JP2005312458A - ウイルスのヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

【課題】各種のヘルペスウイルス：七面鳥ウイルス（ＨＶＴ）、マーク病ウイルス（ＭＤＶ）および感染性気管支炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の遺伝子の非必須的領域（および外来遺伝の子挿入候補部位として）および（または）抗原遺伝子暗号領域（抗原コード領域）を同定した。
【解決手段】前者にはＨＳＶ（ヘルペス単純ウイルス）のｇＣ遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子、ＭＤＶまたはＨＶＴのＴＫ（チミジンキナーゼ）領域、ＩＬＴＶのＯＲＦ３、ＩＬＴＶ、ＭＤＶまたはＨＶＴのリボヌクレオシド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、ＭＤＶのリボヌクレオシド還元酵素（小サブユニット）遺伝子が含まれる。抗原コード領域にはＨＳＶのｇＢ、ｇＣおよびｇＨ遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子、ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＩＬＴＶ相同遺伝子、ＩＬＴＶのＯＲＦ２そしてＨＳＶ−１の即時型初期遺伝子ＩＥ−１７５およびＩＥ−６８のＨＶＴ相同遺伝子が含まれる。
【選択図】 図１

Description

本発明はウイルスのヌクレオチド配列に関するものであり、特に、病気に対する免疫性を付与するワクチンを作るためのウイルスのヌクレオチド配列に関するものである。

ヘルペスウイルスは大きな二重鎖ＤＮＡウイルスで、エンベロープによって囲まれた２０面体カプシドからなる。このウイルスは生物学的特性とゲノム構造とにもとづいてアルファ、ベータおよびガンマヘルペスウイルスに分類される[Roizman,B et al.(1981)Inter-virology18,201-217]。
トリヘルペスウイルスには鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレック病を引き起こすマレック病ウイルス（ＭＤＶ）（ガンマヘルペスウイルス）［総説： Payne,L.N.(ed)Marek's Disease(1985),Martinus Nijhoff Publishing,Boston]と、鶏の呼吸器系上部に感染して致死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）（アルファウイルス）とが含まれる。

最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護された遺伝子を同定することを可能とするような、ＭＤＶ、ＩＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水痘性口内炎ウイルス（ＶＺＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）との間における顕著なアミノ酸配列の相同性（ホモロジー）が発見された。これらには、ＨＳＶの糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶおよび七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配列、ＴＫおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢおよびＶＺＶの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶのアミノ酸配列も含まれる[Backmaster,A et al.(1988)J.gen.Virol,89,2033-2042]。
ＭＤＶの株は３つの血清型に分類されている。１型は病原性の株とその弱毒株、２型は天然の非病原性株、そして３型はＨＶＴが含まれる。１０年以上前から、ＨＶＴによる種痘がマレック病に対して顕著な有効性を示すことが知られている。

しかし最近になって、ＨＶＴによる種痘に対して抵抗性を示すＭＤＶが単離されている。このようなウイルス毒性が非常に高いＭＤＶによる鶏の損失は、米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生している。しかし、ＨＶＴ、２型ＭＤＶおよびＭＤＶ高ウイルス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いることによって、そのような損失を確実ではないが減少させることが可能である。
このような知見、すなわちＨＶＴまたは２型ＭＤＶによって共有されないＭＤＶ型特異的エピトープが存在するということは、われわれに抗原的には従来のワクチンよりもＭＤＶに関係した改良型ワクチンを作ることが可能であることを結論させた。［総説： Ross and Biggs in Goldman J.M.and Epstein M.A. (eds)Leukaemia and Lymphoma Research, Vaccine Intervention against Virus-Induced Tumour,p13-31,Macmillan,1986］

いくつかのヘルペスウイルス抗原は、組換えワクシニアウイルス内で発現されたときに保護免疫を与えることが示される。これらには、ＨＳＶのｇＢ［CantinE.M.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,5908-5912］、ＨＳＶのｇＤ［Paoletti,E.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,193-197］および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）のｇＰ５０、ＨＳＶのｇＤの相同タンパク質（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）［Marchioli,C.C.et al.(1987)J.Virol.61.3977-3981］が含まれる。なぜなら、ウイルスの貫通および感染力にｇＢが必須であること、またヘルペスウイルス間で保存されているｇＢとその相同タンパク質は重要な免疫源であるからである。
さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在することは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答にとって重要な標的となる［Blacklaws,B.A.et al. J.gen.Virol. 68, 1103-1114 (1987);McLaughlin-Taylor,E.et al. (1988) J.gen. Virol. 69,1731-1734］。
最近になって報告されたＨＳＶの糖タンパク質ｇＨもまた感染力にとって必須なものであり、また重要な免疫源でもある［Desal,P.J.etal.(1988) J.gen. Virol.69, 1147-1156］。また、ｇＣの相同タンパク質であるＰＲＶのｇＩＩＩも中和抗体の主標的および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重要であるが、かならずしも必須のタンパク質ではないことが知られている。しかし興味深いことは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞介在細胞毒性反応における即時型初期タンパク質の期待はずれな出現である［Kozinowski U.H.et al.(1987)J.Virol.61.2054-2058］。同様な抗原は、マレック病における潜伏感染リンパ球および形質転換リンパ球の排除において重要な役割を担うことができよう。なぜなら、マレック病の腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系において即時型初期ＲＮＡ転写産物が検出されるからである。

また、ボックスウイルスワクシニアをベクターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よって、肝炎抗原はＨＳＶで発現されている［Shih,M.F.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81, 5867-5870］。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子はＰＲＶで発現されている［Thomsen,D.R.et al.(1987)Gene 57,261-265］。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝子組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。
肝炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに融合され、また組換えＤＮＡはＨＳＶのＴＫ遺伝子に挿入される。組換えＤＮＡと野生型ＨＳＶＤＮＡとの同時トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによって肝炎抗原を発現するＴＫ−ウイルスが得られる。
ＰＲＶの場合、ＵｓにマッピングされたｇＸ遺伝子を外来遺伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略は、ＨＳＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失ＰＲＶ突然変異体（ＴＫ陽性ウイルス）に挿入することを含むものである。そして、プラズミノーゲン活性因子はＨＳＶのＴＫ遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同遺伝子組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−ウイルスを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する［前掲、Thomsen et al.］。

