KR20150024116A - 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물 - Google Patents

바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물 Download PDF

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황요셉
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허용주
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군산대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 본 발명은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물, 이를 포함하는 축산용 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 여러 구현예에 따르면, 본 발명의 축산용 프로바이오틱스 조성물은 축산 가축의 성장률을 증가시키는 효과가 있고, 선천적 면역성이 높은 것으로 확인되며, 살모넬라 균에 대한 항균효과가 매우 우수하므로 살모넬라 균과 같은 장내 병원성 미생물의 생성을 억제하여 세균 감염성 질병을 예방은 물론 치료를 위한 프로바이오틱스, 축산용 사료첨가제, 이를 포함하는 사료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있고, 밀집사육으로 인한 질병발생에 대한 면역력 강화로 저항성을 높이며, 천연 항생제 개념을 도입하여 항생제 잔류나 부작용을 예방하고, 전염병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

Description

바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물{Probiotics composition for livestock farming containing a mixture of bacillus sp., lactobacillus sp., Yeast sp. and phage}
본 발명은 본 발명은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물, 이를 포함하는 축산용 사료 첨가제에 관한 것이다.
일반적으로 우리나라 축산업은 전업화, 규모화가 한우에서 젖소, 돼지, 육계, 산란계에 이르기까지 공통적으로 박차가 가해진 1990년대 초 이후 현재까지 다른 나라 축산업 발전사에서 사례를 찾아보기 힘든 괄목성장을 거듭했다. 2010년도 농림업 전체 생산액에서 주요 축종과 축산물이 차지하는 비중이 40.2%로 나타난 가운데 생산액 10대 품목 중 주요 축종 및 축산물이 2위에서 7위까지 차례로 랭크돼 언론의 초점이 모아졌고 축산업계 내부에서 높아진 축산업 위상과 당면현황이 화제가 된바 있다. 통계청에 따르면 2011년 4/4분기(12.1일 기준) 가축동향조사 결과 한·육우는 2,950천 마리로 전분기보다 94천 마리(3.1%) 감소하였고 돼지는 8,171천 마리로 전분기보다 388천 마리(5.0%) 증가하였고 육계는 76,435천 마리로 전분기보다 5,397천 마리(7.6%) 증가하였다. 축산업의 비약적인 성장에도 불구하고 조류 인플루엔자(HPAI) 와 구제역과 같은 유행성 질병이 매년 증가하고 있는 추세이다. 가축의 질병 예방과 가축 생산성을 높이기 위하여 그 동안 생장 촉진제로서의 항생제를 지속적으로 사용하여 왔다. 그러나 이러한 항생제의 남용으로 인하여 축산물에 잔류되어 인체에 전이되고 결과적으로 알레르기 등의 질병을 일으키는 문제와 인체의 내성을 증가시켜 질병 발생 시 약물의 치료 효과를 감소시키는 등의 문제가 발생된다. 국내에서는 2005년도에 항생제에 대하여 25개 품목으로 대폭 그 범위를 감소시켜 왔고, EU(유럽연합)는 이보다 더 강도 높은 조치를 취하였으며, 2006년부터 가축의 치료목적 외에 성장촉진용 항생물질의 사료 첨가를 전면 금지시키고 있는 상황이다. 현재 여러 종류의 항생제들이 국내에서는 질병치료 및 감염예방에 단독 또는 사료에 첨가되어 사용되고 있으나 안전성이 보다 요구되고 있으며 항생물질의 계속적인 사용은 내성을 갖는 미생물의 증가를 초래하게 되고 이러한 내성균은 사람에게 전염될 수 있고 가축의 장내 세균총의 파괴와 함께 항생물질의 축적으로 생육에 지장을 초래할 뿐만 아니라 식용 시 악영향을 미칠 수 있다. 특히, 장내서식 유익 세균총은 대사과정에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라 면역강화 및 동물의 성장과 건강 유지를 위해 필수적이며 비타민의 생성 등 유익한 역할을 하나 항생물질 등의 투여로 장내세균총의 생물학적 균형이 깨지면 감염 방어기작에 이상이 생겨 병원미생물의 침입이 용이하게 되는 문제점이 있다.
