CN109561667A - 家禽益生菌疫苗组合物和其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了如下组合物，该组合物包含益生菌和马立克氏病疫苗，所述益生菌包含至少一种活细菌菌株。可以将包含益生菌、或包含益生菌和马立克氏病疫苗的组合物给予至受试者，包括家禽。可卵内给予这些组合物以增加该受试者胃肠道中的早期乳酸菌、减少该受试者胃肠道中的革兰氏阴性细菌、降低该受试者胃肠道中的沙门氏菌水平、并且提高该受试者的体重增加。本文还提供了包含益生菌和马立克氏病疫苗的试剂盒。

Description

家禽益生菌疫苗组合物和其使用方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年7月11日提交的美国临时专利申请号62/360,569的优先权，将其通过引用以其整体并入本文。

介绍

在商业条件下，包括鸡和火鸡在内的数百万家禽孵化环境恶劣，并且暴露于热压力和孵化场中潜在的致病菌若干小时。增加的压力以及孵化柜中潜在的大量病原体造成病原体定殖的理想条件。人们普遍认为，如沙门氏菌等动物源性病原体的自然传播途径是粪-口途径(White等人,1997；Galanis等人,2006)。然而，已公布的研究也表明家禽中的沙门氏菌可能通过空气传播(Wathes等人,1988；Baskerville等人,1992；Leach等人,1999；Fallschissel等人,2009)。

禽类呼吸道结构是解释对传染剂具有敏感性和抗性的重要组成部分。在日龄的禽类家畜中，在主支气管区域中未见或很少见浸润性淋巴细胞(Fagerland和Arp,1990；Smialek等人,2011)，并且直到3-4周龄才会在这些位置形成淋巴结(Fagerland和Arp,1993；Drolet等人,2010)。在接下来一周，产生IgG、IgA或IgM的细胞数量持续增加，然而，直到6-8周龄，鸡的支气管相关淋巴组织(BALT)才成熟(Bienenstock,1980；Bienenstock和McDermott,2005；De Geus,2012)。因此，商业性新生家禽极易受到空气传播的病原体的影响，不论该病原体是不是呼吸道或肠道细菌(Arshad等人,1998)。

为了帮助预防家禽患病和出现病原体感染，使用益生菌已成为一种有用的策略。一个多世纪以前，Eli Metchnikoff提出了突破性的想法来摄取可存活的细菌以改善健康状况(Metchnikoff,1908)。这种概念在今天更具吸引力，因为抗菌抗性细菌已成为许多国家的问题(Kiser,1976；Dahiya等人,2006；Teillant和Laxminarayan,2015)。动物饲料中即将禁用抗生素，这为扩大替代性预防药物创造了一个具有挑战性的情境(Parker,1990；Dahiya等人,2006；You和Silbergeld,2014)。益生菌和直接饲喂的微生物越来越被公认为是保持在不使用抗生素情况下饲养的家禽的胃肠道健康并提升其表现的最佳工具之一(Dominguez-Bello和Blaser,2008)。除了改善肠道微生物平衡、新陈代谢、和肠道完整性(Isolauri等人,2002；Salminen和Isolauri,2006)，研究还示出，某些益生菌具有抗炎性(Borchers等人,2009；Lyte,2011)、抗氧化性(Farnell等人,2006；Tao等人,2006；Zareie等人,2006；Segawa等人,2011；Howarth和Wang,2013)、以及增强的屏障完整特性(Yu等人,2012)。此外，一些研究人员已证实益生菌对先天免疫(Alvarez-Olmos和Oberhelman,2001；Vanderpool等人,2008；Molinaro等人,2012)以及体液免疫(Arvola等人,1999；Haghighi等人,2006；Howarth和Wang,2013)的益处。

尽管已经示出益生菌在被直接饲喂至动物时有可能促进家禽中健康微生物菌群发育和预防家禽疾病，但是这种给予通常可能太晚以至于不能在孵化后立即最佳地保护动物免受恶劣条件的影响。卵内给予益生菌给出了一种可能的方法来确保益生菌可在孵化之前或孵化期间发挥其有益作用。

然而，考虑到如果每个卵进行一次以上的卵内注射，该卵受到感染和损伤的风险就会高得令人无法接受，那么唯一实用且可靠的卵内给予益生菌的方法是将其与马立克氏病(Marek’s disease，MD)疫苗的稀释剂混合。益生菌的优选递送位点是禽羊膜，其也是马立克氏病疫苗的递送位点。就在破壳(在孵化前突破蛋壳)之前，禽胚吞下残留的羊膜液，这提供了第一次用有益的微生物菌群接种胃肠道的机会。虽然用传统的卵内疫苗接种单次注射进禽羊膜仅造成很小的孵化率损失，但是当卵从孵化器转移到孵化柜(约d18E)的那个时候，由于高技术注射设备显著增加，二次注射遇到重大阻碍，这使由于双注射使胚胎受到物理损伤的风险加倍，并且使孵化环境中普遍存在的机会性细菌病原体意外污染的几率增加了至少一倍。

MD是由致癌α-疱疹病毒引起的家鸡的淋巴组织增生性疾病(Churchill和Biggs,1967；Calnek,2001)。该疾病与淋巴瘤、神经系统表现、和免疫抑制有关(Calnek,2001)。毫无疑问，半个多世纪以来，MD一直是家禽业的一个主要问题(Nair,2005)，并且如果没有MD疫苗的开发，如今我们所知道的现代家禽业就不会存在(Baigent等人,2006；Gimeno,2008；Parvizi等人,2010；Silva等人,2010；Dunn和Silva,2012)。该病毒在环境中如此丰富和稳定，以至于在孵化场接种疫苗是控制商品鸡群MD的唯一有效方法(Witter等人,1980,2005；Baigent等人,2006；Dunn等人,2010)。由于显著的经济和免疫抑制影响，现代商品鸡进行疫苗接种后离开孵化场。

尽管将益生菌与MD疫苗组合似乎是在卵内同时传递两者的直接方式，但是本领域已知MD疫苗的稀释剂对添加其他药剂敏感。例如，已知冻干和稳定性是MD疫苗的难题，并且适当照看和处理MD疫苗对其生存力和功效是关键的。参见，例如，Calnek等人,AppliedMicrobiology[应用微生物学]20:5 723-726(1970)；11^th edition of Diseases ofPoultry[家禽疾病第11版],编辑:Y.M.Saif,第15章作者Aly M.Fadly。因此，本领域需要能够卵内递送益生菌而不会不利地影响马立克氏病(MD)疫苗的功效的组合物和方法。

