイエーダ複合体で染色し、再びエバンスブルーで逆染色した。スラ イドを５０％グリセロール中に据え付けた後、蛍光顕微鏡により試験しｆ二。得 られた結果をコダックトリエックスパンフィルム（Ｋｏｄａｋ　Ｔｒｉ−Ｘ　Ｐ ａｎ　ｆｉｌｍ）を使用して、（ａ）覆土と（ｂ）血液塗末標本を１０００倍で とった写真を第１図に示す。結合した抗体は鮮やかな緑色の蛍光としてみえるの であるが、明らかにすべての場合にそれがみられた。モノクローナル抗体の力価 は高＜、（ｔｏ＠分の１希釈）、覆土およびエリスロサイト期にも同じように活 性である（試験されたエリスロサイト期に対して育生された池のモノクローン抗 体は１０分の１の希釈でも覆土を染色しない。）。

プラスモジウム・ファルシパルムの非同時性インビトロ培養体、単離Ｋｌ（５％ 寄生虫血）をトレーガ−とイエンセン（同誌）の手法に従い作り、１度ＰＢＳ中 で洗い、Ｏ１％サポニンＰＢＳ中４℃で溶解する。

取り出した寄生虫（約２．５Ｘ１０’個）をＰＢＳ中で３回洗浄し、必要な時ま での貯蔵のために一７０℃でベレットにして凍結する。ペレットを電気泳動に使 用するためゲル試料緩衝液中沸騰させて溶解し、レムリ。

ネイチャー、１９７０年、第２２７巻、第６９０頁の手法に従い１０％ゲルでソ ジウム　ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル泳動法（Ｓ　Ｄ　Ｓ　 −Ｐ　ＡＧＥ）に供するのがその時の操作量は約１００μｇの全タンパク質であ る。このタンパク質の量はゲルに負担をかけすぎであるが、この量は検出される タンパク質が全タンパク質のほんの少しの割合しか構成しない時は任意にできる 。

電気泳動ゲルで分離されたタンパク質は、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、プロシ ーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ ・ザ・ニーニスニー、１９７９年、第７６巻、第４３５０頁に記述されているウ ェスタン　ブロッティングとして知られている手法を使用することにより、ニト ロセルロース紙に移される。ニトロセルロース紙上の所望のタンパク質の位置は トウビン（同誌）に記述されたＥＬＩＳＡ手法により明らかにされる。ニトロセ ルロースプロットをまず実施例２に述べたように２００分の１に希釈した腹水流 動体の形態の５．１−１モノクローナル抗体で調査する。続いて５００分の１に 希釈しｆこ血清の形格でポリバレントラビット抗マウスｌ　ｉＧ　（ｐｏｉｙｖ ａｌｅｎｔ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ、　Ｉ　ｇＧ　）で調査し、 最後に１０００分の１の希釈でホースラディツシュ（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ ）・ペルオキシダーゼ複合ボート抗うビットＩｇＧ　（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒ ａｂｂｉｔ　Ｉ　ｇＧＸシグマ）で調査する複合酵素はオルトージアンスジン・ ジハイドロクロライド（０−ｄｉａｎｉｓｄｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒ ｉｄｅ）（シグマ）お上び過酸化水素と反応して、所望のタンパク質の位置で色 を生長させる。

インビボで生じたタンパク質と実施例５および６の手法により作られたモノクロ ーナル抗体５．１−１に結合したエピトープを含む他のタンパク質との比較を簡 単にするため、すべてのこれらのタンパク質についての特性データは実施例７に 示した。

硫酸アンモニウム沈殿とＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより腹水流動 体から精製したモノクローナル抗体５．１−１を製造業者により指示され１こ手 法に従いｃＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉ ａ）社製）に結合してアフィニティクロマトグラフィーを作製した。この手法は ｔｍＭＨｃＱ中で洗浄することによりＣＮ　Ｂ　ｒ活性化セファロースの再活性 化を含むものである。０　、１　Ｍ　Ｎ　ａＨＣＯｓ、０゜５Ｍ　ＮａＣＱの免 疫グロブリンを循環させながら２時間セファロース物質と接触さけ結合を効果的 に行なわせる。セファロース物質上に残存する結合部位は、ｐＩ（８の０．２Ｍ グリシンと２時間循環処理し、続いて０゜１Ｍアセテート、ｐＨ４，０の０．５ Ｍ　ＮａＣ（２および、０　、１　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｘ、０．５ＭＮａＣ＆の 連続操作を３回行ない洗うことにより、不活性化される。以上の操作で生じたア フィニティクロマトグラフィー物質はＰＢＳ中に貯蔵する。

５ＸｌＯ”個の寄生虫を含むプラスモジウム・ファルシパルムの非同時性培養物 からのタンパク抽出物を界面活性剤ＮＰ４０（ＢＤＨ）で溶解し、ホルダーとフ リーマン、ネイチャー、１９８１年、第２９４巻、第３６２頁に述べられている ように調製した。抽出物はアフィニティクロマトグラフィーカラムに供するが、 ４℃で８Ｍ尿素で結合タンパク質を溶出する前に、簡単に抽出緩衝液で洗う。約 ＩＯμｇのタンパク質の収量であった。　固体製品を作るために、溶出物をトリ ス−緩新生理的食塩水（ｐＨ７）に対して透析し、凍結乾燥により濃縮する。本 実施例のタンパク質の特性データは実施例７に示した。

実施例６ ｍ　ＲＮ　Ａ使用によるエピトープ５．１−１含有タンパク質の調製 タンパク質を非同時性培養（ハイドら、同誌）から得られた３５Ｓ−メチオニン およびプラスモジウム・ファルシパルムポリＡ“ｍＲＮＡで捕捉された網赤血球 溶解物インビトロ翻訳系（ベルハムとジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナル・ オブ・バイオケミストリー、１９６７年、第６７巻、第２４７頁）中で合成する 。

