JPS62500142A - プラズモジウム・ファルシパルムの抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プラズモジウム・ファルシパルム の抗原 本発明は、プラズモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｓｉｕｒｎ　ｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍ　）感染に対する防御免疫を付与するのに好適な抗原性を有する 合成ペプチドおよび合成ポリペプチド、並びに、その製造方法に関するものであ る。

最も重篤な形のヒトマラリアを引き起こす原生動物、プラズモジウム・ファルシ パルムに対する免疫は、長年の広範な暴露の後にのみ獲得される。ヒトでの天然 の免疫原として多数のＰ、ファルシパルム・ポリペプチドがあるが、その内、ど れだけのものが防御免疫において重要性を有するかは、全く明らかでない。多く の抗原がその様な役割を持たず、実際、それらは集団的に免疫系に過剰に負荷さ れるので、その内のいくつかは、反生産的（カウンタープロダクティブ）に作用 している可能性がある。多くのＰ、ファルシパルム抗原に株特異性のあることが 明らかにされており、異なる寄生虫株間での抗原の多様性が免疫回避に一役を担 っているのかもしれない。

近年、分子クローニング技術によって、Ｐ、ファルシパルムの各ポリペプチド抗 原の分析が容易になった（１）。

ヒト抗体を用いて、クローンされた配列を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏ目）コロニ〜をスクリーニングすることにより、これらの抗原をコー ドしている多数のｃＤＮＡ　クロ一ンが単離された。これらのクローンの生産お よびスクリーニングは、国際特許出願Ｎｏ。

ＰＣＴ／ＡＵ　８４１０００１６の明細書に詳細に記載されている。

その様な抗原のｊつは未熟なリング段階（環状体）のＰ。ファルシパルムに感染 した赤血球表面に存在しているので、リング−感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ） と称される。この暴露された部位により、これが免疫性攻撃における標的である と思われる。ＲＥＳＡは、多くのプラズモジウム抗原に見出された構造上の特異 性、即ち、複数個のオリゴペプチドが直列に礫返し配された配列（複数のタンデ ム反復配列）を有する（２〜６）。

ハイブリダイゼーションおよび免疫螢光法による研究ノ結果、パブア修ニュ・− ギニ７　（Ｐａｐｕａ　Ｎｅｗ　Ｇｕｉｎｅａ）単離体ＦＣ２７由来のＲＥＳＡ は、ガーナ（Ｇｈａｎａ　）由来のＮＦ７株等、広範囲ｉ／（及ぶＰ、ファルシ パルム単ＡＶ体内に保持されていることが示された。そこで、異なるＰ、ファル シパルムの味から得られたＲＥＳＡｃＤＮＡクローン相互の関係を、免疫学的方 法並びに配列決定法により研究した。パプア・ニューギニア産のＦＣ２７株由来 のＲＥＳＡと反応する抗体がアフリカ人患者の体内に存在しており、一方、ＮＦ ７株由来のＲＥＳＡと反応する抗体がパプア・ニューギニア人患者の体内に存在 していた。Ｐ、ファルシパルムのＦＣ２７株およびＮＦ７株から得たＲＥＳＡの 部分をコードしている８個のｃ　ＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列から 、これら２株のＲＥＳＡポリペプチドは緊密なホモローガス（同質）性を有して いるとの結論を得た。これらＣＤＮＡクローンの配列決定により、ＲＥＳＡポリ ペプチドに、タンデム配列反復に係る２個の別々のブロックが同定された。反復 ブロックの１つはＦＣ２７のＲＥＳＡのＣ末端に位置しており、４個の異なる、 しかしながら近縁の８．４．４および３個のアミノ酸の酸性配列を含有している 。約６００塩基５′側には、これもまた酸性アミノ酸に富む、近縁のアミノ酸を コードしている反復配列の第２のブロックが存在している。配列の相関性の一致 に基づき、これら反復に係る２ブロツクは、交差反応性の抗原決定基（エピトー プ）をコードしていることが分った。

ＳＤ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで分離した、同期増殖した寄生虫抗原のイムノプロ ットにより、ＲＥＳＡは成熟トロホゾイト内で分子ｆｆｉ（ＭＩ）２１０，００ ０のタンパク質として合成され、リング期（環状体段階）の寄生虫に感染した赤 血球の膜み結合して見出される分子ｆｆｉ　１５５，０００の形のものにプロセ ッシングされることが示された。

Ｍｒ２１０，０００タンパク質は、幾つかの抗−ＲＥＳＡモノクローナル抗体お よび抗−ＲＥＳＡペプチド抗体と反応しない、Ｌいうことが最近になって発見さ れたことから、Ｍｒ２１０，０００タンパク質は、Ｍｒ１５５，０００ＲＥＳＡ 分子の前駆体でなく、交差反応性の抗原であるとされている。

メロディト中のＭｒ１５５，０００　ポリペプチドは非イオン性界面活性剤トリ トンＸ−１００に可溶性であるが、リング−感染赤血球の膜を透過した後は、か なり、トリトン−不溶性となる。この様に、ＲＥＳＡは赤血球細胞骨格と相互反 応すると思われる。ＲＥＳＡが膜の脂質二分チ層を透過するか否かは未だ不明で あるが、本発明で決定されたＲＥＳＡ遺伝子の完全な配列から重要な手がかりが 得られるかもしれない。これにより、ＲＥＳＡが、短い介在配列によって隔てら れている２個のエクソンを含んでいることが演鐸的に示された（第２図）。エク ソン１は、多くの生物における、分泌ペプチドのシグナルペプチドに典型的な疎 水性配列で開始されでいる。次いで、約３６アミノ酸残基の親水性配列、さらに 、１４残基の第２の疎水性の配列が続いている。さらに２０２塩基下流には、１ ６アミノ酸の非−荷電配列で始まり、次いで、高度に荷電した領域が続く、エク ソン２がある。イントロンの排除によって生じる疎水性配列は、通常、多くの真 抗性遺伝子における膜−アンカーセグメントである。

以下に詳述する様に、本発明を完成するに至った研究の結果、配列、ハイブリダ イゼーション、および免疫学的データーに基づき、ＲＥＳＡは、Ｐ、ファルシパ ルムの大部分、またはすべての株に高度に保存されていると思われる。さらに、 ＲＥＳＡの反復性構造並びにリング感染赤血球上の位置は、間接的な免疫螢光法 等によって検出するのに好適な高い、感受性を有しているので、様々な株間でＲ ＥＳＡが免疫学的に類似しているこ乏は、ＲＴ’、　Ｓ　Ａが免疫学的診断の目 的に充分に適さし得ることを意味する、。

大腸菌内でのクローニングおよび発現の結果検出されたもう一つの抗原６４ヨ、 ファルシパルム点在性反復抗ｎｉｉ　（Ｆａｉｃｉ、ｐａｒｕｍ　Ｉｎｔｅｒｓ ｐｅｒｓｅｄ　Ｒｅｐｅａｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　（ＦＩＲｘ））と命名された（ ６）。他の幾つかの反１！ｌｚ性抗原同様、ＦＸＲＡは、高度に荷電された領域 で両側を囲まれた短い繰返し２単位を含む構造単位を食付している。しかしなが ら、ＦＩＲＡではこの全構造単位自身が、抗原内で数回、反復されでいる。