광범위 항생제는 축산농가에서 사육증진과 세균성 질병을 예방을 목적으로 무방비하게 사용되어져 왔고, 항생제 오남용으로 인해 다재 내성을 갖는 세균이 출현하여 더 이상 치료목적과 사육증진으로 사용될 수 없는 실정이며 이러한 이유로 사료공정서에 의거 2011년 7월 이후 사료 내 항생제 첨가를 금지시켰다. 이러한 실정에서 EU의 경우에도 2006년 이후 성장촉진용 항생제 사용을 전면금지하여 청정육을 생산하고 있으나 국내 양돈, 양계산업의 경우 항생제의 과다사용으로 항생제의 내성 보유율이 다른 나라에 비해 상대적으로 높고 돈육 내 항생물질의 잔류가 지속적으로 검출되고 있는 실정이다.
안전하고 위생적인 축산물에 대한 소비자의 욕구가 높아진데다 정부 또한 검사 강화 방침을 세워 농축가들 스스로가 유해물질 잔류에 대한 불안으로 항생, 항균제를 사용하는 대신 생균제를 사용한 제품에 대한 선호도가 높아지고 있어, 부작용이 비교적 적은 친환경적인 probiotics에 대한 관심과 연구가 점차 증가되고 있는 실정이다. probiotics는 항생제를 대체 할 수 있는 대체 물질로 1970년대에 들어서 처음으로 사용되기 시작하였으며, 숙주의 건강에 유익한 효과를 나타내는 살아있는 미생물로서 다양한 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있어 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당한다. 미생물, 효소 및 식물 추출물 등 천연자원을 사료에 첨가하는 가축 사육은 기존의 화학 항생제와 환경오염을 줄일 수 있으며, 또한 가축 및 인체에 있어서 병원성 세균들에 대한 내성을 유발하지 않고 성장을 촉진시킬 수 있는 항생제 대체제이다. 따라서 Salmonella 및 대장균 등 병원성세균에 대한 항균효과, 육계의 성장 촉진 및 면역증강 기능 효과를 통하여 질병 예방 및 생산성 향상 등의 기능을 수행할 수 있는 천연 물질을 발굴하여 이용할 필요가 있다.
1885년 Salmon 및 Smith에 의해 보고된 살모넬라 속균은 사람과 동물의 장관에 분포하는 장내세균으로서, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) 및 살모넬라 타이피수이스( Salmonella . typhisuis)는 급성패혈증을 일으킨다. 이 외에 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella typhimurium ), 살모넬라 엔테라이티디스( Salmonella enteritidis ) 및 살모넬라 더비( Salmonella derby ) 등은 주로 결장염을 일으키는 원인균이다. 감염경로는 오염된 원료사료나 물에 의해 전염될 수 있으며 임상증상을 보이지 않으면서 균을 보균하고 있는 성돈이 중요한 전염원이 될 수 있다. 즉 보균돈이 여러 가지 스트레스에 의해 발병하게 되면 발병축의 분변을 통해 경구 감염된다. 이러한 균의 배설은 질병에서 회복된 후에도 약 3개월 동안 지속되며 간혹 몇몇 돼지는 영구적으로 보균하면서 균을 배설하기도 한다. 균은 거름 속에서 오랜 기간 생존하며 분변 중에서는 20주까지 생존한 사실이 보고되었다. 살모넬라균은 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있으며 이와 연관된 식품의 종류 또한 매우 다양하다. 살모넬라균의 오염은 이러한 오염된 동물이나 사람과의 직접적 접촉을 통하여 또는 이들의 분변에 의해 오염된 환경에서 전염될 수 있다. 따라서 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 않을 경우 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식품을 통하여 다른 식품이 교차 오염될 수 있다.
살모넬라균 중 대표적 균종인 살모넬라 엔테라이티디스는 달걀과 연관이 크며, 살모넬라 타이피뮤리움은 돼지고기, 가금류 및 소고기와 연관이 크다. 어린 돼지에서는 살모넬라균에 의해 패혈증, 설사, 장염 등을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 이환율과 폐사율이 높으며, 성돈에서는 불현성 감염으로 인한 보균돈이 많아 질병전파의 매개체 역할을 하며, 특히 식육 및 환경오염의 원인이 되기도 한다. 또한, 소의 급성 또는 만성의 소화기 전염병으로 주로 송아지에 다발하며 발열, 장염 및 패혈증상을 주증으로하고 폐염, 뇌염, 관절염, 유산 및 유방염도 일으킬 수 있다. 뿐만 아니라, 가금류의 경우, 살모넬라균에 감염된 산란계로부터 부화한 병아리는 몇 주안에 분변으로 많은 양의 세균을 배출하므로 감염의 원인이 되기도 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 살모넬라 및 대장균 등 병원성세균에 대한 항균효과, 가축의 성장 촉진 및 면역증강 기능 효과를 통하여 질병 예방 및 생산성 향상 등의 기능을 수행할 수 있고, 바실러스 속(bacillus sp.), 락토바실러스 속(lactobacillus sp.), 이스트(yeast) 및 파지(phage) 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스를 제공하는 것이다.
