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Die
vorliegende Erfindung betrifft virale Impfstoffe, welche verwendet
werden können,
um eine Immunität
gegen eine Erkrankung vorzusehen, und Nucleotidsequenzen zur Einbeziehung
in die Viren solcher Impfstoffe.
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Hintergrund
und Beschreibung des Stands der Technik
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Herpesviren
sind große
doppelsträngige DNA-Viren,
welche aus einem ikosaedrischen Capsid bestehen, das von einer Hülle umgeben
ist. Die Gruppe wurde auf Basis der Genomstruktur und der biologischen
Eigenschaften als Alpha-, Beta- und Gamma-Herpesviren klassifiziert
[Roizman B. et al., Intervirology 16 (1981), 201–217]. Geflügel-Herpesviren umfassen das
Marek Virus (MDV) (ein Gamma-Herpesvirus), das bei Hühnern eine
Lymphomerkrankung von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung hervorruft
[zusammengefaßt
in Payne L.N. (Hrsg.), Marek's
Disease (1985), Martinus Nijhoff Publishing, Boston], und das Infektiöse Laryngotracheitis-Virus (ILTV)
(ein Alpha-Herpesvirus),
welches eine akute Infektion der oberen Atemwege bei Hühnern hervorruft,
die in Sterblichkeit und einer Abnahme der Eierproduktion resultiert.
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Eine
jüngste
unerwartete Entdeckung im Labor der hier genannten Anmelder ist,
dass eine ausreichende Aminosäurehomologie
zwischen MDV, ILTV und Säuger-Herpesviren,
insbesondere dem Varicella zoster-Virus (VZV) und dem Herpes simplex-Virus
(HSV), besteht, was die Identifizierung zahlreicher konservierter
Gene erlaubt. Diese umfassen die MDV- und die Truthahn-Herpesvirus (HVT)-Homologe
der Glykoproteine gB, gC und gH von HSV; die ILTV-, MDV- und HVT-Homologe
von TK- und Ribonucleotidreduktase-Genen und das ILTV-Homolog von
gB und den Genen 34 und 35 von VZV [Buckmaster A. et al., J. Gen.
Virol. 69 (1988), 2033–2042].
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Die
Stämme
von MDV wurden in drei Serotypen eingeteilt. Typ 1 umfaßt pathogene
Stämme
und ihre attenuierten Abkömmlinge.
Typ 2 ist eine Gruppe von natürlich
vorkommenden, nicht-pathogenen Stämmen, und Typ 3 ist HVT. Während mehr
als einem Jahrzehnt war die Impfung mit HVT bei der Bekämpfung der
Marek Krankheit, außerordentlich
wirksam. Jedoch wurden in den letzten Jahren neue Stämme von
MDV isoliert, die trotz der Impfung mit HVT eine Erkrankung hervorrufen.
Verluste infolge dieser "sehr
virulenten" Stämme traten
in Teilen der USA, Europa und im Nahen Osten auf. Obwohl der Schutzgrad
durch die Verwendung einer Mischung von HVT, Typ 2-MDV und attenuierten
Abkömmlingen
von sehr virulenten Stämmen
zur Impfung verbessert werden kann, waren die Ergebnisse unberechenbar.
Aus diesen Beobachtungen und der Tatsache, dass es MDV-typspezifische
Epitope gibt, die bei HVT oder dem Typ 2-MDV nicht vorkommen, folgerten
die Anmelder, dass verbesserte Impfstoffe hergestellt werden könnten, welche
antigenisch mehr mit MDV verwandt sind als gegenwärtige Impfstoffe
[beschrieben von Ross und Biggs in Goldman J.M. und Epstein M.A.
(Hrsg.), Leukaemia and Lymphoma Research, Vaccine Intervention Against
Virus-Induced Tumour (1986), Macmillan, 13–31].
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Für eine Reihe
von Herpesvirus-Antigenen wurde gezeigt, dass sie eine schutzgewährende Immunität verleihen,
wenn sie in einem rekombinanten Vaccinia-Virus exprimiert werden.
Diese umfassen das gB-Gen von HSV [Cantin E.M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 (1987), 5908–5912],
gD von HSV [Paoletti E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. (1984),
193–197]
und gp50 des Pseudorabiesvirus (PRV), ein Homolog von HSV-gD [Marchioli
C.C. et al., J. Virol. 61 (1987), 3977–3981]. Infolge der absoluten
Erfordernis von gB für
die Viruspenetration und -infektiosität und da es unter Herpesviren
konserviert ist, sind gB und dessen Homologe wichtige Immungene.
Es wurde außerdem
gezeigt, dass die Anwesenheit von gB auf der Oberfläche von
infizierten Zellen ein wichtiges Zielmolekül für humorale und zellvermittelte
Immunantworten darstellt [Blacklaws B.A. et al., J. Gen. Virol.
68 (1987),1103–1114; McLaughlin-Taylor
E. et al., J. Gen. Virol. 69 (1988),1731–1734]. Das vor kurzem beschriebene Glycoprotein
gH von HSV ist für
die Infektiösität ebenfalls
notwendig und kann auch ein wichtiges Immunogen sein [Desai P.J.
et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 1147–1156]. Es wurde auch gezeigt,
dass glll des Pseudorabiesvirus (PRV), ein Homolog von gC, ein wichtiges
Zielmolekül
für neutralisierende
Antikörper
und für
cytotoxische T-Zellen ist, obwohl es ein nicht-essentielles Protein
ist. Ebenfalls von Interesse ist die unerwartete Beteiligung von
sehr frühen Proteinen
an T-Zellen-vermittelten,
cytotoxischen Reaktionen in mit dem Cytomegalievirus (CMV) infizierten
Zellen [Kozinowski U.H. et al., J. Virol. 61 (1987), 2054–2058]. Ähnliche
Antigene könnten
bei der Abstoßung
von latent infizierten und transformierten Lymphocyten bei der Marek
Krankheit eine wichtige Rolle spielen, da sehr frühe RNA-Transkripte
in Tumoren bei der aus Marek-Krankheit etablierten lymphoblastoiden
Zellinien nachgewiesen wurden.
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Obwohl
viele rekombinante Impfstoffe unter Verwendung des Pockenvirus Vaccinia
als Vektor hergestellt wurden, gibt es auch Berichte über die Verwendung
von Herpesviren als Vektoren für
die Expression von fremden Genen. So wurde das Hepatitis-Antigen
in HSV exprimiert [Shih M.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81. (1984), 5867–5870],
und der Plasminogenaktivator aus menschlichem Gewebe wurde in PRV
exprimiert [Thomsen D.R. et al., Gene 57 (1987), 261–265]. In
beiden Fällen
wurden fremde Gene in clonierte Fragmente von nicht essentiellen Herpes-Genen
inseriert, die danach in den Virusvektor durch homologe Rekombination
eingebracht wurden. Das Hepatitisvirus-Gen wurde mit einem Herpesvirus-Promotor
fusioniert, und die rekombinante DNA wurde in das TK-Gen von HSV
inseriert. Eine homologe Rekombination nach Cotransfektion der rekombinanten
DNA und der Wildtyp-HSV-DNA ergab TK–-Virusclone, welche
das Hepatitis-Antigen exprimierten.
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Im
Falle von PRV wurde die gX-Gen-Kartierung in US als
Stelle zur Insertion des fremden Gens verwendet. Die angewandte
Strategie umfaßte
die Insertion des TK-Gens von HSV in das gX-Gen einer PRV-Mutante,
die bezüglich
ihres TK-Gens einen Defekt aufwies, der in einem TK-positiven Virus
resultierte. Das Plasminogenaktivator-Gen aus menschlichem Gewebe
wurde dann in ein cloniertes Fragment von HSV-TK inseriert, und
die Rekombinante wurde in die PRV-Mutante durch homologe Rekombination eingebracht.
