BR122021021551B1 - Uso de uma composição e composição - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a produtos e composições que podem ser benéficos em cruzamento animal. Os mencionados produtos e composições compreendem microrganismos, tais como bactérias, e bactérias pró-bióticas em particular. São, portanto, fornecidas no presente linhagens microbianas, bem como critérios de seleção que permitirão ao técnico no assunto encontrar linhagens adicionais úteis na presente invenção. As linhagens, bem como as composições que as compreendem, podem ser administradas a animais, animais de fazenda tais como suínos em particular. A administração pode ocorrer nos primeiros dias de vida. Por meio da administração dos produtos ou composições de acordo com a presente invenção, pode-se promover o crescimento animal e o peso do animal pode ser aumentado. Infecções bacterianas podem também ser evitadas ou tratadas por meio dos mencionados compostos ou composições.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] Animais recém-nascidos e particularmente aqueles em criação (intensiva) são propensos a infecções bacterianas e outras. Essas infecções podem causar diarreia associada à perda de peso e, em casos severos, até a morte do recém-nascido. Vários anos atrás, por exemplo, foram descritos casos de diarreia em leitões recém-nascidos em fazendas de suínos de diferentes situações geográficas na Espanha. Acredita-se que a mencionada diarreia seja um sintoma nesses animais, em que o fator causador do mencionado sintoma às vezes é dificilmente localizado. Em muitos casos de diarreia em suínos recém-nascidos, por exemplo, é possível isolar linhagens bacterianas possivelmente desfavoráveis/indesejadas, tais como Escherichia coli, isoladamente ou em combinação com Clostridium perfringens ou Clostridium difficile, mas a diarreia normalmente é detectada logo após o nascimento e procedimentos de profilaxia e tratamento rotineiros frequentemente não são eficazes.

[002] Sem desejar restrições a nenhuma teoria específica, acredita-se que a disbiose (também denominada disbacteriose) possa ser um fator causador. Disbiose designa uma condição com desequilíbrios microbianos sobre ou no interior do corpo. Em animais de fazenda, particularmente suínos, a disbiose pode ser causada pelo uso indiscriminado de antibióticos durante a manutenção da semeadura, produzindo alterações da flora intestinal de leitões recém-nascidos.

[003] Em vista dessas desvantagens do uso de antibióticos, recomenda-se a redução do uso de antibióticos em acasalamento animal. Por outro lado, métodos de tratamento alternativos dos animais recém-nascidos seriam necessários para substituir os antibióticos comumente utilizados.

[004] Como a União Europeia recomenda desde 2005 a redução do uso de antibióticos como promotores do crescimento na criação de suínos (alterado pela Regulamentação (EC) n° 378/2005 de quatro de março de 2005), os criadores de animais estão buscando alternativas que possam melhorar a situação geral de saúde de animais (de criação), particularmente nos primeiros dias de vida. Os inventores do presente fornecem uma solução para este problema e a mencionada solução é descrita a seguir. A presente invenção soluciona, portanto, diversos problemas causados pelos métodos do estado da técnica e os efeitos vantajosos serão detalhados abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[005] Em primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende pelo menos um, tal como um, preferencialmente pelo menos dois, tal como dois, de maior preferência pelo menos três, tal como três, de maior preferência pelo menos quatro, tal como quatro, alternativamente pelo menos cinco, tal como cinco, alternativamente pelo menos seis, tal como seis, alternativamente pelo menos sete, tal como sete, alternativamente pelo menos oito, tal como oito microrganismo(s), preferencialmente uma bactéria e, de maior preferência, uma bactéria de ácido láctico. A bactéria de ácido láctico é idealmente selecionada a partir das linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59), todas as quais foram depositadas junto ao CECT. Em uma realização, a composição compreende uma ou mais linhagens, em que cada linhagem atende pelo menos à condição (a) a seguir, preferencialmente às duas condições (a) e (b) e, de preferência superior, todas as condições (a), (b) e (c): a. exibe atividade antimicrobiana evidenciada por pelo menos uma das zonas de inibição a seguir: (i) 10 mm ou mais, tal como 14 mm ou mais, para Salmonella; (ii) 9 mm ou mais, preferencialmente 10 mm ou mais, para Listeria monocytogenes; (iii) 9 mm ou mais, preferencialmente 10 mm ou mais, para Staphyloccocus aureus; (iv) 10 mm ou mais, tal como 18 mm ou mais, para Escherichia coli; b. é capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante três horas de incubação sob pH = 3,5 ou, alternativamente, sob pH = 2,5; e c. é capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante quatro horas de incubação na presença de 0,45% de extrato de bílis, preferencialmente sob pH = 8.

[006] A composição de acordo com a presente invenção pode destinar-se a uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecção bacteriana e/ou aumento de peso de mamíferos recém- nascidos (preferencialmente leitões). Neste método, a composição é administrada ao mamífero.

[007] A presente invenção também fornece um microrganismo, preferencialmente uma bactéria e, de maior preferência, uma bactéria de ácido láctico. A bactéria de ácido láctico é idealmente selecionada a partir das linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59), todas as quais foram depositadas junto à CECT (Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos) pela AQUILON CYL S.L. Números AqSyn entre parênteses, que podem ser utilizados como sinônimos de cada uma das linhagens, foram atribuídos às linhagens pelos inventores do presente.

[008] CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10) foram depositados em 20 de junho de 2012. CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59) foram depositados em 16 de maio de 2013.

[009] Em uma realização particular, a composição compreende pelo menos um, como por exemplo um, preferencialmente pelo menos dois, como dois, de maior preferência pelo menos três, como três, das três linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10). Em uma realização alternativa, a composição compreende todos os quatro CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10).

[010] Em uma realização alternativa, a composição compreende um ou mais dentre CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59), tal como um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito.

[011] Em uma realização alternativa, a composição compreende pelo menos um, tal como um, preferencialmente pelo menos dois, tal como dois, de maior preferência pelo menos três, tal como três, de maior preferência pelo menos quatro, tal como quatro dentre CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59).

[012] Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17) e CECT 8349 (AqSynJ55). Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em uma realização preferida, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59).

[013] Em uma realização da presente invenção, pelo menos uma das linhagens compreendidas na composição, tais como uma e/ou duas e/ou três e/ou quatro e/ou cinco e/ou seis e/ou sete e/ou oito e preferencialmente todas as linhagens compreendidas na composição não possuem resistência a antibióticos; nomeadamente, elas não são capazes de sobreviver após exposição ao tratamento com antibióticos padrão apropriado.

[014] Em qualquer dos casos, “compreende” pode ser opcionalmente compreendido de forma que outras linhagens bacterianas estão presentes, ou nenhuma outra linhagem bacteriana está presente. Mesmo se nenhuma outra linhagem bacteriana estiver presente, “compreende” pode opcionalmente significar que outros ingredientes adicionais estão presentes, ou seja, qualquer ingrediente diferente de bactérias.

[015] O(s) outro(s) ingrediente(s) não são limitados de nenhuma forma. Em um aspecto preferido, pelo menos um composto pré-biótico é compreendido na composição de acordo com a presente invenção, ou seja, como outro ingrediente.

[016] Com relação às composições de diferentes linhagens, qualquer razão de mistura é possível. A razão de mistura é indicada a seguir por unidades de formação de colônias (CFU), em que as CFUs são adequadamente determinadas antes da mistura das linhagens individuais. Em uma realização, as razões das linhagens podem ou não ser iguais, tais como 1:(0,1-10):(0,1-10) para uma composição de três linhagens, 1:1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) para uma composição de quatro linhagens e assim por diante. Em outra realização, as razões das linhagens são aproximada ou substancialmente iguais, como 1:1:1 para uma composição de três linhagens, 1:1:1:1 para uma composição de quatro linhagens e assim por diante. A composição pode ser preparada por meio de mistura da quantidade bacteriana correspondente (conforme determinado pela contagem de colônias) de cada linhagem a ser incorporada à composição. As linhagens a serem incorporadas podem ser fornecidas como padrões de linhagens individuais, cada uma delas, por exemplo, na forma liofilizada. Caso diferentes padrões tenham diferentes concentrações (CFU/g), quantidades apropriadas (g) de cada um são utilizadas, de forma que a composição desejada tenha a CFU desejada de cada uma das linhagens. Seus exemplos são exibidos abaixo.

[017] Pré-bióticos são bem conhecidos na técnica e, quando utilizados na presente invenção, não têm limitação particular do pré-biótico como tal. Todavia, em realizações preferidas, o pelo menos um produto pré-biótico na composição é selecionado a partir dos compostos e composições a seguir: betaglucanos, manano-oligossacarídeos, inulina, oligofrutose, galacto- oligossacarídeos (GOS), lactulose, lactossacarose, galactotriose, fructo- oligossacarídeo (FOS), celobiose, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarose, vitamina E ou uma de suas variantes (em que as variantes são selecionadas a partir de alfa, beta, gama, delta tocoferóis, tocotrienóis e tocomonoenóis). Opcionalmente, manano-oligossacarídeos e/ou inulina podem ser preferidos.