본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물 또는 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 식방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 축산농가에서, 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 및 파지 혼합물, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 축산 가축에 급이하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 살모넬라 감염성 질병을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 사료를 가축에 급여하는 단계를 포함하는 가축의 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법에 관한 것이다.
본 발명의 여러 구현예에 따르면, 본 발명의 축산용 프로바이오틱스 조성물은 축산 가축의 성장률을 증가시키는 효과가 있고, 선천적 면역성이 높은 것으로 확인되며, 살모넬라 균에 대한 항균효과가 매우 우수하므로 살모넬라 균과 같은 장내 병원성 미생물의 생성을 억제하여 세균 감염성 질병을 예방은 물론 치료를 위한 프로바이오틱스, 축산용 사료첨가제, 이를 포함하는 사료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있고, 밀집사육으로 인한 질병발생에 대한 면역력 강화로 저항성을 높이며, 천연 항생제 개념을 도입하여 항생제 잔류나 부작용을 예방하고, 전염병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스 그룹에 대한 내산성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 이스트 그룹에 대한 내산성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 락토바실러스 그룹에 대한 내산성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스 그룹에 대한 내담즙산 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 이스트 그룹에 대한 내담즙산 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 락토바실러스 그룹에 대한 내담즙산 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트 및 락토바실러스의 내열성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 살로넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지의 내산성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지의 열안정성 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 박테리오파지의 형태학적 특성을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 살균 능력 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 농도에 따른 ROI 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 종류에 따른 ROI 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 농도에 따른 식균 작용 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 종류에 따른 식균 작용 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 농도에 따른 리소자임 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 종류에 따른 리소자임 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 농도에 따른 SOD 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 종류에 따른 SOD 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 구현예에 따른 바실러스, 이스트, 락토바실러스 및 살모넬라 균으로부터 분리된 박테리아파지 혼합물의 항균 효과 결과를 나타내는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (1) 바실러스 속(bacillus sp.), (2) 락토바실러스 속(Lactobaciilus sp.), (3) 이스트 속(Yeast sp.) 및 (4) 파지(phage) 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스가 개시된다.
본 발명에 있어서, 프로바이틱스(생균제 : Probiotics)란 항생제에 상대적인 개념의 용어로써, 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 물질로, 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당하는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (1) 바실러스 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되고, 상기 (2) 락토바실러스 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되며, 상기 (3) 이스트 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되고, 상기 (4) 파지는 2×105-2×109 PFU/g의 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 특히, 바실러스 속의 농도가 2×105 CFU/㎖ 미만의 농도로 첨가되는 경우, 바실러스 속에 의한 항균효과, 소화효과를 기대하기 힘들고, 2×109 CFU/㎖ 초과하여 첨가되는 경우, 타켓 숙주의 양이 적을 때 오히려 파지의 경쟁반응으로 인한 내성비율을 높여 숙주균의 증식을 높일 수 있는 우려가 있다.
또한, 락토바실러스 속의 농도가 2×105 CFU/㎖ 미만의 농도로 첨가되는 경우, 장내미생물총의 불균형 및 면역력 상승 효과를 기대하기 힘들며, 2×109 CFU/㎖ 초과하여 첨가되는 경우, 타켓 숙주의 양이 적을 때 오히려 파지의 경쟁반응으로 인한 내성비율을 높여 숙주균의 증식을 높일 수 있는 우려가 있다.
나아가, 이스트 속의 농도가 2×105 CFU/㎖ 미만의 농도로 첨가되는 경우, 유익균의 성장에 도움이 될수 없고 면역력 상승, 설사예방의 문제점이 있고, 2×109 CFU/㎖ 초과하여 첨가되는 경우, 타켓 숙주의 양이 적을 때 오히려 파지의 경쟁반응으로 인한 내성비율을 높여 숙주균의 증식을 높일 수 있는 우려가 있다.