发明内容

本发明提供了组合物，并且该组合物可包括益生菌、马立克氏病疫苗、和任选的稀释剂。

在另一方面中，提供了用本文所述组合物治疗受试者的方法。该方法可包括向该受试者给予包含益生菌和马立克氏病疫苗的本文所述的组合物中的任何一种。该方法还可包括通过向家禽受试者卵内给予益生菌来治疗受试者。

在另外的方面，提供了试剂盒。这些试剂盒可包括益生菌、马立克氏病疫苗、和任选的稀释剂。

附图说明

图1是示出用盐水或FloraMax益生菌卵内接种后，孵化后第1天、3天、和7天从胃肠道的前肠和后肠回收乳酸菌的图。*表示显著不同的手段(p<0.05)。

图2是示出用盐水或FloraMax益生菌卵内接种后，孵化后第1天、3天、和7天，从胃肠道的前肠和后肠回收革兰氏阴性细菌的图。*表示显著不同的手段(p<0.05)。

图3是示出用盐水或FloraMax益生菌卵内接种后，孵化后第1天、3天、和7天，从盲肠样品中回收沙门氏菌的量的图。*表示显著不同的手段(p<0.05)。

图4是示出用盐水或FloraMax益生菌卵内接种后，孵化后第1天、3天、和7天，每个治疗组的所有禽类的平均体重的图。*表示显著不同的手段(p<0.05)。

图5是示出用盐水或所指示的益生菌卵内接种后，孵化后第1天从胃肠道回收的乳酸菌的图。条状上方的不同字母A、B、C表示显著不同的手段(P<0.05)。

具体实施方式

本发明诸位发明人惊奇地发现，当通过卵内注射组合给予时，肠道适应性乳酸菌(如-B11中发现的那些)不会干扰商业性马立克氏病(MD)疫苗对鸡的保护功效。此外，这些细菌分离物不影响孵化率、显著减少放置时的革兰氏阴性细菌群体、增加对肠炎沙门氏菌的抗性、并增加肉仔鸡的7天体重。

发明人解决的两个主要问题之一是卵内给予肠道适应性乳酸菌(如那些在-B11中发现的)是否会对MD疫苗保护功效产生负面影响。如实例中示出，发明人证明，当益生菌与MD疫苗组合时，没有负面影响，并且甚至可能对MD疫苗的保护功效有小的改善。就发明人所知，这是第一份示出益生菌与卵内MD疫苗组合的可能性，并示出没有负面影响的报告。卵内施用益生菌的另一个主要问题是肉鸡的孵化率，但在进行的每次试验中，益生菌也示出对孵化率没有负面影响。

在本申请中，发明人还观察到，当与用盐水处理的鸡相比，在孵化前接受该益生菌的胚胎的乳糖阳性革兰氏阴性细菌显著减少(参见，例如，表3)。尽管有大量证据表明，益生菌(如-B11)能够在实验室和商业条件下控制家禽的沙门氏菌感染(Farnell等人,2006；Higgins等人,2007,2008,2010；Vicente等人,2007；Menconi等人,2011,2013；Tellez等人,2012；Biloni等人,2013；Delgado等人,2014)，但是本申请进一步证明了当卵内给予时，益生菌(如-B11)是有效的。本申请中披露的结果表明，卵内给予益生菌-B11不会对火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗功效或鸡的孵化率产生负面影响，并且改善生命的前7天期间的体重(BW)和肠道完整性，同时减少肉鸡肠道沙门氏菌(SE)肠道负荷。

提供了益生菌疫苗组合物。该组合物可包括益生菌和马立克氏病疫苗。任选地，该组合物可进一步包括稀释剂。

该益生菌可包括乳酸菌或者两种或更多种乳酸菌种的任何组合。乳酸菌可被选择用于家禽的肠道适应。已成功证明了用于选择家禽的肠道适应性乳酸菌的几种方法。Bielke及其同事证明了一种体外竞争测定，该测定成功地将数百万候选物快速筛选为更少的分离物，用于体内试验(Bielke等人,Poult.Sci.[家禽科学]82:9 1378-82(2003))。在许多出版物中已经证明了进一步的卵内评估，这些出版物包括，Torres-Rodriguez等人,Poult.Sci.[家禽科学]85:100-100(2005)；Higgins等人,Poult.Sci.[家禽科学]85:38-39(2006)；和Higgins等人,Poult.Sci.[家禽科学]86:2315-2321(2006)。这些研究成功的主要指标基于常见革兰氏阴性沙门氏菌病原体的竞争性排除。进一步评估包括选择的LAB对表现、骨质量、和肠道形态分析的影响(Gutierrez-Ruentes等人,International Journalof Poultry Science[国际家禽科学杂志]12:322-327(2013)；Biloni等人,Poult.Sci.[家禽科学]92:2337-2346(2013))。

该益生菌可包括乳酸菌种，该种选自以下属，该属由以下组成：乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Lueconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或其组合。在一些实施例中，该益生菌可包括来自魏斯氏菌属的乳酸菌和来自片球菌属的乳酸菌。任选地，该益生菌可包括乳酸菌种食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、乳酸菌种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、或两者。根据本发明还可以使用其他乳酸菌种，包括但不限于，肠膜状明串珠菌(Lueconostoc mesenteroide)和胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)1、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)。当使用一种以上的细菌作为益生菌时，可以组合不同比例的细菌物种。例如，当考虑两个细菌物种的益生菌时，菌株的比例可以是大约1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；1:10(第一细菌物种比第二细菌物种)或大约1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；1:10(第二细菌物种比第一细菌物种)。在-B11中，使用的食窦魏斯氏菌与乳酸片球菌的比例约为1:4，尽管根据本发明，预期其他比例(即1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；1:10)也是有效的。

该益生菌可以包括商业产品-B11中存在(单独或以组合形式)的细菌物种(NRRL-FM46B-50961和NRRL-FM18B50964)。-B11是一种明确的乳酸菌益生菌培养物，其已证明鸡和火鸡中正常菌群的加速发育。它提供对沙门氏菌种感染的增强的抵抗力(Farnell等人,2006；Higgins等人,2007,2008,2010；Vicente等人,2007；Menconi等人,2011,2013；Tellez等人,2012；Biloni等人,2013；Delgado等人,2014)，减少了育雏室内商品火鸡的特发性腹泻(Higgins等人,2005)，以及有助于提高家禽表现和降低成本(Torres-Rodriguez等人,2007；Vicente等人,2008)。