[018] A presente invenção também fornece o uso da composição descrita acima em um método de tratamento de seres humanos ou animais. Tratamento de um animal, em particular um mamífero e/ou animal doméstico, pode ser preferido. Preferencialmente, o animal é um animal não humano e, de maior preferência, é da subordem dos suínos (a subordem dos suínos (também conhecida como Suiformes) é uma linhagem de mamíferos que inclui os porcos e queixadas das famílias Suidae e Tayassuidae). Suíno ou porco, selvagem ou doméstico, pode ser particularmente preferido. Em outra realização, a composição é administrada a seres humanos.

[019] A presente invenção também fornece uma composição que compreende microrganismos, preferencialmente bactérias e, de maior preferência, bactérias de ácido láctico para uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecções bacterianas e/ou de aumento do peso de um mamífero recém-nascido, preferencialmente um leitão. Alternativamente, a composição destina-se a uso em um método de promoção do crescimento de um mamífero recém-nascido, preferencialmente um leitão.

[020] A mencionada composição para uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecções bacterianas e/ou aumento de peso e/ou promoção do crescimento pode compreender pelo menos uma das linhagens bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em algumas realizações, a mencionada composição para uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecções bacterianas e/ou aumento de peso e/ou promoção de crescimento é a composição particular descrita acima (em qualquer realização descrita).

[021] A composição para uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecções bacterianas e/ou aumento de peso e/ou promoção do crescimento pode ser administrada dentro dos 14 primeiros dias após o nascimento (preferencialmente dentro dos 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 primeiros dias após o nascimento e, de maior preferência, dentro dos dois primeiros dias após o nascimento ou dentro do primeiro dia (24 horas) após o nascimento.

[022] Com este propósito, a composição pode ser administrada oralmente, por exemplo. A composição pode estar em qualquer forma, tal como forma liofilizada, líquida ou nebulizada. Se, por exemplo, bactérias liofilizadas forem utilizadas na fabricação da composição, a mencionada composição preliminar de bactérias liofilizadas pode ser reidratada, por exemplo, com solução salina isotônica estéril, de forma que possa ser obtida uma composição final com a concentração total desejada (CFU/ml).

[023] Para proporcionar fácil uso, a composição pode estar em forma dosada. Por exemplo, cada dose compreende 107 ou mais, 108 ou mais, 109 ou mais, 1010 ou mais, 1011 ou mais unidades de formação de colônias (CFU) de bactérias (109 ou mais pode ser preferido). Uma dose pode ter volume na faixa de 0,1 a 100 ml, preferencialmente 0,2 a 50 ml, de maior preferência 0,5 a 20 ml, de maior preferência 1,0 a 10 ml, de maior preferência 1,5 a 5 ml e, de preferência ainda maior, (substancialmente) 2 ml. Dose de 2 ml com 109 ou mais CFU pode ser particularmente preferida.

[024] Qualquer quantidade de doses pode ser administrada e o técnico no assunto pode escolher a duração do tratamento de acordo com as necessidades na fazenda correspondente. Em uma realização particular, a quantidade total de doses administradas a mamíferos é de 10 ou menos, tal como qualquer número selecionado a partir de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou qualquer faixa que combine qualquer um destes números (exceto 10) com qualquer um destes números, desde que o segundo número seja mais alto (por exemplo, 1 a 3 doses). Um total de duas doses por animal pode ser particularmente preferida.

[025] Em uma realização preferida, uma primeira dose é administrada nas primeiras 24 horas após nascimento e uma segunda dose é administrada nas 24 horas subsequentes. Opcionalmente, estas são as duas únicas doses. Em outra opção, outras doses são administradas a seguir.

[026] A composição de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para tratamento ou prevenção de uma condição em mamíferos, como uma infecção bacteriana. Em algumas realizações, a condição pode ser selecionada a partir de diarreia devido a infecções bacterianas (incluindo colibacilose), diarreia de recém-nascido por Clostridium difficile, Clostridium perfringens tipo A e C. Também é possível administrar a composição a animais que sofrem de diarreia, mesmo se não houver sido (ainda) comprovado que o fator causador da mencionada diarreia é uma infecção (bacteriana).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[027] Figura 1: diferentes padrões de PCR geralmente destinam- se a espécies bacterianas distintas como descrito no Exemplo 1 (linhas 1-5, 7: Lactobacillus reuteri, linhas 8-11: Enterococcus faecium, linha 6: Marcador de peso molecular).

[028] Figura 2: Zonas de inibição, exemplo ilustrativo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] A descrição detalhada a seguir descreve variantes específicas e/ou preferidas das características individuais da presente invenção. A presente invenção também contempla, como realizações particularmente preferidas, aquelas realizações, que são geradas por meio da combinação de duas ou mais das variantes específicas e/ou preferidas descritas para duas ou mais das características da presente invenção.

[030] Exceto se expressamente especificado em contrário, o termo “compreende” é utilizado no contexto do presente documento para indicar que outros membros podem opcionalmente estar presente além dos membros da lista introduzidos por “compreende”. Todavia, é contemplado como realização específica da presente invenção que o termo “compreende” engloba a possibilidade de que nenhum outro membro esteja presente, ou seja, para a finalidade dessa realização, “compreende” deve ser compreendido com o significado de “consiste de”.

[031] Exceto se expressamente especificado em contrário, todas as indicações de quantidades relativas no presente pedido de patente são realizadas em base peso/peso. Indicações de quantidades relativas de um componente caracterizado por um termo genérico destinam-se a referir-se à quantidade total de todas as variantes ou membros específicos cobertos pelo mencionado termo genérico. Caso certo componente definido por um termo genérico seja especificado como estando presente em certa quantidade relativa e se este componente também for caracterizado por ser uma variante ou membro específico coberto pelo termo genérico, entende-se que nenhuma outra variante ou membro coberto pelo termo genérico está adicionalmente presente, de maneira que a quantidade relativa total de componentes cobertos pelo termo genérico excede a quantidade relativa especificada; de maior preferência, nenhuma outra variante ou membro coberto pelo termo genérico está presente.

[032] A presente invenção integra o conceito de pró-bióticos e pré- bióticos e, portanto, fornece simbióticos. Os inventores abrem uma nova janela terapêutica de bactérias e composições com efeito imunomodulador. Os microrganismos ou composições podem ser administrados em um estágio de vida inicial de um animal, como um leitão. Portanto, a presente invenção refere- se a produtos e composições que podem ser benéficos na criação de animais. A observação importante real, como evidenciado pelos exemplos, é o fato de que o tratamento pró-biótico é pelo menos igualmente eficaz e mais provavelmente melhor (em comparação com o tratamento antibiótico padrão), em termos de produtividade, que o tratamento com antibióticos. A contribuição dos inventores possui enorme impacto econômico devido ao custo geral de tratamento e devido à pressão legal e impacto ambiental.

[033] Os microrganismos, preferencialmente bactérias que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, são microrganismos com efeitos benéficos. Eles preferencialmente são bactérias de ácido láctico. Mesmo espécies não bacterianas de microrganismos podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, desde que elas obedeçam ao critério de seleção (a) até (c) abaixo. Sabe-se, por exemplo, que algumas leveduras podem também ter propriedades pró-bióticas.

[034] Embora os parâmetros funcionais descritos neste documento sejam o critério de seleção mais importante, no tocante às espécies dos microrganismos, são preferidas bactérias de ácido láctico. Bactérias de ácido láctico (LAB) compreendem um subtipo de bactérias gram-positivas tolerantes a ácidos que é associado pelas suas características metabólicas e fisiológicas comuns. Estas bactérias, encontradas naturalmente em plantas em decomposição e produtos lácteos, assim como em fezes de animais, produzem ácido láctico como produto final metabólico principal da fermentação de carboidratos. Bactérias de ácido láctico são geralmente reconhecidas como seguras (estado GRAS) devido à sua aparência onipresente em alimentos e à sua contribuição com a microflora saudável de superfícies da mucosa de mamíferos. Bactérias de ácido láctico são preferencialmente selecionadas a partir do gênero Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weisella. Lactobacillus e/ou Enterococcus podem ser preferidos. Lactobacillus é preferido. As bactérias preferidas neste documento são preferencialmente gram-positivas e negativas para catalase. Pode-se testar se uma bactéria é ou não gram-positiva de acordo com tecnologias padrão conhecidas na técnica. Manchas gram consistem de manchas consecutivas com diferentes “colorações” (manchas) e lavagem da amostra para verificar se ela é positiva ou negativa. O teste de uma bactéria para verificar se ela é ou não negativa para catalase é o seguinte: O teste de catalase envolve a adição de peróxido de hidrogênio a uma amostra de cultura ou inclinação de ágar. Se as bactérias em questão produzirem catalase, elas converterão o peróxido de hidrogênio e será gerado gás oxigênio. A evolução de gás causa a formação de bolhas e estas bolhas são indicativas de um teste positivo (bactéria positiva para catalase).

