KR101345936B1 - 비복제성 벡터화된 백신 투여에 의한 조류 면역화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 면역학 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 조류 인플루엔자와 같은 조류 항원 및 면역원을 조류에게 전달하기 위한 재조합 사람 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조류 배아를 포함하는 조류 검체 내에 조류 면역원을 도입시켜 발현시키는 방법뿐만 아니라, 조류 검체 내에서 조류 면역원에 대한 면역원성 반응을 유도해 내는 방법을 제공한다.
재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터, 조류 항원, 조류 면역원, 백신, 면역

Description

비복제성 벡터화된 백신 투여에 의한 조류 면역화{IMMUNIZATION OF AVIANS BY ADMINISTRATION OF NON-REPLICATING VECTORED VACCINES}
관련 출원에 대한 정보
본 출원은 전문이 본원에 참고인용된 2005년 8월 15일에 출원된 미국 가출원 일련번호 60/708,524를 우선권으로 주장한다.
또한, 2002년 1월 18일에 출원된 미국 특허 출원 일련번호 10/052,323; 2002년 4월 5일에 출원된 10/116,963; 2003년 1월 16일에 출원된 10/346,021; 및 1998년 8월 13일에 출원된 미국 특허 6,705,693; 6,716,823; 6,348,450; 및 PCT/US98/16739(모두 본원에 전문이 참고인용됨)도 언급되어 있다.
이러한 각 출원, 특허 및 본 명세서에 인용된 각 문헌, 및 상기 각 출원, 특허 및 문헌에 인용된 각 문헌("출원에 인용된 문헌"), 및 이러한 출원에 인용된 문헌에 언급되거나 인용된 각 문헌은 텍스트이거나 출원 및 특허 진행 과정이거나 간에, 뿐만 아니라 그 진행 과정 동안에 진보된 특허성의 지지에 관한 모든 의견서들도 본 발명에 참고인용된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 조류 면역원 및 항원, 예컨대 조류 인플루엔자 바이러스 항원을 조류에게 전달하기 위한 E1 결손성 사람 아데노바이러스 벡터와 같은 재조합 비복제성 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조류 배아를 비롯한 조류 검체에 조류 면역원을 도입시켜 발현시키는 방법, 및 조류 검체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도해 내는 방법도 제공한다.
조류 인플루엔자(AI)는 조류, 다른 동물 및 사람을 감염시키는 심각한 병원균이다. 1997년 이래, AI 바이러스가 사람에게 전염되는 여러 가지 사건이 있었다(Subbarao et al., 1998; Ungchusak et al., 2005). 또한, 의학적 역사 중의 다수의 경우에서 조류와 사람 인플루엔자 바이러스 사이에 유전자 재조합이 일어난 증거도 제시되어 있다(Kawaoka et al., 1989). 조류와 사람은 밀접한 접촉을 하고 있는 바, 잠재적으로 종 장벽을 넘어 사람 개체 중으로 유입될 수 있는 새로운 AI 바이러스 균주의 발생이 계속적인 공중 위생 문제가 될 것으로 생각된다.
AI 바이러스의 전염을 차단하고 사람에게 전염되는 유행병의 위험을 저하시키기 위한 가장 유망한 시도는 조류의 집단 백신접종인 것으로 보인다. 불활성화된 전체 바이러스를 이용한 조류의 백신접종은 지난 몇 년 동안 몇몇 국가에서 수행되어 왔다. 이러한 AI 백신은 감염된 난(卵)에서 수거된 양막요막액으로부터 제조되고, 이어서 포르말린이나 β-프로피오락톤에 의해 불활성화된다(Tollis and Di Trani, 2002). 하지만, 새로운 AI 바이러스 균주의 예측할 수 없는 출현, AI 바이러스의 닭 배아에 매우 치명적인 형태로의 진화(Wood et al., 2002), 및 바이오테러리스트에 의해 가능한 치명적 AI 균주 전염은 안전하고 효과적인 AI 백신의 신속 한 개발과 적시 공급을 중대하지만 매우 어려운 임무로 만든다. 또한, 동일한 균주의 불활성화된 AI 바이러스를 이전에 백신접종한 닭과 야생에서 감염된 닭을 구별하는 것은 불가능하다.
AI 바이러스의 적혈구응집소(HA)을 암호화하는 실험적 재조합 계두 바이러스는 날개 웨브 천자 후 H5N2 AI 바이러스 공격에 대하여 병아리를 보호했고, 적혈구응집억제(HI) 혈청 반응은 무시해도 좋았다(Beard et al., 1992). 또한, HA를 발현하는 생 재조합 종두 바이러스가 날개 웨브를 통해 접종된 닭은 치명적인 AI 바이러스 공격에 대하여 방어 면역을 발생시켰고, 소량의 혈청 HI 항체가 검출되었다(Chambers et al., 1988). 소화관에 대한 친화성이 있는 물새 기원의 AI 분리물이 경구 AI 백신으로서 닭에게 접종되었지만(Crawford et al., 1998), 이러한 분리물은 이러한 바이러스 유형 고유의 동적 진화로 인해, 새로운 AI 바이러스 균주에 대하여 광범위한 효과를 나타낼 것으로 생각되지 않는다.
또한, 조류는 바큘로바이러스 벡터로부터 발현된 HA 단백질의 경피 주사(Crawford et al., 1999) 및 유전자 총을 이용한 HA 암호화 발현 플라스미드의 피부로의 접종(Fynan et al., 1993)에 의해 면역화되기도 한다. 이러한 AI 백신들은 조류가 임상적 징후 및 사망을 나타내지 않도록 방어할 수 있고, 동종 HA를 함유하는 공격 바이러스의 호흡기 및 장내 복제를 저하시킬 수 있다. 또한, 뉴캣슬병 바이러스 벡터로부터 HA를 발현하는 저가 에어로졸 AI 백신(Swayne, 2003) 또는 비병원성 인플루엔자 바이러스 백본(backbone)을 함유하는 재조합 인플루엔자 바이러스(Lee et al., 2004; Webby et al., 2004)가 효능적인 경우가 있다는 증거도 제시 되어 있다.
상기 AI 백신은 대부분 노동 집약적인 비경구 전달에 의존한다. 경구 및 에어로졸 AI 백신은 집단 접종 시 각 조류에게 균일한 용량을 전달할 때, 불일치를 허용한다. 또한, 일부 백신에서 사용되는 복제성 벡터는 비천연의 미생물 형태를 환경에 전달함으로써 생물학적 위험을 제공한다. 재조합된 인플루엔자 바이러스 백신은 심지어 환경에서 동시에 순환하는 야생형 AI 바이러스와 재편성 인플루엔자 바이러스 사이에 재조합을 통해 유해한 재편성(reassortment)을 발생시킬 수도 있다(Hilleman, 2002).
재조합 아데노바이러스("Ad") 벡터를 백신 캐리어로서 이용하는 이유 중에 주목할 만한 몇가지 이유가 있다. Ad 벡터는 유사분열 세포와 유사분열후 세포를 모두 동일계에서 형질도입시킬 수 있다. 또한, 고 역가의 바이러스(즉, 1ml당 1012 pfu(플라크 형성 단위) 초과)를 함유하는 Ad 스톡(stock)의 제조는 용이하여, 세포를 높은 감염다중도(MOI)로 동일계내 형질도입시키는 것을 가능하게 한다. 또한, Ad 벡터는 백신으로서 장기적인 사용의 기초가 되는 입증된 안전성 기록도 갖고 있다. 더욱이, Ad 바이러스는 높은 유전자 발현의 수준을 유도할 수 있고(적어도 초기 방출물일 때), 복제 결손성 Ad 벡터는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 쉽게 생물학적조작, 제조 및 저장될 수 있다.
Ad계 백신은 특정 수용체에 대한 Ad 벡터의 높은 친화성과 엔도솜(endosome) 경로를 회피하는 역량으로 인해, DNA 백신보다도 효력이 크다(Curiel, 1994). Ad 벡터는 닭 세포 표면에서 발견되는 콕사키 및 아데노바이러스 수용체(CAR)에 대한 섬유의 결합을 통해 닭 배아 부분을 형질도입시킬 수 있다(Tan et al., 2001). 또한, Ad 성분 중 적어도 하나인 헥손(hexon)은 높은 면역원성이어서, 외인성 항원에 보강제 활성을 부여할 수 있다(Molinier-Frenkel et al., 2002).
Ad계 백신은 주조직적합복합체(MHC) 클래스 I 제한 T 세포 반응을 유도하는 능력 면에서 자연 감염의 효과를 모방하지만, 이 벡터로부터 병원균 게놈의 부분단편만이 발현되기 때문에 독성으로 다시 복귀될 가능성은 없다. 이러한 "선택적 발현"은 감염된 동물과 백신접종된 비감염 동물을 구분하는 문제점을 해결해 줄 수 있는데, 이것은 상기 벡터에 의해 암호화되지 않는 병원균의 특정 마커가 두 동물을 구별하는데 사용될 수 있기 때문이다. 특히, 자연 시료로부터 관련 항원 유전자를 직접 증폭 및 클로닝할 수 있기 때문에 벡터화된 백신의 제조에 병원균의 전파가 필요하지 않다(Rajakumar et al., 1990). 이것은 높은 독성인 AI 균주, 예컨대 H5N1의 생산에 특히 중요한데, 그 이유는 이 균주의 전파가 너무 어렵고 위험하기 때문이다(Wood et al., 2002). 상기 특징 외에도, 상업적 문제점은 가금류 산업에서 중대한 요인이다. 현행 AI 백신만의 가격은 달리는 새에게 주사해야 하는 노동을 계산하지 않을 때 새 1마리당 약 7센트이다(Normile, 2004).
복제 무능성 E1/E3 결손성 사람 Ad 혈청형 5(Ad5) 유래의 벡터는 포유동물에서 심층 연구되었다(Graham and Prevec, 1995). 항원을 암호화하는 조류 Ad 계배 치명적 희귀(CELO) 바이러스 벡터를 피하 또는 피내 주사하여 닭을 면역화시켰지만(Francois et al., 2004), CELO 벡터는 순응도율이 낮고 닭 세포에서 복제하는 능력 때문에 잠재적으로 유해할 수 있다. CELO는 식별가능한 E1, E3 및 E4 영역을 갖고 있지 않기 때문에(Chiocca et al., 1996), 복제 무능성 CELO 벡터는 이번에는 면역화를 위한 캐리어로서 이용할 수 없다. 본 발명은 다양한 범위의 질병 환경에서 조류를 방어하고, 결과적으로 조류 병원균이 사람에게 전염되지 않게 하기 위한 안전하고 효과적인 유전자 전달 방법을 제공함으로써 상기 이루고자 하는 과제를 해결한다.
발명의 개요
이제, 사람 아데노바이러스 벡터화된 백신의 근육내 및 난내 전달이 조류를 신속, 안전하고 효과적으로 면역화할 수 있다는 것이 놀랍게도 확인되었다. 여러 조류 병원균에 대한 조류의 집단 면역화는 거대한 경제적 손실을 예방하고 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 조류 병원균이 사람 개체군에 전염되지 않게 하는데 중요하다. 기계식 주입기를 이용한 백신 또는 면역원성 조성물의 난내(in ovo) 전달은 적기에 조류를 집단 면역화할 수 있는 비노동집약적 방법이다. 다른 난내 조류 백신과 달리, 사람 아데노바이러스 벡터화된 백신 또는 면역원성 조성물의 생산에는 치명적인 병원균의 전파가 필요하지 않고 조류 내에서 복제할 수 있는 벡터에 의한 항원이나 면역원의 전염을 수반하지 않는다. 더욱이, 이러한 유형의 백신이나 면역원성 조성물에 의한 면역화는 백신접종된 동물과 자연적으로 감염된 동물을 서로 구분할 수 있게 한다.
일 관점으로서, 본 발명은 하나 이상의 당해 조류 항원이나 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열과 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.
사람 아데노바이러스 서열은 사람 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 것이 바람직하다. 사람 아데노바이러스 서열은 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래되는 것일 수 있다.
프로모터 서열은 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 예컨대 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 헤르페스바이러스류, 예컨대 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 폭스바이러스류, 예컨대 조류폭스(avipox), 계두(fowlpox), 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 것일 수 있다.
하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자에서 유래된 것, 즉 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 및 뉴라미니다제에서 유래된 것이 바람직하다.
특히, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로부터 유래된 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 다른 관점은 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터와 수의학적 허용성 매개제 또는 부형제를 함유하는, 조류 검체 내로 생체내 전달하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다.
상기 아데노바이러스 DNA 서열은 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)에서 유래된 것이 바람직하다.
상기 사람 아데노바이러스 서열은 사람 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 것이 바람직하다. 이러한 사람 아데노바이러스 서열은 복제 결손성 아데노바이러스에서 유래될 수 있다.
상기 프로모터 서열은 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, EF1-α 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 헤르페스바이러스류, 예컨대 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 폭스바이러스류, 예컨대 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래될 수 있다.
하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자, 즉 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 및 뉴라미니다제로부터 유래된 것이 바람직하다.
하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9에서 유래되는 것이 더욱 바람직하다.
면역원성 조성물 또는 백신은 추가로 보강제를 함유할 수 있다.
면역원성 조성물 또는 백신은 추가로 다른 백신을 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터와 세포를 접촉시키는 단계, 및 상기 세포 내에서 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현시키기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 세포에 도입 및 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 세포는 293 세포 또는 PER.C6 세포인 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
다른 관점으로서, 본 발명은 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터와 조류 배아를 접촉시키는 단계, 및 이로써 상기 조류 배아 내에서 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원의 발현을 수득하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 조류 배아 내에 도입시켜 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
조류 배아에서 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원을 도입시켜 발현시키는 방법은 난내(in ovo) 전달에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
다른 관점으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 면역학적 유효량을 조류 검체에게 투여하는 것을 포함하여, 조류 검체의 면역원성 반응을 유도해 내는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현시키는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량으로 조류 검체를 감염시키는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이 조류 검체 내에서 상기 하나 이상의 당해 조류 항원이나 면역원에 대한 면역원성 반응을 유도해 내기에 충분한 수준으로 발현되는 것인, 조류 검체 내에서 면역원성 반응을 유도해 내는 방법을 제공한다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법은 추가로 다른 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
감염시키는 방법은 난내 전달에 의해 일어나는 것이 바람직하다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량으로 조류 검체를 감염시키는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이, 조류 검체 내에서 상기 하나 이상의 당해 조류 항원이나 면역원에 대한 면역원성 반응을 유도해 내기에 충분한 수준으로 발현되는 것인, 조류 검체 내에서 면역원성 반응을 유도해 내는 방법을 제공한다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법은 추가로 다른 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 조류 검체는 날개 웨브, 날개 끝, 가슴근 또는 대퇴 근조직의 근육내 주사에 의해 감염되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조류 검체는 난내 감염될 수 있다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 조류 검체의 병원균 항원을 암호화하는 이종 핵산 분자를 함유하고 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스를 난내 투여하는 것을 포함하는, 조류 검체의 접종 방법을 제공한다.
상기 사람 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 사람 아데노바이러스는 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조류 병원균의 항원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
상기 조류 병원균의 항원은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
상기 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법은 추가로 다른 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하여, 상기 재조합 사람 아데노바이러스를 조류 배아로 전달하는, 면역원성 조성물을 조류 배아로 전달하기 위한 난내 투여 장치를 제공한다.
상기 사람 아데노바이러스 발현 벡터는 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 서열을 함유하는 것이 바람직하다.
상기 사람 아데노바이러스 발현 벡터는 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 사람 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것이 바람직하다.
상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
상기 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 당해 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법은 추가로 다른 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
이와 같은 양태 및 여타 양태들은 이하 상세한 설명에 개시되거나 상세한 설명으로부터 자명하게 알 수 있고 상세한 설명에 포함되어 있다.
이하 상세한 설명은 예시적으로 제시된 것으로, 기술된 특정 양태들로만 본 발명을 제한시키려고 한 것이 아니며, 본 발명에 참고적으로 포함되는 첨부 도면과 관련해서 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 조류 인플루엔자 HA를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 난내 및 근육내 주입 시 수득되는 닭의 면역화를 도시한 그래프이다. 그룹 1은 수정란당 5x1010 pfu의 접종량을 200㎕의 부피로 주입한 9일령의 닭 수정란을 나타내고, 그룹 2는 18일령의 닭 수정란을 나타낸다. 그룹 3에서는 조류 인플루엔자 HA를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 동물 1마리당 2.5x1010 pfu의 접종량을 100㎕의 부피로 4주령의 닭 4마리에게 근육내 주입했다.
도 2는 AdTW68.H5를 배양 10일 또는 18일째 난내 만으로 백신접종한 28일령의 SPF 닭, 및 배양 10일 또는 18일째 난내 백신접종하고 부화후 15일째 비측 경로로 추가접종한 닭에서 검출되는 적혈구응집 억제 항체 역가(점)를 도시한 그래프이다. 막대, 기하평균 log2[HI 역가]. 순수 대조용 닭에서는 HI 역가가 검출되지 않았다(데이터는 미제시).
도 3은 AdTW68.H5를 수정 18일째 난내로만 백신접종하거나(병아리 7마리) 또는 난내 백신접종하고 부화 후 15일째 비내 추가접종한(병아리 12마리), 부화후 23일 및 29일째 SPF 닭에 존재하는 적혈구응집반응 억제 항체 역가를 도시한 그래프 이다. D23 및 D29, 각각 부화후 23일과 29일째의 HI 역가; 점, 각 병아리의 log2[HI 역가]; 막대, 기하학적 평균 log2[HI 역가]. 부화 후 23일과 29일째 순수 대조용 병아리 11마리에서는 HI 역가가 검출되지 않았다(데이터는 미제시).
