NL9202026A - Recombinant nuclëinezuur, daardoor gecodeerd polypeptide materiaal en daarop gebaseerd transmissie-blokkerend vaccin ter bestrijding van de malariaparasiet Plasmodium falciparum. - Google Patents

Description

Titel: Recombinant nucleïnezuur, daardoor gecodeerd polypeptide materiaal en daarop gebaseerd transmissie-blokkerend vaccin ter bestrijding van de malariaparasiet Plasmodium falciparum

Gebied van de uitvinding

De uitvinding ligt op het gebied van de malaria-bestrijding en betreft de bereiding van een vaccin gebaseerd op de identificatie, isolatie, karakterisatie, manipulatie en expressie van een bepaald gen van de humane malariaparasiet Plasmodium falciparum. Met name betreft de uitvinding het gebruik van het gen-product, of delen daarvan, als vaccincomponent ter inductie van een immunologisch afweersysteem dat specifiek tegen de extracellulaire ontwikkeling van de parasiet in de als tussengastheer optredende mug van het geslacht Anopheles is gericht.

Achtergrond van de uitvinding

Sedert mensenheugenis behoort malaria tot een van de meest voorkomende en gevreesde tropische ziekten. Ongeveer de helft van de wereldbevolking wordt door de ziekte bedreigd en gemiddeld genomen zijn zo'n 400 miljoen mensen ook daadwerkelijk ziek. Het jaarlijkse aantal dodelijke slachtoffers, voornamelijk kinderen, wordt op zo'n 2,5 miljoen mensen geschat.

De parasitaire ziekte malaria wordt veroorzaakt door eencellige protozoa van het geslacht Plasmodium en van mens tot mens overgedragen door de vrouwelijke muskiet van het geslacht Anopheles. Er zijn 4 verschillende soorten malariaparasieten bekend waarvoor de mens tussengastheer is. Deze soorten verschillen onderling sterk van elkaar met betrekking tot de aard en ernst van het door hen opgewekte ziektebeeld.

Zowel wat betreft infectiviteit, morbiditeit als mortaliteit is Plasmodium falciparum de meest gevaarlijke malariaparasiet voor de mens. Deze is in gebieden waar malaria endemisch is veelal de belangrijkste ziekteverwekker en zeer vaak daarbij ook nog resistent tegen geneesmiddelen zoals bv. chloroquine. Zowel in tropische als subtropische gebieden komt Plasmodium falciparum vrij algemeen verspreid voor.

De op een na belangrijkste en behoorlijk verspreid voorkomende parasiet is Plasmodium vivax. De andere twee soorten, Plasmodium ovale en Plasmodium malariae. komen slechts in een beperkt aantal gebieden voor (Plasmodium ovale alleen in West Africa). Ook vormen laatstgenoemde parasieten geen echte bedreiging voor de volksgezondheid.

Humane malariaparasieten zijn zeer gastheer-specifiek. Dit betekent dat ze niet met behulp van dieren vermenigvuldigd kunnen worden en dat men voor de productie/vermeerdering van de asexuele erythrocytaire stadia en gametocyten dus op uiterst kostbare in vitro kweken is aangewezen.

Voor een mondiale bestrijding van de ziekte waren in de zestiger en zeventiger jaren twee strategieën bijzonder in zwang, een die rechtstreeks gericht was op een bestrijding van de vector-muskiet met behulp van larvaciden en insecticiden (bijv. DDT), de ander op een bestrijding van de eencellige parasiet van het geslacht Plasmodium met behulp van geneesmiddelen (in het bijzonder derivaten van kinine, zoals bijvoorbeeld chloroquine).

Alhoewel deze grootscheepse bestrijdingscampagnes aanvankelijk zeer succesvol leken te zijn, is als gevolg van een dramatische ontwikkeling van resistenties tegen deze bestrijdingsmiddelen het rendement van deze bestrijdingsstrategieën snel verslechterd. Het aantal ziektegevallen dat aanvankelijk enorm sterk afnam, bleek een decennium later weer enorm sterk toe te nemen. Ter illustratie moge het volgende voorbeeld dienen. In 1935 was het aantal klinische ziektegevallen in India ongeveer honderd miljoen, in 1965 was dit aantal, dankzij het systematisch bespuiten van grote gebieden met DDT, nog slechts zo'n honderd duizend. Tien jaar na het staken van de bespuitingen had dit aantal weer epidemische vormen aangenomen. Eind jaren zeventig werden alweer 150 miljoen klinische gevallen gerapporteerd waarvan vanwege de evenzeer opgetreden resistenties tegen chloroquine zeer vele met een dodelijke afloop. Om deze reden, en in mindere mate ook uit milieu-hygiënische overwegingen, is men eind zestiger jaren met DDT bespuitingen gestopt en is men op zoek gegaan naar nieuwe bestrijdingsmiddelen waaraan laatstgenoemde bezwaren niet kleven.

Mede vanwege de schijnbaar grenzeloze mogelijkheden van de toenmaals enorm sterk in opkomst zijnde recombinant DNA technologie werden eind zeventiger jaren onderzoekslijnen gestart die op een min of meer 'klassieke' benadering van het probleem waren gebaseerd, nl. de bestrijding van malariaparasieten, Plasmodium falciparum in het bijzonder, door middel van vaccins. Reeds vanaf het prille begin heeft de Wereld Gezondheids Organisatie (WHO) deze alternatieve benadering zeer sterk geëntameerd en tevens de mondiale coördinatie van het vaccin-onderzoek op zich genomen. Doel van de alternatieve bestrijdingsmethode is om door middel van een gerichte stimulering van de humorale en cellulaire immunologische afweersystemen van de mens een efficiënt afweersysteem op te bouwen dat in staat is, hetzij in de geïnfecteerde mens hetzij in de geïnfecteerde mug van het geslacht Anopheles. de complexe levenscyclus van de parasiet te doorbreken.

In grote lijnen zijn de levenscycli van alle malariaparasieten aan elkaar gelijk. Elke parasiet kent zijn eigen specifieke gastheer (een muskiet van het geslacht Anopheles) en tussengastheer (bijv. de mens) .

Besmetting van de mens begint met een steek door een parasieten-dragende mug. Met het speeksel worden de sporozoieten of sikkelkiemen op de tussengastheer (mens) overgebracht. Nadat deze in het bloed terecht zijn gekomen, infecteren ze vrijwel onmiddellijk de leverparenchymcellen. Ten koste van deze cel groeit de parasiet uit tot een reuzecel (schizont) met zeer veel kernen (syncitium). Na een uitbundige membraansynthese deelt deze cel zich tenslotte op in enkele tienduizenden minicellen, de zgn. merozoieten. De levercel gaat hieraan ten gronde en de merozoieten komen dan in de bloedbaan terecht. Het hepatocytaire vermenigvuldigingsstadium gaat meestal slechts ten koste van enkele levercellen, reden waarom de primaire parasitaire infectie voor de patiënt meestal volkomen onopgemerkt blijft.

Na vrijkomen uit de levercel zijn de merozoieten voor hun verdere ongeslachtelijke vermenigvuldiging afhankelijk van de rode bloedcellen (erythrocyten) die ze vrijwel onmiddellijk na vrijkomen uit de hepatocyt infecteren. Aanvankelijk hebben de parasieten hierin een ringvormige struktuur die uitgroeit tot een vrij-beweeglijke trofozoiet welke zich o.a. met het rijkelijk in de erythrocyt aanwezige hemoglobine voedt. Uit de trofozoiet groeit vervolgens een 8 tot 16 kernen bevattende schizont die aansluitend op een uitgebreide membraansynthese openbarst onder vrijkomen van nakomeling merozoieten. Vrijwel onmiddellijk na vrijkomen dringen deze weer nieuwe erythrocyten binnen en herhaalt zich het zojuist beschreven replicatieproces. Behalve koortsverwekkende stoffen komt met het openbarsten van de erythrocyt ook een onverteerbaar ijzerhoudend polymeer, het pigment of hemozoin, vrij dat een product is van de hemoglobine digestie. De malaria-ziekte is dan begonnen zoals door aantonen van de parasiet in een 'dikke bloeddruppel' ondubbelzinnig kan worden gediagnostiseerd. Wanneer het vermenigvuldigings-proces van de merozoieten in de erythrocyt synchroon verloopt (in twee resp. drie dagen), gaat de koorts eveneens een periodiciteit vertonen. Het aantal parasieten neemt dan logaritmisch toe en met elke erythrocytaire infectie gaan even zovele rode cellen verloren. Ook niet-geïnfecteerde cellen gaan hierbij ten gronde waardoor op den duur bloedarmoede ontstaat. Behalve koortsaanvallen en bloedarmoede kenmerkt de malaria-ziekte zich nog door andere symptomen, zoals bv. milt-vergroting of cerebrale malaria. Cerebrale malaria komt vaak bij infecties met Plasmodium falciparum voor en is een gevolg van het 'dichtslibben' van de capillaire bloedvaatjes met aggregaten van geïnfecteerde erythrocyten.

Na infectie van een erythrocyt door een merozoiet ontwikkelen zich hieruit niet altijd merozoieten. Via een nog niet opgehelderd mechanisme en met lage frequentie kan de merozoiet zich in de erythrocyt ook tot een precursor van een vrouwelijke of mannelijke geslachtscel, de vrouwelijke respectievelijk mannelijke gametocyt, ontwikkelen. Na ontwikkeling blijven deze intracellulaire geslachtelijke vormen in het bloed circuleren en worden wanneer ze voldoende 'oud' zijn door het immuunsysteem opgeruimd. Pas wanneer ze tijdens een bloedmaal door een muskiet worden opgezogen, worden ze ten gevolge van de verandering in temperatuur en pH uit hun rust gewekt en rijpen ze in de muggemaag vrijwel onmiddellijk uit tot mannelijke microgameten c.q. vrouwelijke macrogameten die na vrijkomen elkaar vrijwel onmiddellijk bevruchten. Nadat de ontstane zygote tot een beweeglijke oökineet is uitgegroeid, dringt deze door de wand van de middendarm om zich te nestelen onder het basaal membraan. Onder gelijktijdige ontwikkeling van vele sporozoieten groeit deze dan uit tot een oöcyste. Zijn deze eenmaal rijp dan barsten deze onder vrijkomen van de nakomeling sporozieten open.