[035] As bactérias de ácido láctico preferidas neste documento são preferencialmente capazes de crescer em meio MRS e, de maior preferência, em ágar MRS acidificado, como descrito abaixo. Meio MRS foi criado para favorecer o crescimento de bactérias de ácido láctico, especialmente Lactobacillus sp. Acredita-se que ele desfavoreça o crescimento da grande maioria das bactérias gram-negativas. Todavia, outras bactérias além de bactérias de ácido láctico podem eventualmente crescer em MRS e é, portanto, recomendável ou até necessário verificar se as colônias pertencem a gram- positivo e são bactérias negativas para catalase.

[036] As bactérias de ácido láctico preferidas neste documento podem possivelmente ser bactérias pró-bióticas. A definição mais comumente aceita de “pró-biótico” foi fornecida em 1998 por Füller, que o descreveu como “um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro ao aprimorar seu equilíbrio microbiano intestinal”. Geralmente, pró- bióticos são microrganismos vivos. Acredita-se que diferentes pró-bióticos tenham diferentes ações no intestino e diferentes pró-bióticos podem, portanto, agir juntos para fornecer um efeito benéfico. Outras fontes definem pró-bióticos como aqueles microrganismos para os quais já tenha sido provado benefício de saúde sobre o ser humano ou animal. Critérios de seleção de pró-bióticos são publicados em Report of a Join FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura e Organização Mundial da Saúde, 2001, Córdoba, Argentina. As vantagens do uso de bactérias vivas foram amplamente descritas.

[037] Nos últimos anos, foi introduzido o conceito de “pré-bióticos”; pré-bióticos são componentes alimentícios não digeríveis que aumentam o crescimento de microrganismos específicos no trato gastrointestinal. “Simbióticos” são composições que compreendem pelo menos um pró-biótico e pelo menos um pré-biótico. Essas composições são compreendidas como incentivando o crescimento de bactérias benéficas (por exemplo, os pró- bióticos). Como exemplo ilustrativo, produtos lácteos fermentados são frequentemente considerados simbióticos porque contêm bactérias vivas e a fonte de alimento necessária para elas. Embora os benefícios associados a pré- bióticos e pró-bióticos sejam favoráveis, os pesquisadores são cautelosos sobre a tomada de conclusões gerais porque os benefícios variam, dependendo do tipo e da quantidade de pré e pró-biótico consumidos, assim como combinações específicas de pró-bióticos específicos com pré-bióticos específicos. Portanto, simbióticos poderosos são baseados em uma combinação de linhagens específicas de bactérias pró-bióticas com pré-bióticos cuidadosamente selecionados. Eles podem trazer benefícios importantes de saúde para um mamífero.

[038] Pró-bióticos, pré-bióticos e simbióticos específicos foram sugeridos para usos em seres humanos e critérios de seleção para pró-bióticos são descritos, por exemplo, em Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura e Organização Mundial da Saúde, 2001, Córdoba, Argentina.

[039] A presente invenção utiliza microrganismos, bactérias em particular, que possuem potencial de exibir benefício de saúde sobre animais, animais de fazenda em particular. Preferencialmente, o animal é um animal doméstico, domesticado ou animal que não é doméstico nem domesticado (ou seja, selvagem), mas que pertence à mesma espécie ou gênero de um animal doméstico. Por exemplo, um porco selvagem seria incluído nesta definição, já que ele pertence à mesma espécie de um porco doméstico. Alguns exemplos de animais domésticos que podem ser tratados incluem, sem limitações, cachorros, gatos e outros animais de estimação, cavalos, bois, galinhas e outras aves, suínos, ovelhas e cabras. Preferencialmente, o animal é um animal de fazenda e animais de fazenda incluem, sem limitações, cavalos, bois, galinhas e outras aves, suínos, ovelhas e cabras. De maior preferência, o animal é da subordem dos suínos. A subordem dos suínos (também conhecida como Suiformes) é uma linhagem de mamíferos que inclui os porcos e queixadas das famílias Suidae e Tayassuidae. Suíno ou porco, selvagem ou doméstico, pode ser particularmente preferido.

[040] As linhagens que são adequadas para a presente invenção podem ser identificadas da seguinte forma.

[041] Primeira etapa para chegar às linhagens de acordo com a presente invenção: isolamento de linhagens isoladas.

[042] Em uma primeira etapa, é isolada uma amostra que contém microrganismos (preferencialmente bactérias). Pode ser adequada qualquer fonte de microrganismos que, no sentido mais amplo, pode ser qualquer amostra não estéril da natureza. A fonte pode ser de animais (domésticos), como de animais jovens nos primeiros 30 dias de vida, ou de suas mães. Alternativamente, a fonte pode ser de animais selvagens (por exemplo, javalis selvagens), como amostras coletadas de javalis selvagens capturados. Fontes adequadas incluem colostro de animais mães (por exemplo, porcas), amostras de mecônio de animais recém-nascidos (por exemplo, leitões), lavagens de parede intestinal de animais domésticos ou selvagens ou bactérias intestinais naturais de ácido láctico. Microrganismos (por exemplo, bactérias) contidos nas amostras podem ser cultivados sobre meio de crescimento bem conhecido na técnica como sendo adequado para o crescimento de microrganismos intestinais, por exemplo, meio MRS. Os microrganismos podem ser estriados, o que permitirá o isolamento de colônias únicas. As colônias isoladas podem ser escolhidas e as linhagens respectivas, adicionalmente propagadas em um meio de crescimento apropriado (por exemplo, o mesmo utilizado inicialmente).

[043] As linhagens destas colônias isoladas são opcionalmente testadas por manchas Gram por meio de métodos conhecidos na técnica (e selecionadas se forem gram-positivas) e/ou testadas para determinar a presença de atividade de catalase, como descrito acima (e selecionadas se forem negativas para catalase).

[044] Segunda etapa para chegar às linhagens de acordo com a presente invenção: testes in vitro.

[045] Para ser selecionada como útil para a presente invenção, uma linhagem de microrganismos, que se origina preferencialmente da primeira etapa descrita acima, necessita atender a pelo menos um dos critérios a seguir que são relacionados em primeiro lugar no presente e detalhados abaixo: a. atividade contra bactérias indesejadas; b. tolerância a ácidos; e c. Tolerância a sais de bílis.

[046] Os itens (a) a (c) representam prioridade; ou seja, é mais desejado que o critério (a) seja atendido, é o segundo mais desejado que os critérios (a) e (b) sejam atendidos e, de maior preferência, que todos os critérios (a) a (c) sejam atendidos. Os critérios de seleção são detalhados a seguir. i. Atividade contra bactérias indesejadas:

[047] É realizada varredura in vitro contra bactérias indesejadas. “Indesejadas” são bactérias selecionadas a partir de uma ou mais das seguintes: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus e Escherichia coli. Preferencialmente, a espécie de Salmonella é Salmonella enterica, de maior preferência Salmonella enterica sorotipo Typhimurium.

[048] A atividade contra as bactérias indesejadas é testada de acordo com o teste de mancha sobre o gramado, que é descrito a seguir. Culturas líquidas por uma noite (MRS) de cada linhagem a ser testada são aplicadas como manchas isoladas de 10 μl sobre ágar MRS e incubadas a 30 °C por 24 h em condições anaeróbicas. Após a incubação, as placas são cobertas com 7 ml de ágar BHI semissólido (0,7%) inoculado com uma das bactérias indesejadas (1%; 1 ml de cultura por uma noite em meio de 100 ml). Placas separadas que contêm uma linhagem particular a ser testada são sobrepostas com uma das espécies de bactérias indesejadas, respectivamente. Cada um destes testes é realizado em triplicata. Após incubação por 24 h à temperatura de crescimento ideal da bactéria indesejada ou perto dela (em que essa temperatura de crescimento ideal é conhecida na técnica para cada uma das bactérias indesejadas referidas neste documento), as amostras são examinadas para determinar evidências de inibição. Com este propósito, verifica-se primeiro se uma zona de inibição está presente. Se estiver, o diâmetro da zona de inibição é medido opticamente. Quando a zona de inibição não parecer exatamente circular, a medição da zona de inibição é realizada com uma regra de medição do diâmetro mais curto da zona de inibição. Por fim, é determinada a média aritmética do experimento em triplicata e verifica-se se o critério a seguir é atendido.

[049] Critério: pelo menos uma das seguintes condições [(i), (ii), (iii), (iv)] necessita ser atendida para que uma linhagem seja selecionada como positiva: i. para Salmonella, zona de inibição de 10 mm ou mais, por exemplo, 14 mm ou mais; ii. para Listeria monocytogenes, zona de inibição de 9 mm ou mais, preferencialmente 10 mm ou mais; iii. para Staphyloccocus aureus, zona de inibição de 9 mm ou mais, preferencialmente 10 mm ou mais; e iv. para Escherichia coli, zona de inibição de 10 mm ou mais, por exemplo 18 mm ou mais.

[050] 9 mm ou mais inclui 10 mm ou mais, 11 mm ou mais, 12 mm ou mais, 13 mm ou mais, 14 mm ou mais, 15 mm ou mais, 16 mm ou mais, 17 mm ou mais, 18 mm ou mais, 19 mm ou mais, 20 mm ou mais, 21 mm ou mais, 22 mm ou mais, 23 mm ou mais, 24 mm ou mais, 25 mm ou mais.

