DE68929544T2 - Virale Vakzine - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft virale Impfstoffe, welche verwendet werden können, um eine Immunität gegen eine Erkrankung vorzusehen, und Nucleotidsequenzen zur Einbeziehung in die Viren solcher Impfstoffe.
  • Hintergrund und Beschreibung des Stands der Technik
  • Herpesviren sind große doppelsträngige DNA-Viren, welche aus einem ikosaedrischen Capsid bestehen, das von einer Hülle umgeben ist. Die Gruppe wurde auf Basis der Genomstruktur und der biologischen Eigenschaften als Alpha-, Beta- und Gamma-Herpesviren klassifiziert [Roizman B. et al., Intervirology 16 (1981), 201–217]. Geflügel-Herpesviren umfassen das Marek Virus (MDV) (ein Gamma-Herpesvirus), das bei Hühnern eine Lymphomerkrankung von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung hervorruft [zusammengefaßt in Payne L.N. (Hrsg.), Marek's Disease (1985), Martinus Nijhoff Publishing, Boston], und das Infektiöse Laryngotracheitis-Virus (ILTV) (ein Alpha-Herpesvirus), welches eine akute Infektion der oberen Atemwege bei Hühnern hervorruft, die in Sterblichkeit und einer Abnahme der Eierproduktion resultiert.
  • Eine jüngste unerwartete Entdeckung im Labor der hier genannten Anmelder ist, dass eine ausreichende Aminosäurehomologie zwischen MDV, ILTV und Säuger-Herpesviren, insbesondere dem Varicella zoster-Virus (VZV) und dem Herpes simplex-Virus (HSV), besteht, was die Identifizierung zahlreicher konservierter Gene erlaubt. Diese umfassen die MDV- und die Truthahn-Herpesvirus (HVT)-Homologe der Glykoproteine gB, gC und gH von HSV; die ILTV-, MDV- und HVT-Homologe von TK- und Ribonucleotidreduktase-Genen und das ILTV-Homolog von gB und den Genen 34 und 35 von VZV [Buckmaster A. et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 2033–2042].
  • Die Stämme von MDV wurden in drei Serotypen eingeteilt. Typ 1 umfaßt pathogene Stämme und ihre attenuierten Abkömmlinge. Typ 2 ist eine Gruppe von natürlich vorkommenden, nicht-pathogenen Stämmen, und Typ 3 ist HVT. Während mehr als einem Jahrzehnt war die Impfung mit HVT bei der Bekämpfung der Marek Krankheit, außerordentlich wirksam. Jedoch wurden in den letzten Jahren neue Stämme von MDV isoliert, die trotz der Impfung mit HVT eine Erkrankung hervorrufen. Verluste infolge dieser "sehr virulenten" Stämme traten in Teilen der USA, Europa und im Nahen Osten auf. Obwohl der Schutzgrad durch die Verwendung einer Mischung von HVT, Typ 2-MDV und attenuierten Abkömmlingen von sehr virulenten Stämmen zur Impfung verbessert werden kann, waren die Ergebnisse unberechenbar. Aus diesen Beobachtungen und der Tatsache, dass es MDV-typspezifische Epitope gibt, die bei HVT oder dem Typ 2-MDV nicht vorkommen, folgerten die Anmelder, dass verbesserte Impfstoffe hergestellt werden könnten, welche antigenisch mehr mit MDV verwandt sind als gegenwärtige Impfstoffe [beschrieben von Ross und Biggs in Goldman J.M. und Epstein M.A. (Hrsg.), Leukaemia and Lymphoma Research, Vaccine Intervention Against Virus-Induced Tumour (1986), Macmillan, 13–31].
  • Für eine Reihe von Herpesvirus-Antigenen wurde gezeigt, dass sie eine schutzgewährende Immunität verleihen, wenn sie in einem rekombinanten Vaccinia-Virus exprimiert werden. Diese umfassen das gB-Gen von HSV [Cantin E.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5908–5912], gD von HSV [Paoletti E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. (1984), 193–197] und gp50 des Pseudorabiesvirus (PRV), ein Homolog von HSV-gD [Marchioli C.C. et al., J. Virol. 61 (1987), 3977–3981]. Infolge der absoluten Erfordernis von gB für die Viruspenetration und -infektiosität und da es unter Herpesviren konserviert ist, sind gB und dessen Homologe wichtige Immungene. Es wurde außerdem gezeigt, dass die Anwesenheit von gB auf der Oberfläche von infizierten Zellen ein wichtiges Zielmolekül für humorale und zellvermittelte Immunantworten darstellt [Blacklaws B.A. et al., J. Gen. Virol. 68 (1987),1103–1114; McLaughlin-Taylor E. et al., J. Gen. Virol. 69 (1988),1731–1734]. Das vor kurzem beschriebene Glycoprotein gH von HSV ist für die Infektiösität ebenfalls notwendig und kann auch ein wichtiges Immunogen sein [Desai P.J. et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 1147–1156]. Es wurde auch gezeigt, dass glll des Pseudorabiesvirus (PRV), ein Homolog von gC, ein wichtiges Zielmolekül für neutralisierende Antikörper und für cytotoxische T-Zellen ist, obwohl es ein nicht-essentielles Protein ist. Ebenfalls von Interesse ist die unerwartete Beteiligung von sehr frühen Proteinen an T-Zellen-vermittelten, cytotoxischen Reaktionen in mit dem Cytomegalievirus (CMV) infizierten Zellen [Kozinowski U.H. et al., J. Virol. 61 (1987), 2054–2058]. Ähnliche Antigene könnten bei der Abstoßung von latent infizierten und transformierten Lymphocyten bei der Marek Krankheit eine wichtige Rolle spielen, da sehr frühe RNA-Transkripte in Tumoren bei der aus Marek-Krankheit etablierten lymphoblastoiden Zellinien nachgewiesen wurden.
  • Obwohl viele rekombinante Impfstoffe unter Verwendung des Pockenvirus Vaccinia als Vektor hergestellt wurden, gibt es auch Berichte über die Verwendung von Herpesviren als Vektoren für die Expression von fremden Genen. So wurde das Hepatitis-Antigen in HSV exprimiert [Shih M.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. (1984), 5867–5870], und der Plasminogenaktivator aus menschlichem Gewebe wurde in PRV exprimiert [Thomsen D.R. et al., Gene 57 (1987), 261–265]. In beiden Fällen wurden fremde Gene in clonierte Fragmente von nicht essentiellen Herpes-Genen inseriert, die danach in den Virusvektor durch homologe Rekombination eingebracht wurden. Das Hepatitisvirus-Gen wurde mit einem Herpesvirus-Promotor fusioniert, und die rekombinante DNA wurde in das TK-Gen von HSV inseriert. Eine homologe Rekombination nach Cotransfektion der rekombinanten DNA und der Wildtyp-HSV-DNA ergab TK–-Virusclone, welche das Hepatitis-Antigen exprimierten.