Deze verplaatsen zich dan, gedreven door een nog onopgehelderd mechanisme, via de haemocoel naar de speekselklier alwaar zij zich in het lumen nestelen. Wanneer deze mug nu weer een bloedmaal neemt, komt een fractie van deze sporozoieten in het bloed van het volgend slachtoffer terecht en is de parasitaire ontwikkelingcyclus gesloten.

Het kweken van parasieten in het laboratorium is een bijzonder moeilijke en kostbare aangelegenheid (humane sera en bloedcellen zijn hiervoor vereist). Daar de replicatie in vitro daarenboven zeer inefficiënt verloopt, kunnen ze slechts in zeer geringe hoeveelheden in het laboratorium worden geproduceerd. Dit geldt mutatls mutandi ook voor de op het oppervlak van deze parasieten gelegen antigenen. Om deze redenen kunnen voor vaccinatie tegen de malariaparasiet geen afgezwakte of gedode parasieten worden gebruikt (bij gebruik van gedode parasieten wordt niet eens een beschermende immuunrespons verkregen), zoals vaak wel mogelijk is voor de bestrijding van bacteriële of virale infecties, en is men voor een grootschalige productie van de respectievelijke antigenen, of delen daarvan, op moderne moleculair biologische en/of organisch chemische technieken aangewezen.

Daar de parasiet voor het volledig doorlopen van zijn levenscyclus van gastheer (mens resp. mug) dient te wisselen, kunnen in theorie drie niveau's aangewezen worden waarop met behulp van een geactiveerd immunologisch afweersysteem de levenscyclus van de parasiet doorbroken zou kunnen worden. Deze drie niveau's zijn: 1. Verhindering van penetratie respectievelijk vermenigvuldiging van de parasiet in de humane levercel; 2. Verhindering van penetratie respectievelijk vermenigvuldiging van de parasiet (merozoiet) in de rode bloedcel; en 3. Verhindering van vorming/rijping van de geslachtscellen, hun wederzijdse bevruchting en de daarop aansluitende ontwikkeling tot voor de mens infectieuze parasitaire stadia.

De antigenen of delen daarvan die voor de ontwikkeling van een vaccin in aanmerking komen, dienen op het oppervlak van de parasiet respectievelijk geïnfecteerde cel te zijn gelegen. Op het cellulaire oppervlak van de sexuele stadia (gametocyten, gameten en/of zygoten) van de parasiet zijn met behulp van transmissie-blokkerende mono-clonale antilichamen (TB Mabs) tot dusverre drie eiwitten, Pfs230, Pfs45/48 en Pfs25, aangetoond die niet alleen van wezenlijk belang zijn voor de ontwikkeling van de parasiet in de mug, maar bovendien het vermogen bezitten om een krachtige 'transmissie-blokkerende' immuunrespons op te roepen. Remming van hun biologische activiteit met behulp van TB Mabs leidt tot een blokkade van de replicatie van de parasiet en mutatis mutandi ook tot remming van de transmissie van de parasiet van mug naar mens (1, 28).

Van deze eiwitten is Pfs25, een eiwit met een molecuulmassa van ca. 25kDa dat pas in de muggemaag wordt gesynthetiseerd, tot nog toe het enige eiwit waarvan het gen is gekloneerd en gekarakteriseerd (12). De eiwit-componenten van het doublet Pfs45/48 en Pfs230 komen als een stabiel complex op het celoppervlak van zowel gametocyten als gameten voor (14, 22, 28, 29).

Studies naar de biochemische en biofysiche eigenschappen hebben aangetoond dat de twee eiwit-componenten van het Pfs45/48 doublet door dezelfde TB Mabs (bv. 32F3 en 32F5) worden herkend, beide sterk hydrofobe glycoproteïnen zijn en eenzelfde isoëlectrisch punt hebben (13, 22, 28, 29). Immunologische studies hebben aangetoond dat er ten minste vier verschillende epitopen in deze eiwitten voorkomen en dat door de tot nog toe geïdentificeerde TB Mabs enkel zogenaamde conformatie-afhankelijke epitopen worden herkend, dit wil zeggen de epitopen worden niet herkend in eiwitten waarvan de zwavel-disulfide bruggen met behulp van reductiemiddelen zijn verbroken (1).

Epidemiologische studies hebben aangetoond dat de epitopen van Pfs45/48 in veld isolaten van Plasmodium falciparum zeer sterk zijn geconserveerd (5). Al deze bevindingen, tezamen met de ontdekking dat ook in de meest natuurlijke situatie (in de mens) de synthese van transmissie blokkerende antilichamen kan worden geïnduceerd (6-10, 17), suggereren dat Pfs45/48 een heel belangrijk instrument zou kunnen zijn voor de ontwikkeling van een transmissie-blokkerend en 'self-boosting' vaccin. Het is om deze redenen dat een onderzoek is gestart naar de identificatie en karakterisatie van het gen of de genen, dat (die) voor de afzonderlijke eiwitcomponenten van Pfs45/48 codeert (coderen) en naar de mogelijkheid om dit gen (deze genen) in heterologe pro- en eukaryotische systemen tot expressie te brengen.

Met transmissie-blokkerend wordt hierin het vermogen van antilichamen bedoeld om, wanneer tezamen met de parasiet uit het bloed in de muggemaag opgezogen, de in de muggemaag verlopende extracellulaire replicatiecyclus te doorbreken. Resultaat van deze immunologische blokkade is dat dezelfde mug bij het nemen van een volgend bloedmaal geen parasieten op een volgend slachtoffer zal overdragen.

Korte samenvatting van de uitvinding

Volgens de uitvinding is het nu gelukt om met behulp van geavanceerde biochemische, immunologische en moleculair biologische technieken uiterst geringe hoeveelheden van elk van de eiwitten van het doublet Pfs45/48 (d.w.z. twee nauwverwante eiwitten met een molecuulmassa van 45 kDa resp. 48 kDa), die zowel op het oppervlak van gametocyten als jonge gameten/zygoten voorkomen, te zuiveren en vervolgens te karakteriseren middels HPLC-chromatografie van hun tryptische digesten gevolgd door een bepaling van de aminozuur-sequentie van enkele van de aldus verkregen peptiden. Zoals hierin uitvoerig beschreven wordt, hebben de uit de opgehelderde aminozuur-sequenties afgeleide gedegenereerde nucleotidesequenties vervolgens als instrument gediend bij de identificatie en isolatie van de voor

Pfs45/48 coderende sequentie uit een cDNA bank die uit gametocyt-mRNA was geconstrueerd. Nadat diverse klonen geïdentificeerd waren, is de nucleotidesequentie van het volledige intronloze Pfs45/48 gen en de daarmee corresponderende aminozuurvolgorde van het primaire translatie-product opgehelderd (SEQ ID NO: 1).

Pas nadat onomstotelijk gebleken was dat: (a) alle van de HPLC-peptiden bepaalde aminozuurvolgordes ook daadwerkelijk in de 'afgeleide' aminozuursequentie van Pfs45/48 waren terug te vinden, en (b) antilichamen, die in een konijn tegen een in de darmbacterie Escherichia coli gesynthetiseerd deel van Pfs45/48 eiwit waren opgewekt, het Pfs45/48 doublet op een Western-blot ondubbelzinnig herkenden, werd de ondubbelzinnige conclusie getrokken dat het Pfs45/48 gen daadwerkelijk was geïsoleerd en gekarakteriseerd. Tevens kon uit de verkregen resultaten de ondubbelzinnige conclusie getrokken worden dat het 'peptide-deel' van de eiwitten Pfs45 en Pfs48 door een en hetzelfde gen wordt gecodeerd. De codongene sequentie is 1347 bp lang en codeert voor een 448 aminozuren lange polypeptideketen met een molecuulmassa van 51,6 kDa. Uit computer-ondersteunde analyses zijn aanwijzingen verkregen dat Pfs45/48 eiwit zeven potentiële N-glycosyleringsplaatsen bevat en dat zowel aan het N-terminale als C-terminale uiteinde hydrofobe aminozuursequenties zijn gelegen. De N-terminale sequentie is vermoedelijk een signaalsequentie terwijl de C-terminale sequentie mogelijk betrokken is bij een membraan-verankering van de eiwitketen via een glycosylphosphatidylinositol anker.

Vervolgens zijn studies ondernomen om het gen, of delen ervan, in heterologe prokaryotische en eukaryotische systemen tot expressie te brengen. Met een serum dat in konijnen tegen een in Escherichia coli gesynthetiseerd Pfs45/48 peptide was opgewekt, kon de conclusie dat gen Pfs45/48 was geïsoleerd ondubbelzinnig worden bevestigd.

Geen van de in Escherichia coli gesynthetiseerde recombinant Pfs45/48 peptiden is tot nog toe in staat gebleken om bij konijnen een transmissie-blokkerende immuunrespons op te wekken. Aangezien alle tot nog toe bekende transmissie-blokkerende monoklonale antilichamen uitsluitend conformatie-afhankelijke epitopen in de eiwitten van het Pfs45/48 doublet lijken te herkennen, werd met deze negatieve uitslag ernstig rekening gehouden.