发明人还披露了另外四种乳酸菌种(LAB 1-4)。如在图5中示出，发明人提供的证据表明，LAB菌株1-4对产前肠道定殖有效。LAB菌株1-4是球菌物种，并且因此该益生菌也可包括一种或多种球菌物种。发明人期望可以选择多种乳酸菌种和菌株用于本文提供的组合物和方法中。

马立克氏病疫苗可包括向家禽提供针对马立克氏病的保护的任何疫苗。马立克氏病疫苗可以是无细胞疫苗、细胞相关疫苗、或包括无细胞疫苗和细胞相关疫苗两种形式的组合。几种不同类型的马立克氏病疫苗，无论是单独地还是以各种组合形式，在本领域中都是众所周知的，并且可以根据本发明使用。最常见的马立克氏病疫苗是减毒血清1型MDV、天然无毒HVT、血清2型MDV病毒、及其组合。血清2型病毒通常与HVT菌株组合以利用本领域充分证明的协同活性优势。

马立克氏病疫苗可包括HVT疫苗。该HVT疫苗可包括任何HVT菌株，包括但不限于火鸡疱疹病毒的FC-126菌株。任选地，火鸡疱疹病毒的FC-126菌株可存在于可商购疫苗(如但不限于梅里亚精选大药厂(Merial Select)的马立克氏病疫苗血清3型活病毒(LiveVirus)HVT)中。该马立克氏病疫苗可包括减毒MDV菌株。该减毒MDV菌株可包括SB-1、301B/1、R2/23、CVI988或其组合。该马立克氏病疫苗可包括二价疫苗，该二价疫苗包括HVT和减毒MDV菌株的组合或包括血清1型和血清2型MDV菌株的组合。

该稀释剂可包括用于递送马立克氏病疫苗的任何溶液。该稀释剂可包括碳水化合物、磷酸盐缓冲剂、NZ胺、NZ胺AS、或其任何组合。该碳水化合物可以是蔗糖。任选地，该稀释剂可包括二甲基亚砜。优选地，该稀释剂是等渗的。该稀释剂可包括任何与可商购的马立克氏病疫苗包含在一起的稀释剂。在一些实施例中，该稀释剂可包括与梅里亚精选大药厂的马立克氏病疫苗血清3型活病毒HVT包含在一起的稀释剂。

还提供了治疗受试者的方法。该方法可包括向受试者给予包括益生菌和马立克氏病疫苗的本文所述的组合物中的任何一种。该受试者可以是任何可能感染马立克氏病的物种或任何受益于给予马立克氏病疫苗的物种。合适的受试者包括但不限于家禽，如鸡和火鸡。另外的方法包括向受试者卵内给予益生菌。适当地，该益生菌含有细菌菌株NRRL-FM46B-50961和/或NRRL-FM18B50964。这种给予不会影响孵化率，但会致使孵化后3至7天前体重增加。卵内给予益生菌还增加了乳酸菌的数量、减少了革兰氏阴性细菌的数量、并减少了孵化后胃肠道中沙门氏菌的数量。在孵化后第3天、5天或7天前，与未卵内给予益生菌的对照受试者相比，体重增加可以是至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、或甚至超过10％。

可向15、16、17、18、19、20、21、或22日龄的胚胎卵内给予这些组合物。可替代地或以组合形式，这些组合物可在孵化时或孵化后给予。根据本发明的马立克氏病疫苗的有用剂量将根据受试者的年龄、体重、和物种，以及给予的模式和途径而变化。关于可商购的马立克氏病疫苗，剂量应符合标签或其他说明书上的指示。通常，超过500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、或5000个噬斑形成单位/动物的剂量是合适的。该组合物可以以足以引起免疫应答的任何剂量给予。

根据本发明的益生菌的有用剂量将根据受试者的年龄、体重、和物种，以及给予的模式和途径而变化。可以使用超过10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、或10⁸个菌落形成单位(CFU)的剂量。适当地，向每个卵给予10³-10⁵个菌落形成单位。当在没有该马立克氏病疫苗的情况下给予该益生菌时，可以使用更高量的益生菌，如10³/10⁸cfu/卵。

提供试剂盒。这些试剂盒可包括本文所述的任何组合物。这些试剂盒可包括益生菌和马立克氏病疫苗。任选地，这些试剂盒可进一步包括稀释剂。在试剂盒中，该益生菌和马立克氏病疫苗可以在同一隔室(如安瓿)中，或者可以在分开的隔室中。试剂盒内的稀释剂可以位于与该益生菌和马立克氏病疫苗分开的隔室中，或者可以位于与该益生菌和/或马立克氏病疫苗相同的隔室中。该益生菌和马立克氏病疫苗可进一步作为溶液或固体(如冻干粉)存在。

本发明披露不限于本文所述的构造、组分安排、或方法步骤的具体细节。根据以下披露内容，本文披露的组合物和方法能够以对于本领域技术人员而言显而易见的各种方式制备、实践、使用、实施、和/或形成。这里使用的措辞和术语仅用于描述的目的，而不应被视为限制权利要求的范围。如在说明书和权利要求中使用的用于指代各种结构或方法步骤的顺序指示词(如第一、第二、和第三)并不意味着被解释为指示任何特定结构或步骤，或者任何特定顺序、或者这类结构或步骤的配置。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如(such as)”)的使用仅旨在有助于本披露，并不意味着对本披露的范围的任何限制。说明书中的文字和附图中示出的结构都不应被解释为表示任何未要求保护的元素对于所披露的主题的实践都是必不可少的。本文中使用术语“包括”、“包含”、或“具有”、及其变体意指涵盖其后列出的元素及其等同物、以及其他元素。描述为“包括”、“包含”、或“具有”某些元素的实施例也被认为“基本上由那些某些元素组成”和“由那些某些元素组成”。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独描述一样。例如，如果浓度范围表示为1％至50％，则意图在本说明书中明确列举如2％至40％、10％至30％、或1％至3％等值。这些仅是具体意图的实例，并且在所列举的最低值和最高值之间(包括所列举的最低值和最高值)的所有可能的数值组合将被认为在本披露中明确陈述。使用词语“约”来描述特定的所述量或量的范围意指表示非常接近所述量的值包括在该量中，例如由于制造公差以及形成测量值中的仪器和人为误差等而可能或自然会考虑的值。除非另有说明，否则所有涉及量的百分比均以重量计。