도 4는 18일령 백색 레그혼 닭 배아에 난내 백신접종 결과를 도시한 그래프이다. 난내 백신접종은 AdTW68.H5(난내) 1011 vp를 사용하여 수행했다. 별도의 그룹에서, 난내 백신접종된 병아리에게 부화후 15일째 동일한 접종량의 AdTW68.H5를 비내 점하 방식으로 추가접종했다(난내 + 비내 추가접종). 면역화되지 않은 순수 배아는 음성 대조군으로서 제공했다(대조군). 34일령의 닭에게 고병원성 A/Ck/Queretaro/14588-19/95(H5N2) AI 바이러스 균주의 치사 접종량을 후비공 세극(choanal slit)을 통해 비내로 항원접종했다. 생존율의 통계학적으로 유의적인 변화는 Logrank 검사(Prism 4.03, GraphPad Software)를 이용하는 연구를 통해 측정했다. 비측 추가접종 적용의 존재 또는 부재 하에 AdTW68.H5의 난내 백신접종은 백신접종되지 않은 대조군과 비교했을 때(P<0.001), AI 바이러스의 치사량 공격에 대하여 닭을 유의적으로 방어했다(100%).
도 5는 고병원성 AI 바이러스로 비내 항원공격 후 백신접종된 닭과 대조용 닭에서 수득한 구강인두 시료에 존재하는, 정량적 실시간 RT-PCR(16)로 정량분석된 A/Ck/Queretaro/14588-19/95 바이러스 RNA를 도시한 그래프이다. 닭은 도 3의 설명에 기술된 바와 같이 백신접종되었다. 시료는 감염 후 2일, 4일 및 7일째에 수집했다. 바이러스 부하량의 유의적인 차이(P<0.05)는 백신접종된 그룹과 백신접종되지 않은 대조군에서 7일째 달성되었다.
도 6은 3x108 ifu 접종량의 AdTW68.H5 벡터의 접종으로 수행된 18일째 난내 백신접종 결과를 도시한 그래프이다. 상기 Ad5 벡터는 Sartobind Q5 막(Sartorius North America, Inc., Edgewood, NY)으로 정제하여 A195 완충액(Evans, 2004)에 재현탁시켰다. D25일째에는 항원공격전 혈청 HI 항체를 분석했다. 마이너스 부호(-)는 항원공격으로 죽은 닭을 나타낸다; 플러스 부호(+)는 항원공격에서 살아남은 닭을 나타낸다. 생존 닭은 죽은 닭과 비교했을 때(무비교 t-검증; Prism 4.03), 유의적으로 상승된 항원공격전 혈청 HI 활성(P<0.001)을 나타냈다. 모든 순수 대조용 닭 및 대조용 벡터 AdCMV-tetC로 면역화된 닭은 측정가능한 HI 항체 역가를 나타내지 않았다.
도 7은 AdTW68.H5 벡터를 3x108 ifu 접종량으로 접종하여 수행한, 18일 째 난내 백신접종 결과를 도시한 그래프이다. Ad5 벡터는 Sartobind Q5 막(Sartorius North America, Inc., Edgewood, NY)으로 정제하여 A195 완충액(Evans, 2004)에 재현탁시켰다. D31에는 105 EID50의 H5N1 AI 바이러스 A/Swan/Mongolia//244L/2005를 비내 투여하여 대조군 및 면역화된 닭에 항원주입했다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서, "함유한다", "함유하는" 및 "보유하는" 등의 표현은 미국 특허법에서 정의하는 의미를 나타낼 수 있고, "포함한다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어진다"의 표현도 마찬가지로 미국 특허법에서 정의하는 의미를 갖고 있으며, 이 용어는 확장 가능한 표현으로서, 언급된 것의 기본 또는 신규 특징이 언급된 것 이상의 존재에 의해서 변화되지는 않지만, 종래 기술의 양태를 배제하는 한, 언급되는 것 이상의 존재를 허용한다.
"핵산" 또는 "핵산 서열"이란 용어는 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 이 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산, 즉 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 이 용어는 합성 백본을 보유한 핵산 유사 구조를 포함한다[예컨대, Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; 및 Samstag, 1996].
본 명세서에 사용된, "재조합"은 합성되거나 또는 시험관내에서 다르게 조작된 폴리뉴클레오타이드(예, "재조합 폴리뉴클레오타이드"), 세포 또는 다른 생물학적 계에서 유전자 산물을 생산하기 위해 재조합 폴리뉴클레오타이드를 이용하는 방법, 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드("재조합 단백질")를 의미한다. "재조합 방법"은 또한 본 발명의 벡터에서 폴리펩타이드 암호 서열의 발현, 예컨대 유도성 또는 구성적 발현을 위해 발현 카세트 또는 벡터 내에 다른 급원 유래의 다양한 암호 영역 또는 도메인 또는 프로모터 서열을 보유한 핵산을 결찰(ligation)시키는 것을 포함한다.
"이종"이란 용어는 핵산과 관련하여 사용될 때에는 그 핵산이 자연에서 정상 적으로 발견되지 않는 세포 또는 바이러스 내에 있거나; 자연에서 정상적으로 발견될 때 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2 이상의 부분서열(subsequence)을 함유하거나; 또는 세포 또는 구조 내에서 다른 핵산 또는 다른 분자에 대한 발현 수준 또는 물리적 관계가 자연에서 정상적으로 발견되지 않을 정도로 재조합 조작된 것을 나타낸다. 이러한 상황에서 사용된 유사 용어는 "외인성"이다. 예를 들어, 이종 핵산은 관련이 없는 유전자 유래의 2 이상의 서열이 자연에서 발견되지 않는 방식으로 배열되어(예컨대, 본 발명의 아데노바이러스계 벡터에 삽입된 프로모터 서열에 작동가능하게 결합된 사람 유전자), 일반적으로 재조합 생산된다. 일 예로서, 당해의 이종 핵산은 면역원성 유전자 산물을 암호화할 수 있고, 여기서 아데노바이러스는 백신 또는 백신 조성물로서 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 이종 서열은 다양한 조합의 프로모터 및 서열을 함유할 수 있고, 그 예는 이하 본 명세서에 상세히 설명된다.
"항원"은 면역계에 의해 인식되고 면역 반응을 유도하는 물질이다. 이 상황에서 사용된 유사한 용어는 "면역원"이다.
본 발명의 상황에서 "조류 검체"는 조(Aves) 강에 속하는 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로서, 신조상목(Neognathae) 및 치조상목(Palaeognathae)이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 신조상목은 특히 기러기목(Anseriformes), 칼새목(Apodiformes), 부세로포메스(Buceroformes), 쏙독새목 (Caprimulgiformes), 도요목(Charadriiformes), 황새목(Ciconiiformes), 쥐새목 (Coliiformes), 비둘기목(Columbiformes), 파랑새목(Coraciiformes), 뻐꾸기목 (Cuculiformes), 매목(Falconiformes), 갈벌리포메스(Galbuliformes), 닭목 (Galliformes), 아비목(Gaviiformes), 두루미목 (Gruiformes), 무소파기포메스(Musophagiformes), 오피스토코미포메스(Opisthocomiformes), 참새목 (Passeriformes), 사다새목(Pelecaniformes), 홍학목 (Phoenicopteriformes), 딱따구리목(Piciformes), 논병아리목(Podicipediformes), 바다제비목 (Procellariiformes), 앵무목(Psittaciformes), 펭귄목(Sphenisciformes), 올빼미목 (Strigiformes), 벌새목(Trochiliformes), 비단날개새목(Trogoniformes), 세가락메추라기목(Turniciformes) 및 후투티목(Upupiformes)을 포함한다. 치조상목은 특히 키위새목(Apterygiforems), 화식조목(Casuariiformes), 공조목(Dinornithiformes), 레아목(Rheiformes), 타조목(Struthioniformes) 및 티니아미포메스(Tiniamiformes)를 포함한다. 조류 검체는 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 함유할 수 있다.
유전자 또는 핵산의 "발현"은 세포의 유전자 발현뿐만 아니라 클로닝계 및 임의의 다른 환경에서의 핵산(들)의 전사 및 해독을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "벡터"는 한 환경에서 다른 환경으로, 실체의 전달을 허용하거나 용이하게 하는 기구이다. 일 예로서, 재조합 DNA 기술에 사용되는 일부 벡터는 DNA 분절(예컨대, 이종 DNA 분절, 예컨대 이종 cDNA 분절)과 같은 실체를 표적 세포 내로 전달되게 한다. 본 발명은 바이러스 벡터, 세균 벡터, 원생동물 벡터, DNA 벡터 또는 이의 재조합체를 포함할 수 있는 재조합 벡터를 포함한다.
벡터 내에서 발현되는 외인성 DNA(예컨대, 당해 에피토프 및/또는 항원 및/ 또는 치료제를 암호화하는) 및 이러한 외인성 DNA를 제공하는 문헌에 관해, 뿐만 아니라 핵산 분자의 발현을 증강시키기 위한 전사 및/또는 해독 인자의 발현에 관해, 그리고, "당해 에피토프", "치료제", "면역 반응", "면역학적 반응", "방어 면역 반응", "면역학적 조성물", "면역원성 조성물" 및 "백신 조성물"과 같은 용어에 관해서는 특히 미국 특허 5,990,091(1999년 11월 23일 특허됨), WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 여기에 인용된 문헌과 상기 특허 및 PCT 출원의 진행 시의 기록 문서(이들 모두는 본 발명에 참고인용된다)를 참고한다. 따라서, 미국 특허 5,990,091 및 WO 98/00166과 WO 99/60164, 그리고 여기에 인용된 문헌과 상기 특허 및 PCT 출원의 진행 시에 기록 문서, 본 명세서에 인용된 여타 문헌 또는 본원에 참고인용된 다른 문헌들은 본 발명의 실시에 참고될 수 있고; 여기에 인용된 모든 외인성 핵산 분자, 프로모터 및 벡터는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 또한 미국 특허 6,706,693; 6,716,823; 6,348,450; 미국 특허 출원 일련번호 10/424,409; 10/052,323; 10/116,963; 10/346,021; 및 PCT/US98/16739로부터 1999년 2월 25일에 공개된 WO 99/08713도 참고할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "면역원성 조성물" 및 "면역학적 조성물" 및 "면역원성 또는 면역학적 조성물"이란 용어는 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 바이러스로부터 발현된 당해 항원 또는 면역원에 대하여 면역 반응을 유도해 내는 임의의 조성물을 포함하며; 예를 들어, 검체에 투여된 후 당해의 표적 면역원 또는 항원에 대하여 면역 반응을 유도해 낸다. "백신성 조성물" 및 "백신" 및 "백신 조성물"이란 용어는 당해 항원(들)에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하고; 예컨대 검체에 투여하거나 주사된 후, 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유도해 내거나 또는 본 발명의 아데노바이러스 벡터로부터 발현된 항원 또는 면역원에 대해 효과적인 방어 작용을 제공하는 모든 조성물을 포함한다. "수의학적 조성물"은 에리트로포에틴(EPO)과 같은 치료 단백질 또는 인터페론(IFN)과 같은 면역조절성 단백질을 발현하는 수의용 벡터를 포함하는 모든 조성물을 의미한다. 이와 마찬가지로, "약학적 조성물"이란 용어는 치료 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 모든 조성물을 의미한다.
"면역학적 유효량"은 검체에 투여했을 때 당해 유전자 산물에 대한 면역 반응을 생성하는 당해 유전자를 암호화하는 재조합 벡터의 함량 또는 농도이다.
"순환성 재조합 형태"는 2 이상의 아형 또는 균주 중에서 유전자 재편성된 재조합 바이러스를 의미한다. 본 발명의 상황 중에서 사용된 다른 용어는 "하이브리드 형태", "재조합된 형태" 및 "재편성 형태"이다.
"임상 분리물"이란, 예컨대 감염된 검체로부터 분리된 다음, 고 증식성 공여체 바이러스의 실험실 순응된 마스터 균주를 보유한 실험용 세포 또는 검체 중에서 재편성된, 흔히 사용되는 실험용 바이러스 균주를 의미한다.
"야생 분리물"은 감염된 검체로부터 분리되거나 환경으로부터 분리된 바이러스를 의미한다.
본 발명의 방법은 예방적 백신접종으로서 질병을 예방하거나 또는 치료적 백신접종으로서 질병의 증후군을 경감시키기 위해 적당히 적용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 단독물로서 또는 면역학적 조성물이나 면역원성 조 성물의 일부로서 검체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 단백질(들)의 생체내 발현에 의해 당해 검체에게 하나 이상의 단백질을 전달하거나 투여하는데 사용될 수도 있다.
본 발명에 따라 수득된 면역학적 산물 및/또는 항체 및/또는 발현된 산물은 시험관내에서 발현될 수 있고, 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체가 통상 사용되는 방식으로 사용될 수 있으며, 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체를 발현하는 세포는 시험관내 및/또는 생체외 이용분야에 이용될 수 있음을 유념해야 한다. 예컨대, 이러한 용도와 이용분야로는 진단, 분석, 생체외 치료(예컨대 유전자 산물 및/또는 면역학적 반응을 발현하는 세포는 시험관내에서 증식되어 숙주 또는 동물에게 재도입될 수 있다) 등을 포함할 수 있다[예컨대, 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164 및 WO 98/00166과 여기에 인용된 문헌을 참조한다]. 또한, 이 명세서 중의 방법으로 분리되거나 또는 본 명세서 중의 투여 방법 후 시험관내에서 증식된 세포로부터 분리된, 발현된 항체 또는 유전자 산물은 면역성을 유도하고, 치료적 반응을 자극하며(하거나) 수동 면역을 자극하기 위한 서브유닛 에피토프 또는 항원 또는 치료제 또는 항체의 투여와 유사하게, 조성물로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "사람 아데노바이러스"란 용어는 매스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속의 구성원을 포함하는 아데노비리데(Adenoviridae) 과의 모든 사람 아데노바이러스를 포함하는 것을 의미한다. 지금까지 51가지 혈청형 이상의 사람 아데노바이러스가 확인되었다(예컨대, Fields et al., Virology 2, Ch. 67(3d ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조). 상기 아데노바이러스는 혈청군 A, B, C, D, E 또는 F일 수 있다. 상기 사람 아데노바이러스는 혈청형 1(Ad1), 혈청형 2(Ad2), 혈청형 3(Ad3), 혈청형 4(Ad4), 혈청형 6(Ad6), 혈청형 7(Ad7), 혈청형 8(Ad8), 혈청형 9(Ad9), 혈청형 10(Ad10), 혈청형 11(Ad11), 혈청형 12(Ad12), 혈청형 13(Ad13), 혈청형 14(Ad14), 혈청형 15(Ad15), 혈청형 16(Ad16), 혈청형 17(Ad17), 혈청형 18(Ad18), 혈청형 19(Ad19), 혈청형 19a(Ad19a), 혈청형 19p (Ad19p), 혈청형 20(Ad20), 혈청형 21(Ad21), 혈청형 22(Ad22), 혈청형 23(Ad23), 혈청형 24(Ad24), 혈청형 25(Ad25), 혈청형 26(Ad26), 혈청형 27(Ad27), 혈청형 28(Ad28), 혈청형 29(Ad29), 혈청형 30(Ad30), 혈청형 31(Ad31), 혈청형 32(Ad32), 혈청형 33(Ad33), 혈청형 34(Ad34), 혈청형 35(Ad35), 혈청형 36(Ad36), 혈청형 37(Ad37), 혈청형 38(Ad38), 혈청형 39(Ad39), 혈청형 40(Ad40), 혈청형 41(Ad41), 혈청형 42(Ad42), 혈청형 43(Ad43), 혈청형 44(Ad44), 혈청형 45(Ad45), 혈청형 46(Ad46), 혈청형 47(Ad47), 혈청형 48(Ad48), 혈청형 49(Ad49), 혈청형 50(Ad50), 혈청형 51(Ad51), 또는 바람직하게는 혈청형 5(Ad5)일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하나보다 많은 아데노바이러스 혈청형 유래의 부분바이러스 입자를 포함할 수 있는 재조합 아데노바이러스, 재조합 벡터 및 면역원성 조성물도 제공한다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 특정 조직 또는 세포 유형에 대해 변경된 추향성(tropism)을 나타낼 수 있고(Havenga, M.J.E., et al., 2002), 따라서 여러 아데노바이러스 캡시드, 즉 다양한 아데노바이러스 혈청형 유래의 펜 톤(penton) 단백질 또는 섬유의 혼합 및 조화(matching)가 유리할 수 있다. 섬유 및 펜톤을 포함한 아데노바이러스 캡시드의 변형은 미변형 아데노바이러스와 다른 추향성을 가진 아데노바이러스 벡터를 산출할 수 있다. 표적 세포를 감염시키는 능력이 변형되어 최적화된 아데노바이러스 벡터는 치료적 또는 예방적 용량이 유의적으로 감소될 수 있고, 이로써 국소 및 분산 독성이 감소될 수 있다.
아데노바이러스는 무외피 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스 유래의 벡터는 유전자 전달에 특히 유용한 많은 특징을 갖고 있다. 본 명세서에 사용된, "재조합 아데노바이러스 벡터"는 이종 뉴클레오타이드 서열을 하나 이상(예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열) 운반하는 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들어, 아데노바이러스의 생물학은 상세하게 특성이 규명되어 있으며, 아데노바이러스는 심각한 사람 병리 상태와 관련이 없으며, 이 바이러스는 자신의 DNA를 숙주 세포에 도입시키는데 매우 효과적이며, 이 바이러스는 다양한 세포를 감염시킬 수 있어, 광범한 숙주 범위를 갖고 있고, 비교적 용이하게 다량으로 생산할 수 있으며, 바이러스 게놈 중 조기 영역 1("E1")을 결실시킴으로써 복제 결손성 및/또는 비복제성이 되게 할 수 있다.