大腸菌内でＦＩＲＡを発現するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは、そのままのコＩ：ｊ ニー・アッセイにおいて、Ｐ、ファルシパルムが風上病である地方の人の血清（ 〜９３％）と反応した。対応するｃＤＮＡクローンの固定化リゼイト上、アフイ ニテイ法で精製されたヒト抗体により、対応する寄生出抗原は、Ｍｒ）３００， ０００　のポリペプチドであることが同電された。この抗原は、シゾント、並び にリング段階のトロホゾイト中にも存在しており、これは斑点状の免疫螢光像に よって、赤血球と会合（密接少していることが示された。そのｍ　ＲＮ　Ａはメ ロゾイト内で豊富化され、その特異的性質は、リング−感染赤血球の表面に位１ １ｆｆｉ　Ｌ＋でいるＲ　Ｅ　Ｓ　Ａと共通しており、数多くのアレル変異体と 一緒に９１−の遺伝子にコードされている。３　ｃｒ）ＮＡクローンの完全なヌ クレオチド配列により、酸性および塩基性の両アミノ酸を含む高度に荷電された 領域シＣよって両側面を囲まれたヘキ（ノペプチドの１３の反復を含む構造単位 であるこ古が判った。この構造用イ）ン自身が繰返されるので、反復ブロック、 並びに荷電単位が、分子に沿って点在することになる。反復内の配列は荷電単位 内の配列Ｊ：りもはるかに広範囲に変動しでいる。

染色体性ＦＩＲＡクローンの配列から、ＦＩＲＡ遺伝子がＲＥＳＡと類似のやり 方で組織されていることが証明された（第８図）、、これは、短かい５′エクソ ン、はるかに長い３′エクソン、並びに、これら２エクンンの間の境界領域の疎 水性セグメントを含有しでいる。

ＲＥＳＡと同様％ＦＩＲＡにおける反復も３′エクンンのみに限られている。

本発明は、リング−感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、ファルシパルム点在性反 復抗原（ＦＩＲＡ）、並びに、それらと交差反応性のＰ、ファルシパルムの他の 抗原からなる群から選ばれるＰ、ファルシパルムの抗原をコードしている塩基配 列の全で、または一部と実質上対応しているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子 を提供するものである。更に詳しくは、本発明は、第１図または第７図に示され ている塩基配列の全てまたは一部を、少くともその一部として含有していること を特徴とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供するものである。７その 様なヌクレオチド配列は、ＲＥＳＡまたはＦＩＲＡのアミノ酸配列の少くとも一 部を含むポリペプチドをコードしている。

上記の如く、さらには、第１図および第７図にさらに詳しく示されている様に、 ＲＥＳＡおよびＦＩＲＡのアミノ酸配列は、反復単位と、それと接する非−反復 性のペプチド単位からなっている。従って、上記の塩基配列は、１またはそれ以 上のこれら反復単位および／またはフランキング（接する）単位に対応するポリ ペプチド、あるいは、これら反復単位および／またはフランキング単位の組み合 わせに対応するポリペプチドをコードしている。

本発明はまた、ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原、およびそれらと交差反応性のＰ、 ファルシパルム抗原からなる群から選択される抗原全体、または一部の抗原性を 表イつす合成ペプチドあるいは合成ポリペプチド、並びに、これら合成ペプチド または合成ポリペプチドの少くとも１種占、薬学的に許容し得る担体とを含有し てなる、闘乳類におい′ＣＰ、ファルパノパルムに対スる免疫応答を刺激するた めの組成物をも提供丈るものである。本発明のかかる合成ペプチドまたは合成ポ リペプチドは、広範囲にわたつで上に述べたヌクレオチド配列を含有している、 発現コントロール配列と機能的（操作可能）に結合している組換えＤＮＡ分子、 あるいはその様な組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を含有している組換えＤＮＡクローニン グビヒクル、またはベクターを含む宿主細胞内で発現させることにより調製され る。この様にして発現した合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは、ＲＥＳＡま たはＦ　Ｉ　ＲＡ、または他の交差反応性の抗原の全てまたは一部の抗原性を表 わ丈部分と、組換えＤＮＡ分子に融合しでいるＤＮＡによってコードされでいる （＝ｆ加的なポリペプチドからなる融合ポリペプチドであっても良い。別法とし て、この合成ペプチドまたはポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ　）固相合成法等の周知の化学的手段により、製造することもてきる。

本発明の詳細は、以下の記載、並びに添付の図面により、さらに明らがとなるで あろう。

第１図はＲＥＳＡのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示す。ヌ クレオチド配列はジデオキシ法によって決定された（８）。

第２図は第１図の配列から推定されるＲＥＳＡ遺伝子の構造を示す。５′および ３′エクソンが示されている。

第３図中、Ａは電気泳動試料緩衝液中で溶解し、抗〜ＲＥ　Ｓ　Ａ抗体でプロー ブして得た、Ｐ、ファルシパルムの２藺の中朧体の同時培ｊε物に関するウェス タンプロットを示す。ＢおよびＣは、アフイニテイ法で精製したＲ　Ｅ　Ｓ　Ａ に対するヒト抗体を用いＣ得た、Ｐ。

ファルシパルムの、＋１）リング段階％（２）成熟Ｉ・ロホゾイト、（３）シゾ ント、および（４）〆ログイトに関するウェスタンプロットを示す、（Ｂ）にお ける抗原はトリトンＸ〜１００で抽出された。（Ｃ）における抗原はトリトンＸ −１００に不溶性であるが電気泳動試料Ｍ街液には可溶性であった。放射性活性 マーカーはアマ−ジャム、インターナト（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔ、ｃｒｎ ａｔ　、　）、パツキンガムシェア（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｆｉｉｒｅ　）　 （英国）から入手１．　タ。

これは、ミオシン（２００キロダルトン、Ｋｄａｌｔｏｎ）、ホスホリラーゼ− ｂ（９３キロダルトン）、、およびウシ１１Ｔｌ清アルブミン（６９キロダルト ン）を表わす。

第４図は、ウガギ抗−艮ｒ＜　Ｓ　ＡとプロティンＡ金を用いて検出した、シゾ ント内でのミロゾイト形成期における、短糸を持つと思われる低密度小胞内のＲ ＥＳＡの位置（＝）を示す免疫電子顕微鏡写真である。ログトリｘ　ス（ｒｂｏ ｐｔｒｉｅｓ　）　（Ｒ）は標識されていない、（Ｘ４１，７００：挿入Ｘ７３ ，０００）。

第５図は、ウサギ抗−ＲＥＳＡと反応したリング−感染赤血球の切片の電子！ｊ Ｍ微鏡写貞である。

非感染赤ｉｌｎ球の一部も示されている、第６図は、キモトリプシン（２０μｇ ／ｉ）で消化したリング段階感染赤血球のウェスタンプロットであって、（１） は０分、（２）は２０分、（３）は６０分の消化に付されたものを表わす。酵素 消化の後、無傷の赤血球を洗浄し、電気泳動試料緩衝液に溶解し、１０％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース上に電気泳動的に移 行させた。次いで、ニトロセルロースフィルターを希釈率１：５００のウサギ抗 −ＲＥＳＡでプローブした。分子量はキロダルトンで示されており、ＲＥＳＡ（ １５５Ｋｄ）　、β−ガラクトシダ〜ゼ（１１６＋＜、ｄ　）そしてホスホリラ ーゼ−ｂ（９３Ｋｄ）に対応する。