Das TK–-Virus,
welches das menschliche Gen exprimierte, wurde selektiert [Thomsen
et al., vgl. vorstehend]. In ähnlicher
Weise wurde VZV als Vektor verwendet [Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84 (1987), 3896–3900].
Für mehrere
Herpesvirus-Gene
wurde ebenfalls gezeigt, dass sie mit Virulenz verbunden und für die invitro-Vermehrung nicht
erforderlich sind. Diese umfassen die TK-Gene von HSV [Jamieson
A.T. et al., J. Gen. Virol. 24 (1974), 465–480; Field H. und Wildy P.,
J. Hygiene (Cambridge) 81 (1987), 267–277] und von PRV. In der Tat
war seit langem bekannt, dass es einfach ist, PRV durch die Deletion
der TK-Aktivität
abzuschwächen
[Tatarov G. Zentralbl. Vet. Med. 15B (1968), 848–853]. Außerdem wurde die Abschwächung des Bartha-Stamms
von PRV auf einen Defekt in gl zurückgeführt, ein nicht-essentielles
Strukturgycoprotein, welches in US kartiert
wurde [Mettenleiter T. et al., J. Virol. 61 (1987), 4030–4032].
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Gene
einer HSV-Kartierung im Bereich der internen Wiederholung (TRS),
welche die lange einzigartige Sequenz flankieren, wurden ebenfalls
mit Pathogenität
in Verbindung gebracht [Rosen A. et al., Virus Research 5 (1986),
157–175;
Thompson R.L. et al., Virology 131 (1983), 180–192]. Für mehrere zusätzliche
Gene von HSV wurde gezeigt, dass sie für eine in-vitro-Vermehrung
nicht wesentich sind, obgleich nicht bekannt ist, ob sie mit Virulenz
verbunden sind. Diese umfassen UL24 [Sanders P.G., J. Gen. Virol.
63 (1982), 277–295],
die große
Untereinheit der Ribonucleotidreduktase [Goldstein D.J. und Weller
S.K., J. Virol. 62 (1988), 196–205],
gC [Draper K.G. et al., J. Virol. 51 (1984), 578–585], dUTPase [Fisher F.B. & Preston V.G.,
Virology 148 (1986), 190–197]
und UL-55 und UL-56
[MacLean A.R. & Brown
S.M., J. Gen. Virol. 68 (1987), 1339–1350].
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Außerdem gibt
es Hinweise, dass mehrere Gene einer HSV-Kartierung in US für
eine in-vitro-Vermehrung ebenfalls nicht essentiell sind [Weber
P.C. et al., Science 236 (1987), 576–579].
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Die
WO 88/07088 (veröffentlicht
erst am 22. September 1988) offenbart virale Hybridvektoren, die auf
HVT oder MDV basieren und ein Gen von Interesse an einer nicht-essentiellen
Stelle wie den TK-Bereich oder den Protein A codierenden Bereich einschließen. Protein
A scheint in diesem Zusammenhang gC zu entsprechen, wie von Velicer
und Coussens offenbart wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung sieht eine Nucleotidsequenz vor, welche im
Wesentlichen frei von den Sequenzen ist, mit denen sie in dem Wildtypvirus, das
mit der Sequenz assoziierten verbunden wäre, wobei die Sequenz gewählt ist
aus der Gruppe, umfassend:
- (a) das MDV-Homolog
des HSV-gB-Gens,
- (b) das MDV-Homolog des HSV-gH-Gens,
- (c) das TK-Gen von MDV,
- (d) das MDV-Homolog des sehr frühen Gens IE-175 von HSV-1,
- (e) das MDV-Homolog des sehr frühen Gens IE-68 von HSV-1,
- (f) das MDV-Homolog des HSV-gD-Gens und geringfügige Variationen
davon.
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Außerdem können die
TK-Sequenz von HVT, nachstehend zuweilen bezeichnet als Sequenz (x),
und das MDV-Analog von HSV-gC, nachstehend zuweilen bezeichnet als
Sequenz (y), und geringfügige
Variationen von beiden, als Insertionsstellen für bestimmte heterologe Sequenzen
oder als Deletionsstellen verwendet werden, um weniger virulente
Viren zu erhalten, wobei sie aber an sich nicht neu sind.
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Jede
der Sequenzen (a) bis (f), (x) und (y) kann mit weiteren Elementen
wie geeigneten Stopp- und Startsignalen und anderen nicht-codierenden
[5'- und 3'-] Sequenzen, einschließlich Promotoren,
verbunden sein, welche die Expression der Sequenz ermöglichen.
Solche weiteren Elemente können
jene sein, die mit der Sequenz in ihrem natürlich vorkommenden Zustand
verbunden sind, oder können
zu dieser Sequenz heterolog sein.
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Insbesondere
kann der Promotor einer sein, der mit einer der obigen Sequenzen
(d) und (f) verbunden ist.
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Der
Begriff "geringfügige Variationen
hiervon" soll Veränderungen
in der Nucleotidsequenz einschließen, die deren essentiellen
Charakter nicht beeinflussen, zum Beispiel gegenseitige geringfügige Substitutionen
von Nucleotiden. Im Falle von Sequenzen, die zur Insertion in einen.
Vektor gedacht sind, um ein Antigen zu codieren, bezieht sich der "essentielle Charakter
der Sequenz" auf
das codierte Protein oder Glycoprotein. Konservative Austausche in
der Nucleotidsequenz, welche das gleiche Antigen hervorrufen, sind
nachdrücklich
eingeschlossen, ebenso wie Austausche, die konservative Änderungen
in der Aminosäuresequenz
hervorrufen, welche den Antigencharakter des Antigens nicht ungünstig beeinflussen,
insbesondere können
antigene Teile der Antigensequenzen alleine verwendet werden, zum
Beispiel die Bereiche, die den Nucleotiden 816–863, 1377–1595, 1377–1630 oder 1824–1985 von
MDV-gB oder den Nucleotiden 483–633, 843–933 oder
1203–1278
von MDV-gC entsprechen, und geringfügige Variationen hiervon. Diese
Sequenzen und die von ihnen codierten Peptide formen einen weiteren
Aspekt der Erfindung. Im Falle einer Sequenz, die eine Insertionsstelle
ist, ist es nur erforderlich, dass die Sequenz für die Infektiosität und die
Replikation des Virus nicht essentiell ist und dass sie eine hinreichende
Homologie zu der definierten Sequenz aufweist, um eine Rekombination
zu ermöglichen.
Folglich könnte
eine Insertion des Nucleotids in die Sequenz den sich von da an
stromabwärts
anschließenden
Leserahmen vollkommen verändern. Im
Falle einer Antigen-codierenden Sequenz würde dies üblicherweise die Aminosäuresequenz
unerwünschterweise
verändern
(abhängig
davon, wo die Leserahmenverschiebung erfolgt), aber im Falle einer
Insertionsstelle bliebe der Homologiegrad praktisch gleich, so dass
eine Rekombination fast genauso leicht erfolgen kann.
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Allgemein
ausgedrückt,
wird die Sequenz an einer Insertionsstelle, falls eine Nucleotidhomologie von
mindestens 75% vorhanden ist, als eine "geringfügige Variation" angesehen. Vorzugsweise
ist die Sequenz zu mindestens 80, 85, 90, 95 oder 99% homolog. Man
ist sich bewusst, dass sich solche Homologiegrade im Wesentlichen
auf den gesamten Teil einer jeden der vorstehend definierten Sequenzen
(a) bis (f) und (x) beziehen. Kürzere
Sequenzen können als
Sonden bei der Identifizierung oder der Isolierung solcher längerer Sequenzen
verwendet werden, aber in diesem Falle muss der Homologiegrad im
Allgemeinen größer sein,
um eine fehlerfreie Hybridisierung sicherzustellen.