翻訳された物質（５Ｘ　Ｉ　Ｏ’　ｃｐｍに等しい）の一部分を実施例５で述べ た５、１−１モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーに供する。本 実施例の特性データは実施例７に示した。

実施例７ エピトープ５．１−１含有蛋白質のキャラクタリゼ図２は実施例４．５および６ のタンパク質を特徴付けるものであり、得られたそれらのタンパク質を代表する ９個のトラック（ｔｒａｃｋｓ）を・示す。

実施例４．５．６のタンパク質は、それぞれ２３゜０００　ダルトン、２２．０ ００　ダルトン、２４，５００　ダルトンに見つもられた分子量をしているとわ かった。

種々のトラックは次のようにして得た。

１、実施例４で述た方法で得、コマシブリリアントブルーＲ（Ｃｏｏｍａｓｓｉ ｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ）で染色した全寄生虫タンパク質につい て５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

２．２としては、銀染色法（モリセイ、アナリティカル・バイオケミストリー、 １９８１年、第１１７巻、第３０７頁）によって視覚化した。

３、実施例５で述べたアフィニティクロマトグラフィーによって得られたタンパ ク質について実施例４に述べた手順による５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

銀染色法により視覚化。

４、実施例４で述べたようにして得、視覚化した全寄生虫蛋白質のウニスタンブ ロッティング。

５、実施例５の精製タンパク質のＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　ＧＥトラックのウェス タンブロッティングで、実施例４で述べたようにして得、視覚化し几。

６、”Ｓ−メチオニンでラベルした全寄生虫タンパク質についての実施例４によ る５ＤＳ−ＰＡＧＥ［ディーンズら、モレキュラー・アンド・バイオケミカル・ バラノトロノー、１９８３Ｌ第８巻、第４５頁の手段によるプラスモノラム・フ ァルシパルムのトレーガ−とイエンセン（同誌）に従い非同時性培養中３５Ｓ− メチオニンで新陳代謝的にラベルし、実施例５−３００ｃｐｍの三塩化酢酸（Ｔ ＣＡ）沈殿物質倉荷する−で述べたようにＮＰ４０で抽出したタンパク質〕。

ゲルはフルオログラフィーの処理を施しくボナ巻、第８３頁）、乾燥して、オー トラジオグラフィーを行なった。

７、実施例５（３ｘ　ｌ　Ｏ”ｃｐｍのＴＣＡ沈殿性物質を含む）の手順により 全タンパク質のアフィニティクロマトグラフィーにより得られた３５Ｓ−メチオ ニンラベルタンパク質についての実施例４手順による５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルは フルオログラフィー処理を施し、乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。

８　実施例６（５０００ｃｐｍの沈殿性物質を含む）で述べた方法で得られた３ ５Ｓ−メチオニンラベルした全インビトロ翻訳産物についての実施例４の手順に よる５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルはフルオログラフィー処理を施し、乾燥してオート ラジオグラフィーを行なった。

９、実施例６に述べたようにアフイニテイクロマトグラフイーにより全インビト ロ翻訳生産物から分８８れたｆｆ５Ｓ−メチオニンラベルタンノくり質について の実施例４の手順による５ＤＳ−ＰＡＧＥ（５ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｐｍのＴＣＡ沈 殿物の物質を含む）；ゲルはフルオログラフィー処理を施し、乾燥してオートラ ジオグラフィーを行なった。

次の分子量マーカー（ＭＷｔＭ、ファルマノア社製）を第２図中に示した目盛を 付けるために使用している；フェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）（２２０、ＯＯＯ ）、ホスホリラーゼｂ　（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｂ）（９４、０００） 　、アルプミ：ｚ（ａｌｂｕｍｉｎ８６７　、０００　）、カタラーゼ（ｃａｔ ａｌａｓｅ）（６０，０００）　、オヴアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（４ ３。

０００）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅ−ｈｙｄｒｏｇ ｅｎａｓｅ）（３６、０００）　、カルボニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎ ｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ（３０、０００）、トリプシンインヒビター（ｔｒｙ ｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０、１００）、フェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉ ｎＸ　１８　、５００　）およびα−ラクトアルブミン（α−１ａｃｔａｌｂｕ ＋＋＋１ｎ）（１４、４００）ａ第２図から、全タンパク質から得られたトラッ ク４においては単一のバンドが５　、１、−１エピトープを運んでおり、このバ ンドは、測定分子量２３，０００　をもつタンパク質として移動していることが わかる。トラック３と５もまたエピトープを運ぶ単一のバンドを示しているがこ れらの場合、タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィー精製物質であるの だが、測定分子１２２．０００　ダルトンに対応する速さよりわずかに早く移動 している。クロマトグラフィーにかけられた３５Ｓ−メチオニンラベルｍＲＮＡ 全翻訳タンパク質から得られたトラック９はアフィニティクロマトグラフィー力 ラムが数種類のインビトロ製産物を非特異的に捕えていることを示している。し かし、カラムは測定分子量２４，５００の新規タンパク質を特異的に保エピトー プ５．１１含有タンパク質のヒト血清による識別 第３図は実施例４および５のタンパク質とヒト血清との反応を特徴づけるもので あり、それらの得られたタンパク質を代表する６個のトラックを示す（実施例４ および５のタンパク質はそれぞれ測定分子量２３゜０００ダルトンおよび２２， ０００　ダルトンである）。

Ａ、実施例７と同様にして得られた５ＤＳ−ＰＡＧＥで（１）は全寄生虫タンパ ク質についてであり、ウェスタンブロッティング後抗原がみえるように量を多く しである。そして（２）は実施例５でアフィニティクロマトグラフィーによって 得られたタンパク質である：両ゲルとも銀染色法で視覚化している。

Ｂ、ニトロセルロースへ移したへのタンパク質（【）および（２）のウェスタン プロブティング、実施例７と同様にＥＬＩＳＡ手頚で調手順、まず、プロットを ２００分の１希釈て実施例２に述べたように調製した腹水流動体の形態で５．１ −１モノクローナル抗体で調査し、そして、ポリバレントラビット抗マウス［ｇ Ｇ　（５００分の１希釈）に続いてホースラディツシュペルオキシダーゼ複合ボ ート抗うビットＩ　ｇＧ　（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔｉｇｃ）（１０ ００分の１希釈）で調査した。

