JPH11318447A - ウイルスのヌクレオチド配列 - Google Patents

ウイルスのヌクレオチド配列

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JPH11318447A JP11082143A JP8214399A JPH11318447A JP H11318447 A JPH11318447 A JP H11318447A JP 11082143 A JP11082143 A JP 11082143A JP 8214399 A JP8214399 A JP 8214399A JP H11318447 A JPH11318447 A JP H11318447A
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Abstract

(57)【要約】 七面鳥（ＨＶＴ）、マーク病ウイルス（ＭＤＶ）、およ
び感染性気管支炎ウイルス（ＩＬＴＶ）のヘルペスウイ
ルスのいろいろな遺伝子が非必須的領域（および外来遺
伝子挿入部位としてのその仲間たち）および（または）
抗原遺伝子暗号領域（抗原コード領域）として同定され
た。前者には、ＨＳＶ（ヘルペス単純ウイルス）のｇＣ
遺伝子のＨＶＴ相同遺伝子、ＭＤＶまたはＨＶＴのＴＫ
（チミジンキナーゼ）領域、ＩＬＴＶのＯＲＦ３、ＩＬ
ＴＶ、ＭＤＶ、またはＨＶＴのリボヌクレオシド還元酵
素（大サブユニット）遺伝子、ＭＤＶのリボヌクレオシ
ド還元酵素（小サブユニット）遺伝子が含まれる。抗原
コード領域には、ＨＳＶのｇＢ、ｇＣおよびｇＨ遺伝子
のＨＶＴ相同遺伝子、ＨＳＶのｇＢ遺伝子のＩＬＴＶ相
同遺伝子、ＩＬＴＶのＯＲＦ２、そしてＨＳＶ−１の即
時型初期遺伝子ＩＥ−１７５およびＩＥ−６８のＨＶＴ
相同遺伝子が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はウイルスのヌクレオチド配列に関
するもので、病気に対する免疫性を付与するワクチンに
関連したウイルスのヌクレオチド配列を提供することを
目的とする。従来技術ヘルペスウイルスは、大きな二重
鎖ＤＮＡウイルスで、エンベロープによって囲まれた２
０面体カプシドからなる。このウイルスは、生物学的特
性とゲノム構造とにもとづいてアルファ、ベータ、およ
びガンマヘルペスウイルスに分類される［Ｒｏｉｚｍａ
ｎ，Ｂ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｉｎｔｅｒ−ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ１８，２０１−２１７］。トリヘルペスウイ
ルスには、鶏に発生するリンパ腫症の一種であるマレッ
ク病を引き起こすマレック病ウイルス（ＭＤＶ）（ガン
マヘルペスウイルス）［総説： Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．
（ｅｄ）Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅ（１９８５），
Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ］と、鶏の呼吸器系上部に感染して
致死または排卵減少を引き起こす感染性咽頭気管炎ウイ
ルス（ＩＬＴＶ）（アルファウイルス）とが含まれる。
最近、われわれの研究室において偶然にも、多くの保護
された遺伝子を同定することを可能とするような、ＭＤ
Ｖ、ＩＬＴＶおよび哺乳類のヘルペスウイルス、特に水
痘性口内炎ウイルス（ＶＺＶ）および単純ヘルペスウイ
ルス（ＨＳＶ）との間における顕著なアミノ酸配列の相
同性（ホモロジー）が発見された。これらには、ＨＳＶ
の糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨに相同なＭＤＶ
および七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のアミノ酸配
列、ＴＫおよびリボ核酸還元酵素遺伝子に相同なＩＬＴ
Ｖ、ＭＤＶおよびＨＶＴのアミノ酸配列、そしてｇＢお
よびＶＺＶの遺伝子３４および３５に相同なＩＬＴＶの
アミノ酸配列も含まれる［Ｂａｃｋｍａｓｔｅｒ，Ａ
ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８
９，２０３３−２０４２］。ＭＤＶの株は３つの血清型
に分類されている。１型は病原性の株とその弱毒株、２
型は天然の非病原性株、そして３型はＨＶＴが含まれ
る。１０年以上前から、ＨＶＴによる種痘がマレック病
に対して顕著な有効性を示すことが知られている。
【０００２】しかし最近になって、ＨＶＴによる種痘に
対して抵抗性を示すＭＤＶが単離されている。このよう
なウイルス毒性が非常に高いＭＤＶによる鶏の損失は、
米国、ヨーロッパおよび中東の地域において発生してい
る。しかし、ＨＶＴ、２型ＭＤＶおよびＭＤＶ高ウイル
ス毒性株を弱毒化して得た株からなる混合物を用いるこ
とによって、そのような損失を確実ではないが減少させ
ることが可能である。このような知見、すなわちＨＶＴ
または２型ＭＤＶによって共有されないＭＤＶ型特異的
エピトープが存在するということは、われわれに抗原的
には従来のワクチンよりもＭＤＶに関係した改良型ワク
チンを作ることが可能であることを結論させた。［総
説： Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｂｉｇｇｓ ｉｎ Ｇｏｌｄ
ｍａｎ Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｍ．Ａ．
（ｅｄｓ）Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏ
ｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｔｅｒ
ｖｅｎｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄ
ｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｕｒ，ｐ１３−３１，Ｍａｃｍｉｌ
ｌａｎ，１９８６］いくつかのヘルペスウイルス抗原
は、組換えワクシニアウイルス内で発現されたときに保
護免疫を与えることが示される。これらには、ＨＳＶの
ｇＢ［ＣａｎｔｉｎＥ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８４，５９０８−５９１２］、ＨＳＶのｇＤ［Ｐａｏｌ
ｅｔｔｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，１９３
−１９７］および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）のｇＰ５
０、ＨＳＶのｇＤの相同タンパク質（ｈｏｍｏｌｏｇｕ
ｅ）［Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１
９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．３９７７−３９８１］
が含まれる。なぜなら、ウイルスの貫通および感染力に
ｇＢが必須であること、またヘルペスウイルス間で保存
されているｇＢとその相同タンパク質は重要な免疫源で
あるからである。さらに、感染細胞の表層にｇＢが存在
することは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答にと
って重要な標的となる［Ｂｌａｃｋｌａｗｓ，Ｂ．Ａ．
ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１１０３
−１１１４（１９８７）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａ
ｙｌｏｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．６９，１７３１−１７３４］。最近になっ
て報告されたＨＳＶの糖タンパク質ｇＨもまた感染力に
とって必須なものであり、また重要な免疫源でもある
［Ｄｅｓａｌ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９，１１４７−１１５６］。ま
た、ｇＣの相同タンパク質であるＰＲＶのｇＩＩＩも中
和抗体の主標的および細胞毒性Ｔ細胞の主標的として重
要であるが、かならずしも必須のタンパク質ではないこ
とが知られている。しかし興味深いことは、サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）によって感染された細胞のＴ細胞
介在細胞毒性反応における即時型初期タンパク質の期待
はずれな出現である［Ｋｏｚｉｎｏｗｓｋｉ Ｕ．Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．２０
５４−２０５８］。同様な抗原は、マレック病における
潜伏感染リンパ球および形質転換リンパ球の排除におい
て重要な役割を担うことができよう。なぜなら、マレッ
ク病の腫瘍組織から確立されたリンパ球芽細胞系にお
いて即時型初期ＲＮＡ転写産物が検出されるからであ
る。
【０００３】また、ボックスウイルスワクシニアをベク
ターとして用いて作られた多くの組換えワクチンが報告
されており、また外来遺伝子発現のためにヘルペスウイ
ルスをベクターとして用いた場合も報告されている。よ
って、肝炎抗原はＨＳＶで発現されている［Ｓｈｉｈ，
Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１， ５８６７
−５８７０］。またヒト組織プラズミノーゲン活性因子
はＰＲＶで発現されている［Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ ５７，２６１−２
６５］。これら両者の場合、外来遺伝子は非必須的なヘ
ルペス遺伝子のクローン化断片内に挿入され、相同遺伝
子組換えによってウイルスベクターに組み込まれる。肝
炎ウイルス遺伝子は、ヘルペスウイルスプロモーターに
融合され、また組換えＤＮＡはＨＳＶのＴＫ遺伝子に挿
入される。組換えＤＮＡと野生型ＨＳＶＤＮＡとの同時
トランスフェクションにつづく相同遺伝子組換えによっ