Om deze reden zijn tevens studies ondernomen om ook in heterologe eukaryotische cellen (COS-cellen en insectecellen) het P£s45/48 gen tot expressie te brengen. Na een geslaagde expressie van Pfs45/48-eiwit in insectecellen die met recombinant Pfs45/48 baculovirus waren geïnfecteerd, kon worden aangetoond dat in een heteroloog eukaryotisch expressie-systeem Pfs45/48 antigenen worden geproduceerd die door Pfs45/48-specifieke transmissie-blokkerende monoklonale antilichamen worden herkend. Deze bezitten het vermogen tot inductie van conformatie-afhankelijke transmissie-blokkerende immuniteit.

Met andere woorden bewijzen deze studies ondubbelzinnig dat de productie van Pfs45/48 antigenen, die transmissie-blokkerende immuniteit bij de mens kunnen induceren, met behulp van heterologe eukaryotische systemen tot de mogelijkheden behoort. Pfs45/48 eiwit wordt in het heterologe eukaryotische expressiesysteem dus kennelijk zo gevouwen dat het na insertie in het oppervlakte-membraan van de insectecel specifiek door transmissie-blokkerende monoklonale antilichamen van Pfs45/48 wordt herkend. De productie van een transmissie-blokkerend vaccin op basis van Pfs45/48 eiwit met behulp van een heteroloog eukaryotisch expressie systeem is derhalve nu een reële mogelijkheid geworden.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De uitvinding verschaft een recombinant nucleïnezuur molecuul, omvattende een nucleotidesequentie gekozen uit (a) nucleotidesequenties die coderen voor de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, (b) nucleotidesequenties die hybridiseren met een aan een nucleotidesequentie volgens (a) complementaire nucleotidesequentie en coderen voor een polypeptide of eiwit dat herkend wordt door een antilichaam dat aan een Plasmodium eiwit kan binden, en (c) fragmenten van een nucleotidesequentie volgens (a) of (b) met een lengte van ten minste 7 nucleotiden.

Volgens de uitvinding gaat de voorkeur uit naar een dergelijk recombinant nucleïnezuur molecuul, dat de in figuur 2 getoonde codongene nucleotidesequentie, een daarvan binnen de grenzen van de degeneratie van de genetische code afwijkende nucleotidesequentie coderend voor de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, een nucleotidesequentie die hybridiseert met ten minste een van de aan deze nucleotidesequenties complementaire nucleotidesequenties en codeert voor een aan Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 verwant polypeptide of eiwit, of een fragment van een van deze nucleotidesequenties met een lengte van ten minste 8 nucleotiden omvat.

Liefst gaat het hierbij om een recombinant nucleïnezuur molecuul, dat codeert voor een polypeptide of eiwit dat herkend wordt door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam met transmissie-blokkerende eigenschappen.

Wanneer hierin sprake is van nucleotidesequenties die hybridiseren met een eerder gedefinieerde nucleotidesequentie wordt daarmee gedoeld op hybridisatie onder conventionele hybridisatie-condities, bij voorkeur zodanig stringente hybridisatiecondities dat hybridisatie met niet homologe sequenties wordt vermeden. Met "nucleïnezuur molecuul" wordt beoogd zowel DNA als RNA te omvatten.

Recombinant nucleïnezuur volgens de uitvinding kan voor vele doeleinden worden gebruikt, bijv. voor klonèringsdoeleinden, voor expressie van het eiwit of polypeptide waarvoor het codeert in een heterologe gastheer(cel), voor diagnostische doeleinden als probe of primer voor hybridisatie- of PCR analyse (waarvoor ook nucleïnezuur molekulen met een lengte van 7 of meer, in de praktijk 8 of meer, bij voorkeur 10 of meer, liefst ten minste 12 of zelfs ten minste 15 nucleotiden geschikt zijn), enz. De voorkeur heeft echter gebruik van het recombinante nucleïnezuur ten behoeve van de synthese van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 in heterologe gastheercellen.

De uitvinding verschaft verder een polypeptide materiaal, omvattende een aminozuursequentie waarvoor gecodeerd wordt door een nucleotidesequentie zoals hierboven is gedefinieerd. Met de term "polypeptide materiaal" wordt beoogd zowel oligo- en polypeptiden als eiwitten (polypeptiden die een posttranslationele modificatie zoals processing, acylering, verankering met glycosylphosphatidyl-inositol of glycosylering hebben ondergaan) te omvatten.

Bij voorkeur gaat het hierbij om een polypeptide materiaal, gekozen uit (a) Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 met de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie, (b) een polypeptide met de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, (c) een fragment van een polypeptide volgens (b) met een lengte van ten minste 7, bij voorkeur ten minste 8 aminozuren.

De uitvinding omvat echter tevens natuurlijke en artificiële varianten van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, waarvan de aminozuursequentie afwijkt van de in figuur 2 getoonde sequentie maar die door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam, in het bijzonder een aan Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 bindend antilichaam, liefst transmissie-blokkerend antilichaam, worden herkend. Evenzo omvat de uitvinding polypeptiden met een van de in figuur 2 getoonde sequentie afwijkende aminozuursequentie die door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam, in het bijzonder een aan Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 bindend antilichaam, liefst transmissie-blokkerend antilichaam, worden herkend.

Volgens de uitvinding heeft het de voorkeur dat het polypeptide materiaal herkend wordt door een antilichaam dat aan een Plasmodium eiwit kan binden, liefst door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam met transmissie-blokkerende eigenschappen. Voorbeelden van aan een Plasmodium eiwit bindende antilichamen met transmissie-blokkerende eigenschappen zijn de bekende monoclonale antilichamen 32F3 en 32F5 die aan Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 binden.

Het polypeptide materiaal volgens de uitvinding is een nieuw "synthetisch" materiaal, waarmee bedoeld wordt het materiaal, zoals het in de natuur voorkomt, uit te sluiten. Ten aanzien van de wijze waarop het materiaal wordt bereid, is de uitvinding niet beperkt. De bereiding kan langs chemische weg (conventionele peptide synthese) plaats vinden, maar wordt bij voorkeur gerealiseerd door expressie van recombinant nucleïnezuur in een heterologe gastheercel of gastheer.

Derhalve verschaft de uitvinding tevens een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het kweken van een gastheercel die het polypeptide materiaal produceert en het winnen van het geproduceerde polypeptide materiaal, waarbij een gastheercel wordt gebruikt die het vermogen om het polypeptide materiaal te synthetiseren heeft verworven als gevolg van genetische manipulatie met behulp van een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens de uitvinding. De genetische manipulatie kan zijn uitgevoerd aan een cel waarvan de gastheercel afstamt.

De gastheercel kan een prokaryotische gastheercel zijn, bijv. een Escherichia coli bacterie of een bacterie van een andere soort, maar de voorkeur heeft dat een eukaryotische cel als gastheercel wordt toegepast, bijvoorbeeld een gistcel, schimmelcel, plantecel, insektecel (bijvoorbeeld Spodoptera fruaioerda) of zoogdiercel (bijvoorbeeld Chinese hamster ovarium cellen).

Ook omvat de uitvinding een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het kweken van een transgeen plantaardig of dierlijk organisme dat het polypeptide materiaal produceert en het winnen van het geproduceerde polypeptide materiaal, waarbij een transgeen organisme wordt gebruikt dat het vermogen om het polypeptide materiaal te synthetiseren heeft verworven als gevolg van genetische manipulatie met behulp van een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens de uitvinding. In het geval van een transgeen dier gaat de voorkeur uit naar een transgeen knaagdier, zoals muis, rat, cavia en konijn, maar ook transgene huisdieren, zoals koe, schaap en geit komen in aanmerking.

De uitvinding verschaft tevens een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het uitvoeren van zodanige peptide-synthese stappen dat een polypeptide materiaal volgens de uitvinding wordt verkregen.

Polypeptide materiaal volgens de uitvinding kan voor diverse doeleinden worden gebruikt, bijvoorbeeld voor immunisatie teneinde een antilichaamrespons op te wekken, al dan niet in het kader van een werkwijze voor het bereiden van monoklonale antilichamen. Ook fragmenten met een lengte vanaf 7, in de praktijk vanaf 8 aminozuren, bij voorkeur ten minste 10 of zelfs ten minste 12, liefst ten minste 15 aminozuren, komen daarvoor in aanmerking. De grootste voorkeur heeft echter de toepassing van polypeptide materiaal volgens de uitvinding, in het bijzonder recombinant Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, in een transmissie-blokkerend vaccin dat voor de bestrijding van malaria kan worden ingezet.

De uitvinding verschaft dus verder een transmissie-blokkerend vaccin ter bestrijding van de malariaparasiet Plasmodium falciparum, omvattende een polypeptide materiaal volgens de uitvinding en een geschikte drager of adjuvans. Voor vaccinpreparaten geschikte dragers en adjuvantia zijn aan de deskundige bekend, evenals in aanmerking komende vaccinatiemethoden.

Materialen en Methoden

Strategie Klonering Gen Pfs45/48

Met behulp van immuno-affiniteitschromatografie is het eiwitdoublet Pfs45 en Pfs48 uit gametocyt-extracten van Plasmodium falciparum geïsoleerd. Vervolgens zijn van de d.m.v. polyacrylamide gelelectroforese gezuiverde eiwitten tryptische digesten gemaakt, die middels HPLC-chromatografie in hun samenstellende peptide componenten zijn gescheiden. Van een zevental peptiden is vervolgens m.b.v. een gas-fase sequenator de aminozuurvolgorde bepaald en zijn op basis van deze volgordes een drietal oligonucleotiden met gedegenereerde sequenties gesynthetiseerd. Met behulp van twee van deze oligonucleotiden en de polymerase ketting reaktie (PCR) zijn daarop aansluitend genomische sequenties van Plasmodium falciparum geamplificeerd die na markering met radioactief fosfaat op hun beurt weer gebruikt zijn voor het vissen naar complementaire sequenties in een uit gametocyt-mRNA geconstrueerde cDNA bibliotheek. Met behulp van de opgepikte recombinanten is tenslotte de nucleotide sequentie van het intronloze Pfs45/48 gen bepaald.