同様に、ＶＺＶをベクターとして使用する［Lowe et al. (1987) Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A. 84,3896-3900］。いくつかのヘルペスウイルス遺伝子も毒力（virulence）に関連しており、またインビトロの系における増殖に必須のものでないことが知られている。これらにはＨＳＶのＴＫ遺伝子［Jamieson,A.T.et al. (1974) J.Gen Virol. 24, 465-480;Field,H. and Wildy,P.,(1987) J.Hygiene(Cambridge) 81,267-277］およびＰＲＶのＴＫ遺伝子が含まれる。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失によって容易に減少される［Tatarov,G. (1968) Zentralbl.Vet.Met.Med 15B,848-853］。さらに、ＰＲＶのバルサ（Ｂａｒｔｈａ）株の減少はＵｓにマッピングされた非必須的糖タンパク質ｇ１の欠失にもとづく［Mettenleiter,T.et al.(1987)J.Virol.61,4030-4032］。
長い非反復配列の側面を守る間在繰り返し領域（ＴＲＳ）に存在するＨＳＶマッピングの遺伝子は、病原性に関係している［Rosen,A.et al.(1986) Virus Research 5, 157-175; Thompson,R.L.e al.(1983)Virology 131,180-192］。

ＨＳＶのいくつかの付加的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須であるが、毒力に関係していると報告されている。これらには、ＵＬ２４（Sanders,P.G.,(1982), J.gen.Virol.63,277-295）、リボ核酸還元酵素の大サブユニット（Godstein D.J.and Weller, S.K.(1988) J.Virol.62,196-205）、ｇＣ（Draper K.G.et.al.(1984) J.Virol.51,578-585）、ｄＵＴＰアーゼ（Fisher,F.B.and Preston,V.G.(1986) Virology 148,190-197）、そしてＵＬ５５およびＵＬ５６（MacLean,A.R.and Brown,S.M.(1987) J.gen.Virol.68,1339-1350）が含まれる。さらに、ＵｓにおけるＨＳＶマッピングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系における増殖に非必須である［Weber,P.C.et al.(1987) Science 236,576-579］。

本発明は、野生型ウイルスにおいて前記ヌクレオチド配列に結合して存在する他の配列を実質的に含まないヌクレオチド配列を提供する。

本発明のヌクレオチド配列は下記の群の中から選択されるる配列およびそのマイナーな変異で生じるマイナー変異配列にある：
（ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＭＶＴ相同遺伝子、
（ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子、
（ｃ）ＭＳＶのｇＨ遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子、
（ｄ）ＩＬＴＶのＴＫ遺伝子、
（ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＩＬＴＶ相同遺伝子、
（ｆ）ＩＬＴＶのＯＲＦ２、
（ｇ）ＩＬＴＶのＯＲＦ３、
（ｈ）ＩＬＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、
（ｉ）ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、
（ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、
（ｌ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ１７５のＨＶＴ相同遺伝子、
（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ６８のＨＶＴ相同遺伝子。

前記（ａ）から（ｍ）に記載されたそれぞれの配列は、それぞれの配列を発現させるのに必要な停止および開始シグナルおよびプロモーターを含む他の５'および３'非遺伝暗号配列（ノンコーデイング配列）と結合したものであろう。そのような付加された配列はいわゆる自然発生的なものか、あるいは非対応ものであろう。
特に、プロモーターは前記（１）および（ｍ）のひとつと結合しているであろう。

前記した「マイナー変異配列」という言葉の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌクレオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチドのマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コード）するためにベクターに挿入される配列の場合、配列にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タンパク質をコードしていることを意味する。その抗原の持つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現されるような配列内における保守的変化（conservative changes）はこのようなマイナー変異に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分のみが使用される。そのような部分とは、例えば、ＨＶＴのｇＨ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の２７３−３２０または８６７−９２６およびそれらのマイナー変異に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれらの配列およびこれらの配列によりコードされるペプチドによってなされる。

挿入部位に相当する配列の場合、ウイウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的なものではなく、また組換えを可能とするような配列と相同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させるものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合では、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ずることを意味する（フレームシフトがどこに生ずるかに依存する）が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほとんど同じであるので、組換えが容易に行えるであろう。
挿入部位においてヌクレオチドの相同性が７５％存在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされるが、少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の相同性があることが好ましい。このような相同性（homology）の度合いは上記の配列（ａ）ないし（ｆ）および（ｘ）のそれぞれの全体に実質的に関係している。短い配列は、このような長い配列を単離または同定するためのプローブとして用いられるが、この場合は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高い相同性が必要とされる。

よって、本発明はさらに上記配列（ａ）ないし（ｍ）のいずれかの少なくとも一部分に対して９０％（好ましくは９５％、９９％または１００％）の相同性を有する少なくとも１３のヌクレオチド副配列を提供するものである。
上記したように、配列（ａ）ないし（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）は抗原発現配列として好適であり、またＭＤＶのＴＫ領域配列は抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として好適である。よって、配列（ｂ）は両方の機能に好適である。
これらの配列は、ここで開示された配列情報と、例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型のＤＮＡとそのプローブとのハイブリダイゼーションとを含む標準的技術を用いることによって自然発生的な（naturally-occurring）のＩＬＴＶ、ＨＶＴおよびＭＤＶウイルスから容易に単離可能である。

抗原ＩＬＴＶおよびＨＶＴ配列、すなわち配列（ａ）から（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）は、適当な宿主、特にＨＶＴまたはＭＤＶ内において現される。ひとつのＩＬＴＶ配列の挿入のための好適な非必須部位はＨＳＶのｇＣ遺伝子のＭＳＶ相同遺伝子、ＨＶＴまたはＭＤＶのＴＫ遺伝子、ＨＶＴまたはＭＤＶリホヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、およびＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サブユニット）遺伝子を含む。
第二に本発明は、ＭＤＶ、ＨＶＴおよびＩＬＴＶの挿入または欠失突然変異を提供するものである。すなわち、
（ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはＴＫ遺伝子のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
（ｉｉ）ＭＤＶの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニット）の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異であり、
（ｉｉｉ）ＩＬＴＶの場合、ＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異である。
これらの突然変異は同定された領域の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると考えられる。