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So
sieht ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung Untersequenzen von
mindestens 13 Nucleotiden mit mindestens 90% (vorzugsweise 95%,
99% oder 100%) Homologie zu mindestens einem Teil von einer der
obigen Sequenzen (a) bis (f), (x) und (y) vor.
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In
der obigen Liste sind die Sequenzen (a), (b) sowie (d) bis (f) als
Antigen-exprimierende Sequenzen nützlich, und die Sequenzen (y)
ist als Insertionsstelle für
heterologe Sequenzen nützlich.
Die Sequenz (c) ist zur Deletion nützlich, um TK–-Mutanten
vorzusehen.
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Die
Sequenzen können
leicht aus natürlich vorkommenden
HVT- und MDV-Viren unter Ver- bzw. Anwendung der hier angegebenen
Sequenzinformationen und Standardverfahren isoliert werden, dazu gehört beispielsweise
die Herstellung von Oligonucleotidsonden und deren Verwendung zur
Hybridisierung mit natürlich
vorkommender DNA.
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Die
von den obigen Sequenzen (a), (b) und (f) codierten isolierten Polypeptide
sind neu und bilden einen weiteren Gesichtspunkt der Erfindung,
neben weiteren geringfügigen
Variationen davon und beliebigen glycosylierten Formen davon, die
aus der Expression der genannten Sequenzen in MDV-empfänglichen
Zellen resultieren.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt, stellt die Erfindung MDV-Mutanten bereit, welche
bezüglich
des TK-Gens Insertions- oder Deletionsmutanten sind.
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Die
Mutation kann in den codierenden oder nicht-codierenden Sequenzen
des identifizierten Bereichs erfolgen.
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Ein
MDV-Antigen exprimierendes Gen kann aus einem virulenten Stamm von
MDV isoliert und in den TK-Bereich eines weniger virulenten Stamms von
MDV inseriert werden; diese Insertion würde ein neues "Virus" ergeben, wenn sie
kein natürlich
vorkommendes Virus ergibt.
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Andere
heterologe Antigen-codierende Sequenzen sowie zum Beispiel eine
MDV-Antigen-codierende Sequenz können
eingeschlossen sein.
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Die
heterologe Sequenz kann alternativ eine Sequenz sein, die ein Antigen
codiert, welches mit einer der folgenden Krankheiten verbunden ist:
Vogel-Encephalomyelitis (epidemischer Tremor), Vogelgrippe (Geflügelpest),
Vogel-Leukose, von atypischer Geflügelpest verschiedene Vogel-Paramyxoviren
(PMV2 bis PMV7), Vogel-Reoviruserkrankungen (Darmerkrankung, Tenosynovitis),
Geflügelanämie (hervorgerufen
durch ein Geflügelanämieagens), Coccidiose,
Eierverlust-Syndrom (EDS76), Geflügelpocken, infektiöse Bronchitis,
infektiöse
Bursalerkrankungen (Gumboro), Einschlußkörper-Hepatitis (Adenovirus),
lymphoproliferative Erkrankung von Truthähnen, atypische Geflügelpest,
Reticuloendotheliose bei Hühnern,
Reticuloendotheliose bei Truthähnen,
Rotavirus-Enteritis, hämorrhagische
Enteritis bei Truthähnen
und Rhinotracheitis bei Truthähnen.
Die Sequenz kann alternativ Paramyosin (ein Muskelprotein, welches
allen nicht-Wirbeltierparasiten gemeinsam ist) oder einen antigenen
Teil davon, Somatostatin oder einen wachstumsfördernden Teil davon oder einen
Immunregulator codieren.
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Die
erfindungsgemäßen Vektoren
stellen außerdem
einen multivalenten Impfschutz bereit.
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Die
mutierten Viren sind möglicherweise
als attenuierte Viren in Impfstoffen nützlich, ohne notwendigerweise
eine inserierte heterologe Sequenz aufzuweisen.
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Ein
geeignetes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Deletions-
oder Insertionsmutanten gemäß dem 2.
Aspekt umfasst einfach das Einbringen, zum Beispiel durch Cotransfektion,
einer Deletions- oder Insertionsmutante des TK-Bereichs und entweder
der gesamten viralen DNA oder eines ganzen Virus (zum Beispiel des
Wildtypvirus) in eine geeignete Zelle. Es wurde festgestellt, dass
die bloße DNA
solcher Viren infektiös
ist, mit der Maßgabe, dass
sie nicht geschert wurde. Ein Calciumphosphatpräzipitat der DNA ist im Allgemeinen
vorteilhaft. Geeignete Zellen umfassen Hühnerembryofibroblasten, Hühnernierenzellen
und Entenembryofibroblasten, die alle vorzugsweise in subkonfluenten
einzelligen Schichten in Petrischalen gezüchtet werden. Die transfizierte
DNA und die gesamte virale DNA wird dann in den infizierten Zellen
durch homologe Rekombination miteinander rekombinieren, und die
gewünschten
Rekombinanten können
zum Beispiel durch den Nachweis einer Hybridisierung mit geeigneten
Sonden oder durch einen Immuntest unter Verwendung von geeigneten
Antikörpern
gegen das Genprodukt des in Frage kommenden Bereichs durchmustert
werden.
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Damit
eine homologe Rekombination erfolgen kann, muss sich die virale
DNA replizieren. Gegenwärtig
ist kein zellfreies Replikationssystem für MDV bekannt. Falls jedoch
ein solches System zugänglich
wird, dann könnte
das erfindungsgemäße Verfahren
darin durchgeführt
werden. Die Umgebung, in der die Replikation und die Rekombination erfolgen,
ist nicht entscheidend.
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Die
Bereiche (a), (b) und (d) bis (f), für die oben nachgewiesen wurde,
dass sie für
die Codierung von immunologisch nützlichen viralen Antigenen
verantwortlich sind, können
in geeignete Vektoren zum Beispiel in HVT oder andere Vektoren,
wie das Geflügelpockenvirus,
in Bakterien oder Pilze inseriert werden. Im Falle von viralen Vektoren,
insbesondere von Herpesvirusvektoren und Pockenvirusvektoren, kann
eine solche Insertion durch die Rekombination zwischen der Antigen-codierenden
Sequenz, die von geeigneten nicht-essentiellen Sequenzen flankiert wird,
und dem Genom des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle ausgeführt werden, wie
oben beschrieben. Wenn der Vektor HVT ist, ist der Promotor üblicherweise
ein HVT- oder MDV-Vektor. Wenn der Vektor ein Geflügelpockenvirus
oder ein anderes Virus ist, ist der Promotor üblicherweise ein Promotor,
welcher in dem Vektor endogen ist. Im Falle von Bakterien und Pilzen
kann die Antigen-codierende Sequenz unter Anwendung von bekannten oder
noch zu entdeckenden Verfahren der DNA-Manipulierung inseriert werden.
Ein nicht-pathogener Stamm von Salmonella kann als ein solcher Wirt
verwendet werden. Die heterologe Sequenz kann in das Genom des Wirtes
inseriert werden oder kann auf einem unabhängig replizierenden Plasmid
getragen werden. Ein Promotor, der in dem Wirt vorkommt, wird üblicherweise
verwendet, um die Expression der heterologen (das virale Antigen
codierenden) Sequenz zu steuern.
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Die
verwendeten flankierenden Sequenzen können den ganzen, praktisch
den ganzen oder weniger als den Bereich umfassen, in den die heterologe
Sequenz inseriert werden soll. Falls der ganze Bereich verwendet
wird, dann liegt die Sequenz dieses Bereichs eindeutig noch in dem
so erhaltenen Virus vor, aber die Funktion dieses Bereichs ist deletiert. Falls
weniger als der ganze Bereich als flankierende Sequenzen verwendet
wird, dann ist das Ergebnis eine strukturelle sowie funktionelle
Deletion. Jeder dieser Ansätze
kann verwendet werden.
