ES2940463T3 - Composiciones probióticas y prebióticas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a productos y composiciones que pueden ser beneficiosos en la cría de animales. Dichos productos y composiciones comprenden microorganismos, tales como bacterias, y bacterias probióticas en particular. Por tanto, en el presente documento se proporcionan cepas microbianas, así como criterios de selección que permitirán al lector experto encontrar otras cepas útiles en la presente invención. Las cepas, así como las composiciones que las comprenden, pueden administrarse a animales, en particular animales de granja tales como cerdos. La administración puede ocurrir en los primeros días de vida. Mediante la administración de los productos o composiciones de la invención se puede promover el crecimiento animal y se puede aumentar el peso del animal. Las infecciones bacterianas también pueden prevenirse o tratarse mediante dichos compuestos o composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones probióticas y prebióticas

Antecedentes de la técnica

Los animales recién nacidos, y en particular los de explotación (intensiva), son propensos a las infecciones bacterianas y otras infecciones. Estas infecciones pueden conducir a diarrea asociada con pérdida de peso y, en casos graves, incluso la muerte del recién nacido. Por ejemplo, hace varios años se han descrito casos de diarrea en lechones recién nacidos en explotaciones porcinas de diferentes ubicaciones geográficas en España. Se cree que dicha diarrea es un síntoma en estos animales, mientras que el factor causante de dicho síntoma es a veces difícil de localizar. En muchos casos de diarrea en cerdos recién nacidos, por ejemplo, es posible aislar cepas bacterianas posiblemente desfavorables/indeseables, tales como Escherichia coli, sola o en combinación con Clostridium perfringens o Clostridium difficile, pero la diarrea se detecta habitualmente justo después del nacimiento y los procedimientos rutinarios de tratamiento y profilaxis no suelen ser eficaces.

Sin querer restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que la disbiosis (también denominada disbacteriosis) puede ser un factor causante. La disbiosis se refiere a una afección con desequilibrios microbianos sobre o dentro del cuerpo. En los animales de cría, los cerdos en particular, la disbiosis puede estar provocada por el uso indiscriminado de antibióticos durante el mantenimiento de las cerdas, produciendo alteraciones en la flora intestinal de los lechones recién nacidos.

En vista de estas desventajas del uso de antibióticos, se recomienda reducir el uso de antibióticos en la crianza de animales. Por otra parte, se necesitarían entonces métodos alternativos de tratamiento de los animales recién nacidos para sustituir a los antibióticos de uso común. Abe et al., vol. 78, págs. 2838-2846, 1995, American Dairy Association, sugieren la administración de probióticos a terneros y lechones recién nacidos para reducir la incidencia de diarrea.

Dado que la UE recomienda desde 2005 reducir el uso de antibióticos como promotores del crecimiento en la cría de cerdos (modificado por el Reglamento (CE) n.° 378/2005 de 4 de marzo de 2005), los criadores de animales anhelan alternativas que puedan mejorar el estado de salud general de los animales (de granja), especialmente en los primeros días de vida. Los presentes inventores aportan una solución a este problema, y dicha solución se describe a continuación. La presente invención resuelve así varios problemas provocados por los métodos del estado de la técnica, y los efectos ventajosos se detallarán a continuación.

Breve descripción de la invención

En un primer aspecto, la divulgación se refiere a una composición que comprende al menos uno, tal como uno, preferiblemente al menos dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, más preferiblemente al menos cuatro, tal como cuatro, alternativamente al menos cinco, tal como cinco, alternativamente al menos seis, tal como seis, alternativamente al menos siete, tal como siete, alternativamente al menos ocho, tal como ocho, microorganismo(s), preferiblemente una bacteria, y más preferiblemente una bacteria del ácido láctico. La bacteria del ácido láctico se selecciona idealmente de las cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59), que están todas depositadas en la CECT. En una realización, la composición que comprende una o más cepas, en la que cada cepa cumple al menos la siguiente condición a., y preferiblemente ambas condiciones a. y b., y lo más preferiblemente todas las condiciones a., b. y c.:

a. muestra una actividad antimicrobiana evidenciada por al menos una de las zonas de inhibición siguientes: (i) 10 mm o más, por ejemplo 14 mm o más, para Salmonella, (ii) 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más, para Listeria monocytogenes, (iii) 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más, para Staphyloccocus aureus, (iv) 10 mm o más, por ejemplo 18 mm o más, para Escherichia coli;

b. es capaz de conservar esencialmente la misma viabilidad durante 3 horas de incubación a pH=3,5, o alternativamente a pH=2,5;

c. es capaz de conservar esencialmente la misma viabilidad durante 4 horas de incubación en presencia de extracto de bilis al 0,45%, preferiblemente a pH=8.

La composición de la invención puede ser para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana, y/o para aumentar el peso de un mamífero recién nacido (preferiblemente un lechón). En este método, la composición se administra al mamífero.

La divulgación también proporciona un microorganismo, preferiblemente una bacteria, y más preferiblemente una bacteria del ácido láctico. La bacteria del ácido láctico se selecciona idealmente de las cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59), que están todas depositadas en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) por AQUILON CYL S.L. Los números AqSyn entre paréntesis, que pueden usarse como sinónimos para cada una de las cepas, fueron asignados a las cepas por los presentes inventores. CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10) se depositaron el 20 de junio de 2012. CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59) se depositaron el 16 de mayo de 2013.

En una realización particular, la composición comprende al menos una, tal como una, preferiblemente dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, de las tres cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10). En una realización alternativa, la composición comprende las cuatro de CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); y CECT 8166 (AqSyn10).

En una realización alternativa, la composición comprende una o más de CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59), tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho.

En una realización alternativa, la composición comprende al menos una, tal como una, preferiblemente al menos dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, más preferiblemente al menos cuatro, tal como cuatro, de CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17) y CECT 8349 (AqSynJ55). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CeCT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende lastres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización preferida, la composición comprende las cuatro de CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59).

En una realización de la presente invención, al menos una de las cepas comprendidas en la composición, tal como una, y/o dos, y/o tres, y/o cuatro, y/o cinco, y/o seis, y/o siete, y/u ocho, y preferiblemente la totalidad de las cepas comprendidas en la composición, están libres de resistencia a los antibióticos, concretamente no son capaces de sobrevivir después de la exposición al tratamiento con antibióticos convencional apropiado.

En cualquier caso, “comprende” puede entenderse opcionalmente en el sentido de que están presentes cepas bacterianas adicionales o en el sentido de que no están presentes cepas bacterianas adicionales. Incluso si no están presentes cepas bacterianas adicionales, “comprende” puede significar opcionalmente que están presentes otros componentes adicionales, es decir, cualquier componente distinto de bacterias.

El otro componente (u otros componentes) no está limitado en modo alguno. En un aspecto preferido, al menos un compuesto prebiótico está comprendido en la composición de la invención, es decir, como otro componente.

En cuanto a las composiciones de diferentes cepas, es posible cualquier razón de mezclado. La razón de mezclado se indica a continuación mediante unidades formadoras de colonias (UFC), las UFC se determinan de manera adecuada antes de mezclar las cepas individuales. En una realización, las razones de las cepas pueden ser iguales o no, tales como 1:(0,1-10):(0,1-10) para una composición de tres cepas, 1:1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) para una composición de cuatro cepas, y así sucesivamente. En otra realización, las razones de las cepas son aproximada o sustancialmente iguales, tales como 1:1:1 para una composición de tres cepas y 1:1:1:1 para una composición de cuatro cepas, y así sucesivamente. La composición puede prepararse mezclando la cantidad bacteriana respectiva (tal como se determina mediante recuento de colonias) de cada cepa que va a incorporarse a la composición. Las cepas que van a incorporarse pueden proporcionarse como reservas de cepas individuales, cada una de ellas, por ejemplo, en forma de un liofilizado. En el caso de que las diferentes reservas tengan concentraciones diferentes (UFC/g), se usan cantidades apropiadas (g) de cada una, de modo que la composición deseada tiene las UFC deseadas de cada una de las cepas. A continuación se muestran ejemplos de las mismas.