ＨＶＴ、ＭＤ Ｖ、およびＩＬＴＶのそれぞれの突然変異体は、鳥禽（ベクターが複製される）類のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列からなるベクターと同様に、非対応抗原コード配列（hetdlogous antigen-encoding sequences）のためのウイルスベクターとして利用できるであろう。このような配列として、もちろんこれらに限定されるものではないが、（ａ）ないし（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）が含まれる。
非対応（heterologous）という言葉は、ここではウイルスゲノムに関係した場所に見出されていない抗原発現配列（antigen-expressing gene）を意味している。すなわち、抗原発現遺伝子はＩＬＴＶの病原性株から単離可能で、これよりも病原性の低い株のＴＫ領域に挿入れると考えれる。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起こらない場合、非対応と見なされる。

また非対応配列は、鳥脳脊髄炎（流行性振せん）、鳥インフルエンザ（鳥禽ペスト）、鳥白血病、ニューキャッスル病（ＰＭＶ２ないしＰＭＶ７）以外の鳥パラマイキソバイラス（avian paramyxoiruses）、鳥レオウイルス病（腸の病気、腱しょう炎）、ニワトリ貧血（ニワトリ貧血剤によって起こる）、胞子虫症、エッグドロップ症候群（ＥＤＳ７６）、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、感染性粘液嚢症（グンボロ（Ｇｕｍｂｏｒｏ））、封入体肝炎（アデノウイルス）、七面鳥リンパ増殖性疾患（lymphoproliferative disease）、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス腸炎、七面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎（rhinotracheitis）のいずれか一つの疾患に関係した抗原をコードするものである。
よって、本発明にもとづくベクターは多価ワクチンによる保護を可能とする。例えば、ＭＤＶ抗原の遺伝暗号配列（コード配列）を持つＩＬＴＶを含むワクチは、ＩＴＬおよびマーク病からワクチンを接種された生物を保護する。
さらに、突然変異ＩＬＴＶウイルスそれ自体は、弱毒化されたウイルスとしてワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿入された非対応配列を持つ必要性はない。

本発明にもとづく欠失または挿入突然変異体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばＴＫ領域の同時トランスフェクション（co-transfection）、欠失または挿入変異されたものと全ウイルスＤＮＡまたは全ウイルス（例えば野生型（wild type）のウイルス）を導入することである。そのようなウイルスのむき出しとなったＤＮＡが感染性を有することはすでに知られており、切断しないで調製した。リン酸カルシウムによる沈澱によってＤＮＡを調製するのが好ましい。この方法に用いられる適当な細胞とは、ニワトリ胚繊維芽細胞（embryo fibroblast）、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団として播種されることによって好適に増殖する。相同遺伝子組換えによって形質転換ＤＮＡと全ウイルスＤＮＡとを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって行なわれる。
相同遺伝子組換えが行なわれるためには、ウイルスＤＮＡは複製されなければならない。現在のところＮＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶのための細胞フリーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものではない。

免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコードすることに関与したＩＬＴＶおよびＨＶＴ領域は、適当なベクター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウイルス、細菌また菌類などのような他のベクター）に挿入される。ウイルスベクターの場合（特にヘルペスウイルスベクターおよび腸炎ウイルスベクター）、抗原をコードしている配列（適当な配列（フランキング配列）が両端にある）と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクターゲノムとの間にそのような挿入がなされる。
宿主にとって内在（endogenous）的なものであるプロモーターは、非対応（ウイルス抗原をコードする）配列の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法またはこれから発見されるであろう方法によって挿入されよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主として用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによって運ばれる。
フランキング配列は、非対応配列が挿入される少なからずすべての領域が含まれる。もし、すべての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質転換されたベクターに残るであろう。しかし、そのような領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全部ではなく一部をフランキング配列として用いた場合、機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。
よって、ＩＴＬＶの欠失または挿入突然変異のそのような構成は、ワクチンの改良につながる。一方、ＨＶＴ、鳥類伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組み込まれたＩＬＴＶの糖タンパク質（glycoproteins）または他のＩＬＴＶタンパク質の発現は、効果的なワクチンの製造を可能とする。

ウイルスまたはベクターとしてＨＶＴ、ＭＤＶまたはＩＬＴＶを含むワクチンを合成するするために、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細胞内で増殖させる。この場合に用いる焙地は１９９培地（ウエルカムまたはフローラボラトリーズ）のような標準的な培養液を使用し、この培養液で３７℃、３ないし４日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシドと４％牛血清を含む培養液に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、そのアンプルを液体窒素保存する。
通常、予防接種（ワクチン投与）は生後１日経過したニワトリのひよこに対しておこなわれ、約１，０００プラーク形成単位を筋肉注射することによってワクチン投与が実施される。この後、数日で免疫ができる。
本発明にもとづくワクチンは、ＭＤＶに感染しやすい鳥（ｆｏｗｌ）、例えば商業的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家禽類を保護するために用いられるものである。
以下、本発明の好適な実施態様を添付した図を参照しながら実施例にもとづいて説明する。

一般的アプローチ
バクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同定するためのプローブとして用いた。このような同定は制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによってなされた。詳しくは、以下に説明する。
ウイルスの株 ＮＤＶの高い癌誘発性（high oncogenic）を有するＲＢ１Ｂ株（Schat,K.A.et al.Avian Pathol.11,593-605,1982）を米国のコーネル大学Ｂ．カルネック（B.Calnek）教授から入手した。このウイルスの精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラークを形成させることによって行なった。ニワトリＳＰＦおよびＲＩＲ内で２度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞（chick embryo fibroblasts;CEF）内で４回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって高い癌誘発性が示された。