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Folglich
können
drei Strategien für
die Konstruktion von verbesserten Marek-Krankheit Impfstoffen in
Betracht gezogen werden: (1) die Konstruktion eines rekombinanten
HVT, das ausgewählte MDV-Gene
exprimiert; (2) die Konstruktion von Deletions- oder Insertionsmutanten
von sehr virulenten Stämmen
von MDV, welche abgeschwächt
und daher zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind; und (3) die
Konstruktion von rekombinanten Viren, welche MDV-Proteine in anderen
Vektoren wie dem Geflügelpockenvirus
exprimieren.
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Zur
Herstellung eines Impfstoffs, in dem HVT oder MDV das Virus oder
der Vektor ist, wird das Virus in geeigneten Zellen wie Hühnerembryofibroblasten
in einem Standardkulturmedium wie 199-Medium (Wellcome oder Flow
Laboratories) während
3 bis 4 Tagen bei etwa 37°C
vermehrt. Die Zellen werden durch die Behandlung mit Trypsin geerntet
und vor der Lagerung in flüssigem
Stickstoff in versiegelten Ampullen in Medium, enthaltend 10% Dimethylsulfoxid
und 4% Kälberserum,
suspendiert.
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Zur
Impfung werden üblicherweise
Tage alte Küken
intramuskulär
etwa 1000 Plaque-bildende Einheiten injiziert. Die Immunität folgt
innerhalb weniger Tage.
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Es
sollte angemerkt werden, dass MDV und HVT zellassoziierte Viren
sind und nur infektiös
sind, wenn sie in Zellen vorliegen. Folglich umfaßt ein auf solchen
Viren basierender Impfstoff immer geeignete infizierte Zellen.
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Die
erfindungsgemäßen Impfstoffe
können verwendet
werden, um Geflügel
zu schützen,
das für MDV
anfällig
ist, einschließlich
kommerziell gezüchtetem
Geflügel,
wie Hühner,
Truthähne,
Enten und Wachteln.
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Die
bevorzugten Aspekte der Erfindung werden nun anhand von Beispielen
und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
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1 eine
Karte des MDV-Genoms ist, die zum Teil die BamHI-Stellenverteilung und die Lage der gB-
und TK-Gene zeigt;
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2 (auf 18 Blättern) die Nucleotidsequenz des
gB-Gens des RB1B-Stamms
von MDV zeigt, wobei sich die Nummerierung auf die MDV-Nucleotide bezieht,
die Sequenz eines Teils des HVT-gB-Gens unterhalb der Linie gezeigt
ist, Homologien durch vertikale Balken angegeben sind und Aminosäureunterschiede
zwischen MDV-gB und HVT-gB oberhalb der Zeile gezeigt sind;
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3 eine
Karte des HVT-Genoms ist, welche die Positionen der gH- (gestrichelt), TK- (schwarz)
und Haupt-Capsidprotein- (MCP, gestrichelt) Gene zeigt, wobei HindIII-Stellen
als "H" gezeigt sind;
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4 (auf 8 Blättern) die Nucleotidsequenz des
größten Teils
des HVT-gBGens zeigt,
wobei die entsprechende Aminosäuresequenz
oberhalb der Linie gezeigt ist:
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5 (auf 10 Blättern) die Nucleotidsequenz des
HVT-TK-Gens zeigt, wobei sich die Nummerierung auf die HVT-Nucleotide
bezieht, die Sequenz eines Teils des MDV-TK-Gens unterhalb der Linie
gezeigt ist, Homologien durch vertikale Balken angegeben sind und
Aminosäureunterschiede
zwischen MDV-TK
und HVT-TK oberhalb der Zeile gezeigt sind;
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6 (auf 6 Blättern) die Nucleotidsequenz des
gC-Gens des RB1B-Stamms
von MDV zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zelle gezeigt
sind;
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7 einen
Teil der Nucleotidsequenz des HVT-Homologs des VZV62/HSV-1-IE-175-Gens zeigt,
wobei die entsprechenden Aminosäuren
oberhalb der Zeile gezeigt sind;
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8 einen
Teil der Nucleotidsequenz des HVT-Ribonucleotidreduktase (große Untereinheit)-Gens
zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt
sind;
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9 (auf 2 Blättern) einen Teil der Nucleotidsequenz
des MDV-Ribonucleotidreduktase (große Untereinheit)-Gens zeigt,
wobei die entsprechenden Aminosäuren
oberhalb der Zeile gezeigt sind;
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10 einen
Teil der Nucleotidsequenz des MDV-Ribonucleotidreduktase (kleine Untereinheit)-Gens
zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb der Zeile gezeigt
sind;
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11 einen
Teil der Nucleotidsequenz des MDV-Homologs des HSV-1-IE-175-Gens zeigt,
wobei die entsprechenden Aminosäuren
oberhalb der Zeile gezeigt sind;
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12 einen
Teil des MDV-Homologs des HSV-1-1E-68-Gens zeigt, wobei die entsprechenden Aminosäuren oberhalb
der Zeile gezeigt sind;
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13 eine
schematische Darstellung einer homologen Rekombination in einem
nicht-essentiellen Bereich eines viralen Genoms und einem homologen
Bereich einer DNA, die in einen Plasmidvektor cloniert wurde, ist;
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14 (auf 27 Blättern) die 4 und 5 ergänzt
und die Nucleotid- und
die vorhergesagten Aminosäuresequenzen
von dem Bereich zeigt, der die MDV- und HVT-TK- und -gH- und die
flankierenden Gene enthält.
Die in Klammern gesetzten MDV-Aminosäuresequenzen sind jene, welche
möglicherweise
von diesem Nucleotidsequenzbereich codiert werden, falls das stromaufwärts angeordnete ATG-Triplett
die wirkliche Geninitiationsstelle war. Sternchen kennzeichnen Stoppcodons.
Zur Optimierung der Alignments wurden in die Sequenzen Zwischenräume eingefügt. Doppelpunkte
zwischen den MDV- und HVT-DNA-Sequenzen geben Nucleotide an, die
zwischen den zwei Viren konserviert sind. Die MDV-Aminosäuren sind
nur in Positionen gezeigt, wo sie sich von denen in HVT unterscheiden,
und
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15 zeigt die Nucleotid-Teilsequenz des MDV-Homologs
von HSV-gD, in der die vorausgesagten Aminosäuren oberhalb der MDV-Nucleotidsequenz
gezeigt sind und in Fettschrift dargestellte Reste zwischen dem
MDV- und dem HSV-1-gD-Bereich konserviert sind.
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Beispiele: Allgemeine
Ansätze
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Ausgewählte kurze
Sequenzen der Vogel-Herpesviren, die in dem Bacteriophagenvektor M13
cloniert worden waren, wurden als Sonden zur Identifizierung längerer Fragmente
verwendet, die möglicherweise
die ganzen Gene von Interesse enthalten. Dies wurde durch eine Southem-Blot-Hybridisierung
von Restriktionsfragmenten durchgeführt. Genaue Einzelheiten werden
nachstehend angegeben.
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Virusstämme
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Der "sehr onkogene" Stamm RB1 B von MDV
[Schat K.A. et al., Avian Pathol. 11 (1982), 593–605] wurde von Professor B.
Calnek, Comell University, Ithaca, USA, erhalten. Das erhaltene
Virus wurde in Hühnernierenzellen
in Gewebekultur plaquegereinigt. Es wurde zwei Passagen in SPF-RIR-Hühnern und
vier Passagen in Hühnerembryofibroblasten
(CEF) unterworfen. Sein "sehr
onkogener" Charakter
wurde durch eine große
Häufigkeit von
makroskopischen Tumoren gezeigt, wenn es in genetisch resistente
N-Linien-Hühner überimpft wurde.