Los prebióticos se conocen bien en la técnica y, cuando se usan en la presente invención, no hay ninguna limitación particular del prebiótico como tal. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el al menos un producto prebiótico en la composición se selecciona de los compuestos y las composiciones siguientes: beta-glucanos, mananooligosacáridos, inulina, oligofructosa, galacto-oligosacáridos (GOS), lactulosa, lactosacarosa, galactotriosa, fructooligosacárido (FOS), celobiosa, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarosa, vitamina E o una variante de la misma (en la que las variantes se seleccionan de alfa, beta, gamma, delta tocoferoles, tocotrienoles y tocomonoenoles). Opcionalmente, pueden preferirse manano-oligosacáridos y/o inulina.

La presente divulgación también proporciona el uso de la composición descrita anteriormente en un método para tratar un humano o animal. Puede preferirse el tratamiento de un animal, un mamífero y/o un animal doméstico en particular. Preferiblemente, el animal es un animal no humano, y más preferiblemente es del suborden Suina (el suborden Suina (también conocido como Suiformes) es un linaje de mamíferos que incluye los cerdos y pecaríes de las familias Suidae y Tayassuidae). Pueden preferirse particularmente el ganado porcino o los cerdos, ya sean salvajes o domésticos. En otra realización, la composición se administra a un humano.

La divulgación también proporciona una composición que comprende microorganismos, preferiblemente bacterias, y más preferiblemente bacterias del ácido láctico, para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana, y/o para aumentar el peso de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Alternativamente, la composición es para su uso en un método para fomentar el crecimiento de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón.

Dicha composición para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana y/o para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento puede comprender al menos una de las cepas bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En algunas realizaciones, dicha composición para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana y/o para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento es la composición particular anteriormente descrita (en cualquier realización descrita).

La composición para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana y/o para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento puede administrarse en el plazo de los primeros 14 días después del nacimiento (más preferiblemente dentro de los primeros 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ó 2 días después del nacimiento y lo más preferiblemente en el plazo de los primeros 2 días después del nacimiento o en el plazo del 1 día (24 horas) después del nacimiento.

Para ello, la composición puede administrarse por vía oral, por ejemplo. La composición puede estar en cualquier forma, tal como en forma liofilizada, líquida o nebulizada. Si, por ejemplo, se usan bacterias liofilizadas para preparar la composición, entonces dicha composición preliminar de bacterias liofilizadas puede rehidratarse, por ejemplo, con solución salina isotónica estéril, de modo que puede obtenerse una composición final con la concentración (UFC/ml) total deseada.

Para facilitar su uso, la composición puede estar en forma dosificada. Por ejemplo, cada dosis comprende 107 o más, 108 o más, 109 o más, 1010 o más, 1011 o más, unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias (pueden preferirse 109 o más). Una dosis puede tener un volumen en el intervalo de 0,1 a 100 ml, preferiblemente de 0,2 a 50 ml, más preferiblemente de 0,5 a 20 ml, más preferiblemente de 1,0 a 10 ml, más preferiblemente de 1,5 a 5 ml, e incluso más preferiblemente de (sustancialmente) 2 ml. Puede preferirse particularmente una dosis de 2 ml con 109 o más UFC.

Puede administrarse cualquier número de dosis y el experto puede elegir la duración del tratamiento según las necesidades en la granja respectiva. En una realización particular, el número total de dosis administradas a un animal es de 10 o menos, tal como cualquier número seleccionado de los siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o cualquier intervalo que combine uno cualquiera de estos números (excepto 10) con uno cualquiera de estos números, siempre que el segundo número sea mayor (por ejemplo, de 1 a 3 dosis por ejemplo). Puede preferirse particularmente un total de dos dosis por animal.

En una realización preferida, una primera dosis se administra en las primeras 24 horas después del nacimiento y una segunda dosis se administra en las 24 horas posteriores. Opcionalmente, estas son las únicas dos dosis. En otra opción, se administran doses adicionales a continuación.

La composición de la invención es particularmente adecuada para tratar o prevenir una afección en un mamífero, tal como una infección bacteriana. En algunas realizaciones, la afección puede seleccionarse de diarrea debido a infecciones bacterianas (incluyendo colibacilosis), diarrea del recién nacido por Clostridium difficile, tipo A y C por Clostridium perfringens. También es posible administrar la composición a animales que padecen diarrea, incluso si no se ha demostrado (aún) que una infección (bacteriana) sea el factor causante de dicha diarrea.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: diferentes patrones de PCR habitualmente apuntan a especies bacterianas distintas tal como se describe en el ejemplo 1 (carriles 1-5, 7: Lactobacillus reuteri, carriles 8-11: Enterococcus faecium, carril 6: marcador de peso molecular).

Figura 2: zonas de inhibición, ejemplo ilustrativo.

Divulgación detallada de la invención

La siguiente descripción detallada divulga variantes específicas y/o preferidas de las características individuales de la invención. La presente invención también contempla como realizaciones particularmente preferidas aquellas realizaciones que se generan combinando dos o más de las variantes específicas y/o preferidas descritas para dos o más de las características de la presente invención.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, el término “que comprende” se usa en el contexto del presente documento para indicar que pueden estar presentes opcionalmente elementos adicionales además de los elementos de la lista introducida por “que comprende”. Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente invención que el término “que comprende” abarque la posibilidad de que no estén presentes elementos adicionales, es decir, a los efectos de esta realización, “que comprende” debe entenderse en el sentido de “que consiste en”.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, todas las indicaciones de cantidades relativas en la presente solicitud se hacen sobre una base peso/peso. Se pretende que las indicaciones de cantidades relativas de un componente caracterizado por un término genérico se refieran a la cantidad total de todas las variantes o elementos específicos cubiertos por dicho término genérico. Si se especifica que un determinado componente definido por un término genérico está presente en una determinada cantidad relativa, y si este componente se caracteriza además por ser una variante o elemento específico cubierto por el término genérico, se entiende que no están presentes adicionalmente otras variantes o elementos cubiertos por el término genérico de manera que la cantidad relativa total de componentes cubiertos por el término genérico supere la cantidad relativa especificada; más preferiblemente no están presentes en absoluto otras variantes o elementos cubiertos por el término genérico.

La presente invención integra el concepto de probióticos y prebióticos, proporcionando así simbióticos. Los inventores abren una nueva ventana terapéutica de bacterias y composiciones que tienen un efecto inmunomodulador. Los microorganismos o las composiciones pueden administrarse en una etapa temprana de la vida de un animal, tal como un lechón. Por tanto, la invención se refiere a productos y a composiciones que pueden ser beneficiosos en la crianza de animales. La observación realmente importante, tal como se evidencia mediante los ejemplos, es que el tratamiento probiótico es al menos igual de eficaz, y muy probablemente mejor (en comparación con el tratamiento con antibióticos convencional), en cuanto a productividad con respecto al tratamiento con antibióticos. La contribución de los inventores tiene un enorme impacto económico, tanto por el coste global del tratamiento como por la presión legal y el impacto medioambiental.

Los microorganismos, preferiblemente bacterias, que pueden usarse según la invención, son microorganismos con efectos beneficiosos. Son preferiblemente bacterias del ácido láctico. Según la presente invención pueden usarse incluso especies de microorganismos no bacterianas, siempre que cumplan los criterios de selección a. a c. a continuación. Por ejemplo, se sabe que algunas levaduras también pueden tener propiedades probióticas.