ウエルカムリサーチ（Wellcome Research Laboratories,Beckenham,Kewnt）から得たＨＶＴのＦＣ１２６株（Witter,R.L.et al.Am.J.Vet.Res.31,525-538、1970)を、ＣＥＦ内で１４回継代した。つづいて我々の研究室においてアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）およびＣＥＦ内で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらにＣＥＦ内で増殖させた。本実施例のクローニングに用いるウイルスＤＮＡは元の単離から数えて２４回の継代がなされたウイルスから抽出した。
組織培養 ＣＥＦは１９９培養液（ウイエルカム社製）を含む回転ボトル中において培養された。なお、この培養液には、ペニシルン、ストレプトマイシン、ファンジゾン（Fugizone）（レグド．テイー．エム；Regd.T.M）および前記牛血清が添加されている（Ross,L.J.M.et al.J.gen.Virol.28,37-47,1975）。 ＣＫＣは１０ｃｍペトリ皿中で培養した（Churchill,A.E.and Biggs P.M.,Nature,215,528-530,1967）。

ＭＤＶ−ＤＮＡの単離 ＲＢＩＢ感染細胞（cell associated RB1B）を、回転ボトルのＣＥＦからなる単層に、感染の程度が一細胞あたり約０．００１プラーク形成単位（ｐｆｕ）となるようにして植つけて、３７℃で培養した。培養３日目で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換された新しい培養液は、２％牛血清を含む１９９培養液である。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分画からウイルスを単離した（Lee,Y.S.et al.J.gen.Virol.51,245-253,1980）。ウイルスＤＮＡは、精製ウイルスをサルコシル、プロテナーゼＫおよびトリス緩衝液でもって一晩、３７℃で処理し、それをグリセロール勾配でもってゾーン遠心（前掲、Lee,Y.S.etal.）によって精製した。高分子量のウイルスＤＮＡをエタノールによって沈澱させた後、１０ｍＭのトリス／ＩｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。
ＩＬＴＶ−ＤＮＡの単離
（ａ）感染ＣＫＣを採集し、播種後２〜３日経過したＰＢＳで洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこない、氷冷ＴＥ感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活性剤であるＮＰ４０（最終濃度１％）を添加して攪拌し、氷うえで１５分間、インキュベートした。ＲＮアーゼ処理後、試料を２０００ｒ．ｐ．ｍ．５分間遠心した。
遠心後、上清を採り、ＳＤＳ（最終濃度１％）およびプロテナーゼＫ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃、３０分間、インキューベートした。この混合物を２回のフェノール／クロロホルム処理、および１回のクロロホルム処理をおこない、続いて、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することによってＤＮＡを沈澱させた。

（ｂ）また、ウイルスＤＮＡを以下の方法によりウイルス感染細胞の培養液から単離した。感染後２〜３日目のそのウイルス感染細胞の培養液を集め、３０００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、４℃の条件でベンチトップ遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び１９，０００ｒ．ｐ．ｍ．の回転数により超遠心（ソーバル）を４℃、１時間の条件でおこなった。この超遠心処理によって得られたウイルスペレットをＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＲＮアーゼンでＲＮＡの消化をおこなった。そして、既に述べたようにしてＳＤＳおよびプロテアーゼＫ処理をおこなって、ウイルスをこわした。
最後に破壊されたウイルスから既に述べた方法によりＤＮＡを抽出した。
ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング １μｇのＭＤＶを制限酵素ＢａｍＨ１によって切断し、これをジフォスフォリレートｐＵＣ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１制限部位に連結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ１株細胞を標準的方法（Hanahan,D.J.Mol.Biol.166,557-580,1983）によって形質転換し、この形質転換細胞をアンピリシンおよびＸ−ｇａｌ存在下で培養した。白いコロニーを採取し、ニックトランスレーションされたＭＤＶ−ＤＮＡとの雑種形成（ハイブリタゼーション）によってその存在またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Crunstein M.and Hogness,D.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,3961,1975）た。陽性コロニーを小量で培養し、そしてホルムス（Holmes,D.S.）およびクイグレイ（Quigley,M.）の方法（Holmes,D.S.and Quigley,M.,Anal.Biochem.114,193-297,1981）によってプラスミドＤＮＡを単離した。挿入部位の大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消化し、それをアガロース電気泳動することによって調べた。その結果、１ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも少ない塩基対からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラスミドが得られた。

ＩＬＴＶ−ＤＮＡのクローニング
ＩＬＴＶ−ＤＮＡのＥｃｏＲ１およびＢｇ１ＩＩライブラリーを既に述べたようなｐＵＣＢに含まれるウイルスＤＮＡのクリーニング消化（Cloning Digerts）によって得た。
ウイルスＤＮＡのランダムシークエンシング ソニケーション処理したウイルスＤＮＡ断片をジフォスフォリレートＭ１３．ｍｐ１０（アマーシャムインターナショナルＰＬＣ）のＳｍａＩ制限部位にクローン化し、ＭＤＶ挿入部位を含むプラークをＮＤＶ−ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定した。そして、その配列を３５Ｓ−ｄＡＴＰを用いたジデオキシ方法（Sanger,F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463-5467）によって同定した。
同様な方法をＭＤＶ−ＤＮＡのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プラークはｐＵＣ１３含有コロニーを避けるために標識された挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定した。

実施例１
ＭＤＶのｇＢ遺伝子
ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片１３とハイブリダイズされたＨＳＶおよびＶＺＶのｇＢ遺伝子に対して相同性を示す（第１図参照）。ＭＤＶのＲＢ１株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片のシークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のＮＨ３末端から始まる１／３の部分がＩ３を含んでいた。この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片Ｋ３と同定された。［図１］は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタンパク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（［図２０］）。
これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初期翻訳配列は他のヘルペスウイルスのｇＢ遺伝子と共通な部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広げることが可能な疎水性配列が存在する（Pellet,P.E.et al.J.Virol.53,243-253,1985）。
しかし、ＭＤＶのｇＢ遺伝子はＨＳＶのｇＢ遺伝子とたった４８％のアミノ酸配列の相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５１−１９２０残基、［図２］−［図１９］）の挿入およびグリコシレーションによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示す。
ＨＶＴのｇＢ（［図２］〜[図１９］）に該当する限定された配列データ（７０２塩基）とＭＤＶのｇＢの配列とを比較すると、これら２つの糖タンパク質に関して７６．９％の核酸の相同性と８７．１％のアミノ酸の相同性とが認められた。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢにおけるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したＨＳＶのｇＢのドメインと等価な領域（１３２３−１４３３残基）に特に集中した（前掲、Pellet P.E.et al.1985）。ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間におけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の領域に集中された。