Der FC126-Stamm von HVT [Witter R.L. et al., Am. J. Vet. Res. 31
(1970), 525–538],
der von den Wellcome Research Laboratories, Beckenharm, Kent, erhalten
wurde, wurde 14 Passagen in CEF unterworfen. Er wurde anschließend in
Entenembryofibroblasten (DEF) und CEF im Labor der Anmelder vermehrt.
Er wurde dann plaquegereinigt und in CEF weiter vermehrt. Die zur
Clonierung in der vorliegenden Arbeit verwendete virale DNA wurde
aus einem Virus extrahiert, das 29 Passagen seit der ursprünglichen
Isolierung unterworfen worden war.
-
Gewebekultur
-
CEF
wurden in Rollerflaschen in 199-Medium (Wellcome), supplementiert
mit Penicillin, Streptomycin, Fungizone (eingetragenes Warenzeichen) und
Kälberserum,
gezüchtet,
wie bereits beschrieben [Ross L.J.N. et al., J. Gen. Virol. 28 (1975),
37–47].
-
CKC
wurden in 10 cm-Petrischalen gezüchtet
[Churchill A.E. und Biggs P.M., Nature 215 (1967), 528–530].
-
Isolierung
von MDV-DNA
-
Der
zellassoziierte Stamm RB1B wurde auf konfluente einzellige Schichten
von CEF in Rollerflaschen in einer Infektionsmultiplizität von etwa
0,001 Plaquebildenden Einheiten (PBE) pro Zelle überimpft, und die Kulturen
wurden bei 37°C
inkubiert. Nach 3 Tagen wurde das Medium entfernt und durch frisches
199-Medium, enthaltend
2% Kälberserum, ersetzt.
Die Zellen wurden zur Virusreinigung nach 2 bis 3 Tagen geerntet,
wenn die cytopathische Wirkung umfangreich war. Das Virus wurde
durch eine Zonenzentrifugation ("rate-zonal
centrifugation")
der Cytoplasmafraktion von infizierten Zellen erhalten [Lee Y.S.
et al., J. Gen. Virol. 51 (1980), 245–253]. Die virale DNA wurde
durch Behandlung des gereinigten Virus mit Sarcosyl, Proteinase
K und Tris-Puffer, pH 9, über
Nacht bei 37°C
extrahiert und durch eine Zonenzentrifugation in Glyceringradienten,
wie bereits beschrieben [Lee et al., 1980], gereinigt. Hochmolekulargewichtige
virale DNA wurde mit Ethanol präzipitiert
und in 10 mM Tris, pH 7,5, in 1 mM EDTA (TE) resuspendiert.
-
Clonierung
von MDV-DNA
-
1 μg MDV-DNA
wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und mit BamHI-gespaltener, dephosphorylierter
pUC13-DNA (Pharmacia) ligiert. Kompetente Zellen des E. coli-Stamms
TG1 wurden gemäß Standardverfahren
transformiert [Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557–580] und
in Anwesenheit von Ampicillin und X-Gal gezüchtet. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und
auf die Gegenwart von MDV-Insertionen durch Hybridisierung mit nicktranslatierter
MDV-DNA getestet [Grunstein M. und Hogness D.S., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 72 (1975), 3961]. Positive Kolonien wurden in einem kleinen
Volumen gezüchtet,
und die Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren von Holmes D.S. und
Quigley M. [Anal. Biochem. 114 (1981), 193–297] isoliert. Die Größe der Insertionen
wurde durch Elektrophorese von BamHI-Spaltprodukten der rekombinanten
DNA in Agarosegelen bestimmt. Es wurden Plasmide erhalten, die MDV-Insertionen
im Bereich von weniger als 1 bis 18 Kbp enthielten.
-
Zufallssequenzierung viraler
DNA
-
Beschallte
Fragmente viraler DNA wurden in SmaI-gespaltenes, dephosphoryliertes
M13.mp10 (Amersham International PLC) cloniert, und MDV-Insertionen enthaltende
Plaques wurden durch Hybridisierung mit MDV-DNA identifiziert. Die
Sequenz wurde durch das Didesoxyverfahren [Sanger F. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467] unter Verwendung von 35S-dATP bestimmt.
-
Das
gleiche Verfahren wurde angewendet, um clonierte Fragmente von MDV-DNA
zu sequenzieren, außer
dass Plaques durch Hybridisierung mit der markierten Insertion identifiziert
wurden, um Kolonien zu vermeiden, die pUC13-Fragmente enthalten.
-
Beispiel 1: gB-Gen von
MDV
-
Ein
M13-Clon eines HVT-Homologs zu dem gB-Gen von VZV und HSV hybridisierte
mit dem BamHI-Fragment 13 von MDV (vgl. 1). Die
Sequenzierung dieses aus einer BamHI-Bank des RB1B-Stamms von MDV
erhaltenen Fragments zeigte, dass zwei Drittel des Gens, beginnend
mit dem NH2-Terminus, in 13 enthalten waren. Der
Rest des Gens wurde in dem benachbarten Restriktionsfragment K3
identifiziert. 1 zeigt die Kartenposition des
Gens, das 2,6 Kbp lang ist. Seine RNA wurde auf etwa 2,8 Kb geschätzt. Das
translatierte Protein ist 865 Aminosäuren lang (2).
Es umfasst etwa 20 Aminosäuren,
die Teil einer Signalsequenzdomäne sein
können.
Die translatierte Primärsequenz
von MDV-gB hat einige wenige Merkmale gemein mit gB von anderen
Herpesviren, wie die Anordnung von Cysteinresten und die Anwesenheit
von hydrophoben Sequenzen, die vermutlich in der Lage sind, eine Lipiddoppelschicht
zu durchspannen [Pellet P.E. et al., J. Virol. 53 (1985), 243–253]. Jedoch
weist das MDV-gB nur eine 48%-ige Aminosäureübereinstimmung mit gB von HSV
auf und hat viele einzigartige Merkmale, wie die Insertion von 23
Aminosäureresten
(Reste 1851–1920, 2) und das Vorhandensein von zusätzlichen
Stellen mit Glycosylierungspotential. Der Vergleich der Sequenz
von MDV-gB mit begrenzten Sequenzdaten (702 Basen), die für HVT-gB
(2) erhältlich sind, zeigte eine Nucleinsäureübereinstimmung
von 76,9% und eine Aminosäureübereinstimmung
von 87,1 % zwischen diesen zwei Glycoproteinen. Aminosäuresubstitutionen
in HVT-gB waren im Vergleich zu MDV-gB in einem Bereich (Reste 1323–1433) besonders
ausgeprägt,
der einer mit Virusneutralisation assoziierten Domäne von HSV-gB
entsprach [Pellet P.E. et al. (1985), wie vorstehend]. Aminosäuresubstitutionen zwischen
MDV- und HVT-gB wurden auch in anderen Bereichen unbekannter Funktion
bemerkt.
-
Beispiel 2: gH-Gen von
HVT und gH-Gen von MDV
-
Ein
M13-Clon von HVT, der Sequenzen enthielt, die dem HSV-gH homolog
waren, wurde während
unserer früheren
Arbeit zur Genidentifizierung und -kartierung isoliert (Buckmaster
et al. (1988) wie vorstehend). Dieser Clon, bei Verwendung als Sonde,
hybridisierte mit einem 6-Kbp langen HindIII-Fragment von HVT (3).