て肝炎抗原を発現するＴＫ−ウイルスが得られる。ＰＲ
Ｖの場合、ＵｓにマッピングされたｇＸ遺伝子を外来遺
伝子の挿入部位として用いられる。ここで用いれる戦略
は、ＨＳＶのＴＫ遺伝子をＴＫ欠失ＰＲＶ突然変異体
（ＴＫ陽性ウイルス）に挿入することを含むものであ
る。そして、プラズミノーゲン活性因子はＨＳＶのＴＫ
遺伝子のクローン化断片に挿入し、この組換え体を相同
遺伝子組換えによってＰＲＶに導入する。ＴＫ−ウイル
スを前記のヒト遺伝子を発現するものとして選別する
［前掲、Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔａｌ．］。同様に、ＶＺ
Ｖをベクターとして使用する［Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．
（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，３８９６−３９００］。いくつかの
ヘルペスウイルス遺伝子も毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）
に関連しており、またインビトロの系における増殖に必
須のものでないことが知られている。これらにはＨＳＶ
のＴＫ遺伝子［Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９７４）Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．２４，４６５
−４８０；Ｆｉｅｌｄ，Ｈ．ａｎｄ Ｗｉｌｄｙ，
Ｐ．，（１９８７）Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ）８１，２６７−２７７］およびＰＲＶのＴＫ遺
伝子が含まれる。実際、ＰＲＶはＴＫ活性の欠失によっ
て容易に減少される［Ｔａｔａｒｏｖ，Ｇ．（１９６
８）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｖｅｔ．Ｍｅｔ．Ｍｅｄ １
５Ｂ，８４８−８５３］。さらに、ＰＲＶのバルサ（Ｂ
ａｒｔｈａ）株の減少はＵｓにマッピングされた非必須
的糖タンパク質ｇ１の欠失にもとづく［Ｍｅｔｔｅｎｌ
ｅｉｔｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６１，４０３０−４０３２］。長い非反復配列の
側面を守る間在繰り返し領域（ＴＲＳ）に存在するＨＳ
Ｖマッピングの遺伝子は、病原性に関係している［Ｒｏ
ｓｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＶｉｒｕｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ ５，１５７−１７５；Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，Ｒ．Ｌ．ｅ ａｌ．（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１３１，１８０−１９２］。ＨＳＶのいくつかの付加
的な遺伝子はインビトロの系における増殖には非必須で
あるが、毒力に関係していると報告されている。これら
には、ＵＬ２４（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．，（１９８
２），Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６３，２７７−２９
５）、リボ核酸還元酵素の大サブユニット（Ｇｏｄｓｔ
ｅｉｎ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．（１
９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，１９６−２０５）、ｇ
Ｃ（Ｄｒａｐｅｒ Ｋ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．（１９８４）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，５７８−５８５）、ｄＵＴＰア
ーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｂ．ａｎｄＰｒｅｓｔｏｎ，
Ｖ．Ｇ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８，１９
０−１９７）、そしてＵＬ５５およびＵＬ５６（Ｍａｃ
Ｌｅａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄＢｒｏｗｎ，Ｓ．Ｍ．（１９
８７）Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８，１３３９−１３
５０）が含まれる。さらに、ＵｓにおけるＨＳＶマッピ
ングのいくつかの遺伝子もまた、インビトロ系における
増殖に非必須である［Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，５７６−５
７９］。
【０００４】本発明の概要本発明は、ひとつのヌクレオ
チド配列を提供するものであり、このヌクレオチド配列
に関連した野生型ウイルス内において前記ヌクレオチド
配列に結合して存在する他の配列から遊離したもので、
このヌクレオチド配列は、（ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子の
ＭＶＴ相同遺伝子、（ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子のＨＶＴ
相同遺伝子、（ｃ）ＭＳＶのｇＨ遺伝子のＨＶＴ相同遺
伝子、（ｄ）ＩＬＴＶのＴＫ遺伝子、（ｅ）ＨＳＶのｇ
Ｂ遺伝子のＩＬＴＶ相同遺伝子、（ｆ）ＩＬＴＶのＯＲ
Ｆ２、（ｇ）ＩＬＴＶのＯＲＦ３、（ｈ）ＩＬＴＶのリ
ボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、（ｉ）Ｈ
ＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）、
（ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニ
ット）、（ｌ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ１７
５のＨＶＴ相同遺伝子、（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期
遺伝子ＩＥ６８のＨＶＴ相同遺伝子、そしてそれらの配
列にマイナーな変異が生じたマイナー変異配列である。
前記（ａ）から（ｍ）に記載されたそれぞれの配列は、
それぞれの配列を発現させるのに必要な停止および開始
シグナルおよびプロモーターを含む他の５’および３’
非遺伝暗号配列（ノンコーデイング配列）と結合したも
のであろう。そのような付加された配列はいわゆる自然
発生的なものか、あるいは非対応ものであろう。特に、
プロモーターは前記（１）および（ｍ）のひとつと結合
しているであろう。
【０００５】前記した「マイナー変異配列」という言葉
の意味は、その配列が本来コードしている遺伝子発現産
物そのもののあるべき姿を損なうことがないようなヌク
レオチド配列の変化であり、例えば相互のヌクレオチド
のマイナー置換である。ある抗原を遺伝暗号化（コー
ド）するためにベクターに挿入される配列の場合、配列
にとって必須なこととは配列がタンパク質または糖タン
パク質をコードしていることを意味する。その抗原の持
つ抗原性に悪影響を及ぼすことがないようなアミノ酸配
列の保存的な置換が生じて同様な抗原が遺伝子発現され
るような配列内における保守的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａ
ｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ）はこのようなマイナー変異
に含まれるものであろう。特に、抗原をコードする配列
のなかで、抗原タンパク質そのものをコードする部分の
みが使用される。そのような部分とは、例えば、ＨＶＴ
のｇＨ遺伝子に相当するヌクレオチド配列の２７３−３
２０または８６７−９２６およびそれらのマイナー変異
に該当する領域である。本発明のさらなる態様はこれら
の配列およびこれらの配列によりコードされるペプチド
によってなされる。挿入部位に相当する配列の場合、ウ
イウルスの感染力と複製とに関しては、なんら必須的な
ものではなく、また組換えを可能とするような配列と相
同な配列のみが必要とされる。よって、特定の配列への
特定のヌクレオチド配列の挿入は、挿入される場所から
下流に向けてリーデイングフレームを完全に変化させる
ものとなるであろう。抗原をコードする配列の場合で
は、このような変化は好ましくないアミノ酸配列を生ず
ることを意味する（フレームシフトがどこに生ずるかに
依存する）が、挿入部位の場合は相同性の度合いはほと
んど同じであるので、組換えが容易に行なえるであろ
う。挿入部位においてヌクレオチドの相同性が７５％存
在した場合、通常その配列はマイナー変異と見なされる
が、少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の
相同性があることが好ましい。このような相同性（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｙ）の度合いは上記の配列（ａ）ないし
（ｆ）および（ｘ）のそれぞれの全体に実質的に関係し
ている。短い配列は、このような長い配列を単離または
同定するためのプローブとして用いられるが、この場合
は正確なハイブリダイゼーションを行なわせるために高
い相同性が必要とされる。
【０００６】よって、本発明はさらに上記配列（ａ）な
いし（ｍ）のいずれかの少なくとも一部分に対して９０
％（好ましくは９５％、９９％または１００％）の相同
性を有する少なくとも１３のヌクレオチド副配列を提供
するものである。上記したように、配列（ａ）ないし
（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）は抗原発
現配列として好適であり、またＭＤＶのＴＫ領域配列は