第７図は、ＦＩＲＡ遺伝子のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列をボタ 。ヌクレオチド配列はジデオキシ法で決定された（８）。ライブラリィを組立て る（−惑に３′末端に結合（ライゲート）させたＥｃｏＲＩ　！１ンカーが庁在 してい４Ｃいので、この配列の３′末端は不完全である（おそらく欠失による） 。

第８図は第７図の配列から推定されるＦＩＲＡ遺伝子の構造を示す。

第９図はマラリアにさらされた人から得た血清プールのアフイニテイ精製により 得たヒト抗体を用いた、イムノアッセイ（ＡおよびＢ）、並びにウェスタン・プ ロット法（ＣおよびＤ）の結果を示す。ＡおよヒＣにおりる抗体はＦＩＲＡ−セ ファロース吸収剤を用いて精製され、他方、ＢおよびＤにおける抗体はλａｍｐ ３−セファロース吸収剤を用いて精製された。ＣおよびＩ）におけるＰ、ファル シパルム単離体は、１、パプア・ニューギニア起源のＦｅ１２　：２、タイラン ド起源のに１；および３、ガーナ由来のＮＦ７であった。

第１０図は、純化した融合ポリペプチド（２μｇ／ｍ／　）で被覆したマイクロ タイタープレートを用いた固相ＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ法により、アフイニテイｖｔ製 されたＦＩＲＡ抗体を検定した結果を示している。図中、ＯはＦＩＲＡ・フラグ メント、口はＲＥＳＡによる５′反復、△′はＲＥＳＡの３′反復に相当する。

ＦＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）、１ＭＲ１４３／ＰＮＧ　（ＩＭＲ１４３）、 １ＭＲ１４４／ＰＮＧ（ＩＭＲ１４４）およびＭＡＤ７１／ＰＮＧ　（ＭＡＤ７ １）の各単離体は、パフア・ニューギ二アの医学研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　 ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）の協力により得られた。ガーナ起源 のＮＦ７およびタイランド起源のに１は、ウオーリカー氏（Ｄ、　Ｗａｌ　ｌ　 １ｋｅｒ　、ニシンバラ大学）から提供された。

コロニーイムノアッセイ 一連の抗原−陽性コロニーのレプリカを３０℃で一夜増殖させ、３８℃で誘導し 、溶離した（７）。抗−大腸菌反応性を除くために血清を吸収させ、３％ウシ血 清アルブミンで、ｐＨ９，５ｉでおいて１７５００に希釈し、ｇ　終曲Ｋ、スタ フィロコッカス・ア′ウレウス（Ｓｔａｌ）ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕ ｓ　）由来の　■　プロティンΔ血清は、バブア・ニューギニア、マダン（λ４ ａｄａｎｇ　）の住民の同意の下に入手した。一般的な調査過程では、急性′７ ラリア症伏を示している人が幾人かいる外は、無症候性の寄生虫血症であること が分った。寄生虫血症患者を、クロロキンで治療した。子供から標本を得る際に は、事前に視の承諾を得た。

−フｒ−ジＤＮＡをＣ，ＣＺ−、平衡密度遠心にかけて精製し、Ｉ’：　ｃｏＲ Ｉ　消化に付し、１％低融点アガロースゲルー（−サイズ分画化した後、フェノ ール抽出し１．−ツク−トラ゛・・スレージョンにより標識した１、１−の０． ７５Ｍ　ＮａＣ１／　０．７５　Ｍクエン酸ナトリウム１５０％ホルノ・アミ　 ド／”　（５０μｇ　／　Ｉｎ１）の鮭清子ＤＮＡ／（１０μｇ／−）の？す（ Ｃ）　／　ｏ、　ｏ　２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　）１０．０２％ポリビニ ルピロリドン／　０．０２％ＢＳＡ　中の標識化挿入体３　ｍｌ　（：３Ｘ　１ ０”　ｃｐｍ　）を、＝一連の抗原−場１１°クローンとハイブリダイズさせた 。挿入体をｐ　Ｕｃ−９中にサブクローンし７（９）、精製（−７だ後、）−： 記の如くニソクトンンスレー　トラ、ザザーン・プロット実験にλｇｔ　１０う 、イブラリイから染色体性ＲＥ　Ｓ　Ａクロー・ンを単離し、ＥｃｏＲ１挿入体 をｐＵＣ３にザブクローンさせた。ＥｃｏＲｌ挿入体のＲｓａｉ、　Ａｈａｌ［ および５ｓｐ１７ラグメントをＭ１３ｒｎｐ１８およびｒｒｉｐ１９ベクターに サブクローンし、ジデオキシ法によって配列決定した（８）。合成プライマーを も用いた。結果をスタテン（５ｔａｄｅｎ　）のプログラムに従って処理したｆ ｉｌｌ、、示された配列は５．３，５ｋｂ　染色体のＥｃｏＲＩフラグメントが 、そのＪ！、ｅｏＲＩ部位においで＋　ｃＤＮＡ　クローンＡ、ｇ４６のＥｃｏ Ｒ１部位に結合している配列からなっていた。

初めに、染色体ＦＩＲＡクローンをλ［ｔｌＯ中の６ｋｂ　Ａｂａ　Ｉ［フラグ メントとしτ同定した。このＡｈａ■フラグメントをｐＵｃＢにサブクローンし た。次いで、Ｐ　Ｖ　１１　ＪＩおよびＲ１５ａＪ７ラグメントをＭ１３ｍＰ８ 　および〜ｆ１３ｎ月）９ベクター・にす′フ′クローンし、ジデオキシ法で配 列決定した。

抗−ＲＥ　Ｓ　Ａおよび抗−１・゛ＴλＡ抗体のアフィニテ既述の如＜（テして Ａ（Ｈ２８、Ａｇ２３１　およびλａＩｉｌ　ｐ３各クローンの調心１γτ養（ ５０ｍｌ　）を調製した（５および６）０ベレツト化された細菌を、１００　ｍ Ｍりん酸ナトリウム緩イΦ〒液、Ｐ　Ｈ６，８／　１０　ｍＭ　ジチオトレイト ール中で音波処理した後、１９イＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ、ｉを加えて室温 で混合した。可溶性の細菌タンパク質をセファデックスＧ−１０に通すことによ り、１００　ｍＭりん酸ナトリウム、ｐ　Ｈ６，８／　Ｉ　ｎＩＭジヂジチオト レイトール中１％Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４て平衡化し、製造業者の指示に 従って室温でＣＮＢｒ　活性化セファロース（ファーマシア、スエーデン）とコ ンジュゲート（複音体形成）させた。

パプア・ニューギニアの住民から得たヒト血清のプールを、遠心して等容ｈ］の りん酸緩衝化食塩水（Ｐｉ／ＮａＣ１）で希釈シ・　λａｍｐ３−セファロース 吸収剤に予備吸収ざぜた後、Ａｇ２８またはＡｇ２３１吸収剤りを通過させるこ 、！：により、？ｈ澄化し、た。非特異的な結合タンパク質を、１００　ｍＭホ ウ酸チトリウム１５　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１／　０．０５　Ｘ　ＴＷｅｅｎ　 ２０、ｐＨ８，５で洗浄し、次いで、Ｐｉ／Ｎａｐ／で洗浄する洗を合サイクル を繰返し行うことにより、除去した。結合しｊ：抗体を１ｏ。