Die Sequenzierung zeigte, dass dieses Fragment ungefähr ein Viertel des
gH-Gens, einschließlich
des Carboxy-Terminus, enthielt. Das benachbarte HindIII-Fragment
(3,2 Kbp), das den Rest des gH-Gens enthielt, wurde durch Hybridisierung
unter Verwendung eines clonierten HpaI-Fragments von HVT, das mit
der HindIII-Stelle überlappte,
identifiziert. 4 zeigt die Sequenz
des codierenden Bereichs des gH-Gens von HVT (2,3 Kbp) und die flankierenden
Sequenzen. Die Aminosäureidentität von dem
gH-Gen von HVT und seinem Homolog in HSV1, VZV und EBV betrug lediglich
20, 24 bzw. 20% (geschätzt
auf der Basis der maximierten Aminosäureüberschneidungen von 630, 644
bzw. 153).
-
Beispiel 3: TK-Gen von
HVT und TK-Gen von MDV
-
Der
gesamte codierende Bereich des TK-Gens von HVT (1053 bp) war im
oben beschriebenen 3,2 Kbp langen HindIII-Fragment enthalten (3).
Die Sequenz des vollständigen
Gens und der flankierenden Bereiche ist in 5 gezeigt.
In ähnlicher
Weise ist das gesamte MDV-TK-Gen innerhalb des 3,6 Kbp langen BamHI-K2-Fragments
von MDV enthalten (1). Die vollständige Sequenz des
MDV-TK-Gens ist in 14 gezeigt. Ein
Vergleich der TK-Sequenzen
von MDV und HVT zeigt, dass die beiden Gene eine 60%ige Aminosäurenidentität aufweisen.
Im Gegensatz dazu liegen die prozentualen Aminosäureidentitäten von dem TK-Gen von HVT
und den TK-Genen von HSV 1, VZV und EBV bei lediglich 30, 27 bzw.
24 Prozent (geschätzt
von den Aminosäureüberschneidungen von
320, 332 bzw. 193). Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von HVT- und MDV-TK
zeigen charakteristische ATP- und/oder
CTP-Bindungsstellenmotive, die für
eine Reihe von Virus- und eukaryontischen Proteinen beschrieben
sind, die mit Phosphorylierung verbunden sind (Gentry G.A., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 6815–6819). Diese konservierten
Sequenzen sind Beispiele für
nützliche Stellen
für die
Insertion und Expression von fremden Genen und zur Herstellung von
TK–-Deletionsmutanten.
-
Beispiel 4: A-Antigen-Gen
von MDV (gP57-65) (gC-Homolog)
-
Das
A-Antigen-Gen ist für
die Impfstoffherstellung sowohl als Immunogen (es codiert ein wichtiges
Glycopolypeptid-Produkt) von Interesse, auch weil wir es als Homolog
des HSV-gC, einem potentiell nicht-essentiellen Bereich, identifiziert
haben. Das A-Antigen-Gen wurde innerhalb des BamH1 B-Fragments von
MDV kartiert (Isfort et al. 1987), und es wurde die Nucleotidsequenz
für den
GA-Stamm von MDV bestimmt (Coussens und Velicer, Abstract OP18.51,
VII International Congress of Virology, 9.-14. August 1987, Edmonton,
Canada; J. Virol. 62, 2373–2379).
Während
der früher
beschriebenen Zufallssequenzierungsstudien (Buckmaster et al., 1988) identifizierten
wir einen M13-Clon (Nr. 130), der von dem A-Antigen-Gen stammte.
Dieser Clon wurde dann zur Identifizierung eines 2,3 Kbp langen EcoR1/PvuII-Fragments
von dem RB1B-Stamm von MDV verwendet, der das A-Antigen enthält. Dieses Fragment
wurde nach Standardprotokollen in einen mit SmaI/EcoR1 gespaltenen
pUC13-Vektor cloniert. Ein Plasmid (pMB419) wurde mit dem M13-Didesoxynucleotid-Verfahren
sequenziert. Die Sequenz des MDV-RB1B-A-Antigens
und die vorausgesagte Aminosäuresequenz
des Proteins sind in 6 dargestellt.
Die A-Antigen-Bereiche von MDV und HVT sind nicht-essentielle Gene
und können
daher als Stellen in MDV und HVT dienen, in die andere Gene durch
homologe Rekombination in das Virus inseriert werden können. Wie
unten ausgeführt,
wird das von verschiedenen Beweisführungen gestützt.
- 1) Während
unserer Studie isolierten und sequenzierten wir einen anderen RB1
B-A-Antigen-Clon. Dieser wies einen zusätzlichen T-Rest im Strang der
45 T-Basen, 3' zum
A-Antigen-ATG-Codon auf. Dieses zusätzliche T eine Rahmenverschiebung
würde verursachen,
die es dem Gen unmöglich
machen würde,
funktionales A-Antigen zu codieren. Da es wahrscheinlich ist, dass
dieses Gen von einem replizierenden MDV cloniert wurde, deuten die
Ergebnisse darauf hin, dass das A-Antigen für den Virus nicht essentiell
ist.
- 2) Bei der Durchführung
einer Ähnlichkeitsrecherche
wurde es klar, dass das MDV-A-Antigen-Gen das Homologe der HSV-gC-
und PRV-gpIII-Glycoproteine ist. Von diesen beiden homologen Genen ist
bekannt, dass sie nicht essentiell sind [für das HSV-Homolog, siehe Rosenthal
et al., J. Virol. 61 (1987), 2438–2447].
- 3) Es wurde von Stämmen
von MDV berichtet, die gemäß dem Agar-Gel-Diffusions-Test [Churchill A.E.
et al., J. Gen. Virol. 4 (1969) 557–564] kein A-Antigen aufwiesen
oder geringe Mengen produzierten, wenn die empfindlichere 2D-Radio-Immunopräzipitation
verwendet wurde (van Zaane D. et al., Virology 121 (1982), 133–146).
-
Außerdem,
da das A-Antigen ein wichtiges sekretiertes Glycoprotein ist, könnte es
eine besonders geeignete Stelle für die Präsentation von fremden Epitopen
innerhalb des A-Antigens als lösliche, sekretierte
Glycoproteine, darstellen. Dies kann durch die Clonierung von Oligonucleotiden
erreicht werden, die diese Epitope im Rahmen innerhalb des A-Antigen-Gens
codieren.
-
Strategien
zum Einbringen von Genen in HVT-Vektoren
-
Zwei
Möglichkeiten
können
in Betracht gezogen werden: 1) die Insertion in nicht-essentielle
Gene des Vektors; oder 2) die Substitution fremder Gene für das entsprechende
Gen des Vektors. Dies wäre nur
in Bereichen möglich,
die bereits eine deutliche Homologie aufweisen, wie es zwischen
einigen Genen von MDV und HVT der Fall sein kann.
-
Beispiel 5: Insertion
in nicht-essentielle Gene von HVT oder MDV
-
(a) Insertion in den TK-Locus
des Vektors.
-
- 1) HVT oder MDV können als Vektoren zur Insertion
und Expression von Vogel-Herpesvirus-Genen verwendet werden. Insbesondere
kann gB, gH oder gC von RB1B-MDV in HVT inseriert werden. Man kann
den mit dem inserierten Gen assoziierten Promotor oder heterologe
Promotoren verwenden, einschließlich
solcher einer anderen Klasse von Genen (zum Beispiel den sehr frühen Promotor,
um die Expression von gB zu optimieren).
- 2) HVT oder MDV können
als allgemeine Vektoren für
die Insertion und Expression von Genen verwendet werden, welche
mit Vogel-Herpesviren nicht verwandt sind und wahrscheinlich eine
Manipulation der Promotoren zur optimalen Expression erforderlich
machen.
-
Das
zur Geninsertion anzuwendende Verfahren entspricht im Wesentlichen
dem zuvor für
die Insertion eines Hepatitis-Antigens in HSV beschriebenen [Shih
et a1., 1984, wie vorstehend).