Ｃ，ニトロセルロースへ移したＡのタンパク質（１）および（２）のウェスタン ブロッティング；実施例７と同様にＥＬＩＳＡ手順で調査し、まず、マラリア風 土性の地域であるニカラグアに住む妊婦から集めた５０の血清試料をプールする ことによって得られたヒトの血清（２００分の１希釈）調査し、ついでホースラ ディツシュペルオキシダーゼ複合ボート抗ヒトＮＧ（シグマ１０００分の１希釈 ）で調査した。

Ｄ、ニトロセルロースへ移したＡのタンパク質（１）および（２）のウェスタン ブロッティング；実施例７と同様にＥＬＩＳＡ手順でプローブし、まず、プラス モジウム・ファルシパルムマラリアに全熱さらされていない個人から得たヒト血 清（２００分の【に希釈）で調査し、次いで、ホースラディツシュペルオキシダ ーゼ複合ボート抗ヒトＩｇＧ（シグマ１０００分の１に希釈）で調査した。示さ れた目盛は実施例７と同じ分子量マーカーを使用した。

第３図中では、モノクローナル抗体５．１−１（Ｂ）および風土性血清（Ｃ）に よって示されたバンドが特異的である。免疫されていない血清ついてはバンドが 全く見えない。トラックＢ２では５．ｉｌエピトープは測定分子量が２２，００ ０　ダルトンのタンパク質の形に見えるがトラックＢｌでは、５．１−１エピト ープは測定分子量が２３，０００　ダルトンのタンパク質の形で検知されている 。プールされたヒト血清はＣ１に全寄生虫タンパク質の中にある多くの抗原を検 知しているが、ＢおよびＣのトラック１および２中のバンドの位置と強度を比較 すると測定分子量が２３，０００ダルトンのタンパク質であることを示している １つの特別強いバンド（矢印で示した）が存在する（セファロースに結びついた アフィニティクロマトグラフイー精製タンパク質は、このプールされた血清中の １％抗体と特異的に結びつく。）。

実施例９ エピトープ５．１−１含有バクテリアクロ一ン発現タンパク質の調製 ファージλｇｔ　１１−　Ａｍｐ３　（１ａｃ５、ｎ１ｎ５、ｃＩ８５７．５ｔ ｏｏ、ａｍｐＲ）中の登録プラスモジウム・ファルシパルムｃＤＮＡ（タイのＫ ｌと命名されたプラスモジウム・ファルシパルム単離体から得られ、タイトング とビーレ、トランザクション・才ブ・ザ・ロイヤル・ソサイアティー・才ブ・ト ロピカル・メディシン・アンド・ハイノン、１９８１年、第７５巻、第２７２頁 に記述されている）をヤングら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニーニスニー、１９８３年、第８０ 巻、第３７８７頁に述べられているように調製し、ｍ　ＲＮ　Ａからコピーされ た単らせんｃＤＮＡ（ハイドら、モレキュラー・アンド・バイオケミカル・バラ シトロジー、１９８４年、第１０巻、第２６９頁に述べられているように精製） を逆転写酵素を使い二重らせんｃＤＮＡに転化し、モしてｃＤＮＡをリンカ−で ファージのＥｃｏＲＩサイトへクローニングし、インビトロでλカプシド（ｃａ ｐｓ　１ｄｅ）へパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）する（スカレンゲーら、クロモ ツマ（ベルリン）、１９８１年２第８２巻、第２０５頁）。ライブラリーは、ヤ ングとデービス、サイエンス、１９８３年、第２２２巻、第７７８頁に述べられ ているようにエシェリヒア・コリＹ１０９０の非増大形態［△１ａｃＵ１６９　 、△Ｉｏｎ、　ａｒａＤｌ　３９、５ｔｒＡ、　ｔｈｉ、　５ｕｐＦ、　５ｕｐ Ｆ［ｔｒｐＣ２２：　：Ｔｎｌ　０１（ｐＭｃ　９　（１ａｃＩ”　、　ａｍｐ Ｒ））コで培養されている。

λｇｔｌ　１−Ａｍｐ３　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのため、ハイ ブリドーマ５．１−１により作られた抗体に認識された自然のエリスロサイト期 プラスモジウム・ファルシパルム抗原に耕具的なポリクローナル抗体調査を次の ように準備する。自然に得られた２３．０００　ダルトン分子量（５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによる）の抗原を、英国特許出願Ｎｏ、８４０４４９３の実施例５に記述さ れておりそして抗原を運ぶアフィニティカラムを供給するためにその実施例に述 べられている手順と同じ手順でＣＮＢｒ活性化したセファロースに共有結合的に 結合している抗体のアフィニティカラムを使用してアフィニティクロマトグラフ ィーにより、プラスモジウム・ファルノパルムエリスロサイト期の非イオン性先 争性抽出物から調製する。ファルシベルムマラリア風土性の地域に住んでいる個 人の全ヒトイムノグロブリンを生理的ｉｔ＋液（１０ｍＭ）リス（Ｔ　ｒｉｓ） 、０．１５ＭＮａＣ１、ｐＨ７，４）アフィニテイカラムに供した。カラムを洗 い終った後、抗原に対して特異的なポリクローンヒト抗体を低いｐＨＩ衝液（０ ，１Ｍグリシン、０．１５ＭＮａＣ！２．、　ｐＨ２，５）に溶出する。