ｒｎＭグリ’ｙ　７／　１５０ｍＭ　ＮａＣ／！、ＰＩ！２．６で溶離し、直ち に、２Ｍ）リス：ｒ−ｉｃｌ！、ｐＦＩ８．Ｑで１）ＩＩ　７．Ｏに調節（、。

た。

ウェスタン・プロット Ｐ、ファルシパルムのタンパク抽出物を調製し、７．５％ポリアクリルアミド／ 　Ｎａ１）ｏｄ　ＳＯ４ゲルにより分画化した。ゲルから得たタンパク賀゛をニ トロセルロース上に電気泳動的に移行させ、Ｐｉ／ＮａＣ１中、５′Ｘ脱脂粉乳 中でインキュベートした後、アフィニティ精製したヒト抗体と反応させた。フィ ルターを１２５１−標１熾プロティンＡとインキュベートし、オートラジオグラ フィーにかけた。

免疫電子顕微鏡写真 Ａｇ２８　およびＡｇ２３］免疫吸収剤を用いてアフィニテイ精製したヒト抗体 、あるいは、Ａ、ｇ２８　によって生成された融合ポリペプチドに対して惹起さ れたつザギ抗血清を用い、プロディンへ−金法によって免疫電子顕微鏡写真を撮 った。免疫電子顕微鏡写真用の標本を０，２５％グルタルアルデヒドで固定化し く２５℃で１０分間）、Ｑ、　ｌ　Ｍりん酸緩衝液、ｐＨ７，４中５０ｍ　Ｍ　 ＮＨ４Ｃ／　て希釈した後、調製し７たばかりのりん酸緩衝液中５　Ｑ　ｍＭ　 Ｎ）１４Ｃｊ　に入れ、３０分間放置した。

次いで細胞をりん酸緩衝液で２回洗争し、７０％エタノールで脱水した後、Ｌ、 　Ｒ，ホワイト（Ｗｈｉｔｅ　）樹脂、ハード・ブＬ／−ド〔ロンドン・レジン （ＬｏｎｄｏｎＲｅｓｉｎ　）　Ｇｏ、　Ｌｔｄｏ、ペイシンゲストーク（Ｂａ ｓｉｎｇｓｔｏｋｅ）、イングランド〕中に入れた。切片を、０．２５％Ｔｗｅ ｅｎ　２０含宵ｏ、　ｏ　５　Ｍホスフェート、ｐＨ７，４（ＰＯ４：　Ｔｗｅ ｅｎ　）　中、１％ウシアルブミンまたは卵アルブミン中で５分間インキュベー トした後％ＰＯ４：　Ｔｗｅｅｎ中、ウサギ抗−ＲＥＳＡ抗血清（希釈率１／１ ００）またはアフィニティー精製ヒト抗−ＲＥＳＡ抗体、１滴の上に３０〜６０ 分間、室温下で移行させた。ＰＯ４：Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、切片を、ＰＯ４ ：　Ｔｗｅｅｎで１／１０に希釈したプロティンへ−金（Ｅ、−Ｙラボラトリイ ズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　Ｉｎｃ、　：ｌに、３０〜６０分間、移行 させた。さらに洗浄した後、切片を酢酸ウラニル水溶液で染色した。単離したメ ロゾイトを、４℃において０．２５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定化さ せた後、感染細胞と同様に処理した。

結果−ＲＥＳＡ Ｆｅ１２からのＲＥＳＡクローンの単離ＲＥＳＡｃＤＮＡクローンの調製は、国 際特許出願蔦ＰＣＴ／ＡＵ８４１０００１６　の実施例に詳しく記載されており 、本明細書ではそれを引用する。

ＲＥＳＡポリペプチドに対して特異的なヒト抗体をアフイニテイクロマトグラフ イーで精製した。ウェスタンプロットによると、抗体はＭｒ、１５５，０００に 優勢例 なバンドを示して反応したが、幾つかの実験では、接△ 近しτ移動する二重線（ダブレット）に分割されていた。抗−ＲＥＳＡ抗体と反 応する、より分子量の大きいポリペプチドは、単離体が異ることによりサイズが 変化しく第３図へ）、単離体ＦＣ２７の場合にはＭｒ。

２１０．０００　であった。さらに、幾つかの抗原製品においては、より低分子 量のポリペプチド（Ｍｒ、ｓｏ、ｏｏｏ）も検出すれた（第３図Ａ）。Ｍｒ、２ １０．０００ポリペプチドはシゾントに最も豊富であった（第３図Ｂ）。逆に、 Ｍｒ、　１５，０００抗原は、メロゾイト、環状体およびトロホゾイトに多く、 シゾント内には少量であった（第３図ＢおよびＣ）。

ＲＥＳＡと赤血球膜との相互反応性を調べるために洗浄剤（デタージエント、界 面活性剤）対するＲＥＳＡの溶解性を測定した。Ｍｒ２１０，０００ポリペプチ ドは非イオン性洗浄剤のＴｒｉｔｏｎＸ　−Ｉ　ＱＱ溶液に可溶性であり、メロ ダイト中に存在しているＭｒ１５５，０００ポリペプチドの大部分も同様であっ た（第３図Ｂ）。

これに対して、リング段階、並びに他の生活環におけるＭｒ１５５，０００抗原 はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−ＩＱＱに不溶性であったが、ＳＤＳおよび２−メルカプ トエタノールを含んだ電気泳動試料緩衝液には可溶であった（第３図、Ｂおよび Ｃ）。

同じイムノプロットをＡｇ２８　融合ポリペプチドに対して惹起されたモノクロ ーナル抗体、またはＲＥＳＡ合成ペプチドに対して惹起されたマウスの抗血清で プローブすると、Ｍｒ、　２１０，０００ペプチドは検出されなかったが、Ｍｒ 、１５５，０００ポリペプチドは強いシグナルを示した。従って、Ｍｒ、２１０ ，０００　ポリペプチドは、ＲＥ　Ｓ　Ａの最初の翻訳産物ではｒ、ｊ（、ＲＥ ＳＡと交差反応し得る、別の遺伝子産物であると思われる。

大腸菌内で発現されたＲＥＳＡ融合ポリペプチドに対するマウスの抗体に関する 前記の研究により、これは、様々な地域から得たＰ、ファルシパルムの全株と交 差反応することが証明された。これらのＲＥＳＡｃＤＮＡクローンは、パプア・ ニューギニア由来の血清との反応性に基づいて単離されたＰ、ファルシパルムに さらされたヒトにおいても、広範囲に及ぶ様々な地域のＲＥＳＡと交差反応し得 る等価の抗体が惹起されるか否かを決定するために、バプア・ニューギニア株Ｆ Ｃ２７から得た、ＲＥＳＡの一部を発現する多くのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンに対 し、アフリカ人の血清を試験した。１３３０個別に単離された抗原陽性クローン （内１６はＲＥＳＡをコードしている）の配列と血清とを、既述の、自体そのま まのイムノアッセイ法によって反応させた（７）。アフリカ人の血清は両方とも ＲＥＳＡｃＤＮＡクローンと反応した。反応の程度は多数のＰＮＧ血清と良く匹 敵していた。しかしながら、反応の程度は、ＰＮＧ血清の差異により、かなり変 化するという点が重要である。アフリカ人面清は、大部分がへキサペプチド配列 の様々な反復からなっているＦＩＲＡをコードしているｃＤＮＡクローン等の、 他の様々なｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａ　クローンとも反応した。これに対し、・Ｆｅ１２ の株−特異的Ｓ−抗原をコードしでいるｃＤＮＡクローンとは反応しなかった。