不承认任何参考文献(包括本说明书中引用的任何非专利或专利文献)构成现有技术。特别地，应理解，除非另有说明，否则本文中对任何文件的引用并不构成承认任何这些文件构成美国或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。对参考文献的任何讨论均陈述其作者的主张，并且申请人保留质疑本文引用的任何文件的准确性和相关性的权利。除非另有明确说明，否则本文引用的所有参考文献均以引用的方式完整并入本文。如果在引用的参考文献中找到的任何定义和/或描述之间存在任何差异，则本披露将对该事件进行控制。

除非上下文另有说明或表示，否则术语“一个/种(a/an)”和“该”意指“一或多个/种”。例如，“蛋白质”或“RNA”应分别解释为表示“一种或多种蛋白质”或“一种或多种RNA”。

如本文所用，本领域普通技术人员将理解“约”、“大约”、“基本上”、和“显著地”，并且在某种程度上将根据它们的使用环境而变化。如果这些术语的使用对于普通人来说是不明确的，对该特定术语加或减≤10％以及“基本上”和“显著”将表示对该特定术语加或减>10％。

以下实例仅用于说明，并不意指对本发明或所附权利要求的范围的限制。

实例

实例1-卵内给予乳酸菌的影响

本实例描述了卵内给予乳酸菌，特别是肠道适应性乳酸菌对早期孵化表现和抵抗病原菌或不利于雏鸡的饲料效率的细菌定殖的能力的影响。我们发现，卵内给予益生菌乳酸菌对孵化率没有负面影响，增加了乳酸菌在胃肠道的定殖，减少了胃肠道中革兰氏阴性细菌的回收，减少了胃肠道中沙门氏菌的回收，并且导致在孵化后3至7天体重显著增加。这些结果证明卵内给予益生菌对早期雏鸡胃肠道健康的益处。

在实验1中，向150个卵中注入200μL/卵的无菌盐水，并向150个卵中注入200μL/卵的将上述卵加入到胚胎发育19天时的羊膜中。该益生菌含有由两种胃肠道适应性细菌的混合物组成的2×10⁴CFU/200μL。在孵化时，将雏鸡随机分配到15只鸡/圈栏的单个圈栏中，并随意提供食物和水。在孵化后第1天、3天、和7天，通过从每个治疗组中选择12只雏鸡来评估对所选细菌组的胃肠道回收的影响，并且获得前肠和后肠样品，并用于评估细菌回收。图1示出了孵化后第1天、3天、和7天从前肠和后肠中回收的乳酸菌。在第1天，卵内接受益生菌的雏鸡的前肠和后肠中的乳酸菌显著增加，但是在孵化后的后期没有看到这些差异。如图2示出，接受益生菌的雏鸡孵化后第1天的前肠和后肠以及孵化后第3天的后肠中的革兰氏阴性细菌水平也显著降低，但在孵化后第7天这些差异消失。

进行实验2以评估给予益生菌是否能够通过孵化后给予雏鸡的抗生素抗性细菌菌株来阻止定殖。在实验2中，向120个卵中注入200μL/卵的无菌盐水，并向120个卵中注入200μL/卵的将上述卵加入到胚胎发育19天时的羊膜中。该益生菌含有由两种胃肠道适应性细菌的混合物组成的2×10⁴CFU/200μL。在孵化时，将雏鸡随机分配到30只鸡/圈栏的单个圈栏中，并随意提供食物和水。在孵化后第1天、3天和7天，随机从每个治疗组选择12只雏鸡，并且获得盲肠样品，并将其用于评估沙门氏菌的回收。在孵化后第1天、3天和7天，还对雏鸡进行称重。如图3示出，在孵化后早期时间点，卵内接受益生菌的雏鸡的盲肠样品中具有显著更少的沙门氏菌。因此，接受益生菌的雏鸡可能不太容易受到早期感染。另外，如图4示出，在孵化后第3天和7天，接受益生菌的雏鸡还示出显著的体重增加。孵化后的第7天前，重量增加了接近10％。

进行实验3以评估其他益生菌是否会产生类似的效果。我们选择了先前从鸡中分离的四种野生型乳酸菌益生菌候选者，并且示出在MRS琼脂上生长良好，并且将这些中的每一种卵内以10⁴CFU/胚胎给予到胚胎发育18天时的羊膜中。我们发现该给予对孵化率没有影响。在孵化当天对胃肠道取样，并评估乳酸菌的存在和革兰氏阴性细菌的缺失。观察到类似的结果。如图5示出，所有卵内提供了乳酸菌益生菌的雏鸡在第1天显示出乳酸菌增加。因此，发明人认为，卵内提供的胃肠道益生菌至少在孵化后的第一周内即可改善雏鸡的健康。

实例2-卵内给予 -B11和MD疫苗的影响

本实例描述了关于肉鸡中马立克氏病HVT疫苗保护功效、孵化率、微生物群组成、形态测定分析和肠炎沙门氏菌感染的-B11的卵内评估。

进行了四项实验以评估卵内给予-B11(FM)对鸡中的马立克氏病(MD)火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗保护功效、孵化率、微生物群组成、形态测定分析、和肠炎沙门氏菌(SE)感染的影响。在实验1中，将日龄18天的白来航鸡胚胎随机分布在四个组：1)卵内疫苗接种HVT，并且没有马立克氏病病毒(MDV)激发；2)卵内疫苗接种HVT+FM，并且没有MDV激发；3)卵内疫苗接种HVT，并且用有毒的MDV激发(vMDV；菌株583A)；4)卵内疫苗接种HVT+FM，并且用vMDV激发。实验2的设计与实验1完全相同，不同之处在于用有强毒的MDV(vvMDV；菌株Md5和612)激发雏鸡。在两个实验中，监测禽类直到8周龄，并测试MD发病率。在实验3和4中，将盐水或FM注射至日龄18天的商品肉鸡胚胎，以测量孵化率和胃肠道组成。另外，在实验4中，然后在孵化时向所有孵出的鸡经口灌胃SE，并保持7天，以监测孵化后的BW。在实验1和2中，在仅疫苗接种HVT或疫苗接种HVT+FM的禽类中，MD百分比之间没有显著差异(P>0.05)。在实验3和4中，给予益生菌不会对孵化率产生负面影响，但确实减少了乳糖阳性革兰氏阴性细菌。此外，BW的增加与接受益生菌的鸡的回肠中较高的绒毛表面积以及显著降低的SE发病率相关。该研究的结果表明，卵内给予FM不会对HVT防御MD的能力或鸡的孵化率产生负面影响，并且改善生命的前7天期间的BW，并且降低肉鸡的SE回收。