Aunque los parámetros funcionales descritos en el presente documento son los criterios de selección más importantes, en lo que respecta a las especies de los microorganismos, se prefieren las bacterias del ácido láctico. Las bacterias del ácido láctico (BAL) comprenden un clado de bacterias Gram positivas, tolerantes a los ácidos, que están asociadas por sus características metabólicas y fisiológicas comunes. Estas bacterias, que se encuentran de manera natural en las plantas en descomposición y en los productos lácteos, así como en las heces de los animales, producen ácido láctico como principal producto metabólico final de la fermentación de los hidratos de carbono. Las bacterias del ácido láctico son generalmente reconocidas como seguras (estatus GRAS), debido a su omnipresencia en los alimentos y a su contribución a la microflora saludable de las superficies mucosas de los mamíferos. Las bacterias del ácido láctico se seleccionan preferiblemente entre los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella. Pueden preferirse Lactobacillus y/o Enterococcus. Se prefiere Lactobacillus. En el presente documento, las bacterias preferidas son preferiblemente Gram positivas y catalasa negativas. Puede comprobarse si una bacteria es Gram positiva según las tecnologías convencionales conocidas en la técnica. La tinción de Gram consiste en la tinción consecutiva con diferentes “colorantes” (tinciones) y el lavado de la muestra para comprobar si es positiva o negativa. Si una bacteria es catalasa negativa se comprueba tal como sigue: la prueba de la catalasa consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una muestra de cultivo o a un tubo de agar inclinado. Si las bacterias en cuestión producen catalasa, convertirán el peróxido de hidrógeno y se desprenderá gas oxígeno. La evolución del gas hace que se formen burbujas y estas burbujas son indicativas de una prueba positiva (bacteria catalasa positiva).

En el presente documento, las bacterias del ácido láctico preferidas son preferiblemente capaces de crecer en medio MRS, y más preferiblemente en agar MRS acidificado tal como se describe a continuación. El medio MRS se creó para favorecer el crecimiento de bacterias del ácido láctico, especialmente Lactobacillus sp. Se cree que desfavorece el crecimiento de la gran mayoría de bacterias Gram negativas. Sin embargo, otras bacterias distintas de las bacterias del ácido láctico pueden crecer eventualmente en MRS, por lo que es recomendable o incluso necesario comprobar que las colonias pertenecen a bacterias Gram positivas y son catalasa negativas.

En el presente documento, las bacterias del ácido láctico preferidas pueden ser posiblemente bacterias probióticas. La definición más comúnmente aceptada de “probiótico” fue dada en 1998 por Füller, que lo describió como “un suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal”. En general, los probióticos son microorganismos vivos. Se cree que probióticos diferentes tienen acciones diferentes en el intestino, y por lo tanto diferentes probióticos pueden actuar juntos para proporcionar un efecto beneficioso. Otras fuentes definen los probióticos como aquellos microorganismos para los que ya se ha demostrado un beneficio para la salud humana o animal. Los criterios de selección de los probióticos se publican en: “Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y Organización Mundial de la Salud, 2001, Córdoba, Argentina. Las ventajas del uso de bacterias vivas han sido ampliamente descritas.

En los últimos años se ha introducido el concepto de “prebióticos”; los prebióticos son componentes alimentarios no digeribles que aumentan el crecimiento de microorganismos específicos en el tubo gastrointestinal. Los “simbióticos” son composiciones que comprenden al menos un probiótico y al menos un prebiótico. Se entiende que tales composiciones fomentan el crecimiento de bacterias beneficiosas (por ejemplo, los probióticos). Como ejemplo ilustrativo, los productos lácteos fermentados se consideran a menudo como simbióticos porque contienen bacterias vivas y la fuente alimentaria que necesitan. Aunque los beneficios asociados a los prebióticos y probióticos son favorables, los investigadores son cautos a la hora de sacar conclusiones generales porque los beneficios varían, dependiendo del tipo y cantidad de prebiótico y probiótico consumida, así como de las combinaciones específicas de probióticos específicos con prebióticos específicos. Por tanto, los potentes simbióticos se basan en una combinación de cepas específicas de bacterias probióticas con prebióticos cuidadosamente seleccionados. Pueden suponer un importante beneficio para la salud del mamífero.

Se ha sugerido el uso de probióticos, prebióticos y simbióticos específicos en humanos, y los criterios de selección de probióticos se divulgan, por ejemplo, en el “Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y Organización Mundial de la Salud, 2001, Córdoba, Argentina.

La presente invención usa microorganismos, bacterias en particular, que tienen un potencial de mostrar un beneficio para la salud en animales, animales de granja en particular. Preferiblemente, el animal es un animal doméstico, domesticado o un animal que no es doméstico ni domesticado (es decir, salvaje) pero que pertenece a la misma especie o género que un animal doméstico. Un cerdo salvaje, por ejemplo, estaría incluido en esta definición, ya que pertenece a la misma especie que un cerdo doméstico. Algunos ejemplos de animales domésticos que pueden tratarse incluyen, sin limitación, perros, gatos y otros animales de compañía, caballos, ganado vacuno, pollos y otras aves de corral, cerdos, ovejas y cabras. Preferiblemente, el animal es un animal de granja, y los animales de granja incluyen, sin limitación, caballos, ganado vacuno, pollos y otras aves de corral, cerdos, ovejas y cabras. Más preferiblemente, el animal pertenece al suborden Suina. El suborden Suina (también conocido como Suiformes) es un linaje de mamíferos que incluye los cerdos y los pecaríes de las familias Suidae y Tayassuidae. Puede preferirse particularmente el ganado porcino o los cerdos, ya sean salvajes o domésticos.

Las cepas que son adecuadas para la presente invención pueden identificarse tal como sigue.

Primera etapa para llegar a las cepas de la invención: aislamiento de cepas individuales

En una primera etapa, se aísla una muestra que contiene microorganismos (preferiblemente bacterias). Puede ser adecuada cualquier fuente de microorganismos, que en sentido más amplio puede ser cualquier muestra no estéril de la naturaleza. La fuente puede proceder de animales (domésticos), tales como de animales jóvenes en los primeros 30 días de vida, o de sus madres. Alternativamente, la fuente puede ser de animales salvajes (por ejemplo, jabalíes), tales como muestras recogidas de jabalíes capturados. Las fuentes adecuadas incluyen el calostro de animales madre (por ejemplo, cerdas), muestras de meconio de animales recién nacidos (por ejemplo, lechones), lavados de la pared intestinal de animales domésticos o salvajes o bacterias del ácido láctico intestinales naturales. Los microorganismos (por ejemplo, bacterias) contenidos en las muestras pueden hacerse crecer en medios de crecimiento bien conocidos en la técnica por ser adecuados para el crecimiento de microorganismos intestinales, por ejemplo, el medio MRS. Los microorganismos pueden sembrarse en estrías, lo que permitirá aislar colonias individuales. Las colonias individuales pueden recogerse y las cepas respectivas pueden seguir propagándose en un medio de crecimiento adecuado (por ejemplo, el mismo que se usó inicialmente).

Las cepas de estas colonias individuales se analizan opcionalmente mediante tinción de Gram por métodos conocidos en la técnica (y se seleccionan si son Gram positivas) y/o se analizan para detectar la presencia de actividad catalasa tal como se describió anteriormente (y se seleccionan si son catalasa negativas).

Segunda etapa para llegar a las cepas de la invención: pruebas in vitro

Con el fin de seleccionarse como útil para la presente invención, una cepa de microorganismos, preferiblemente procedente de la primera etapa descrita anteriormente, debe cumplir al menos uno de los siguientes criterios que se enumeran por primera vez en este caso y después se detallan a continuación:

a. Actividad contra bacterias no deseadas;

b. Tolerancia a los ácidos;

c. Tolerancia a las sales biliares;

Los puntos a. a c. representan la prioridad; es decir, lo más deseado es que se cumpla el criterio a., lo segundo más deseado es que se cumplan los criterios a. y b., y lo más preferido es que se cumplan todos los criterios a. a c. Los criterios de selección se detallan a continuación.

(i) Actividad contra bacterias no deseadas

Se realiza un examen in vitro frente a bacterias no deseadas. “No deseadas” son bacterias seleccionadas de las siguientes una o más: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus y Escherichia coli. Preferiblemente, la especie de Salmonella es Salmonella enterica, más preferiblemente Salmonella enterica serotipo Typhimurium.