[051] 10 mm ou mais inclui 11 mm ou mais, 12 mm ou mais, 13 mm ou mais, 14 mm ou mais, 15 mm ou mais, 16 mm ou mais, 17 mm ou mais, 18 mm ou mais, 19 mm ou mais, 20 mm ou mais, 21 mm ou mais, 22 mm ou mais, 23 mm ou mais, 24 mm ou mais, 25 mm ou mais, 26 mm ou mais, 27 mm ou mais, 28 mm ou mais, 29 mm ou mais, 30 mm ou mais, 35 mm ou mais.

[052] 14 mm ou mais inclui 15 mm ou mais, 16 mm ou mais, 17 mm ou mais, 18 mm ou mais, 19 mm ou mais, 20 mm ou mais, 19 mm ou mais, 20 mm ou mais, 25 mm ou mais, 30 mm ou mais.

[053] 18 mm ou mais inclui 19 mm ou mais, 20 mm ou mais, 21 mm ou mais, 22 mm ou mais, 23 mm ou mais, 24 mm ou mais, 25 mm ou mais, 26 mm ou mais, 27 mm ou mais, 28 mm ou mais, 29 mm ou mais, 30 mm ou mais, 35 mm ou mais.

[054] Uma composição que compreende várias linhagens pode também ser testada com base nos critérios acima e essa composição, para que seja selecionada para ser adequada para qualquer dos usos médicos descritos neste documento, necessita atender a todos os critérios [(i), (ii), (iii), (iv)]. Também pode ser esperado que essa composição possa ser preparada adequadamente combinando-se linhagens individuais de microrganismos das quais todos atendem pelo menos um dos critérios (i), (ii), (iii), (iv); mas, para verificar se este é mesmo o caso ou não, é necessário teste experimental.

[055] Alternativamente, o teste de difusão em cavidade em ágar pode ser utilizado para determinar zonas de inibição. Este processo elimina qualquer traço de ácido láctico que poderia ser produzido em caldo de MRS de baixa glicose ao neutralizar sobrenadantes sem células. Culturas de fase estacionária das espécies a serem testadas, cultivadas sob condições anaeróbicas, são colhidas por meio de centrifugação (5000 g/20 min/4 °C) e o pH do sobrenadante livre de células é ajustado em 6,5 com 1 M de NaOH. Sobrenadantes são esterilizados por filtro (0,20 mm; Millipore Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). O sobrenadante sem células (30 μl) é adicionado a cavidades com 7 mm de diâmetro cortadas em placas de ágar inoculadas com (cerca de) 105 unidades de formação de colônias (CFU)/ml da bactéria indesejada relacionada em (i), (ii), (iii) e (iv). As placas de ágar são então incubadas a 30 °C por 24 horas. O diâmetro das zonas de inibição em torno das cavidades é medido e os critérios de seleção são conforme indicado em (i), (ii), (iii) e (iv) acima, dos quais pelo menos um necessita ser atendido para que uma linhagem seja selecionada como positiva.

[056] Para informação: os testes acima são baseados no descrito por Kawai et al., 2004, Applied and Environmental Microbiology 70 (5): 29062911; Dortu et al. 2008, Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586; Hata et al., 2009, International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh, 2009, Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125-1132. ii. Tolerância a ácidos:

[057] Ácido pode ser considerado simulação do suco gástrico e sua tolerância a ele é testada da seguinte forma. 100 μl de uma suspensão inicial em MRS de 6-8 x 108 CFU/ml de cada linhagem são suspensos em MRS acidificado (pH = 3,5 ou, alternativamente, pH = 2,5), acidificado mediante adição de uma quantidade apropriada de 12 N HCl, e incubados a 37 °C sob agitação de 110 rpm. Amostras são testadas por meio de contagem de colônias (CFU/ml) após 0, 3 e 6 horas.

[058] Critério: a linhagem necessita ser capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade (pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 95% de CFU após o teste em comparação com anteriormente, preferencialmente pelo menos 50% de CFU após o teste em comparação com anteriormente) durante 3 horas de incubação no mencionado meio. Para referência: um protocolo similar é brevemente descrito por Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260). iii. Tolerância a sais de bílis:

[059] Simulação das condições naturais do intestino delgado de mamíferos.

[060] 100 μl de uma suspensão inicial em MRS de 6-8 x 108 CFU/ml de uma linhagem bacteriana são suspensos em solução de intestino delgado simulado (por exemplo, MRS sob pH = 8 (pH ajustado mediante adição de NaOH) e 0,45% de extrato de bílis (extrato de bílis, suíno, B8631-100G, SIGMA-ALDRICH)) e incubados a 37 °C sob agitação de 110 rpm. Amostras são testadas por meio de contagem de colônias (CFU/ml) em 1, 2 e 4 horas.

[061] Critério: sem perda de viabilidade (ou essencialmente sem perda de viabilidade, ou seja, preferencialmente 50% ou mais de CFU, tal como 50%, 60%, 70%, 75%, 80% ou 95% ou mais de CFU) após exposição a sucos simulados do intestino delgado (0, 45% sais de bílis, opcionalmente sob pH = 8) por 4 horas. Um protocolo similar é brevemente descrito por Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260.

[062] Opcionalmente, as linhagens que haviam sido identificadas como positivas pelos critérios acima (a) a (c) podem também ser testadas para determinar sua aderência a superfícies epiteliais e persistência no trato gastrointestinal do animal (por exemplo, suíno). Acredita-se que linhagens com boas propriedades de aderência terão melhor desempenho.

[063] Opcionalmente, as linhagens que foram identificadas como positivas segundo os critérios acima (a) a (c) são adicionalmente testadas para determinar seu perfil de resistência a antibióticos, por exemplo, por meio do teste de concentração mínima de antibióticos (testes de microplacas VetMIC) e/ou um teste de resistência genotípico é realizado por meio de PCR para diferentes genes de resistência (Egervarn et al., 2010, Antonie van Leeuwenhoek 97: 189200). Acredita-se que bactérias sem resistência a antibióticos (ausência ou inatividade/perda de função de genes de resistência) sejam mais adequadas para aplicação a animais de fazenda.

[064] A bactéria de ácido láctico de acordo com a presente invenção pode ser selecionada a partir das linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Acredita-se que todas estas linhagens tenham propriedades pró-bióticas e elas podem, portanto, ser denominadas pró- bióticos neste documento. As linhagens respectivas foram isoladas pelos inventores do presente de acordo com os critérios de seleção acima. CECT refere-se à Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos, enquanto os números AqSyn entre parênteses, que podem ser utilizados como sinônimos para cada uma das linhagens, foram alocados às linhagens pelos inventores do presente. Cada bactéria foi testada e considerada atendendo pelo menos um dos critérios (a) a (c) acima. Ao encontrar outras linhagens com propriedades benéficas de acordo com a presente invenção, pode ser suficiente que qualquer uma dessas linhagens, para que seja selecionada como adequada para a presente invenção, atenda pelo menos um dos critérios (a) a (c) acima. A presente invenção também fornece uma composição que compreende pelo menos uma, tal como uma, preferencialmente pelo menos duas, tal como duas, de maior preferência pelo menos três, tal como três, de preferência ainda maior pelo menos quatro, tal como quatro, alternativamente pelo menos cinco, tal como cinco, alternativamente pelo menos seis, tal como seis, alternativamente pelo menos sete, tal como sete, alternativamente pelo menos oito, tal como oito dessas linhagens. Acredita-se que diferentes linhagens apresentem diferentes ações no intestino e diferentes linhagens podem, portanto, agir juntas para fornecer um efeito benéfico.

[065] Em uma realização particular, a composição compreende pelo menos uma, tal como uma, preferencialmente duas, tal como duas, de maior preferência as três linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10). Em uma realização alternativa, a composição compreende as linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10).

[066] Em uma realização alternativa, a composição compreende um ou mais dentre CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59), tal como um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito.

[067] Em uma realização alternativa, a composição compreende pelo menos um, tal como um, preferencialmente pelo menos dois, tal como dois, de maior preferência pelo menos três, tal como três, de preferência ainda maior pelo menos quatro, tal como quatro dentre CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59).

[068] Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17) e CECT 8349 (AqSynJ55). Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); e CECT 8350 (AqSynJ59). Em uma realização alternativa, a composição compreende as três linhagens a seguir: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em uma realização alternativa, a composição compreende todos os quatro dentre CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59).

[069] Em uma realização da presente invenção, pelo menos uma das linhagens compreendidas na composição, tal como um e/ou dois e/ou três e/ou quatro e/ou cinco e/ou seis e/ou sete e/ou oito das linhagens compreendidas na composição e, preferencialmente, todas as linhagens compreendidas na composição são livres de resistência a antibióticos; nomeadamente, elas não são capazes de sobreviver após a exposição ao tratamento com antibióticos padrão apropriado.

[070] Um teste in vitro de concentração mínima inibidora (MIC) destinado a avaliar resistências a antibióticos pode ser realizado para todas as linhagens sugeridas. Os antibióticos avaliados podem ser os seguintes: Ampicilina, Vancomicina, Gentamicina, Canamicina, Estreptomicina, Eritromicina, Clindamicina, Tetraciclina e Cloranfenicol.