  • Im Falle von PRV wurde die gX-Gen-Kartierung in US als Stelle zur Insertion des fremden Gens verwendet. Die angewandte Strategie umfaßte die Insertion des TK-Gens von HSV in das gX-Gen einer PRV-Mutante, die bezüglich ihres TK-Gens einen Defekt aufwies, der in einem TK-positiven Virus resultierte. Das Plasminogenaktivator-Gen aus menschlichem Gewebe wurde dann in ein cloniertes Fragment von HSV-TK inseriert, und die Rekombinante wurde in die PRV-Mutante durch homologe Rekombination eingebracht. Das TK–-Virus, welches das menschliche Gen exprimierte, wurde selektiert [Thomsen et al., vgl. vorstehend]. In ähnlicher Weise wurde VZV als Vektor verwendet [Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 3896–3900]. Für mehrere Herpesvirus-Gene wurde ebenfalls gezeigt, dass sie mit Virulenz verbunden und für die invitro-Vermehrung nicht erforderlich sind. Diese umfassen die TK-Gene von HSV [Jamieson A.T. et al., J. Gen. Virol. 24 (1974), 465–480; Field H. und Wildy P., J. Hygiene (Cambridge) 81 (1987), 267–277] und von PRV. In der Tat war seit langem bekannt, dass es einfach ist, PRV durch die Deletion der TK-Aktivität abzuschwächen [Tatarov G. Zentralbl. Vet. Med. 15B (1968), 848–853]. Außerdem wurde die Abschwächung des Bartha-Stamms von PRV auf einen Defekt in gl zurückgeführt, ein nicht-essentielles Strukturgycoprotein, welches in US kartiert wurde [Mettenleiter T. et al., J. Virol. 61 (1987), 4030–4032].
  • Gene einer HSV-Kartierung im Bereich der internen Wiederholung (TRS), welche die lange einzigartige Sequenz flankieren, wurden ebenfalls mit Pathogenität in Verbindung gebracht [Rosen A. et al., Virus Research 5 (1986), 157–175; Thompson R.L. et al., Virology 131 (1983), 180–192]. Für mehrere zusätzliche Gene von HSV wurde gezeigt, dass sie für eine in-vitro-Vermehrung nicht wesentich sind, obgleich nicht bekannt ist, ob sie mit Virulenz verbunden sind. Diese umfassen UL24 [Sanders P.G., J. Gen. Virol. 63 (1982), 277–295], die große Untereinheit der Ribonucleotidreduktase [Goldstein D.J. und Weller S.K., J. Virol. 62 (1988), 196–205], gC [Draper K.G. et al., J. Virol. 51 (1984), 578–585], dUTPase [Fisher F.B. & Preston V.G., Virology 148 (1986), 190–197] und UL-55 und UL-56 [MacLean A.R. & Brown S.M., J. Gen. Virol. 68 (1987), 1339–1350].
  • Außerdem gibt es Hinweise, dass mehrere Gene einer HSV-Kartierung in US für eine in-vitro-Vermehrung ebenfalls nicht essentiell sind [Weber P.C. et al., Science 236 (1987), 576–579].
  • Die WO 88/07088 (veröffentlicht erst am 22. September 1988) offenbart virale Hybridvektoren, die auf HVT oder MDV basieren und ein Gen von Interesse an einer nicht-essentiellen Stelle wie den TK-Bereich oder den Protein A codierenden Bereich einschließen. Protein A scheint in diesem Zusammenhang gC zu entsprechen, wie von Velicer und Coussens offenbart wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht eine Nucleotidsequenz vor, welche im Wesentlichen frei von den Sequenzen ist, mit denen sie in dem Wildtypvirus, das mit der Sequenz assoziierten verbunden wäre, wobei die Sequenz gewählt ist aus der Gruppe, umfassend:
    • (a) das MDV-Homolog des HSV-gB-Gens,
    • (b) das MDV-Homolog des HSV-gH-Gens,
    • (c) das TK-Gen von MDV,
    • (d) das MDV-Homolog des sehr frühen Gens IE-175 von HSV-1,
    • (e) das MDV-Homolog des sehr frühen Gens IE-68 von HSV-1,
    • (f) das MDV-Homolog des HSV-gD-Gens und geringfügige Variationen davon.
  • Außerdem können die TK-Sequenz von HVT, nachstehend zuweilen bezeichnet als Sequenz (x), und das MDV-Analog von HSV-gC, nachstehend zuweilen bezeichnet als Sequenz (y), und geringfügige Variationen von beiden, als Insertionsstellen für bestimmte heterologe Sequenzen oder als Deletionsstellen verwendet werden, um weniger virulente Viren zu erhalten, wobei sie aber an sich nicht neu sind.
  • Jede der Sequenzen (a) bis (f), (x) und (y) kann mit weiteren Elementen wie geeigneten Stopp- und Startsignalen und anderen nicht-codierenden [5'- und 3'-] Sequenzen, einschließlich Promotoren, verbunden sein, welche die Expression der Sequenz ermöglichen. Solche weiteren Elemente können jene sein, die mit der Sequenz in ihrem natürlich vorkommenden Zustand verbunden sind, oder können zu dieser Sequenz heterolog sein.
  • Insbesondere kann der Promotor einer sein, der mit einer der obigen Sequenzen (d) und (f) verbunden ist.
  • Der Begriff "geringfügige Variationen hiervon" soll Veränderungen in der Nucleotidsequenz einschließen, die deren essentiellen Charakter nicht beeinflussen, zum Beispiel gegenseitige geringfügige Substitutionen von Nucleotiden. Im Falle von Sequenzen, die zur Insertion in einen. Vektor gedacht sind, um ein Antigen zu codieren, bezieht sich der "essentielle Charakter der Sequenz" auf das codierte Protein oder Glycoprotein. Konservative Austausche in der Nucleotidsequenz, welche das gleiche Antigen hervorrufen, sind nachdrücklich eingeschlossen, ebenso wie Austausche, die konservative Änderungen in der Aminosäuresequenz hervorrufen, welche den Antigencharakter des Antigens nicht ungünstig beeinflussen, insbesondere können antigene Teile der Antigensequenzen alleine verwendet werden, zum Beispiel die Bereiche, die den Nucleotiden 816–863, 1377–1595, 1377–1630 oder 1824–1985 von MDV-gB oder den Nucleotiden 483–633, 843–933 oder 1203–1278 von MDV-gC entsprechen, und geringfügige Variationen hiervon. Diese Sequenzen und die von ihnen codierten Peptide formen einen weiteren Aspekt der Erfindung. Im Falle einer Sequenz, die eine Insertionsstelle ist, ist es nur erforderlich, dass die Sequenz für die Infektiosität und die Replikation des Virus nicht essentiell ist und dass sie eine hinreichende Homologie zu der definierten Sequenz aufweist, um eine Rekombination zu ermöglichen. Folglich könnte eine Insertion des Nucleotids in die Sequenz den sich von da an stromabwärts anschließenden Leserahmen vollkommen verändern. Im Falle einer Antigen-codierenden Sequenz würde dies üblicherweise die Aminosäuresequenz unerwünschterweise verändern (abhängig davon, wo die Leserahmenverschiebung erfolgt), aber im Falle einer Insertionsstelle bliebe der Homologiegrad praktisch gleich, so dass eine Rekombination fast genauso leicht erfolgen kann.
  • Allgemein ausgedrückt, wird die Sequenz an einer Insertionsstelle, falls eine Nucleotidhomologie von mindestens 75% vorhanden ist, als eine "geringfügige Variation" angesehen. Vorzugsweise ist die Sequenz zu mindestens 80, 85, 90, 95 oder 99% homolog. Man ist sich bewusst, dass sich solche Homologiegrade im Wesentlichen auf den gesamten Teil einer jeden der vorstehend definierten Sequenzen (a) bis (f) und (x) beziehen. Kürzere Sequenzen können als Sonden bei der Identifizierung oder der Isolierung solcher längerer Sequenzen verwendet werden, aber in diesem Falle muss der Homologiegrad im Allgemeinen größer sein, um eine fehlerfreie Hybridisierung sicherzustellen.
  • So sieht ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung Untersequenzen von mindestens 13 Nucleotiden mit mindestens 90% (vorzugsweise 95%, 99% oder 100%) Homologie zu mindestens einem Teil von einer der obigen Sequenzen (a) bis (f), (x) und (y) vor.