在动物胃肠道中生存和定殖的细菌群落数量超过后生动物的总体细胞数量的估计10倍(Neish,2009)。今天，微生物组被认为是“被遗忘的器官”，其像宿主内的器官一样运作，并协调对健康与疾病之间的平衡产生深远影响的众多生理和生物功能(O’Hara和Shanahan,2006；Tellez,2014)。据报道，早期建立微生物组可改善肠道相关淋巴组织的组合(Martin等人,2010)、干预免疫系统的发育(McFall-Ngai,2007)、保持粘膜屏障完整性(Duerkop等人,2009)、调节肠细胞增殖(Moran,2007)、调节血流量(Sekirov等人,2010)、调节肠神经系统(Tlaskalová-Hogenová等人,2011)、并改善营养物质的消化(Dass等人,2007；Walter等人,2011；Qiu等人,2012)。这些细菌群体的基本定殖始于出生/孵化，然后是复杂和动态微生物群体的渐进性组合(Di Mauro等人,2013)。

在商业条件下，数百万鸡和火鸡孵化环境恶劣，并且暴露于热压力和孵化场中潜在的致病菌若干小时。增加的压力以及孵化柜中潜在的丰富的病原体造成病原体定殖的理想条件。人们普遍认为，如沙门氏菌等动物源性病原体的自然传播途径是粪-口(White等人,1997；Galanis等人,2006)。然而，已公布的研究也表明家禽中的沙门氏菌可能通过空气传播(Wathes等人,1988；Baskerville等人,1992；Leach等人,1999；Fallschissel等人,2009)。了解禽类呼吸道的解剖学和免疫学防御有助于澄清这个问题。禽类呼吸道结构是对传染剂具有敏感性和抗性的重要组成部分。在日龄的鸡和火鸡中，在主支气管区域中未见或很少见浸润性淋巴细胞(Fagerland和Arp,1990；Smialek等人,2011)，并且直到3-4周龄才会在这些位置形成淋巴结(Fagerland和Arp,1993；Drolet等人,2010)。在接下来一周，产生IgG、IgA或IgM的细胞数量持续增加，然而，直到6-8周龄，鸡的支气管相关淋巴组织(BALT)才成熟(Bienenstock,1980；Bienenstock和McDermott,2005；De Geus,2012)。因此，商业性新生家禽极易受到空气传播的病原体的影响，不论该病原体是不是呼吸道或肠道细菌(Arshad等人,1998)。为了支持这些研究结果，我们实验室最近表明，通过粪-呼吸途径传播是沙门氏菌进入的可行入口(Kallapura等人,2014a,b,c)。这种感染模式可以解释一些与在实验室研究中通过口服途径感染通常所要求的高口服激发剂量相关的现场条件下相对低剂量感染性的临床表现。这也支持了以前的研究，所述研究证明了沙门氏菌在孵化柜和孵化场孵化器中的风扇驱动传播(Hashemzadeh等人,2010)。

一个多世纪以前，Eli Metchnikoff提出了突破性的想法来摄取可存活的细菌以改善健康状况(Metchnikoff,1908)。这种概念在今天更具吸引力，因为抗菌抗性细菌已成为许多国家的问题(Kiser,1976；Dahiya等人,2006；Teillant和Laxminarayan,2015)。动物饲料中即将禁用抗生素，这为扩大替代性预防药物创造了一个具有挑战性的情境(Parker,1990；Dahiya等人,2006；You和Silbergeld,2014)。益生菌和直接饲喂的微生物越来越被公认为是保持在不使用抗生素情况下饲养的家禽的胃肠道健康并提升其表现的最佳工具之一(Dominguez-Bello和Blaser,2008)。除了改善肠道微生物平衡、新陈代谢、和肠道完整性(Isolauri等人,2002；Salminen和Isolauri,2006)，研究还示出，某些益生菌具有抗炎性(Borchers等人,2009；Lyte,2011)、抗氧化性(Farnell等人,2006；Tao等人,2006；Zareie等人,2006；Segawa等人,2011；Howarth和Wang,2013)、以及增强的屏障完整特性(Yu等人,2012)。此外，一些研究人员已证实益生菌对先天免疫(Alvarez-Olmos和Oberhelman,2001；Vanderpool等人,2008；Molinaro等人,2012)以及体液免疫(Arvola等人,1999；Haghighi等人,2006；Howarth和Wang,2013)的益处。

-B11是一种明确的乳酸菌(LAB)益生菌培养物，其已证明鸡和火鸡中正常菌群的加速发育。它提供对沙门氏菌种感染的增强的抵抗力(Farnell等人,2006；Higgins等人,2007,2008,2010；Vicente等人,2007；Menconi等人,2011,2013；Tellez等人,2012；Biloni等人,2013；Delgado等人,2014)，减少了育雏室内商品火鸡的特发性腹泻(Higgins等人,2005)，以及提高家禽表现和降低成本(Torres-Rodriguez等人,2007；Vicente等人,2008)。然而，尚没有研究对卵内给予-B11进行评估，并且评估这种给予途径的唯一实用且可靠的方法是将-B11与马立克氏病(MD)疫苗的稀释剂混合。因此，本发明研究的目的是评估卵内给予-B11对鸡中的MD火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗保护功效、孵化率、微生物群组成、形态测定分析、和SE感染的影响。