抗原発現遺伝子の挿入のための非必須的部位部位として
好適である。よって、配列（ｂ）は両方の機能に好適で
ある。これらの配列は、ここで開示された配列情報と、
例えばオリゴヌクレオチドプロープの合成および野生型
のＤＮＡとそのプローブとのハイブリダイゼーションと
を含む標準的技術を用いることによって自然発生的な
（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のＩＬＴ
Ｖ、ＨＶＴおよびＭＤＶウイルスから容易に単離可能で
ある。抗原ＩＬＴＶおよびＨＶＴ配列、すなわち配列
（ａ）から（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および
（ｍ）は、適当な宿主、特にＨＶＴまたはＭＤＶ内にお
いて現される。ひとつのＩＬＴＶ配列の挿入のための好
適な非必須部位はＨＳＶのｇＣ遺伝子のＭＳＶ相同遺伝
子、ＨＶＴまたはＭＤＶのＴＫ遺伝子、ＨＶＴまたはＭ
ＤＶリホヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝
子、およびＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サブ
ユニット）遺伝子を含む。第二に本発明は、ＭＤＶ、Ｈ
ＶＴおよびＩＬＴＶの挿入または欠失突然変異を提供す
るものである。すなわち、（ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶ
のｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはＴＫ遺伝子
のリボヌクレオチド還元酵素遺伝子の突然変異であり、
（ｉｉ）ＭＤＶの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領
域の突然変異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子
（小サブユニット）の突然変異またはリボヌクレオチド
還元酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異であり、
（ｉｉｉ）ＩＬＴＶの場合、ＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３また
はリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニット）
の突然変異である。これらの突然変異は同定された領域
の遺伝子コード配列または遺伝子非コード領域にあると
考えられる。
【０００７】ＨＶＴ、ＭＤ Ｖ、およびＩＬＴＶのそれ
ぞれの突然変異体は、鳥禽（ベクターが複製される）類
のなかで遺伝子発現されることが望まれる他の配列から
なるベクターと同様に、非対応抗原コード配列（ｈｅｔ
ｄｌｏｇｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）のためのウイルスベクターとして
利用できるであろう。このような配列として、もちろん
これらに限定されるものではないが、（ａ）ないし
（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）および（ｍ）が含まれ
る。非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）という言葉
は、ここではウイルスゲノムに関係した場所に見出され
ていない抗原発現配列（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｎｇ ｇｅｎｅ）を意味している。すなわち、抗原
発現遺伝子はＩＬＴＶの病原性株から単離可能で、これ
よりも病原性の低い株のＴＫ領域に挿入れると考えれ
る。この挿入が自然発生的に生ずるウイルスでは起こら
ない場合、非対応と見なされる。また非対応配列は、鳥
脳脊髄炎（流行性振せん）、鳥インフルエンザ（鳥禽ペ
スト）、鳥白血病、ニューキャッスル病（ＰＭＶ２ない
しＰＭＶ７）以外の鳥パラマイキソバイラス（ａｖｉａ
ｎ ｐａｒａｍｙｘｏｉｒｕｓｅｓ）、鳥レオウイルス
病（腸の病気、腱しょう炎）、ニワトリ貧血（ニワトリ
貧血剤によって起こる）、胞子虫症、エッグドロップ症
候群（ＥＤＳ７６）、伝染性上皮腫、感染性気管支炎、
感染性粘液嚢症（グンボロ（Ｇｕｍｂｏｒｏ））、封入
体肝炎（アデノウイルス）、七面鳥リンパ増殖性疾患
（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅ
ａｓｅ）、ニューキャッスル病、ニワトリの細網内皮増
殖症、七面鳥の細網内皮増殖症、ロタウイルス腸炎、七
面鳥出血性腸炎および七面鳥鼻炎（ｒｈｉｎｏｔｒａｃ
ｈｅｉｔｉｓ）のいずれか一つの疾患に関係した抗原を
コードするものである。よって、本発明にもとづくベク
ターは多価ワクチンによる保護を可能とする。例えば、
ＭＤＶ抗原の遺伝暗号配列（コード配列）を持つＩＬＴ
Ｖを含むワクチンは、ＩＴＬおよびマーク病からワクチ
ンを接種された生物を保護する。さらに、突然変異ＩＬ
ＴＶウイルスそれ自体は、弱毒化されたウイルスとして
ワクチンに利用される潜在的可能性があり、また挿入さ
れた非対応配列を持つ必要性はない。
【０００８】本発明にもとづく欠失または挿入突然変異
体の調製の簡易的な方法は、適当な細胞に、例えばＴＫ
領域の同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｉｏｎ）、欠失または挿入変異されたものと全ウ
イルスＤＮＡまたは全ウイルス（例えば野生型（ｗｉｌ
ｄ ｔｙｐｅ）のウイルス）を導入することである。そ
のようなウイルスのむき出しとなったＤＮＡが感染性を
有することはすでに知られており、切断しないで調製し
た。リン酸カルシウムによる沈澱によってＤＮＡを調製
するのが好ましい。この方法に用いられる適当な細胞と
は、ニワトリ胚繊維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏ
ｂｌａｓｔ）、ニワトリ腎臓細胞およびアヒル胚繊維芽
細胞であり、これらはペトリ皿に単層からなる細胞集団
として播種されることによって好適に増殖する。相同遺
伝子組換えによって形質転換ＤＮＡと全ウイルスＤＮＡ
とを感染細胞内で互いに組換え、そして目的とする組換
え体をスクリーニングする。このスクリーニングは、例
えば適当なプローブによるハイブリダイゼーションか、
あるいは問題となっている領域の遺伝子産物に対する適
当な抗体を用いた免疫アッセイによる検知手段によって
行なわれる。相同遺伝子組換えが行なわれるためには、
ウイルスＤＮＡは複製されなければならない。現在のと
ころＮＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶのための細胞フリ
ーの複製系は知られていないが、もしそのような系が可
能となったら、本発明はそのような系で実施されよう。
複製および組換えが行なわれる環境は決定的なものでは
ない。
【０００９】免疫学的に利用可能なウイルス抗原をコー
ドすることに関与したＩＬＴＶおよびＨＶＴ領域は、適
当なベクター（例えばＨＶＴ、または伝染性上皮腫ウイ
ルス、細菌また菌類などのような他のベクター）に挿入
される。ウイルスベクターの場合（特にヘルペスウイル
スベクターおよび腸炎ウイルスベクター）、抗原をコー
ドしている配列（適当な配列（フランキング配列）が両
端にある）と、上記した適当な宿主細胞内にあるベクタ
ーゲノムとの間にそのような挿入がなされる。宿主にと
って内在（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）的なものであるプロ
モーターは、非対応（ウイルス抗原をコードする）配列
の対照遺伝子発現として用いられる。細菌および菌類の
場合、抗原をコードする配列はすでに知られている方法
またはこれから発見されるであろう方法によって挿入さ
れよう。サルモネラ菌の非毒性株をそのような宿主とし
て用いることが可能である。非対応配列は宿主ゲノムに
挿入されるか、または自律的に複製するプラスミドによ
って運ばれる。フランキング配列は、非対応配列が挿入
される少なからずすべての領域が含まれる。もし、すべ
ての領域が用いられるとしたら、その領域の配列は形質
転換されたベクターに残るであろう。しかし、そのよう
な領域には機能的な欠失が生ずる。もし、その領域の全
部ではなく一部をフランキング配列として用いた場合、
機能的な欠失と同様の構造的欠失が生ずるであろう。よ
って、ＩＴＬＶの欠失または挿入突然変異のそのような
構成は、ワクチンの改良につながる。一方、ＨＶＴ、鳥
類伝染性上皮腫ウイルスまたは他のベクターに組み込ま
れたＩＬＴＶの糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ）または他のＩＬＴＶタンパク質の発現は、効果的
なワクチンの製造を可能とする。
【００１０】ウイルスまたはベクターとしてＨＶＴ、Ｍ
ＤＶまたはＩＬＴＶを含むワクチンを合成するするため
に、ウイルスをニワトリ胚繊維芽細胞のような適当な細
胞内で増殖させる。この場合に用いる焙地は１９９培地
（ウエルカムまたはフローラボラトリーズ）のような標
準的な培養液を使用し、この培養液で３７℃、３ないし
４日間増殖させる。つぎに、細胞をトリプシン処理し、
１０％ジメチルスルホキシドと４％牛血清を含む培養液
に懸濁する。その後、細胞をアンプルに入れて密閉し、
そのアンプルを液体窒素保存する。通常、予防接種（ワ
クチン投与）は生後１日経過したニワトリのひよこに対
しておこなわれ、約１，０００プラーク形成単位を筋肉
注射することによってワクチン投与が実施される。この
後、数日で免疫ができる。本発明にもとづくワクチン
は、ＭＤＶに感染しやすい鳥（ｆｏｗｌ）、例えば商業
的に利用される鶏、七面鳥、あひる、がちょうなどの家
禽類を保護するために用いられるものである。以下、本
発明の好適な実施態様を添付した図を参照しながら実施
例にもとづいて説明する。
【００１１】実施例：一般的アプローチ バクテリオファージベクターＭ１３にクローン化された
鳥ヘルペスウイルスの短配列を選んで、それを興味ある
遺伝子全体が含まれていると考えられる長めの断片を同
定するためのプローブとして用いた。このような同定は
制限断片のサザンブロットハイブリダイゼーションによ