実施例２
ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭＤＶのｇＨ遺伝子
ＨＳＶのｇＨ遺伝子に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれわれの初期の研究において同定された（前掲、Buckmaster et al.1988）。このクローンは、プローブとして用いた場合、ＨＶＴの６ｋｂからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）する（図２０）。
シークエンス（配列決定）によって、この断片がカルボキシ末端を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝子を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残りの部分を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．２ｋｂ）はＨｉｎｄＩＩＩ部位と重なり合うＨＶＴのクローン化ＨｐａＩ断片とハイブリダイゼーションされた。［図２１］〜［図２８］は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）とフランキング配列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ遺伝子と、ＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶに含まれるその相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）は、それぞれ２０、２４および２０であった（アミノ酸が最大重なり合った数６３０、６４４および１５３からそれぞれ推定した）。

実施例３
ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶのＴＫ遺伝子
ＨＶＴのＴＫ遺伝子の全遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）は、前記した３．２ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むものである（［図２０］）。
遺伝子全体およびフランキング領域の配列は［図２９］〜［図３８］に示した。同様に、ＭＤＫのＴＫ遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからなるＢａｍＨ１Ｋ２断片を含むものである（［図１］）。ＭＤＫのＴＫ遺伝子の完全な配列を［図６３］に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＴＫ配列の比較空、２つの遺伝子は６０％のアミノ酸の同一性を有することがわかった。これとは対照的に、ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶのＴＫ遺伝子間の同一性はそれぞれたったの３０、２７および２４％であった（アミノ酸が最大重なり合った数３２０、３３２および１９３からそれぞれ推定した）。ＨＶＴおよびＭＤＶのＴＫ遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、ジン酸化に関連したいくつかのウイルスおよび真核生物のタンパク質のためのＡＴＰおよび（または）ＣＴＰ結合部位の特徴を示した（Gentry,G.A.Proc.Natl.Acad.ASci.U.S.A.82,6815-6819）。これらの保守的な配列は外来遺伝子の発現および挿入のための好適な部位として、またＴＫ−欠失突然変異体を産生するのに好適である。

実施例４
ＭＤＶ（ｇＰ５７−６５）（ｇＣ相同遺伝子）のＡ抗原遺伝子
Ａ抗原遺伝子は、ＨＳＶの相同遺伝子として同定されたことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子であり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードする）として、また非必須領域として用いられる。このＡ抗原遺伝子は、ＭＤＶのＢａｍＨ１Ｂ断片の中に置かれており（Isfort et al.1987）、ＭＤＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されている（Coussens and Velicer,Abstract OP18.51,VII International Congress of Virology9-14August,(1987)Edmonton,Canada;J.Virol.62,2374-2379）。
前記したランダムなシークエンス決定に関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物であるＭ１３クローン（Ｎｏ．１３０）を同定した。よって、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＲＢ１Ｂ株から得られた２．３ＫｂｐのＥｃｏＲ１／ＰｖｕＩＩ断片を同定するのに用いた。
そして、この断片を標準的な方法により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によって裂かれたｐＵＣ１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢ１ＢのＡ抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは［図３９］〜［図４４］に示した。

ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗原領域は非必須遺伝子であり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位として好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の遺伝子が挿入されよう。このことはいくつかの証拠から支持される。それらの証拠を以下に示す。
（１）われわれの研究において、他のＲＢ１ＢのＡ抗原が単離され、かつ配列決定された。これは３'からＡ抗原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらなった（T's 45 bases 3'to the A antigen ATG codon）余分な（エクストラ）Ｔ残基を有する。このエクストロラＴは遺伝子に機能的なＡ抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシフト変異を引き起こす。この遺伝子は複製ＭＤＶからクローン化可能であるので、その結果Ａ抗原はウイルスにとって非必須的なものであることになる。

（２）同様な研究から、ＭＤＶのＡ抗原はＨＳＶのｇＣおよびＰＲＶのｇｐＩＩＩ糖タンパク質と相同であることが明らかになった。これら２つの相同遺伝子は非必須的なものと考えられている（ＨＳＶ相対体にとって、ロセンタルらの文献：Rosenthal et al.J.Virol.61,2438-2447を参照）。
（３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ抗原が欠如していると判定された株（churchill,A.E.et al.J.gen.Virol.4,557-564,1969）またはより感度の高い２次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す株が報告されている（Van Zaane,D.et al.Virology 121,133-146）。
さらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所（location）であろう。これによって、Ａ抗原遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしているオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろう。
ＨＶＴおよびＩＬＴＶベクターへ遺伝子を導入するための戦略
２つの可能性がある、すなわち、
（１）ベクターの非必須的遺伝子への挿入、
（２）ベクターの該当する遺伝子との置換。
これは、ＭＤＶおよびＨＶＴのいくつかの遺伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能である。

実施例５
ＨＶＴ，ＩＬＴＶまたはＭＤＶの非必須的遺伝子への挿入
（ａ）ベクターのＴＫ遺伝子座への挿入
（１）ＨＶＴ，ＩＬＴＶまたはＭＤＶは鳥ペルペスウイルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして用いられることが可能であろう。特にＭＤＶのＲＢ１Ｂ株のｇＢ，ｇＣ，ｇＨまたはｇＣは、ＩＬＴＶに挿入される。また、ＩＬＴＶのｇＢおよびＤＳ−１７はＨＶＴまたはＭＤＶに挿入される。これらは、挿入された遺伝子と結合したプロモーター、非対応（heterologous）プロモーター、或はこれらの異なるクラスにある遺伝子（例えば、ｇＢ遺伝子発現に好適な即時型初期プロモーター）を用いるであろう。
（２）ＩＬＴＶは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベクターとして利用可能であり、また、最適な発現のためのプロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に用いられる方法は、ＨＳＶへの肝炎抗原の挿入に関する既知の方法（前掲、Shih et al.1984）に基づく。
既に述べた方法に因って得られたＭＤＶおよびＨＶＴのＤＮＡは、ＤＮＡ抽出中にＤＮＡの切断が起こらないような予防策を講じることによって、感染性をそこなわず、ＤＮＡを保護することができる。