  • In der obigen Liste sind die Sequenzen (a), (b) sowie (d) bis (f) als Antigen-exprimierende Sequenzen nützlich, und die Sequenzen (y) ist als Insertionsstelle für heterologe Sequenzen nützlich. Die Sequenz (c) ist zur Deletion nützlich, um TK–-Mutanten vorzusehen.
  • Die Sequenzen können leicht aus natürlich vorkommenden HVT- und MDV-Viren unter Ver- bzw. Anwendung der hier angegebenen Sequenzinformationen und Standardverfahren isoliert werden, dazu gehört beispielsweise die Herstellung von Oligonucleotidsonden und deren Verwendung zur Hybridisierung mit natürlich vorkommender DNA.
  • Die von den obigen Sequenzen (a), (b) und (f) codierten isolierten Polypeptide sind neu und bilden einen weiteren Gesichtspunkt der Erfindung, neben weiteren geringfügigen Variationen davon und beliebigen glycosylierten Formen davon, die aus der Expression der genannten Sequenzen in MDV-empfänglichen Zellen resultieren.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt, stellt die Erfindung MDV-Mutanten bereit, welche bezüglich des TK-Gens Insertions- oder Deletionsmutanten sind.
  • Die Mutation kann in den codierenden oder nicht-codierenden Sequenzen des identifizierten Bereichs erfolgen.
  • Ein MDV-Antigen exprimierendes Gen kann aus einem virulenten Stamm von MDV isoliert und in den TK-Bereich eines weniger virulenten Stamms von MDV inseriert werden; diese Insertion würde ein neues "Virus" ergeben, wenn sie kein natürlich vorkommendes Virus ergibt.
  • Andere heterologe Antigen-codierende Sequenzen sowie zum Beispiel eine MDV-Antigen-codierende Sequenz können eingeschlossen sein.
  • Die heterologe Sequenz kann alternativ eine Sequenz sein, die ein Antigen codiert, welches mit einer der folgenden Krankheiten verbunden ist: Vogel-Encephalomyelitis (epidemischer Tremor), Vogelgrippe (Geflügelpest), Vogel-Leukose, von atypischer Geflügelpest verschiedene Vogel-Paramyxoviren (PMV2 bis PMV7), Vogel-Reoviruserkrankungen (Darmerkrankung, Tenosynovitis), Geflügelanämie (hervorgerufen durch ein Geflügelanämieagens), Coccidiose, Eierverlust-Syndrom (EDS76), Geflügelpocken, infektiöse Bronchitis, infektiöse Bursalerkrankungen (Gumboro), Einschlußkörper-Hepatitis (Adenovirus), lymphoproliferative Erkrankung von Truthähnen, atypische Geflügelpest, Reticuloendotheliose bei Hühnern, Reticuloendotheliose bei Truthähnen, Rotavirus-Enteritis, hämorrhagische Enteritis bei Truthähnen und Rhinotracheitis bei Truthähnen. Die Sequenz kann alternativ Paramyosin (ein Muskelprotein, welches allen nicht-Wirbeltierparasiten gemeinsam ist) oder einen antigenen Teil davon, Somatostatin oder einen wachstumsfördernden Teil davon oder einen Immunregulator codieren.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren stellen außerdem einen multivalenten Impfschutz bereit.
  • Die mutierten Viren sind möglicherweise als attenuierte Viren in Impfstoffen nützlich, ohne notwendigerweise eine inserierte heterologe Sequenz aufzuweisen.
  • Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Deletions- oder Insertionsmutanten gemäß dem 2. Aspekt umfasst einfach das Einbringen, zum Beispiel durch Cotransfektion, einer Deletions- oder Insertionsmutante des TK-Bereichs und entweder der gesamten viralen DNA oder eines ganzen Virus (zum Beispiel des Wildtypvirus) in eine geeignete Zelle. Es wurde festgestellt, dass die bloße DNA solcher Viren infektiös ist, mit der Maßgabe, dass sie nicht geschert wurde. Ein Calciumphosphatpräzipitat der DNA ist im Allgemeinen vorteilhaft. Geeignete Zellen umfassen Hühnerembryofibroblasten, Hühnernierenzellen und Entenembryofibroblasten, die alle vorzugsweise in subkonfluenten einzelligen Schichten in Petrischalen gezüchtet werden. Die transfizierte DNA und die gesamte virale DNA wird dann in den infizierten Zellen durch homologe Rekombination miteinander rekombinieren, und die gewünschten Rekombinanten können zum Beispiel durch den Nachweis einer Hybridisierung mit geeigneten Sonden oder durch einen Immuntest unter Verwendung von geeigneten Antikörpern gegen das Genprodukt des in Frage kommenden Bereichs durchmustert werden.
  • Damit eine homologe Rekombination erfolgen kann, muss sich die virale DNA replizieren. Gegenwärtig ist kein zellfreies Replikationssystem für MDV bekannt. Falls jedoch ein solches System zugänglich wird, dann könnte das erfindungsgemäße Verfahren darin durchgeführt werden. Die Umgebung, in der die Replikation und die Rekombination erfolgen, ist nicht entscheidend.
  • Die Bereiche (a), (b) und (d) bis (f), für die oben nachgewiesen wurde, dass sie für die Codierung von immunologisch nützlichen viralen Antigenen verantwortlich sind, können in geeignete Vektoren zum Beispiel in HVT oder andere Vektoren, wie das Geflügelpockenvirus, in Bakterien oder Pilze inseriert werden. Im Falle von viralen Vektoren, insbesondere von Herpesvirusvektoren und Pockenvirusvektoren, kann eine solche Insertion durch die Rekombination zwischen der Antigen-codierenden Sequenz, die von geeigneten nicht-essentiellen Sequenzen flankiert wird, und dem Genom des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle ausgeführt werden, wie oben beschrieben. Wenn der Vektor HVT ist, ist der Promotor üblicherweise ein HVT- oder MDV-Vektor. Wenn der Vektor ein Geflügelpockenvirus oder ein anderes Virus ist, ist der Promotor üblicherweise ein Promotor, welcher in dem Vektor endogen ist. Im Falle von Bakterien und Pilzen kann die Antigen-codierende Sequenz unter Anwendung von bekannten oder noch zu entdeckenden Verfahren der DNA-Manipulierung inseriert werden. Ein nicht-pathogener Stamm von Salmonella kann als ein solcher Wirt verwendet werden. Die heterologe Sequenz kann in das Genom des Wirtes inseriert werden oder kann auf einem unabhängig replizierenden Plasmid getragen werden. Ein Promotor, der in dem Wirt vorkommt, wird üblicherweise verwendet, um die Expression der heterologen (das virale Antigen codierenden) Sequenz zu steuern.
  • Die verwendeten flankierenden Sequenzen können den ganzen, praktisch den ganzen oder weniger als den Bereich umfassen, in den die heterologe Sequenz inseriert werden soll. Falls der ganze Bereich verwendet wird, dann liegt die Sequenz dieses Bereichs eindeutig noch in dem so erhaltenen Virus vor, aber die Funktion dieses Bereichs ist deletiert. Falls weniger als der ganze Bereich als flankierende Sequenzen verwendet wird, dann ist das Ergebnis eine strukturelle sowie funktionelle Deletion. Jeder dieser Ansätze kann verwendet werden.
  • Folglich können drei Strategien für die Konstruktion von verbesserten Marek-Krankheit Impfstoffen in Betracht gezogen werden: (1) die Konstruktion eines rekombinanten HVT, das ausgewählte MDV-Gene exprimiert; (2) die Konstruktion von Deletions- oder Insertionsmutanten von sehr virulenten Stämmen von MDV, welche abgeschwächt und daher zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind; und (3) die Konstruktion von rekombinanten Viren, welche MDV-Proteine in anderen Vektoren wie dem Geflügelpockenvirus exprimieren.