Parasieten

Gametocyten van Plasmodium falciparum (isolaat NF54) werden geproduceerd in een geautomatiseerd kweeksysteem zoals beschreven door Ponnudurai c.s. (19). Met behulp van centrifugatie (30 min, 6000 x g en bij 24°C) door een laag van 18% Nycodenz werden de gametocyten van de asexuele bloedstadia gescheiden (29).

Erythrocyten in de gametocyten fractie werden gelyseerd door de cellen 5 min bij 4°C te incuberen in 140 mM NH4CI. Vervolgens werd het mengsel gedurende 10 min bij 4°C gecentrifugeerd in een Eppendorf centrifuge.

Koppeling van Pfs45/48 Specifiek Monoclonaal Antilichaam aan CL-Sepharose

Voor de covalente koppeling van het Pfs45/48 specifieke monoclonale antilichaam IgG 32-F5 (28) aan vers bereide cyanogeen- bromide geactiveerde CL-Sepharose werden de condities gevolgd zoals beschreven door Harlow en Lane (11).

Isolatie en Zuivering van Pfs45/48

Voor de zuivering van elk der componenten van het eiwit-doublet Pfs45/48 werd uitgegaan van een Triton X-114 extract dat middels sonificatie in 40 ml Triton X-114-buffer (2% Triton X-114 (v/v) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) uit 3 x 109 gametocyten was bereid. Behalve voornoemde componenten waren aan de extractiebuffer nog de volgende protease-remmers toegevoegd: phenylmethylsulfonyl fluoride (170 μg/ml) , tosyl-phenylalanine chloromethyl keton (100 μg/ml), tosyl-lysine chloromethyl keton (50 μg/ml), pepstatine (0,7 μg/ml) en leupeptine (0,5 μg/ml) . Na 3 uur staan op ijs werd de vloeibare fase door middel van centrifugatie (1 uur, 100.000 x g, 4°C) van de onopgeloste bestanddelen gescheiden.

Na verdunning van het supernatant met 0,1 volume lOx bindings-buffer (lOx bindingsbuffer = 300 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 M NaCl) werd hierbij 5 ml, aan CL-Sepharose gekoppeld, Pfs45/48 specifiek mono-clonaal antilichaam gepipetteerd waarna het mengsel onder zachtjes schudden overnacht bij 4°C werd geïncubeerd. Na incubatie werd de CL-Sepharose achtereenvolgens gewassen met tweemaal 50 ml: 1. hoog-zout buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40); 2. laag-zout buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,1% SDS); en 3. 150 mM NaCl.

Tenslotte werden de Sepharose korrels nog eenmaal batch-gewijs gewassen met 50 ml gedestilleerd water. Na wassen werden de eiwitten met behulp van 5 ml 1% SDS en een incubatie van 10 min bij 70°C van de korrels geëlueerd. Na vriesdrogen van het eluaat werd aan het eiwit 400 μΐ 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, toegevoegd en werd, totdat al het eiwit opgelost was (ca. 10 min), het geheel in een kokend waterbad geplaatst. Na afkoelen en toevoeging van glycerol en broomfenol blauw tot een eindconcentratie van resp. 10% en 0,005% werden de eiwitten van het doublet van elkaar gescheiden middels SDS-polyacrylamide gel-electroforese onder niet-reducerende omstandigheden (4, 18). Na electroforese werden de twee eiwitbanden met Coomassie blauw gekleurd (18), uit de gel gesneden en bij -20°C in de diepvries bewaard.

Trypsine Digestie, Zuivering en Sequentie Analyse van Tryptische Peptiden

Na uitsnijden werden de gelsegmenten met respectievelijk het Pfs45- en het Pfs48-eiwit gedurende 1 uur bij 37°C in 400 μΐ 100 mM natrium-boraat, pH 9, geïncubeerd. Na toevoeging van trypsine tot een eindconcentratie van 1 μg/ml werd het mengsel gedurende 72 uur in een waterbad van 37°C geïncubeerd. Na 24 en 60 uur incubatie werd nog eens een gelijke hoeveelheid trypsine bij het mengsel gepipetteerd. Aansluitend op de incubatie werden de gelsegmenten middels centrifugatie van de incubatievloeistof gescheiden en werd dithiothreitol, tot een eindconcentratie van 10 mM, bij de incubatie-vloeistof gepipetteerd. Na het mengsel nogmaals gedurende 30 min bij 37°C te hebben geïncubeerd, werd het digestiemengsel op een HPLC C18-reverse-phase kolom (Beekman, 4,7 x 250 mm) gebracht die in 0,063% trifluorazijnzuur (TFA) in aqua dest (= eluens A) was ge-preïncubeerd. Elutie van de peptiden (elutiesnelheid: 1 ml/min) vond plaats met gradiënten, van eluens B (= 0,060% TFA in aceto-nitril-water (80:20)) in eluens A, van de volgende samenstellingen: 1. gradiënt van 0-40% B in een tijdsbestek van 60 min; 2. gradiënt van 40—75% B in 30 min; en 3. gradiënt van 75-100% B in 10 min.

De elutie werd gevolgd middels bepaling van de UV-absorptie bij 214 nm. Na elutie werden de piekfracties ingedampt met behulp van een Speed-Vac centrifuge. Van een zevental peptiden werd tenslotte de aminozuurvolgorde bepaald met behulp van een gas-fase sequenator (Applied Biosystems, Model 477A).

Oligonucleotide Synthese en Polymerase Ketting Reactie

Oligonucleotide primers voor polymerase ketting reacties (PCR) en sequentie-analyses werden gesynthetiseerd met behulp van een Cyclone Plus DNA synthesizer (Milligen/Biosearch).

Een PCR reactiemengsel had de volgende samenstelling: 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatine, 0,1% Triton X-100, 200 μΜ van elke der nucleotidetrifosfaten dATP, dGTP, dCTP en dTTP, 50 pmol van de 5'-primer en 3’-primer, 100 ng genomisch Plasmodium falciparum DNA en 2,5 eenheden Taq DNA polymerase (Promega). DNA amplificatie vond plaats in 35 cycli, elk bestaande uit een incubatie van 1 min bij 96°C, 1,5 min bij 50°C en 3 min bij 72°C. Na incubatie werden de reactieproducten geanalyseerd middels electroforese op een 1% agarose gel (23).

Screening van Garnetocyt-cDNA Bibliotheek en Nucleotide Sequentie-analyse

Een gametocyt-cDNA bibliotheek (100.000 kolonies) in pcDNA II (InVitrogen, San Diego, USA) werd uitgeplateerd op LB-agar platen waarna hiervan replica's op nitrocellulose filters werden gemaakt volgens standaard procedures (23) . Vervolgens werd het circa 750 bp lange PCR fragment in een random-prime reactie (23) radioactief gemaakt met a32P gelabeld dATP, waarna de filters hiermede overnacht en bij 55°C werden geïncubeerd.

Samenstelling hybridisatie-vloeistof: 6 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,1% SDS en 100 μg/ml haringsperma DNA (20 x SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Na citraat, pH 7,0 ; 50 x Denhardt's = 1% Ficoll, 1% polyvinylpyrrolidone, 1% runderserumalbumine).

Na wassen bij 55°C met 0,1 x SSC werden de hybridisatiesignalen met behulp van autoradiografie zichtbaar gemaakt. Positief reagerende kolonies werden daarna rein gestreken en vervolgens werd van de cDNA inserts de nucleotide-volgorde bepaald met behulp van de voor dubbelstrengs DNA ontwikkelde keten-termineringsmethode (2, 3, 24) .

Northern Blot Analyse

Uit circa 100 x 106 parasieten van zowel de asexuele stadia (schizonten plus merozoieten) als sexuele stadia (gametocyten of gameten) werd volgens standaard technieken (23) RNA geïsoleerd dat vervolgens op een 1% agarose/formaldehyde gel (10 μg/slot) werd gefractioneerd (21) .

Na blotting van het RNA op een nitrocellulose-filter (23) werd dit overnacht bij 45°C geïncubeerd in de hybridisatievloeistof zoals eerder omschreven en waarbij een aan het 5'-uiteinde met radioactief fosfaat gelabelde (23) PCR primer was gepipetteerd. Na incubatie werd het filter diverse malen bij 40°C gewassen met 6 x SSC waarna het filter ingelegd werd voor autoradiografie (72 uur bij -80°C) .

Western Blot Analyse

Ten behoeve van immunologische analyses werden uit gametocyten geïsoleerde eiwitten middels electroforese op 10% SDS-polyacrylamide gels (5 x 106 gametocyt-equivalenten per laan) onder niet-reducerende condities gefractioneerd.

Na electroblotten van de eiwitten op een nitrocellulose-filter werden de filters gedurende 3-16 uur geïncubeerd in een oplossing van 3% runderserumalbumine in PBS (PBS = 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, 150 mM NaCl). Daarna werden de filters geïncubeerd met hetzij een polyclonaal antiserum (1:400 verdund met PBS) dat tegen een in Escherichia coli gesynthetiseerd recombinant peptide van Pfs45/48 was opgewekt (vide infra), hetzij met het eerder genoemde Pfs45/48-specifieke monoclonaal antilichaam 32F3 (eindconcentratie 1 μg/ml). Na een tweede incubatie met een alkalische fosfatase-geconjugeerd antilichaam (geit-anti-konijn respectievelijk konijn-anti-muis en 1:5000 verdund in PBS) werden de immuuncomplexen met de chromogene substraten BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat) en nitroblue-tetrazolium chloride (NBT) zichtbaar gemaakt.

Synthese van Pfs45/48 Specifieke Peptiden in E. coli

Gebruikmakend van standaard recombinant DNA technieken (23) werd een PCR fragment, coderend voor aminozuren 118 t/m 218 van Pfs45/48, gekloneerd in de fusie-eiwit vector pGEX-3X (26).