[071] Com o propósito de diferenciar linhagens resistentes de suscetíveis, o Painel Europeu de Autoridade de Segurança Alimentar (EFSA) sobre Aditivos e Produtos ou Substâncias Utilizadas em Ração Animal (FEEDAP) define valores de corte microbiológicos. Valores de corte microbiológicos são estabelecidos estudando a distribuição de MICs dos antimicrobianos selecionados em populações bacterianas pertencentes a uma única unidade taxonômica (espécie ou gênero). A parte da população que claramente se afasta das populações normais suscetíveis é classificada como resistente. Os valores de corte microbianos que podem ser utilizados para avaliar as resistências a antibióticos das linhagens de acordo com a presente invenção são as definidas em Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance, Painel EFSA sobre Aditivos e Produtos ou Substâncias Utilizadas em Ração Animal (FEEDAP), Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA), Parma, Itália. EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740.

[072] De qualquer forma, “compreende” pode opcionalmente ser entendido como outras linhagens bacterianas estão presentes, ou como nenhuma outra linhagem bacteriana está presente. Mesmo se nenhuma outra linhagem bacteriana estiver presente, “compreende” pode opcionalmente significar que outros ingredientes, ou seja, qualquer ingrediente além das bactérias, estão presentes.

[073] O(s) outro(s) ingrediente(s) não é(são) limitado(s) de forma alguma. Em um aspecto preferido, pelo menos um composto pré-biótico é compreendido na composição de acordo com a presente invenção, ou seja, como outro ingrediente. Em um conceito muito amplo, pré-bióticos são todas as fontes de alimento que podem ser metabolizadas por pró-bióticos. Preferencialmente, pré-bióticos não são digeríveis ou são escassamente digeríveis por mamíferos. Portanto, após a absorção pelo mamífero, os pré- bióticos não digeríveis podem passar pelo intestino delgado e entrar no intestino grosso para estimular o crescimento dos pró-bióticos neste compartimento. Portanto, pré-bióticos podem servir de fonte de alimento para pró-bióticos. Acredita-se que os pré-bióticos, muitos dos quais são carboidratos não digeríveis, promovam o crescimento de pró-bióticos dentro do intestino. Pré- bióticos são naturalmente encontrados, por exemplo, em cebolas, grãos integrais, bananas, alho, mel, alho-poró, alcachofras, alimentos fortificados e bebidas, assim como suplementos alimentares. Pré-bióticos são bem conhecidos na técnica e, quando utilizados na presente invenção, não há limitação particular do pré-biótico como tal. Todavia, em realizações preferidas, o pelo menos um produto pré-biótico na composição é selecionado a partir dos compostos e composições a seguir: carboidratos não digeríveis, betaglucanos, manano-oligossacarídeos, inulina, oligofrutose, galacto-oligossacarídeos (GOS), lactulose, lactossacarose, galactotriose, fructo-oligossacarídeo (FOS), celobiose, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarose, vitamina E ou uma de suas variantes (em que as variantes são selecionadas a partir de alfa, beta, gama, delta tocoferóis, tocotrienóis e tocomonoenóis). Opcionalmente, manano-oligossacarídeos e/ou inulina podem ser preferidos.

[074] Com relação às composições de linhagens diferentes, qualquer razão de mistura é possível. A razão de mistura é indicada em unidades de formação de colônias (CFU), que são determinadas adequadamente antes da mistura das linhagens individuais. Em uma realização, as razões das linhagens podem ou não ser iguais, tais como 1:(0,1-10):(0,1-10) para uma composição de três linhagens, 1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) para uma composição de quatro linhagens e assim por diante. Em outra realização, as razões das linhagens são aproximada ou substancialmente iguais, como 1:1:1 para uma composição de três linhagens e 1:1:1:1 para uma composição de quatro linhagens e assim por diante. A composição pode ser preparada misturando a respectiva quantidade bacteriana (conforme determinado por meio de contagem de colônias) de cada linhagem a ser incorporada à composição.

[075] A presente invenção também fornece o uso de uma composição em um método de tratamento de seres humanos ou animais. O tratamento de animais, mamíferos e/ou animais domésticos em particular pode ser preferido. Preferencialmente, o animal é da subordem dos suínos (a subordem dos suínos é uma linhagem de mamíferos que inclui os porcos e queixadas das famílias Suidae e Tayassuidae). Suíno ou porco, selvagem ou doméstico, pode ser particularmente preferido. Isso também inclui porcos que vivem em condições semisselvagens, ou seja, raças de porcos domésticos que vivem a maior parte do ano ao ar livre e encontram sua própria comida. A composição pode ser uma composição que compreende pelo menos uma das linhagens depositadas acima descritas.

[076] A presente invenção também fornece uma composição que compreende bactérias de ácido láctico para uso em um método de aumento de peso de mamíferos recém-nascidos, preferencialmente leitões. Alternativamente, a composição destina-se a uso em um método de promoção do crescimento de mamíferos recém-nascidos, preferencialmente leitões. Alternativamente, a composição destina-se a uso em um método de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecções bacterianas em mamíferos recém-nascidos, preferencialmente leitões. Pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, de maior preferência pelo menos três, tal como quatro ou mais de quatro linhagens diferentes de bactérias de ácido láctico são compreendidas na composição. No caso da composição para o uso descrito neste parágrafo, cada bactéria de ácido láctico precisa atender a pelo menos um dos critérios (a) a (c) (atividade contra bactérias indesejadas; tolerância a ácidos; tolerância aos sais de bílis), como descrito acima. Em relação ao critério (a), a zona de inibição mínima referenciada acima é normalmente observada para todas as bactérias indesejadas (i) a (iv). Preferencialmente, a composição deverá atender a uma série (tal como (a) e (b)) e preferencialmente todos os critérios (a) a (c) acima. Também é possível que no mencionado método, nenhum antibiótico seja administrado ao animal. Uma composição pró-biótica ou uma composição simbiótica pode ser utilizada no mencionado método (ou seja, que compreende pelo menos um composto pré-biótico).

[077] A composição da composição de acordo com a presente invenção compreende microrganismos vivos, preferencialmente bactérias. Em particular, a mencionada composição para uso em um método de aumento de peso e/ou de promoção do crescimento e/ou de tratamento ou prevenção da diarreia causada por uma infecção bacteriana pode compreender pelo menos uma, tal como uma e/ou duas e/ou três e/ou quatro e/ou cinco e/ou seis e/ou sete e/ou oito das linhagens bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59). Em algumas realizações, a mencionada composição para uso em um método de aumento de peso e/ou de promoção do crescimento e/ou de tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecção bacteriana é a composição particular descrita acima (em qualquer realização descrita).

[078] A composição para uso em um método de aumento de peso e/ou promoção do crescimento e/ou tratamento ou prevenção da diarreia causada por infecção bacteriana pode ser administrada dentro dos 14 primeiros dias após o nascimento (de maior preferência, dentro dos 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 primeiros dias após o nascimento e, de maior preferência, dentro dos dois primeiros dias após o nascimento ou dentro do primeiro dia (24 horas) após o nascimento.

[079] Qualquer via de administração é adequada, mas administração oral pode ser preferida. Mais tipicamente, é fornecida uma dose a cada animal diretamente na boca para garantir que o animal engoliu a dose. Alternativamente, a composição também pode ser fornecida como suplemento alimentar, ou seja, adicionada à alimentação diária do animal.

[080] A composição pode apresentar-se em qualquer forma, tal como forma liofilizada, líquida ou nebulizada. Se, por exemplo, bactérias liofilizadas forem utilizadas para compor a composição, a mencionada composição preliminar de bactérias liofilizadas pode ser reidratada, por exemplo, com solução salina isotônica estéril ou com água estéril ou com meio de crescimento estéril, para que seja obtida uma composição final com a concentração total desejada (CFU/ml).

[081] Para proporcionar fácil uso, a composição pode encontrar- se em forma dosada. Por exemplo, cada dose pode compreender 107 ou mais, 108 ou mais, 109 ou mais, 1010 ou mais, 1011 ou mais unidades de formação de colônias (CFU) de microrganismos (bactérias); uma dose de 109 ou mais pode ser preferida. Uma dose pode ter volume na faixa de 0,1 a 100 ml, preferencialmente 0,2 a 50 ml, de maior preferência 0,5 a 20 ml, de maior preferência 1,0 a 10 ml, de maior preferência 1,5 a 5 ml e, de preferência ainda maior, (substancialmente) 2 ml. Dose de 2 ml com 109 ou mais CFUs pode ser particularmente preferida.

[082] Qualquer quantidade de doses pode ser administrada e o técnico no assunto pode escolher o comprimento do tratamento de acordo com as necessidades na fazenda correspondente. Em uma realização particular, o número total de doses administradas a um animal é de 10 ou menos, tal como qualquer número selecionado a partir de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou qualquer faixa que combina qualquer um destes números (exceto 10) com qualquer um destes números, desde que o segundo número seja mais alto (por exemplo, 1 a 3 doses). Um total de duas doses por animal pode ser particularmente preferido.