材料与方法

益生菌培养物

-B11(太平洋兽医集团美国公司，Fayetteville，AR)是一种明确的益生菌培养物，其来自含有LAB的专有菌株的家禽胃肠道来源。

关于马立克氏病HVT疫苗的-B11的卵内评估

鸡和病毒

在这些实验中使用母体抗体阴性的白来航鸡15I₅x7₁鸡(Bacon等人,2000)。这些对MD敏感的鸡来自SPF育种群，所述育种群未进行MD疫苗接种或经受通过常规监测测试对MDV抗体、外源性禽白血病病毒、和网状内皮细胞增多症病毒呈阴性的暴露。将所有禽类均置于负压Horsfall-Bauer隔离器中，并在美国农业部禽类疾病和肿瘤学实验室(ADOL)动物护理和使用委员会(USDA Avian Disease and Oncology Laboratory(ADOL)Animal Care andUse Committee)批准后进行实验。使病毒在保持在Leibovitz L-15培养基和McCoy 5A培养基(1:1)中的原代鸭胚成纤维细胞(DEF)上繁殖，该培养基补充有2.5％牛血清和抗生素(Witter等人,1980)。在实验1中，将鸡用MDV菌株583(一种有毒(v)菌株)激发。在实验2中，将鸡用MDV菌株Md5或612(两者均有强毒(vv))激发。HVT是一种商业疫苗，并如制造商所推荐的进行制备和使用(梅里亚精选大药厂(Merial Select)的马立克氏病疫苗血清3型活病毒HVT)。

实验设计

实验1

在两个独立的试验中，雏鸡被随机分为四组(每组17只)：1)卵内疫苗接种HVT，并且没有MDV激发；2)卵内疫苗接种HVT+-B11，并且没有MDV激发；3)卵内疫苗接种HVT，并且用MDV激发；4)卵内疫苗接种HVT+-B11，并且用MDV激发。将MD疫苗以制造商推荐的剂量单独或与-B11(10⁴cfu)一起卵内给予。监测禽类直至8周龄，然后以人道主义方式进行安乐死，并评估MD发病率。如果在尸体剖检时存在周围神经扩大、肿瘤或两者，则认为鸡是MD阳性的。当不能确定存在扩大的神经或大体肿瘤(gross tumor)时，收集组织样品并进行处理以进行显微镜评估。在放置第一周期间死亡的雏鸡被认为是非特异性雏鸡死亡率，并被排除在实验之外。

实验2

使用与实验1所述相同的条件，不同之处在于使用MDV菌株Md5和612代替菌株583A，并且该实验仅包括一个试验。

卵内施用-B11对孵化率和微生物群组成的影响

实验3由三个独立的试验组成。从科宝公司(Cobb-Vantress，阿肯色州西罗亚温泉)获得十八日龄的胚胎。在每次试验中，对卵进行光检，并通过卵内注射盐水或10⁴cfu的-B11接种到羊膜中。将两个治疗组放置在单独的孵化器中以避免交叉污染。在第21天，从孵化器中取出雏鸡并确定孵化率。在每个试验中，对来自每组的12只鸡进行人道主义安乐死以评估如下所述的选择性培养基上的胃肠道组成。

计数细菌

对于试验1，以无菌方式去除整个肠(胃至盲肠)。对于试验2和3，分别去除前肠(胃至美克尔憩室(Meckel’s diverticulum))和后肠(美克尔憩室至盲肠)。将切片收集到无菌袋中并均质化。称量样品并用无菌0.9％盐水制备1:4wt/vol的稀释液。在无菌96孔Bacti平底板中制备来自每组每个样品的10倍稀释液，并将稀释的样品铺板两种不同的培养基上；以评估Man Rogosa Sharpe(Difco^TM乳杆菌MRS琼脂VWR目录号90004-084，佐治亚州萨沃尼30024)中的LAB总数；麦康基(MacConkey，VWR目录号89429-342，佐治亚州萨沃尼30024)中总乳糖阳性革兰氏阴性细菌。关于肉鸡体重、肠炎沙门氏菌回收、和形态分析的卵内给予-B11的评估

在实验4中，在所有实验中使用的激发生物体是肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica(SE)serovar,Enteritidis)，13A型噬菌体(最初从爱荷华州埃姆斯的美国农业部国家兽医服务实验室(USDA National Veterinary Services Laboratory,Ames,IA)获得)的家禽分离物。该分离物对25μg/mL的新生霉素(NO，目录号N-1628，西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州63103)具有抗性，并且针对对20μg/mL萘啶酸(NA，目录号N-4382，西格玛公司)的抗性进行选择。对于本发明的研究，将100μL来自冷冻等分试样的SE添加到10mL的胰蛋白酶大豆肉汤(目录号22092，西格玛公司)中，并在37℃孵育8h，并且每8h通过三次以确保所有细菌都处于对数生长期。孵育后，通过以1,800×g离心10分钟用无菌0.9％盐水将细菌细胞洗涤3次，在盐水中重构，通过用分光光度计(Spectronic 20D+，SpectronicInstruments Thermo Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州02451)的光密度测定法定量，并稀释至约10⁸cfu/ml的浓度。通过连续稀释和在具有NO和NA的亮绿琼脂(BGA，目录号70134，西格玛公司)上铺板来进一步验证SE的浓度，用于计数用于激发鸡的实际cfu。

在本试验中，从科宝公司收到了300个十八日龄的胚胎。在第18天，对卵进行光检，并通过卵内注射盐水或10⁴cfu-B11接种到羊膜中。将两个治疗组放置在单独的孵化柜中，所述孵化柜放置在单独的房间中以避免交叉污染。在第21天，从孵化器中取出雏鸡以测量孵化率。然后在孵化的当天，向所有鸡经口灌胃SE(约10⁴cfu/雏鸡)。接种后(PI)二十四小时，用二氧化碳窒息性气体对二十只鸡实施安乐死以确定如下所述的SE肠道定殖。还从这些鸡中采集5个样品以确定如下所述的肠道形态分析。在第1天、3天、和7天测定BW。向鸡随意提供水和均衡的无药玉米大豆饮食，满足NRC推荐的家禽营养需求(1994)。所有动物处理程序均符合阿肯色大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)的规定。

沙门氏菌回收

将盲肠-盲肠扁桃体(ceca-cecal tonsil，CCT)均质化并用盐水(1:4wt/vol)稀释，并将十倍稀释液铺板在含有NO和NA的BGA上，在37℃孵育24h，以计数总SE菌落形成单位。在铺板以计算总SE后，CCT样品富含双倍强度连四硫酸盐富集肉汤，并进一步在37℃孵育24h以富含沙门氏菌。然后，将富集样品铺板在含有NO和NA的BGA上，并在37℃孵育24h，以确认典型的乳糖阴性沙门氏菌菌落的存在/缺失。