ポリクローナル抗体を免疫的調査がトウビンら、プロシーディンゲス・才ブ・ザ ・ナショナル・アカデミイー・オブ・ザ・サイエンシズ・オブ・ニーニスニー。

１９７９年、第７６巻、第４３５０頁に記述されているようにホースラディシュ ペルオキシダーゼ複合第２抗体を利用すること以外はヤングとデービス、同誌に 述べられている類似の手順によりλｇｔ　１１−　Ａｍｐ３ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをス クリーンするために使用する。特に興味のある組換え体ファージを含有するリソ アンのスクリーニング手順による同定に続いて、組換え杯ファージ、およびそれ に対応するＤ　Ｎ　Ａとタンパク質は次のようにして得られろ。

ファージ調製 エシェリヒア・コリ　Ｙ１０９０を組換え体ファージで溶原性にする。溶原化は Ｌ−ブイヨン（Ｌ　′−ｂｒｏｔｈ）（バクトドリブトン（Ｂ　ａｃｔｏ　Ｔ　 ｒｙｐｔｏｎ）、ｌＯｇ、ディフコ・バクト・イースト・エキストラクト（Ｄｉ ｆｃ。

Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ）、５ｇ、ＮａＣ１，５ｇ、１名にな るまでの水、ｐＨ７，２）中、３０°Ｃでファージと生長バクテリアを同数混合 して感染せず生き残ってい６．＜９？’）ア。ｉ　Ｍ　ｉ−ヵ４い。１．ッヶ２ ？。、ゎ４いファージ（λ　ｃＩ−″）を使用することによりリソアンを選択す ることにより行なわれる。

Ｃ＊＊＊）　あるいは、耐アンピンリン性（５０μｇ／ｍｉ）を有するリソアン を選択してもよい。

確認されたリソアンをＬ−ブイヨン中３０℃振動させながら生長させ０．４５の ０Ｄ６５゜とする。そしてリソアンを４２℃のウォーターバス中へ入れ２５分振 動し、続いて３７℃定温器へ移し、振動させながら成長させる。０Ｄａ５ｏ値に 続いて、培養を始めてから典型的には約９０分後に培養物が完全に溶解する。そ してクロロホルムを２　ｍ、ｅ／リットルの濃度で培養物に加え、培養物を遠心 分離機にかける（８５００ｇ、１０分、４℃）。表面浮遊物質を移して、遠心分 離（４３０００ｇ、３時間、４℃）によりその表面浮遊物からファージをベレッ トにする。そしてファージを緩衝液（Ｋ　ＨｔＰＯ，，３ｇ′；Ｎａ、ＨＰＯ， ，７ｇ　；　ＮａＣ１，５ｇ：０．１Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，水溶液、１０　ｍｌ：　０ ．０１Ｍ　ＣａＣ！、水溶液、ｌｏｍ、ｉ；１％ゲル化水溶液、１　ｍ兇ψ　； Ｉリットルになるまでの水）中、最初の培養物７５０Ｊ当りＩＯＪの緩衝液濃度 で４°Ｃで振動させて再び＠濁する。ファージ緩衝液中ファージの９．濁液に塩 化セシウム（再＠濁ファージ１０ａＪ当り７．３ｇ）を加え、遠心分離（１００ ０，０００９，２６時間、４℃）１　ｍＭ）　（Ｔ　ｒｉｓ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ ）に対してｐＨ８で透析する。

ＤＮＡ調製 ＤＮＡは次のように精製ファージから調製する。ファージの懸濁液とフェノール ／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）とを同じ量を混ぜてタンパク物質を取り除き、 水性相を集める。そしてこの抽出手順を４回行なう。そして最後の水性相をエー テルで２回抽出し、残りのＤＮＡを含んでいる相をＴｒｉｓ（５０ｍＭ）と５Ｄ Ｓ（０，０５％ｖ／ｖ）含有後新液（ｐＨ８）中プロティナーゼＫ（０゜５ｍｇ ／ｚｌ最Ｐ：ａ度）で処理し、残査のタンパク質を変性させ消化する。その処理 溶液を再びフェノール／クロロフォルム（１：ｌｖ／ｖ）で−回抽出し、エーテ ルで２回抽出する。最後にＤＮＡをエタノールで沈殿させ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ （１）Ｈ８）に再び溶解させる。

タンパク質調製 エシェリヒア・コリリソゲンをＬ−ブイヨン中３０℃で振動させ０．３のＯＤ、 、。まで育生する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子からの発現が、イソプロピルチ オ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）の１００　ｍＭ　−水溶液をｐ過滅 菌して最終ＩＰＴ’Ｇａ度１　ｍＭになるよう培養物に加えることによって引き おこされろ。３Ｏ℃で培養物の振動をさらに２時間続けて細胞をベレットにする （４，０００ｇ、５分、２２°Ｃ）。ペレット化された細胞をラエムリの５ＤＳ −サンプル緩衝液（ネイチャー、１９７０年、第２２２巻、第６８０頁）中に取 り初期培養物体積の３％体積にする。そして緩衝液試料を遠心分離にかけ、（１ ２，０００ｇ、５分）非溶解性の物質を取り除き、そして表面浮遊物質を１トラ ツク当す２５１’ｌ）８度でＳＤＳ　ＰＡＧＥｌＯ％ゲルニかける（ラエムリ、 同誌）。