La actividad contra las bacterias no deseadas se someterse a prueba mediante la prueba de mancha en el césped (spot-on-lawn), que se describe a continuación. Se aplican cultivos líquidos de una noche (MRS) de cada cepa que va a someterse a prueba como manchas individuales de 10 |il sobre agar MRS y se incuban a 30°C durante 24 h en condiciones anaerobias. Tras la incubación, las placas se cubren con 7 ml de agar BHI semisólido (0,7%) inoculado con una de las bacterias no deseadas (1%; 1 ml de cultivo de una noche en 100 ml de medio). Se cubren placas separadas que contengan una cepa particular que va a someterse a prueba con una de las especies de bacterias no deseadas, respectivamente. Cada una de tales pruebas se realiza por triplicado. Después de incubación durante 24 horas a o cerca de la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria no deseada (temperatura óptima de crecimiento conocida en la técnica para cada una de las bacterias no deseadas mencionadas en el presente documento), se examinan las muestras para comprobar si hay indicios de inhibición. Para ello, se comprueba en primer lugar si existe una zona de inhibición. En caso afirmativo, se mide ópticamente el diámetro de la zona de inhibición. En los casos en que la zona de inhibición no parece exactamente circular, la medición de la zona de inhibición se realiza con la regla de medir el diámetro más corto de la zona de inhibición. Por último, se determina la media aritmética del experimento por triplicado y se comprueba si se cumple el siguiente criterio.

CRITERIO: Para que una cepa sea seleccionada como positiva, debe cumplirse al menos una de las siguientes condiciones [(i), (ii), (iii), (iv)]:

(i) Para Salmonella, zona de inhibición de 10 mm o más, por ejemplo, 14 mm o más.

(ii) Para Listeria monocytogenes, zona de inhibición de 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más.

(iii) Para Staphyloccocus aureus, zona de inhibición de 9 mm o más, preferiblemente 10 mm o más.

(iv) Para Escherichia coli, zona de inhibición de 10 mm o más, por ejemplo, 18 mm o más.

9 mm o más incluye 10 mm o más, 11 mm o más, 12 mm o más, 13 mm o más, 14 mm o más, 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más.

10 mm o más incluye 11 mm o más, 12 mm o más, 13 mm o más, 14 mm o más, 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más 26 mm o más, 27 mm o más, 28 mm o más, 29 mm o más, 30 mm o más, 35 mm o más.

14 mm o más incluye 15 mm o más, 16 mm o más, 17 mm o más, 18 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 19 mm o más, 20 mm o más, 25 mm o más, 30 mm o más.

18 mm o más incluye 19 o más, 20 mm o más, 21 mm o más, 22 mm o más, 23 mm o más, 24 mm o más, 25 mm o más, 26 mm o más, 27 mm o más, 28 mm o más, 29 mm o más, 30 mm o más, 35 mm o más.

Una composición que comprenda varias cepas también puede someterse a prueba en relación con los criterios anteriores, y tal composición, con el fin de seleccionarse como adecuada para cualquiera de los usos médicos descritos en el presente documento, debe cumplir todos los criterios [(i), (ii), (iii), (iv)]. También cabe esperar que una composición de este tipo pueda prepararse adecuadamente combinando cepas individuales de microorganismos de las que cada una cumpla al menos uno de los criterios (i), (ii), (iii), (iv); pero debe comprobarse experimentalmente si éste es realmente el caso.

Alternativamente, puede usarse el ensayo de difusión en pocillos de agar para determinar las zonas de inhibición. Este procedimiento elimina cualquier rastro de ácido láctico que pudiera producirse en el caldo MRS bajo en glucosa neutralizando los sobrenadantes libres de células. Los cultivos en fase estacionaria de las especies que van a someterse a prueba, hechos crecer en condiciones anaerobias, se recogen por centrifugación (5000 g/20 min/4°C), y el pH del sobrenadante libre de células se ajusta a 6,5 con NaOH 1 M. Los sobrenadantes se esterilizan por filtración (0,20 mm; Millipore Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). El sobrenadante libre de células (30 |il) se añade a pocillos de 7 mm de diámetro cortados en placas de agar inoculadas con [aproximadamente] 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml de la bacteria no deseada enumerada en (i), (ii), (iii), (iv). A continuación, las placas de agar se incuban a 30°C durante 24 horas. Se mide el diámetro de las zonas de inhibición alrededor de los pocillos, y los criterios de selección son los indicados en los incisos (i), (ii), (iii) y (iv) anteriores, de los cuales debe cumplirse al menos uno para que una cepa se seleccione como positiva.

A título informativo: los ensayos anteriores se basan en lo descrito por Kawai et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911; Dortu et al. 2008. Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586; Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125­ 1132).

(ii) Tolerancia a los ácidos

Puede considerarse que el ácido imita al jugo gástrico, y la tolerancia al mismo se somete a prueba tal como sigue. Se suspenden 100 |il de una suspensión inicial en MRS de 6-8 * 108 UFC/ml de cada cepa en MRS acidificado (pH=3,5, o, alternativamente pH=2,5) acidificado tras la adición de la cantidad adecuada de HCl 12 N) y se incuban a 37°C con agitación a 110 rpm. Las muestras se analizan por recuento de colonias (UFC/ml) a las horas 0, 3 y 6. CRITERIO: la cepa debe poder retener esencialmente la misma viabilidad (al menos el 50%, o al menos el 55%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 95% de UFC después de la prueba en comparación con antes, más preferiblemente al menos el 50% de UFC después de la prueba en comparación con antes) durante 3 horas de incubación en dicho medio. Como referencia: un protocolo similar se describe brevemente en Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260).

(iii) Tolerancia a las sales biliares

Simulación de las condiciones naturales del intestino delgado de los mamíferos.

Se suspenden 100 |il de una suspensión inicial en MRS de 6-8 * 108 UFC/ml de una cepa bacteriana en una disolución simulada de intestino delgado (por ejemplo, MRS a pH=8 (pH ajustado al añadir NaOH) y el 0,45% de extracto biliar (extracto biliar, porcino. B8631-100G. SIGMA-ALDRICH)) y se incuban a 37°C con agitación a 110 rpm. Las muestras se analizaron por recuento de colonias (UFC/ml) a las horas 1, 2 y 4.

CRITERIO: ninguna pérdida de viabilidad (o esencialmente ninguna pérdida de viabilidad, es decir, preferiblemente el 50% o más de UFC, tal como el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 75%, o el 80%, o el 95% o más de UFC) después de la exposición a jugos simulados de intestino delgado (el 0,45% de sales biliares, opcionalmente a pH=8) durante 4 horas. Un protocolo similar se describe brevemente en Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253- 260.

Opcionalmente, las cepas que se hayan identificado como positivas según los criterios a. a c. anteriores también pueden someterse a pruebas para determinar su adherencia a superficies epiteliales y su persistencia en el tubo gastrointestinal de los animales (por ejemplo, cerdos). Se cree que las cepas con buenas propiedades de adherencia obtendrán mejores resultados.

Opcionalmente, las cepas que se han identificado como positivas según los criterios a. a c. anteriores se someten a pruebas adicionalmente para determinar su perfil de resistencia a los antibióticos, por ejemplo, mediante la prueba de concentración mínima de antibióticos (pruebas de microplaca VetMIC) y/o se realiza una prueba de resistencia genotípica mediante la realización de una PCR para diferentes genes de resistencia (Egervarn et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97: 189-200). Se cree que las bacterias sin resistencia a los antibióticos (ausencia o inactividad/pérdida de función de los genes de resistencia) son las más adecuadas para su aplicación en animales de granja.

La bacteria del ácido láctico de la presente divulgación puede seleccionarse de las cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12), CECT 8348 (AqSynJ17), CECT 8349 (AqSynJ55) y C^ecT 8350 (AqSynJ59). Se cree que todas estas cepas tienen propiedades probióticas, y por tanto pueden denominarse probióticos en el presente documento. Los presentes inventores aislaron las cepas respectivas según los criterios de selección anteriores. CECT se refiere a Colección Española de Cultivos Tipo, mientras que los números AqSyn entre paréntesis, que pueden usarse como sinónimos para cada una de las cepas, fueron asignados a las cepas por los presentes inventores. Cada bacteria se sometió a prueba y se halló que cumplía al menos uno de los criterios a. a c. anteriores. En la búsqueda de cepas adicionales con propiedades beneficiosas según esta invención, puede ser suficiente que cualquiera de tales cepas, con el fin de seleccionarse como adecuada para la presente invención, cumpla al menos uno de los criterios a. a c. anteriores. La invención también proporciona una composición tal como se reivindica que comprende al menos una, tal como una, preferiblemente al menos dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, más preferiblemente al menos cuatro, tal como cuatro, alternativamente al menos cinco, tal como cinco, alternativamente al menos seis, tal como seis, alternativamente al menos siete, tal como siete, alternativamente al menos ocho, tal como ocho, de estas cepas. Se cree que cepas diferentes tienen acciones diferentes en el intestino, y por lo tanto diferentes cepas pueden actuar juntas para proporcionar un efecto beneficioso.