[083] Portanto, os inventores fornecem um novo uso para essas composições por meio do emprego opcional da composição pró-biótica ou simbiótica em um estágio de vida inicial. Em uma realização preferida, uma primeira dose é administrada nas 24 primeiras horas depois do nascimento e uma segunda dose é administrada nas 24 horas subsequentes. Opcionalmente, estas são as duas únicas doses. Em outra opção, mais doses são administradas a seguir.

[084] A composição de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para tratar ou prevenir uma condição em mamíferos, tal como uma infecção bacteriana ou disbiose. A infecção pode ser ou incluir uma infecção do trato digestivo. Essa infecção pode ser causada por qualquer bactéria, como por exemplo, Escherichia coli, isoladamente ou em combinação com Clostridium perfringens ou com Clostridium difficile. Outros fatores causadores podem incluir Salmonella, Listeria monocytogenes e Staphyloccocus aureus. Em algumas realizações, a condição pode ser selecionada a partir de diarreia devido a infecções bacterianas (que incluem colibacilose), diarreia do recém-nascido de Clostridium difficile e Clostridium perfringes tipos A e C. Meningite estreptocócica pode também ser tratada. É possível ainda administrar a composição a animais que sofrem de diarreia ou com risco de sofrer de diarreia, mesmo se (ainda) não se houver comprovado que uma infecção (bacteriana) é o fator causador da mencionada diarreia. Animais com risco de sofrer de diarreia podem ser considerados aqueles animais que vivem (ou nasceram) em locais onde diarreia foi observada durante os últimos 12 meses, 6 meses, 3 meses ou 1 mês.

[085] Os resultados dos inventores confirmam o efeito vantajoso do uso dos produtos e composições de acordo com a presente invenção. Conforme exibido nos exemplos de prova de conceito abaixo, o percentual de mortalidade era claramente mais baixo que outras semanas com apenas administração de antibióticos de rotina (ver Exemplos). Portanto, preferencialmente a composição de acordo com a presente invenção é administrada a animais que não são tratados com antibiótico(s) ao mesmo tempo.

[086] A presente invenção também fornece um microrganismo, preferencialmente bactéria e de, maior preferência, uma bactéria de ácido láctico. A bactéria de ácido láctico é idealmente selecionada a partir das linhagens a seguir: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59), as quais foram todas depositadas com CECT.

[087] O presente pedido de patente compreende os itens a seguir: 1. Composição que compreende uma ou mais linhagens de microrganismos para uso em um método de aumento de peso de um mamífero recém-nascido (preferencialmente um leitão), em que cada linhagem atende pelo menos à condição (a) a seguir, preferencialmente às duas condições (a) e (b) e, de preferência superior, a todas as condições (a), (b) e (c): a. possui pelo menos uma das atividades antimicrobianas a seguir, conforme evidenciado por zonas de inibição determinadas por meio do teste de mancha sobre o gramado: (i) zona de inibição de 14 mm ou mais para Salmonella; (ii) zona de inibição de 9 mm ou mais para Listeria monocytogenes; (iii) zona de inibição de 9 mm ou mais para Staphyloccocus aureus; (iv) zona de inibição de 18 mm ou mais para Escherichia coli; b. é capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante três horas de incubação sob pH = 2,5; c. é capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante quatro horas de incubação na presença de 0,45% de extrato de bílis e pH = 8; 2. Bactéria de ácido láctico selecionada a partir das linhagens a seguir: a. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8163 (AqSyn04); b. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8165 (AqSyn06); c. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8164 (AqSyn09); d. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8166 (AqSyn10); 3. Composição que compreende pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, de maior preferência pelo menos três e, de preferência ainda maior, todas as linhagens bacterianas do item 2; 4. Composição de acordo com o item 3, que compreende ou consiste das três linhagens a seguir: i. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8163 (AqSyn04); ii. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8164 (AqSyn09); iii. linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8166 (AqSyn10). 5. Composição de acordo com o item 4, que compreende ou consiste de todas as quatro linhagens do item 1; 6. Composição de acordo com qualquer dos itens 3 a 5, que compreende adicionalmente pelo menos um produto pré-biótico; 7. Composição de acordo com o item 6, em que o pelo menos um produto pré-biótico é selecionado a partir dos compostos e composições a seguir: betaglucanos, manano-oligossacarídeos, inulina, oligofrutose, galacto- oligossacarídeos (GOS), lactulose, lactossacarose, galactotriose, fructo- oligossacarídeo (FOS), celobiose, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarose, vitamina E ou uma de suas variantes (em que as variantes são selecionadas a partir de alfa, beta, gama, delta tocoferóis, tocotrienóis e tocomonoenóis), em que são preferidos manano-oligossacarídeos e/ou inulina; 8. Composição de acordo com qualquer dos itens 3 a 7 para uso em um método de tratamento de seres humanos ou animais, que preferencialmente são animais mamíferos e/ou domésticos e, de maior preferência, porcos; 9. Composição para uso de acordo com o item 1, em que a composição é a composição de acordo com os itens 3 a 7; 10. Composição para uso de acordo com o item 1 ou 9, em que a composição é administrada dentro dos 14 primeiros dias após o nascimento (preferencialmente dentro dos 13, 12, 11, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 primeiros dias após o nascimento e, de maior preferência, dentro dos dois primeiros dias após o nascimento; 11. Composição para uso de acordo com qualquer dos itens 1 ou 9 a 10 para administração oral; 12. Composição para uso de acordo com qualquer dos itens 1 ou 9 a 11, que se encontra em forma liofilizada, líquida ou nebulizada; 13. Composição para uso de acordo com qualquer dos itens 1 ou 9 a 12, em que a composição é fornecida em forma dosada e cada dosagem compreende 109 ou mais unidades de formação de colônias (CFU); 14. Composição para uso de acordo com o item 13 para administração em duas doses; 15. Composição para uso de acordo com o item 14, em que a primeira dose é administrada nas primeiras 24 horas após o nascimento e a segunda dose é administrada nas 24 horas subsequentes; e 16. Composição para uso de acordo com qualquer dos itens 1 ou 9 a 15 para tratamento ou prevenção de infecções bacterianas, como diarreia devido a infecções bacterianas (que incluem colibacilose), diarreia do recém- nascido de Clostridium difficile, Clostridium perfringens tipos A e C.

[088] Materiais e métodos: Meio MRS: A receita de meio MRS foi preparada de acordo com a receita obtida da Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos (CECT; www.cect.org) da seguinte forma: 10,0 g de peptona, 10,0 g de extrato de carne bovina, 5,0 g de extrato de levedura, 20,0 g de glicose, 2,00 g de citrato de amônio, 5,00 g de acetato de sódio, 0,20 g de MgSO4.7H2O, 0,05 g de MnSO4.H2O, 2,00 g de K2HPO4, (15 g de pó de ágar (apenas para meio sólido)), 1 L de água destilada.

[089] Receita de meio BHI (Infusão de Coração-Cérebro) foi preparada de acordo com a receita obtida a partir da Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos (CECT; www.cect.org) da seguinte forma: 12,5 g de sólidos de infusão de cérebro de bezerro, 5,0 g de sólidos de infusão de coração bovino, 10,0 g de proteose peptona, 2,0 g de glicose, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de HNa2PO4, 1 L de água destilada (15 g de pó de ágar (apenas para meio sólido)).

[090] Tratamento antibiótico: normalmente, cada fazenda de porcos trata de leitões recém-nascidos com antibióticos e possivelmente suplemento de ferro. Geralmente, cada fazenda de porcos possui tratamento “padrão” diferente para seus animais (elas geralmente injetam uma dose de antibiótico e suplementação de ferro no nascimento). Nos experimentos abaixo, o tratamento padrão das respectivas fazendas foi utilizado. Antibióticos são geralmente utilizados também esporadicamente por diarreia, claudicação, sintomas respiratórios e muitos outros fatos diários sem um protocolo completamente estabelecido em leitões.

EXEMPLOS EXEMPLO 1A

[091] Origem das linhagens: Linhagens bacterianas foram isoladas e identificadas da seguinte forma.

[092] O isolamento das linhagens bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) e CECT 8166 (AqSyn10) foi realizado de colostro de porcas e amostras de mecônio de leitões recém-nascidos. A amostragem ocorreu em fazendas de suínos de alta qualidade sanitária na Espanha.

[093] Amostras foram cultivadas aerobicamente e anaerobicamente em De Man, Rogosa, placas de ágar Sharpe (MRS) por 24 horas a 37 °C e colônias gram-positivas e negativa para catalase de diferentes morfologias foram isoladas. Todas as colônias pertenceram a linhagens bacterianas. Mais precisamente, foram isoladas 61 linhagens bacterianas diferentes. Cada uma foi amplificada por meio de PCR com primers de PCR dirigidos à região espaçadora de rRNA 16S/23S, conforme descrito por Berthier e Ehrlich, 1998, FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.