エシェリヒア・コリリソゲンの形で２つの特別なりローンを得るために実施例９ に述へに手頃を使用した。

これら２つはλＡｇ５　、１　（８）とλ、Ａｇ５．１　（９）に命名され後者 を受け入れ番号ＮＣｔＢ１２Ｑ１６の元に供託した。λＡｇ５　、１　（８）お よびλＡｇ５　、１　（９）に対する色々な抗体調査の反応が研究され、λＡｇ ５　、１（８）、λＡｇ５　、　ｌ　（９）およびλｇｔｌ　ｌ−Ａｍｐ３（コ ントロールとして）に対応する３セツトのフィルターを各フィルターを適当なフ ァージの約１５０のプラグをもつ平板調製しており、エシェリヒア・コリ　Ｙ１ ０９０　について培養して使用している。各セットのフィルターの１つを（ａ） ラビット抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清、（ｂ）風土性ヒト血清イムノグロブ リン、（Ｃ）５、ｉｌエピトープ特異性抗体を除いた風土性ヒト血清イムノグロ ブリン、（ｄ）５．ｉｌエピトープ特異性ポリクローナル抗体および（ｅ）ハイ ブリドーマ５．１−１から得られたモノクローナル抗体で調べた。各ファージは ラビット抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清により認識されるプラクを与え、一方 λｇｔ　１１−　Ａｍｐ３プラクは反応しなかったがえＡｇ５．１　（８）およ びλＡｇ５．１　（９）プラクは風土性ヒト血清イムノグロブリンと反応した（ しかし５．１−１工ピトープ特異性抗体を除去した血清とは反応しなかっｆこ） 。５．１−１エピトープに特異的なポリクローナルヒト血清はえｇｔｌｌ−Ａｓ ｐ３中のタンパク質への非特異的結合を事実上まっｆこく示さず、一方、λＡｇ ５　、１　（８）およびλＡｇ５゜１　（９）はこの調査で認識されるプラクを 与えｆこ。最後に、λＡｇ５．１　（８）お上びλＡｇ５．１　（９）プラクは 、λｇｔ　ｌ　１−　Ａｍｐ３プラクはそうではないが、ハイプリドーマ５．１ −１によって作られるモノクローナル抗体により認識されることがわかった。

これらのクローンに含有されているＤＮＡ挿入物を単離し、Ｍ１３ａ＋ｐＨ中へ 再クローン化し、チェインターミネータ法により配列決定し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ によりλＡｇ５．１（８）挿入物が約３３０の塩基対を測定し、λＡｇ５．１　 （９）挿入物が約６６０の塩基対を測定したが実際に存在する塩基対の数は各場 合これよりも幾分小さい。クローンの全体的構造を第４図に示し、挿入物に対し て決定された詳細な構造をクローンλＡｇ５．１　（８）については第５図（ａ ）に、クローンλＡｇ５．１　（９）については第５図（ｂ）に示す。各場合２ つのＧＡＡＴＴＣＥｃｏＲｌ　部位の間に存在するヌクレオチドは、ヌクレオチ ドとアミノ酸残基に番号を付してページの上部左端から下部右端へ５′〜３′へ の配列に示されており、ヌクレオチドは丸かっこでヌクレオチドの上に（最初の アラビア数字を数の関係しているヌクレオチドの上に）そしてアミノ酸残基は角 ガッコで示してあり、第５図（ａ）ではＣＧＣコドンのＣとこのコドンに対応す るアルギニン残基でそれぞれ１として始め、第５図（ｂ）ではＡＴＧコドンのＡ とこのコドンに対応するメチオニン（ａ＋ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）残基でそれぞれ ｌとして始めている。これらの図中、およびこの明細書中のほかの場所には、慣 習的な記号を採用している。即ち、Ａ、Ｃ，ＧおよびＴをそれぞれアデニン（ａ ｄｅｎｉｎｅ）　、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ ）およびチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）塩基を含有するヌクレオチドを示すために使 用しており、色々なアミノ酸残基を次のような記号で表わしている。

アラニン（Ａ　１ａｎｉｎｅ）　＝　Ａ　ｌａアルギニン（Ａ　ｒｇｉｎｉｎｅ ）　＝　Ａ　ｒｇアスパラギン（Ａ　ｓｐａｒａｇｉｎｅ）　＝　Ａ　ｓｎアス パラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ）　＝Ａｓｐグルタミン（Ｇ　ｌｕｔ ａｍｉｎｅ）　＝　Ｇ　ｉｎグルタミン酸（Ｇ　ｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ）　 ＝　Ｇ　ｌｕグリシン（Ｇ　１ｙｃｔｎｅ）　＝　Ｇ　ｌｙヒスチジン（Ｈ１ｓ ｔｉｄｉｎｅ）　＝　Ｈｉｓイソロイシン（Ｉ　５ｏｌｅｕｃｉｎｅ）　＝　ｒ 　Ｉｅロイシン（Ｌ　ｅｕｃｉｎｅ）　−Ｌ　ｅｕリジン　（Ｌ　ｙｓｉｎｅ） 　＝　Ｌ　ｙｓメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）　＝　Ｍｅｔフェニルアラ ニン（Ｐ　ｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）　＝　Ｐ　ｈｅプロリン（Ｐ　ｒｏｌｉ ｎｅ）　＝　Ｐ　ｒ。

セリ：／　（Ｓ　ｅｒｉｎｅ）　＝　Ｓ　ｅｒスレオニン（Ｔ　ｈｒｅｏｎｉｎ ｅ）　＝　Ｔ　ｈｒチロシン（Ｔ　ｙｒｏｓｉｎｅ）　＝　Ｔ　ｙｒバリン（Ｖ 　ａｌｉｎｅ）　＝　Ｖ　ａ１２つのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは第５図（ａ）５（ｂ）の 比較から明らかなように３′末端に向かって重複している。クローンλＡｇ５． １　（９）に存在する遺伝子の真の配列と一部異なっている１５の塩基対配列が λＡｇ５．ｉ　（８）クローンＥｃｏＲＩ部位に続いて存在することがわかる。

このことはｃＤＮＡの第２の鎖の合成の下準備のために使用されるトリ骨髄芽球 症つィルス逆転子酵素が第１の鎖の中のループを使用し、正確でないループ領域 （前述の１５の塩基対によって表わされている）で塩基対形成の下＄備を生じさ せろｆニめに起るのである。

両押入物は［λＡｇ５　、１　（８）およびλ、Ａｇ５．１　（９）中それぞれ Ｉ８およびＩ２残基の；ポリーＡ末端をしている。配列はまｆニボリーへ末端か ら上流にある潜在的ナポリアデニル化信号４へＡ　Ｕ　Ａ　Ａを与えろヌクレオ チドグループＡ　、Ａ　Ｔ　Ａ　Ａを含有しているので、両クローンは自然に発 生する構造遺伝子のためのｍＲＮＡの３′末端を表わしていると仮定される。