ストウおよびウイルキーの方法（前掲、Stow & Wilkie J.gen.Virol. 33, 477, 1976）によって得られたウイルスＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱物をＣＥＦからなるサブコンフルエント（sub-confluent）な単層に添加した。１時間、３７℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した状態（コンフルエントな状態）となるまで１〜２日間培養した。コンフルエントな状態からなる１９９培地（ウエルカム）と、前記培養駅の一部を置き換えた（１：１または２：１）。そして、プラークが形成されるまで、３７℃で培養した。通常、このプラーク形成は４〜５日後に見られるようになる。１μｇのＨＶＴ−ＤＮＡあたり、約２００のプラークが得られ、また１μｇのＭＤＶ−ＤＮＡあたり、約５０のプラークが得られるであろう。組換えウイルスの相同遺伝子組換えおよび単離のために、目的とする遺伝子を前記したような１０：１ないし２：１のＴＫまたはｇＣおよび野生型ウイルスと共形質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、完全な野生株を共感染（co-infection）に用いることが可能である。

ＨＶＴのＦｃ−１２６株のＴＫ遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられる制限酵素は、ＢａｎＩＩ、Ｂｓｐ１２８６、ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩおよびＮｓｐｂＩＩおよびＳｐｈＩである。これらの制限酵素による切断（消化）部位は、ＴＫ遺伝子の発現を妨害する外来ＤＮＡの挿入部位として用いられ、ＴＫ遺伝子部分がこれらの酵素（またＥｃｏＫも利用可）の組合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化させる。
これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクターに消化部位をもち、このような部位にウイルスＤＮＡ断片がクローン化される。よって、ベクターを切断することなしにクローン化されたＤＮＡを直線化するために制限酵素による部分消化の手法が用いられよう。

前記した酵素群には、フランキング遺伝子活性を阻害するようなものは含まれておらず、ＨＳＶ−１相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。ウイールスの組換えは、「プラークリクフト（plaquelifts）」によって検知することが可能である。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感染細胞と、放出されたウイルスとをニトロセルロースに移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞からの変性ＤＮＡと、ウイルスとをハイブリダイゼーションするもので、細胞のＤＮＡはヴィラレアル５の文献（Villareal,L.et al.Science 196,183-185,1977）に記載された好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウイルスは、単層培養回収できる。
同様の方法が目的とするエプトープを発現する組換えウイルスを単離することに用いることが可能である。例えば、「プラークリフト」に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロテインあのような適当な検知システムを用いることによって、この結合した抗体の存在を検出することができる。そして、アシクロビル（acyclovir)(前掲、Ross,N.1985）
（Schat,K.A.et.al.Antiviral Research4,159-270,1984）またはＦＭＡＵを含む培地で増殖させることによってＴＫ−ウイルスを選別する。適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン化ＴＫ遺伝子（図４５−５５）に挿入する。

次に、この組換えＤＮＡをひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎臓細胞中にベクターの感染ＤＮＡと同時トランスフェクション（co-transfection）させる。
この戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大させることである。また、最適な発現に適したプロモーターの選択が可能となることである。よって、即時型プロモーターの利用は、潜伏性（latently）感染細胞における発現を可能とする。
（ｂ）ベクターのｇＣ遺伝子座における挿入、Ａ抗原ＣＨＳＶのｇＣ遺伝子ＨＶＴおよびＭＤＶ相同遺伝子）は生体内（in vivo）およびガラス器内（in vitro）系（ｇＣに関するセッション参照）でのウイルス増殖にとって必須なものではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現のための好適な部位となるであろう。
さらに、Ａ抗原は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるものであることから、外来タンパク質の免疫特性を強化することに利用できる。
このＡ抗原遺伝子座におけるウイルス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも一部がｇＣ遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そして感染性ウイルスＤＮＡとともに形質転換されることによって達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗体によるウイルスプラークのスクリーニングは、組換え体の単離を可能とする。

実施例６
ＨＶＴにおけるＩＬＴＶ遺伝子とその相同遺伝子との置換
実施例５に示した方法によって、置換はクローン化されたＩＬＴＶ配列と感染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの同時トランスフェクションによって達成される。
ＩＬＴＶから誘導された遺伝子をＨＶＴのそれに対応するものと置換することが効果的であろう。ＩＬＴＶ配列とエピトープとを発現する組換え体は、ＩＬＴＶ特異的モノクローン抗体または、既に述べたユニークＩＬＴＶ配列に対する抗ペプチド抗体を用いることによって検出できる。
この方法の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、相対的に単純な方法から成るということである。しかし、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。

実施例７
ＩＬＴＶのＴＫ−突然変異体を得るための戦略欠失突然変異
欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能である。例えば、ＡＴＰおよびＣＴＰ結合部位をリン酸化するような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに対してである。これは、制限酵素による二重消化（double digestion）によって達成される。ここで用いられる制限酵素は、ＳｎａＢ１またはＢｃ１Ｉである。
二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづいて、ウイルスＤＮＡとの同時トランスフェクションまたは、ウイルス感染細胞へのトランスフェクションを実施する。制限酵素の選択などによる［図４５］〜［図５５］、［図５６］およびプラスミドｐＩＬＢｇの地図（［図６７］）を参照してもらいたい。
ＴＫ−ウイルスはアシクロビル（acuclovir)（前掲、Ross,N.1985）または、ＦＭＡＵ（前掲、Schat,K.a.et al.1984）の存在下よって、ハイブリダイゼーションによって、プラーク精製クーロンにおけるＫ遺伝子の欠失う部位の不存在に関して調べた。
ＩＬＴＶの欠失による突然変異それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウイルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺伝子配列をもつものとして用いることが可能である。