  • Zur Herstellung eines Impfstoffs, in dem HVT oder MDV das Virus oder der Vektor ist, wird das Virus in geeigneten Zellen wie Hühnerembryofibroblasten in einem Standardkulturmedium wie 199-Medium (Wellcome oder Flow Laboratories) während 3 bis 4 Tagen bei etwa 37°C vermehrt. Die Zellen werden durch die Behandlung mit Trypsin geerntet und vor der Lagerung in flüssigem Stickstoff in versiegelten Ampullen in Medium, enthaltend 10% Dimethylsulfoxid und 4% Kälberserum, suspendiert.
  • Zur Impfung werden üblicherweise Tage alte Küken intramuskulär etwa 1000 Plaque-bildende Einheiten injiziert. Die Immunität folgt innerhalb weniger Tage.
  • Es sollte angemerkt werden, dass MDV und HVT zellassoziierte Viren sind und nur infektiös sind, wenn sie in Zellen vorliegen. Folglich umfaßt ein auf solchen Viren basierender Impfstoff immer geeignete infizierte Zellen.
  • Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können verwendet werden, um Geflügel zu schützen, das für MDV anfällig ist, einschließlich kommerziell gezüchtetem Geflügel, wie Hühner, Truthähne, Enten und Wachteln.
  • Die bevorzugten Aspekte der Erfindung werden nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
  • 1 eine Karte des MDV-Genoms ist, die zum Teil die BamHI-Stellenverteilung und die Lage der gB- und TK-Gene zeigt;
  • 2 (auf 18 Blättern) die Nucleotidsequenz des gB-Gens des RB1B-Stamms von MDV zeigt, wobei sich die Nummerierung auf die MDV-Nucleotide bezieht, die Sequenz eines Teils des HVT-gB-Gens unterhalb der Linie gezeigt ist, Homologien durch vertikale Balken angegeben sind und Aminosäureunterschiede zwischen MDV-gB und HVT-gB oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 3 eine Karte des HVT-Genoms ist, welche die Positionen der gH- (gestrichelt), TK- (schwarz) und Haupt-Capsidprotein- (MCP, gestrichelt) Gene zeigt, wobei HindIII-Stellen als "H" gezeigt sind;
  • 4 (auf 8 Blättern) die Nucleotidsequenz des größten Teils des HVT-gBGens zeigt, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz oberhalb der Linie gezeigt ist:
  • 5 (auf 10 Blättern) die Nucleotidsequenz des HVT-TK-Gens zeigt, wobei sich die Nummerierung auf die HVT-Nucleotide bezieht, die Sequenz eines Teils des MDV-TK-Gens unterhalb der Linie gezeigt ist, Homologien durch vertikale Balken angegeben sind und Aminosäureunterschiede zwischen MDV-TK und HVT-TK oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 6 (auf 6 Blättern) die Nucleotidsequenz des gC-Gens des RB1B-Stamms von MDV zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zelle gezeigt sind;
  • 7 einen Teil der Nucleotidsequenz des HVT-Homologs des VZV62/HSV-1-IE-175-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 8 einen Teil der Nucleotidsequenz des HVT-Ribonucleotidreduktase (große Untereinheit)-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 9 (auf 2 Blättern) einen Teil der Nucleotidsequenz des MDV-Ribonucleotidreduktase (große Untereinheit)-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 10 einen Teil der Nucleotidsequenz des MDV-Ribonucleotidreduktase (kleine Untereinheit)-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 11 einen Teil der Nucleotidsequenz des MDV-Homologs des HSV-1-IE-175-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 12 einen Teil des MDV-Homologs des HSV-1-1E-68-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt sind;
  • 13 eine schematische Darstellung einer homologen Rekombination in einem nicht-essentiellen Bereich eines viralen Genoms und einem homologen Bereich einer DNA, die in einen Plasmidvektor cloniert wurde, ist;
  • 14 (auf 27 Blättern) die 4 und 5 ergänzt und die Nucleotid- und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von dem Bereich zeigt, der die MDV- und HVT-TK- und -gH- und die flankierenden Gene enthält. Die in Klammern gesetzten MDV-Aminosäuresequenzen sind jene, welche möglicherweise von diesem Nucleotidsequenzbereich codiert werden, falls das stromaufwärts angeordnete ATG-Triplett die wirkliche Geninitiationsstelle war. Sternchen kennzeichnen Stoppcodons. Zur Optimierung der Alignments wurden in die Sequenzen Zwischenräume eingefügt. Doppelpunkte zwischen den MDV- und HVT-DNA-Sequenzen geben Nucleotide an, die zwischen den zwei Viren konserviert sind. Die MDV-Aminosäuren sind nur in Positionen gezeigt, wo sie sich von denen in HVT unterscheiden, und
  • 15 zeigt die Nucleotid-Teilsequenz des MDV-Homologs von HSV-gD, in der die vorausgesagten Aminosäuren oberhalb der MDV-Nucleotidsequenz gezeigt sind und in Fettschrift dargestellte Reste zwischen dem MDV- und dem HSV-1-gD-Bereich konserviert sind.
  • Beispiele: Allgemeine Ansätze
  • Ausgewählte kurze Sequenzen der Vogel-Herpesviren, die in dem Bacteriophagenvektor M13 cloniert worden waren, wurden als Sonden zur Identifizierung längerer Fragmente verwendet, die möglicherweise die ganzen Gene von Interesse enthalten. Dies wurde durch eine Southem-Blot-Hybridisierung von Restriktionsfragmenten durchgeführt. Genaue Einzelheiten werden nachstehend angegeben.
  • Virusstämme
  • Der "sehr onkogene" Stamm RB1 B von MDV [Schat K.A. et al., Avian Pathol. 11 (1982), 593–605] wurde von Professor B. Calnek, Comell University, Ithaca, USA, erhalten. Das erhaltene Virus wurde in Hühnernierenzellen in Gewebekultur plaquegereinigt. Es wurde zwei Passagen in SPF-RIR-Hühnern und vier Passagen in Hühnerembryofibroblasten (CEF) unterworfen. Sein "sehr onkogener" Charakter wurde durch eine große Häufigkeit von makroskopischen Tumoren gezeigt, wenn es in genetisch resistente N-Linien-Hühner überimpft wurde. Der FC126-Stamm von HVT [Witter R.L. et al., Am. J. Vet. Res. 31 (1970), 525–538], der von den Wellcome Research Laboratories, Beckenharm, Kent, erhalten wurde, wurde 14 Passagen in CEF unterworfen. Er wurde anschließend in Entenembryofibroblasten (DEF) und CEF im Labor der Anmelder vermehrt. Er wurde dann plaquegereinigt und in CEF weiter vermehrt. Die zur Clonierung in der vorliegenden Arbeit verwendete virale DNA wurde aus einem Virus extrahiert, das 29 Passagen seit der ursprünglichen Isolierung unterworfen worden war.
  • Gewebekultur
  • CEF wurden in Rollerflaschen in 199-Medium (Wellcome), supplementiert mit Penicillin, Streptomycin, Fungizone (eingetragenes Warenzeichen) und Kälberserum, gezüchtet, wie bereits beschrieben [Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 28 (1975), 37–47].
  • CKC wurden in 10 cm-Petrischalen gezüchtet [Churchill A.E. und Biggs P.M., Nature 215 (1967), 528–530].