５′末端にλＡｇ５．１　（８）挿入物はβ−ガラクトシダーゼがβ−ガラクト シダーゼの融合およびこのクローンにより製造されるプラスモジウム・ファルシ パルムタンパク質の融合をひき起こす段階に読み取り枠を有する。対照的に、え Ａｇ、５　、１　（９）挿入物はβ−ガラクトノダーゼのそういった段階に５′ 末端に意味のないコドンをもっているので、このクローンは融合タンパク質を生 じない。λＡｇ５　、１　（９）の翻訳は、ＡＴＧコドン（塩基対１．２および ３と番号を付けられている）でエシェリヒア・コリ中で開始されると信じられて おり、明らかなンヤインダルガルノの配列は存在しないけれども、普通バクテリ ア開始部位で生じるヌクレオチドが（−１，−２，−３，−２０，＋４゜＋５． ＋５．−７．　＋ｌ　Ｉおよび＋１２の位置）付近に浮性する。同じ開始コドン （ま１こは近（の上流にあろコドン）か寄生虫の中で使用されるように考えろれ ろ。コード化配列の５′末端（ｌから６９までの位置）にアラニン−２２の後に 開裂ｇ９うるてうろう完全なノグナルベブチドを合成するための遺伝情報を指定 する−そろい２３のコドンか存在する。この事は、寄生虫がタンパク質をエキス ボートすることおよび第１翻訳生産物が明らかに最終形格のタンパク質より大き いという観察結果と一致する。さらに、その事は寄生虫内で使用される開始コド ンから作られる指示を支持する。疎水性残基バリン−８０からチロノンｌｏｔの 長い内部配列はタンパク質合成の間ストップートランスファ　−（ｓｔｏｐ　− ｔｒａｎｓｆｅｒ）配列として作用するということに気付くべきである。

ヌクレオチドｌから４８６よりなるクローンλＡｇ５．１　（９）に存在するコ ード化配列は、それが自然のタンパク質の移動度に近い移動度をしている１６２ のアミノ酸残基タンパク質の合成を指図するので、自然の構造遺伝子のコード化 配列の全体に対応するものと認められる。アスパラギン−１２０からプロリン− １３７にわたる１８個のアミノ酸配列、Ａｓｎ−Ａｌａ−４へｓｎ　−Ｐ　ｒｏ 　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｐ　−（Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅ ｒ）−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒ。

はスポロザイトの表面と共有しているイントラーエリスロサイト期エピトープを 形成すると考えられており、１５個のかっこでくくっていない残基は特に重要で あのクローンからのタンパク質は興味のある分子量範囲に妥当なｌＯ％ｗ／ｖゲ ルを使用して「タンパク質調製」で述べたラエムリの手順に従い５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分離した。

（＊＊＊＊）本実施例で述べた手順の変化の中で、２つのファージクローンλＡ ｇ５．１　（８）およびλＡｇ５．１　（９）のリソゲンをヤングとデービス、 ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ ・オブ・ザ・ニーニスニー、１９８３年、第８０巻。

第７１９４頁に述べているエシェリヒア・コリＢＴＡ２８２Ｃ△１ａｃＵ　１６ ９　、ΔＩｏｎ、　ａｒａＤｌ　３９、５ｔｒＲ，ｔｈｉ、　ｈｔｌａｌ　５０ （ｃｈｒ：　：ＴｎｌＯ）ｈｓｄＲ〜Ｍ”］中に調製し、この株は遺伝子がスイ ッチされることがないようにエシェリヒア・コリ　Ｙ１０９０が含有するｌａｃ リプレッサーを欠如している。これらのエシェリヒア・コリＢＴＡ２８２リソゲ ンはエシェリヒア・コリ　Ｙ１０９０リソゲンの調製に使用したのと同様の方法 で「ファージ調製」に述べられているようにして得られる精製ファージλＡｇ５ 　、１　（８）およびλＡｇ５．１　（９）から調製される。

エシェリヒア・コリ　ＢＴＡ２８２リソゲンをＩ　ＰＴＧを使用しないこと以外 、エシェリヒア・コリ　Ｙ１０９０リソゲンについて述べた同様の方法でタンパ ク質を調製するために使用したが、その際リソゲンを他の場合にＩＰＩＧで可能 な制御をすることなくタンパク質の収量を上げるために４２℃の温度に上げるこ とにより誘導する。Ｙ１０９０リソゲンからのタンパク質の収量の方がよいけれ どもＢＴＡ２８２リソゲンも満足のいく収量を示す。

分離タンパク質をニトロセルロースにウニスタンプロツトシ、トウビンの同誌の 手順によりホースラディンユベルオキシダーゼ複合第２抗体を使用して免疫学的 に調査した。使用した抗体はラビット抗−β−ガラクトンダーゼ抗血清および２ ００分のｌ希釈で前記しｆこように調製し１こ自然の抗原に特異性のめるポリク ローナルヒト抗体でめった。これらの手順は実施例４および７により詳細に論じ られている。得られｒこ結果を第６図に示してあり、トラックｌから６はラビッ ト抗−β−ガラクトンダーゼ抗血清での調査に関するものであり、トラック５か ら１１まではポリクローナルヒト抗体での調査に関するものである。トラックｌ はβ−ガラクトシダーゼ（０，２’ｇ、シグマ）を含有し、一方トラック２から ２までは次の誘導リソアンからの全タンパク質を含有する：エシェリヒア・コリ 　ＢＴＡ２８２（λｇｔ　ｌ　１−　Ａｍｐ３　）（）ラック２および５）、エ シェリヒア・コリ　ＢＴＡ２８２（λＡｇ５．１　（９）（トラック３および６ 　）、エシェリヒア・コリ　ＢＴＡ２８２（λＡｇ５．１　（８Ｘ　トラック４ および７　）、エシェリヒア・コリ　ＹＩ０９０（λｇｔｌ　１−Ａｍｐ３）０ ラツク８）、エシェリヒア・コリ　Ｙ１０９０（λＡｇ５　、１（９））（トラ ック９）およびエシェリヒア・コリ　ＹＩＯ９０（λＡｇ５．ｌ　（８））（） ラックＩ　Ｏ）。トラック１１は２．５ＸＩＯ’個のサポニン溶解エリスロサイ ト期寄生虫からのタンパク質を含有している。キロダルトンＭＷｔＭ　目盛を付 与する１こめに使用されている分子量マーカーは次のようなファルマンア社製の ものである：フエリチン（２２０，０００）、ホスホリラーゼｂ（９４，０００ ）、７／ｌ、ブミ：／（６７，０００）、カタラーゼ（６０，０００）、オヴア ルブミン（４３，０００）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（３６，０００）、カ ルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００）、トリプシンインヒビター（２０， １００）、フェツチ：ｚ（１８，５００）およびα−ラクトアルブミン（１４， ４００）。目盛についての２２．２３および２４キロダルトンの数字は便利さの ために、２０．１および１４．４キロダルトンマーカーから外挿したものである 。