ってなされた。詳しくは、以下に説明する。ウイルスの
株 ＮＤＶの高い癌誘発性（ｈｉｇｈ ｏｎｃｏｇｅｎ
ｉｃ）を有するＲＢ１Ｂ株（Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．１１，５９３−６
０５，１９８２）を米国のコーネル大学Ｂ．カルネック
（Ｂ．Ｃａｌｎｅｋ）教授から入手した。このウイルス
の精製は、ニワトリ腎臓細胞の組織培養中においてプラ
ークを形成させることによって行なった。ニワトリＳＰ
ＦおよびＲＩＲ内で２度継代し、ひよこ胚繊維芽細胞
（ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｓ；ＣＥＦ）内で４回継代した。ニワトリの遺伝的抵抗
性Ｎ−系統株に接種した場合に生ずる悪性腫瘍によって
高い癌誘発性が示された。
【００１２】ウエルカムリサーチ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｃ
ｋｅｎｈａｍ，Ｋｅｗｎｔ）から得たＨＶＴのＦＣ１２
６株（Ｗｉｔｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．
Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３１，５２５−５３８、１９７０）
を、ＣＥＦ内で１４回継代した。つづいて我々の研究室
においてアヒル胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）およびＣＥＦ内
で増殖させた。そして、プラーク精製を行ない、さらに
ＣＥＦ内で増殖させた。本実施例のクローニングに用い
るウイルスＤＮＡは元の単離から数えて２４回の継代が
なされたウイルスから抽出した。組織培養 ＣＥＦは１
９９培養液（ウイエルカム社製）を含む回転ボトル中に
おいて培養された。なお、この培養液には、ペニシル
ン、ストレプトマイシン、ファンジゾン（Ｆｕｇｉｚｏ
ｎｅ）（レグド．テイー．エム；Ｒｅｇｄ．Ｔ．Ｍ）お
よび前記牛血清が添加されている（Ｒｏｓｓ，Ｌ．Ｊ．
Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２８，３７
−４７，１９７５）。ＣＫＣは１０ｃｍペトリ皿中で培
養した（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｉｇ
ｇｓ Ｐ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，２１５，５２８−５３
０，１９６７）。ＭＤＶ−ＤＮＡの単離 ＲＢＩＢ感染
細胞（ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＲＢ１Ｂ）を、
回転ボトルのＣＥＦからなる単層に、感染の程度が一細
胞あたり約０．００１プラーク形成単位（ｐｆｕ）とな
るようにして植つけて、３７℃で培養した。培養３日目
で、培養液を捨てて新しい培養液と交換した。交換され
た新しい培養液は、２％牛血清を含む１９９培養液であ
る。そして、ゾーン遠心法によって感染細胞の細胞質分
画からウイルスを単離した（Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａ
ｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５１，２４５−２５３，
１９８０）。ウイルスＤＮＡは、精製ウイルスをサルコ
シル、プロテナーゼＫおよびトリス緩衝液でもって一
晩、３７℃で処理し、それをグリセロール勾配でもって
ゾーン遠心（前掲、Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．ｅｔａｌ．）によ
って精製した。高分子量のウイルスＤＮＡをエタノール
によって沈澱させた後、１０ｍＭのトリス／ＩｍＭのＥ
ＤＴＡからなるＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。 ＩＬＴＶ−ＤＮＡの単離 （ａ）感染ＣＫＣを採集し、播種後２〜３日経過したＰ
ＢＳで洗った後にボルテックスルによる攪拌をおこな
い、氷冷ＴＥ感傷液に再懸濁した。非イオン性の界面活
性剤であるＮＰ４０（最終濃度１％）を添加して攪拌
し、氷うえで１５分間、インキュベートした。ＲＮアー
ゼ処理後、試料を２０００ｒ．ｐ．ｍ．５分間遠心し
た。遠心後、上清を採り、ＳＤＳ（最終濃度１％）およ
びプロテナーゼＫ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加え
て３７℃、３０分間、インキューベートした。この混合
物を２図のフェノール／クロロホルム処理、および１図
のクロロホルム処理をおこない、続いて、１／１０容量
の３Ｍ酢酸ナトリウムを含むエタノール処理することに
よってＤＮＡを沈澱させた。
【００１３】（ｂ）また、ウイルスＤＮＡを以下の方法
によりウイルス感染細胞の培養液化ら単離下。感染後２
〜３日目のそのウイルス感染細胞の培養駅を厚め、３０
００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、４℃の条件でベンチトップ
遠心機により遠心処理した。遠心後、上清を再び１９，
０００ｒ．ｐ．ｍ．の回転数により超遠心（ソーバル）
を４℃、１時間の条件でおこなった。この超遠心処理に
よって得られたウイルスペレットをＴＥ緩衝液に再懸濁
し、ＲＮアーゼンでＲＮＡの消化をおこなった。そし
て、既に述べたようにしてＳＤＳおよびプロテアーゼＫ
処理をおこなって、ウイルスをこわした。最後に破壊さ
れたウイルスから既に述べた方法によりＤＮＡを抽出し
た。ＭＤＶ−ＤＮＡのクローニング １μｇのＭＤＶを
制限酵素ＢａｍＨ１によって切断し、これをジフォスフ
ォリレートｐＵＣ１３ＤＮＡのＢａｍＨ１制限部位に連
結した。一方、使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴＧ
１株細胞を標準的方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０，１９８３）に
よって形質転換し、この形質転換細胞をアンピリシンお
よびＸ−ｇａｌ存在下で培養した。白いコロニーを採取
し、ニックトランスレーションされたＭＤＶ−ＤＮＡと
の雑種形成（ハイブリ代是−ション）によってその存在
またはＭＤＶ挿入部位について調べた（Ｃｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．Ｓ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，
３９６１，１９７５）た。陽性コロニーを小量で培養
し、そしてホルムス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．）および
クイグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．）の方法（Ｈｏｌｍ
ｅｓ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄＱｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．，Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４，１９３−２９７，１９８
１）によってプラスミドＤＮＡを単離した。挿入部位の
大きさは、組換えＤＮＡをＢａｍＨ１消化し、それをア
ガロース電気泳動することによって調べた。その結果、
１ないし１８キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも少ない塩基対
からなるＭＤＶ挿入部位を有するプラスミドが得られ
た。
【００１４】ＩＬＴＶ−ＤＮＡのクローニング ＩＬＴＶ−ＤＮＡのＥｃｏＲ１およびＢｇ１ＩＩライブ
ラリーを既に述べたようなｐＵＣＢに含まれるウイルス
ＤＮＡのクリーニング消化（ＣｌｏｎｉｎｇＤｉｇｅｒ
ｔｓ）によって得た。ウイルスＤＮＡのランダムシーク
エンシング ソニケーション処理したウイルスＤＮＡ断
片をジフォスフォリレートＭ１３．ｍｐ１０（アマーシ
ャムインターナショナルＰＬＣ）のＳｍａＩ制限部位に
クローン化し、ＭＤＶ挿入部位を含むプラークをＮＤＶ
−ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定
した。そして、その配列を３５Ｓ−ｄＡＴＰを用いたジ
デオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４，５４６３−５
４６７）によって同定した。同様な方法をＭＤＶ−ＤＮ
Ａのクローン化断片の配列決定に用いた。この場合、プ
ラークはｐＵＣ１３含有コロニーを避けるために標識さ
れた挿入部位とのハイブリダイゼーションによって決定
した。
【００１５】実施例１： ＭＤＶのｇＢ遺伝子 ＨＶＴのＭ１３クローンは、ＭＤＶのＢａｍＨ１断片１
３とハイブリダイズされたＨＳＶおよびＶＺＶのｇＢ遺
伝子に対して相同性を示す（第１図参照）。ＭＤＶのＲ
Ｂ１株のＢＢａｍＨ１ライブラリーから得たこの断片の
シークエンシングが示すことによれば、その遺伝子のＮ
Ｈ３末端から始まる１／３の部分がＩ３を含んでいた。
この遺伝子の残りの部分は、隣接する制限断片Ｋ３と同
定された。第１図は、２．６ｋｐの長さからなる遺伝子
の位置を示す地図である。その遺伝子から転写されたｍ
ＲＮＡの長さは２．６ｋｐと推測される。翻訳されたタ
ンパク質の長さはアミノ酸、８６５個に相当した（図２
０）。これはシグナル配列ドメインの部分を構成する約
２０のアミノ酸も含まれる。ＭＤＶ−ｇＢ遺伝子の初期
翻訳配列は他のヘルペスウイルスのｇＢ遺伝子と共通な
部分、例えばシステイン残基の列および脂質二重層を広
げることが可能な疎水性配列が存在する（Ｐｅｌｌｅ
ｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３，２４
３−２５３，１９８５）。しかし、ＭＤＶのｇＢ遺伝子
はＨＳＶのｇＢ遺伝子とたった４８％のアミノ酸配列の
相同性しか認められず、２３個のアミノ酸（１８５１−
１９２０残基、図２−１９）の挿入およびグリコシレー
ションによるエクストラ部位の存在など独特の姿を示