또한, 파지의 농도가 2×105 PFU/g 미만의 농도로 첨가되는 경우, 유해세균의 1차적 사멸을 기대하기 힘들며 유익균의 장내역할이 미비해질 우려가 있고, 2×109 PFU/g 초과하여 첨가되는 경우, 타켓 숙주의 양이 적을 때 오히려 파지의 경쟁반응으로 인한 내성비율을 높여 숙주균의 증식을 높일 수 있는 우려가 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (1) 바실러스 속은 바실러스 서브틸러스(bacillus subtillis), 바실러스 리케니포르미스(bacillus licheniformis) 중에서 선택되는 1종 이상이고,
상기 (2) 락토바실러스 속은 락토바실러스 플란타룸(Lactobaciilus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(lactobacillus paracasei), 락토바실러스 페르멘텀(lactobacillus fermentum) 중에서 선택되는 1종 이상이고,
상기 (3) 이스트 속은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 아노말라(Pichia anomala) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (1) 바실러스 속은 유전자은행(genbank) 등록번호(accession number) KC757129.1, JX042469.1. KC172009.1, JX123316.1 및 AB743877.1 중에서 선택되는 1종 이상이고,
상기 (2) 락토바실러스 속은 유전자은행 등록번호 JX426117.1, JF965377.1 및 JX272056.1 중에서 선택되는 1종 이상이고,
상기 (3) 이스트 속은 유전자은행 등록번호 JN887919.1 및 FJ865436.1 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (4) 파지는 살모넬라 겔리나움(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 이.콜라이(E. coli ), 프로테우스 속( Proteus sp .) 중에서 선택되는 1종 이상의 균에 대하여 특이적으로 용균 현상을 보이는 박테리오파지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 박테리오파지는 포도비리대(podoviridae)과 또는 시포비리데(Siphoviridae)과인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 박테리오파지는
(a) 물 시료에 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 속 중에서 선택되는 1종 이상의 균과 뇌심장침출액(BHI)을 첨가한 후, 배양하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 배양이 완료된 시료에 박테리아를 첨가한 후, 배양하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 배양이 완료된 시료를 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여과하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 여과물을 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 속 중에서 선택되는 1종 이상의 균이 도말되어 있는 BHI 배지에 접종한 후, 상기 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 속 중에서 선택되는 1종 이상의 균을 첨가하여 중층배지를 만든 후, 증폭시켜 파지를 여과하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 축산용 프로바이오틱스 조성물은 오리, 닭, 거위, 꿩, 메추라기, 칠면조, 소, 젖소, 말, 당나귀, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼, 고양이 중에서 선택되는 1종 이상의 축산 가축인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 개시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사료첨가제는 축산 가축의 양식에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 사료첨가제는 오리, 닭, 거위, 꿩, 메추라기, 칠면조, 소, 젖소, 말, 당나귀, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼, 고양이 중에서 선택되는 1종 이상의 축산 가축인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사료 첨가제는 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 프로바이오틱스 생균제로서의 조건 중 가장 기본적으로 갖추어야 할 부분은 산에 대한 내성력, 십이지장에서 분비 되는 담즙산에 대한 내성 및 내열성이다. 먼저, 구강으로 섭취하게 되는 프로바이오틱스는 식도를 거쳐 제일 먼저 위에 도착하게 되고, 이때 위산에 견디지 못하면 프로바이오틱스 생균으로 사용가치를 잃어버리게 되는 문제점이 있고, 또한 담즙산은 간에서 합성되어 십이지장으로 분비되는 지방분해 요소로서 세균의 성장과 증식을 억제 하는 기능을 지니고 있으며 특히 장내 유래세균이 아닌 경우 담즙산에 저항성이 없다고 보고된 바 있으며, 생균제 제품 가공처리 과정이 보통 50 ℃ 이상에서 이루어지는 점을 감안 할 때 내열성이 요구된다.
이러한 면에서, 본 발명의 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물은 pH 3 이상의 내산성을 가지고 있으므로 생균제 급이 시, 장내까지 도달할 수 있고, 담즙이 존재하는 인공적인 환경에서 높은 생존력을 나타내고 있으며, 내열성이 매우 강하므로 펠렛형 사료의 제조시나 상온의 유통 및 저장 단계에서 매우 안정하므로 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 사료 내 바실러스 서브틸러스 및 파지 혼합물은 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 포함하는 사료첨가제를 사료 전체 중량을 기준으로, 0.05-10 중량%의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물 혼합물을 포함하는 사료가 개시된다.
한편, 상기 사료첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물은 경제성과 효율성을 고려하여 사료 전체 중량을 기준으로, 0.05 - 10 중량%의 비율로 혼합하였으며, 상기 농도 범위를 벗어나는 경우 10 중량% 초과로 첨가되는 경우에는 항생제 비용 및 사료비용 대비 농가의 부담이 증가될 수 있고, 상기 1-10 kg 포장을 특징으로 하는 사료첨가제의 투여 방법 및 노동력의 문제점을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 축산 농가에서, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물 또는 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산 가축의 식방법이 개시된다.