肠道形态分析

对于肠道形态测定分析，收集回肠和十二指肠样品(n＝5)。从每只禽中除去十二指肠中点的1m区段和回肠下部的远端，并在10％的缓冲的甲醛中固定48h。将这些肠段中的每一个包埋在石蜡中，并将每个样品的5-μm切片置于载玻片上，并用苏木精和曙红染色，以在光学显微镜下检查。使用ImageJ软件包测量所有形态学参数(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。从每个样品中取每个研究变量的十个重复测量值，并将平均值用于统计分析。从绒毛顶部到固有层顶部测量绒毛长度(VL)(Yitbarek等人,2013)。从基部向上到腺窝和绒毛之间的过渡区域测量腺窝深度(Biloni等人,2013)。在每片绒毛的最宽区域处测量绒毛宽度(VW)，而将绒毛与腺窝比例确定为绒毛高度(VH)与腺窝深度的比例。使用公式(2π)(VW/2)(VL)计算绒毛表面积(VSA)(Sakamoto等人,2000)。

统计学分析

使用SAS的GLM程序(赛仕软件(SAS Institute),2002)将所有数据作为完全随机化设计进行单向方差分析。数据表示为均值±标准误差。使用邓肯多范围检验(Duncan’smultiple-range test)确定均值的显著差异(P<0.05)。MDV和SE发病率数据表示为阳性/总的鸡(％)，并使用卡方独立性检验比较SE的回收百分比，测试所有可能的组合以确定这些研究的显著性(P≤0.001)(Zar,1984)。

结果

本研究解决了三个主要问题：1)卵内给予与MD疫苗混合的-B11是否会对疫苗功效产生负面影响，2)卵内给予对孵化率和微生物群组成的影响和3)对肉鸡中沙门氏菌感染的影响。实验1由两个独立的重复实验组成，以确定当在禽类卵内仅用HVT疫苗接种时，或用HVT+-B11疫苗接种，然后用vMDV激发时，是否有任何差异。关于实验1和2中HVT疫苗功效的卵内评估-B11的结果总结在表1中。在两个实验中，单独使用HVT疫苗接种或用HVT+-B11疫苗接种的禽类的MD％之间没有显著差异，虽然治疗之间的数字差异表明益生菌可能能轻微改善用MDV菌株583激发的禽类的保护免疫力。当我们在实验2中使用vvMDV菌株(Md5或612)时，这种潜在的益处并不明显(表1)。

表1

关于HVT马立克疫苗病毒稳定性和疾病发病率的-B11的卵内评估。

将马立克氏病HVT疫苗以制造商标记的剂量单独或与-B11(10⁴cfu/g)一起卵内给予。在5日龄时，在实验1中，分别使用500pfu vMDV菌株583，或者500pfu vvMDV菌株Md5或612，给予MDV激发。监测禽类直至8周龄，然后实施安乐死，并测量MD发病率。P>0.05

实验3中卵内给予益生菌-B11对孵化率的影响展示在表2中。给予益生菌的胚胎或对照之间的孵化率没有显著差异。卵内施用FloraMax-B11对实验3中孵化性肉鸡胃肠道微生物组成的影响的结果总结在表3中。在试验1和3中，在孵化当天，当与盐水对照组比对时，用-B11处理的鸡示出乳糖阳性革兰氏阴性细菌回收显著降低。在试验2中，该治疗组的回收数量低于对照组，并且实际上其革兰氏阴性细菌降低至不可回收的数量。除了试验2中的后肠外，与盐水处理组(表3)相比时，在益生菌组中观察到LAB总数显著增加。

表2

卵内施用-B11对孵化率的影响。

在第18天，对卵进行光检，并通过在卵内注射0.9％的盐水或-B11接种到羊膜中。在第21天，从孵化器中取出雏鸡并确定孵化率，P>0.05。

表3

卵内施用-B11对孵化性肉鸡胃肠道微生物组成的影响。

在第18天，对卵进行光检，并通过卵内注射盐水或-B11接种到羊膜中。在第21天，从孵化器中取出雏鸡，并且对于实验1，无菌地去除整个肠(胃至盲肠)。对于试验2和3，分别去除前肠(胃至美克尔憩室(Meckel’s diverticulum))和后肠(美克尔憩室至盲肠)。

¹将样品铺板在麦康基琼脂(MacConkey agar)上以评估总乳糖阳性革兰氏阴性细菌。

²将样品铺板在MRS琼脂上以评估总乳酸菌。

数据表示为均值±标准误差。*每个平板各列内上标表示显著差异(P<0.05，n＝12)。

关于实验4中肉鸡孵化率、BW、和SE回收的卵内给予-B11的结果总结在表4中。在本实验中，当新生鸡从孵化柜中取出时，其孵化率或BW没有观察到显著变化；然而，当在第3天和第7天与盐水对照组相比，在接受益生菌的鸡中，观察到BW显著增加(表4)。有趣的是，当与盐水对照鸡相比，接受益生菌的鸡示出，其发病率和从CCT中回收的总SEcfu数显著降低(表4)。

表4

关于肉鸡孵化率、体重、和肠炎沙门氏菌回收的卵内给予-B11的评估。

在第18天，对卵进行光检，并通过卵内注射盐水或-B11接种到羊膜中。在第21天，从孵化器中取出雏鸡，并在孵化当天，用肠炎沙门氏菌(SE)进行激发(约10⁴cfu/雏鸡)。发病率数据表示为接种后(PI)24小时时阳性/总的鸡(％)，星号指示显著差异P<0.001，n＝20/组。盲肠内容物的Log₁₀SE/g表示为均值±标准误差。^ab各列内上标表示显著差异(P<0.05，n＝12/组)。

卵内施用-B11对实验4中孵化性肉鸡胃肠道形态测定分析的影响的结果总结在表5中。当与十二指肠对照相比，在治疗组中观察到VH、VW、和VSA的数值增加。然而，当与盐水对照组相比，接受益生菌的胚胎显示绒毛:腺窝深度比例显著增加。在回肠中，当与对照组相比，经益生菌处理的组中的VH、VSA、和腺窝深度显著增加。

表5

关于孵化型肉鸡胃肠道形态测定分析的卵内给予-B11的评估

^a,b同一列内具有不同上标的均值差异显著(P<0.05)。

*绒毛表面积：[2π×(绒毛宽度/2)×(绒毛高度)]