す。ＨＶＴのｇＢ（図２−１９）に該当する限定された
配列データ（７０２塩基）とＭＤＶのｇＢの配列とを比
較すると、これら２つの糖タンパク質に関して７６．９
％の核酸の相同性と８７．１％のアミノ酸の相同性とが
認められた。ＭＤＶのｇＢと比較してＨＶＴのｇＢにお
けるアミノ酸置換は、ウイルス中和に関連したＨＳＶの
ｇＢのドメインと等価な領域（１３２３−１４３３残
基）に特に集中した（前掲、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐ．Ｅ．ｅ
ｔ ａｌ．１９８５）。ＭＤＶおよびＨＶＴのｇＢ間に
おけるアミノ酸置換もまた、未知の機能に関連した他の
領域に集中された。
【００１６】実施例２： ＨＶＴのｇＨ遺伝子およびＭ
ＤＶのｇＨ遺伝子 ＨＳＶのｇＨ遺伝子に相同な配列を含むＨＶＴのＭ１３
クローンは、遺伝子同定およびマッピングに関するわれ
われの初期の研究において同定された（前掲、Ｂｕｃｋ
ｍａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８８）。このクローン
は、プローブとして用いた場合、ＨＶＴの６ｋｂからな
るＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリダイズ（雑種形成）す
る（図２０）。シークエンス（配列決定）によって、こ
の断片がカルボキシ末端を含むおよそ１／４のｇＨ遺伝
子を含むことが明らかになった。ｇＨ遺伝子の残りの部
分を有する隣接するＨｉｎｄＩＩＩ断片（３．２ｋｂ）
はＨｉｎｄＩＩＩ部位と重なり合うＨＶＴのクローン化
ＨｐａＩ断片とハイブリダイゼーションされた。第４図
は、ＨＶＴのｇＨ遺伝子の遺伝暗号領域（コード領域）
とフランキング配列とを示すものである。ＨＶＴのｇＨ
遺伝子と、ＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢＶに含まれるそ
の相同遺伝子との間におけるアミノ酸の同一性（％）
は、それぞれ２０、２４および２０であった（アミノ酸
が最大重なり合った数６３０、６４４および１５３から
それぞれ推定した）。
【００１７】実施例３： ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＭＤＶ
のＴＫ遺伝子 ＨＶＴのＴＫ遺伝子の全遺伝暗号領域（１０５３ｂｐ）
は、前記した３．２ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ断片
を含むものである（図２０）。遺伝子全体およびフラン
キング領域の配列は図２９−３８に示した。同様に、Ｍ
ＤＫのＴＫ遺伝子はＭＤＶの３．６ｋｂｐからなるＢａ
ｍＨ１Ｋ２断片を含むものである。ＭＤＫのＴＫ遺伝子
の完全な配列を図６３ に示した。ＭＤＶおよびＨＶ
ＴのＴＫ配列の比較空、２つの遺伝子は６０％のアミノ
酸の同一性を有することがわかった。これとは対照的
に、ＨＶＴのＴＫ遺伝子とＨＳＶ１、ＶＺＶおよびＥＢ
ＶのＴＫ遺伝子間の同一性はそれぞれたったの３０、２
７および２４％であった（アミノ酸が最大重なり合った
数３２０、３３２および１９３からそれぞれ推定し
た）。ＨＶＴおよびＭＤＶのＴＫ遺伝子から予想される
アミノ酸配列は、ジン酸化に関連したいくつかのウイル
スおよび真核生物のタンパク質のためのＡＴＰおよび
（または）ＣＴＰ結合部位の特徴を示した（Ｇｅｎｔｒ
ｙ，Ｇ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＡＳｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６８１５−６８１９）。これら
の保守的な配列は外来遺伝子の発現および挿入のための
好適な部位として、またＴＫ−欠失突然変異体を産生す
るのに好適である。
【００１８】実施例４：ＭＤＶ（ｇＰ５７−６５）（ｇ
Ｃ相同遺伝子）のＡ抗原遺伝子 Ａ抗原遺伝子は、ＨＳＶの相同遺伝子として同定された
ことからワクチンの開発にとって大変興味深い遺伝子で
あり、免疫源（主要グリコポリペプチド産物をコードす
る）として、また非必須領域として用いられる。このＡ
抗原遺伝子は、ＭＤＶのＢａｍＨ１Ｂ断片の中に置かれ
ており（Ｉｓｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ＭＤ
ＶのＧＡ株に関してはヌクレオチド配列が決定されてい
る（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌｉｃｅｒ，Ａｂ
ｓｔｒａｃｔ ＯＰ１８．５１，ＶＩＩ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ９−１４Ａｕｇｕｓｔ，（１９８７）Ｅｄｍｏｎ
ｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２３７
４−２３７９）。前記したランダムなシークエンス決定
に関する研究過程において、Ａ抗原遺伝子発現産物であ
るＭ１３クローン（Ｎｏ．１３０）を同定した。よっ
て、このクローンをＡ抗原を含むＭＤＶのＲＢ１Ｂ株か
ら得られた２．３ＫｂｐのＥｃｏＲ１／ＰｖｕＩＩ断片
を同定するのに用いた。そして、この断片を標準的な方
法により、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１によって裂かれたｐＵ
Ｃ１３ベクターにクローン化した。ＭＤＶのＲＢ１Ｂの
Ａ抗原の配列と予想されるアミノ酸配列とは図３９−４
４に示した。ＭＤＶおよびＨＶＴのＡ抗原領域は非必須
遺伝子であり、よってＭＤＶおよびＨＶＴ内の部位とし
て好適であり、その中に相同遺伝子組換えによって他の
遺伝子が挿入されよう。このことはいくつかの証拠から
支持される。それらの証拠を以下に示す。 （１）われわれの研究において、他のＲＢ１ＢのＡ抗原
が単離され、かつ配列決定された。これは３’からＡ抗
原ＡＴＧコドンまでのＴが４５塩基つらなった（Ｔ’ｓ
４５ ｂａｓｅｓ ３’ｔｏ ｔｈｅ Ａ ａｎｔｉ
ｇｅｎ ＡＴＧｃｏｄｏｎ）余分な（エクストラ）Ｔ残
基を有する。このエクストロラＴは遺伝子に機能的なＡ
抗原をコードさせるのを不可能にするようなフレームシ
フト変異を引き起こす。この遺伝子は複製ＭＤＶからク
ローン化可能であるので、その結果Ａ抗原はウイルスに
とって非必須的なものであることになる。 （２）同様な研究から、ＭＤＶのＡ抗原はＨＳＶのｇＣ
およびＰＲＶのｇｐＩＩＩ糖タンパク質と相同であるこ
とが明らかになった。これら２つの相同遺伝子は非必須
的なものと考えられている（ＨＳＶ相対体にとって、ロ
センタルらの文献：Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２４３８−２４４７を見よ。 （３）ＭＤＶの株であって寒天ゲル分散試験によってＡ
抗原が欠如していると判定された株（ｃｈｕｒｃｈｉｌ
ｌ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
４，５５７−５６４，１９６９）またはより感度の高い
２次元免疫沈降試験において低レベルの検出結果を示す
株が報告されている（Ｖａｎ Ｚａａｎｅ，Ｄ．ｅｔ
ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２１，１３３−１４６）。
さらに、Ａ抗原は主要な分泌糖タンパク質であり、Ａタ
ンパク質にある外来エピトープを示すための好適な場所
（ｌｏｃａｔｉｏｎ）であろう。これによって、Ａ抗原
遺伝子内にあるフレーム内のエピトープをコードしてい
るオリゴヌクレオチドをコードすることが可能であろ
う。
【００１９】ＨＶＴおよびＩＬＴＶベクターへ遺伝子を
導入するための戦略 ２つの可能性がある、すなわち、（１）ベクターの非必
須的遺伝子への挿入、（２）ベクターの該当する得電子
との置換。これは、ＭＤＶおよびＨＶＴのいくつかの遺
伝子間において実質的に相同な領域においてのみ可能で
ある。
【００２０】実施例５：ＨＶＴ，ＩＬＴＶまたはＭＤＶ
の非必須的遺伝子への挿入 （ａ）ベクターのＴＫ遺伝子座への挿入 （１）ＨＶＴ，ＩＬＴＶまたはＭＤＶは鳥ペルペスウイ
ルスの遺伝子の挿入および発現のためのベクターとして
用いられることが可能であろう。特にＭＤＶのＲＢ１Ｂ
株のｇＢ，ｇＣ，ｇＨまたはｇＣは、ＩＬＴＶに挿入さ
れる。また、ＩＬＴＶのｇＢおよびＤＳ−１７はＨＶＴ
またはＭＤＶに挿入される。これらは、挿入された遺伝
子と結合したプロモーター、非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏ
ｇｏｕｓ）プロモーター、或はこれらの異なるクラスに
ある遺伝子（例えば、ｇＢ遺伝子発現に好適な即時型初
期プロモーター）を用いるであろう。 （２）ＩＬＴＶは、鳥ペルペスウイルスの遺伝子とは無
関係な遺伝子を挿入および発現させるための一般的なベ
クターとして利用可能であり、また、最適な発現のため
のプロオモーターを操作する必要とする遺伝子の挿入に
用いられる方法は、ＨＳＶへの肝炎抗原の挿入に関する
既知の方法（前掲、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．１９８４）
に基づく。既に述べた方法に因って得られたＭＤＶおよ
びＨＶＴのＤＮＡは、ＤＮＡ抽出中にＤＮＡの切断が起
こらないような予防策を講じることによって、間宣誓を
そこなわず、ＤＮＡを保護することができる。ストウお
よびウイルキーの方法（前掲、Ｓｔｏｗ ＆Ｗｉｌｋｉ
ｅ Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３３，４７７，１９７
６）によって得られたウイルスＤＮＡのリン酸カルシウ
ム沈澱物をＣＥＦからなるサブコンフルエント（ｓｕｂ
−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な単層に添加した。１時間、３
７℃で吸着させた後、培養液を添加して細胞が密集した
状態（コンフルエントな状態）となるまで１〜２日間培
養した。コンフルエントな状態からなる１９９培地（ウ
エルカム）と、前記培養駅の一部を置き換えた（１：１
または２：１）。そして、プラークが形成されるまで、
３７℃で培養した。通常、このプラーク形成は４〜５日
後に見られるようになる。１μｇのＨＶＴ−ＤＮＡあた
り、約２００のプラークが得られ、また１μｇのＭＤＶ