En una realización particular, la composición comprende al menos una, tal como una, preferiblemente dos, tal como dos, más preferiblemente las tres cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10). En una realización alternativa, la composición comprende las cepas siguientes: CEC^t 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10).

En una realización alternativa, la composición comprende una o más de CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59), tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho.

En una realización alternativa, la composición comprende al menos una, tal como una, preferiblemente al menos dos, tal como dos, más preferiblemente al menos tres, tal como tres, más preferiblemente al menos cuatro, tal como cuatro, de CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17) y CECT 8349 (AqSynJ55). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CeCT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las tres cepas siguientes: CECT 8347 (AqSynJ12); CE^cT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59). En una realización alternativa, la composición comprende las cuatro de CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59).

En una realización de la presente invención, al menos una de las cepas comprendidas en la composición, tal como una, y/o dos, y/o tres, y/o cuatro, y/o cinco, y/o seis, y/o siete, y/u ocho de las cepas comprendidas en la composición, y preferiblemente todas las cepas comprendidas en la composición, están libres de resistencia a los antibióticos, es decir, no son capaces de sobrevivir después de la exposición al tratamiento con antibióticos convencional apropiado.

Puede realizarse una prueba in vitro de concentración inhibidora mínima (CIM) con el objetivo de evaluar las resistencias a los antibióticos para todas las cepas sugeridas. Los antibióticos evaluados pueden ser los siguientes: ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloranfenicol.

Con el propósito de distinguir las cepas resistentes de las susceptibles, la Comisión Técnica de Aditivos y Productos o Sustancias utilizados en los Piensos para Animales (FEEDAP) de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) define valores de corte microbiológicos. Los valores de corte microbiológicos se establecen estudiando la distribución de las CMI de los antimicrobianos elegidos en poblaciones bacterianas pertenecientes a una única unidad taxonómica (especie o género). La parte de la población que se desvía claramente de las poblaciones susceptibles normales se clasifica como resistente. Los valores de corte microbiológicos que pueden usarse para evaluar las resistencias a los antibióticos de las cepas de la presente invención son los definidos en “Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance’’, Comisión Técnica de Aditivos y Productos o Sustancias utilizados en los Piensos para Animales (Fe e Da P) de la EFSA, Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), Parma, Italia. EFSA Journal 2012;10(6):2740.

En cualquier caso, “comprende” puede entenderse opcionalmente en el sentido de que están presentes cepas bacterianas adicionales, o en el sentido de que no están presentes cepas bacterianas adicionales. Incluso si no están presentes cepas bacterianas adicionales, “comprende” puede significar opcionalmente que están presentes otros componentes adicionales, es decir, cualquier componente distinto de bacterias.

El otro componente (u otros componentes) no está limitado en modo alguno. En un aspecto preferido, al menos un compuesto prebiótico está comprendido en la composición de la invención, es decir, como otro componente. En un concepto muy amplio, los prebióticos son todas aquellas fuentes alimentarias que pueden ser metabolizadas por los probióticos. Preferiblemente, los prebióticos no son digeribles o son poco digeribles por un mamífero. Por tanto, tras la ingesta por el mamífero, los prebióticos no digeribles pueden atravesar el intestino delgado y entrar en el intestino grueso para estimular el crecimiento de los probióticos en este compartimento. Por tanto, los prebióticos pueden servir como fuente alimentaria para los probióticos. Se cree que los prebióticos, muchos de los cuales son hidratos de carbono no digeribles, promueven el crecimiento de los probióticos dentro del intestino. Los prebióticos se encuentran de manera natural, por ejemplo, en las cebollas, los cereales integrales, los plátanos, el ajo, la miel, los puerros, las alcachofas, los alimentos y bebidas enriquecidos, así como en los suplementos alimenticios. Los prebióticos se conocen bien en la técnica y cuando se usan en la presente invención no hay ninguna limitación particular del prebiótico como tal. Sin embargo, en las realizaciones preferidas, el al menos un producto prebiótico de la composición se selecciona de los siguientes compuestos y composiciones: hidratos de carbono no digeribles, betaglucanos, manano-oligosacáridos, inulina, oligofructosa, galacto-oligosacáridos (GOS), lactulosa, lactosacarosa, galactotriosa, fructo-oligosacárido (FOS), celobiosa, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glucosilsacarosa, vitamina E o una variante de la misma (en la que las variantes se seleccionan de alfa, beta, gamma, delta tocoferoles, tocotrienoles y tocomonoenoles). Opcionalmente, pueden preferirse manano-oligosacáridos y/o inulina.

En cuanto a las composiciones de diferentes cepas, es posible cualquier razón de mezclado. La razón de mezclado se indica en unidades formadoras de colonias (UFC), que se determinan de manera adecuada antes de mezclar las cepas individuales. En una realización, las razones de las cepas pueden ser iguales o no, tales como 1:(0,1-10):(0,1-10) para una composición de tres cepas, 1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) para una composición de cuatro cepas, y así sucesivamente. En otra realización, las razones de las cepas son aproximada o sustancialmente iguales, tales como 1:1:1 para una composición de tres cepas, 1:1:1:1 para una composición de cuatro cepas, y así sucesivamente. La composición puede prepararse mezclando la cantidad bacteriana respectiva (tal como se determina mediante recuento de colonias) de cada cepa que va a incorporarse a la composición.

La presente divulgación también proporciona el uso de una composición en un método para tratar un humano o animal. Puede preferirse el tratamiento de un animal, un mamífero y/o un animal doméstico en particular. Preferiblemente, el animal es del suborden Suina (el suborden Suina es un linaje de mamíferos que incluye los cerdos y pecaríes de las familias Suidae y Tayassuidae). Puede preferirse particularmente el ganado porcino o los cerdos, ya sean salvajes o domésticos. Esto también incluye cerdos que viven en condiciones semisalvajes, es decir, razas de cerdos domésticos que viven la mayor parte del año en el exterior y buscan su propio alimento. La composición puede ser una composición que comprende al menos una de las cepas depositadas anteriormente descritas.

La invención también proporciona una composición tal como se reivindica que comprende bacterias del ácido láctico para su uso en un método para aumentar el peso de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Alternativamente, la composición es para su uso en un método para fomentar el crecimiento de un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Alternativamente, la composición es para su uso en un método para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana en un mamífero recién nacido, preferiblemente un lechón. Al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, tal como cuatro o más de cuatro cepas diferentes de bacterias del ácido láctico están comprendidas en la composición. En el caso de la composición para el uso descrito en este párrafo, cada bacteria del ácido láctico debe cumplir al menos uno de los criterios a. a c. (actividad contra bacterias no deseadas; tolerancia a los ácidos; tolerancia a las sales biliares) tal como se describieron anteriormente. En cuanto al criterio a., la zona de inhibición mínima a la que se hace referencia anteriormente se observa normalmente para todas las bacterias no deseadas (i) a (iv). Preferiblemente, la composición debe cumplir una pluralidad (tal como a. y b.) y preferiblemente la totalidad de los criterios (a. a c.) anteriores. También es posible que en dicho método no se administre antibiótico al animal. En dicho método puede usarse o bien una composición probiótica o bien una composición simbiótica (es decir, una que comprende al menos un compuesto prebiótico).

La composición de la invención comprende microorganismos vivos, preferiblemente bacterias. En particular, dicha composición para su uso en un método para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento y/o para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana, puede comprender al menos una, tal como una y/o dos, y/o tres, y/o cuatro, y/o cinco, y/o seis, y/o siete, y/u ocho, de las cepas bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10); CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55); y CECT 8350 (AqSynJ59). En algunas realizaciones, dicha composición para su uso en un método para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento y/o para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana es la composición particular anteriormente descrita (en cualquier realización descrita).