-
Die
MDV- und HVT-DNA, welche, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde,
ist infektiös,
mit der Maßgabe,
dass Vorsichtsmaßnahmen
getroffen werden, die DNA während
der Extraktion nicht zu scheren. Calciumphosphatpräzipitate
viraler DNA, welche, wie von Stow und Wilki beschrieben hergestellt
wurden [J. Gen. Virol. 33 (1976), 477], wurden zu subkonfluenten
einzelligen Schichten von CEF zugegeben. Nach 1-stündiger Absorption
bei 37°C
wurde Kulturmedium zugegeben, und die Kulturen wurden 1 oder 2 Tage
bis zum Erreichen der Konfluenz inkubiert. Die einzelligen Schichten
wurden mit Trypsin behandelt, in 199-Medium (Wellcome), enthaltend
2 bis 4% Kälberserum,
erneut plattiert (1:1 oder 1:2) und bei 37°C inkubiert, bis sich Plaques
entwickelten, üblicherweise
nach 4 bis 5 Tagen. Etwa 200 Plaques können pro μg HVT-DNA erhalten werden, und
etwa 50 pro μg
MDV-DNA.
-
Zur
homologen Rekombination und Isolierung eines rekombinaten Virus werden
die Gene von Interesse in nicht-essentielle Gene wie TK oder gC inseriert
und mit viraler Wildtyp-DNA in Molverhältnissen im Bereich von 10:1
bis 2:1 cotransfiziert, wie vorstehend beschrieben. Alternativ kann
das intakte Wildtypvirus zur Coinfektion verwendet werden.
-
Restriktionsenzymstellen,
welche für
die Insertion fremder Antigene in das TK-Gen des HVT-Stamms Fc-126
verwendet werden können, umfassen:
BanII, Bsp1286, DraIII, EcoRI, HincII, HpaI, NheI und NspbII.
-
RE-Stellen,
welche zur Erzeugung von definierten TK-Deletionsmutanten in dem
MDV-Serotyp I-Stamm RB1B verwendet werden können, umfassen: BalI, HaelI,
NdeI und SphI als Insertionsstellen für fremde DNA, die das TK-Gen
unterbrechen würde,
und doppelte Spaltungen von Kombinationen dieser vier Restriktionsenzmye
(EcoK könnte
auch verwendet werden), um einen Teil des TK-Gens zu entfernen, um es auf diese Weise
zu inaktivieren.
-
Einige
dieser Enzyme weisen auch Stellen in dem Plasmidvektor auf, in den
die Virus-DNA-Fragmente cloniert werden. So können zur Linearisierung der
clonierten DNA, ohne auch im Vektor zu schneiden, partielle Spaltungen
durchgeführt
werden.
-
Keines
der vorstehenden Enzyme sollte eine Unterbrechung der flankierenden
Gene hervorrufen; von HSV-1-Homologen davon ist bekannt, dass sie bei
der Virusvermehrung eine wichtige Rolle spielen.
-
Die
Virusrekombination kann durch "Plaque-Abzüge" nachgewiesen werden,
die den Transfer von infizierten Zellen und dem freigesetzten Virus,
die sich an den Agarüberzug
angeheftet haben, auf Nitrocellulose und die Hybridisierung der
aus den Zellen und dem Virus freigesetzten denaturierten DNA mit
geeigneten Sonden umfassen, wie bei Villareal L. et al., Science
196 (1977), 183–185,
beschrieben. Das Virus, welches mit der Sonde hybridisiert, kann
aus der einzelligen Schicht gewonnen werden.
-
Ein ähnliches
Verfahren kann angewendet werden, um das rekombinante Virus zu isolieren,
welches Epitope von Interesse exprimiert. In diesem Fall werden
die Nitrocellulose-"Plaque-Abzüge" mit einem Antikörper behandelt,
und die Anwesenheit des gebundenen Antikörpers wird unter Verwendung
eines geeigneten Nachweissystems, wie markiertes Protein A oder
ein Phosphatasekonjugierter Anti-Globulin-Antikörper nachgewiesen.
-
Das
Gen von Interesse mit geeigneten Promotoren wird zuerst in das clonierte
TK-Gen inseriert. Die rekombinante DNA wird dann mit infektiöser DNA des
Vektors in Hühnerembryofibroblasten
oder Hühnernierenzellen
cotransfiziert, und das TK–-Virus kann durch die
Vermehrung in Acyclovir enthaltendem Medium [Ross N., (1985), wie
vorstehend) oder FMAU [Schat K.A. et al., Antiviral Research 4 (1984), 159–270] selektiert
werden. Alternativ oder zusätzlich
werden Plaques auf die Anwesenheit des Gens von Interesse unter
Verwendung von "Plaque-Abzüge" auf Nitrocellulose
und durch Hybridisierung mit einer entsprechend markierten Sonde
durchmustert. Die Plaques werden auch auf die Expression der Epitope
von Interesse unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern oder
Antipeptid-Antikörpern durchmustert.
-
Der
Hauptvorteil dieser Strategie ist, dass das Selektionsverfahren
die Chancen zum Erhalt von Virusrekombinanten erhöht, die
das Gen von Interesse enthalten. Es bietet auch die Möglichkeit
der Verwendung verschiedener Promotoren für eine optimale Expression.
So erlaubt die Verwendung eines sehr frühen Promotors die Expression
in latent infizierten Zellen.
-
(b) Insertion in andere
nicht-essentielle Stellen des Vektors.
-
Da
das A-Antigen (HVT- und MDV-Homologe von HSV-gC) für die Virusvermehrung
in vivo und in vitro nicht essentiell ist (siehe obigen Abschnitt
zu gC), ist es eine möglicherweise
nützliche
Stelle für die
Insertion und Expression fremder Gene. Außerdem, da es eines der am
häufigsten
vorkommenden Antigene ist und sezerniert wird, kann es besonders nützlich zur
Verstärkung
der immunogenen Eigenschaften fremder Proteine sein. Die Isolierung
von Virusrekombinanten an diesem Locus kann ausgeführt werden,
indem zuerst mindestens ein Teil des Gens von Interesse im Leserahmen
in das gC-Gen inseriert und dann mit infektiöser viraler DNA cotransfiziert wird.
Die Durchmusterung von Virusplaques mit sequenzspezifischen Sonden
oder mit einem spezifischen Antikörper erlaubt die Isolierung
von Rekombinanten.
-
Eine
Antigen-codierende Sequenz kann auch in das Ribonucleotidreduktase
(große
Untereinheit)-Gen von HVT oder von MDV inseriert werden; vgl. 8 und 9.
-
Beispiel 6: Substitution
von MDV-Genen anstelle ihre Homologe in HVT
-
Die
Substitution kann durch die Cotransfektion von clonierten MDV-Sequenzen und infektiöser HVT-DNA
ausgeführt
werden, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Substitution der aus
dem RB1B-Stamm von MDV stammenden gB- und gC-Gene anstelle ihrer
Gegenstücke
in HVT kann ebenso bewirkt werden wie die Substitution des gH-Gens
von MDV, anderer Glycoproteine und von sehr frühen Genen.
-
Rekombinante,
welche MDV-Sequenzen und -Epitope exprimieren, können unter Verwendung von MDV-spezifischen
monoclonalen Antikörpern oder
von gegen einzigartige MDV-Sequenzen erzeugten Antikörpern nachgewiesen
werden, wie vorstehend beschrieben.
-
Der
Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es verhältnismäßig einfach ist und keine Manipulation der
Promotoren erfordert. Es kann jedoch auf Gene begrenzt sein, welche
eine deutliche Homologie gemeinsam haben.