  • Isolierung von MDV-DNA
  • Der zellassoziierte Stamm RB1B wurde auf konfluente einzellige Schichten von CEF in Rollerflaschen in einer Infektionsmultiplizität von etwa 0,001 Plaquebildenden Einheiten (PBE) pro Zelle überimpft, und die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert. Nach 3 Tagen wurde das Medium entfernt und durch frisches 199-Medium, enthaltend 2% Kälberserum, ersetzt. Die Zellen wurden zur Virusreinigung nach 2 bis 3 Tagen geerntet, wenn die cytopathische Wirkung umfangreich war. Das Virus wurde durch eine Zonenzentrifugation ("rate-zonal centrifugation") der Cytoplasmafraktion von infizierten Zellen erhalten [Lee Y.S. et al., J. Gen. Virol. 51 (1980), 245–253]. Die virale DNA wurde durch Behandlung des gereinigten Virus mit Sarcosyl, Proteinase K und Tris-Puffer, pH 9, über Nacht bei 37°C extrahiert und durch eine Zonenzentrifugation in Glyceringradienten, wie bereits beschrieben [Lee et al., 1980], gereinigt. Hochmolekulargewichtige virale DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 10 mM Tris, pH 7,5, in 1 mM EDTA (TE) resuspendiert.
  • Clonierung von MDV-DNA
  • 1 μg MDV-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und mit BamHI-gespaltener, dephosphorylierter pUC13-DNA (Pharmacia) ligiert. Kompetente Zellen des E. coli-Stamms TG1 wurden gemäß Standardverfahren transformiert [Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557–580] und in Anwesenheit von Ampicillin und X-Gal gezüchtet. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und auf die Gegenwart von MDV-Insertionen durch Hybridisierung mit nicktranslatierter MDV-DNA getestet [Grunstein M. und Hogness D.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 3961]. Positive Kolonien wurden in einem kleinen Volumen gezüchtet, und die Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren von Holmes D.S. und Quigley M. [Anal. Biochem. 114 (1981), 193–297] isoliert. Die Größe der Insertionen wurde durch Elektrophorese von BamHI-Spaltprodukten der rekombinanten DNA in Agarosegelen bestimmt. Es wurden Plasmide erhalten, die MDV-Insertionen im Bereich von weniger als 1 bis 18 Kbp enthielten.
  • Zufallssequenzierung viraler DNA
  • Beschallte Fragmente viraler DNA wurden in SmaI-gespaltenes, dephosphoryliertes M13.mp10 (Amersham International PLC) cloniert, und MDV-Insertionen enthaltende Plaques wurden durch Hybridisierung mit MDV-DNA identifiziert. Die Sequenz wurde durch das Didesoxyverfahren [Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467] unter Verwendung von 35S-dATP bestimmt.
  • Das gleiche Verfahren wurde angewendet, um clonierte Fragmente von MDV-DNA zu sequenzieren, außer dass Plaques durch Hybridisierung mit der markierten Insertion identifiziert wurden, um Kolonien zu vermeiden, die pUC13-Fragmente enthalten.
  • Beispiel 1: gB-Gen von MDV
  • Ein M13-Clon eines HVT-Homologs zu dem gB-Gen von VZV und HSV hybridisierte mit dem BamHI-Fragment 13 von MDV (vgl. 1). Die Sequenzierung dieses aus einer BamHI-Bank des RB1B-Stamms von MDV erhaltenen Fragments zeigte, dass zwei Drittel des Gens, beginnend mit dem NH2-Terminus, in 13 enthalten waren. Der Rest des Gens wurde in dem benachbarten Restriktionsfragment K3 identifiziert. 1 zeigt die Kartenposition des Gens, das 2,6 Kbp lang ist. Seine RNA wurde auf etwa 2,8 Kb geschätzt. Das translatierte Protein ist 865 Aminosäuren lang (2). Es umfasst etwa 20 Aminosäuren, die Teil einer Signalsequenzdomäne sein können. Die translatierte Primärsequenz von MDV-gB hat einige wenige Merkmale gemein mit gB von anderen Herpesviren, wie die Anordnung von Cysteinresten und die Anwesenheit von hydrophoben Sequenzen, die vermutlich in der Lage sind, eine Lipiddoppelschicht zu durchspannen [Pellet P.E. et al., J. Virol. 53 (1985), 243–253]. Jedoch weist das MDV-gB nur eine 48%-ige Aminosäureübereinstimmung mit gB von HSV auf und hat viele einzigartige Merkmale, wie die Insertion von 23 Aminosäureresten (Reste 1851–1920, 2) und das Vorhandensein von zusätzlichen Stellen mit Glycosylierungspotential. Der Vergleich der Sequenz von MDV-gB mit begrenzten Sequenzdaten (702 Basen), die für HVT-gB (2) erhältlich sind, zeigte eine Nucleinsäureübereinstimmung von 76,9% und eine Aminosäureübereinstimmung von 87,1 % zwischen diesen zwei Glycoproteinen. Aminosäuresubstitutionen in HVT-gB waren im Vergleich zu MDV-gB in einem Bereich (Reste 1323–1433) besonders ausgeprägt, der einer mit Virusneutralisation assoziierten Domäne von HSV-gB entsprach [Pellet P.E. et al. (1985), wie vorstehend]. Aminosäuresubstitutionen zwischen MDV- und HVT-gB wurden auch in anderen Bereichen unbekannter Funktion bemerkt.
  • Beispiel 2: gH-Gen von HVT und gH-Gen von MDV
  • Ein M13-Clon von HVT, der Sequenzen enthielt, die dem HSV-gH homolog waren, wurde während unserer früheren Arbeit zur Genidentifizierung und -kartierung isoliert (Buckmaster et al. (1988) wie vorstehend). Dieser Clon, bei Verwendung als Sonde, hybridisierte mit einem 6-Kbp langen HindIII-Fragment von HVT (3). Die Sequenzierung zeigte, dass dieses Fragment ungefähr ein Viertel des gH-Gens, einschließlich des Carboxy-Terminus, enthielt. Das benachbarte HindIII-Fragment (3,2 Kbp), das den Rest des gH-Gens enthielt, wurde durch Hybridisierung unter Verwendung eines clonierten HpaI-Fragments von HVT, das mit der HindIII-Stelle überlappte, identifiziert. 4 zeigt die Sequenz des codierenden Bereichs des gH-Gens von HVT (2,3 Kbp) und die flankierenden Sequenzen. Die Aminosäureidentität von dem gH-Gen von HVT und seinem Homolog in HSV1, VZV und EBV betrug lediglich 20, 24 bzw. 20% (geschätzt auf der Basis der maximierten Aminosäureüberschneidungen von 630, 644 bzw. 153).
  • Beispiel 3: TK-Gen von HVT und TK-Gen von MDV
  • Der gesamte codierende Bereich des TK-Gens von HVT (1053 bp) war im oben beschriebenen 3,2 Kbp langen HindIII-Fragment enthalten (3). Die Sequenz des vollständigen Gens und der flankierenden Bereiche ist in 5 gezeigt. In ähnlicher Weise ist das gesamte MDV-TK-Gen innerhalb des 3,6 Kbp langen BamHI-K2-Fragments von MDV enthalten (1). Die vollständige Sequenz des MDV-TK-Gens ist in 14 gezeigt. Ein Vergleich der TK-Sequenzen von MDV und HVT zeigt, dass die beiden Gene eine 60%ige Aminosäurenidentität aufweisen. Im Gegensatz dazu liegen die prozentualen Aminosäureidentitäten von dem TK-Gen von HVT und den TK-Genen von HSV 1, VZV und EBV bei lediglich 30, 27 bzw. 24 Prozent (geschätzt von den Aminosäureüberschneidungen von 320, 332 bzw. 193). Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von HVT- und MDV-TK zeigen charakteristische ATP- und/oder CTP-Bindungsstellenmotive, die für eine Reihe von Virus- und eukaryontischen Proteinen beschrieben sind, die mit Phosphorylierung verbunden sind (Gentry G.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 6815–6819). Diese konservierten Sequenzen sind Beispiele für nützliche Stellen für die Insertion und Expression von fremden Genen und zur Herstellung von TK–-Deletionsmutanten.