Na inductie met IPTG werd het in zogenaamde ’inclusion bodies' aanwezige fusie-eiwit van glutathion-S-transferase door middel van SDS-polyacrylamide gel-electroforese gezuiverd (20) . Na electroforese werden de eiwitten zichtbaar gemaakt met behulp van 0,25 M KC1. Vervolgens werden de fusie-eiwitten bevattende gelsegmenten uitgesneden en overnacht bij kamertemperatuur in 100 μΐ elutie-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM CaCl2, 0,01% SDS) geïncubeerd.

Na toevoegen van KC1 tot een eindconcentratie van 50 mM werd nog eens 10 min bij 0°C geïncubeerd waarna, ter verwijdering van het SDS-precipitaat, 5 min in een Eppendorf-centrifuge werd gecentrifugeerd.

Met de geïsoleerde eiwitten werden vervolgens konijnen (New Zealand White) geïmmuniseerd: 4 injecties, elk met 0,5 mg fusie-eiwit; de eerste in Freunds-adjuvants compleet en de andere 3 in Freunds-adjuvants incompleet.

Expressie van Gen Pfs45/48 in Insectecellen

Voor dit doel werden twee PCR primers: a. 5'-GCTAGCATGATGTTATATATTTCTGCG-3' (SEQ ID NO: 2) en b. 5'-GCTAGCATGAGCTAAATATATAATAATATTGC-3' (SEQ ID NO: 3) gesynthetiseerd die respectievelijk overlappen met het start- en stopcodon van gen Pfs45/48 en aan het 5’-uiteinde van een herkenningssequentie van het restrictie-enzym Nhel zijn voorzien.

Na incubatie van de primers met genomisch Plasmodium falciparum DNA (30 cycli elk bestaande uit een incubatie van resp. 1 min bij 96°C, 1 min bij 55°C en 2,5 min bij 72°C) werd het geamplificeerde DNA-fragment middels agarose gelelectroforese gezuiverd en na incubatie met Nhel in de Nhel site van de transfervector pJVPlOZ geïnserteerd (30).

Nadat de recombinant (pJV45/48P10Z) met de gewenste oriëntatie van het PCR-fragment was geïdentificeerd en gekarakteriseerd, werd deze tezamen met het genoom van de baculovirus vector Autocrapha californica volgens standaard methoden (27) in weefselkweekcellen (Sf9) van de insect Spodoptera fruaiperda getransfecteerd. Na positieve selectie van de recombinante baculovirussen met het chromogene substraat 5-bromo-4-chlorothiogalactoside (X-gal) werden deze met behulp van dezelfde selectie technieken rein gekweekt.

Voor immuno-fluorescentie experimenten (IFA) werden Sf9 cellen op dekglaasjes gekweekt en vervolgens met het recombinante baculovirus geïnfecteerd (circa 1 plaque-forming unit (pfu) per cel). Drie dagen na infectie werd met de IFA-assay onderzocht of Pfs45/48-eiwit was gesynthetiseerd en of het, analoog aan het authentieke eiwit, op het buitenoppervlak van het celmembraan van de geïnfecteerde cellen werd geexposeerd.

Immuno-Fluorescentie Assay

Geïnfecteerde cellen werden gefixeerd met ethanol/aceton (1:1) en vervolgens 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd met hetzij polyclonaal antiserum (1:100 verdund in PBS), hetzij monoclonaal antiserum 32F5 (10 μg/ml in PBS). Na wassen met PBS werd bij de cellen een met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld tweede antilichaam (geit-anti-konijn IgG, 1:100 verdund in Evans Blue of konijn-anti-muis IgG, 1:200 verdund in Evans Blue; Evans Blue = 0,5% glucose, 0,05% Evans Blue in PBS) gepipetteerd en na 30 min incubatie in het donker werden de cellen gewassen met PBS, en na drogen met behulp van een fluorescentie-microskoop geanalyseerd.

Resultaten en Discussie

Isolatie en Zuiverinq van Pfs45/48

Aangezien Pfs45/48 een zeer hydrofoob membraan eiwit is (22, 28), is het voor het oplossen ervan noodzakelijk dat het oplosmiddel een detergens bevat (Triton X-114 of SDS). Met de beschreven procedure kon Pfs45/48 efficiënt uit de garnetocyt-membranen worden geëxtraheerd en vervolgens efficiënt aan het aan CL-Sepharose gekoppelde monoclonaal antilichaam 32F5 worden gebonden. De zeer hoge affiniteit van 32F5 voor Pfs45/48 maakte het mogelijk dat zowel bij de binding als bij het wassen van de affiniteitkolom stringente condities werden gebruikt. Hierdoor werd bereikt dat er zich geen andere antigenen aspecifiek aan de affiniteitskolom gingen hechten. Omgekeerd maakte zulk een hoge affiniteit het gebruik van 'krachtige' elutie-middelen noodzakelijk.

Na kolomchromatografie zijn de afzonderlijke eiwit-componenten van het doublet Pfs45/48 onder niet-reducerende condities van elkaar gescheiden middels SDS-polyacrylamide gelelectroforese (4, 18). Met deze tweede zuiveringsstap werd tevens bereikt dat ook IgG, dat altijd in meerdere of mindere mate van een immuno-affiniteits kolom lekt, van de respectievelijke eiwitcomponenten werd gescheiden. Op basis van de intensiteit van de Coomassie-blauw gekleurde eiwitbanden kon geconcludeerd worden dat elk der componenten voor meer dan 90% zuiver was en dat de geschatte opbrengst van Pfs45 ongeveer 20 μg en dat van Pfs48 ongeveer 16 μg bedroeg. Na kleuring werden de eiwitbanden uit de gel gesneden en werd, ter verificatie dat Pfs45 en Pfs48 daadwerkelijk waren geïsoleerd, een deel van de eiwitfracties opnieuw onder niet-reducerende condities op een polyacrylamide gel gefractioneerd (18) . Na electroforese werden de eiwitten op een nitrocellulose-filter geblot en met het monoclonaal antilichaam 32F5 geïncubeerd. Na zichtbaar maken van de immuun-complexen met een tweede geconjugeerd antilichaam en een chromogeen substraat (Materialen en Methoden) kon inderdaad de ondubbelzinnige conclusie worden getrokken dat de twee componenten van het doublet vrij van IgG of andere eiwitcomponenten waren geïsoleerd.

Trypsine Digestie

Ter verkrijging van een zo volledig mogelijk digest werden de eiwitten langdurig in aanwezigheid van een zo laag mogelijke trypsine concentratie geïncubeerd. Na digestie werden de tryptische peptiden van elkaar gescheiden met behulp van reverse-phase HPLC-chromatografie. De enorme overeenkomsten tussen de elutie-patronen van de peptiden welke door trypsine uit Pfs45 en Pfs48 waren vrijgemaakt, bevestigden onze eerdere vermoedens dat deze twee eiwitten slechts in geringe mate van elkaar konden verschillen.

Ter verdere verificatie hiervan werden enkele overeenkomstige peptide-fracties van de HPLC-eluaten van Pfs45 en Pfs48 bij elkaar gevoegd en vervolgens opnieuw met behulp van de HPLC-kolom gefractioneerd. In alle gevallen kon slechts één piek worden geëlueerd hetgeen opnieuw bewijst dat de peptide-fracties zuiver waren en dat de overeenkomstige fracties van de kolom-eluaten van Pfs45 en Pfs48 peptiden met een identieke aminozuurvolgorde bevatten.

Na fractionering op de HPLC-kolom is van vijf Pfs45 specifieke peptiden en van vier 'gemengde' peptiden van Pfs45 en Pfs48 de aminozuurvolgorde bepaald. Uit deze analyses bleek dat de trypsine digesties toch nog onvolledig waren en dat, op basis van sequentie-overlap tussen de peptiden, uit de verkregen resultaten zeven, voor het merendeel ondubbelzinnige, aminozuursequenties (Tabel 1) konden worden afgeleid. Duidelijk is dat peptide 2, en mogelijk ook peptide 5, het product is van een onvolledige proteolytische digestie.

Combinatie van de aminozuurvolgordes van de peptiden 1, 2 en 3 levert de (meest waarschijnlijke) aminozuursequentie: VYTDYENRVETDISELGLIEYEIE (SEQ ID NO: 4) .

De in Tabel 1 onderstreepte sequenties zijn gebruikt voor het ontwerpen van de gedegenereerde oligonucleotiden ten behoeve van de PCR-amplificatie (vide supra).

PCR en Northern Blot Analyse

Bij het ontwerpen van gedegenereerde oligonucleotide primers ten behoeve van de PCR-amplificatie werd onder meer gebruik gemaakt van het reeds gepubliceerde codongebruik van Plasmodium falciparum (25). Op basis van de aminozuurvolgorde van peptide 1 (Tabel 1) werd zowel een 'sense'-primer als een 'antisense'-primer gesynthetiseerd; op basis van de aminozuursequentie van peptide 5 werd alleen een (gedegenereerde) antisense-primer gesynthetiseerd. Voor de sense- en antisense-primer van peptide 1 waren de nucleotide volgordes: 1. 5'-ATT TCA GAA TTA GGT TTA ATT GAA TAT GAA ATT GAA-3'

A AA A

(SEQ ID NO: 5) respectievelijk, 2. 5'-TTC AAT TTC ATA TTC AAT TAA ACC TAA TTC TGA AAT-3'

T TT T

(SEQ ID NO: 6)

De antisense-primer die van peptide 5 is afgeleid had de nucleotidevolgorde: 51-ATC TGG TAT TAT ATC TCC TGG TCT ATT TAA TCC TAC-3'

A A A AA

(SEQ ID NO: 7)

Na synthese werden de antisense primers op hun specificiteit getest middels hybridisatie met Northern blots van RNA-fracties die uit asexuele en sexuele stadia van de parasiet waren geïsoleerd (Figuur 1). Afgezien van het feit dat er specifieke hybridisatie-signalen werden verkregen, bevestigden deze experimenten dat de expressie van Pfs45/48 sexueel stadium-specifiek is en dat het Pfs45/48 gen middels twee mRNAs met lengtes van 2,3 kb en 2,8 kb tot expressie wordt gebracht (Figuur 1).