아데노바이러스의 게놈은 약 36,000개의 염기쌍("bp")을 보유한 선형 이본쇄 DNA 분자로서, 각 가닥의 5' 말단에는 55kDa 말단 단백질이 공유결합되어 있다. Ad DNA는 약 100bp로 이루어진 동일한 역방위 말단 반복("IRT")을 함유하며, 이의 정확한 길이는 혈청형에 따라 달라진다. 바이러스의 복제 오리진(origin)은 게놈 단부에 있는 ITR 내에 정확하게 위치해 있다. DNA 합성은 2단계로 일어난다. 먼저, 복제가 가닥 치환에 의해 진행되고, 결과적으로 딸 이본쇄 분자와 부모의 치환된 가닥이 생긴다. 치환된 가닥은 일본쇄이며, "팬핸들(panhandle)" 중간체를 형성할 수 있어, 복제 개시 및 딸 이본쇄 분자의 생성을 허용한다. 또는, 복제가 게놈의 양 단부로부터 동시에 진행될 수도 있고, 이는 팬핸들 구조의 형성을 필요로 하지 않는다.
증식성 감염 사이클 동안, 바이러스 유전자는 2단계, 즉 바이러스 DNA 복제 이하의 기간인 초기 단계와 바이러스 DNA 복제의 개시와 일치하는 후기 단계로 발현된다. 초기 단계 중에는, E1, E2, E3 및 E4 영역에 의해 암호화된 초기 유전자 산물만이 발현되어, 바이러스 구조 단백질의 합성을 위해 세포를 준비시키는 많은 기능을 수행한다(Berk, A.J., 1986). 후기 단계 동안에는 후기 바이러스 유전자 산물이 초기 유전자 산물 외에도 발현되고, 숙주 세포 DNA와 단백질 합성이 중단된다. 결과적으로, 세포는 바이러스 DNA 및 바이러스 구조 단백질의 생산만을 담당하게 된다(Tooze, J., 1981).
아데노바이러스의 E1 영역은 표적 세포의 감염 후 발현된 아데노바이러스의 제1 영역이다. 이 영역은 2개의 전사 단위, E1A 및 E1B 유전자로 이루어져 있고, 이 유전자 둘 다 일차(배아) 잠식성 배양물의 종양원성 형질전환에 필요한 것이다. E1A 유전자 산물의 주요 기능은 휴지 세포가 세포 주기를 시작하게 유도하고 세포 DNA 합성을 재개하고, E1B 유전자 및 바이러스 게놈의 다른 조기 영역(E2, E3 및 E4)을 전사적으로 활성화시키는 것이다. E1A 유전자만에 의한 일차 세포의 형질감염은 무제한적 증식(무한증식)을 유도할 수 있지만, 완전한 형질전환을 산출하지는 않는다. 하지만, E1A의 발현은 대부분의 경우, 세포예정사(아폽토시스)를 유도하고, 가끔씩만 무한증식이 수득된다(Jochemsen et al., 1987). E1B 유전자의 공동발현은 아폽토시스의 유도를 차단하고 완전한 형태적 형질전환이 일어나도록 하는데 필요하다. 확립된 무한증식 세포주에서는 E1A의 고농도 발현이 E1B의 부재 하에서도 완전한 형질전환을 유발할 수 있다(Roberts, B.E. et al., 1985).
E1B 암호화된 단백질은 바이러스 복제가 가능하도록 세포 기능을 재유도하는데 있어서 E1A를 돕는다. 본질적으로 핵에 위치해 있는 복합체를 형성하는 E1B 55kD 및 E4 33kD 단백질은 숙주 단백질의 합성을 억제하고 바이러스 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 한다. 이들의 주요 영향은 감염의 후기 단계의 개시와 동시에, 핵에서 세포질로 바이러스 mRNA의 선택적 수송을 성립시키는 것이다. E1B 21kD 단백질은 증식성 감염 주기의 정확한 일시적 조절에 중요하여, 바이러스 생활사가 완료되기 전에 숙주 세포가 조기 사망하는 것을 방지한다. E1B 21kD 유전자 산물을 발현할 수 없는 돌연변이 바이러스는 숙주 세포 염색체 DNA의 과도한 분해(deg-표현형)를 동반하고 증강된 세포변성 효과(cyt-표현형; Telling et al., 1994)가 동반되는 단축된 감염 사이클을 나타낸다. deg 및 cyt 표현형은 E1A 유전자가 추가로 돌연변이될 때 억제되며, 이는 이 표현형들이 E1A의 기능이라는 것을 시사한다(White, E. et al., 1988). 더욱이, E1B 21kDa 단백질은 E1A가 다른 바이러스 유전자 위에서 전환되는 속도를 지연시킨다. 하지만, E1B 21kD가 어떠한 기작에 의해서 상기 E1A 종속 기능을 억제하는지는 아직 알려져 있지 않다.
아데노바이러스는 레트로바이러스 등과 달리, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되 지 않고, 비분열 세포를 감염시킬 수 있으며 재조합 유전자를 생체내에서 효과적으로 전이할 수 있다(Brody et al., 1994). 이러한 특징은 아데노바이러스가 당해 항원이나 면역원 등을 필요로 하는 세포, 조직 또는 검체 내로 생체내 유전자 전달하기에 바람직한 후보가 되게 한다.
복수의 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터는 이 벡터의 운반능을 증가시킴은 물론, 복제 가능 아데노바이러스(RCA)를 생성시키는 재조합의 가능성을 감소시키는데 바람직하다. 아데노바이러스가 복수의 결실을 함유하는 경우에는 각 결실이 단독으로 존재하는 경우에 복제 결손성 및/또는 비복제성 아데노바이러스를 산출하는 것일 필요는 없다. 결실들 중에서 하나의 결실이 아데노바이러스 복제 결손성 또는 비복제성이 되게 하는 한, 다른 결실들은 다른 목적을 위해, 예컨대 아데노바이러스 게놈의 이종 뉴클레오타이드 서열 운반능을 증가시키는 목적으로 포함될 수 있다. 하나보다 많은 결실이 기능성 단백질의 발현을 차단하여 아데노바이러스 복제 결손성 및/또는 비복제성 및/또는 약독성이 되게 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 모든 결실이 아데노바이러스 복제 결손성 및/또는 비복제성 및/또는 약독성이 되게 하는 결실인 것이 좋다. 하지만, 본 발명은 또한 복제 가능한 및/또는 야생형인, 즉 검체에서 감염과 복제에 필요한 모든 아데노바이러스 유전자를 함유하는 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터도 포함한다.
아데노바이러스 재조합체를 이용하는 본 발명의 양태는 E1 결손성 또는 결실된, 또는 E3 결손성 또는 결실된, 또는 E4 결손성 또는 결실된 것, 또는 E1과 E3의 결실, 또는 E1과 E4의 결실, 또는 E3과 E4의 결실, 또는 E1, E3 및 E4의 결실을 함 유하는 아데노바이러스 벡터, 또는 모든 바이러스 유전자가 결실된 "제3세대(gutless)" 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 아데노바이러스 벡터는 E1, E3 또는 E4 유전자에 돌연변이를 포함하거나, 이러한 아데노바이러스 유전자 또는 모든 아데노바이러스 유전자에 결실을 포함할 수 있다. E1 돌연변이는 E1 결손성 아데노바이러스 돌연변이체가 비허용 세포에서 복제 결손성 및/또는 비복제성이며, 극히 적어도 매우 약독성이라고 전해지기 때문에 벡터의 안전역(safety margin)을 상승시킨다. E3 돌연변이는 면역 기구를 붕괴시켜 항원의 면역원성을 증강시키며, 이로써 아데노바이러스는 MHC 클래스 I분자를 억제조절(downregulate)한다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제함으로써 아데노바이러스 벡터의 면역원성을 감소시키고, 이로써 동일한 벡터를 이용한 반복된 재백신접종이 가능하도록 할 수 있다. 본 발명은 E1, 또는 E3, 또는 E4, 또는 E1과 E3, 또는 E1과 E4가 결실되거나 돌연변이된 임의의 혈청형 또는 혈청군의 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 아데노바이러스 유전자의 결실 또는 돌연변이는 상기 단백질들의 활성에 손상 또는 실질적으로 완전한 상실을 초래한다.
"제3 세대" 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터과에 속하는 또 다른 유형의 벡터이다. 이 벡터의 복제에는 자연 환경에 존재하지 않는 조건인 E1a 및 Cre를 모두 발현하는 특별한 사람 293 세포주와 헬퍼(helper) 바이러스가 있어야 하고; 이 벡터에는 모든 바이러스 유전자가 결실되어 있어서, 이 벡터는 백신 캐리어로서 비면역원성이어서, 재백신접종을 위해 여러번 접종될 수 있다. "제3 세대" 아데노바이러스 벡터는 또한 당해 항원이나 면역원(들)을 수용하기 위한 36kb 공간 을 함유하여, 세포 내로 다수의 항원 또는 면역원의 공동전달이 가능하다.
당업계에 공지된 다른 아데노바이러스 벡터 시스템으로는, AdEasy 시스템(He et al., 1998) 및 이후에 변형된 AdEasier 시스템(Zeng et al., 2001)이 있으며, 이들은 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 세포, 예컨대 BJ5183 세포 중에서 하룻밤 동안 공여체 벡터와 Ad 헬퍼 벡터 사이에 상동성 재조합이 일어나게 함으로써 293 세포 중의 재조합 Ad 벡터가 신속하게 생성되도록 개발된 것이다. pAdEasy는 당해의 항원이나 면역원을 발현하는 pShuttle-CMV와 같은 공여체 벡터와 트랜스(in trans)로 공급되었을 때 아데노바이러스 캡시드에 항원이나 면역원(예, 면역원들 및/또는 항원들)의 패키징을 초래하는 아데노바이러스 구조 서열을 함유한다. pAdEasy의 서열은 당업계에 공지되어 있고, 스트라타진(Stratagene)을 통해 공공연히 상업적으로 입수용이하다.
본 발명은 AdHigh 시스템(미국 특허 가출원 일련번호 60/683,638)을 이용하여 생성될 수 있다. AdHigh는 조류 검체에 유해하거나 치명적일 수 있는 RCA의 발생 위험 없이, 고역가의 재조합 아데노바이러스를 생성하는 안전하고 신속하며 효과적인 방법이다. 또한, RCA는 사람에게 병원성일 수 있고, 먹이사슬에 바람직하지 않게 존재할 수 있다. AdHigh 시스템은 E. 콜리 세포에서 아데노바이러스 백본 플라스미드와 재조합체를 형성한 후 PER.C6 세포와 같은 허용성(permissive) 세포에서 RCA 부재 아데노바이러스의 생성을 촉진하기 위해 pAdHigh와 같은 변형된 셔틀 플라스미드를 이용한다. 이러한 셔틀 플라스미드는 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원과 같은 조류 면역원 또는 항원의 용이한 삽입을 위한 폴리링커 또는 다클로닝 부위(MCS)를 함유한다. 이러한 아데노바이러스 셔틀 플라스미드와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드, 예컨대 pAdEasy의 세균 세포(즉, BJ5183)에서의 재조합은 용이하게 수행되어 본 발명의 조류 항원이나 면역원을 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스를 생산할 수 있다. 클로닝 및 제한분석에 의한 재조합 벡터의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
RGD 모티프와 같은 특정 서열 모티프는 아데노바이러스 벡터의 감염성을 증강시키기 위하여 상기 아데노바이러스 벡터의 H-I 루프에 삽입될 수 있다. 이 서열은 인테그린으로 불리는 세포 표면 수용체의 상과(superfamily)와 특정 세포외 바탕질(matrix) 및 부착 단백질과의 상호작용에 필수적인 것으로 밝혀져 있다. RGD 모티프의 삽입은 바람직하게는 면역약화 검체에게 유용할 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 전술한 바와 같은 임의의 아데노바이러스 벡터에 특정 항원 또는 면역원 또는 이의 단편을 클로닝시켜 작제한다. 이러한 아데노바이러스 재조합체는 척추동물용의 세포를 형질도입시키는데 면역제로서 이용된다(예컨대, 참고인용된 미국 특허 출원 일련번호 10/424,409 참조).
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 시험관내 및 생체내 모두에서 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 핵산을 세포로 전달하는데 유용하다. 구체적으로, 본 발명의 벡터는 핵산을 동물, 더욱 바람직하게는 조류 및 포유동물 세포에 전달하거나 전이시키는데 바람직하게 이용될 수 있다. 당해의 핵산으로는 펩타이드 및 단백질, 바람직하게는 치료용(예컨대, 의학용 또는 수의학용) 또는 면역원성(예, 백신용) 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
당해 항원이나 면역원을 암호화하는 코돈은 "최적화된" 코돈이며, 즉 상기 코돈은 인플루엔자 등에서 흔히 사용되는 코돈 대신에, 고발현성 조류 유전자에서 흔히 나타나는 코돈이다. 이러한 코돈의 사용은 사람 또는 조류 세포에서 상기 항원이나 면역원의 효과적인 발현을 제공한다. 다른 양태에 따르면, 예컨대 당해의 항원 또는 면역원이 세균, 효모 또는 다른 발현계에서 발현될 때, 코돈 사용 패턴은 변경되어 상기 항원이나 면역원이 발현되고 있는 유기체에서 고 발현성인 유전자로 코돈 편견을 나타낸다. 코돈 사용 패턴은 많은 종의 고 발현성 유전자에 관한 문헌에 공지되어 있다(예, Nakamura et al., 1996; Wang et al., 1998; McEwan et al. 1998).
또 다른 대안예로서, 아데노바이러스 벡터는 원하는 유전자 산물을 발현시키기 위해, 예컨대 당해의 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위해 배양물 중의 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 상기 단백질 또는 펩타이드는 배지로 분비되어 당업계에 공지된 통상적인 기술뿐만 아니라 본 명세서에 제공된 기술을 이용하여 정제할 수 있는 것이 바람직하다. 단백질의 세포외 분비를 유도하는 시그널 펩타이드 서열은 당업계에 공지되어 있고, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 당해 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다. 또는, 세포는 용균될 수 있고, 이 세포 용균물로부터 발현된 재조합 단백질이 정제될 수 있다. 세포는 바람직하게는 동물 세포이고, 더욱 바람직하게는 조류 또는 포유동물 세포이다. 또한, 아데노바이러스에 의한 형질도입이 가능한 세포도 바람직하다.
이러한 세포에는 PER.C6 세포, 911 세포 및 HEK293 세포 등이 있다. 본 발명은 또한, 예컨대 조류 배아 섬유아세포, 예를 들어 DF-1 세포, 조류 줄기 세포, 예를 들어 본원에 참고인용된 미국 특허 6,872,561; 6,642,042; 6,280,970; 및 6,255,108에 기술된 세포, 조류 림프아세포, 조류 상피 세포, 특히 예컨대 계배 유래의 세포주 CHCC-OU2(Ogura, H. et al., 1987; 일본 특허 공개번호 9-173059), 메추라기 유래의 세포주 QT-35(일본 특허 공개번호 9-98778) 등과 같은, 이에 국한되지 않는 조류 세포의 이용을 포함한다. 감염, 형질감염 또는 임의의 유형의 유전자 전이가 가능한 모든 조류 세포가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
숙주 세포를 배양하기 위한 배양 배지에는 조직 배양에 일반적으로 사용되는 배지, 예컨대 특히 M199-어얼리 기초배지, 이글 MEM(E-MEM), 둘베코 MEM(DMEM), SC-UCM102, UP-SFM(GIBCO BRL), EX-CELL302(Nichirei), EX-CELL293-S(Nichirei), TFBM-01(Nichirei), ASF104 등이 있다. 특정 세포 유형에 적당한 배양 배지는 미국모식균배양물수집소(ATCC) 또는 유럽 세포배양물 수집소(ECACC)에서 찾아볼 수 있다. 배양 배지에는 L-글루타민과 같은 아미노산, 염, 항진균제 또는 항균제, 예컨대 Fungizone?, 페니실린-스티렙토마이신, 동물 혈청 등이 보충될 수 있다. 세포 배양 배지는 경우에 따라 무혈청 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 백신으로서 유용한 벡터를 제공한다. 면역원 또는 항원은 아데노바이러스 캡시드에 제공될 수 있고, 또는 항원은 재조합 아데노바이러스 게놈 내로 도입되어 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반되는 항원 또는 면역원으 로부터 발현될 수도 있다. 아데노바이러스 벡터는 당해 임의의 항원 또는 면역원을 제공할 수 있다. 면역원의 예는 본 명세서에 상세히 설명되어 있다.