  • Beispiel 4: A-Antigen-Gen von MDV (gP57-65) (gC-Homolog)
  • Das A-Antigen-Gen ist für die Impfstoffherstellung sowohl als Immunogen (es codiert ein wichtiges Glycopolypeptid-Produkt) von Interesse, auch weil wir es als Homolog des HSV-gC, einem potentiell nicht-essentiellen Bereich, identifiziert haben. Das A-Antigen-Gen wurde innerhalb des BamH1 B-Fragments von MDV kartiert (Isfort et al. 1987), und es wurde die Nucleotidsequenz für den GA-Stamm von MDV bestimmt (Coussens und Velicer, Abstract OP18.51, VII International Congress of Virology, 9.-14. August 1987, Edmonton, Canada; J. Virol. 62, 2373–2379). Während der früher beschriebenen Zufallssequenzierungsstudien (Buckmaster et al., 1988) identifizierten wir einen M13-Clon (Nr. 130), der von dem A-Antigen-Gen stammte. Dieser Clon wurde dann zur Identifizierung eines 2,3 Kbp langen EcoR1/PvuII-Fragments von dem RB1B-Stamm von MDV verwendet, der das A-Antigen enthält. Dieses Fragment wurde nach Standardprotokollen in einen mit SmaI/EcoR1 gespaltenen pUC13-Vektor cloniert. Ein Plasmid (pMB419) wurde mit dem M13-Didesoxynucleotid-Verfahren sequenziert. Die Sequenz des MDV-RB1B-A-Antigens und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Proteins sind in 6 dargestellt. Die A-Antigen-Bereiche von MDV und HVT sind nicht-essentielle Gene und können daher als Stellen in MDV und HVT dienen, in die andere Gene durch homologe Rekombination in das Virus inseriert werden können. Wie unten ausgeführt, wird das von verschiedenen Beweisführungen gestützt.
    • 1) Während unserer Studie isolierten und sequenzierten wir einen anderen RB1 B-A-Antigen-Clon. Dieser wies einen zusätzlichen T-Rest im Strang der 45 T-Basen, 3' zum A-Antigen-ATG-Codon auf. Dieses zusätzliche T eine Rahmenverschiebung würde verursachen, die es dem Gen unmöglich machen würde, funktionales A-Antigen zu codieren. Da es wahrscheinlich ist, dass dieses Gen von einem replizierenden MDV cloniert wurde, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das A-Antigen für den Virus nicht essentiell ist.
    • 2) Bei der Durchführung einer Ähnlichkeitsrecherche wurde es klar, dass das MDV-A-Antigen-Gen das Homologe der HSV-gC- und PRV-gpIII-Glycoproteine ist. Von diesen beiden homologen Genen ist bekannt, dass sie nicht essentiell sind [für das HSV-Homolog, siehe Rosenthal et al., J. Virol. 61 (1987), 2438–2447].
    • 3) Es wurde von Stämmen von MDV berichtet, die gemäß dem Agar-Gel-Diffusions-Test [Churchill A.E. et al., J. Gen. Virol. 4 (1969) 557–564] kein A-Antigen aufwiesen oder geringe Mengen produzierten, wenn die empfindlichere 2D-Radio-Immunopräzipitation verwendet wurde (van Zaane D. et al., Virology 121 (1982), 133–146).
  • Außerdem, da das A-Antigen ein wichtiges sekretiertes Glycoprotein ist, könnte es eine besonders geeignete Stelle für die Präsentation von fremden Epitopen innerhalb des A-Antigens als lösliche, sekretierte Glycoproteine, darstellen. Dies kann durch die Clonierung von Oligonucleotiden erreicht werden, die diese Epitope im Rahmen innerhalb des A-Antigen-Gens codieren.
  • Strategien zum Einbringen von Genen in HVT-Vektoren
  • Zwei Möglichkeiten können in Betracht gezogen werden: 1) die Insertion in nicht-essentielle Gene des Vektors; oder 2) die Substitution fremder Gene für das entsprechende Gen des Vektors. Dies wäre nur in Bereichen möglich, die bereits eine deutliche Homologie aufweisen, wie es zwischen einigen Genen von MDV und HVT der Fall sein kann.
  • Beispiel 5: Insertion in nicht-essentielle Gene von HVT oder MDV
  • (a) Insertion in den TK-Locus des Vektors.
    • 1) HVT oder MDV können als Vektoren zur Insertion und Expression von Vogel-Herpesvirus-Genen verwendet werden. Insbesondere kann gB, gH oder gC von RB1B-MDV in HVT inseriert werden. Man kann den mit dem inserierten Gen assoziierten Promotor oder heterologe Promotoren verwenden, einschließlich solcher einer anderen Klasse von Genen (zum Beispiel den sehr frühen Promotor, um die Expression von gB zu optimieren).
    • 2) HVT oder MDV können als allgemeine Vektoren für die Insertion und Expression von Genen verwendet werden, welche mit Vogel-Herpesviren nicht verwandt sind und wahrscheinlich eine Manipulation der Promotoren zur optimalen Expression erforderlich machen.
  • Das zur Geninsertion anzuwendende Verfahren entspricht im Wesentlichen dem zuvor für die Insertion eines Hepatitis-Antigens in HSV beschriebenen [Shih et a1., 1984, wie vorstehend).
  • Die MDV- und HVT-DNA, welche, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, ist infektiös, mit der Maßgabe, dass Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, die DNA während der Extraktion nicht zu scheren. Calciumphosphatpräzipitate viraler DNA, welche, wie von Stow und Wilki beschrieben hergestellt wurden [J. Gen. Virol. 33 (1976), 477], wurden zu subkonfluenten einzelligen Schichten von CEF zugegeben. Nach 1-stündiger Absorption bei 37°C wurde Kulturmedium zugegeben, und die Kulturen wurden 1 oder 2 Tage bis zum Erreichen der Konfluenz inkubiert. Die einzelligen Schichten wurden mit Trypsin behandelt, in 199-Medium (Wellcome), enthaltend 2 bis 4% Kälberserum, erneut plattiert (1:1 oder 1:2) und bei 37°C inkubiert, bis sich Plaques entwickelten, üblicherweise nach 4 bis 5 Tagen. Etwa 200 Plaques können pro μg HVT-DNA erhalten werden, und etwa 50 pro μg MDV-DNA.
  • Zur homologen Rekombination und Isolierung eines rekombinaten Virus werden die Gene von Interesse in nicht-essentielle Gene wie TK oder gC inseriert und mit viraler Wildtyp-DNA in Molverhältnissen im Bereich von 10:1 bis 2:1 cotransfiziert, wie vorstehend beschrieben. Alternativ kann das intakte Wildtypvirus zur Coinfektion verwendet werden.
  • Restriktionsenzymstellen, welche für die Insertion fremder Antigene in das TK-Gen des HVT-Stamms Fc-126 verwendet werden können, umfassen: BanII, Bsp1286, DraIII, EcoRI, HincII, HpaI, NheI und NspbII.