La composición para su uso en un método para aumentar el peso y/o para fomentar el crecimiento y/o para tratar o prevenir la diarrea provocada por una infección bacteriana puede administrarse en el plazo de los primeros 14 días después del nacimiento (más preferiblemente en el plazo de los primeros 13 ó12ó 11 ó 10ó 9 u 8ó 7ó 6ó 5ó 4ó 3 ó 2 días después del nacimiento y lo más preferiblemente en el plazo de los primeros 2 días después del nacimiento o en el plazo del 1 día (24 horas) después del nacimiento.

Cualquier vía de administración es adecuada, pero puede preferirse la administración oral. Lo más habitual es administrar una dosis a cada animal directamente en la boca para asegurarse de que el animal traga la dosis. Alternativamente, la composición también puede proporcionarse como suplemento alimenticio, es decir, añadirse al alimento diario del animal.

La composición puede estar en cualquier forma, tal como en forma liofilizada, líquida o nebulizada. Si, por ejemplo, se usan bacterias liofilizadas para preparar la composición, entonces dicha composición preliminar de bacterias liofilizadas puede rehidratarse, por ejemplo, con solución salina isotónica estéril o con agua estéril o con medio de cultivo estéril, de modo que puede obtenerse una composición final con la concentración total deseada (UFC/ml).

Para facilitar su uso, la composición puede presentarse en forma dosificada. Por ejemplo, cada dosis puede comprender 107 o más, 108 o más, 109 o más, 1010 o más, 1011 o más unidades formadoras de colonias (UFC) de microorganismos (bacterias); puede preferirse una dosis de 109 o más. Una dosis puede tener un volumen en el intervalo de 0,1 a 100 ml, preferiblemente de 0,2 a 50 ml, más preferiblemente de 0,5 a 20 ml, más preferiblemente de 1,0 a 10 ml, más preferiblemente de 1,5 a 5 ml, e incluso más preferiblemente de (sustancialmente) 2 ml. Puede preferirse particularmente una dosis de 2 ml con 109 o más UFC.

Puede administrarse cualquier número de dosis y el experto puede elegir la duración del tratamiento según las necesidades en la granja respectiva. En una realización particular, el número total de dosis administradas a un animal es de 10 o menos, tal como cualquier número seleccionado de los siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o cualquier intervalo que combine uno cualquiera de estos números (excepto 10) con uno cualquiera de estos números, siempre que el segundo número sea mayor (por ejemplo, de 1 a 3 dosis por ejemplo). Puede preferirse particularmente un total de dos dosis por animal.

Por tanto, los inventores proporcionan un nuevo uso para tales composiciones al emplear opcionalmente la composición probiótica o simbiótica en una etapa de vida temprana. En una realización preferida, una primera dosis se administra en las primeras 24 horas después del nacimiento y una segunda dosis se administra en las 24 horas posteriores. Opcionalmente, estas son las únicas dos dosis. En otra opción, se administran doses adicionales a continuación.

La composición de la invención es particularmente adecuada para tratar o prevenir una afección en un mamífero, tal como una infección bacteriana o disbiosis. La infección puede ser o incluir una infección del tubo digestivo. Tal infección puede estar provocada por cualquier bacteria, tal como, por ejemplo, Escherichia coli, solas o en combinación con Clostridium perfringens o con Clostridium difficile. Otros factores causantes pueden incluir Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus. En algunas realizaciones, la afección puede seleccionarse de diarrea debida a infecciones bacterianas (incluyendo colibacilosis), diarrea del recién nacido por Clostridium difficile, tipo A y C por Clostridium perfringens. También puede tratarse la meningitis estreptocócica. También es posible administrar la composición a animales que padecen diarrea o que están en riesgo de padecer diarrea, incluso si no se ha demostrado (aún) que una infección (bacteriana) es el factor causante de dicha diarrea. Puede apreciarse que los animales que están en riesgo de padecer diarrea son aquellos animales que viven en (o nacen en) instalaciones en las que se había observado diarrea durante los últimos 12 meses, 6 meses, 3 meses o 1 mes.

Los resultados de los inventores confirman el efecto ventajoso del uso de los productos y las composiciones de la invención. Tal como se muestra en los ejemplos de prueba de concepto a continuación, el porcentaje de mortalidad fue claramente menor que en otras semanas con tan sólo el tratamiento con antibióticos de rutina (véanse los ejemplos). Por tanto, la composición de la invención se administra preferiblemente a animales que no se tratan al mismo tiempo con antibiótico(s).

La divulgación también proporciona un microorganismo, preferiblemente una bacteria, y más preferiblemente una bacteria del ácido láctico. La bacteria del ácido láctico se selecciona idealmente de las cepas siguientes: CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09); CECT 8166 (AqSyn10), CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59), que están todas depositadas en la CECT.

Materiales y métodos

Medio MRS: se preparó la receta del medio MRS según la receta obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT; www.cect.org) tal como sigue: 10,0 g de peptona, 10,0 g de extracto de carne de vacuno, 5,0 g de extracto de levadura, 20,0 g de glucosa, 2,00 g de citrato de amonio, 5,00 g de acetato de sodio, 0,20 g de MgSO4.7H2O, 0,05 g de MnSO4.H2O, 2,00 g de K2HPO4, [15 g de agar en polvo (sólo para medios sólidos)], 1 l de agua destilada.

Se preparó la receta del medio BHI (infusión de cerebro y corazón) según la receta obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT; www.cect.org) tal como sigue: 12,5 g de sólidos de infusión de cerebro de ternero, 5,0 g de sólidos de infusión de corazón de ternera, 10,0 g de proteosa peptona, 2,0 g de glucosa, 5,0 g de NaCl, 2,5 g de HNa2PO4, 1 l de agua destilada [15 g de agar en polvo (sólo para medios sólidos)].

Tratamiento con antibióticos: normalmente, cada granja porcina trata a los lechones recién nacidos con antibióticos y posiblemente con un suplemento de hierro. Generalmente, cada granja porcina tiene un tratamiento “convencional” diferente para sus animales (habitualmente inyectan una dosis de antibióticos y un suplemento de hierro al nacer). En los experimentos a continuación, se usó el tratamiento convencional de las respectivas granjas. Generalmente, los antibióticos también se usan de manera esporádica por diarreas, cojeras, síntomas respiratorios y muchos otros hechos cotidianos sin un protocolo completo establecido en lechones.

Ejemplos

Ejemplo 1 A: Origen de las cepas

Las cepas bacterianas se aislaron e identificaron tal como sigue.

El aislamiento de las cepas bacterianas CECT 8163 (AqSyn04); CECT 8165 (AqSyn06); CECT 8164 (AqSyn09) y CECT 8166 (AqSyn10) se realizó a partir de calostro de cerdas y muestras de meconio de lechones recién nacidos. La toma de muestras tuvo lugar en granjas porcinas de alta calidad sanitaria en España.

Las muestras se hicieron crecer de manera aerobia y anaerobia en placas de agar de De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) durante 24 horas a 37°C, y se aislaron colonias Gram positivas catalasa negativas de diferentes morfologías. Todas las colonias pertenecían a cepas bacterianas. Más precisamente, se aislaron 61 cepas bacterianas diferentes. Cada una se amplificó por PCR usando cebadores de pCr que seleccionan como diana la región espaciadora de ARNr 16S/23Stal como describieron Berthier y Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.

Después de la amplificación y la electroforesis, se purificaron y secuenciaron bandas claramente diferenciadas. Los diferentes patrones de PCR se muestran en la figura 1. Mediante la secuenciación, las cepas se asignaron a varias especies bacterianas.

1.1 Caracterización de las cepas

Sin querer restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que pueden existir diferencias sustanciales entre cepas. Con el fin de diferenciar cepas de la misma especie, se realizó una prueba API 50 CH (Biomérieux, REF 50 300) según las instrucciones del fabricante con el fin de describir los patrones de fermentación de hidratos de carbono de los sustratos, lo que confirma diferencias entre cepas de la misma especie.