항원 또는 면역원은 적당한 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 것이 바람직하다. 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 오리진(예컨대 pBR322와 같은 세균 벡터에서 유래된 것과 같은 세균 오리진이거나, 또는 자율 복제 서열(ARS)과 같은 진핵 오리진일 수 있다), 프로모터, 인헨서 및 필수 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 접목 부위, 폴리아데닐화 부위, 패키징 시그널 및 전사 터미네이터 서열을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 표적 세포로 전달될 항원 또는 면역원 서열(들)과 작동적으로 결합된, 적당한 전사/해독 조절 시그널 및 폴리아데닐화 시그널(예, 소 증식 호르몬 유래의 폴리아데닐화 시그널, SV40 폴리아데닐화 시그널)을 함유할 수 있다. 다양한 프로모터/인헨서 부재는 원하는 조직 특이적 발현 및 레벨에 따라 사용될 수 있다. 프로모터는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적이거나 유도성(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터)일 수 있다. 프로모터는 선천적인 것이거나 이종성일 수 있고, 자연 서열이거나 합성 서열일 수 있다. 이종성이란, 전사 개시 영역이 이 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서 발견되지 않는 것을 의미한다. 프로모터는 당해 표적 세포(들) 또는 조직(들)에서 기능하는 것으로 선택한다. 뇌 특이적, 간 특이적 및 근육 특이적(예컨대, 골격, 심장, 평활근 및/또는 횡경막 특이적) 프로모터가 본 발명에 포함된다. 포유동물 프로모터 및 조류 프로모터도 바람직하다.
프로모터는 유리하게는 "조기(early)" 프로모터일 수 있다. "조기" 프로모터는 당업계에 공지되어 있고 새로운 단백질 합성의 부재 시에 신속하게 일시적으로 발현되는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터로서 정의되고 있다. 이 프로모터는 또한 "강한" 또는 "약한" 프로모터일 수 있다. "강한 프로모터" 및 "약한 프로모터"란 용어는 당업계에 공지되어 있고, 그 프로모터에서의 전사 개시의 상대적 빈도(횟수/분)에 의해 정의될 수 있다. "강한" 또는 "약한" 프로모터는 RNA 폴리머라제에 대한 친화성에 의해서도 정의될 수 있다.
항원 또는 면역원은 예컨대 사람 시토메갈로바이러스(CMV) 주 즉시조기발현(major immediate-early) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장인자 1-α(EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스 프로모터 등과 작동적으로 결합된 것이 더욱 바람직하다. 다른 발현 조절 서열에는 면역글로불린 유전자, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스 등 유래의 프로모터가 포함된다. 임의의 조류 바이러스 프로모터 외에도, 임의의 포유동물 바이러스 프로모터가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 바이러스 기원의 조류 프로모터 중에서 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV)의 즉시조기발현(즉, ICP4, ICP27) 유전자의 프로모터, 마렉병 바이러스의 조기발현(즉, 티미딘 키나제, DNA 헬리카제, 리보뉴클레오타이드 리덕타제) 또는 후기발현(즉, gB, gD, gC, gK) 유전자의 프로모터, 또는 칠면조 헤르페스 바이러스(즉, gB, gC, ICP4) 유전자의 프로모터가 본 발명의 방법과 벡터에 사용될 수 있다. 더욱이, 과도한 실험 없이 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유 도하거나 유도해 내기 위해 당해의 항원 또는 면역원을 충분히 다량으로 발현하는 적당한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 당업자의 영역에 해당된다.
CMV 프로모터를 이용한 이종 뉴클레오타이드 전사의 유도는 면역능 동물에서 발현의 억제조절을 초래할 수 있는 것으로 생각되었다(예컨대, Guo et al., 1996 참조). 따라서, 이러한 항원 또는 면역원 발현의 억제조절을 초래하지 않는 변형된 CMV 프로모터 등과 상기 항원 또는 면역원 서열을 작동가능하게 결합시키는 것도 바람직하다.
본 발명의 벡터는 또한 프로모터의 하류에 바람직하게 위치할 수 있는 폴리링커 또는 다클로닝부위("MCS")를 포함할 수도 있다. 폴리링커는 프로모터 서열과 "프레임내(in-frame)"에 있는 항원 또는 면역원 분자의 삽입 부위를 제공하여, 당해 항원 또는 면역원에 상기 프로모터 서열을 "작동가능하게 결합"시킨다. 다클로닝부위 및 폴리링커는 당업자에게 공지되어 있다. 본 명세서에 사용된, "작동가능하게 결합된"이란 표현은 기술된 성분들이 의도된 방식에 따라 작용하게 하는 관계에 있는 것을 의미한다.
항생제 내성을 암호화하는 선택성 마커는 재조합 벡터의 시험관내 증폭 및 정제에 사용될 때, 그리고 상업적으로 입수용이한 AdEasy, AdEasier 및 AdHigh 아데노바이러스 시스템의 환경에서는 공여체 벡터와 아데노바이러스 헬퍼 벡터 사이에 상동성 재조합을 모니터하기 위해, 벡터에 따라서 존재할 수 있다. AdEasy, AdEasier 및 AdHigh 시스템은 ITR 서열에서 아데노바이러스 헬퍼 벡터와 공여체 벡터 사이에 상동성 재조합을 촉진한다. 각 벡터는 다른 항생제 내성 유전자를 함유 하며, 이중 선택에 의해 재조합된 벡터를 발현하는 재조합체가 선택될 수 있다. 본 발명의 벡터에 혼입될 수 있는 상기 항생제 내성 유전자의 예에는 특히 앰피실린, 테트라사이클린, 네오마이신, 제오신, 카나마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
항원 또는 면역원이 하나보다 많은 양태에서, 항원 또는 면역원 서열은 하나의 상류 프로모터 및 하나 이상의 하류 내부리보솜도입부위(IRES) 서열(예, 피코나바이러스 EMC IRES 서열)과 작동가능하게 결합될 수 있다.
항원 또는 면역원 서열(들)이 전사되고 그 다음 표적 세포 내에서 해독되는 본 발명의 양태에서는, 삽입된 단백질 암호 서열의 효과적인 해독을 위해 일반적으로 특정 개시 시그널을 필요로 한다. 이러한 외인성 해독 조절 서열은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 것으로서, 자연 및 합성의 다양한 기원에서 수득될 수 있다.
조류 병원균에서 유래된 임의의 조류 항원 또는 면역원은 본 발명의 방법 및 재조합 벡터에서 사용될 수 있다. 바람직한 항원 또는 면역원에는 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 항원 또는 면역원, 예컨대 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 바탕질 및 핵단백질 항원 또는 면역원, 감염성 점액낭병 바이러스 항원, 예컨대 VP1, VP1s1, VP1s2, VP2(Heine, H.G. et al., 1991; Dormitorio, T.V.et al., 1997; and Cao, Y.C. et al., 1998), VP2S, VP3, VP4, VP4S 및 VP5, 마렉병 바이러스 항원, 예컨대 티미딘 키나제, gA, gB, gC, gD, gE, gH, gI 및 gL(Coussens et al., 1988); Ross et al. 1989); Ross et al., 1991); 국제 공개번호 WO 90/02803(1990); Brunovskis and Velicer, 1995); and Yoshida et al. 1994), 헤르페스바이러스, 예컨대 감염성 후두기관염 바이러스 항원, 예컨대 gA, gB, gD, gE, gI 및 gG(Veits, J. et al 2003), 조류 감염성 기관지염 바이러스 항원, 예컨대 당단백질 돌기, 통합막단백질 M, 소형막단백질 E 및 다단백질(Casais, R. et al 2003), 조류 레오바이러스 항원, 예컨대 캡시드, 시그마 MS, 시그마 A, 시그마 B 및 시그마 C 단백질(Spandidos, D.A. et al., 1976), 폭스바이러스, 예컨대 조류폭스, 파울폭스, 카나리폭스, 비둘기폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스 항원, 예를 들어 티미딘 키나제, 조류 폴리오마바이러스 항원, 예컨대 VP1, VP2, VP3 및 VP4(Rott, O. et al. 1988), 뉴캣슬병 바이러스 항원, 예컨대 HN, P, NP, M, F 및 L 단백질(Alexander, D.J. 1990에서 검토됨), 조류 뉴모바이러스 항원 SH, F, G 및 N(Seal, B.S., 2000), 조류 비기관염 바이러스 항원, 예컨대 당단백질, 바탕질, 융합 및 뉴클레오캡시드(Cook, J.K., 1990), 조류 세망내피증 바이러스 항원, 예컨대 p29, 엔벨로프, gag, 프로테아제 및 폴리머라제(Dornburg, R. 1995), 조류 레트로바이러스, 예컨대 조류 암종 바이러스 항원 gag, pol 및 env, 조류 내인성 바이러스 gag, pol, env, 캡시드 및 프로테아제(Rovigatti, U.G. et al., 1983), 조류 태아적모구증 바이러스 gag, erbA, erbB(Graf, T. et al., 1983), 조류 간염 바이러스 코어 단백질, pol 및 표면 단백질(Cova, L., et al., 1993), 조류 빈혈 바이러스 VP1, VP2, VP3(Rosenberger, J.K. et al., 1998), 조류 장염 바이러스 항원 폴리머라제, 52K 단백질, 펜톤, IIIa 및 코어 단백질(Pitcovski, J. et al., 1988), 파체코병 바이러스 IE 단백질, 당단백질 K, 헬리카제, 당단백질 N, VP11-12, 당단 백질 H, 티미딘 키나제, 당단백질 B 및 핵 인단백질(Kaleta E.F., 1990), 조류 백혈병 바이러스 항원 엔벨로프, gag 및 폴리머라제(Graf, T. et al., 1978), 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스 항원, 예컨대 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6 및 VP7(Mori, Y. et al., 2003; Borgan, M.A. et al., 2003), 조류 백혈증 바이러스 항원, 예컨대 엔벨로프, gag 및 폴리머라제(Bieth, E. et al., 1992); 조류 근건막섬유육종 바이러스(Kawai, S. et al., 1992), 조류 골수아세포증바이러스 항원 p15, p27, 엔벨로프, gag 및 폴리머라제, 뉴클레오캡시드 및 gs-b(Joliot, V. et al., 1993), 조류 골수아세포증 관련 바이러스(Perbal, B., 1995), 조류 골수구종증 바이러스(Petropoulos, C.J., 1997), 조류 육종 바이러스 항원, 예컨대 p19 및 엔벨로프(Neckameyer, W.S. et al., 1985) 및 조류 비장 괴사 바이러스 gag, 엔벨로프 및 폴리머라제(Purchase, H.G. et al., 1975)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 다른 면역원/항원에는 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 균주 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 39kDa 협막 단백질(Ali, H.A. et al., 2004; Rimler, R.B. 2001), 16kDa 외막 단백질(Kasten, R.W., et al., 1995), 리포폴리사카라이드(Baert, K. et al., 2005); 에세리키아 콜리 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 타입 1 섬모, P 섬모 및 컬리(curli)(Roland, K. et al., 2004); F1 섬모 어드해신, P 섬모 어드헤신, 에어로박틴 수용체 단백질 및 리포폴리사카라이드(Kariyawasam, S. et al., 2002); 마이코플라즈마 갈리셉티컴(Mycoplasma gallisepticum) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 주 막 항원 pMGA(또한 P67로 알려져 있음; Jan, G. et al. 2001; Noormohammadi, A.H. et al., 2002a), TM-1(Saito, S. et al., 1993), 어드해신(Barbour, E.K. et al., 1989), P52(Jan, G. et al., 2001), 혈청평판응집반응(SPA) 항원(Ahmad, I. et al., 1988); 마이코플라즈마 갈리나슘(Mycoplasma gallinaceum), 마이코플라즈마 갈리나럼(Mycoplasma gallinarum), 마이코플라즈마 갈로파보니스(Mycoplasma gallopavonis), 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 주요 막항원 MSPB(Noormohammadi, A.H. et al., 2002b) 및 165kDa 단백질(Ben Abdelmoumen, B. et al., 1999); 마이코플라즈마 멜레아글리디스(Mycoplasma meleagridis), 마이코플라즈마 이오웨(Mycoplasma iowae), 마이코플라즈마 풀로럼(Mycoplasma pullorum), 마이코플라즈마 이미탄스(Mycoplasma imitans), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 편모, 포린, OmpA, SEF21 및 SEF14 섬모(Ochoa-Reparaz, J. et al., 2004); 예컨대 SEF14 및 SEF21을 발현하는 갈리나럼(Gallinarum) 및 티피뮤리엄(Typhimurium)과 같은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 유래 항원; 캠필로박터 제주니(Camplylobacter jejuni) 유래 항원, 예컨대 편모, 67kDa 항원, CjaA, CjaC 및 CjaD 단백질(Widders, P.R. et al., 1998; Wyszynska, A. et al., 2004), 헤모필러스 파라갈리나럼(Haemophilus paragallinarum) 유래 항원, 예컨대 혈청군 A, B 및 C 항원, 예컨대 헤마글루티닌(Yamaguchi, T. et al., 1988); 리메렐라 아나티페스티퍼(Riemerella anatipestifer) 유래 항원, 예컨대 박테린 항원(Higgins, D.A. et al., 2000); 예컨대, 주요 외막 단백질(MOMP)(Vanrompay, D. et al., 1999)을 발현하는 혈청형 A 및 6B와 같은 클라미디아 시타시(Chlamydia psittachi) 균주 유래 항원; 에리시펠로트릭스 류시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathiae) 유래 항원, 예컨대 66-64kDa 단백질 항원(Timoney, J.F. et al., 1993); 에리시펠로트릭스 인시디오사(Erysipelothrix insidiosa) 유래 항원, 예컨대 박테린(Bigland, C.H. and Matsumoto, J.J., 1975), 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 항원, 예컨대 항원 P39 및 박테리오페린(Al-Mariri, A. et al., 2001), 보렐리아 안세리나(Borrelia anserina) 유래 항원, 예컨대 22kDa 주요 외표면 단백질(Sambri, V. et al., 1999); 외막 단백질 P66(Bunikis, J. et al., 1998) 및 OspC(Marconi, R.T. et al., 1993); 알칼리제네스 페컬리스(Alcaligenes faecalis), 스트렙토코커스 페컬리스(Streptococcus faecalis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 항원이 있다.
또한, 본 발명은 조류의 원생동물 항원 유래의 면역원/항원의 이용을 포함하며, 그 예로는 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 유래 항원, 예컨대 3-1E 항원(Lillehoj, H.S. et al., 2005; Ding, X. et al., 2004), 첨단복합체 항원(Constantinoiu, C.C. et al., 2004) 및 젖산염 탈수소효소(Schaap, D. et al., 2004), 에이메리아 막시마(Eimeria maxima) 유래 항원, 예컨대 gam56 및 gam82(Belli, S.I. et al., 2004), 56 및 82kDa 항원 단백질(Belli, S.I. et al., 2002), 및 EmTFP250(Witcombe, D.M. et al., 2004), 에이메리아 네카트릭스(Eimeria necatrix) 유래 항원, 예컨대 35kDa 단백질(Tajima, O. et al, 2003), 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella), 예컨대 TA4 및 SO7 유전자 산물(Wu, S.Q. et al., 2004; Pogonka, T. et al., 2003) 및 12kDa 난포낭 벽 단백질(Karim, M.J. 1996), 에이메리아 버미포미스(Eimeria vermiformis), 에이메리아 아데노에이데스(Eimeria adenoeides), 류코사이토존 카울러리(Leucocytozoon caulleryi) 유래 항원, 예컨대 R7 외막 항원(Ito, A., et al., 2005), 플라스모듐 렐릭텀(Plasmodium relictum), 플라스모듐 갈리나슘(Plasmodium gallinaceum) 유래 항원, 예컨대 CSP 단백질(Grim, K.C. et al., 2004) 및 17kDa 및 32kDa 단백질 항원(Langer, R.C. et al., 2002) 및 플라스모듐 엘롱가텀(Plasmodium elongatum) 유래 항원 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 양태는 조류 인플루엔자 바이러스 항원 또는 면역원을 이용한다. 또한, 본 발명은 일회 주사로 조류의 다발성 조류 질환을 방어할 수 있는 다가 백신 또는 면역원성 조성물과 같은 다양한 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
조류 인플루엔자 바이러스는 사람, 돼지, 말 및 심지어 해양 포유동물에게도 전염되었고, 사람 인플루엔자 유행병의 출연에 주요 기여인자였다. 오르토믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 인플루엔자 바이러스는 이의 핵단백질(NP)과 바탕질(M1) 단백질의 항원성 차이를 바탕으로, A, B 및 C로 분류된다. 모든 조류 인플루엔자 바이러스는 타입 A로 분류된다. 또한, 2가지 표면 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)의 항원성을 바탕으로 아형이 분류된다. 현재, 인플루엔자 A 바이러스 중에서 15개의 HA와 9개의 NA 아형이 확인되어 있다(Murphy, B.R., et al., 1996; Rohm, C. et al., 1996b). HA 항원성을 초래하는 HA1 영역의 아미노 산 서열은 아형 간에 30% 이상의 서열이 상이하다(Rohm, C. et al., 1996b). 모든 HA 및 NA 아형을 보유하는 바이러스가 조류 종에서 발견되었지만, 포유동물 인플루엔자 바이러스의 바이러스 아형은 제한적이다.
조류 인플루엔자 A 바이러스는 독성에 따라 다음과 같이 분류된다: 조류흑사병을 유발할 수 있는 고독성 타입, 및 일반적으로 약한 질병 또는 무증상 감염을 일으키는 무독성 타입. 드문 경우이지만, 실험실에서 병원성이 낮은 바이러스도 야생에서 심각한 질병의 발발을 유발하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 바이러스들과 관련된 이환율 및 치사율은 치명적 바이러스에 의해 유발되는 것보다 훨씬 낮은 경향이 있다.