  • RE-Stellen, welche zur Erzeugung von definierten TK-Deletionsmutanten in dem MDV-Serotyp I-Stamm RB1B verwendet werden können, umfassen: BalI, HaelI, NdeI und SphI als Insertionsstellen für fremde DNA, die das TK-Gen unterbrechen würde, und doppelte Spaltungen von Kombinationen dieser vier Restriktionsenzmye (EcoK könnte auch verwendet werden), um einen Teil des TK-Gens zu entfernen, um es auf diese Weise zu inaktivieren.
  • Einige dieser Enzyme weisen auch Stellen in dem Plasmidvektor auf, in den die Virus-DNA-Fragmente cloniert werden. So können zur Linearisierung der clonierten DNA, ohne auch im Vektor zu schneiden, partielle Spaltungen durchgeführt werden.
  • Keines der vorstehenden Enzyme sollte eine Unterbrechung der flankierenden Gene hervorrufen; von HSV-1-Homologen davon ist bekannt, dass sie bei der Virusvermehrung eine wichtige Rolle spielen.
  • Die Virusrekombination kann durch "Plaque-Abzüge" nachgewiesen werden, die den Transfer von infizierten Zellen und dem freigesetzten Virus, die sich an den Agarüberzug angeheftet haben, auf Nitrocellulose und die Hybridisierung der aus den Zellen und dem Virus freigesetzten denaturierten DNA mit geeigneten Sonden umfassen, wie bei Villareal L. et al., Science 196 (1977), 183–185, beschrieben. Das Virus, welches mit der Sonde hybridisiert, kann aus der einzelligen Schicht gewonnen werden.
  • Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um das rekombinante Virus zu isolieren, welches Epitope von Interesse exprimiert. In diesem Fall werden die Nitrocellulose-"Plaque-Abzüge" mit einem Antikörper behandelt, und die Anwesenheit des gebundenen Antikörpers wird unter Verwendung eines geeigneten Nachweissystems, wie markiertes Protein A oder ein Phosphatasekonjugierter Anti-Globulin-Antikörper nachgewiesen.
  • Das Gen von Interesse mit geeigneten Promotoren wird zuerst in das clonierte TK-Gen inseriert. Die rekombinante DNA wird dann mit infektiöser DNA des Vektors in Hühnerembryofibroblasten oder Hühnernierenzellen cotransfiziert, und das TK–-Virus kann durch die Vermehrung in Acyclovir enthaltendem Medium [Ross N., (1985), wie vorstehend) oder FMAU [Schat K.A. et al., Antiviral Research 4 (1984), 159–270] selektiert werden. Alternativ oder zusätzlich werden Plaques auf die Anwesenheit des Gens von Interesse unter Verwendung von "Plaque-Abzüge" auf Nitrocellulose und durch Hybridisierung mit einer entsprechend markierten Sonde durchmustert. Die Plaques werden auch auf die Expression der Epitope von Interesse unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern oder Antipeptid-Antikörpern durchmustert.
  • Der Hauptvorteil dieser Strategie ist, dass das Selektionsverfahren die Chancen zum Erhalt von Virusrekombinanten erhöht, die das Gen von Interesse enthalten. Es bietet auch die Möglichkeit der Verwendung verschiedener Promotoren für eine optimale Expression. So erlaubt die Verwendung eines sehr frühen Promotors die Expression in latent infizierten Zellen.
  • (b) Insertion in andere nicht-essentielle Stellen des Vektors.
  • Da das A-Antigen (HVT- und MDV-Homologe von HSV-gC) für die Virusvermehrung in vivo und in vitro nicht essentiell ist (siehe obigen Abschnitt zu gC), ist es eine möglicherweise nützliche Stelle für die Insertion und Expression fremder Gene. Außerdem, da es eines der am häufigsten vorkommenden Antigene ist und sezerniert wird, kann es besonders nützlich zur Verstärkung der immunogenen Eigenschaften fremder Proteine sein. Die Isolierung von Virusrekombinanten an diesem Locus kann ausgeführt werden, indem zuerst mindestens ein Teil des Gens von Interesse im Leserahmen in das gC-Gen inseriert und dann mit infektiöser viraler DNA cotransfiziert wird. Die Durchmusterung von Virusplaques mit sequenzspezifischen Sonden oder mit einem spezifischen Antikörper erlaubt die Isolierung von Rekombinanten.
  • Eine Antigen-codierende Sequenz kann auch in das Ribonucleotidreduktase (große Untereinheit)-Gen von HVT oder von MDV inseriert werden; vgl. 8 und 9.
  • Beispiel 6: Substitution von MDV-Genen anstelle ihre Homologe in HVT
  • Die Substitution kann durch die Cotransfektion von clonierten MDV-Sequenzen und infektiöser HVT-DNA ausgeführt werden, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Substitution der aus dem RB1B-Stamm von MDV stammenden gB- und gC-Gene anstelle ihrer Gegenstücke in HVT kann ebenso bewirkt werden wie die Substitution des gH-Gens von MDV, anderer Glycoproteine und von sehr frühen Genen.
  • Rekombinante, welche MDV-Sequenzen und -Epitope exprimieren, können unter Verwendung von MDV-spezifischen monoclonalen Antikörpern oder von gegen einzigartige MDV-Sequenzen erzeugten Antikörpern nachgewiesen werden, wie vorstehend beschrieben.
  • Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es verhältnismäßig einfach ist und keine Manipulation der Promotoren erfordert. Es kann jedoch auf Gene begrenzt sein, welche eine deutliche Homologie gemeinsam haben.
  • Beispiel 7: Strategien zum Erhalt von TK--Mutanten von MDV Deletionsmutanten
  • Deletionen können in einen geeigneten Teil des Gens eingeführt werden, zum Beispiel in die Domänen des Gens, welche zur Nucleosidbindung erforderlich sind. Dies kann durch eine doppelte Restriktionsenzymspaltung, zum Beispiel mit HaeII und einem der folgenden Enzyme BalI, NdeI, SphI oder EcoK ausgeführt werden. Geeignete Fragmente werden dann religiert, gefolgt von einer Cotransfektion mit infektiöser viraler DNA oder einer Transfektion in viral infizierte Zellen. Bei der Wahl der Restriktionsenzyme usw. kann auf die 7 und 8 und auf den obigen Abschnitt, der die Insertion heterologer Sequenzen betrifft, Bezug genommen werden. Das TK--Virus kann in Gegenwart von Acyclovir [Ross N. (1985), wie vorstehend] oder FMAU [Schat K.A. et al. (1984), wie vorstehend] selektiert werden. Plaquegereinigte Clone können dann auf die Abwesenheit des deletierten Teils des TK-Gens durch Hybridisierung getestet werden.
  • Die Deletionsmutanten von MDV können selbst als attenuierte Viren zur Impfstoffherstellung verwendet werden oder insertierte Sequenzen für heterologe Antigene aufweisen.
  • Insertionsmutanten
  • Ein funktionelles β-Galactosidasegen unter der Kontrolle eines Herpesvirus-Promotors oder einer anderen geeigneten Sequenz oder einer einzigen Base wird zuerst in eine Domäne des TK-Gens eingebracht, welche für die TK-Aktivität essentiell ist. Die rekombinante DNA wird dann mit infektiöser viraler DNA cotransfiziert oder in Virus-infizierte Zellen transfiziert, um zu erlauben, dass eine homologe Rekombination erfolgt. Die Selektion in Gegenwart von Acyclovir oder FMAU ergibt TK--Insertionsmutanten. Falls ein β-Galactosidasegen eingeführt wird, können Mutanten durch die Produktion von blauen Plaques in Gegenwart von X-Gal nachgewiesen werden.