De las 61 cepas, pudieron observarse 10 grupos diferentes por patrones de fermentación de hidratos de carbono, lo que confirma la presencia de 10 cepas diferentes. Se tomó una de cada grupo como ejemplo y se sometió a los siguientes métodos in vitro.

Las 10 cepas pertenecían a las especies Lactobacillus reuteri y Enterococcus faecium.

1. Lactobacillus reuteri

2. Lactobacillus reuteri

3. Lactobacillus reuteri

4. Lactobacillus reuteri (AqSyn04)

5. Lactobacillus reuteri

6. Lactobacillus reuteri (AqSyn06)

7. Enterococcus faecium

8. Enterococcus faecium

9. Enterococcus faecium (AqSyn09)

10. Enterococcus faecium (AqSyn10)

Estas 10 cepas se sometieron a prueba adicionalmente con el fin de comprobar su posible uso para mejorar la salud de los animales (de cerdos en particular), véase la siguiente sección 1.2).

1.2 Selección de las cepas

Las 10 cepas identificadas tal como se describieron en la sección 1.1 se sometieron a prueba adicionalmente. Se planteó la hipótesis de que una combinación de criterios antimicrobianos y de tolerancia podrían ayudar a encontrar cepas adecuadas entre las cepas anteriores. Por tanto, cada una de las cepas por separado se sometió a cada una de las pruebas a. a c. descritas anteriormente en la sección “Pruebas de selección in vitro’’.

El trabajo diligente de los presentes inventores mostró que los criterios a. a c., descritos anteriormente en la sección “Pruebas de selección in vitro’’, son adecuados para identificar cepas que son adecuadas para la presente invención. Por tanto, las cepas se sometieron a prueba según dichos criterios a. a c. Las pruebas in vitro revelaron cuatro cepas con propiedades particularmente beneficiosas. Los resultados se enumeran a continuación.

Tabla: Resultados de las pruebas in vitro:

Tal como puede observarse en la tabla anterior, después de dichas pruebas in vitro, se identificaron cuatro cepas (dos de Lactobacillus reuteri (AqSyn04, AqSyn06) y dos de Enterococcus faecium (AqSyn09, AqSyn10). [En la tabla anterior no se muestran los resultados para las 6 cepas restante, es decir aquellas que no cumplieron al menos uno de los criterios a. a c.].

A partir de las mismas se preparó una composición de estas cepas tal como se describe en el ejemplo 2 A.

Ejemplo 1 B: Origen de las cepas

Las cepas bacterianas se aislaron e identificaron tal como sigue.

El aislamiento de las cepas bacterianas CECT 8347 (AqSynJ12); CECT 8348 (AqSynJ17); CECT 8349 (AqSynJ55) y CECT 8350 (AqSynJ59) se realizó a partir de lavados de pared intestinal de intestino de jabalí.

Las muestras se hicieron crecer de manera aerobia y anaerobia en placas de agar de De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) durante 24 horas a 37°C, y se aislaron colonias Gram positivas catalasa negativas de diferentes morfologías. Todas las colonias pertenecían a cepas bacterianas. Más precisamente, se aislaron 61 cepas bacterianas diferentes. Cada una se amplificó por PCR usando cebadores de ^pC^r que seleccionan como diana la región espaciadora de ARNr 16S/23Stal como describieron Berthier y Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.

Después de la amplificación y la electroforesis, se purificaron y secuenciaron bandas claramente diferenciadas. Mediante la secuenciación, las cepas se asignaron a varias especies bacterianas.

1.1 Caracterización y selección de las cepas

1. Lactobacillus fermentum (AqSynJ12)

2. Lactobacillus reuteri (AqSynJ17)

3. Lactobacillus mucosae (AqSynJ55)

4. Lactobacillus plantarum (AqSynJ59)

Las pruebas in vitro siguiendo los criterios a. a c., descritos anteriormente en la sección “Pruebas de selección in vitro". revelaron cuatro cepas con propiedades particularmente beneficiosas. Los resultados se enumeran a continuación.

Tal como puede observarse en la tabla anterior, las cepas de jabalíes cumplen los criterios de selección. Además, las cepas anteriormente identificadas están libres de resistencia a los antibióticos.

Se realizó una prueba in vitro de concentración inhibidora mínima (CIM) con el objetivo de evaluar las resistencias a los antibióticos para las cepas anteriores (AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55, AqSynJ59). Los antibióticos evaluados fueron los siguientes:

ampicilina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y cloranfenicol.

Los valores de corte microbiológicos que se usaron para evaluar las resistencias a los antibióticos de las cepas de la presente invención son los definidos en “Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance”, Comisión Técnica de Aditivos y Productos o Sustancias usados en Piensos para Animales de la EFSA (^f E^e DAP), Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), Parma, Italia. EFSA Journal 2012;10(6):2740.

A partir de las mismas se preparó una composición de estas cepas tal como se describe en el ejemplo 2 B (composiciones D y E).

Ejemplo 2 A: Preparación de una composición probiótica según la invención y de una composición simbiótica según la invención

Cada una de las cepas AqSyn04, AqSyn06, AqSyn09, AqSyn10 se hizo crecer en el cultivo de caldo MRS mediante fermentación, se recogió y se liofilizó. Se comprobó la viabilidad del producto final mediante recuento de colonias. Se prepararon las composiciones que contenían la totalidad de estas cuatro cepas tras la adición opcional de compuestos prebióticos. Se prepararon las siguientes composiciones:

Composición A: (2,5 x 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se usaron en forma liofilizada. La composición A puede verse como un probiótico.

Composición B: (2,5 x 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se usaron en forma liofilizada. La composición B puede verse como un simbiótico.

Además, se preparó una composición C, que contenía sólo tres de las cuatro cepas bacterianas (AqSyn04, AqSyn09, AqSyn10), tal como sigue.

Composición C: (3,3 x 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se usaron en forma liofilizada. La composición C puede verse como un simbiótico.

Las composiciones se prepararon mezclando la misma cantidad bacteriana (tal como se determina mediante recuento de colonias (valores respectivos en g indicados anteriormente)) de cada cepa que va a incorporarse a la composición, se añadieron los componentes adicionales indicados (por ejemplo, composición B, composición C) y se rehidrató la composición respectiva así obtenida con solución salina isotónica, de modo que se obtuvo una composición final que contenía 109 UFC (total de todas las cepas contenidas en la misma) en una dosis de 2 ml. Ejemplo 2 B: Preparación de una composición probiótica según la invención y de una composición simbiótica según la invención

Cada una de las cepas AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55, AqSynJ59 se hizo crecer en el cultivo de caldo MRS mediante fermentación, se recogió y se liofilizó. Se comprobó la viabilidad del producto final mediante recuento de colonias. Se prepararon las composiciones que contenían la totalidad de estas cuatro cepas tras la adición opcional de compuestos prebióticos. Se prepararon las siguientes composiciones:

Composición D: (2,5 x 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se usaron en forma liofilizada. La composición D puede verse como un probiótico.

Composición E: (2,5 x 108 UFC de cada cepa en 2 ml)

Todas las cepas se usaron en forma liofilizada. La composición E puede verse como un simbiótico.

Ejemplo 3: Administración a lechones sin administración de antibióticos (primera prueba de concepto)

La primera prueba de concepto se llevó a cabo en una granja próxima a una granja porcina ubicada en la provincia de Zamora (España) con 2400 cerdas y problemas de diarrea crónica en lechones recién nacidos. Siete camadas (78 lechones) recibieron la composición A (véase el ejemplo 2 A) y otras siete camadas (81 lechones) se mantuvieron como control, tal como sigue.

Los lechones a los que se les administró la composición A recibieron una dosis (véase el ejemplo 2 A) diariamente desde el nacimiento hasta el día 14° de vida sin tratamiento con antibióticos.

El tratamiento del grupo de control fue una inyección i.m. de 1 ml de un producto comercial que contenía 150 mg de amoxicilina y 40.000 IU de gentamicina. Los lechones con diarrea en este grupo estaban recibiendo este tratamiento una vez al día durante los días que mostraron diarrea.