挿入突然変異
ヘルペスウイルスプロモーターまたは他の適当な配列なたはシグナル塩基による調整下にある機能的竈−ガラクトリダーゼ遺伝子は、ＴＫ活性によって重要なＴＫ遺伝子のドメインにまず誘導される。そして、組換え体ＤＮＡは感染性ウイルスＤＮＡと共形質転換するか、もしくはウイルス感染細胞にトランスフェクションして、相同遺伝子組換えをおこす。アセロビルまたはＦＭＡＵ存在下における選別はＴＫ−挿入突然変異体を生じさせるであろう。もし、竈−ガラクトリダーゼが導入されたとしたら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存在下で青い色のプラークが生じることによって検出される。
必要に応じてＴＫ遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベクターにサブクローン化することができる。

実施例８
ＨＶＴへのＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＤ遺伝子の挿入
（本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す）
ＨＶＴのＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵＣＢにフロー化し、ｐＴＫ１Ｂと呼ばれるプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラスミドを切断する制限エンドヌクレアーゼＲｓｒＩＩ（図２９−３８のヌクレオチド配置１９７，酵素認識部位（ＧＧＡＣＣＧ）によって直線化する。
これによって、「粘着性（sticky）」端末が生じ、この生じた端末を通常の方法（参考文献：″Molecula rCloning:a Laborator yManual″,ed.Maniatis T.,Fritsch E.F.,and Sambrook J.Cold Spring Harbor Laboratory,1982）によつて修復する。

ＲＢ１ＢのｇＢ 遺伝子を独自に２つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｉ₃およびＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｋ₃と命名した。一つのプラスミド上にある完全な複製ｇＢ遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドをＢａｍＨ１で切断し、そして切断を連結（レゲーション）した。目的通りに作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。しかし、前記したように、完全なｇＢ配列は実質的にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記のように合成されたＰＴＫ１Ｂにクローン化した。また、ＭＤＶのｇＢオープンリーディングフレームは、ＨｉｎｃＩＩおよびＮａｅＩによる消化によって、プラスミドＭＳＢ２７から切り出され、部分的にＨｐａＩによって切断されたＨＶＴのＴＫプラスミドｐＴＫ１Ｂに連絡される。ＴＫとｇＢの両配列を含む組換え体プラスミドはハイブリダイゼーションによって同定され、さらにサザンブロットによって分析される。そして、組換え体プラスミドはＨＶＴウイルス（ウイルスＤＮＡ）を含む細胞に誘導され、ＴＫ遺伝子へｇＢ遺伝子を誘導することにようる相同遺伝子組換えがおこなわれる。ＪＶＴウイルス組換え体はアシクロビルまたはＦＭＡＵによって選別され、或いは標識ｇＢプローブによって検出される。

実施例９
ＨＶＴに挿入されるＲＢ１ＢのｇＣ（ＣＡ抗原）遺伝子
末端が鈍くなった（blunt ended）ＰＴＫ１Ｂを実施例８に示されるようにして合成した。ＲＢ１ＢのｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ｐｕＣ１３ポリリンカーに含まれる部位）によって、プラスミドｐＭＢ４１９（実施例４）から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復されたｇＣ断片を実施例８に示したようにして直線化された末端修復ｐＴＫ１Ｂにクローン化した（クローニングは、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位元素標識断片によるプロービング、またはＤＮＡセークエンシング、または、これらの組合せによって変化に富んだものである。）

ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢ１ＢのｇＣ遺伝子をもつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱またはエレクトロポレーション（電気穿孔）によってＨＶＴ−感染細胞にトランスフェクションさせた。ｇＣ遺伝子の両端をクロスオーバー（cross-over）させたＨＶＴウイルスとＨＶＴのＴＫプラスミドのフランキング配列との間の相同遺伝子組換えは、ＲＢ１ＢのｇＣ遺伝子をＨＶＴウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組換え体は前記のようにして、ＴＫ−として選別され、またはプロービングによって同定される。類似の方法として、既に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺伝子などをここで開示したＩＬＴＶの非必須的ゲノムに挿入するためのクローニング戦略を提供するために用いられるものであり、またはＩＬＴＶ中の抗原遺伝子を作るために利用される。

ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺伝子の位置を示すＭＤＶの地図。 ＭＤＶのＲＢ１Ｂ株に存在するｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列。ＭＤＶの各ヌクレオチドを参照して番号を付けた。ＨＶＴのｇＢ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところには下側に記載されている。相同性は垂直の棒によって示されている。ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇＢ遺伝子と間のアミノ酸の違いは上側に示されている。 図２の続き。 図３の続き。 図４の続き。 図５の続き。 図６の続き。 図７の続き。 図８の続き。 図９の続き。 図１０の続き。 図１１の続き。 図１２の続き。 図１３の続き。 図１４の続き。 図１５の続き。 図１６の続き。 図１７の続き。 図１８の続き。 ｇＨ（破線）、ＴＫ（黒塗）および主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の位置を示す図。それぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨで表わしている。 ＨＶＴｇＨ遺伝子の大部分のヌクレオチド配列。対応するアミノ酸配列を上部に示す。 図２１の続き。 図２２の続き。 図２３の続き。 図２４の続き。 図２５の続き。 図２６の続き。 図２７の続き。 ＨＶＴ ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列。番号はＨＶＴヌクレオチドを参照。ＨＶＴ ＴＫ遺伝子の部分の配列は下に記載。相同性は垂直棒で示す。ＭＤＶ ＴＫとＨＶＴ ＴＫのアミノ酸の違いは上部に示す。 図２９の続き。 図３０の続き。 図３１の続き。 図３２の続き。 図３３の続き。 図３４の続き。 図３５の続き。 図３６の続き。 図３７の続き。 ＭＤＶのＲＢＩＢ株のｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列。対応するアミノ酸は上部に示す。 図３９の続き。 図４０の続き。 図４１の続き。 図４２の続き。 図４４の続き。 ＴＫ遺伝子のクラスターを含むＩＬＴＶゲノムの５４００塩基対のヌクレオチドと、予想されるアミノ酸配列を示す図。主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を作ると予想されるアミノ酸配列はストランド用配列の下に、また、相補ストランド用配列の上に単一文字コートで示してある。 図４５の続き。 図４６の続き。 図４７の続き。 図４８の続き。 図４９の続き。 図５０の続き。 図５１の続き。 図５２の続き。 図５３の続き。 図５４の続き。 ＩＬＴＶゲノムのＴＫを含む部分での遺伝子体系を示す図。ＩＬＴＶ ＤＮＡのＥｃｏＲ１（ｐＩＬＥｃ１）とＢｇ１ＩＴ（ｐＩＬＢｇ２）産生断片を含む互いに重なるＰＵＣ１３プラスミドクローンを示している。 ＩＬＴＶ ｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列の一部。 ＩＬＴＶ リボヌクレオチド還元酵素のヌクレオチド配列の一部（大きなサブユニット）。 ＶＺＶ６２／ＨＳＶ−１ ＩＥ１７５遺伝子のＨＴＶ相同体のヌクレオチド配列。 ＨＴＶリボヌクレオチド還元酵素（大きなサブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の一部 ＭＤＶリボヌクレオチド還元酵素（大きなサブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の一部 図６１の続き ＭＤＶリボヌクレオチド還元酵素（小さいサブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の一部 ＨＳＶ−１ ＩＥ−１７５遺伝子のＭＤＶ相同体のヌクレオチド配列の一部。 ＨＳＶ−１ ＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相同体の一部。 ウイルス性ゲノムの非必須領域およびプラスミドベクター内でクロー発生させたＤＮＡの相同領域での相同的遺伝子組み換え法を示す概念図。 ＴＫ遺伝子およびＯＲＦｓ３、５の制限部位と位置とを示すｐＩＬＢｇ２プラスミドの地図。