−ＤＮＡあたり、約５０のプラークが得られるであろ
う。組換えウイルスの相同遺伝子組換えおよび単離のた
めに、目的とする遺伝子を前記したような１０：１ない
し２：１のＴＫまたはｇＣおよび野生型ウイルスと共形
質転換したような非必須的遺伝子へ、挿入する。或は、
完全な野生株を共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に
用いることが可能である。ＨＶＴのＦｃ−１２６株のＴ
Ｋ遺伝子への外来抗原遺伝子を挿入することに用いられ
る制限酵素は、ＢａｎＩＩ、Ｂｓｐ１２８６、ＤｒａＩ
ＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ
およびＮｓｐｂＩＩおよびＳｐｈＩである。これらの制
限酵素による切断（消化）部位は、ＴＫ遺伝子の発現を
妨害する外来ＤＮＡの挿入部位として用いられ、ＴＫ遺
伝子部分がこれらの酵素（またＥｃｏＫも利用可）の組
合せによる二重消化によって取り除かれて、不活性化さ
せる。これらの酵素のいくつかは、プラスミドベクター
に消化部位をもち、このような部位にウイルスＤＮＡ断
片がクローン化される。よって、ベクターを切断するこ
となしにクローン化されたＤＮＡを直線化するために制
限酵素による部分消化の手法が用いられよう。
【００２１】前記した酵素群には、フランキング遺伝子
活性を阻害するようなものは含まれておらず、ＨＳＶ−
１相同遺伝子がウイルスの増殖に重要な役割を果たす。
ウイールスの組換えは、「プラークリクフト（ｐｌａｑ
ｕｅｌｉｆｔｓ）」によって検知することが可能であ
る。このプラークリフトは、寒天培地にへばりついた感
染細胞と、放出されたウイルスとをニトロセルロースに
移すことによって、そのニトロセルロース上で、細胞か
らの変性ＤＮＡと、ウイルスとをハイブリダイゼーショ
ンするもので、細胞のＤＮＡはヴィラレアル５の文献
（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ １９６，１８３−１８５，１９７７）に記載された
好適なプローブとする。プローブと雑種形成されたウイ
ルスは、単層培養回収できる。同様の方法が目的とする
エプトープを発現する組換えウイルスを単離することに
用いることが可能である。例えば、「プラークリフト」
に用いられるニトロセルロースに抗体処理をほどこし、
つづいて結合したフォスファターゼまたは標識プロテイ
ンあのような適当な検知システムを用いることによっ
て、この結合した抗体の存在を検出することができる。
そして、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（前掲、
Ｒｏｓｓ，Ｎ．１９８５） （Ｓｃｈａｔ，Ｋ．Ａ．ｅ
ｔ．ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４，
１５９−２７０，１９８４）またはＦＭＡＵを含む培地
で増殖させることによってＴＫ−ウイルスを選別する。
適当なプロモーターをもつ遺伝子をまず最初にクローン
化ＴＫ遺伝子（図４５−５５）に挿入する。次に、この
組換えＤＮＡをひよこ胚繊維芽細胞または、ニワトリ腎
臓細胞中にベクターの感染ＤＮＡと同時トランスフェク
ション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる。こ
の戦略の主な利点は、前記選別方法が目的とする遺伝子
を含むウイルスの組換え体を得るチャンスを増大させる
ことである。また、最適な発現に適したプロモーターの
選択が可能となることである。よって、即時型プロモー
ターの利用は、潜伏性（ｌａｔｅｎｔｌｙ）感染細胞に
おける発現を可能とする。（ｂ）ベクターのｇＣ遺伝子
座における挿入、Ａ抗原ＣＨＳＶのｇＣ遺伝子ＨＶＴお
よびＭＤＶ相同遺伝子）は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）お
よびガラス器内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系（ｇＣに関する
セッション参照）でのウイルス増殖にとって必須なもの
ではないので、その部分は外来遺伝子の挿入および発現
のための好適な部位となるであろう。さらに、Ａ抗原
は、豊富にある抗原の一つであり、また分泌されるもの
であることから、外来タンパク質の免疫特性を強化する
ことに利用できる。このＡ抗原遺伝子座におけるウイル
ス組換え体の単離は目的とする遺伝子の少なくとも一部
がｇＣ遺伝子にあるクレームにまず挿入され、そして間
宣誓ウイルスＤＮＡとともに形質転換されることによっ
て達成される。配列特異的プローブまたは特異的抗体に
よるウイルスプラークのスクリーニングは、組換え体の
単離を可能とする。
【００２２】実施例６：ＨＶＴにおけるＩＬＴＶ遺伝子
とその相同遺伝子との置換 実施例５に示した方法によって、置換はクローン化され
たＩＬＴＶ配列と感染性ＨＶＴ−ＤＮＡとの同時トラン
スフェクションによって達成される。ＩＬＴＶから誘導
された遺伝子をＨＶＴのそれに対応するものと置換する
ことが効果的であろう。ＩＬＴＶ配列とエピトープとを
発現する組換え体は、ＩＬＴＶ特異的モノクローン抗体
または、既に述べたユニークＩＬＴＶ配列に対する抗ペ
プチド抗体を用いることによって検出できる。この方法
の利点は、プロモーターの操作を必要としないことと、
相対的に単純な方法から成るということである。しか
し、相同な部分を持つ遺伝子に限定される。
【００２３】実施例７：ＩＬＴＶのＴＫ−突然変異体を
得るための戦略欠失突然変異 欠失を遺伝子のどの場所にでも生じさせることが可能で
ある。例えば、ＡＴＰおよびＣＴＰ結合部位をリン酸化
するような酵素としての機能に必要な遺伝子のドメンに
対してである。これは、制限酵素による二重消化（ｄｏ
ｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって達成される。
ここで用いられる制限酵素は、ＳｎａＢ１またはＢｃ１
Ｉである。二重消化後、適当な断片を再結合させ、つづ
いて、ウイルスＤＮＡとの同時トランスフェクションま
たは、ウイルス感染細胞へのトランスフェクションを実
施する。制限酵素の選択などによる図４５−５５、図５
６およびプラスミドｐＩＬＢｇの地図（図６７）を参照
してもらいたい。ＴＫ−ウイルスはアシクロビル（ａｃ
ｕｃｌｏｖｉｒ）（前掲、Ｒｏｓｓ，Ｎ．１９８５）ま
たは、ＦＭＡＵ（前掲、Ｓｃｈａｔ，Ｋ．ａ．ｅｔ ａ
ｌ．１９８４）の存在下よって、ハイブリダイゼーショ
ンによって、プラーク精製クーロンにおけるＫ遺伝子の
欠失う部位の不存在に関して調べた。ＩＬＴＶの欠失う
突然変異対それ自体をワクチン合成のための弱毒化ウイ
ルスとして用いること、また挿入されたヘテロな抗原遺
伝子配列をもつものとして用いることが可能である。挿入突然変異 ヘルペスウイルスプロモーターまたは他
の適当な配列なたはシグナル塩基による調整下にある機
能的β−ガラクトリダーゼ遺伝子は、ＴＫ活性によって
重要なＴＫ遺伝子のドメインにまず誘導される。そし
て、組換え体ＤＮＡは間宣誓ウイルスだＮと共形質転換
するか、もしくはウイルス感染細胞にトランスフェクシ
ョンして、相同遺伝子組換えをおこす。アセロビルまた
はＦＭＡＵ存在下における選別はＴＫ−挿入突然変異体
を生じさせるであろう。もし、β−ガラクトリダーゼが
導入されたとしたら、突然変異体はＸ−ｇａｌ存在下で
青い色のプラークが生じることによって検出される。必
要に応じてＴＫ遺伝子とそれを囲む配列を他の適当なベ
クターにサブクローン化することができる。
【００２４】実施例８：ＨＶＴへのＭＤＶのＲＢＩＢ株
に存在するｇＤ遺伝子の挿入 （本発明の範囲に囲まれないが、類似の方法を示す）Ｈ
ＶＴのＴＫ遺伝子をプラスミドベクターｐＵＣＢにフロ
ー化し、ｐＴＫ１Ｂと呼ばれるプラスミドを作る。この
プラスミドを、例えばＴＫ遺伝子のみをもつプラスミド
を切断する制限エンドヌクレアーゼＲｓｒＩＩ（図２９
−３８のヌクレオチド配置１９７，酵素認識部位（ＧＧ
ＡＣＣＧ）によって直線化する。これによって、「粘着
性（ｓｔｉｃｋｙ）」端末が生じ、この生じた端末を通
常の方法（参考文献：″Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙＭａｎｕａｌ″，
ｅｄ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．
Ｆ．，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８
２）によつて修復する。ＲＢ１ＢのｇＢ 遺伝子を独自
に２つのプラスミド上にクーロン化し、それぞれＲＢ１
Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｉ３およびＲＢ１Ｂ−ＢａｍＨ１−Ｋ
３と命名した。一つのプラスミド上にある完全な複製ｇ
Ｂ遺伝子を生じさせる為に、両方のプラスミドをＢａｍ
Ｈ１で切断し、そして切断を連結（レゲーション）し
た。目的通りに作られた組換え体をプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析によって同定した。しかし、前記したよう
に、完全なｇＢ配列は実質的にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで
切断し、両端を修復してそのプラスミドを前記のように
合成されたＰＴＫ１Ｂにクローン化した。また、ＭＤＶ
のｇＢオープンリーディングフレームは、ＨｉｎｃＩＩ
およびＮａｅＩによる消化によって、プラスミドＭＳＢ
２７から切り出され、部分的にＨｐａＩによって切断さ
れたＨＶＴのＴＫプラスミドｐＴＫ１Ｂに連絡される。
ＴＫとｇＢの両配列を含む組換え体プラスミドはハイブ
リダイゼーションによって同定され、さらにサザンブロ
ットによって分析される。そして、組換え体プラスミド
はＨＶＴウイルス（ウイルスＤＮＡ）を含む細胞に誘導
され、ＴＫ遺伝子へｇＢ遺伝子を誘導することにようる
相同遺伝子組換えがおこなわれる。ＪＶＴウイルス組換
え体はアシクロビルまたはＦＭＡＵによって選別され、
或は標識ｇＢプローブによって検出される。
【００２５】実施例９：ＨＶＴに挿入されるＲＢ１Ｂの
ｇＣ（ＣＡ抗原）遺伝子 末端が鈍くなった（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）ＰＴＫ１