[094] Após a amplificação e eletroforese, bandas claramente diferenciadas foram purificadas e sequenciadas. Os padrões PCR diferentes são exibidos na Figura 1. No sequenciamento, as linhagens foram deslocadas para várias espécies bacterianas. 1.1 Caracterização das linhagens: Sem desejar restrições a uma teoria particular, acredita-se que possam existir diferenças substanciais de linhagem. A fim de diferenciar linhagens da mesma espécie, foi realizado um teste API 50 CH (Biomérieux, REF 50 300) de acordo com as instruções do fabricante, para descrever padrões de fermentação de carboidratos dos substratos, o que confirma diferenças entre linhagens da mesma espécie.

[095] De 61 linhagens, 10 grupos diferentes puderam ser observados por padrões de fermentação de carboidratos, o que confirma a presença de 10 linhagens diferentes. Uma de cada grupo foi tomada como exemplo e submetida aos métodos in vitro a seguir.

[096] As 10 linhagens pertenceram às espécies Lactobacillus reuteri e Enterococcus faecium: 1. Lactobacillus reuteri; 2. Lactobacillus reuteri; 3. Lactobacillus reuteri; 4. Lactobacillus reuteri (AqSyn04); 5. Lactobacillus reuteri; 6. Lactobacillus reuteri (AqSyn06); 7. Enterococcus faecium; 8. Enterococcus faecium; 9. Enterococcus faecium (AqSyn09); e 10. Enterococcus faecium (AqSyn10).

[097] Estas 10 linhagens foram também testadas para verificar seu possível uso no aprimoramento da saúde animal (suína, em particular), conforme a seção 1.2 a seguir. 1.2 Seleção das linhagens: As 10 linhagens identificadas como descrito na seção 1.1 foram novamente testadas. Criou-se uma hipótese de que uma combinação de critérios antimicrobianos e de tolerância poderá ajudar a encontrar linhagens adequadas entre as linhagens anteriores. Portanto, cada uma das linhagens foi submetida separadamente a cada um dos testes (a) a (c) descritos acima sob “testes de seleção in vitro”.

[098] O trabalho diligente dos inventores do presente demonstrou que os critérios (a) a (c), descritos acima sob “testes de seleção in vitro”, são adequados para identificar linhagens que são adequadas para a presente invenção. Portanto, as linhagens foram testadas de acordo com os critérios (a) a (c) mencionados. Os testes in vitro revelaram quatro linhagens com propriedades particularmente benéficas. Os resultados são relacionados abaixo. TABELA

[099] Resultados dos testes in vitro: AqSyn04 AqSyn06 AqSyn09 AqSyn10

[100] Como pode ser observado na Tabela acima, após os mencionados testes in vitro, foram identificadas quatro linhagens (duas de Lactobacillus reuteri (AqSyn04, AqSyn06) e duas de Enterococcus faecium (AqSyn09, AqSyn10) (os resultados das seis linhagens restantes, ou seja, aquela que não atendeu pelo menos a um dos critérios (a) a (c), não são exibidos na Tabela acima).

[101] Uma composição dessas linhagens foi preparada a partir delas conforme descrito no Exemplo 2A.

EXEMPLO 1B

[102] Origem das linhagens: Linhagens isoladas foram isoladas e identificadas conforme segue.

[103] O isolamento de linhagens bacterianas de CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) e CECT 8350 (AqSynJ59) foi elaborado com lavagens de parede intestinal de intestino de javali selvagem.

[104] Amostras foram cultivadas aeróbica e anaerobicamente em placas agar De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) por 24 horas a 37 °C e foram isoladas colônias negativas para catalase Gram-positivas de diferentes morfologias. Todas as colônias pertenceram a linhagens bacterianas. Mais precisamente, 61 linhagens bacterianas diferentes foram isoladas. Cada uma foi amplificada por meio de PCR utilizando primers de PCR dirigidos à região espaçadora de rRNA 16S/23S conforme descrito por Berthier e Ehrlich, 1998, FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.

[105] Após amplificação e eletroforese, faixas claramente diferenciadas foram purificadas e sequenciadas. Mediante sequenciamento, as linhagens foram alocadas a diversas espécies bacterianas: 1.1 Caracterização e seleção das linhagens: 1. Lactobacillus fermentum (AqSynJ12); 2. Lactobacillus reuteri (AqSynJ17); 3. Lactobacillus mucosae (AqSynJ55); e 4. Lactobacillus plantarum (AqSynJ59).

[106] Testes in vitro seguindo os critérios (a) a (c), descritos acima como “testes in vitro de seleção” revelaram quatro linhagens com propriedades particularmente benéficas. Os resultados encontram-se relacionados abaixo.

[107] Como pode ser observado na Tabela acima, linhagens de javalis selvagens atendem aos critérios de seleção. Ademais, as linhagens acima identificadas não apresentam resistência a antibióticos.

[108] Um teste in vitro de concentração inibidora mínima (MIC) destinado a avaliar resistências a antibióticos foi realizado para as linhagens acima (AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55 e AqSynJ59). Os antibióticos avaliados foram os seguintes: Ampicilina, Vancomicina, Gentamicina, Canamicina, Estreptomicina, Eritromicina, Clindamicina, Tetraciclina e Cloranfenicol.

[109] Os valores de corte microbiológicos que foram utilizados para avaliar as resistências a antibióticos das linhagens de acordo com a presente invenção são os definidos em Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance, Painel EFSA de Aditivos e Produtos ou Substâncias Utilizadas em Ração Animal (FEEDAP), Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA), Parma, Itália, EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740.

[110] Uma composição destas linhagens foi preparada conforme descrito no Exemplo 2B (composições D e E).

EXEMPLO 2a: PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PRÓ-BIÓTICA DE ACORDO COM A INVENÇÃO E DE UMA COMPOSIÇÃO SIMBIÓTICA DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[111] Preparação de composição pró-biótica de acordo com a presente invenção e de uma composição simbiótica de acordo com a presente invenção.

[112] Cada uma das linhagens AqSyn04, AqSyn06, AqSyn09 e AqSyn10 foi cultivada em cultura de caldo MRS por meio de fermentação, colhida e liofilizada. Viabilidade do produto final foi verificada por meio de contagem de colônias. Foram preparadas composições que contêm todas as quatro destas linhagens mediante adição opcional de compostos pré-bióticos. Foram preparadas as composições a seguir:

[113] Composição A (2,5 x 108 CFUs de cada linhagem em 2 ml):

[114] Todas as linhagens foram utilizadas em forma liofilizada. A composição A pode ser vista como pró-biótica.

[115] Composição B (2,5 x 108 CFUs de cada linhagem em 2 ml):

[116] Todas as linhagens foram utilizadas em forma liofilizada. A composição B pode ser vista como simbiótica.

[117] Ademais, foi preparada uma composição C, a qual continha apenas três das quatro linhagens bacterianas (AqSyn04, AqSyn09, AqSyn10), conforme segue.

[118] Composição C (3,3 x 108 CFU de cada linhagem em 2 ml):

[119] Todas as linhagens foram utilizadas em forma liofilizada. A composição C pode ser considerada simbiótica.

[120] As composições foram preparadas misturando-se a mesma quantidade bacteriana conforme determinado por meio de contagem de colônias (valores respectivos em g indicados acima) de cada linhagem a ser incorporada à composição, os outros ingredientes indicados foram adicionados (por exemplo, composição B e composição C) e a composição respectiva obtida desta forma foi reidratada com solução salina isotônica, de forma que fosse obtida uma composição final contendo 109 CFU (total de todas as linhagens ali contidas) em uma dose de 2 ml.

EXEMPLO 2B

[121] Preparação de composição pró-biótica de acordo com a presente invenção e de composição simbiótica de acordo com a presente invenção.

[122] Cada uma das linhagens AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55 e AqSynJ59 foi cultivada em cultura de caldo MRS por meio de fermentação, colhida e liofilizada. A viabilidade do produto final foi verificada por meio de contagem de colônias. Foram preparadas composições contendo todas as quatro destas linhagens mediante adição opcional de compostos pré-bióticos. Foram preparadas as composições a seguir:

[123] Composição D (2,5 x 108 CFU de cada linhagem em 2 ml):

[124] Todas as linhagens foram utilizadas em forma liofilizada. A composição D pode ser considerada pró-biótica.

[125] Composição E (2,5 x 108 CFU de cada linhagem em 2 ml):

[126] Todas as linhagens foram utilizadas em forma liofilizada. A composição E pode ser considerada simbiótica.

EXEMPLO 3

[127] Administração a leitões sem administração de antibióticos (primeira prova de conceito): A primeira prova de conceito foi realizada em uma fazenda de suínos próxima da fazenda localizada na província de Zamora (Espanha) com 2400 porcas e problemas de diarreia crônica em leitões recém- nascidos. Sete ninhadas (78 leitões) receberam a composição A (vide Exemplo 2A) e outras sete ninhadas (81 leitões) foram mantidas como controle, conforme segue.

[128] Os leitões aos quais a composição A foi administrada receberam uma dose (vide Exemplo 2A) diariamente do nascimento até o 14° dia de vida sem tratamento com antibióticos.

[129] O tratamento do grupo de controle foi uma injeção IM de 1 ml de um produto comercial contendo 150 mg de amoxicilina e 40.000 UI de gentamicina. Os leitões diarreicos neste grupo receberam este tratamento uma vez por dia durante os dias em que eles exibiram diarreia.