Claims (17)

1. ヌクレオチド配列であって、前記配列は前記配列と結合した野生株ウイルス内において前記配列に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグループから選ばれることによって成り立つ：
   （ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
   （ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
   （ｃ）ＨＳＶのｇＨ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、またはその２７３−３２０または８６７−９２６の部分、
   （ｄ）ＩＬＴＶのＴＫ遺伝子、
   （ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＩＬＴＶの遺伝子、
   （ｆ）ＩＬＴＶのＯＲＦ２、
   （ｇ）ＩＬＴＶのＯＲＦ３、および
   （ｈ）ＩＬＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、
   （ｉ）ＨＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、
   （ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サブユニット）遺伝子、
   （ｋ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、
   （ｌ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−６８と相同なＨＶＴの遺伝子、（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−１７５と相同なＨＶＴの遺伝子。
2. 請求の範囲第１項記載にもとづく配列であって、前記配列は遺伝暗号部分と（または）、前記配列の少なくとも５'もしくは３'側の非遺伝暗号部分とによって構成さることを特徴とする。
3. 請求の範囲第１項または第２項（ｃ配列を除く）記載にもとづく配列と適当な宿主で複製可能なＤＮＡとを含むことを特徴とするプラスミドベクター。
4. 請求の範囲第３項記載にもとづくプラスミドベクターであって、前記ベクターはＭＤＶ−、ＨＶＴ−、またはＩＬＴＶ−感受性細胞に適当なベクターであることを特徴とする。
5. ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴの挿入または欠失突然変異体であって以下の特徴を有する：、
   （ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはＴＫ遺伝子のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
   （ｉｉ）ＭＤＶの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニット）の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異であり、また
   （ｉｉｉ）ＩＬＴＶの場合、ＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異である。
6. 請求の範囲第５項記載の突然変異体ウイルスであって、非必須的部分の遺伝子は前記突然変異の領域に挿入されることを特徴とする。
7. 請求の範囲第６項記載の突然変異体ウイルスであって、前記相同な遺伝子は抗原、またはＨＶＴ、ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤ、ニューキャッスル病もしくはエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）と結合した前記抗原の部分をコードすることを特徴とする。
8. 請求の範囲第１項記載のＨＶＴのｇＨ遺伝子の部分のいずれか一つによってコードされたことを特徴とするペプチド。
9. 請求の範囲第５項記載にもとづく突然変異体を調製するための方法であって、前記方法は、
   （ｉ）（ａ）前記領域の欠失または挿入突然変異体コピーと、（ｂ）ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶから得られた全ウイルスＤＮＡまたは全ＨＶＴ、ＭＤＶまたはＩＬＴＶウイルスのいずれか一方と相同遺伝子組換えを行なうこと、そして （ｉｉ）組換え体ウイルスを単離することからなる。
10. 請求の範囲第１１項記載の方法であって、前記（ｉ）において前記突然変異体コピーと、全ウイルスＤＮＡまたは全ウイルスのいずれか一方とを適当な細胞に導入するもので、また前記細胞内に取り込また前記ＤＮＡの複製過程中に前記組換えが起こることを特徴とする。
11. 請求の範囲第５項記載にもとづく突然変異体ＩＬＴウイルスとＩＬＴＶ感受性細胞とを含むワクチンであって、前記ウイルスは少なくとも前記突然変異の結果により弱毒化されていることを特徴とする。
12. 請求の範囲第５項、第６項、または第７項記載にもとづく突然体と、感受性細胞とを含み、ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶに対して効果的であることを特徴とするワクチン。
13. ＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤに対して効果的な種痘ベクターであって、前記ベクターは家禽内で複製可能な微生物を含むもので、前記微生物は配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）または（ｍ）のいずれか一つまたは複数にもとづいた異種で複製可能なＤＮＡを含むＩＬＴＶまたはＨＶＴベクターを有することを特徴とする。
14. キャリアメジウムと請求の範囲第１３項記載にもとづくベクターとからなることを特徴とするワクチン。
15. 請求の範囲第１４項記載にもとづくワクチンであって、前記キャリアメジウムはＩＬＴＶ−、ＨＶＴ−、またはＭＤＶ−感受性細胞を含むもので、また前記ベクターはＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤＶであることを特徴とする。
16. 病気治療のための家禽への種痘方法であって、前記方法は前記家禽に、請求の範囲第１１項、第１２項、第１４項、および第１５項のいずれか一項記載の非毒性免疫量のワクチンを接種をすることを特徴とする。
17. 請求の範囲第１６項記載にもとづく方法によって種痘されたことを特徴とする家禽。

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