De antisense-probe die van peptide 1 was afgeleid, reageerde aanzienlijk sterker met de RNA blots dan de antisense-probe afgeleid van peptide 5. Naar achteraf bleek, was dit een gevolg van het feit dat de aminozuurvolgorde van peptide 5 niet geheel ondubbelzinnig bleek te zijn bepaald. Met name bleek uit de nucleotidesequentie analyses dat in het peptide het aminozuur arginine (Tabel 1) niet voorkomt (vide infra). Deze base-mismatch ten spijt resulteerde PCR-amplificatie van genomisch DNA met deze primer, en de sense-primer van peptide 1, toch in een 750 baseparen lang product. Sequentie-analyse van dit product resulteerde in een, de gehele sequentie overspannend, 'open-reading-frame' (ORF) waarin verrassend genoeg tevens nog de opgehelderde aminozuurvolgordes van drie andere peptiden (Tabel 1) voorkwamen.

Isolatie en Sequentie van Gen Pfs45/48

Het 750 bp lange PCR fragment werd gebruikt voor de screening van een gametocyten-specifieke cDNA bibliotheek. Hieruit werden 12 klonen opgepikt met inserts variërend in grootte van 1000 tot ca. 2500 bp. Na sequentie-analyse kon hieruit ondubbelzinnig een unieke nucleotidesequentie worden samengesteld met slechts één lang ORF van 1347 bp en coderend voor een eiwit met een lengte van 448 aminozuren en een molekuulmassa van 51,6 kDa (Figuur 2).

Zoals te verwachten viel, konden de aminozuurvolgordes van alle tryptische peptiden waar de sequentie van bepaald was in het ORF worden terugggevonden. Op basis van deze ondubbelzinnige resultaten lijkt de conclusie gerechtvaardigd dat de opgehelderde nucleotidesequentie voor het peptide deel van elk der twee eiwit-componenten van het Pfs45/48 doublet codeert.

Deze conclusie wordt verder nog ondersteund door het feit dat de afgeleide aminozuursequentie alle karakteristieken van een membraaneiwit vertoont, d.w.z. een hydrofobe signaalsequentie aan het N-terminale uiteinde en een sterk hydrofobe aminozuursequentie nabij het C-terminale uiteinde. Het feit dat de C-terminaal gelegen hydrofobe sequentie door geen andere sequentie wordt gevolgd is vermoedelijk een aanwijzing voor het feit dat, evenals vele andere membraan eiwitten van Plasmodium falciparum, de eiwitten Pfs45 en Pfs48 via een glycosyl-phosphatidylinositol anker aan het buitenoppervlak van de gametocyt/gameet worden verankerd (15).

Computer-ondersteunde sequentie analyses leerden verder dat in de aminozuursequentie van Pfs45/48 zeven potentiële N-glycosylerings plaatsen voorkomen (Figuur 2) . Al deze karakteristieken stemmen uitmuntend overeen met de reeds bekende biochemische en fysisch-chemische eigenschappen van Pfs45/48. Op basis van Southern-blot analyses en grootte-vergelijkingen van PCR-fragmenten die uit amplificaties van genomische DNAs en cDNAs waren verkregen, kon verder nog de conclusie worden getrokken dat de codongene sequentie van het Pfs45/48 gen geen introns bevat en dat er slechts één kopie van dit gen voorkomt in het Plasmodium falciparum genoom.

Expressie van (deelfragmenten) van Gen Pfs45/48 1. Expressie in Escherichia coli

Een PCR fragment, coderend voor de aminozuren 118 tot en met 218 van Pfs45/48 (Figuur 2) werd gerecombineerd met het 3'-uiteinde van het glutathion-S-transferase gen van de fusievector pGEX-3X en vervolgens in Escherichia coli tot expressie gebracht. Resultaat van dit construct was dat het peptide na inductie in grote hoeveelheden werd gesynthetiseerd waarvan het overgrote deel in de vorm van zogenaamde 'inclusion bodies' in de cel werd afgezet.

Na oogsten van de 'inclusion bodies' werd het eiwit gezuiverd middels SDS-polyacrylamide gel-electrophorese en vervolgens gebruikt voor het opwekken van Pfs45/48 specifieke antisera (Materialen en Methoden).

Daaropvolgend werden met de verkregen antisera immunologische analyses uitgevoerd op Western-blots die gemaakt waren van eiwitten die uit de asexuele (schizont, merozoiet) stadia en sexuele (gametocyten/gameten) stadia waren geïsoleerd. Uit de resultaten kon ondubbelzinnig geconcludeerd worden dat de antisera specifiek reageerden met de Pfs45/48 eiwitten in de sexuele stadia maar niet met de eiwitten die uit de asexuele bloed stadia waren geïsoleerd (Figuur 3).

Ook in een immunofluorescentie-assay bleken de antisera uitsluitend te reageren met antigenen die voorkomen op het oppervlak van de sexuele stadia. De antisera bezaten evenwel geen transmissie-blokkerende activiteit. Aangezien alle tot nog toe geïsoleerde transmissie-blokkerende monoclonale antilichamen van Pfs45/48 tegen conformatie-afhankelijke epitopen zijn gericht (1), werd met deze uitkomst sterk rekening gehouden. De specifieke herkenning van Pfs45 en Pfs48 door het peptide-antiserum bevestigt evenwel de eerder getrokken conclusie dat het gekarakteriseerde gen de codongene informatie voor het eiwit-doublet Pfs45/48 bevat.

2. Expressie van Gen Pfs45/48 in Insectecellen

Het feit dat alle gekarakteriseerde transmissie-blokkerende monoclonale antilichamen van Pfs45/48 conformatie-afhankelijke epitopen herkennen (1), suggereert dat voor het verkrijgen van een transmissieblokkerende immuunrespons een authentieke vouwing van het eiwit onontbeerlijk is. Om deze reden werden studies ondernomen om de gehele codongene sequentie van Pfs45/48 met behulp van recombinant baculovirus in insectecellen tot expressie te brengen.

Analyse van de expressie van het Pfs45/48 gen met behulp van immunofluorescentie assay's toonde aan dat de synthese van Pfs45/48 specifieke eiwitten zowel met het polyclonale antiserum (vide supra) als met het transmissie-blokkerend antilichaam 32F5 ondubbelzinnig kon worden aangetoond (Figuur 4). Alhoewel we, vanwege de nog lage expressie, er nog niet in geslaagd zijn om ook met Western blots de synthese van Pfs45/48 specifieke eiwitten aan te tonen, bewijzen deze studies desalniettemin dat de inductie van transmissie-blokkerende immuniteit door Pfs45/48 specifieke eiwitten die in een heteroloog eukaryotisch expressie systeem zijn gesynthetiseerd, een reële mogelijkheid is. De experimenten tonen derhalve aan dat het met heterologe eukaryotische expressie systemen mogelijk is om een transmissie-blokkerend vaccin te produceren.

Figuurbespreking

Figuur 1: Northern-blot analyses van asexueel, gametocyt en gameet RNA

Totaal RNA (10 μg per laan) van asexuele bloed-stadium parasieten (laan 1), gametocyten (laan 2), of gameten (laan 3) van isolaat NF54 van Plasmodium falciparum werd na electroforese geblot op een membraan van nitrocellulose. Voor de detectie van Pfs45/48 specifieke mRNAs werd het membraan geïncubeerd met een aan het 5’-uiteinde radioactief gemaakte PCR primer (specifieke aktiviteit 2 x 108 cpm/^g) en vervolgens gewassen zoals beschreven in Materialen en Methoden. Autoradiografie duurde 72 uur. De lengtes van de RNA markers (BRL) zijn in kilobaseparen (kb) opgegeven.

Figuur 2: Nucleotide-volgorde en afgeleide aminozuur-volgorde van gen Pfs45/48

De codongene sequentie (1347 nucleotiden) is met hoofdletters aangegeven. Getrokken lijnen: peptide sequenties welke met behulp van microsequentie analyse van gezuiverde tryptische peptiden van Pfs45 en Pfs48 zijn opgehelderd. Stippellijnen: onbepaalde of verkeerd toegewezen aminozuren na aminozuursequentie analyses.

Dubbel getrokken lijnen: tryptische peptide sequenties waarvan nucleotide sequenties van gedegenereerde PCR primers zijn afgeleid. Open cirkels: potentiële N-glycosyleringsplaatsen. Gebroken lijnen: hydrofobe aminozuur sequenties.

Figuur 3: Western-blot analyse van gametocyt-eiwitten

Eiwit-extracten van gametocyten (5 x 106 gametocyt-equivalenten per laan) werden geëlectroforeerd door een SDS-polyacrylamide gel en daarna geblot op nitrocellulose. Vervolgens werden de respectievelijke lanen geïncubeerd met: (a) konijne pre-immuun serum (laan 1); (b) immuunserum opgewekt tegen het recombinante fusie eiwit (laan 2); en (c) monoclonaal antilichaam 32F3 (laan 3) .

Na een tweede incubatie met een, met alkalische fosfatase geconjugeerd geit-anti-konijn resp. konijn-anti-muis antilichaam werden de immuuncomplexen zichtbaar gemaakt zoals in Materialen en Methoden is beschreven. De molecuulmassa's van de marker eiwitten zijn in kDa opgegeven.