従って、地理的に異なった地域からのＲＥＳＡポリペプチドは、人間にとって天 然の免疫原である非−反応性エピトープを共有してＧ）ると思われる。

ＲＥＳＡの抗原決定基 これまで免疫学的に研究されたＲＥＳＡｃＤＮＡ発現クローンは全て、５′末端 で内因性ＥｃｏＲ１部位と接していた。この部位の５′　に何らかの抗原決定基 が存在するか否かを調べるために、ＮＦ７ＡＧ１３から得た大きいＥＣ０ＲＩフ ラグメントをｐＵＣ９にサブクローンし、音波処理して無作為にフラグメント（ 断片）化し、生じたフラグメントをλＡｍｐ３　に再クローンした。このフラグ メントの規定された領域を発現するクローンを同定するために、得られたクロー ンを３個の異る制限フラグメント、即ち、反復の５′側て位置するフラグメント 、反復を含有するフラグメント、並びに反復の３′側のフラグメントの各々　を 用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。次に５選択したクロ ーンが、大きい融合ポリペプチド、即ち、細胞から得た全抽出物をポリアクリル アミドゲル電気泳動にかけた後、クー・マツシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　）ブル ー染色により検出可能なポリペプチドを発現するかどうかを調べた。配列の正し いフレームを除く全ての配列には複数個の終ＩＪ：、コドンが存在しでいるので 、その様な発現されたクローンは、既に抗体結合に関して分析されたあらゆるフ ラグメントの５′側にあるＲＥＳＡのフラグメントであると結論し得る。

次いで、５′反復を発現するクローンを、Ｐ、ファルシパルムにさらされた病歴 を有するＰＮＧ患者の血清を用い、そのままのコロニー・イムノアッセイに付し た。５′反復を含んでいる幾つかのクローンが血清と反応した。５’ＲＥＳＡ反 復にも、３′反復さ同様に、ヒトでの天然の免疫原である抗原決定基が含まれて いるとの結論に達した。

ＲＥＳＡのエクソン１中の残基１７から５２までの配列に相当する３６ア°ミノ 酸ペプチド（第１図）を合成し、マラリアにさらされた人での、ＲＥＳＡの該領 域に関する抗体を試験するのに用いた。固相ラジオイムノアッセイによって測定 したところ、幾人かは、このペプチドに対する著しい抗体レベルを示した。従っ て、ＲＥＳＡのエクソン１には、天然の免疫原性エピトープが存在しており、こ れは、非反復性配列によってコードされていると思われる。

ＲＥＳＡ配列の免疫原性 ＲＥＳＡの３′および５′反復を発現するクローンからＲＥＳＡ／β−ガラクト シダーゼ融合ポリペプチドを単列した。これらのタンパク質の免疫原性を、抗原 ０゜２５〜０．５ηと完全フロイント・アジュバントとを用いてウサギを免疫す ることにより、試験した。４〜６週間後に、不完全アジュバント中に入れた同量 の抗原を、ウサギにブースター投与した。どの場合においても、インビトロで増 殖しているＰ、ファルシパルム中で発現されたＲＥＳＡ分子と反応する抗体が惹 起されていた。

キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌ　ｅＬｉｍｐｅｔ　Ｈａ ｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）とコンジーＬ’７’−）シタ３［ｔ）ＲＥＳＡ合成ペプ チド（表１）を用いてウサギを免疫し、得られた抗血清を、ウソアルブミンとコ ンジュゲートさせたこれら３ペプチドの各々、並びにＲＥＳＡの３′および５′ 反復および感染した赤血球の音波処理物に対応する融合ポリペプチド、に対して 調べた。これらのペプチドで免疫されたマウスは全て、その配列を含んでいるホ モローガスなペプチドおよび融合ポリペプチドと反応し得る抗体を産生じていた 。更に、ペプｆｌ’ＲＥｓＡ３’−２（ＥＥＮＶｘ５　）　は、（ｍ　ｏ　ａ’ 　反復ペプチド、ＲＥ　Ｓ　Ａ　３’−１（ＥＥＮＶＥＨＤＡ　）　（コレは通 常アミノ酸５個の配列を有する）と反応する抗体をも惹起した。しかしながら、 その逆は成立せず、抗ＲＥＳＡ３’−１抗体はＲＥＳＡ　３’−２と反応しなか った。

これらの抗−ペプチド抗血清をペプチド−ＢＳＡコンジュゲートについて検定し たところ、ＲＥＳＡの５′および３′反復間には見掛は上、交差反応性を認めな かった。しかし、同じ血清を融合ポリペプチド上で検定したところ、このペプチ ドは、両反復構造と反応する抗体を惹起することが判った。しかし、ホモローガ スな反復との反応に比べで、ヘテロローガスな反復との反応は極めて弱かった。

この抗−ペプチド抗血清を、感染赤血球のウエスタンプロットにおけるプローブ として用いた。全ての抗血清がＭｒ１５５．ＱＱＱＲ，ＥＳＡポリペプチドと特 醍的に反応した。

ＲＥＳＡに於ける反復に対応する配列およびて合成したことを除き、メリフィー ルドの固相法に従って行った。

十括弧内の数字は、反復ブロック内に各配列が現われる回数を示す。

ＲＥ　Ｓ　ＡＯ位；ｎ ＲＥＳＡは免疫電子顕微鏡写真により、リング段階の寄生虫に感染した赤血球の 膜上に検出されたが、赤血球内の未成熟な寄生虫には随伴しでいなかった（第５ 図）。一方、成熟寄生虫を含有している赤血球膜は標識されなかったのに対し、 寄生虫の細胞質内の短糸を有すると思われる高電子密度のオルガネラには金粒子 が付随していた（第４図）。Ｓ抗原に対する対照抗体は赤血球、膜上のメロゾイ トと反応しなかった。

メロゾイトの標識化は明らかに内部で行われており、メロゾイト表面の特異的な 標識化を示唆するものはない。標識化は核から離れた集合体中、並びに、時には ロブトリイ（ｒｈｏｐｔｒγ）上で起きる。他のメロゾイトにおいては、金粒子 はさらに拡散されていたが、粒子不含のロブ）　ＩＪイ付近に存在していた。同 様の金の分布は、アフイニテイ精製ヒト抗体、並びにクローンされた抗原に対し て惹起されたウサギ抗体の両方に関しても観察されたが、アフイニテイ精製ヒト 抗体においてはより高いバックグラウンド標識化が明らかであったつ標識化に関 して観察される型（パターン）に特異性のあることが、他のクローンされたＰ、 ファルシパルム抗原（例、Ｓ抗原）に対するアフイニテイ精製ヒト抗体またはウ サギ抗血清について同じ方法を採用しても、ラベリング（標識化）の型が異なっ ていたり、標識されなかったりすることから、証明された。

さらに、ＲＥＳＡの位置を、タンパク分解的酵素の攻撃における接近可能性に基 いて検討した。無傷の、リング段階の寄生虫に感染した赤血球（約５％寄生虫血 症）をキモトリプシンまたはトリプシンで処理すると、Ｍｒ　１．５５，０００ ポリペプチドは限られた数の部位で開裂され、２個の主フラグメントが生成する 。これらは抗ＲＥＳＡ抗体と反応した無傷の分子の様である（第６図）。この結 果は、ＲＥＳＡ分子の少くとも一部が、リング−感染面球の外面に露出している ことを示している。