[130] Os resultados desta primeira prova de conceito pareceram ser bastante notáveis, demonstrando eficácia inesperada do tratamento de acordo com a presente invenção. Em vista destes resultados, os inventores não presumiram apenas o efeito esperado em flora de patógenos, mas também um estímulo do sistema imunológico natural do leitão. Sem desejar restrições a uma teoria específica, pode ser compreendido que a composição administrada apresentou efeito direto sobre patógenos digestivos e, provavelmente, sobre a reação natural dos leitões contra essas infecções digestivas.

EXEMPLO 4

[131] Administração a leitões em diferentes regimes de dosagem (segunda prova de conceito):

[132] Este experimento foi realizado em Zamora (Espanha) na mesma fazenda do Exemplo 3. Resumidamente, os inventores pretenderam demonstrar a influência da composição A sobre o sistema imunológico inato do leitão recém-nascido. A administração em diferentes estágios da vida inicial do leitão também foi investigada. Compreende-se que, na vida inicial do leitão, a flora animal ainda está imatura.

[133] A composição A foi fornecida para sete ninhadas (65 leitões) no dia do nascimento, um segundo grupo de sete ninhadas (84 leitões) recebeu a composição A nos primeiro e segundo dias de vida (qualquer aplicação de antibiótico) e um terceiro grupo de sete ninhadas (80 leitões) foi tomado como controle, como no Exemplo 3. É importante notar que apenas o grupo controle recebeu tratamento com antibiótico, enquanto os grupos que receberam a composição A estavam não sofreram aplicação de antibiótico. Os inventores demonstraram que ganho de peso similar pode ser alcançado como no grupo controle.

[134] Os resultados demonstram que a administração de duas doses é benéfica. Em particular, aplicação dupla nos estágios iniciais logo após o nascimento do leitão pode proteger os animais contra doenças digestivas sem o uso de antibióticos e a mortalidade pode ser reduzida.

[135] Outra observação importante neste ponto é o fato de que a administração pró-biótica que foi testada é pelo menos tão eficaz quanto o tratamento com antibióticos em termos de produtividade.

EXEMPLO 5

[136] Administração a leitões e influência sobre o sistema imunológico (terceira prova de conceito):

[137] A terceira prova de conceito foi realizada em uma fazenda localizada na província de Murcia. A fazenda tinha 2400 porcas e problemas de diarreia em leitões logo após o nascimento. Estes problemas digestivos foram diagnosticados como produzidos por Escherichia coli e Clostridium difficile.

[138] Tratamento normal dos leitões nesta fazenda (leitões controle neste experimento) era uma injeção de 100 mg de tulatromicina logo após o nascimento. Em seguida, os leitões que apresentaram diarreia durante a lactação também foram tratados oralmente com espiramicina (25 mg/kg de peso vivo) e colistina (5 mg/kg de peso vivo) uma vez por dia durante os dias em que eles sofriam de diarreia.

[139] Neste experimento, a composição A foi administrada duas vezes em 29 ninhadas, ou seja, (1) logo após o nascimento e (2) no segundo dia de vida, sem tratamento de antibiótico. 34 ninhadas foram manipuladas como procedimentos normais de fazenda.

[140] Tabela do índice produtivo por desmame:

[141] Esta prova de conceito certificou a possibilidade de aprimorar a administração de distúrbios digestivos iniciais em leitões recém- nascidos, particularmente sem o uso de antibióticos.

EXEMPLO 6

[142] Administração a leitões e influência sobre o sistema imunológico (quarta prova de conceito): A próxima prova de conceito destinou-se a testar o produto como desempenho regular na rotina da fazenda. Este experimento ocorreu na região de Huesca em uma fazenda de 5500 porcas. Devido a fatores logísticos, não foi possível manter um grupo controle. A composição B foi fornecida a todos os leitões nascidos em uma certa semana (semana 13 do ano de 2012) e compara os indicadores produtivos com as semanas abaixo e após o experimento. Nessa fazenda, o tratamento normal dos leitões com diarreia foi a administração durante três dias de 1 ml por dia de um produto comercial contendo 100 mg de ampicilina e 250.000 UI de metanosulfonato sódio colistina.

[143] Resultados de indicadores produtivos; a composição B foi administrada na 13a semana:

[144] Casos de diarreia (A) foram observados em 80% de porcas primíparas (como normalmente, sem tratamento com a composição B) e algumas das porcas multíparas. Os leitões estavam com 3 a 5 dias de idade. Todos os casos de diarreia desapareceram sem tratamento com antibióticos.

[145] Os resultados do inventor confirmam o efeito vantajoso do uso dos produtos e composições de acordo com a presente invenção. O percentual de mortalidade foi claramente menor que o de outras semanas com apenas administração de antibióticos de rotina.

EXEMPLO 7

[146] Experimentos in vivo com a composição E foram realizados em uma fazenda em Zaragoza (Espanha) com 1200 mães hiperprolíficas (média de 14 leitões nascidos vivos por ninhada) e 56 nascimentos por semana (784 leitões por semana), com o propósito de fazer os leitões crescerem até 20 kg para fornecimento a outras fazendas, com problemas periódicos de diarreia na fase de lactação em leitões com menos de uma semana de idade. O fazendeiro cuidou dos leitões de forma padrão e administrou o produto (composição E acima) no nascimento e no segundo dia de idade a todas as ninhadas. Os resultados do tratamento com a composição E foram similares àqueles obtidos com as composições A, B e C.

Claims (11)

1. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, que compreende pelo menos três linhagens bacterianas selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8163 (AqSyn04); (b) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8165 (AqSyn06); (c) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8164 (AqSyn09); (d) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8166 (AqSyn10); caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de diarreia causada por infecção bacteriana em mamíferos recém-nascidos.

2. USO, de acordo a reivindicação 1, caracterizado por cada linhagem ser capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante três horas de incubação sob pH 3,5.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por cada linhagem ser capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante quatro horas de incubação na presença de extrato de bílis a 0,45%.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por cada linhagem possuir todas as atividades antimicrobianas a seguir, conforme evidenciado por zonas de inibição determinadas por meio do teste de mancha sobre o gramado: (i) zona de inibição de 10 mm ou mais para Salmonella; (ii) zona de inibição de 10 mm ou mais para Listeria monocytogenes; (iii) zona de inibição de 10 mm ou mais para Staphylococcus aureus; (iv) zona de inibição de 10 mm ou mais para Escherichia coli.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por pelo menos uma linhagem e, preferencialmente, todas as linhagens serem livres de resistência a antibióticos.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente pelo menos um produto pré- biótico, em que o pelo menos um produto pré-biótico é preferencialmente selecionado a partir dos compostos e composições a seguir: betaglucanos, manano-oligossacarídeos, inulina, oligofrutose, galacto-oligossacarídeos (GOS), lactulose, lactossacarose, galactotriose, fructo-oligossacarídeo (FOS), celobiose, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarose, vitamina E ou uma de suas variantes (em que as variantes são selecionadas a partir de alfa, beta, gama, delta tocoferóis, tocotrienóis e tocomonoenóis), em que são preferidos manano-oligossacarídeos e/ou inulina.

7. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela composição destinar-se a administração oral.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo medicamento destinar-se a tratamento ou prevenção de infecções bacterianas selecionadas de diarreia, devido a infecções bacterianas (incluindo colibacilose), diarreia de recém-nascidos por Clostridium difficile, Clostridium perfringens tipo A e C.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por cada linhagem atender pelo menos às condições a seguir: (a) possuir todas as atividades antimicrobianas a seguir, conforme evidenciado por zonas de inibição determinadas por meio do teste de mancha sobre o gramado: (i) zona de inibição de 10 mm ou mais para Salmonella; (ii) zona de inibição de 10 mm ou mais para Listeria monocytogenes; (iii) zona de inibição de 10 mm ou mais para Staphylococcus aureus; (iv) zona de inibição de 10 mm ou mais para Escherichia coli; (b) ser capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante três horas de incubação sob pH 3,5; e (c) ser capaz de manter essencialmente a mesma viabilidade durante quatro horas de incubação na presença de extrato de bílis a 0,45%.

10. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender pelo menos três, de maior preferência pelo menos quatro linhagens bacterianas, selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8163 (AqSyn04); (b) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8165 (AqSyn06); (c) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8164 (AqSyn09); (d) linhagem depositada na Coleção Espanhola de Cultivos de Tipos com número de depósito CECT 8166 (AqSyn10).

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos um produto pré- biótico, em que o pelo menos um produto pré-biótico é preferencialmente selecionado a partir dos compostos e composições a seguir: betaglucanos, manano-oligossacarídeos, inulina, oligofrutose, galacto-oligossacarídeos (GOS), lactulose, lactossacarose, galactotriose, fructo-oligossacarídeo (FOS), celobiose, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarose, vitamina E ou uma de suas variantes (em que as variantes são selecionadas a partir de alfa, beta, gama, delta tocoferóis, tocotrienóis e tocomonoenóis), em que são preferidos manano-oligossacarídeos e/ou inulina.

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