Los resultados de esta primera prueba de concepto parecían bastante notables, mostrando una eficacia inesperada del tratamiento de la invención. En vista de estos resultados, los inventores supusieron no sólo el efecto esperado en la flora patógena sino también una estimulación del sistema inmunitario natural de los lechones. Sin querer restringirse a ninguna teoría en particular, puede entenderse que la composición administrada tuvo un efecto directo sobre los patógenos digestivos y probablemente sobre la respuesta natural de los lechones contra estas infecciones digestivas.

Ejemplo 4: Administración a lechones en diferentes pautas posológicas (segunda prueba de concepto)

Este experimento se llevó a cabo en Zamora (España) en la misma granja que el ejemplo 3. Brevemente, los inventores tenían como objetivo demostrar la influencia de la composición A sobre el sistema inmunitario innato de los lechones recién nacidos. También se investigó la administración en diferentes etapas de la vida temprana de los lechones. Se entiende que, en la vida temprana de los lechones, la flora de los animales todavía es inmadura.

Se administró la composición A a siete camadas (65 lechones) el día de nacimiento, un segundo grupo de siete camadas (84 lechones) recibió la composición A en los días de vida primero y segundo (cualquier aplicación de antibióticos) y un tercer grupo de siete camadas (80 lechones) se tomó como control, tal como en el ejemplo 3. Es importante observar que sólo el grupo de control recibió tratamiento con antibióticos, mientras que los grupos que recibieron la composición A no recibieron ninguna aplicación de antibióticos. Los inventores demuestran que pueden alcanzarse una ganancia de peso similar al grupo de control.

Los resultados muestran que la administración de dos dosis es beneficiosa. En particular, la doble aplicación en etapas muy tempranas después del nacimiento de los lechones puede proteger a los animales contra enfermedades digestivas sin el uso de antibióticos, y puede reducirse la mortalidad.

Una observación importante adicional en este punto es que la administración de probióticos que se sometió a prueba es al menos igualmente eficaz que el tratamiento con antibióticos en cuanto a productividad.

Ejemplo 5: Administración a lechones e influencia sobre el sistema inmunitario (tercera prueba de concepto) La tercera prueba de concepto se llevó a cabo en una granja ubicada en la provincia de Murcia. La granja tenía 2.400 cerdas y problemas de diarrea en lechones justo después del nacimiento. Se diagnosticó que estos problemas digestivos estaban producidos por Escherichia coli y Clostridium difficile.

El tratamiento habitual de los lechones en esta granja (lechones de control en este experimento) era una inyección de 100 mg de tulatromicina justo después del nacimiento. Después de eso, los lechones que tenían diarrea durante la lactancia también se trataron por vía oral con espiramicina (25 mg/kg de peso vivo) y colistina (5 mg/kg de peso vivo) una vez al día durante los días que tuvieron diarrea.

En este experimento, la composición A se administró dos veces en 29 camadas, es decir, (1) justo después del nacimiento y (2) el segundo día de vida, sin tratamiento con antibióticos. Se manipularon 34 camadas según procedimientos habituales de la granja.

Tabla. Índice productivo en el destete

Esta prueba de concepto certificó la posibilidad de mejorar el tratamiento de alteraciones digestivas tempranas en lechones recién nacidos, particularmente sin el uso de antibióticos.

Ejemplo 6: Administración a lechones e influencia sobre el sistema inmunitario (cuarta prueba de concepto) La siguiente prueba de concepto tenía como objetivo someter a prueba el producto como rendimiento regular en la rutina de la granja. Este experimento tuvo lugar en la región de Huesca en una granja de 5.500 cerdas. Debido a los hechos logísticos, no fue posible mantener un grupo de control. Se administró la composición B a todos los lechones nacidos en una determinada semana (semana 13 del año 2012), comparando los indicadores productivos con las semanas antes y después del experimento. En esta granja, el tratamiento habitual de los lechones con diarrea era la administración durante tres días de 1 ml al día de un producto comercial que contenía 100 mg de ampicilina y 250.000 IU de metanosulfonato de sodio-colistina.

Resultados de indicadores productivos; se administró la composición B en la 13a semana.

(A) Se observaron casos de diarrea en el 80% de las cerdas primíparas (como es habitual sin tratamiento con la composición B) y algunas de las cerdas multíparas. Los lechones tenían de 3 a 5 días. Todos los casos de diarrea desaparecieron sin tratamiento con antibióticos.

Los resultados de los inventores confirman el efecto ventajoso del uso de los productos y las composiciones de la invención. El porcentaje de mortalidad fue claramente menor que otras semanas con sólo tratamiento con antibióticos de rutina.

Ejemplo 7:

Se realizaron experimentos in vivo con la composición E en una granja en Zaragoza (España) con 1.200 madres hiperprolíficas (promedio de 14 lechones nacidos vivos por parto) y 56 nacimientos por semana (784 lechones por semana), que tiene como objetivo criar los lechones hasta los 20 kg para después suministrarlos a otras granjas, con problemas periódicos de diarrea en la fase de lactancia en lechones de menos de 1 semana de vida. El granjero trató los lechones de manera convencional y administró el producto (composición E anterior) en el nacimiento y en el segundo día de vida a todas las camadas. Los resultados del tratamiento con la composición E fueron similares a los obtenidos con las composiciones A, B y C. Se observa que cualquier realización marcada como “divulgación” sólo forma parte de la invención en la medida en que quede cubierta por las reivindicaciones.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   i. Composición para su uso en un método para tratar o prevenir diarrea provocada por una infección bacteriana en un mamífero recién nacido, en la que la composición comprende al menos una bacteria del ácido láctico de la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59); y en la que la composición se administra en el plazo de los primeros 14 días después del nacimiento.

   2. Composición para su uso en un método según la reivindicación 1, en la que el método es para tratar un animal del suborden Suina, perros, gatos, caballos, ganado bovino, aves de corral, ovejas o cabras, preferiblemente en la que el método es para tratar un lechón o un perro.

   3. Composición para su uso en un método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición se administra en el plazo de los primeros 7 días después del nacimiento, preferiblemente en el plazo de los primeros 2 días después del nacimiento.

   4. Composición para su uso en un método según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un producto prebiótico, en la que el al menos un producto prebiótico se selecciona preferiblemente de los compuestos y las composiciones siguientes: beta-glucanos, mananooligosacáridos, inulina, oligofructosa, galacto-oligosacáridos (GOS), lactulosa, lactosacarosa, galactotriosa, fructo-oligosacárido (FOS), celobiosa, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarosa, vitamina E o una variante de la misma, en la que las variantes se seleccionan de alfa, beta, gamma, delta tocoferoles, tocotrienoles y tocomonoenoles, prefiriéndose manano-oligosacáridos y/o inulina.

   5. Composición para su uso en un método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición es para administración oral.

   6. Composición para su uso en un método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en la que el método es para tratar o prevenir una infección bacteriana, en la que la infección bacteriana se selecciona de la lista que consiste en: una colibacilosis que conduce a diarrea, una infección bacteriana por Clostridium difficile que conduce a diarrea del recién nacido, una infección de tipo A o C por Clostridium perfringens. 7. Bacteria del ácido láctico de la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59).

   8. Composición que comprende al menos una bacteria del ácido láctico de la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de depósito CECT 8350 (AqSynJ59).

   9. Composición según la reivindicación 8, que comprende además al menos un producto prebiótico, en la que el al menos un producto prebiótico se selecciona preferiblemente de los compuestos y las composiciones siguientes: beta-glucanos, manano-oligosacáridos, inulina, oligofructosa, galacto-oligosacáridos (GOS), lactulosa, lactosacarosa, galactotriosa, fructo-oligosacárido (FOS), celobiosa, celodextrinas, cilodextrinas, maltitol, lactitol, glicosilsacarosa, vitamina E o una variante de la misma, en la que las variantes se seleccionan de alfa, beta, gamma, delta tocoferoles, tocotrienoles y tocomonoenoles, prefiriéndose manano-oligosacáridos y/o inulina.

   10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, para su uso como medicamento.

   11. Composición para su uso según la reivindicación 10, para su uso en un método para tratar o prevenir diarrea provocada por una infección bacteriana en un humano o un animal, preferiblemente un mamífero y/o un animal doméstico, y más preferiblemente un cerdo.