インビトロでの寄生虫の発育阻ＩＥ Ｐ、ファルシパルムの同期培養物を、アフィニテイ精製ヒト抗−ＲＥＳＡ抗体の 存在下、４８時間培養した。阻害の程度は、通常、対照との比較において２０〜 ４０％阻害の範囲で変化した。

結果−Ｆ　Ｉ　ＲＡ ＦＩＲＡを発現するｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンＦ　Ｉ　ＲＡ　ｃＤＮＡクロ〜ンは 、様々な臨床状況にある６５人から得た１００以上のＰＮＧ血清の組の９５％と 反応した。多くの血清は他のクローンとも強く反応するであろうが、これらは、 血清の大部分と強力に反応した。

ＦＩＲＡは単一の多形性遺伝子によってコードされ５種のＰ、ファルシパルム単 離体（パプア・ニューギニア起源のＦＣ２７、ＩＭＲ１４３、ＩＭＲ１４４およ びＭＡＤ７１、並びにガーナ起源のＮＦ７　）由来の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ 、ＡｈａＮ　およびＲｓａ　１で制限消化し、サザーン・プロッティング法で分 析した。各単離体において、単一の非常に大きい（〉２０ｋｂ）ＥｃｏＲＩフラ グメントがハイブリダイズした（データーは示されていない）。Ａｈａ　［およ びＲｓａｌ消化物中では、様々なサイズの、より小さい単一フラグメントがハイ ブリダイズした。このことから、ＦＩＲＡ遺伝子は多形性であり、調存した全て の単離体中に存在していることが明らかになった。様′２なサイズのフラグメン トは、異ったＦ　Ｉ　ＲＡ遺伝子のアレルを示している様に思われる。僅か５個 の異る単離体から少くとも３個の異ったアレルが検出されたことから、全アレル 数は非常に大きくなると予想される。各単離体中のｒ■−のフラグメントの大き さは、血中段階のプラズモジウムの一倍性ゲツムと一致している。

ＦＩＲＡポリペプチド（第９図）に対して特異的なヒト抗体を、アフイニテイク ロマトグラフイーで精製シタ。ウェスタンプロット法において、この抗体ハ、各 単離体中に含まれている見掛は上極めで大きいＰ。

ファルシパルムのポリペプチド（見掛けの分子量〉３００．０００）　と強く反 応した（第９図Ｃ）。この極端な領域には正確なサイズマーカーがないが、ＦＩ ＲＡの易動度はＦＣ２７のＭｒ２００．０００５抗原よりもかなり低かった。Ｄ ＮＡフラグメントの大きさの僅かな違いに関連していると思われたＦＩＲＡポリ ペプチドの大きさにおける単離体間の差異は検出されなかった（第９図Ｃ）。抗 体は、Ｍｒ＞３００，０００分子のタンパク分解的開裂Ｈ［物り思われる多くの 小さいポリペプチドとも、弱く様々に反応した（第９図Ｃ）。ベクター吸収剤上 の同じ血、青から精製した対照抗体は反応しなかった（第９図Ｔ））。さらに、 他の抗原陽性クロ・−ンからの吸収剤上の同じ血清から精・持した抗体は、Ｍｒ ＞３００，０００　ポリペプチド以外のポリペプチド吉特異的に反応した（デー ターは記載せず）。

結論トして、ＦＩＲＡは被検Ｐ、ファルシパルム各単離体中に発現される非常に 大きいポリペプチドであり、Ｆｅ１２によって発現されたＦＩＲＡのアレルに対 する抗体とＫ　ｌ、およびＮＦ７によって発現されたアレルとが交差反応すると いえる。

ＦＩＲＡおよびそのｍ　ＲＮ　Ａの位置および段階特異性 アフイニデイ精製ヒト抗体並びにクローンＡｇ２３１またはＡ、ｇ２３１科の一 員によって免疫されたマウスの血清は、成熟寄生虫（色素含有）、並びに未成熟 な（環状体、リング型の）寄生虫を含む細胞と反応した。

リング感染細胞上の螢光は不均一であり、寄生虫の限界を越えて分布している様 であった。従って、抗体と、固定化されていない寄生虫処理細胞１とを懸濁液中 で反応させた場合、あるいは、軽くグルタルアルデヒドで固定化し、風乾した寄 生虫処理赤血球の単一層とを反応させた場合には、赤血球表面で染色されて検出 されることはないが、ＦＩＲＡは寄生虫の外方に出ていると思われる（１２）。

この様に、ＦＩ　ＲＡの段階特異性は何故かＲＥＳＡと類似している（２）。高 度に精製されたメロゾイトのｍ　ＲＮ　Ａ　から調製したｃＤＮＡと、配列した １３３コロニーとのハイブリダイゼーションにより、さらに、ＲＩ’：　Ｓ　Ａ との類似性が明らかになった。Ａｇ２３１科の全メンバーがメロゾイトｃＤＮＡ とハイブリダイズした。顕バナ点として、この配列中の他のクローンのみが、あ るいは、７８抗原陽甘クローンに関する別個の配列中のクローンのみが、ＲＥＳ ＡをコードしているメロゾイトｃＤＮＡとハイブリダイズした（２，１．３）。

従ッテ、ＦＩＲＡのｍ　ＲＮ　ＡおよびＲＥＳＡのｍ　ＲＮ　Ａは、それらが、 メロゾイト期においては極めて豊富化サレルＰ、ファルシパルム抗原のｍ　ＲＮ 　Ａの間では一般的ではないといえる。

ＦＩＲＡ配列 Ａｈａ＋［フラグメントを包含している染色体クローンを２ｇ【１０　にクロー ンしてＡｇ２３１．５と命名し。

その完全な配列決定を行った。この遺伝子は介在配列を含有しでおり、全構造は 著しくＲＥＳＡと似通っている。エクソン１はシグナルペプチドかもしれない（ それは極めて短かいが）セグメント、次いで親水性アミノ酸、さらに３２の非荷 電アミノ酸から成っている。

介在配列は、この比較的疎水性のセグメントと直接、隣接して存在している。残 余配列は反復性配列と、内部に点在している非反復性配列とのブロックで構成さ れている。全ての場合、反復性配列は１３のヘキサマーのグループとして示され たが、これらの５′グループの大部分には、非−反復性配列が点在していない。

即ち、３つヘキサマーのブロックが存在する。、３′末端ノ欠失によってリンカ ー−Ａｈａ結合が変化したと思われるので、３′末端の構造は不確実である。

反復配列間の交差反応 Ａｇ　２３１．６（ＦＩＲＡ）上でアフイニテイ精製したヒト抗体は、ＥＬＩＳ Ａにおいて、Ａｇ２３１．６上グナルをＡｇｌ　：３．　ｉ、　７．５　（ＲＥ ＳＡ　ｓ’反復）上には何らのシグナルをも示さなかった（第１０図）、、この 交差反応は、さもなくば別々の抗原における反復配列相互の類似性（ホモロジイ ）と一致している。