Figuur 4: Immunofluorescentie analyse (IFA) van met recombinant baculovirus geïnfecteerde insectecellen

Sf9 cellen werden op dekglaasjes gekweekt en geïnfecteerd met recombinant baculovirus. Drie dagen na infectie werden de cellen gefixeerd en geïncubeerd met respectievelijk: (A) antilichamen die tegen het recombinante fusie-eiwit waren opgewekt; (B) het monoclonale antilichaam 32F5.

Na een tweede incubatie met een met FITC gelabeld geit-anti-koni jn resp. konijn-anti-muis antilichaam werden de cellen onder een fluorescentie microscoop bekeken.

Tabel 1: Aminozuursequenties van tryptische peptiden van eiwit Pfs45/48 van Plasmodium falciparum

1: V E T D ISELGLIEYEIE P W C

(SEQ ID NO: 8)

2: V Y T (I) Y E N ? (V) E T (D) I S E L

S

(SEQ ID NO: 9)

3:V Y T D Y E N R

(SEQ ID NO: 10)

4:A P F Y V T S K

(SEQ ID NO: 11)

5: Y N H L V G L N (R) P G D I IPD

(SEQ ID NO: 12) 6: T I T I (S P F S P) (SEQ ID NO: 13)

7: N L T I F K

(SEQ ID NO: 14)

Van de tussen haakjes geplaatste residuen is de identiteit niet ondubbelzinnig vastgesteld. Hetzelfde geldt voor de plaatsen waar meerdere aminozuren op één positie zijn opgegeven.

REFERENTIES

1. Carter, R., Graves, P.M., Keister, D.B. & Quakyi, I.A.: Parasite Immunol. 12, 587-603 (1990).

2. Casanova, J.L., Pannetier, C., Jaulin, C. & Kourilsky, P.: Nucl. Acids Res. 18, 4028 (1990).

3. DelSal , G., Manfioletti , G. and Schneider, C.: Nucl. Acids Res. 16, 9878 (1988).

4. Doucet, J.P. & Trifaro, J.M.: Anal. Biochem. 168, 265-271 (1988).

5. Foo, A., Carter, R., Lambros, C., Graves, P., Quakyi, I.,

Targett, G.A.T., Ponnudurai, T. and Lewis, G.E.: Am. J. Trp. Hyg.

44, 623-631 (1991).

6. Graves, P.M., Carter, R., Burkot, T.R., Quakyi, I.A. & Kumar, N. K.: Parasite Immunol. 10, 209-218 (1988).

7. Graves, P.M., Bhatia, K., Burkot, T.R., Prasad, M., Wirtz, R.A. & Beckers, P.: Clin. Exp. Immunol. 78, 418-423 (1989).

8. Graves, P.M., Doubrovsky, A., Carter, R., Eida, S. & Beckers, P.: Am. J. Trop. Med. Hyg. 42, 515-520 (1990).

9. Graves, P.M., Doubrovsky, A. & Beckers, P.: Parasite Immunol. 13, 291-299 (1991).

10. Graves, P.M., Doubrovsky, A., Sattabongkot, J. & Battistutta, D.: Am. J. Trop. Med. Hyg. 46, 711-719 (1992).

11. Harlow, E. & Lane, D.: Antibodies. A Laboratory Manual, (CSH,

New York, 1988) .

12. Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. & Miller, L.H.: Nature 333, 74-76 (1988) .

13. Kumar, N. & Carter, R.: Mol. Biochem. Parasitol. 13, 333-342 (1984).

14. Kumar, N. and Wizel, B.: Mol. Biochem. Parasitol. 53, 113-120 (1992).

15. Low, M.G. and Saltiel, A.R.: Science 239, 268-275 (1988).

16. Minotti, A.M., Loeb, L.M., Cook, R., Boggs, B.A. & Cabral, F.: Anal. Biochem. 184, 28-34 (1990).

17. Ong, C.S.L., Zhang, K.Y., Eida, S.J., Graves, P.M., Dow, C., Looker, M., Rogers, N.C., Chiodini, P.L. & Targett, G.A.T.: Parasite Immunol. 121, 447-456 (1990).

18 .Plaxton, W.C. & Moorhead, G.B.C.: Anal. Biochem. 178, 391-393 (1989) .

19. Ponnudurai, T., Lensen, A.H.W. & Meuwissen, J.H.E.Th.:

Parasitol. 87, 439-445 (1983).

20. Prussak, C.E., Almazan, M.T. & Tseng, B.Y.: Anal. Biochem. 178, 233-238 (1989).

21. Rave, N., Crkvenjakov, R. & Boedtker, H.: Nucl. Acids Res. 6, 3559-3567 (1979) .

22. Rener, J., Graves, P.M., Carter, R., Williams, J.L, & Burkot, T.R.: J. Exp. Med. 158, 976-981 (1983).

23. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T.: Molecular Cloning, 2nd ed. (CSH, New York, 1989) .

24. Sanger F., Nicklen, S. & Coulsen, R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5468 (1977) .

25. Saul, A. & Battistutta, D.: Mol. Biochem. Parasitol. 27, 35-42 (1988).

26. Smith, D.B. & Johnson, K.S.: Gene 67, 31-40 (1988).

27. Summers, M.D. & Smith, G.E.: Texas Agricult. Exp. Stat. Bullet. 155 (1987).

28. Vermeulen, A.N., Ponnudurai, T., Beckers, P.J.A., Verhave, J.P., Smits, M.A. & Meuwissen, J.H.E.Th.: J. Exp. Med. 162, 1460-1476 (1985).

29. Vermeulen, A.N., van Deursen, J., Brakenhoff, R.H., Lensen, A.H.W., Ponnudurai, T. & Meuwissen, J.H.E.Th.: Mol. Biochem. Parasitol. 20, 155-163 (1986).

30. Vialard, J., Lalumiere, M., Vernet, T., Briedis, D., Alkhatib, G., Henning, D., Levin, D. and Richardson, C.: J. Virol. 64, 37-50 (1990) .

SEQUENTIE LIJST SEQ ID NO: 1 SEQUENCE TYPE: nucleotide with corresponding protein SEQUENCE LENGTH: 1593 base pairs and 448 amino acids STRANDEDNESS: single acat atatatatat atatatatat atatataatt atacataatt tattttcttt acatattcac ttaaaatttt ttaaaatttt tacaattttt tcttttatac MET Met Leu Tyr lie Ser Ala Lys Lys Ala Gin Val Ala Phe lie Leu 15 10 15 ATG ATG TTA TAT ATT TCT GCG AAA AAG GCT CAA GTT GCT TTT ATC TTA 48

Tyr lie Val Leu Val Leu Arg lie lie Ser Gly Asn Asn Asp Phe Cys 20 25 30 TAT ATA GTA TTA GTA TTA AGA ATA ATA AGT GGA AAC AAT GAT TTT TGT 96

Lys Pro Ser Ser Leu Asn Ser Glu lie Ser Gly Phe lie Gly Tyr Lys 35 40 45 AAG CCT AGC TCT TTG AAT AGT GAA ATA TCT GGA TTC ATA GGA TAT AAG 144

Cys Asn Phe Ser Asn Glu Gly Val His Asn Leu Lys Pro Asp Met Arg 50 55 60 TGT AAT TTT TCA AAT GAA GGT GTT CAT AAT TTA AAG CCA GAT ATG CGT 192

Glu Arg Arg Ser lie Phe Cys Thr lie His Ser Tyr Phe lie Tyr Asp 65 70 75 80 GAA CGT AGG TCT ATT TTT TGC ACC ATC CAT TCG TAT TTT ATA TAT GAT 240

Lys lie Arg Leu lie lie Pro Lys Lys Ser Ser Ser Pro Glu Phe Lys 85 90 95 AAG ATA AGA TTA ATA ATA CCT AAA AAA AGT TCG TCT CCT GAG TTT AAA 288 lie Leu Pro Glu Lys Cys Phe Gin Lys Val Tyr Thr Asp Tyr Glu Asn 100 105 110 ATA TTA CCA GAA AAA TGT TTT CAA AAA GTA TAT ACT GAT TAT GAG AAT 336

Arg Val Glu Thr Asp lie Ser Glu Leu Gly Leu lie Glu Tyr Glu lie 115 120 125 AGA GTT GAA ACT GAT ATA TCG GAA TTA GGT TTA ATT GAA TAT GAA ATA 384

Glu Glu Asn Asp Thr Asn Pro Asn Tyr Asn Glu Arg Thr lie Thr lie 130 135 140 GAA GAA AAT GAT ACA AAC CCT AAT TAT AAT GAA AGG ACA ATA ACT ATA 432

Ser Pro Phe Ser Pro Lys Asp He Glu Phe Phe Cys Phe Cys Asp Asn 145 150 155 160 TCT CCA TTT AGT CCA AAA GAC ATT GAA TTT TTT TGT TTT TGT GAT AAT 480

Thr Glu Lys Val lie Ser Ser He Glu Gly Arg Ser Ala Met Val His 165 170 175 ACT GAA AAG GTT ATA TCA AGT ATA GAA GGG AGA AGT GCT ATG GTA CAT 528

Val Arg Val Leu Lys Tyr Pro His Asn He Leu Phe Thr Asn Leu Thr 180 185 190 GTA CGT GTA TTA AAA TAT CCA CAT AAT ATT TTA TTT ACT AAT TTA ACA 576

Asn Asp Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Asn Glu Ser Asn Phe 195 200 205 AAT GAT CTT TTT ACA TAT TTG CCG AAA ACA TAT AAT GAA TCT AAT TTT 624

Val Ser Asn Val Leu Glu Val Glu Leu Asn Asp Gly Glu Leu Phe Val 210 215 220 GTA AGT AAT GTA TTA GAA GTA GAA TTG AAT GAT GGA GAA TTA TTT GTT 672

Leu Ala Cys Glu Leu He Asn Lys Lys Cys Phe Gin Glu Gly Lys Glu 225 230 235 240 TTA GCT TGT GAA CTA ATT AAT AAA AAA TGT TTT CAA GAA GGA AAA GAA 720