고독성 조류 인플루엔자 바이러스는 오스트렐리아(1976년 [H7] (Bashiruddin, J.B. et al, 1992); 1985년 [H7] (Cross, G.M., 1987; Nestorowicz, A. et al, 1987), 1992년 [H7] (Perdue, M.L. et al, 1997), 1995년 [H7], 및 1997년 [H7]), 영국(1979년 [H7] (Wood, G. W., et al, 1993) 및 1991년 [H5] (Alexander, DJ. et al, 1993), 미국(1983년에서 1984년까지 [H5] (Eckroade, RJ. et al, 1987)), 아일랜드(1983년에서 1984년까지 [H5]) (Kawaoka, Y. et al, 1987), 독일(1979년 [H7] (Rohm, C. et al, 1996a), 멕시코(1994년에서 1995년까지 [H5] (Garcia, M. et al, 1996; Horimoto, T. et al, 1995), 파키스탄(1995년 [H7] (Perdue, M.L. et al, 1997), 이탈리아(1997년 [H5]), 및 홍콩(1997년 [H5] (Claas, EJ. et al, 1988))에서 가금류 폭동을 일으켰다. 어느 한 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 모두 H5 또는 H7 아형인 것으로 추정되고 있으며, 이러한 아형 특이성을 나타내는 이유는 아직 알려져 있지 않다. 독성 바이러스와 NA 아형의 관련성은 없는 것으로 보인다. 2가지 추가 아형인 H4[A/Chicken/Alabama/7395/75(H4N8)](Johnson, D.C. et al., 1976) 및 H10[A/Chicken/Germany/N/49(H10N7)]은 심한 조류흑사병과 같은 폭동 동안에 닭에서 분리되었다.
인플루엔자 A 바이러스의 구조는 상당히 유사하다(Lamb, R.A. et al., 1996). 전자현미경에서 이 바이러스들은 대략 구형(직경이 약 120nm)이고 사상인 비리온을 포함하는, 다형태성이다. HA 및 NA 분자에 해당하는 2가지 독특한 유형의 돌기(길이가 약 16nm)는 비리온의 표면에 존재한다. 이와 같은 2가지 당단백질은 짧은 소수성 아미노산 서열(경막 영역)에 의해 숙주 세포의 형질 막 유래의 지질 엔벨로프에 고정된다. HA는 N 말단 엑토도메인(ectodomain)과 C 말단 앵커(anchor)를 함유하는 타입 I 당단백질인 반면, NA는 N 인접 앵커와 C 말단 엑토도메인을 함유하는 타입 II 당단백질이다. HA는 세포 표면의 시알릴올리고사카라이드에 비리온을 부착시킬 수 있고(Paulson, J.C., 1985), 적혈구응집 활성을 초래한다(Hirst, G.K., 1941). HA는 감염에 대한 방어에 중요한 바이러스 중화 항체를 유도해 낸다. NA는 세포 및 비리온 표면의 시알산(HA에 의해 인식되는 시알릴올리고사카라이드 중의 주요 부)을 제거함으로써 비리온 응집을 차단하는 시알리다제(Gottschalk, A., 1957)이다(Paulson, J.C., 1985). NA에 대한 항체는 또한 숙주 방어에도 중요하다(Webster, R.G., et al., 1988).
HA 및 NA 외에도, M1 단백질의 제한된 수가 비리온에 통합된다(Zebedee, S.L. et al., 1988). 이들은 테트라머를 형성하고, H1 이온 채널 활성을 나타내며, 엔도솜에서 낮은 pH에 의해 활성화될 때, 비리온의 내부를 산성화시켜, 탈피를 촉진한다(Pinto, L.H. et al., 1992). 엔벨로프 내에 존재하는 M1 단백질은 어셈블리와 출아 시에 기능하는 것으로 생각된다. 일본쇄 RNA 분자(mRNA에 상보성이거나 네거티브 센스 서열)의 8개 분절은 바이러스 엔벨로프 내에 NP 및 3개 서브유닛의 바이러스 폴리머라제(PB1, PB2 및 PA)와 함께 함유되어 있고, RNA 복제 및 전사에 관여하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 함께 형성한다. 현재 비리온에 존재하는 것으로 알려진 NS2 단백질(Richardson, J.C. et al., 1991; Yasuda, J. et al., 1993)은 M1 단백질과 상호작용을 통해(Ward, A.C., et al., 1995) 핵으로부터 RNP의 유출에 역할을 하는 것으로 생각되고 있다(O'Neill, R.E. et al., 1998). 인플루엔자 A 바이러스의 유일한 비구조 단백질인 NS1 단백질은 세포 mRNA의 접목 및 핵 유출의 조절뿐만 아니라 해독 자극 등을 비롯하여 다수의 기능을 갖고 있다(Lamb, R.A., et al., 1996). 이의 주요 기능은 NS1 녹아웃 바이러스가 인터페론 무결손성 세포에서 부모 바이러스보다 증식 효율이 떨어지기는 하지만 생육성인 바, 숙주의 인터페론 활성을 중화시키는 것으로 생각된다(Garcia-Sastre, A. et al., 1988).
본 발명에 유용한 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원에는 HA, NA뿐만 아니라 M1, NS2 및 NS1이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원은 HA 및 NA 이다. 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원은 임의의 공지된 AI 균주, 예컨대 모든 조류 인플루엔자 A 균주, 임상 분리물, 야생 분리물 및 이의 재편성체로부터 유래될 수 있다. 이러한 균주 및 아형의 예에는 H10N4, H10N5, H10N7, H10N8, H10N9, H11Nl H11N13, H11N2, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N8, H13N2, H13N3, H13N6, H13N7, H14N5, H14N6, H15N8, H15N9, H16N3, HlNl, H1N2, H1N3, H1N6, H2N1, H2N2, H2N3, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N5, H7N7, H7N8, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8 및 H9N9이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 무엇보다도 항원소변이(antigenic drift) 및 항원대변이(antigenic shift)를 반영하는 변이 또는 달리 변경된 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 이용에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스의 항원성은 점돌연변이(항원소변이)에 의해 점차적으로 변화하거나 또는 유전자 재편성(항원대변이)에 의해 급변한다(Murphy, B.R. et al., 1996). HA 및 NA에 대한 면역학적 압력은 항원소변이를 유도하는 것으로 생각된다. 항원대변이는 비사람 인플루엔자 바이러스가 사람에게 직접 전염되거나, 또는 단세포를 감염시킨 2가지 다른 인플루엔자 바이러스 유래의 유전자의 재편성을 통해 유발될 수 있다(Webster, R.G. et al., 1982). 이론적으로, 8가지 다른 바이러스 게놈 분절의 셔플링(shuffling)으로부터 256가지 다른 조합의 RNA가 생성될 수 있다. 유전자 재편성은 실험실 조건 하에서 시험관내 및 생체내 모두에서 충분히 연구되어 있다(Webster, R.G. et al., 1975). 더욱 중요한 것은, 혼합 감염이 자연계에서 비교적 빈번하게 일어나고 유전자 재편성을 유도할 수 있어, 새로운 야 생 분리물, 하이브리드 형태 또는 재편성 형태를 생성할 수 있다는 점이다(Bean, W.J., et al., 1980; Hinshaw, V.S. et al., 1980; Young, J.F., et al., 1979). 종래의 순환성 바이러스의 재출현은 항원대변이가 일어날 수 있는 또 다른 기전이다.
따라서, 본 발명은 조류 인플루엔자의 임상 분리물, 조류 인플루엔자의 야생 또는 환경 분리물, 하이브리드 형태 및 조류 인플루엔자의 재편성 형태를 비롯하여 항원소변이 또는 항원대변이가 일어난 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 하나보다 많은 조류 인플루엔자 균주 및/또는 하이브리드에 대한 면역원성 반응을 자극하거나 조절하는 다가 조류 인플루엔자 백신 또는 면역원성 조성물을 제공하기 위해서 별도의 재조합 벡터에 전달되거나, 또는 하나의 재조합 벡터에 함께 전달되는, 본 명세서에 개시된 벡터 및 방법에 사용되는 하나보다 많은 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 용도를 포함한다.
인플루엔자 바이러스에 의해 감염되는 조류 종은 집 및 야생 조류 종을 비롯하여 다수가 있다. 그 예에는 닭, 칠면조, 오리, 뿔닭, 집거위, 메추라기, 꿩, 자고새류, 찌르레기과 새, 연작류새, 앵무새, 잉꼬, 갈매기, 섭금류, 바다새 및 에뮤가 있다(Easterday, B.C. et al., 1997; Webster, R.G. et al., 1988). 일부 감염된 새는 인플루엔자의 증후군을 보이지만, 그렇지 않은 새도 있다. 집 조류 종 중에서 칠면조는 인플루엔자 발발이 가장 흔한 조류이며, 닭도 역시 흔하기는 하지만 정도가 덜하다. 조류 인플루엔자 A 바이러스는 무증후성에서부터 약한 상기도 감염, 난(卵) 생성 및 급격히 치명적인 전신 질환에 이르기까지 일련의 증후군을 조 류에서 나타낸다(Eckroade, R.J., et al., 1987). 질환의 병도는 바이러스의 독성, 숙주의 면역 상태와 식이, 동반되는 세균 감염 및 숙주에게 부과된 스트레스를 비롯하여 다수의 요인에 따라 달라진다. 닭과 칠면조에서의 병원성에 따라서, 조류 인플루엔자 A 바이러스는 독성(조류흑사병을 유발할 수 있는) 또는 무독성(약하거나 무증후성 질환을 유발하는)으로 분류된다. 한 조류 종에 대해 고병원성인 경우에도, 인플루엔자 A 바이러스는 다른 조류종에는 병원성이 아닐 수 있다(Alexander, D.J. et al., 1986). 예를 들어, 오리는 닭에 치명적인 바이러스에 일반적으로 내성이 있다. 다른 예로서, 닭과 칠면조를 쉽게 죽이는 A/Turkey/Ireland/1378/85(H5N8)는 감염된 새의 다양한 내부 기관과 혈액에서 검출될 수는 있을지라도 오리에서 질환 증후군을 유발하지는 않는다(Kawaoka, Y. et al., 1987).
인플루엔자 바이러스는 감염된 새의 창자에서부터 분변으로 분비된다(Kida, H., et al., 1980; Webster, R.G., et al., 1978). 전염 방식은 직접 또는 간접적일 수 있다; 그 예에는 에어로졸 및 다른 바이러스 오염물과의 접촉이 포함된다. 감염된 새는 그 분변으로 다량의 바이러스를 배출하는 바, 많은 다른 품목이 오염될 수 있고(예, 사료, 물, 장치 및 우리), 바이러스의 전염에 기여할 수 있다. 수계 전염은 자연 물새 서식지에서 조류 인플루엔자 바이러스가 해마다 보전되는 기전을 제공할 수 있다. 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 가금류와 같은 상업적 조류에서 명백히 볼 수 있는 전형적인 징후와 증후군에는 난 생성 감소, 호흡 징후, 수포음, 과도 누루, 동염, 깃털이 없는 피부의 청색증(특히, 계관 및 아 랫볏), 머리와 얼굴의 부종, 주름진 깃털, 설사 및 신경계 장애 등이 있다.
드러나는 특징의 수는 새의 종과 나이, 바이러스 균주 및 동반되는 세균 감염에 따라 달라진다(Easterday, B.C. et al., 1997; Webster, R.G. et al., 1988). 경우에 따라, 새는 병의 어떠한 징후를 나타냄이 없이 죽을 수 있다(Alexander, D.J. et al., 1993; Wood, G.W., et al., 1994). 고병원성 바이러스가 접종된 닭에서 육안적 및 조직학적 환부는 상당히 유사하지만, 약간의 균주 변이를 나타낸다(Alexander, D.J. et al., 1986; Mo, I.P. et al., 1997; Swayne, D.E. et al., 1997). 보고된 증례 중에서 일부 차이는 실험 조건의 차이, 예컨대 접종 경로, 닭의 품종과 연령, 및 바이러스의 용량 등의 차이를 반영할 수 있다. 미세혈관 내피의 종창, 전신 울혈, 다병소성 출혈, 혈관주위 단핵세포 침윤 및 혈전증은 고독성 바이러스에 감염된 닭에서 일반적으로 관찰되는 증상이다. 이러한 바이러스는 혈관 내피 및 혈관주위 실질 세포에서 효과적으로 복제하며, 이것은 바이러스 전염 및 전신 감염에 중요할 수 있는 성질이다(Kobayashi, Y. et al., 1996; Suarez, D.L. et al., 1998). 또한, 바이러스 항원은 괴사 및 염증성 변화가 있는 다른 기관의 세포외에도 괴사성 심장 근육세포에서도 발견될 수 있다(Kobayashi, Y. et al., 1996).
또한, 본 발명은 세포에서 하나 이상의 항원 또는 면역원을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 실험실 환경에서의 예비 단계로서, 항원 또는 면역원은 리포터 단백질(예, 효소)을 암호화하는 것을 포함하여, 단백질 및 펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열로 치환될 수 있다. 리포터 단백질은 당업계에 공지되어 ㅇ 있고, 그 예에는 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제 및 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제 유전자가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 리포터 단백질의 다수와 이들의 검출 방법은 상용화된 많은 진단 키트에 일부로서 포함되어 있다. 당해의 항원 또는 면역원은 안티센스 핵산, 작은 간섭 RNA(siRNA), 리보자임 또는 다른 비해독 RNA, 예컨대 "가이드" RNA(Gorman et al., 1998) 등을 암호화할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터 및 방법은 재조합 벡터 또는 면역원성 조성물의 전달 시 면역 반응을 조정할 수 있는 치료 단백질 또는 보강 분자의 사용도 포함한다. 이러한 치료 단백질 또는 보강 분자는 면역조절성 분자, 예컨대 인터루킨, 인터페론 및 공자극성 분자를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 조류 검체의 면역 반응을 조절하는 것으로 당업계에 공지된 조류 사이토카인은 닭의 인터페론-α(IFNα)(Karaca, K. et al., 1998; Schijns, V.E. et al., 2000), 닭 인터페론-γ(IFNγ), 닭 인터루킨-1β(ChIL-1β)(Karaca, K. et al., 1998), 닭 인터루킨-2(ChIL-2)(Hilton, L.S. et al., 2002) 및 닭 골수단핵세포 성장인자(cMGF1 York, J.J. et al., 1996; Djeraba, A. et al., 2002). 면역조절성 분자는 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 공동투여되거나, 또는 면역조절성 분자(들)의 핵산이 본 발명의 재조합 벡터 내에 조류 면역원 또는 항원과 함께 공동발현될 수도 있다.
조류 인플루엔자 면역원과 같은 이종 서열의 검체 내에서의 발현은 그 항원이나 면역원의 발현 산물에 대한 검체의 면역반응을 초래할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터는 면역학적 조성물 또는 백신에 사용되어, 방어적일 수 있으나, 반 드시 방어적일 필요는 없는 면역 반응을 유도하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 상황에서 사용된 분자생물학 기술은 서적[Sambrook et al.,(2001)]에 기술되어 있다.
또 다른 대안으로 또는 부가적으로, 본 발명에 포함되는 면역원성 또는 면역학적 조성물에서, 항원 또는 면역원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이로부터 경막 도메인을 암호화하는 부분을 결실시킨 것일 수 있다. 더욱 다른 대안으로 또는 부가적으로, 벡터 또는 면역원성 조성물은 추가로 이종 tPA 시그널 서열, 예컨대 사람 또는 조류 tPA 및/또는 안정화 인트론, 예컨대 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 이종 뉴클레오타이드 서열을 시험관내 및 생체내에서 세포에 전달 및/또는 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따르면, 세포는 본 발명에 따른 재조합 사람 아데노바이러스 벡터로 감염된다(본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이). 세포는 바이러스 형질도입의 자연 과정에 의해 아데노바이러스 벡터로 감염될 수 있다. 또는, 벡터는 당업계에 공지된 다른 임의의 방법에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 표적 아데노바이러스 벡터(이하에 기술됨)와 접촉하고 수용체 매개 세포내이입 등과 같은 교대 기전에 의해 흡수될 수 있다. 다른 예로서, 벡터는 항체 또는 다른 결합 단백질을 이용함으로써 내재성 세포표면 단백질을 표적으로 할 수 있다.
벡터는 유전자 산물(예, 에피토프, 항원, 치료제 및/또는 항체) 조성물에 대 해 제시된 함량에 도달하는 함량으로 조류 검체에 투여될 수 있다. 물론, 본 발명은 본 명세서에 예시된 함량 이하 및 이상의 투약량, 및 조류 검체에게 투여되는 임의의 조성물, 예컨대 그 성분, 및 임의의 특별한 투여 방법에 대해 고찰하며, 적당한 조류 모델에서 치사량(LD) 및 LD50을 측정하는 방법 등에 의한 독성 측정; 및 혈청 적정 및 이의 분석, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석 등에 의한 분석으로 적당한 반응을 유도해 내는 조성물(들)의 투약량, 그 안의 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기를 측정하는 것이 바람직하다. 이러한 측정은 당업자의 지식과 본 명세서 및 여기에 인용된 문헌들로 인해 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
본 발명의 조성물의 예에는 오리피스를 위한, 또는 점막, 예컨대 구강, 비측, 항문, 질, 경구, 위내 등의 투여를 위한 액체 제제, 예컨대 현탁제, 용액제, 분무제, 시럽 또는 엘릭시르; 및 비경구, 경피부, 피하(즉, 하경부를 통해), 피내, 복강내, 근육내(즉, 날개 웨브, 날개 끝, 흉근 및 대퇴 근조직 천자를 통해), 비내 또는 정맥내 투여(예, 주사 투여), 예컨대 멸균 현탁제 및 유제가 포함된다. 이러한 조성물의 예에 대해서는 본원에 참고인용되고 비침습적 전달 방식, 즉 경피부 및 비내 투여를 통해 면역원성 또는 백신 조성물의 면역화 및 전달을 개시하고 있는 미국 특허 6,716,823(2004.4.6); 미국 특허 6,706,693(2004.3.16); 미국 특허 6,348,450(2002.2.19); 미국 출원 일련번호 10/052,323 및 10/116,963; 및 10/346,021에 언급되어 있다. 조류에 대한 다른 투여 및 전달 방법에는 음용수 또는 사료 중에서 재조합 벡터 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것이 있으며, 이 때 백신의 용량은 101 내지 104/동물 사이에서 선택될 수 있다.