組換えＤＮＡ分子、組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよびベクターの調製、 宿主細胞−クローニングビヒクルの組合わせ、並びに宿主細胞によるポリペプチ ドの発現は、国際特許出願ＡＰＣＴ／ＡＵ８４１０００１６の明細書に記載され ている。この明細書ではまた、この様にして発現されたＤＮＡ分子およびポリペ プチドの血清学的診断、並びにプラズモジアに対する防御免疫を刺激するための 単価または多価ワクチンの製造における使用法についても詳しく記述されている 。これらの記述は本発明にも等しく適用し得るものであり、ここにそれらを引用 する、 引用分献 １、サンダ（Ｋｅｍｐ、Ｄ、Ｊ、）　、　：］ぺ／ｌ／　（Ｃｏｐｐｅｌ　、　 Ｒ，！−，）　。

カラ７７　（Ｃｏｔｖｍａｎ、　Ａ、Ｆ、）　、セイント（５ａｉｎｔ　、　Ｒ １３、）、プラウ７　（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、　Ｖ、　）およびアンダース（Ａｎ ｄｅｒｓ、　Ｒ，Ｆ、　）　（１９８３）　プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナ ショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８０、３７８７−３７９１　、。

２、ニア　ヘ／Ｌ／　（Ｃｏｐｐｅｌ、　Ｒ＋Ｌ、）　、カラマン（Ｃｏｗｍａ ｎ、　Ａ。

Ｆ、）、７７ダーｘ　（Ａｎｄｅｒｓ、　ＲｌＦ、　）　、ビアンコ（Ｂｉａｎ ｃｏ　、＾、Ｅ、）セイント（５ａｉｎｔ、　Ｒ，Ｂ、　）、リンゲルバッハ（ Ｌｉｎｇｅｌｈａｃｌｌ、　Ｋ、　Ｒ，）　、　ケ７プ（Ｋｅｍｐ。

Ｄ、Ｊ、）　およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、Ｖ、　）　（１９８４）ネイ チャー（Ｎａｔｕｒｅ　）ｏ　７ドン　３１０　、７８９−７９２゜３、　オザ キ（０ｚａｋｉ、　Ｌ７．Ｓ、）、スペック（５ｖｅＣ＋　ｐ、　）　。

ナツセンツヴアイヒ（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、　ＲｌＳ、　）　。

同（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、　Ｖ、　）およびゴッドソン（ＧＯｄｓｏｎ。

Ｇ−Ｎ−）（１９８３）、　セル（Ｃｅｌｌ　）３４．８１５−８２２゜４、　 ダーム（Ｄａｍｅ、　Ｊ、　Ｂ、　）、ライリアｌｈ　７．　（Ｗｉ　ｌ　ｌ　 ｉａｍｓ　。

Ｊ、Ｌ、）、７クカツトハン（ＭｃＣｕｔｃｈａ、ｎ、　Ｔ、Ｆ、　）、ウニ” −バー　（Ｗｅｂｅｒ、　Ｊ、　Ｌ、　、）　、ヴイルッ（Ｗｉ　ｒｔｚ　、　 Ｒ，Ａ、　）。

ホックメイヤ−（Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ、Ｗ、　Ｔ、　）、サンダース（５ａｎｄ ｅｒｓ、　Ｇ、　Ｓ、　）　、レッデイ（Ｒｅｄｄｙ、　Ｅ、　Ｐ、　）　、　 ７０イ（Ｍａｌｏｙ　、　Ｗ、Ｌ、）　／％イア　７．　（Ｈａｙｎｅｓ、　Ｊ 、　Ｄ、）　、　シナイブ−（５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　！、　）、　ｏバー７　 （Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、）　。

ディツプス（Ｄｉｇｇｓ、　Ｃ，Ｌ、　）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｌ−Ｈ，）（１９８４）　サイｘ　７　ス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２２５　。

５９３−５９９　。

５、コヘル（Ｃｏｐｐｅｌ、Ｒ，Ｌ、）、カラ７　ン（Ｃｏｗｍａｎ。

Ａ、Ｆ、）、リンゲルバッハ（Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、に、Ｒ１）。

プラウ７　（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、　Ｖ、　）　、セイ、ント（５ａｉｎｔ、　Ｒ ，Ｂ。

）、サンダ（Ｋｅｍｐ、　Ｄ、　Ｊ　、）およびアンダース（Ａｎｄｃｒｓ、　 Ｒ，Ｆ、　）　（Ｘ９８３　）ネイチャー（ロンドン）３０６、７５１．−７５ ６゜ ６、　スクール（５ｔａｈｌ、Ｈ−Ｄ、　）、　クリ、：Ｌ　−−ＩＪ−−（Ｃ ｒｅｗｔｌｌｅｒ、　Ｐ、　Ｅ、）　、　７　ンダース（Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ 、）　。

プラウ：／　（Ｂｒｏｗｎ、Ｇ、　Ｖ、　）　、　：Ｉ　ヘア１／　（Ｃｏｐｐ ｅｌ、Ｒ，Ｌ。

）、ビア　７　：Ｉ　（Ｂｉａｎｃｏ、　Ａ＋Ｅ、）　、　ミツチェル（Ｍｉｃ ｃｈｅｌｌ　、　Ｇ、Ｆ、）およびサンダ（Ｋｅｍｐ、　Ｄ、　Ｊ、　）（１９ ８５）。プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オーブ、サ イエンスイズ（ＵＳＡ）８２．５４３−５４７゜ ７、スター／Ｌ／　（５ｔａｈｌ　、Ｈ−Ｄ＋）　、　：Ｉぺ／Ｌ／　（Ｃｏｐ ｐｅｌ　、　ＲｏＬ。

）、プラウ７　（Ｂｒｏｗｎ、Ｇ、Ｖ、　）、セイント（５ａｉｎｔ。

Ｒ，Ｂ、）、リンゲルバッハ（Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｋ、　）　、カラ？　 ７　、　（Ｃｏｗｍａｎ、　Ａ、　Ｆ、）、アンダース（Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ 。

）オヨびサンダ（Ｋｅｍｐ、Ｄ、Ｊ、）（１９８４）　プロシーディンゲス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ（ＵＳＡ　）８１．２ ４５６−２４６０゜ ８、　サンガー（Ｓａｎｇｅｒ、Ｒ，）、　＝ツクレフ　（Ｎ１ｃｋｌｃｎ、　 Ｓ。

）およびコウルン：／　（Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，）　（１９７７）　プ ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンスイズ （ＵＳＡ　）　７４．５４６３−５４６７゜ ９、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　）およびビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ、 　Ｊ、　）　（１９８２）ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９．　２６９−２７６゜ １０、スティデン（Ｓｔａｄｅｎ、Ｒ，）（１，９８０）　５Ｃクレイ’７り・ アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、）　８゜３６７３− ３６９４゜ １１、　アサ−トン（Ａｃｈｅｒｔｏｎ、Ｅ、）、カビーツェル（Ｃａｖｉｅｚ ｅｌ、　Ｍ、　）、　７オツクス（Ｆｏｘ、　Ｈ，）　、バーキス（Ｈａｒｋｉ ｓｓ、　Ｄ、　）　、オーバー（０ｖｅｒ、Ｒ２）、シェパード（５ｈｅｐｐａ ｒｄ、Ｒ，Ｃ，）　（１９８３）　シ：ｒ−イ・’ｙム・７り、　バーキン・ト ラフ　ス（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ、　）　１．６ ５−７３゜ １２、パー／Ｌ／７ン（Ｐｅｒｌｍａｎ　、Ｈ，）　、　ヘーツィ７　ｘ　（Ｂ ｅｒｚｉｎｓ、　Ｋ、　）　、ウオールグレア　（Ｗａｈｌｇｒｅｎ　、　Ｍ、 ）　。