Ｂを実施例８に示されるようにして合成した。ＲＢ１Ｂ
のｇＣ遺伝子を制限エンドヌクレマーゼＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ（ｐｕＣ１３ポリリンカーに含まれる
部位）によって、プラスミドｐＭＢ４１９（実施例４）
から切断した。これによって生じた粘着性末端を標準的
なプロトコールに基づいて再び修復した。末端を修復さ
れたｇＣ断片を実施例８に示したようにして直線化され
た末端修復ｐＴＫ１Ｂにクローン化した（クローニング
は、制限酵素による獲られるクローンの分析放射性同位
元素標識断片によるプロービング、またはＤＮＡセーク
エンシング、または、これらの組合せによって変化に富
んだものである。） ＨＶＴの中にクローン化されたＲＢ１ＢのｇＣ遺伝子を
もつプラスミドを、リン酸カルシウムによる沈澱または
エレクトロポレーション（電気穿孔）によってＨＶＴ−
感染細胞にトランスフェクションさせた。ｇＣ遺伝子の
両端をクロスオーバー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）させた
ＨＶＴウイルスとＨＶＴのＴＫプラスミドのフランキン
グ配列との間の相同遺伝子組換えは、ＲＢ１ＢのｇＣ遺
伝子をＨＶＴウイルスゲノムへ運ぶ。ウイルス組換え体
は前記のようにして、ＴＫ−として選別され、またはプ
ロービングによって同定される。類似の方法として、既
に述べられ、かつ図に示された並列情報は、それらの遺
伝子などをここで開示したＩＬＴＶの非必須的ゲノムに
挿入するためのクローニング戦略を提供するために用い
られるものであり、またはＩＬＴＶ中の抗原遺伝子を作
るために利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよび
ＴＫ遺伝子の位置を示すＭＤＶの地図である。
【図２】第２図は、ＭＤＶのＲＢ１Ｂ株に存在するｇＢ
遺伝子のヌクレオチド配列を示すもので、ＭＤＶの各ヌ
クレオチドに添えられた番号が記されている。ＨＶＴの
ｇＢ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド配列のところ
には下線が引かれている。相同性は垂直の棒によって示
されている。そして、ＭＤＶのｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇ
Ｂ遺伝子と間のアミノ酸の違いは線の上の線によって示
されている。
【図３】図２の続きである。
【図４】図２の続きである。
【図５】図２の続きである。
【図６】図２の続きである。
【図７】図２の続きである。
【図８】図２の続きである。
【図９】図２の続きである。
【図１０】図２の続きである。
【図１１】図２の続きである。
【図１２】図２の続きである。
【図１３】図２の続きである。
【図１４】図２の続きである。
【図１５】図２の続きである。
【図１６】図２の続きである。
【図１７】図２の続きである。
【図１８】図２の続きである。
【図１９】図２の続きである。
【図２０】第３図は、ｇＨ（破線）、ＴＫ（黒塗）およ
び主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の
位置を示すもので、またそれぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位
をＨで表わしている。
【図２１】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【手続補正書】
【提出日】平成１１年３月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ヌクレオチド配列であって、前記配列は
前記配列と結合した野生株ウイルス内において前記配列
に隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグル
ープから選ばれることによって成り立つ： （ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
（ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
（ｃ）ＨＳＶのｇＨ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、ま
たはその273-320または867-926の部分、（ｄ）ＩＬＴＶ
のＴＫ遺伝子、（ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＩＬ
ＴＶの遺伝子、（ｆ）ＩＬＴＶのＯＲＦ２、（ｇ）ＩＬ
ＴＶのＯＲＦ３、および（ｈ）ＩＬＴＶのリボヌクレオ
チド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、（ｉ）ＨＴＶ
のリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝
子、（ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（小サブ
ユニット）遺伝子、（ｋ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還
元酵素（大サブユニット）遺伝子、（ｌ）ＨＳＶ−Ｉの
即時型初期遺伝子ＩＥ−６８と相同なＨＶＴの遺伝子、
そして（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−１７
５と相同なＨＶＴの遺伝子。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年６月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢａｍＨ１部位の分布とｇＢおよびＴＫ遺伝子
の位置を表すＭＤＶの地図である。
【図２】ＭＤＶのＲＢ１Ｂ株に存在するｇＢ遺伝子のヌ
クレオチド配列を示し、ＭＤＶの各ヌクレオチドに添え
られた番号が記されている。ＨＶＴのｇＢ遺伝子に該当
する部分のヌクレオチド配列のところには下線が引かれ
ている。相同性は垂直の棒により示されている。ＭＤＶ
のｇＢ遺伝子とＨＶＴのｇＢ遺伝子との間のアミノ酸の
違いは文字列の上の線によって示されている。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】図５の続きである。
【図７】図６の続きである。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】図１０の続きである。
【図１２】図１１の続きである。
【図１３】図１２の続きである。
【図１４】図１３の続きである。
【図１５】図１４の続きである。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】図１６の続きである。
【図１８】図１７の続きである。
【図１９】図１８の続きである。
【図２０】ｇＨ（破線）、ＴＫ（黒塗）および主キャプ
シドタンパク質（ＭＣＰ、点）の各遺伝子の位置を示
す。それぞれのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＨで表す。
【図２１】ＨＶＴのｇＨ遺伝子に該当するヌクレオチド
配列のほぼ全体を示す。その配列に対応するアミノ酸配
列を線上に示す。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】図２７の続きである。
【図２９】ＨＶＴのＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。ＨＶＴの各ヌクレオチドに添えられた番号が記され
る。ＭＤＶのＴＫ遺伝子に該当する部分のヌクレオチド
配列には下線が引かれる。相同性は垂直の棒によって示
される。ＭＤＶのＴＫ遺伝子とＨＶＴのＴＫ遺伝子と間
のアミノ酸の違いは文字列の上の線によって示される。
【図３０】図２９の続きである。
【図３１】図３０の続きである。
【図３２】図３１の続きである。
【図３３】図３２の続きである。
【図３４】図３３の続きである。
【図３５】図３４の続きである。
【図３６】図３５の続きである。
【図３７】図３６の続きである。
【図３８】図３７の続きである。
【図３９】ＭＤＶのＲＢＩＢ株に存在するｇＣ遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す。また、その配列に対応するア
ミノ酸配列を文字列の上側に示した。
【図４０】図３９の続きである。
【図４１】図４０の続きである。
【図４２】図４１の続きである。
【図４３】図４２の続きである。
【図４４】図４３の続きである。
【図４５】ＴＫ遺伝子クラスターを含むＩＬＴＶゲノム
の５４００塩基対からなるヌクレオチドおよび予想され
るアミノ酸配列を示す。メインのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）産物のための予想されたアミノ酸配
列は、ヌクレオチド配列の下にアルファベットの頭文字
で表した。また、アミノ酸配列の上に位置するヌクレオ
チド配列が、それぞれのアミノ酸に対応するコドンを示
す。更に、ＴＡＴＡボックスの位置は下線で示した。Ｏ
ＲＦ４はＩＬＴのＴＫ遺伝子配列である。
【図４６】図４５の続きである。
【図４７】図４６の続きである。
【図４８】図４７の続きである。
【図４９】図４８の続きである。
【図５０】図４９の続きである。
【図５１】図５０の続きである。
【図５２】図５１の続きである。
【図５３】図５２の続きである。
【図５４】図５３の続きである。
【図５５】図５４の続きである。
【図５６】ＩＬＴＶのＴＫ含有部分における遺伝子の配
列を示す。ＩＬＴＶＤＮＡを生じさせるＥｃｏＲ１（ｐ
ＩＬＥｃ１）およびＢａ１ＩＩ（ｐＩＬＢｇ２）部位を
含み、かつオーバーラップされたｐＵＣ１３プラスミド
クローンが示される。オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）は矢印によって示された転写方向をもつオー
プンボックスとして示される。
【図５７】ＩＬＴＶのｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列の
部分を示す。