근육내 주사 시, 투여는 흉부(흉근), 다리(상부 대퇴/측면 옆구리 근조직), 날개 웨브(비막), 하부 날개(겨드랑이), 및 날개 끝을 통해 수행될 수 있다. 사용되는 바늘의 길이와 직경(게이지)은 선택된 근육 중심으로 백신의 전달을 허용하는 것이어야 한다.
특히 바람직한 투여 방법은 난내(in ovo) 전달이다(Gildersleeve R.P., 1993a; Gildersleeve, R.P. et al., 1993b; Sharma, J.M., 1985; Sharma, J.M. et al., 1984). 난내 전달은 자동 주입기에 의한 균일한 용량의 백신 투여가 노동 및 시간 절약적인 바, 조류의 집단 면역화에 유망한 방법으로서 최근 생겨난 방법이다(Johnston et al., 1997; Oshop et al., 2002). 지금까지, 미국 육계의 80% 이상이 마렉병에 대하여 기계식 주입기로 난내 처리되었다(Wakenell et al., 2002). 이 방법은 또한 감염성 점액낭병(IBD) 및 뉴캣슬병(ND) 백신을 투여하는데 점차적으로 사용되고 있다. 또한, 면역 반응도 DNA 백신(Kapczynski et al., 2003; Oshop et al., 2003) 및 복제성 알파바이러스 벡터화된 백신(Schultz-Cherry et al., 2000)의 난내 전달에 의해 닭에서 유도되었다. 이들의 복제성 대응체와 비교했을 때, DNA 및 바이러스 벡터화된 난내 백신 및 면역원성 조성물은 배아를 사멸시키거나 해를 입힐 가능성이 적고, Ad 벡터는 특히 난내에서의 복제 불능성으로 인해 더 높은 순응도율을 나타낸다.
기계식 시스템, 장치 및 기구, 예컨대 INOVOJECT?로서 시판되는 것 등은 발 육 배아에 외상을 일으킴이 없이 정확하게 조정된 용량으로 화합물, 백신 및 면역원성 조성물을 서서히 주입하여, 병아리 취급을 줄이고, 자동화를 통해 부화장 운영능을 향상시키며, 육계 생산 원가를 감소시킨다. INOVOJECT? 및 다른 기계식 시스템, 기구 또는 장치는 주입 헤드를 난의 상부 위로 서서히 낮추고 작은 직경의 중공의 펀치가 껍질에 작은 구멍을 뚫어 작동한다. 주사바늘은 튜브를 통해 조절된 깊이(보통 2.54cm)까지 내려가서, 예정된 소량의 백신, 면역원성 조성물 또는 화합물을 배아로 전달한 다음, 바늘은 회수되고 멸균 세정액으로 세척된다. 난내 백신 및 유전자 전달 방법은 본 발명에 전문이 분명하게 참고인용된 미국 특허 4,458,630; RE 35973; 6,668,753; 6,601,534; 6,506,385; 6,395,961; 6,286,455; 6,244,214; 6,240,877; 6,032,612; 5,784,992; 5,699,751; 5,438,954; 5,339,766; 5,176,101; 5,136,979; 5,056,464; 4,903,635; 4,681,063; 미국 출원 일련번호 10/686,762 (2003.10.16); 10/216,427 (2002.8.9); 10/074,714 (2002.2.13); 및10/043,025(2002.1.9)에서 찾아볼 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 재조합 벡터, 백신 또는 면역원성 조성물을 난내 전달 또는 투여하기 위한 기구 또는 장치를 포함한다. 이러한 기구 또는 장치는 경우에 따라 본 발명의 재조합 사람 아데노바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물을 함유할 수 있고, 즉 조류에 난내 투여하기 위한 벡터 또는 면역원성 조성물이 사전에 적재되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 연속 투여 또는 본원에 기술된 방법의 연속 수행, 예컨대 증상의 요법 또는 치료 과정 및/또는 면역학적 조성물의 추가접종 투여 및/또는 초회항원-추가항원 투여 섭생 등에서 본 발명의 조성물의 주기적 투여를 포함하며; 연속 투여의 시간 및 방법은 과도한 실험없이도 확인될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 벡터를 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법, 예컨대 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 생체내 및/또는 시험관내 및/또는 생체외에서 생산하는 방법(후자 2가지는, 예컨대 본 발명에 따라 투여된 숙주 유래의 세포로부터 분리한 후, 예컨대 이러한 세포의 선택적인 증식 후) 및 이러한 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 예컨대 진단, 분석, 요법, 치료 등에 사용하는 용도를 포함한다.
벡터 조성물은 벡터와 적당한 담체 또는 희석제를 혼합하여 조제하며, 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체 조성물도 마찬가지로 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 적당한 담체 또는 희석제와 혼합하여 조제한다; 예컨대 본 명세서에 인용된 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164, WO 98/00166, 여기에 인용된 문헌들 및 여기에 인용된 다른 문헌들과 여기에 언급된 다른 교시들(예컨대, 담체, 희석제 등에 관해)을 참조한다.
이러한 조성물에서, 재조합 벡터는 적당한 수의학적 또는 약학적 허용성 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리학적 식염수, 포도당 등과 혼합될 수 있다. 또한, 조성물은 동결건조될 수도 있다. 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제, pH 완충제, 보강제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등을 원하는 조제물 및 투여 경로에 따라 함유할 수 있다.
DMSO는 특히 벡터 또는 벡터를 함유하는 면역원성 조성물의 난내 전달과 관련하여 백신 및 면역원성 조성물의 효능을 증강시키는 것으로 알려져 있다. DMSO는 세포막의 투과성을 증가시켜 백신의 효능을 증강시키는 것으로 생각된다(Oshop et al., 2003). 세포를 투과할 수 있고, 양수의 점도를 감소시키며 DMSO에 비해 더 높은 순응도율을 나타낼 수 있는 다른 제제 또는 첨가제는 백신 또는 면역원성 조성물의 조제 시, 특히 난내 전달에 의해 투여 시 사용될 수 있다. 인슐린, 렙틴 및 소마토트로핀 등과 같은 다양한 단백질의 흡수는 비내 투여 후 눈에 띄는 부작용 없이 테트라데실 말토사이드(TDM)와 같은 계면활성제에 의해 증강되는 것으로 밝혀져 있다(Arnold, et al., 2004). 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 TDM의 용도도 포함한다.
0.125% TDM을 함유하는 포뮬레이션은 세포 형태에 적당한 변경을 유발할 수 있지만, 고농도의 TDM(즉, 0.5%)은 더욱 심각한 형태 변화를 일시적으로 유도할 수 있다. TDM은 수정된 조류 난의 양수와 포유동물의 점성 비점막으로 인해 난내 환경에서의 벡터 전달을 증강시키는 것으로 생각된다. 문헌[Arnold, et al(2004)]에 기술된 TDM의 안전성 프로필은 또한 면역화된 조류의 건강 및 먹이사슬에 허용되는 순응도를 촉진시키는데 특히 유리하다.
투여되는 벡터의 함량은 치료받는 검체 및 증상에 따라 달라지며, 1일 체중당 1 또는 수 마이크로그램에서부터 수백 또는 수천 마이크로그램에 이르기까지 다양할 수 있고, 바람직하게는 백신 또는 면역원성 조성물의 용량은 101 내지 106 플 라크 형성 단위(PFU) 사이, 바람직하게는 102 내지 105 PFU/새 사이에서 선택되는 것이 좋다. 주사용인 경우, 상기 역가를 함유하는 백신은 약학적 또는 수의학적 허용성 액체, 예컨대 생리적 식염수로, 날개 웨브 투여용인 경우에 약 0.1ml 또는 0.01ml의 최종 부피로 희석되어야 한다. 본 발명의 벡터 및 방법은 난내 백신접종 및 1일령 병아리의 백신접종에 허용될 뿐만 아니라 더 성숙한 병아리 및 닭의 백신접종에도 허용된다.
벡터는 유전자 산물(예, 에피토프, 항원, 치료제 및/또는 항체) 조성물에 대해 기술된 함량을 달성하기 위한 함량으로 조류 검체에게 비침습적으로 투여될 수 있다. 물론, 본 발명은 본 명세서에 예시된 함량 이상 및 이하의 투약량도 예상하지만, 조류 검체에게 투여되는 임의의 조성물, 예컨대 그 성분, 및 임의의 특정 투여 방법마다 다음을 기준으로 결정하는 것이 바람직하다: 독성, 예컨대 적당한 조류 모델에서 치사량(LD) 및 LD50을 측정하여; 그리고 적당한 반응을 유도해 내는 조성물(들)의 투약량, 그 안의 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석에 의해. 이러한 측정은 당업자의 지식, 본 명세서 및 여기에 인용된 문헌으로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
재조합 벡터는 본 명세서에 기술되고 및/또는 여기에 인용된 문헌에 기술된 투약량에 대응하는 생체내 발현을 수득하기에 적합한 함량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 현탁액에 적당한 범위는 실험적으로 측정될 수 있다. 하나보다 많은 유전자 산물이 하나보다 많은 재조합체에 의해 발현된다면, 각 재조합체는 상 기 함량으로 투여될 수 있고, 또는 각 재조합체는 상기 함량을 함유하는 재조합체의 총합이 함께 제공되도록 투여될 수 있다.
본 발명에 이용된 벡터 또는 플라스미드 조성물에서, 투약량은 본 명세서에 인용된 문헌에 기술되거나 또는 본 명세서에 기술되거나 또는 본 명세서에서 인용된 문헌에서 참고되거나 인용된 문헌에 기술된 바와 같은 것일 수 있다. 투약량은 항원(들)이 직접 존재하는 조성물과 유사한 반응을 유도해 내는 충분한 양의 플라스미드이거나; 그러한 조성물의 투약량과 유사한 발현을 나타내거나; 또는 재조합 조성물에 의해 생체내에서 수득되는 발현과 유사한 발현을 나타내는 것이어야 한다.
하지만, 적당한 면역학적 반응을 유도해 내는 조성물(들)의 투약량, 여기에 함유된 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기는 혈청의 항체 적정 방법, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석법 등의 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 측정에는 당업자의 지식, 본 명세서 및 여기에 인용된 문헌에 개시되어 있는 바, 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 이와 마찬가지로, 연속 투여 시기도 본 명세서 및 당업계의 지식으로부터 지나친 실험없이 확인할 수 있는 방법으로 확인할 수 있다.
본 발명에서 고찰되는 면역원성 또는 면역학적 조성물은 추가로 보강제를 함유할 수 있다. 적합한 보강제에는 fMLP(N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌; 미국 특허 6,017,537) 및/또는 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및/또는 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체가 있다. 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체는 폴리알콜이나 당의 폴리알케닐 에테르 등과 가교될 수 있다. 이러한 화합물은 "카르보 머(carbomer)"라는 용어로 알려져 있다(Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, 1996, 6). 또한, 당업자는 미국 특허 2,909,462(참고인용됨)를 참고할 수도 있으며, 이 문헌에는 3개 이상의 하이드록시 기를 함유하는 폴리하이드록시화된 화합물, 일 양태로서 8개 이하의 하이드록시 기를 함유하는 폴리하이드록시화된 화합물, 다른 양태로서 3개 이상의 하이드록시의 수소 원자가 탄소원자 2개 이상을 함유하는 불포화 지방족 라디칼로 치환되어 있는 화합물, 또 다른 양태로서 상기 라디칼이 탄소원자 약 2개 내지 약 4개를 함유하는 것, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기인 화합물과 가교된 상기 아크릴 중합체가 논의되어 있다. 상기 불포화 라디칼은 메틸과 같은 다른 치환체를 내포할 수 있다. Carbopol?(Noveon Inc., Ohio, USA)이라는 상품명으로 시판되는 제품이 보강제로서 사용하기에 특히 적합하다. 이 제품은 알릴 슈크로스 또는 알릴펜타에리트리톨과 가교되어 있고, 이러한 제품으로 Carbopol? 974P, 934P 및 971P가 예시되어 있다.
말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체에 관해서는, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체이며 선형이거나 가교될 수 있는, 예컨대 디비닐 에테르와 가교될 수 있는 EMA? 제품(Monsanto)이 예시되어 있다. 또한, 참고 인용된 미국 특허 6,713,068 및 문헌[Regelson, W. et al., 1960]에도 예시되어 있다.
4차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질은 전문이 참고인용된 미국 특허 6,713,068에 기술되어 있는 것으로서, 본 발명의 방법과 조성물에도 사용될 수 있다. 이러한 양이온 지질 중에서, DMRIE (N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비 스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO 96/34109)가 바람직하며, 이것은 중성 지질, 유리하게는 DOPE(디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr J.P., 1994)와 결합하여 DMRIE-DOPE를 형성한 것이 바람직하다.
또한, 재조합 백신 또는 면역원성 또는 면역학적 조성물은 수중유 유제의 형태로 조제될 수도 있다. 수중유 유제는 기초 성분이 예컨대 라이트 액체 파라핀 오일(유럽 약전 타입); 이소프레노이드 오일, 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, EICOSANE™ 또는 테트라테트라콘탄; 이소부텐 또는 데센과 같은 알켄(들)의 올리고머화로부터 생성된 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 알콜 또는 산의 에스테르, 예컨대 플랜트 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 예컨대 이소스테아르산 에스테르일 수 있다. 이러한 오일은 유제를 형성하기 위해 유화제와 함께 사용되는 것이 바람직하다. 유화제는 비이온성 계면활성제[예컨대 소르비탄, 만나이드(예, 안하이드로만니톨 올레이트), 글리세롤, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르들일 수 있으며, 이들은 경우에 따라 에톡시화될 수 있다], 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 Pluronic? 제품, 예, L121일 수 있다. 보강제는 유화제(들), 미셀(micelle) 형성제 및 오일의 혼합물일 수 있으며, 그 예로는 상표명 Provax?(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)로서 입수용이한 것이 있다.
당해의 항원 또는 면역원을 하나 이상 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스 벡터, 예컨대 본 명세서에 따른 벡터는 약 5℃에서 액체 형태로 또는 동결건조된 형태로 안정제의 존재 하에 보전 및/또는 보존되고 저장될 수 있다. 동결건조는 공지된 표준 동결건조 절차에 따라 실시할 수 있다. 약학적 허용성 안정제는 SPGA(슈크로스 포스페이트 글루타메이트 알부민; Bovarnick, et al., 1950), 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 덱스트란, 트레할로스), 소듐 글루타메이트(Tsvetkov, T. et al., 1983; Israeli, E. et al., 1993), 단백질, 예컨대 펩톤, 알부민 또는 카세인, 단백질 함유 제제, 예컨대 탈지유(Mills, C.K. et al., 1988; Wolff, E. et al., 1990), 및 완충제(예, 포스페이트 완충제, 알칼리 금속 포스페이트 완충제)일 수 있다. 보강제 및/또는 매개제 또는 부형제는 동결 건조된 제제를 용해시키는데 사용될 수 있다.
이제, 본 발명을 더 상세히 설명하기 위한 비제한적 실시예를 예시할 것인데, 이는 본 발명의 다양한 양태를 예시하는 것이지, 어떠한 방식으로 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: A/Panama/2007/99 HA를 암호화하는 Ad 벡터의 작제
2003-2004년에 백신 생산을 위해 선택한 인플루엔자 바이러스 균주, A/Panama/2007/99(H3N2)(서열번호 1,2)는 질병관리센터(CDC)에서 입수했다. 이 인플루엔자 RNA의 역전사에 의해 적혈구응집소(HA) 유전자를 클로닝한 다음, 이하 표 1의 프라이머를 이용하여 폴리머라제 사슬 반응(PCR)으로 상기 HA 유전자를 증폭시 켰다.
표 1: Ad 벡터의 작제에 사용된 프라이머
Figure 112008018685831-pct00001
이러한 프라이머들은 A/Panama/2007/99 HA 유전자의 5' 및 3' 말단에 어닐링하는 서열뿐만 아니라, 상기 HA 개시 ATG 코돈의 상류에 바로 인접한 진핵세포 리보솜 결합 부위(Kozak, 1986)에 대응하는 서열, 및 후속 클로닝을 위한 KpnI 부위를 함유한다. 전장 HA 유전자를 함유하는 KpnI 단편은 pShuttle-CMV(He et al., 1998)(T.He로부터 제공됨)의 KpnI 부위에, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터의 전사 조절 하에 정확한 배향으로 삽입시켰다. A/Panama/2007/99 HA(AdPNM2007/99.H3)를 암호화하는 E1/E3 결손성 Ad5 벡터는 개시된 바와 같은(Zeng et al., 2001) 간단한 재조합 시스템을 이용하여 사람 293 세포에서 수득했다.
AdPNM2007/99.H3 벡터는 HA 삽입체와 벡터 사이에 5' 및 3' 결합부(junction)를 서열분석하여 확인했다. A/Panama/2007/99에 대한 HI 항체는 AdPNM2007/99.H3의 비내 투여 후 마우스에서 유도해 냈다.