-
Beispiel 7: Strategien
zum Erhalt von TK--Mutanten von MDV Deletionsmutanten
-
Deletionen
können
in einen geeigneten Teil des Gens eingeführt werden, zum Beispiel in
die Domänen
des Gens, welche zur Nucleosidbindung erforderlich sind. Dies kann
durch eine doppelte Restriktionsenzymspaltung, zum Beispiel mit
HaeII und einem der folgenden Enzyme BalI, NdeI, SphI oder EcoK
ausgeführt
werden. Geeignete Fragmente werden dann religiert, gefolgt von einer
Cotransfektion mit infektiöser
viraler DNA oder einer Transfektion in viral infizierte Zellen.
Bei der Wahl der Restriktionsenzyme usw. kann auf die 7 und 8 und
auf den obigen Abschnitt, der die Insertion heterologer Sequenzen
betrifft, Bezug genommen werden. Das TK--Virus
kann in Gegenwart von Acyclovir [Ross N. (1985), wie vorstehend]
oder FMAU [Schat K.A. et al. (1984), wie vorstehend] selektiert
werden. Plaquegereinigte Clone können
dann auf die Abwesenheit des deletierten Teils des TK-Gens durch
Hybridisierung getestet werden.
-
Die
Deletionsmutanten von MDV können selbst
als attenuierte Viren zur Impfstoffherstellung verwendet werden
oder insertierte Sequenzen für
heterologe Antigene aufweisen.
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Insertionsmutanten
-
Ein
funktionelles β-Galactosidasegen
unter der Kontrolle eines Herpesvirus-Promotors oder einer anderen
geeigneten Sequenz oder einer einzigen Base wird zuerst in eine
Domäne
des TK-Gens eingebracht, welche für die TK-Aktivität essentiell
ist. Die rekombinante DNA wird dann mit infektiöser viraler DNA cotransfiziert
oder in Virus-infizierte Zellen transfiziert, um zu erlauben, dass
eine homologe Rekombination erfolgt. Die Selektion in Gegenwart
von Acyclovir oder FMAU ergibt TK--Insertionsmutanten. Falls
ein β-Galactosidasegen
eingeführt
wird, können Mutanten
durch die Produktion von blauen Plaques in Gegenwart von X-Gal nachgewiesen
werden.
-
Das
TK-Gen und umgebende Sequenzen können
gegebenenfalls in einen anderen geeigneten Vektor subcloniert werden.
-
Beispiel 8: Insertion
des MDV-RB1B-gB-Gens in HVT
-
Das
HVT-TK-Gen wird in den Plasmidvektor pUC13 cloniert, um ein Plasmid
zu erzeugen, das als pTK1B bezeichnet wird. Dieses Plasmid wird
zum Beispiel mit der Restriktionsendonuclease RsrII linearisiert,
die das Plasmid nur innerhalb des TK-Gens (Nucleotidposition 197
in 5, Enzymerkennungssequenz CGGACCG)
spaltet. Die auf diese Weise erzeugten "überhängenden
Enden" können durch Standardverfahren
(vgl. "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual",
Hrsg. Maniatis T., Fritsch E.F. und Sambrook, Cold Spring Harbor
Laborator, 1982) repariert werden.
-
Das
RB1B-gB wurde ursprünglich
in zwei Plasmide cloniert, die als RB1B-BamHI-I3 und RB1B-BamHI-K3 bezeichnet werden können (Anmerkung: I3 verlor
während
der Clonierung eine BamHI-Stelle). Zur Erzeugung einer vollständigen gB-Kopie
in einem Plasmid wurden beide Plasmide mit BamHI gespalten und die
Fragmente ligiert. Rekombinanten, welche die gewünschte Anordnung enthielten,
wurden durch eine Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNA identifiziert.
Jedoch wurde, wie vorstehend beschrieben, die vollständige gB-Sequenz anschließend in
einem EcoRI/SalI-Fragment erhalten.
-
Weitere
Informationen in Bezug auf die MDV-gB codierende Sequenz und deren
Manipulation kann man bei Ross et al., J. Gen. Virol. 70 (1989), 1789–1804 finden.
-
Das
einzige rekombinante Plasmid von Ross et al. wird dann mit EcoRI
und SalI gespalten, die Enden werden wiederhergestellt und das Plasmid
wird in PTK1B cloniert, das, wie vorstehend beschrieben, hergestellt
wurde. Alternativ könnte
der offene Leserahmen von MDV-gB aus Plasmid MSB27 durch Spaltung
mit HincII und Nael ausgeschnitten und die Produkte mit dem HVT-TK-Plasmid
pTK1B ligiert werden, welches mit HpaI teilweise gespalten worden
war. Rekombinante Plasmide, welche sowohl die TK- als auch die gB-Sequenz
enthalten, könnten durch
Hybridisierung identifiziert und durch ein Southern-Blot-Verfahren weiter
charakterisiert werden. Die rekombinanten Plasmide werden dann in Zellen
eingeführt,
die das HVT-Virus (virale DNA) enthalten, und eine homologe Rekombination
bringt das gB-Gen in das TK-Gen ein. HVT-Virusrekombinanten können mit
Acyclovir oder FMAU selektiert oder alternativ mit markierten gB-Sonden
nachgewiesen werden.
-
Beispiel 9: RB1B-gC (A-Antigen)-Gen
in HVT
-
PTK1B
mit stumpfen Enden wird, wie in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt.
Das RB1B-gC wird mit den Restriktions-Endonucleasen EcoR1 und HindIII
(Stelle innerhalb des pUC13 Polylinkers) aus dem Plasmid pMB419
herausgespalten (Beispiel 4). Die entstandenen überhängenden Enden werden wieder nach
Standardprotokollen repariert. Das an den Enden reparierte gC-Fragment wird dann
wie in Beispiel 8 in das linearisierte, end-reparierte pTK1B cloniert. (Die
Clonierung kann durch Analyse der erhaltenen Clone mit Restriktionsenzymen,
Sondierung mit radioaktiv markierten Fragmenten oder durch DNA-Sequenzierung
oder eine Kombination dieser Methoden verifiziert werden).
-
Das
erhaltene Plasmid mit dem in das HVT-TK-Gen clonierte RB1B-gC- Gen kann dann in das
HVT-Genom, durch Transfektion des Plasmids in HVT-infizierte Zellen
unter Verwendung von Calciumphosphat-Präzipitation oder Elektroporation
eingeführt
werden. Eine homologe Rekombination, die ein Crossing- oder von
beiden Seiten des gC-Gens einschließt, zwischen dem HVT-Virus und den flankierenden
Sequenzen des HVT-TK-Plasmids wird das RB1BgC-Gen in das HVT-Virus-Genom überführen. Virale
Rekombinante können
ausgewählt
werden (da sie TK- sind) oder, wie oben
beschrieben, identifiziert werden (z.B. durch Sondierung).
-
In
analoger Weise kann die oben und in den Figuren angegebene Sequenzinformation
dazu verwendet werden, Clonierungsstrategien für die Insertion dieser oder
anderer Gene in die nicht-essentiellen Gene des hier beschriebenen
HVT zu entwickeln oder um Kombinationen von Antigen-Genen in HVT herzustellen.
-
Beispiel 10: MDV-gD-Gen
-
15 zeigt einen Teil der Sequenz des MDV-gD-Gens.
Die Sequenz wurde erhalten, indem man zufällige Fragmente des US-Bereichs der MDV-DNA sequenzierte und die
Sequenz mit der Sequenz der bekannten Herpesvirus-Gene verglich (siehe
Buckmaster et al., a.a.O.). Die Sequenz ergab Homologie-Werte von
189 bzw. 216 mit HSV-gD und PRV-gp50. Die Sequenzinformation ist
hilfreich zur Herstellung von geeigneten Sonden zur Isolierung und
Charakterisierung des Gens.