**绒毛高度(VH)与腺窝深度(CD)的比例。

MD是由致癌α-疱疹病毒引起的家鸡的淋巴组织增生性疾病(Churchill和Biggs,1967；Calnek,2001)。该疾病与淋巴瘤、神经系统表现、和免疫抑制有关(Calnek,2001)。毫无疑问，半个多世纪以来，MD一直是家禽业的一个主要问题(Nair,2005)，并且如果没有MD疫苗的开发，如今我们所知道的现代家禽业就不会存在(Baigent等人,2006；Gimeno,2008；Parvizi等人,2010；Silva等人,2010；Dunn和Silva,2012)。该病毒在环境中如此丰富和稳定，以至于在孵化场接种疫苗是控制商品鸡群MD的唯一有效方法(Witter等人,1980,2005；Baigent等人,2006；Dunn等人,2010)。由于显著的经济和免疫抑制影响，现代商品鸡进行疫苗接种后离开孵化场。

虽然，我们已经报道了在孵化场喷雾施用-B11的好处(Wolfenden等人,2007)，但这是第一份卵内同时施用这种明确的益生菌和与其混合的HVT疫苗的报告。我们在本研究中解决的两个主要问题之一是卵内给予-B11是否会对MD疫苗的保护功效产生负面影响。实验1和2的结果证明，未产生负面影响，并且甚至可能对益生菌进行了小的改善，这取决于MDV激发菌株。就我们所知，这是第一份示出益生菌与卵内MD疫苗组合的可能性，并示出没有负面影响的报告。卵内施用FM的另一个主要问题是肉鸡的孵化率，但在进行的每次试验中，益生菌也示出对孵化率没有负面影响。

在本发明研究中，值得注意的是，当与盐水处理的鸡相比时，孵化前接受益生菌的胚胎的乳糖阳性革兰氏阴性细菌显著减少(表3)。尽管有大量证据证明这种特定益生菌能够在实验室或商业条件下控制家禽中的沙门氏菌感染(Farnell等人,2006；Higgins等人,2007,2008,2010；Vicente等人,2007；Menconi等人,2011,2013；Tellez等人,2012；Biloni等人,2013；Delgado等人,2014)。当前本研究通过当在孵化当天对鸡进行激发，并培养24h时减少SE回收，来进一步验证通过卵内给予的益生菌功效(表4)。这些结果与De Oliveira等人(2014)的工作一致，他们证明卵内益生菌定殖可能成为减少家禽中沙门氏菌和其他肠道细菌感染的重要方法。

在实验4中，在第3天和第7天在经处理的鸡中BW显著增加(表4)与在第1天观察到的十二指肠和回肠的显著形态测定变化相关(表5)。经益生菌处理的组中较高的BW可能是由于VH的增加，导致更多的VSA，导致营养更好吸收。这些结果在肉仔鸡早期快速生长的背景下是有意义的。新孵出的现代肉雏鸡的BW一夜之间增加25％，并在5周前增加5000％，达到2kg(Choct,2009)。同样，考虑肉鸡的生产寿命也很重要。现代鸡的完全遗传潜力始于受孕和胚胎发育的第21天。在此期间，温度或氧气等变量很重要，并且任何与之相关的问题都可能在生命后期产生重大影响。因此，鸡21天的胚胎发育加生命的前7天可能潜在地占商品肉鸡寿命(取决于屠宰时间，56天或77天)的50％至74％(Cherian，2011)。因此，早期向胚胎给予益生菌会对禽类的生长和整体健康产生深远的影响。

总之，本研究的结果表明，卵内给予-B11不会对HVT疫苗的功效或鸡的孵化率产生负面影响，并改善生命的前7天期间的BW和肠道完整性，同时降低肉鸡的SE肠道负荷。阐明-B11在其他商业MDV疫苗菌株中的作用需要进一步研究；然而，目前正在进行在商业条件下用HVT疫苗评估该益生菌的研究。

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Claims (27)

1.一种组合物，其包含益生菌和马立克氏病疫苗。

2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含稀释剂。

3.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该益生菌包含乳酸菌。

4.如权利要求3所述的组合物，其中该乳酸菌被选择用于家禽的肠道适应。

5.如权利要求3所述的组合物，其中该乳酸菌选自如下属，该属选自由以下组成的组：乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Lueconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、和片球菌属(Pediococcus)。

6.如权利要求5所述的组合物，其中该益生菌包含来自魏斯氏菌属的乳酸菌和来自片球菌属的乳酸菌。

7.如权利要求6所述的组合物，其中该益生菌包含乳酸菌种食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。

8.如权利要求3所述的组合物，其中该益生菌包含NRRL-FM46B-50961和NRRL-FM18B50964(-B11)。

9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该马立克氏病疫苗包含HVT疫苗。

10.如权利要求9所述的组合物，其中该HVT疫苗包含火鸡疱疹病毒的FC-126菌株。

11.如权利要求10所述的组合物，其中该HVT疫苗包含梅里亚精选大药厂血清3型活病毒。

12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该马立克氏病疫苗包含减毒MDV。

13.如权利要求12所述的组合物，其中该减毒MDV选自下组，该组由以下组成：SB-1、301B/1、R2/23、和CVI988。

14.如权利要求2-13中任一项所述的组合物，其中该稀释剂包含二甲基亚砜。

15.如权利要求2-14中任一项所述的组合物，其中该稀释剂包含补充有该马立克氏病疫苗的稀释剂。

16.如权利要求2-15中任一项所述的组合物，其中该稀释剂包含碳水化合物、磷酸盐缓冲液、和NZ胺。

17.如权利要求16所述的组合物，其中该碳水化合物是蔗糖。

18.一种治疗受试者的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1-17中任一项所述的组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中该受试者是家禽物种。

20.如权利要求19所述的方法，其中该组合物被卵内给予。

21.一种治疗受试者的方法，该方法包括向家禽受试者卵内给予益生菌。

22.如权利要求21所述的方法，其中该益生菌包含乳酸菌。

23.如权利要求21或22中任一项所述的方法，其中该益生菌包含选自下组的细菌，该组由以下组成：乳杆菌属、明串珠菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、和片球菌属。

24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中与未给予该益生菌的对照受试者相比，该方法导致孵化后第7天体重增加至少5％。

25.一种试剂盒，其包含益生菌和马立克氏病疫苗。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其进一步包含稀释剂。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其中该稀释剂包含蔗糖、磷酸盐缓冲液、和NZ胺。