실시예 2: 재조합 Ad 벡터의 난내 및 근육내 주사에 의한 닭의 면역화
사람 Ad 벡터화된 백신을 접종하여 닭을 면역화하는 방법은 지금까지 보고된 적은 없다. Ad5는 자연의 새에서는 발견되지 않는 바, 이 벡터는 닭 세포에서 효과 적으로 감염 및/복제할 수 없을 것으로는 생각되었다. 하지만, 놀랍게도 AdPNM2007/99.H3을 근육내 주사한 3마리 닭에서 2주 후 모두 512의 혈청 HI 역가가 달성되었다(도 1).
AdPNM2007/99.H3 벡터를 9일령 및 18일령의 닭 수정란에 주입한 경우에는, 9일령의 수정란에서는 8의 혈청 HI 역가가, 18일령의 수정란에서는 16의 혈청 HI 역가가 달성되었고, 부화 후 2주째 18일령 유래의 닭에서는 <4, 4 및 8의 HI 역가가 달성되었다. 이러한 결과는 E1/E3 결손성 사람 Ad5 벡터가 조류 세포에서 복제 불능성 및 형질도입 가능성이 있기 때문에 조류에서 백신 담체로서 사용될 수 있다는 것을 암시한다. 난내 백신접종에 의해 유도된 HI의 비교적 낮은 역가는 무엇보다도 투약량과 배아의 발달 연령 때문인 것으로 생각된다. Ad5 벡터는 닭 세포의 표면에서 발견되는 콕사키에바이러스 및 아데노바이러스 수용체(CAR)에 대한 그 섬유의 결합을 통해 닭 배아의 부분을 형질도입시킬 수 있었다(Tan et al., 2001). 면역 반응은 적은 수의 세포만을 형질도입시킨 후에 닭에서 유도해 낼 수 있는데, 그 이유는 Ad가 내재화 후 엔도솜을 파괴하여 벡터 DNA를 보호할 수 있는 강력한 벡터이기 때문이다(Curiel, 1994). 또한, Ad 성분의 적어도 하나, 즉 헥손은 고면역원성이어서, 외인성 항원에 보강 활성을 부여한다(Molinier-Frenkel et al., 2002).
AdPNM2007/99.H3 벡터는 9일령(그룹 1) 및 18일령(그룹 2)의 닭 수정란의 양막에 각각 5x1010pfu/난의 용량을 200㎕의 용량으로 주입했다. 그룹당 6개의 난을 사용했지만, 그룹 1에서는 2마리만, 그룹 2에서 3마리만 부화했다. 혈청 HI 역가는 부화 후 2주째 종래 개시된 바와 같이(Van Kampen et al., 2005) 측정했다. 그룹 3에서는 4주령의 닭 3마리에게 2.5x1010 pfu/동물 용량을 100㎕의 용량으로 근육내 주사했다. HI 역가는 면역화 후 2주째 측정했다.
그룹 1(9일령 배아의 난내 면역화)에서는 8 및 16의 HI 역가가 달성되었고, 그룹 2(18일령 배아의 난내 면역화)에서는 <4(임의적으로 2의 역가로 지정됨), 4 및 8의 HI 역가가 달성되었고; 그룹 3(4주령 닭의 근육내 면역화)에서는 512의 HI 역가가 3마리 모두에서 달성되었다. 도 1은 log2 스케일의 HI 역가를 보여준다. 사각형은 그룹 1에 속하는 각 닭의 HI 역가에 해당하고; 삼각형은 그룹 2에 속하는 각 닭의 HI 역가에 상관된 것이다. 원은 그룹 3에 속하는 각 닭의 HI 역가에 해당한다.
실시예 3: A/Turkey/Wisconsin/68 H 유전자를 암호화하는 Ad 벡터(AdTW68.H5)의 작제
AI 바이러스 균주의 H를 암호화하는 A/Turkey/WI/68H(서열번호 3,4)의 DNA 주형은 USDA 사우스이스트 파울트리 리서치 래보레이토리(Southeast Poultry Research Laboratory; 조지아 아텐스 소재)에서 입수하여 표 2에 제시된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다.
표 2: Ad 벡터의 작제에 사용된 프라이머
Figure 112008018685831-pct00002
이러한 프라이머들은 A/Turkey/Wisconsin/68 H 유전자의 5' 및 3' 말단에 어닐링하는 서열뿐만 아니라, 상기 H 개시 ATG 코돈의 상류에 바로 인접한 진핵세포 리보솜 결합 부위(Kozak, 1986) 및 후속 클로닝을 위한 고유 제한효소 부위를 함유한다. 전장 H 유전자를 함유하는 단편은 셔틀 플라스미드 pAdApt(Crucell에서 제공, 네덜란드 라이덴 소재)의 HindIII-BamHI 부위에, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터의 전사 조절 하에 정확한 배향으로 삽입시켰다. 이어서, A/Turkey/Wisconsin/68 H 유전자(AdTW68.H5)를 암호화하는, RCA 부재 E1/E3 결손성 Ad5 벡터는 개시된 바와 같은(Shi et al., 2001) Ad5 백본 플라스미드 pAdEasy1(He et al., 1998)과 pAdApt-TW68.H5의 공동형질감염에 의해 사람 PER.C6 세포(Crucell에서 제공)에서 생성했다. AdTW68.H5 벡터는 H 삽입체와 벡터 백본 사이에 5' 및 3' 결합부를 서열분석하여 확인했다.
Ad 벡터화된 난내 AI 백신은 고속 생산될 수 있고 출현한 AI 유행병에 대응하여 최고의 안전성 프로필을 보장하는 상황에서 닭 개체군에 집단 투여될 수 있다. 크로마토그래피 매개의 정제(Konz, 2005) 및 장기 저장(Evans, 2004)용 동결기를 필요로 하지 않는 완충액과 함께 무혈청 현탁액 생물반응기(Lewis, 2006)에서 특성이 잘 규명되어 있는 PER.C6 세포주 중의 RCA 부재 Ad5 벡터의 대량 생산은 Ad5 벡터의 생산비를 크게 감소시킬 것이다. AI 백신 생산의 기질로서 수정란 대신에 배양된 세포의 이용은 특히 수정란의 공급이 부족할 수 있을 때 AI의 발발 동안에 중요하다. 이러한 Ad5 벡터화된 AI 백신은 이 벡터가 단지 바이러스 HA를 암호화하기 때문에 DIVA 전략에 부응하는 것이다. 즉, 효소 결합된 면역흡착 분석에 의한 항AI 핵단백질의 측정과 함께 혈청 HI 항체의 분석은 AI 백신 또는 바이러스에 대한 노출을 신속하게 측정할 수 있게 할 것이다.
에어로졸 AI 백신은 뉴캣슬병 바이러스 벡터(Swayne, 2003) 또는 무병원성 인플루엔자 바이러스 백본을 함유하는 재편성 인플루엔자 바이러스(Lee, 2004)로부터 HA를 발현시킴으로써 개발할 수 있지만, RCA 부재 Ad5 벡터화된 난내 AI 백신은 DIVA 전략에 부응하는 비복제성 AI 백신의 균일한 용량을 자동 전달함으로써 면역화된 새의 HPAI 바이러스 감염을 저지할 수 있는 특별한 기반을 마련한다. 복귀체 발생 위험과 관련이 있고 환경의 표적 종 및 비표적 종 모두에서 유전자 변이된 유기체를 확산시키는 복제성 재조합 벡터와 달리, RCA 부재 Ad5 벡터는 야생에서 전파되지 않을 것이다. 동시 순환성 야생 인플루엔자 바이러스와 바람직하지 않은 추가 재편성체를 발생시킬 수 있는 재편성 AI 바이러스 백신(Hilleman, 2002)과 달리, Ad5의 DNA 게놈은 인플루엔자 바이러스의 분절화된 RNA 게놈과 재편성을 일으키는 것이 불가능하다.
실시예 4: AdTW68.H5의 난내 접종
난내 접종은 종래 개시된 바와 같이 수행했다(Senne, 1998; Sharma et al., 1982). 접종 전에 모든 배아는 촛불에 비추어 생육력을 살피고, 접종 부위를 표시 한 뒤, 3.5% 요오드를 함유하는 70% 에틸 알콜 용액으로 소독했다. 뾰족한 팁이 장착된 회전 드릴을 이용하여 껍질에 구멍을 만들었다. 접종은 양막-요막 경로를 통해 1ml 주사기를 이용하여 수행했다. 접종 후, 구멍은 용융 파라핀으로 밀봉했다.
실시예 5: AdTW68.H5의 접종 후 혈청학
AI 균주 A/Turkey/WI/68을 SPF 닭 수정란에서 계대배양하여 106 배아 감염 용량 50%/ml의 역가를 달성했다. 양막요막액을 적혈구응집 활성에 대해 검사했다. 각 혈청 시료의 항체 역가는 종래 기술된(Swayne et al., 1998, Thayer et al., 1998) AI 바이러스의 4 적혈구응집 단위를 이용하여 적혈구응집 억제를 통해 측정했다.
실시예 6: AI 게놈의 시료채취 및 정량분석
각 닭에서 수득한 구인두 시료를 뇌심장침출배지(Difco, 미시간 디트로이트소재) 1.0ml에 현탁시키고 -70℃에 저장했다. RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 추출했다. 정량적 실시간 RT-PCR은 종래 기술된 바와 같이(Spackman, 2002), 타입 A 인플루엔자 바이러스 기질 RNA에 특이적인 프라이머로 수행했다. 바이러스 RNA는 공지된 양의 대조군 A/Ck/Queretaro/14588-19/95 RNA(101.0 내지 106.0 EID50/ml)로부터 작도된 표준 곡선을 이용함으로써 사이클 역치로부터 산입되었다. 실시예 7: AdTW68.H5의 난내 접종과 이어서 부화후 추가접종에 의한 닭의 면역화
접종에 의한 닭의 면역화는 1011 바이러스 입자/ml(vp/ml)를 함유하는 AdTW68.H5 300㎕를 SPF 수정란에 수정 10일째 또는 18일째 투여하여 수행했다. 각 그룹의 부화된 병아리는 동일하게 2그룹으로 나누었다: 병아리 절반에게는 동일한 AdTW68.H5 용량을 부화 후 15일째 비측 경로를 통해 재백신접종하고, 나머지 병아리에게는 부화후 추가접종을 적용하지 않았다.
이러한 닭 그룹에서 부화후 28일째 수득한 혈청에서 검출되는 HI 항체 역가는 도 2에 도시했다. 수정 10일째 난내 백신접종된 병아리는 2 내지 7 log2(평균 4.2) 사이의 HI 역가를 나타냈고; 수정 후 10일째 백신접종하고 부화 후 추가 접종한 병아리는 2 내지 9 log2(평균 5.5) 사이의 HI 역가를 나타냈으며; 수정 18일째 백신접종하고 부화 후 15일째 추가접종한 병아리는 2 내지 8 log2(평균 5.7) 사이의 HI 역가를 나타냈다. 종합해보면, 상기 사람 Ad 벡터화된 AI 백신의 난내 투여는 닭에서 AI에 대한 강한 면역 반응을 유도한 반면, 닭에 상기 벡터화된 백신의 비내 점비는 최근 입증된 것처럼(Gao, 2006) 비효과적이다.
실시예 8: 고병원성 조류 인플루엔자 균주 HPAI A/Ck/Queretaro/19/95(H5N2)를 이용한 치사량 항원공격에 대한 AdTW68.H5 난내 접종의 방어성
19마리 SPF 닭 배아를 배양 18일째 실시예 7에서 기술한 바와 같이 동일한 용량의 AdTW68.H5로 난내 경로를 통해 면역화시켰다. 부화된 병아리는 날개 밴드로 각각 표식했다. 12마리 닭 그룹에게는 부화 후 15일째 비측 경로를 통해 추가접종하고, 나머지 닭 7마리는 추가접종하지 않았다. 혈액 시료는 날개 밴드가 달린 각 닭으로부터 23일째와 29일째에 채취하여 조류 인플루엔자 균주 A/Turkey/Wisconsin/68에 대한 항체의 HI를 검사했다. 종합해 보면, 상기 닭에서 검출된 HI 항체 역가(도 3)는 이전 시험(도 2)에서 수득된 값과 유사했다. 대부분의 닭들은 ≥5 log2의 역가를 달성했다. 난내 접종으로만 백신접종된 병아리는 부화 후 23일 째 5 내지 9 log2의 역가를 달성했다(도 3). 이 닭들은 부화후 29일경까지 항체 역가를 유지 또는 증가시켰다. 비내 추가접종과 함께 난내 백신접종 시에는, 부화 후 23일까지 3 내지 9 log2 사이의 다양한 항체 역가를 나타냈다(도 3). 이전 그룹에서와 같이 마찬가지로, 대부분의 병아리는 부화 후 29일경 1 또는 2 log2 단계 정도 역가를 증가시켰다.
생물안전 등급 3+인 시설에서 HPAI A/Ck/Queretaro/19/95(H5N2)(Horimoto, 1995, Garcia, 1998)의 105 배아 감염 용량(EID50)을 구인두로 접종하여 항원공격을 수행했다. 이 항원공격 균주의 H 유전자는 Ad 벡터화된 백신에 사용된 AI 균주 A/Tk/WI/68의 H(GenBank 수탁번호 U79448 및 U79456)(서열번호 5, 6, 7, 8)와 90.1% 뉴클레오타이드 동일성 및 94.4% 추론된 아미노산 유사성을 보유했다.
난내 백신접종한 병아리 7마리, 난내 백신접종하고 이어서 부화후 15일째 비내 추가접종한 병아리 12마리, 및 백신접종하지 않은 대조군 11마리를 포함한 총 30마리 닭에게 부화후 34일째 항원을 주입했다.
14일의 실험 기간 동안 항원주입된 닭의 이환율 및 치사율을 매일 관찰했다. AI 임상 징후, 예컨대 닭볏과 아랫볏의 부종, 결막염, 식욕감퇴 및 저체온증 등이 대조 닭 11마리 중 10마리에서 항원주입 후 2일째에 관찰되었다. 2일 후, 대조군에 속하는 대부분의 생존 닭은 닭볏 괴사, 아랫볏 부종, 설사, 탈수, 기면 및 다리 정강이의 피하 출혈을 보였다. 백신접종된 닭에서는 질병의 징후가 전혀 발생되지 않았다. AdTW68.H5(19/19)를 백신접종한(난내로만 그리고 난내 + 비내 추가접종) 모든 닭은 항원주입에도 살아남았다(도 4).
항원주입된 닭의 A/Chiken/Quertaro/19/95의 바이러스 게놈은 항원주입 후 2일, 4일 및 7일째 수집한 구인두 면봉채취물에서 실시간 역전사효소-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석했다. 항원주입 후 7일째 백신접종된 닭과 백신접종되지 않은 닭 사이의 AI 바이러스 게놈의 농도에는 유의적인 차이가 나타났다(P<0.05)(도 5). 면역화된 닭에서 검출가능한 바이러스 RNA의 부재는 난내 백신접종이 1주안에 파급되는 AI 바이러스를 저지할 수 있는 면역 반응을 유도해 냈음을 입증하는 증거를 제공한다.
이러한 결과는 종합적으로 여러 인플루엔자 바이러스(사람 및 조류 기원) 유래의 H 유전자를 암호화하는 RCA 부재 사람 Ad 벡터로 난내 면역화된 닭이 동종 AI 바이러스에 대한 HI 항체 역가를 발생시켰고, 동일한 H형의 고병원성 AI 바이러스 균주에 의한 치명적인 항원공격에 대해서 방어되었음을 보여준다.
실시예 9: 고병원성 조류 인플루엔자 균주 A/Swan/Mongolia/244L/2005(H5N1)의 치명적 항원공격에 대한 AdTW68.H5 난내 접종의 방어성
AdTW68.H5 벡터화된 AI 백신이 최근 H5N1 HPAI 바이러스 균주에 대한 방어작 용을 부여할 수 있는지를 측정하기 위해, 닭 31마리에게 2x108 ifu 용량의 AdTW68.H5 벡터를 난내 백신접종했다. 대조군으로는 Ad5 벡터에 노출되지 않은 닭 10마리와 무관련 항원(파상풍 독소 C 단편)(Shi et al., 2001)을 암호화하는 Ad5 벡터(AdCMV-tetC)를 백신접종한 닭 10마리가 포함되었다.
D31일째, 대조군과 면역화된 닭에게 H5N1 AI 바이러스 A/Swan/Mongolia/244L/2005(이 항원공격 균주의 HA는 A/Turkey/Wisconsin/68 균주의 HA와 89%의 추론된 HA 아미노산 서열 유사성을 보유했다)를 항원주입했다. 도 6에 도시된 바와 같이, 난내 면역화는 D25일째, 1 내지 6 log2 범위의 항체를 유도했다. 백신접종되지 않은 닭(10/10)과 AdCMV-terC 면역화된 닭(10/10)은 모두 측정가능한 HI 항체를 전혀 생산하지 않았고, 모두 항원주입 후 9일 이내에 AI로 인해 죽었고, AdTW68.H5 백신접종된 닭의 68%(21/31)는 항원주입 후 10일 째에도 임상 징후 없이 생존했다(도 7). 주목할 점은, HI 역가가 ≥3log2인 면역화된 그룹의 닭 7마리(도 6)는 상기 매우 치명적인 H5N1 AI 바이러스로 인해 사망했다. 이러한 H5N1 AI 바이러스에 대한 생존율은 항원성이 더욱 유사한 HA를 암호화하는 Ad5 벡터를 난내 백신접종한 경우 향상될 수 있을 것으로 생각된다.