Lys Ala Leu Tyr Lys Ser Asn Lys lie lie Tyr His Lys Asn Leu Thr 245 250 255 AAA GCC TTA TAT AAA AGT AAT AAA ATA ATT TAT CAT AAA AAC TTA ACT 7 68 lie Phe Lys Ala Pro Phe Tyr Val Thr Ser Lys Asp Val Asn Thr Glu 260 265 270 ATC TTT AAA GCT CCA TTT TAT GTT ACA TCA AAA GAT GTT AAT ACA GAA 816

Cys Thr Cys Lys Phe Lys Asn Asn Asn Tyr Lys lie Val Leu Lys Pro 275 280 285 TGT ACA TGC AAA TTT AAA AAT AAT AAT TAT AAA ATA GTT TTA AAA CCA 864

Lys Tyr Glu Lys Lys Val lie His Gly Cys Asn Phe Ser Ser Asn Val 290 295 300 AAA TAT GAA AAA AAA GTC ATA CAC GGA TGT AAC TTC TCT TCA AAT GTT 912

Ser Ser Lys His Thr Phe Thr Asp Ser Leu Asp lie Ser Leu Val Asp 305 310 315 320 AGT TCT AAA CAT ACT TTT ACA GAT AGT TTA GAT ATT TCT TTA GTT GAT 960

Asp Ser Ala His lie Ser Cys Asn Val His Leu Ser Glu Pro Lys Tyr 325 330 335 GAT AGT GCA CAT ATT TCA TGT AAC GTA CAT TTG TCT GAA CCA AAA TAT 1008

Asn His Leu Val Gly Leu Asn Cys Pro Gly Asp lie lie Pro Asp Cys 340 345 350 AAT CAT TTG GTA GGT TTA AAT TGT CCT GGT GAT ATT ATA CCA GAT TGC 1056

Phe Phe Gin Val Tyr Gin Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Ser Asn 355 360 365 TTT TTT CAA GTA TAT CAA CCT GAA TCA GAA GAA CTT GAA CCA TCC AAC 1104 lie Val Tyr Leu Asp Ser Gin lie Asn lie Gly Asp lie Glu Tyr Tyr 370 375 380 ATT GTT TAT TTA GAT TCA CAA ATA AAT ATA GGA GAT ATT GAA TAT TAT 1152

Glu Asp Ala Glu Gly Asp Asp Lys lie Lys Leu Phe Gly lie Val Gly 385 390 395 400 GAA GAT GCT GAA GGA GAT GAT AAA ATT AAA TTA TTT GGT ATA GTT GGA 1200

Ser lie Pro Lys Thr Thr Ser Phe Thr Cys lie Cys Lys Lys Asp Lys 405 410 415 AGT ATA CCA AAA ACG ACA TCT TTT ACT TGT ATA TGT AAG AAG GAT AAA 1248

Lys Ser Ala Tyr Met Thr Val Thr lie Asp Ser Ala Tyr Tyr Gly Phe 420 425 430 AAA AGT GCT TAT ATG ACA GTT ACT ATA GAT TCA GCA TAT TAT GGA TTT 1296

Leu Ala Lys Thr Phe lie Phe Leu lie Val Ala lie Leu Leu Tyr lie 435 440 445 TTG GCT AAA ACA TTT ATA TTC CTA ATT GTA GCA ATA TTA TTA TAT ATT 1344 TAGctcatga tatgttatta aaaataaatt aaagttaaaa ttaaaattaa aattaaaaga aatgaataca caaattatta aagattcaag attatttata atgtatatta attatacttt tatggtatat atatetatat atata SEQ ID NO: 2 SEQUENCE TYPE: nucleotide SEQUENCE LENGTH: 27 nucleotides STRANDEDNESS: single GCTAGCATGA TGTTATATAT TTCTGCG 27 SEQ ID NO: 3 SEQUENCE TYPE: nucleotide SEQUENCE LENGTH: 32 nucleotides STRANDEDNESS: single GCTAGCATGA GCTAAATATA TAATAATATT GC 32 SEQ ID NO: 4 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 24 amino acids STRANDEDNESS: single

Val Tyr Thr Asp Tyr Glu Asn Arg Val Glu Thr Asp lie Ser Glu Leu 15 10 15

Gly Leu lie Glu Tyr Glu lie Glu 20 SEQ ID NO: 5 SEQUENCE TYPE: nucleotide SEQUENCE LENGTH: 36 nucleotides STRANDEDNESS: single ATTTCAGAAT TAGGTTTAAT TGAATATGAA ATTGAA 36

A A A A

SEQ ID NO: 6 SEQUENCE TYPE: nucleotide SEQUENCE LENGTH: 36 nucleotides STRANDEDNESS: single TTCAATTTCA TATTCAATTA AACCTAATTC TGAAAT-31 36

T T T T

SEQ ID NO: 7 SEQUENCE TYPE: nucleotide SEQUENCE LENGTH: 36 nucleotides STRANDEDNESS: single ATCTGGTATT ATATCTCCTG GTCTATTTAA TCCTAC-3' 36

AAA A A

SEQ ID NO: 8 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 16 amino acids STRANDEDNESS: single

Val Glu Thr Asp lie Ser Glu Leu Gly Leu lie Glu Tyr Glu lie Glu Pro Trp

Cys 15 10 15 SEQ ID NO: 9 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 16 amino acids STRANDEDNESS: single

Val Tyr Thr lie Tyr Glu Asn Xaa Val Glu Thr Asp lie Ser Glu Leu Ser 15 10 15 SEQ ID NO: 10 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 8 amino acids STRANDEDNESS: single

Val Tyr Thr Asp Tyr Glu Asn Arg 1 5 SEQ ID NO: 11 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 8 amino acids STRANDEDNESS: single

Ala Pro Phe Tyr Val Thr Ser Lys 1 5 SEQ ID NO: 12 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 16 amino acids STRANDEDNESS: single

Tyr Asn His Leu Val Gly Leu Asn Arg Pro Gly Asp lie lie Pro Asp 15 10 15 SEQ ID NO: 13 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 9 amino acids STRANDEDNESS: single

Thr lie Thr lie Ser Pro Phe Ser Pro 1 5 SEQ ID NO: 14 SEQUENCE TYPE: amino acid SEQUENCE LENGTH: 6 amino acids STRANDEDNESS: single

Asn Leu Thr lie Phe Lys 1 5

Claims (13)

1. Een recombinant nucleïnezuur molecuul, omvattende een nucleotidesequentie gekozen uit (a) nucleotidesequenties die coderen voor de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, (b) nucleotidesequenties die hybridiseren met een aan een nucleotidesequentie volgens (a) complementaire nucleotidesequentie en coderen voor een polypeptide of eiwit dat herkend wordt door een antilichaam dat aan een Plasmodium eiwit kan binden, en (c) fragmenten van een nucleotidesequentie volgens (a) of (b) met een lengte van ten minste 7 nucleotiden.

2. Een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens conclusie 1, omvattende de in figuur 2 getoonde codongene nucleotidesequentie, een daarvan binnen de grenzen van de degeneratie van de genetische code afwijkende nucleotidesequentie coderend voor de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, een nucleotidesequentie die hybridiseert met ten minste een van de aan deze nucleotidesequenties complementaire nucleotidesequenties en codeert voor een aan Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 verwant polypeptide of eiwit, of een fragment van een van deze nucleotidesequenties met een lengte van ten minste 8 nucleotiden .

3. Een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens conclusie 1 of 2, dat codeert voor een polypeptide of eiwit dat herkend wordt door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam met transmissie-blokkerende eigenschappen.

4. Een polypeptide materiaal, omvattende een aminozuursequentie waarvoor gecodeerd wordt door een nucleotidesequentie zoals in conclusie 1 of 2 is gedefinieerd.

5. Een polypeptide materiaal volgens conclusie 4, gekozen uit (a) Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48 met de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie, (b) een polypeptide met de in figuur 2 getoonde aminozuursequentie van Plasmodium falciparum eiwit Pfs45/48, (c) een fragment van een polypeptide volgens (b) met een lengte van ten minste 7 aminozuren.

6. Een polypeptide materiaal volgens conclusie 4 of 5, dat herkend wordt door een antilichaam dat aan een Plasmodium eiwit kan binden.

7. Een polypeptide materiaal volgens conclusie 6, dat herkend wordt door een aan een Plasmodium eiwit bindend antilichaam met transmissie-blokkerende eigenschappen.

8. Een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het kweken van een gastheercel die het polypeptide materiaal produceert en het winnen van het geproduceerde polypeptide materiaal, waarbij een gastheercel wordt gebruikt die het vermogen om het polypeptide materiaal te synthetiseren heeft verworven als gevolg van genetische manipulatie met behulp van een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens een van de conclusies 1-3.

9. Een werkwijze volgens conclusie 8, waarbij een eukaryotische cel als gastheercel wordt toegepast.

10. Een werkwijze volgens conclusie 9, waarbij een insektecel of zoogdiercel als gastheercel wordt toegepast.

11. Een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het kweken van een transgeen plantaardig of dierlijk organisme dat het polypeptide materiaal produceert en het winnen van het geproduceerde polypeptide materiaal, waarbij een transgeen organisme wordt gebruikt dat het vermogen om het polypeptide materiaal te synthetiseren heeft verworven als gevolg van genetische manipulatie met behulp van een recombinant nucleïnezuur molecuul volgens een van de conclusies 1-3.

12. Een werkwijze voor het bereiden van een polypeptide materiaal, omvattende het uitvoeren van zodanige peptide-synthese stappen dat een polypeptide materiaal volgens een van de conclusies 4-7 wordt verkregen.

13. Een transmissie-blokkerend vaccin ter bestrijding van de malariaparasiet Plasmodium falcioarum, omvattende een polypeptide materiaal volgens conclusie 7 en een geschikte drager of adjuvans.