λＡｇ５　、１　（８）リソアンは天然のβ−ガラクトシダーゼサブユニットよ り太きく（トラックｌ、２および４を比較参照）そしてポリクローナルヒト抗体 調査により認識される（トラック７および１０を参照）融合タンパク質を作るこ とが第６図から判る。対照的に保菌生物だけを含むコントロールリソアンは抗− β−ガＭＷｔＭ　ｉ　２　３　４　’５　６　’ニア　ａ　９ＴＴＴ　ＡＴＡ　 ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＴＡＣＰ ｈｅ　Ｉｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｔ　Ｌ ｅｕ　ＴｙｒＡＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　’ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＣＣＣ Ａ　ＴｒＣＡＡＡ　ＡＴＡＧＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣＧＡＣＣＣＡ　ＧＣｒ　ＧＡ Ｔ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣＣＣＡＧａｙ　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＡＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　Ｃ ＣＡ　ＡＡＴＡｓ　ｕａ　Ａｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＧＩ　Ｇｌ ｕ　Ｐｒｏ　ＡｓｎＧＣＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　 ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＡＣＡＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　Ｇ ＧＴ　ＣＡＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌａｕ１１ａ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ 　ＶＪＬＩ　Ｐｈｅ　Ｐｈ＠Ｌａｕ　にＬａ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　ＰｈａＡＴＣＡ ＴＴ　ＴｒＣＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＣＴＴＡ　ＧＣＣＧＡＡ　ＡＡＡＴ ｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｓ ｅｒ　５ｅｒＡＡＡＡＡＡ　〜μ　ＡＡＴ　思　Ｍ五　０話　ＴＣＡ　Ｇα　Ｇ ＡＡ　ＣＣＡＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓａ ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＣＧＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　Ｇ ＡＴ　ＡＴＧＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　（：Ｔｒ　ＧＴ Ｔ　ＧＡＡ　ＧＴｒ　ＡＡＣＨｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｇｌｕ　ＶＪＩＩ　ＡＪ（ＩＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＣＣ ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴｒ　ＧＣＣＡＣＴ　ＴＣＡＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　５ｅｒＧＴＡ 　ＣＴＴ　ＧＣＡ　Ｇ（、’Ｔ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　Ｔ ＣＣＡＣＣＡｊｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＨｌｓ　Ｐｒｏ　 Ｐｈａ　Ｌｙｓ　ｌ１ａＧＣＧ’ｒｒＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧτＣＡＡＡＡ ＴＡＡＴＴｒＴＴＡＴｒＴＡτＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴｒＧＣＴＡ ＴＴs ＴｍＧＧ晶ＴＴＣ ＦＩＧ、　５ｂ ’Ｉ　２　３　Ｌ５　６　７　８　９　ｊＯｊＩ　？＃ｔｔＦＩＱｐＨＧ、６ 閃ＴＡツ否鮒告 国ＶＡ調：ｉ！Ｆ報告 ｍＡｍ　ｋにτ／ＧＢ　８５１０００フ。