이러한 결과들은 조류 H5 HA를 암호화하는 RCA 부재 사람 Ad5 벡터로 난내 면역화된 닭이 HPAI 바이러스에 대한 방어 면역을 유도해 낼 수 있음을 입증한다. 이와 같이 본 발명의 상세한 바람직한 양태를 설명했지만, 이의 다양한 분명한 변형이 본 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어남이 없이 가능한 바, 이하 청구의 범위 에 의해 정의되는 본 발명은 상기 상세한 설명에 기술된 특별한 세부 사항들에 의해 제한되는 것이 아니라는 것은 자명하다.
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Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 atc gag aaa acg aac gag aaa ttc cat caa att gaa aaa gaa ttc tca 1248 Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 gaa gta gaa ggg aga att cag gac ctc gag aaa tat gtt gag gac act 1296 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 aaa ata gat ctc tgg tcg tac aac gcg gag ctt ctt gtt gcc ctg gag 1344 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 aac caa cat aca att gat cta act gac tca gaa atg aac aaa ctg ttt 1392 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 gaa aga aca aag aag caa ctg agg gaa aat gct gag gat atg ggc aat 1440 Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 ggt tgt ttc aaa ata tac cac aaa tgt gac aat gcc tgc ata ggg tca 1488 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 485 490 495 atc aga aat gga act tat gac cat gat gta tac aga gac gaa gca tta 1536 Ile 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aag gat tgc agt gtg gct gga tgg ctt ctt ggg aac 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gag ttc cta aat gta ccg gaa tgg tca tat att gta 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 gag aag gac aat cca acc aat ggc tta tgt tat ccg gga gac ttc aat 288 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 gat tat gaa gaa ctg aag tat tta atg agc aac aca aac cat ttt gag 336 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 aaa att caa ata atc cct agg aac tct tgg tcc aat cat gat gcc tca 384 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 tca gga gtg agc tca gca tgc cca tac aat ggt agg tct tcc ttt ttc 432 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 agg agt gtg gtg tgg ttg atc aag aag agt aat gta tac cca aca ata 480 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 aag agg 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270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gtg ggt gct ata aat tcc agt 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 atg cct ttt cac aat gtt cat ccc ctt acc att gga gag tgt ccc aaa 912 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 tat gtc aaa tca gat aaa ctg gtc ctt gca aca gga ctg agg aac gtg 960 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 cct cag aga gaa aca aga ggt ctg ttt gga gca ata gca gga ttc ata 1008 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 gaa ggg ggg tgg caa gga atg gta gat gga tgg tat ggt tac cat cat 1056 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 agc aac gag cag gga agt gga tat gct gca gac aaa gag tcc act cag 1104 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 aaa gca atc gac ggg atc acc aat aaa gtc aac tca atc att gac aaa 1152 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 atg aac act caa ttc gaa gcc gtt ggg aaa gaa ttc aac aac tta gaa 1200 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat gga ttt cta gat 1248 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 gta tgg act tac aat gca gaa ctt ctg gtg ctc atg gaa aat gaa aga 1296 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 act ctg gat ttc cat gat tca tat gtc aag aac cta tac gat aag gtc 1344 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 cga ctc cag ctg aga gat aat gca aaa gaa ttg ggc aat ggg tgt ttg 1392 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 gag ttc tcc cac aaa tgt gac aat gaa tgc atg gaa agt gtg aga aac 1440 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca agg ctg aac aga 1488 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 gag gaa ata gat gga gtc aaa ttg gag tca atg ggc acc tat cag ata 1536 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 cta tca att tac tca aca gtg gcg agt tcc cta gca ctg gca atc atg 1584 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 gta gct ggt ctg tct ttt tgg atg tgc tcc aat gga tca ttg caa tgc 1632 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 aga att tgc atc tag 1647 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 4 <211> 548 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys 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Gln Ile 500 505 510 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 5 <211> 1659 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1656) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1656) <223> Influenza A virus (A/chicken/Queretaro/7653-20/95(H5N2)) Genbank Accession No. U79448 <400> 5 gac caa atc tgc att ggt tat cat gca aac aat tca aca aaa cag gtt 48 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 gac aca atc atg gag aag aat gtg acg gtc aca cat gct cag gac ata 96 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 ctg gaa aaa gaa cac aat gga aga ctc tgc agt ctt aaa gga gtg aag 144 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Arg Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Lys 35 40 45 ccc ctc att ctg aag gat tgc agt gta gct gga tgg ctt ctt gga aat 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gaa ttc ctg aat gta ccg gaa tgg tca tat att gtg 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 gaa aag gac aat cca gcc aat ggc ctg tgt tat ccg gga aac ttc aac 288 Glu Lys Asp Asn Pro Ala Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 gat tat gaa gaa ctg aag cat tta atg agc agc aca aac cat ttt gag 336 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 aaa att cag ata ttt cct agg agc tct tgg tcc aac cat gat gcc tca 384 Lys Ile Gln Ile Phe Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 tca gga gtg agc tct gca tgc cca tac aat ggt agg tct tcc ttt ttc 432 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 agg aat gta gtg tgg ctg atc aag aag aat aat gtg tac cga aca ata 480 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Val Tyr Arg Thr Ile 145 150 155 160 aag agg acc tac cat aac act aat gta gaa gac ctt tta ata tta tgg 528 Lys Arg Thr Tyr His Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 gga att cat cac cct aat gat gca gct gaa cag ata aaa ctc tac cag 576 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Ile Lys Leu Tyr Gln 180 185 190 aac ccg aac act tac gtg tca gtg gga aca tca aca ttg aat caa agg 624 Asn Pro Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 tca atc cca gaa ata gcc acc aga ccc aag gtg aac gga cag agt gga 672 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 agg atg gaa ttt ttt tgg aca ata cta agg ccg aac gac tca atc aac 720 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ser Ile Asn 225 230 235 240 ttt gag agt act ggg aac ttt ata gct cct gaa tat gca tac aag ctt 768 Phe Glu Ser Thr Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Leu 245 250 255 att aaa aaa gga gat tca gca atc atg aaa agt gaa ctg aat tat ggt 816 Ile Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Asn Tyr Gly 260 265 270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gcg ggt gct ata aat tcc agg 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ala Gly Ala Ile Asn Ser Arg 275 280 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Glu Phe 385 390 395 400 aac aac cta gaa agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat 1248 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415 ggc ttt ata gat gta tgg act tac aat gcg gaa ctt cta gtg ctc atg 1296 Gly Phe Ile Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430 gaa aac gaa aga act ctg gat ctc cat gat tca aat gtc aag aaa tta 1344 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Leu His Asp Ser Asn Val Lys Lys Leu 435 440 445 tac gat agg gtc cga ctc cag ctg aga gac aat gcc aaa gaa tta ggc 1392 Tyr Asp Arg Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460 aat ggg tgc ttt gaa ttc tac cac aag tgt gac aat gaa tgc atg gaa 1440 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480 agt gtg aga aat gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca 1488 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser 485 490 495 aga ctg aac agg gag gaa ata gac gga gtc aaa tta gaa tca atg ggg 1536 Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly 500 505 510 act tat cag ata ctt tca atc tat tca aca gta gcg agt tcc cta gca 1584 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525 ctg gca atc atg gta gct ggt cta tct ttt tgg atg tgt tcc aat gga 1632 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 tca tta cag tgc aga att tgc atc tag 1659 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 6 <211> 552 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 6 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Arg Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Ala Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Phe Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Val Tyr Arg Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr His Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Ile Lys Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ser Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Thr Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Leu 245 250 255 Ile Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Asn Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ala Gly Ala Ile Asn Ser Arg 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Phe Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln 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Met Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 7 <211> 1647 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1644) <223> Influenza A virus (A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)) Genbank Accession No. U79456 <400> 7 gac caa atc tgc atc ggt tat cat gca aac aat tca aca aaa caa gtt 48 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 gac aca atc atg gag aag aat gtg acg gtc aca cat gct caa gat ata 96 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 ctg gaa aaa gag cac aac ggg aaa ctc tgc agt ctc aaa gga gtg agg 144 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 ccc ctc att ctg aag gat tgc agt gtg gct gga tgg ctt ctt ggg aac 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gag ttc cta aat gta ccg gaa tgg tca tat att gta 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu 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Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 aac tcg aac act tat gtg tct gta gga aca tca aca cta aat cag agg 624 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 tca att cca gaa ata gct acc agg ccc aaa gtg aat gga caa agt gga 672 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 aga ata gaa ttt ttc tgg aca ata cta agg ccg aac gat gca atc agc 720 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 ttt gaa agt aat ggg aac ttt ata gct cct gaa tat gca tac aag ata 768 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 gtt aaa aag gga gat tca gca atc atg aga agc gaa ctg gag tat ggc 816 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gtg ggt gct ata aat tcc agt 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 atg cct ttt cac aat gtt cat ccc ctt acc att gga gag tgt ccc aaa 912 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 tat gtc aaa tca gat aaa ctg gtc ctt gca aca gga ctg agg aac gtg 960 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 cct cag aga gaa aca aga ggt ctg ttt gga gca ata gca gga ttc ata 1008 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 gaa ggg ggg tgg caa gga atg gta gat gga tgg tat ggt tac cat cat 1056 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 agc aac gag cag gga agt gga tat gct gca gac aaa gag tcc act cag 1104 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 aaa gca atc gac ggg atc acc aat aaa gtc aac tca atc att gac aaa 1152 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 atg aac act caa ttc gaa gcc gtt ggg aaa gaa ttc aac aac tta gaa 1200 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat gga ttt cta gat 1248 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 gta tgg act tac aat gca gaa ctt ctg gtg ctc atg gaa aat gaa aga 1296 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 act ctg gat ttc cat gat tca tat gtc aag aac cta tac gat aag gtc 1344 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 cga ctc cag ctg aga gat aat gca aaa gaa ttg ggc aat ggg tgt ttg 1392 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 gag ttc tcc cac aaa tgt gac aat gaa tgc atg gaa agt gtg aga aac 1440 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca agg ctg aac aga 1488 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 gag gaa ata gat gga gtc aaa ttg gag tca atg ggc acc tat cag ata 1536 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 cta tca att tac tca aca gtg gcg agt tcc cta gca ctg gca atc atg 1584 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 gta gct ggt ctg tct ttt tgg atg tgc tcc aat gga tca ttg caa tgc 1632 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 aga att tgc atc tag 1647 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 8 <211> 548 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 8 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers Used in Construction of Ad vectors <400> 9 cacacaggta ccgccatgaa gactatcatt gctttgagc 39 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers Used in Construction of Ad vectors <400> 10 cacacaggta cctcaaatgc aaatgttgca cc 32

Claims (72)

  1. 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 조류에 난내(in ovo) 투여하는 단계
    를 포함하는, 조류에 조류 인플루엔자에 대한 면역 반응의 유도 방법으로서,
    상기 면역 반응의 유도는 조류 인플루엔자 바이러스 공격에 대한 보호를 제공하는, 면역 반응의 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 아데노바이러스 발현 벡터를 난당(per egg) 1x108 내지 1x1011 pfu의 양으로 투여하거나, ifu에 의한 측정시 상기 양과 동등한 양 또는 바이러스 입자로 측정시 상기 양과 동등한 양으로 투여하는, 면역 반응의 유도 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 아데노바이러스 발현 벡터를 난당(per egg) 5x1010 pfu의 양 또는 난당 2x108 ifu의 양 또는 난당 3x1010 바이러스 입자의 양으로 투여하는, 면역 반응의 유도 방법.
  4. 제1항에 있어서, 면역 반응이 난내(in ovo) 투여된 것과 상이한 인플루엔자 아형으로부터의 보호를 제공하는, 면역 반응의 유도 방법.
  5. 제1항에 있어서, 조류가 부화 후 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 추가로 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 유도 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 추가 투여는 부화 후 2주 내지 4주에서 추가 투여되는, 면역 반응의 유도 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 추가 투여는 근육내 또는 비내(intranasal)로 투여되는, 면역 반응의 유도 방법.
  8. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 면역 반응의 유도 방법.
  9. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 복제 가능 아데노바이러스(Replication competent adenovirus; RCA) 부재인, 면역 반응의 유도 방법.
  10. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 RCA 부재의 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 면역 반응의 유도 방법.
  11. 제1항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 AdEasy 시스템 또는 AdHigh 시스템 유래인, 면역 반응의 유도 방법.
  12. 제1항에 있어서, 조류가 닭인, 면역 반응의 유도 방법.
  13. 제1항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 하나 이상의 아데노바이러스 혈청형 유래의 부분바이러스입자(subviral particles)를 포함하는, 면역 반응의 유도 방법.
  14. 제1항에 있어서, 면역조절성 분자(immunomodulatory molecules)가 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원과 함께 투여되는, 면역 반응의 유도 방법.
  15. 제1항에 있어서, 면역조절성 분자(immunomodulatory molecules)가 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원과 함께 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터로부터 발현되는, 면역 반응의 유도 방법.
  16. 제14항에 있어서, 면역조절성 분자가 인터류킨, 인터페론, 및 공자극성 분자를 포함하는, 면역 반응의 유도 방법.
  17. 제14항에 있어서, 면역조절성 분자가 닭 인터페론-α(IFNα), 닭 인터페론-γ(IFNγ), 닭 인터루킨-1β(ChIL-1β), 닭 인터루킨-2(ChIL-2) 및 닭 골수단핵세포 성장인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 면역 반응의 유도 방법.
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  29. 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 난내(in ovo) 조류 배아에 접촉시키는 단계; 및
    이를 통해 상기 조류 배아 내에서 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원(one or more avian antigens or immunogens of interest)을 발현시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 사람 아데노바이러스는 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 사람 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하는,
    하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 조류 배아 내에 도입시켜 발현시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이 종 서열이 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래된 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 조류 인플루엔자에서 유래된 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 및 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 추가로 다른 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제29항에 있어서, 접촉이 난내(in ovo) 전달에 의해 일어나는 것인, 방법.
  36. 제29항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 복제 가능 아데노바이러스(Replication competent adenovirus; RCA) 부재 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터인, 방법.
  37. 제29항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 방법.
  38. 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 조류 검체에 난내(in ovo) 감염시키는 단계
    를 포함하는, 조류 검체 내에서 면역원성 반응을 유도해 내는 방법으로서,
    상기 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터는 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열 및 사람 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 이를 발현하며,
    상기 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이 조류 검체 내에서 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유도해 내기에 충분한 수준으로 발현되는,
    조류 검체 내에서 면역원성 반응을 유도하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 조류 인플루엔자에서 유래된 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질(matrix) 및 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 이종 서열이 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  43. 제38항에 있어서, 추가로 다른 백신을 함유하는 것인, 방법.
  44. 제38항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 복제 가능 아데노바이러스(Replication competent adenovirus; RCA) 부재 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터인, 방법.
  45. 제38항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 방법.
  46. 조류 검체의 병원균 항원을 암호화하는 이종 핵산 분자를 함유하고 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스를 난내 투여하는 단계
    를 포함하는, 조류 검체의 접종 방법.
  47. 제46항에 있어서, 사람 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 서열을 포함하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 사람 아데노바이러스가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 조류 병원균의 항원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 조류 병원균의 항원이 조류 인플루엔자에서 유래된 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 또는 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 또는 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 방법.
  53. 제46항에 있어서, 추가로 다른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  54. 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 사람 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하여, 상기 재조합 사람 아데노바이러스를 조류 배아로 전달하는, 면역원성 조성물을 조류 배아로 전달하기 위한 난내 투여 장치.
  55. 제54항에 있어서, 사람 아데노바이러스 발현 벡터가 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 서열을 함유하는, 장치.
  56. 제54항에 있어서, 사람 아데노바이러스 발현 벡터가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 사람 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함하는, 장치.
  57. 제54항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것인, 장치.
  58. 제57항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자에서 유래된 것인, 장치.
  59. 제58항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 적혈구응집소, 핵단백질, 바탕질 및 뉴라미니다제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 장치.
  60. 제58항에 있어서, 당해 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 적혈구응집소 아형 3, 5, 7 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 장치.
  61. 제58항에 있어서, 추가로 다른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 장치.
  62. 제29항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 RCA 부재의 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 방법.
  63. 제29항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 AdEasy 시스템 또는 AdHigh 시스템 유래인, 방법.
  64. 제29항에 있어서, 하나 이상의 당해 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 감염성 조류 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 뉴모바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유종증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 관련 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스로부터 유래된 것인, 방법.
  65. 제38항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 RCA 부재의 E1 결손, 또는 E3 결손, 또는 E1 및 E3 결손인 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터인, 방법.
  66. 제38항에 있어서, 아데노바이러스 발현 벡터는 AdEasy 시스템 또는 AdHigh 시스템 유래인, 방법.
  67. 제38항에 있어서, 하나 이상의 조류 항원을 발현하는 아데노바이러스 발현 벡터를 난당(per egg) 1x108 내지 1x1011 pfu의 양으로 투여하거나, ifu에 의한 측정시 상기 양과 동등한 양 또는 바이러스 입자로 측정시 상기 양과 동등한 양으로 투여함으로써 감염시키는, 방법.
  68. 제38항에 있어서, 하나 이상의 조류 항원을 발현하는 아데노바이러스 발현 벡터를 난당(per egg) 5x1010 pfu의 양 또는 난당 2x108 ifu의 양 또는 난당 3x1010 바이러스 입자의 양으로 투여함으로써 감염시키는, 방법.
  69. 제38항에 있어서, 조류가 부화후 하나 이상의 조류 항원을 발현하는 아데노바이러스 발현 벡터를 추가로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 추가 투여는 부화후 2주 내지 4주에서 추가 투여되는, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 추가 투여는 근육내 또는 비내(intranasal)로 투여되는, 방법.
  72. 제54항에 있어서, 사람 아데노바이러스가 RCA 부재 아데노바이러스로부터 유래된 서열을 포함하는, 장치.
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