カールスンン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｊ、　）　、ビョークマン（Ｂｊｏｒｋｍ ａｎｎ、　Ａ、　）　、パタルボヨ（Ｐａｔａｒｖｏｙｏ、Ｍ、Ｅ、　）　。

およびペー／Ｌ／７　：／　（Ｐｅｒｌｍａｎｎ、Ｐ、）　（１ｇ８４）ジャー ナル・オブ・エクスペリメンタルクメデイソン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１５９ ．１６８６−１７０４゜１３．７７ダース（Ａｎｄｅｒｓ、　Ｒ，Ｆ、）、コペ ル（Ｃｏｐｐｃｌ　。

Ｒ，Ｌ、）、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ、　Ｇ、　Ｖ、　）、セイント（Ｓａｉｎｔ 　、　Ｒ，Ｂ、　）　、カラ？　：／　（Ｃｏｗｍａｎ、　Ａ、Ｆ、）　、リン ゲルバッハ（Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、　Ｋ、Ｒｏ）　、ミツチェル（Ｍｉｃｃｈ ｅｌｌ、　Ｇ、　Ｆ、　）およびサンブ（Ｋｅｍｐ、　Ｄ、　Ｊ、　）　（１９ ８４）モレキュラー・オブ・バイオロジカル・メ７’４７７（Ｍｏｌｅｃ、Ｂｉ ｏｌ、Ｍｅｄ、　）２，１７７−１９１゜ＡＡＴＴＣＣＧＡＡ計ＣＣＴＴＴＴＴ ＮＸＴＴＴＴＴＴＣＴ’ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴ船ＣＴＴＡＴＴＩＦ／ａ、／（Ａ 　２ａ。

ｌ）ｃ、　／　（Ｂ）旧。

ＦＩＧ、　／（Ｃ）ａ。

Ｆｙｃ、　／（Ｃ）、ｂ。

１５５−ｍ−・ Ｆ′／Ｇ、　７（８）、ａ。

／７ンｃ、、７（８）ｂ。

Ｆｔｃ、７（Ｃ）、ａ。

Ｆ／ｃ、７（Ｃ）、ｂ。

ＦＩ６．７σ〃、ａ。

国際７Ａ！報告 ＡＮＮＥＸＴＱ丁ＨεＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡｌ’１ＣｌＩＲＥＰＯ ＲＴＯＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、ＰＣ丁 ／ＡＵ　８５１００２２３

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスモジウム・フアルシパムの抗原であつて、リング−感染赤血球表面抗 原（ＲＥＳＡ）、フアルシパルム点在性反復抗原（ＦＩＲＡ）、およびそれらと 交差反応し得るその他のＰ．フアルシパルム抗原からなる群から選択される抗原 をコードしている塩基配列の全てまたは一部分に実質的に相当するヌクレオチド 配列を含有しているＤＮＡ分子。
2. ２．該ヌクレオチド配列が、実質上、Ｐ．フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原に対応 するＰ．フアルシパルムのポリペプチドをコードしている第１項記載のＤＮＡ分 子。
3. ３．該ヌクレオチド配列が、実質上、Ｐ．フアルシパルムのＦＩＲＡ抗原に対応 するＰ．フアルシパルムのポリペプチドをコードしている第１項記載のＤＮＡ分 子。
4. ４．該ヌクレオチド配列が、実質上、第１図に示された塩基配列を含む配列の少 くとも一部によつて特性化される、第１項記載のＤＮＡ分子。
5. ５．該ヌクレオチド配列が、実質上、第７図に示された塩基配列を含む配列の少 くとも一部によつて特性化される、第１項記載のＤＮＡ分子。
6. ６．ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原、並びにそれらと交差反応し得るその他のＰ． フアルシパルム抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルムの抗原の抗原 性を示す少くとも１個のポリペプチドとして発現され得るヌクレオチドを含有し ているＤＮＡ分子。
7. ７．発現コントロール配列と機能的に結合している第１項〜第６項のいずれかに 記載のヌクレオチド配列を含有している組換えＤＮＡ分子。
8. ８．Ｐ．フアルシパルムの少くとも１個のポリペプチドまたはタンパク質の全て 、または一部を発現し得る組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクターで あつて、発現コントロール配列と機能的に結合している第１項〜第６項のいずれ かに記載のヌクレオチド配列が挿入されている組換えＤＮＡクローニングビヒク ルまたはベクター。
9. ９．該ヌクレオチド配列および該発現コントロール配列がバクテリオフアージに 挿入されていることを特徴とする第８項記載の組換えＤＮＡクローニングビヒク ルまたはベクター。
10. １０．該バクテリオフアージがバクテリオフアージλＡｍＰ３であることを特徴 とする第９項記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクター。
11. １１．第７項記載の組換えＤＮＡ分子、あるいは第８項記載の組換えＤＮＡクロ ーニングビヒクルまたはベクターを含有している宿主細胞。
12. １２．ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原、およびそれらと交差反応し得るその他のＰ ．フアルシパルム抗原からなる群がら選択されるＰ．フアルシパルム抗原の全て 、または一部の抗原性を示す合成ペプチドまたは合成ポリペプチド。
13. １３．Ｐ．フアルシパルムのＲＥＳＡ抗原の全てまたは一部の抗原性を示すこと を特徴とする第１２項記載の合成ペプチドまたは合成ポリペプチド。
14. １４．Ｐ．フアルシパルムのＦＩＲＡ抗原の全てまたは一部の抗原性を示すこと を特徴とする第１２項記載の合成ペプチドまたは合成ポリペプチド。
15. １５．ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原およびそれらと交差反応するその他のＰ．フ アルシパルム抗原からなる群がら選択されるＰ．フアルシパルム抗原の抗原性を 示すポリペプチドをＣ−末端配列とし、それと融合する付加的なポリペプチドを Ｎ末端とすることからなる融合ポリペプチド。
16. １６．付加的なポリペプチドが組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクタ ーのＤＮＡによつてコードされているポリペプチドである第１５項記載の融合ポ リペプチド。
17. １７．哺乳類のＰ．フアルシパルムに対する免疫応答を刺激するための組成物で あつて、ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原、およびそれらと交差反応するその他のＰ ．フアルシパルム抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルム抗原の抗原 性を示す少くとも１個のポリペプチドと、薬学的に許容し得る担体とを含有する 組成物。
18. １８．さらにアジユバントをも含有している第１７項記載の組成物。
19. １９．哺乳類の、Ｐ．フアルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激するための組 成物であつて、ＲＥＳＡ抗原、ＦＩＲＡ抗原およびそれらと交差反応するその他 のＰ．フアルシパルム抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルム抗原の 抗原性を示す少くとも１個のポリペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列 を含有しているＤＮＡ分子が挿入されたウイルスまたは微生物と、薬学的に許容 し得る担体とを共に含有している組成物。
20. ２０．哺乳類に第１７項または第１８項に記載の組成物を投与することからなる 、哺乳類の、Ｐ．フアルシパルムに対する免疫応答の刺激方法。