ＰＣＴ／ＧＢ　！１５１０００フ０ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ロー　ＩＮＴＥＲＩＪＡＴ？０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣ）！　Ｒ ＥＦＯＲＴ　０ｈｒＮＴＥＲＮＡτＸ０ＮＡＬ　ＡＰ？Ｌ工ＣＡＴＺＯＮ　Ｎｏ 、　ＰＣ”ｉ’／Ｃ；Ｂ　８５０００７０　（ＳＡ　１ｉ１７９１）Ｔ：ＩＩｐ ｏＸ：ｔ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連して天然 に存在するエピトープを含有し、該寄生虫のイントラーエリスロサイト形態と種 虫表面の両方と反応性を有する抗体を生体内投与において発生させる抗原性物質 。
2. ２．プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連して天然 に存在する抗原中に存在するアミノ酸残基シーケンスを含有し、該シーケンスが 種虫表面に含有されるエピトープに対応する、マラリアに対するワクチン接種に 使用するのに適した抗原性物質。
3. ３．（１）プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連し て天然の抗原中に全体もしくは一部分が存在するアミノ酸シーケンスを含有し、 および（２）該寄生虫の種虫期に存在する抗原性物質に分有されたエピトープを 保有することを特徴とする、マラリアに対するワクチン接種に使用するのに適し た免疫原性の抗原性物質。
4. ４．（１）プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連し た抗原中に全体もしくは一部分が天然に存在するアミノ酸シーケンスを含有し、 および（２）該寄生虫の種虫期に存在する抗原に分有されたエピトープを保有す ることを特徴とする、合成の免疫原性ペプチドもしくは蛋白質である抗原性物質 。
5. ５．分子量が２０，０００〜２５，０００ダルトンの範囲にある第１項から第４ 項いずれかに記載の抗原性物質。
6. ６．（１）分子量が２０，０００〜２５，０００ダルトンの範囲にあり、（２） 寄生虫のイントラーエリスロサイト形態と関連して天然に存在し、および（３） 寄生虫の種虫期に存在する抗原性物質に含有されたエピトープを保有することを 特徴とする、プラスモジウム属の寄生虫の免疫原性蛋白質抗原である、マラリア に対するワクチン接種に使用するのに適した抗原性物質、または該抗原性物質か ら誘導され、該エピトープを発現するアミノ酸残基を含む該抗原性物質中のアミ ノ酸残基シーケンスの全体もしくは一部分を含有する抗原性物質。
7. ７．寄生虫がプラスモジウム・ファルシパルムである第１項から第６項のいずれ かに記載の抗原性物質。
8. ８．プラスモジウム・ファルシパルム寄生虫から誘導され、分子量が２３，００ ０ダルトンである第６項記載の抗原性物質。
9. ９．プラスモジウム・ファルシパルム寄生虫から誘導され、分子量が２２，００ ０ダルトンである第６項記載の抗原性物質。
10. １０．以下のアミノ酸残基シーケンスの全体もしくは一部分を含有し、プラスモ ジウム・ファルシパルム種の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態中に存在す るエピトープを有する免疫原性の抗原性物質：【配列があります】。
11. １１．２つのアミノ酸残基連結グループ【配列があります】および【配列があり ます】 を有する第 １０項記載の抗原性物質。
12. １２．第一グループの末端アスパラギン酸残基および第二グループの末端アスパ ラギン残基がＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ残基グループを介して連結された第１１項 記載の抗原性物質。
13. １３．以下のヌクレオチドシーケンスの全体もしくは一部分を含有し、プラスモ ジウム・ファルシパルム種の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態中に存在す るエピトープに対するシーケンスコーディングを有するＤＮＡおよび同じアミノ 酸残基に対する等価のヌクレオチドシーケンスコーディングを有するＤＮＡ：【 配列があります】。
14. １４．２つの連結ヌクレオチドシーケンス【配列があります】および【配列があ ります】 並びに同じアミノ酸残基に対 する等価なヌクレオチドシーケンスコーディングを有するＤＮＡを含有する第１ ３項記載のＤＮＡ。
15. １５．最後のシーケンスの末端ＧＡＴコドンおよび第２シーケンスの末端ＡＡＴ コドンがヌクレオチドシーケンス【配列があります】または同じ３個のアミノ酸 残基に対する等価なヌクレオチドシーケンスコーディングによって連結された第 １４項記載のＤＮＡ。
16. １６．エシェリヒア・コリリソゲンＮＣＩＢ１２０１６中に存在する、プラスモ ジウム・ファルシパルムから誘導されるヌクレオチドシーケンスを含有するＤＮ Ａ。
17. １７．クローニングビヒクルシーケンスおよび第１３項から第１６項いずれかに 記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
18. １８．クローニングビヒクルシーケンスがラムダファージから誘導されるもので ある第１７項記載の組換えＤＮＡ。
19. １９．クローニングビヒクルシーケンスがファージλｇｔｌｌもしくはそのモデ ィフィケーションから誘導されるものである第１８項記載の組換えＤＮＡ。
20. ２０．エシェリヒア・コリリソゲンＮＣＩＢ１２０１６として寄託されたクロー ンλＡｇ５．１（９）中に含有された組換えＤＮＡ。
21. ２１．第１７項から第２０項いずれかに記載の組換えＤＮＡを含有するホスト細 胞。
22. ２２．エシェリヒア・コリから誘導される第２１項記載のホスト細胞。
23. ２３．クローンλＡｇ５．１（９）を含有するエシェリヒア・コリリソゲンＮＣ ＩＢ１２０１６。
24. ２４．プラスモジウム寄生虫のイントラーエリスロサイト形態中に存在し種虫表 面に分有されたエピトープに対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマセル ライン。
25. ２５．寄生虫がプラスモジウム・ファルシパルムである第２４項記載のハイブリ ドーマセルライン。
26. ２６．第２４項もしくは第２５項記載のハイブリドーマによって生産される抗体 。
27. ２７．生理学的に許容される希釈剤もしくはキャリャーを含有する組成物形態で ある第２６項記載の抗体。
28. ２８．第１項から第１２項いずれかに記載の抗原性物質の調製に第２６項記載の 抗体を使用する方法。
29. ２９．不動化形態の第２６項記載の抗体。
30. ３０．抗原性物質もしくはその前駆体を、第２６項記載の抗体を保持した固体状 担持物質に吸収させ、次いで抗原性物質を担持物質から溶離させることを含む、 第１項から第１２項いずれかに記載の抗原性物質の調製方法。
31. ３１．プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連して天 然に存在するエピトープを含有し、該寄生虫のイントラーエリスロサイト形態と 種虫表面の両方と反応性を有する抗体を生体内投与において発生させる抗原性物 質および生理学的に許容される希釈剤若くはキャリャーを含有する薬剤組成物。
32. ３２．抗原性物質が第２項から第１２項いずれかに記載のものである第３１項記 載の薬剤組成物。
33. ３３．ワクチン形態の第１項から第１２項いずれかに記載の抗原性物質。
34. ３４．プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連して天 然に存在する抗原中に存在し、種虫表面に分有されるエピトープに対応するアミ ノ酸残基シーケンスを含有する薬剤用抗原性物質。
35. ３５．寄生虫がプラスモジウム・ファルシパルムである第３４項記載の抗原性物 質。
36. ３６．プラスモジウム属の寄生虫のイントラーエリスロサイト形態に関連して天 然に存在する抗原中に存在しかつ種虫表面に分有されるエピトープを有するアミ ノ酸シーケンスを含有する抗原性物質を患者の血流中に、マラリアに対する抗体 を生産するのに有効な量投与することを含む、マラリアに対する保護レベルを付 与するための患者の処置方法。
37. ３７．抗原性物質が第２項から第１２項いずれかに記載の抗原性物質である第３ ６項記載の方法。