  • Das TK-Gen und umgebende Sequenzen können gegebenenfalls in einen anderen geeigneten Vektor subcloniert werden.
  • Beispiel 8: Insertion des MDV-RB1B-gB-Gens in HVT
  • Das HVT-TK-Gen wird in den Plasmidvektor pUC13 cloniert, um ein Plasmid zu erzeugen, das als pTK1B bezeichnet wird. Dieses Plasmid wird zum Beispiel mit der Restriktionsendonuclease RsrII linearisiert, die das Plasmid nur innerhalb des TK-Gens (Nucleotidposition 197 in 5, Enzymerkennungssequenz CGGACCG) spaltet. Die auf diese Weise erzeugten "überhängenden Enden" können durch Standardverfahren (vgl. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Hrsg. Maniatis T., Fritsch E.F. und Sambrook, Cold Spring Harbor Laborator, 1982) repariert werden.
  • Das RB1B-gB wurde ursprünglich in zwei Plasmide cloniert, die als RB1B-BamHI-I3 und RB1B-BamHI-K3 bezeichnet werden können (Anmerkung: I3 verlor während der Clonierung eine BamHI-Stelle). Zur Erzeugung einer vollständigen gB-Kopie in einem Plasmid wurden beide Plasmide mit BamHI gespalten und die Fragmente ligiert. Rekombinanten, welche die gewünschte Anordnung enthielten, wurden durch eine Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNA identifiziert. Jedoch wurde, wie vorstehend beschrieben, die vollständige gB-Sequenz anschließend in einem EcoRI/SalI-Fragment erhalten.
  • Weitere Informationen in Bezug auf die MDV-gB codierende Sequenz und deren Manipulation kann man bei Ross et al., J. Gen. Virol. 70 (1989), 1789–1804 finden.
  • Das einzige rekombinante Plasmid von Ross et al. wird dann mit EcoRI und SalI gespalten, die Enden werden wiederhergestellt und das Plasmid wird in PTK1B cloniert, das, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde. Alternativ könnte der offene Leserahmen von MDV-gB aus Plasmid MSB27 durch Spaltung mit HincII und Nael ausgeschnitten und die Produkte mit dem HVT-TK-Plasmid pTK1B ligiert werden, welches mit HpaI teilweise gespalten worden war. Rekombinante Plasmide, welche sowohl die TK- als auch die gB-Sequenz enthalten, könnten durch Hybridisierung identifiziert und durch ein Southern-Blot-Verfahren weiter charakterisiert werden. Die rekombinanten Plasmide werden dann in Zellen eingeführt, die das HVT-Virus (virale DNA) enthalten, und eine homologe Rekombination bringt das gB-Gen in das TK-Gen ein. HVT-Virusrekombinanten können mit Acyclovir oder FMAU selektiert oder alternativ mit markierten gB-Sonden nachgewiesen werden.
  • Beispiel 9: RB1B-gC (A-Antigen)-Gen in HVT
  • PTK1B mit stumpfen Enden wird, wie in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt. Das RB1B-gC wird mit den Restriktions-Endonucleasen EcoR1 und HindIII (Stelle innerhalb des pUC13 Polylinkers) aus dem Plasmid pMB419 herausgespalten (Beispiel 4). Die entstandenen überhängenden Enden werden wieder nach Standardprotokollen repariert. Das an den Enden reparierte gC-Fragment wird dann wie in Beispiel 8 in das linearisierte, end-reparierte pTK1B cloniert. (Die Clonierung kann durch Analyse der erhaltenen Clone mit Restriktionsenzymen, Sondierung mit radioaktiv markierten Fragmenten oder durch DNA-Sequenzierung oder eine Kombination dieser Methoden verifiziert werden).
  • Das erhaltene Plasmid mit dem in das HVT-TK-Gen clonierte RB1B-gC- Gen kann dann in das HVT-Genom, durch Transfektion des Plasmids in HVT-infizierte Zellen unter Verwendung von Calciumphosphat-Präzipitation oder Elektroporation eingeführt werden. Eine homologe Rekombination, die ein Crossing- oder von beiden Seiten des gC-Gens einschließt, zwischen dem HVT-Virus und den flankierenden Sequenzen des HVT-TK-Plasmids wird das RB1BgC-Gen in das HVT-Virus-Genom überführen. Virale Rekombinante können ausgewählt werden (da sie TK- sind) oder, wie oben beschrieben, identifiziert werden (z.B. durch Sondierung).
  • In analoger Weise kann die oben und in den Figuren angegebene Sequenzinformation dazu verwendet werden, Clonierungsstrategien für die Insertion dieser oder anderer Gene in die nicht-essentiellen Gene des hier beschriebenen HVT zu entwickeln oder um Kombinationen von Antigen-Genen in HVT herzustellen.
  • Beispiel 10: MDV-gD-Gen
  • 15 zeigt einen Teil der Sequenz des MDV-gD-Gens. Die Sequenz wurde erhalten, indem man zufällige Fragmente des US-Bereichs der MDV-DNA sequenzierte und die Sequenz mit der Sequenz der bekannten Herpesvirus-Gene verglich (siehe Buckmaster et al., a.a.O.). Die Sequenz ergab Homologie-Werte von 189 bzw. 216 mit HSV-gD und PRV-gp50. Die Sequenzinformation ist hilfreich zur Herstellung von geeigneten Sonden zur Isolierung und Charakterisierung des Gens.

Claims (12)

  1. Impfstoff gegen die Marek-Krankheit, umfassend einen rekombinanten viralen Vektor, der in der Lage ist, einen antigenen Abschnitt eines MDV-Homologs des HSV gD-Gens zu exprimieren, wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens die in 15 offenbarte Nucleotidsequenz umfasst; und wobei, wenn der Vektor ein MDV-viraler Vektor ist, der Impfstoff weiterhin MDV-empfängliche Zellen umfasst, und wobei, wenn der Vektor ein HVT-viraler Vektor ist, der Impfstoff weiterhin HVT-empfängliche Zellen umfasst.
  2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens in eine nicht-essentielle Stelle des viralen Vektors eingefügt ist.
  3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, wobei der virale Vektor weiterhin einen Promotor umfasst, der zu dem MDV-Homolog des HSV gD-Gens heterolog ist.
  4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der virale Vektor MDV ist.
  5. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei der MDV-Vektor HVT ist.
  6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Impfstoff MDV-empfängliche Zellen umfasst.
  7. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der virale Vektor ein Pockenvirus ist.
  8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der virale Vektor ein Geflügelpockenvirus ist.
  9. Nucleotidsequenz, die im Wesentlichen frei von Sequenzen ist, die im Wildtypvirus, das mit der Sequenz assoziiert ist, daran angrenzen würden, wobei die Nucleotidsequenz einen antigenen Abschnitt des Proteins codiert, das durch ein MDV-Homolog des HSV gD-Gens codiert wird, und wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens die in 15 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst.
  10. Vektor, umfassend ein MDV-Homolog des HSV gD-Gens, wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens die in 15 offenbarte Nucleotidsequenz umfasst und wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens einen antigenen Abschnitt des Proteins codiert, das durch das MDV-Homolog des HSV gD-Gens codiert wird.
  11. Plasmidvektor, umfassend ein MDV-Homolog des HSV gD-Gens, wobei das MDV-Homolog des HSV gD-Gens die in 15 offenbarte Nucleotidsequenz umfasst und einen antigenen Abschnitt des Proteins codiert, das durch das MDV-Homolog des HSV gD-Gens codiert wird; der zur Transfektion einer MDV- oder HVT-empfänglichen Zelle geeignet ist.
  12. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 9 oder eines Vektors nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung der Marek-Krankheit.
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