【図５８】ＩＬＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サ
ブユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す。
【図５９】ＶＺＶ６２／ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５遺伝
子のＨＶＴ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示
す。
【図６０】ＨＶＴのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
ユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す。
【図６１】ＭＤＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
ユニット）遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す。
【図６２】図６１の続きである。
【図６３】リボヌクレオチド還元酵素（小サブユニッ
ト）遺伝子のＭＤＶ相同遺伝子のヌクレオチド配列の部
分を示す。
【図６４】ＨＳＶ−１のＩＥ−１７５遺伝子のＭＤＶ相
同遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す。
【図６５】ＨＳＶ−１のＩＥ−６８遺伝子のＭＤＶ相同
遺伝子のヌクレオチド配列の部分を示す。
【図６６】ウイルスゲノムの非必須領域と、プラスミド
ベクターにクローン化されたＤＮＡの相同領域との相同
遺伝子組換えを示す。
【図６７】プラスミドｐＩＬＢｇ２の地図であり、この
地図は制限部位とＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３およびＯＲＦ５
の位置とを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/03 Ｃ０７Ｋ 14/03 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 (72)発明者 ロッス，ルイース ジョセフ ノーマン イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー （番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド内 (72)発明者 スコット，サイモン デビッド イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー （番地なし） インステイチュート フ ォア アニマル ヘルス リミテッド内 (72)発明者 ビンズ，マシュー マッキンリー イギリス国 ＰＥ17 ２ＤＡ ハンティン ドン ホートン ホートン ラボラトリー （番地なし）インスティチュート フォア アニマル ヘルス リミテッド内

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヌクレオチド配列であって、前記配列は前
    記配列と結合した野生株ウイルス内において前記配列に
    隣接する配列は含まれず、また前記配列は以下のグルー
    プから選ばれることによって成り立つ： （ａ）ＨＳＶのｇＢ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
    （ｂ）ＨＳＶのｇＣ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、
    （ｃ）ＨＳＶのｇＨ遺伝子と相同なＨＶＴの遺伝子、ま
    たはその２７３−３２０または８６７−９２６の部分、
    （ｄ）ＩＬＴＶのＴＫ遺伝子、（ｅ）ＨＳＶのｇＢ遺伝
    子と相同なＩＬＴＶの遺伝子、（ｆ）ＩＬＴＶのＯＲＦ
    ２、（ｇ）ＩＬＴＶのＯＲＦ３、および（ｈ）ＩＬＴＶ
    のリボヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝
    子、（ｉ）ＨＴＶのリボヌクレオチド還元酵素（大サブ
    ユニット）遺伝子、（ｊ）ＭＤＶのリボヌクレオチド還
    元酵素（小サブユニット）遺伝子、（ｋ）ＭＤＶのリボ
    ヌクレオチド還元酵素（大サブユニット）遺伝子、
    （ｌ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初期遺伝子ＩＥ−６８と相同
    なＨＶＴの遺伝子、そして（ｍ）ＨＳＶ−Ｉの即時型初
    期遺伝子ＩＥ−１７５と相同なＨＶＴの遺伝子。
  2. 【請求項２】請求の範囲第１項記載にもとづく配列であ
    って、前記配列は遺伝暗号部分と（または）、前記配列
    の少なくとも５’もしくは３’側の非遺伝暗号部分とに
    よって構成さることを特徴とする。
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項または第２項（ｃ配列を
    除く）記載にもとづく配列と適当な宿主で複製可能なＤ
    ＮＡとを含むことを特徴とするプラスミドベクター。
  4. 【請求項４】請求の範囲第３項記載にもとづくプラスミ
    ドベクターであって、前記ベクターはＭＤＶ−、ＨＶＴ
    −、またはＩＬＴＶ−感受性細胞に適当なベクターであ
    ることを特徴とする。
  5. 【請求項５】ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴの挿入また
    は欠失突然変異体であって以下の特徴を有する：、 （ｉ）ＨＶＴの場合、ＨＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域
    の突然変異またはＴＫ遺伝子のリボヌクレオチド還元酵
    素遺伝子の突然変異であり、（ｉｉ）ＭＤＶの場合、Ｈ
    ＳＶのｇＣ遺伝子に相同な領域の突然変異またはリボヌ
    クレオチド還元酵素遺伝子（小サブユニット）の突然変
    異またはリボヌクレオチド還元酵素遺伝子（大サブユニ
    ット）の突然変異であり、また（ｉｉｉ）ＩＬＴＶの場
    合、ＴＫ遺伝子、ＯＲＦ３またはリボヌクレオチド還元
    酵素遺伝子（大サブユニット）の突然変異である。
  6. 【請求項６】請求の範囲第５項記載の突然変異体ウイル
    スであって、非必須的部分の遺伝子は前記突然変異の領
    域に挿入まれることを特徴とする。
  7. 【請求項７】請求の範囲第６項記載の突然変異体ウイル
    スであって、前記相同な遺伝子は抗原、またはＨＶＴ、
    ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤ、ニューキャッスル
    病もしくはエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）と結合した前
    記抗原の部分をコードすることを特徴とする。
  8. 【請求項８】請求の範囲第１項記載のＨＶＴのｇＨ遺伝
    子の部分のいずれか一つによってコードされたことを特
    徴とするペプチド。
  9. 【請求項９】請求の範囲第５項記載にもとづく突然変異
    体を調製するための方法であって、前記方法は、 （ｉ）（ａ）前記領域の欠失または挿入突然変異体コピ
    ーと、（ｂ）ＭＤＶ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶから得ら
    れた全ウイルスＤＮＡまたは全ＨＶＴ、ＭＤＶまたはＩ
    ＬＴＶウイルスのいずれか一方と相同遺伝子組換えを行
    なうこと、そして（ｉｉ）組換え体ウイルスを単離する
    ことからなる。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第１１項記載の方法であっ
    て、前記（ｉ）において前記突然変異体コピーと、全ウ
    イルスＤＮＡまたは全ウイルスのいずれか一方とを適当
    な細胞に導入するもので、また前記細胞内に取り込また
    前記ＤＮＡの複製過程中に前記組換えが起こることを特
    徴とする。
  11. 【請求項１１】請求の範囲第５項記載にもとづく突然変
    異体ＩＬＴウイルスとＩＬＴＶ感受性細胞とを含むワク
    チンであって、前記ウイルスは少なくとも前記突然変異
    の結果により弱毒化されていることを特徴とする。
  12. 【請求項１２】請求の範囲第５項、第６項、または第７
    項記載にもとづく突然体と、感受性細胞とを含み、ＭＤ
    Ｖ、ＨＶＴ、またはＩＬＴＶに対して効果的であること
    を特徴とするワクチン。
  13. 【請求項１３】ＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤに対して
    効果的な種痘ベクターであって、前記ベクターは家禽内
    で複製可能な微生物を含むもので、前記微生物は配列
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｌ）また
    は（ｍ）のいずれか一つまたは複数にもとづいた異種で
    複製可能なＤＮＡを含むＩＬＴＶまたはＨＶＴベクター
    を有することを特徴とする。
  14. 【請求項１４】キャリアメジウムと請求の範囲第１３項
    記載にもとづくベクターとからなることを特徴とするワ
    クチン。
  15. 【請求項１５】請求の範囲第１４項記載にもとづくワク
    チンであって、前記キャリアメジウムはＩＬＴＶ−、Ｈ
    ＶＴ−、またはＭＤＶ−感受性細胞を含むもので、また
    前記ベクターはＩＬＴＶ、ＨＶＴ、またはＭＤＶである
    ことを特徴とする。
  16. 【請求項１６】病気治療のための家禽への種痘方法であ
    って、前記方法は前記家禽に、請求の範囲第１１項、第
    １２項、第１４項、および第１５項のいずれか一項記載
    の非毒性免疫量のワクチンを接種をすることを特徴とす
    る。
  17. 【請求項１７】請求の範囲第１６項記載にもとづく方法
    によって種痘されたことを特徴とする家禽。
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