본 발명에서 배양액이란, 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함한 것, 또는 균주를 접종하여 배양한 후 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 상기 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 상기 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 부가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산 가축의 살모넬라 속(Salmonella sp .), 이.콜라이(E. coli) 및 프로테우스 속(Proteus sp.) 중에서 선택되는 1종 이상에 의한 감염성 질병을 예방하는 방법이 개시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 살모넬라 속 미생물은 살모넬라 겔리나움(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 타이피수이스(Salmonella typhisuis ) 및 살모넬라 더비( Salmonella derby ) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 살모넬라 균은 사람과 동물의 장관에 분포하는 장내세균으로서, 살모넬라 콜레라수이스 및 살모넬라 타이피수이스는 급성패혈증을 일으키고, 이 외에 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 더비 등은 주로 결장염을 일으키는 원인균이다. 살모넬라균 중 대표적 균종인 살모넬라 엔테라이티디스는 달걀과 연관이 크며, 살모넬라 타이피뮤리움은 돼지고기, 가금류 및 소고기와 연관이 크다. 어린 돼지에서는 살모넬라균에 의해 패혈증, 설사, 장염 등을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 이환율과 폐사율이 높으며, 성돈에서는 불현성 감염으로 인한 보균돈이 많아 질병전파의 매개체 역할을 하며, 특히 식육 및 환경오염의 원인이 되기도 한다. 또한, 소의 급성 또는 만성의 소화기 전염병으로 주로 송아지에 다발하며 발열, 장염 및 패혈증상을 주증으로하고 폐염, 뇌염, 관절염, 유산 및 유방염도 일으킬 수 있다. 뿐만 아니라, 가금류의 경우, 살모넬라균에 감염된 산란계로부터 부화한 병아리는 몇 주안에 분변으로 많은 양의 세균을 배출하므로 감염의 원인이 되기도 한다.
이러한 살모넬라 균에 대한 항균효과가 본 발명에 따른 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물에 의해서 확인되었고, 비 특이적 면역반응 활성이 우수한 것으로 확인되었다. 특히, 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라는 서균의 세포벽 성분을 분해하는 작용을 하는 리소자임(lysozyme) 활성을 측정한 결과, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 각각에 대한 리소자임 활성보다 매우 우수한 활성을 나타내므로 감염성 질병을 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물 혼합물을 포함하는 사료를 축산 가축에 급여하는 단계를 포함하는 축산 가축의 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법이 개시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 사료는 5 내지 20 mg/kg/day의 양으로 투여하는 것을 특징으로 한다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백하다.
실시예 1: 유용미생물 및 유해 미생물 분리 및 동정
자연계에 존재하고 있는 유용 미생물 및 유해 미생물을 분리 동정하기 위하여 전라북도 지역 중 총 4지역(군산, 정읍, 김제, 부안)을 중심으로 샘플링을 실시하였다.
샘플링은 1개 지역마다 양계, 축사, 양돈장 중심의 오수 및 주변 환경수를 채수병을 이용하여 1ℓ씩 30여병 가량 채집하였다. 총 4개 지역에서 채집한 시료의 개수는 130개의 샘플을 확보 하였으며, 상온에 보관하고 유용 미생물 및 유해 미생물, Bacteriophage를 분리 하는데 사용하였다.
자연 생태계에서의 유용 미생물을 분리는 1차 적으로 선택 배지를 사용 하여 배양 하였다. 사용 된 선택 배지는 bacillus 동정용 인 Luria Bertani broth(LB, Difco), 유산균 동정용 인 Lactobacilli MRS broth(MRS, Difco), 효모 동정용 인 YM broth & Potato dextrose broth(PDB, Difco)를 사용하였다. 1차적으로 분리한 유용 미생물은 단일집락을 관찰하여 각 유용 미생물의 형태와 유사한 집락을 선택하여 분리 하였다. 또한 유용 미생물을 평판 배지에 계대 배양을 실시하고 정확한 동정을 위하여 API kit를 이용한 생화학적 동정 방법과 Universal primer를 이용한 16S-rRNA Squencing을 통하여 유용 미생물을 최종 동정하였다.
또한, 자연계에서의 유해 미생물을 분리는 위 방법과 동일하게 1차 적으로 선택 배지를 사용 하여 배양 하였다. 사용 된 선택 배지는 Salmonella 분리를 위해 Salmonella Shigella Agar(SSA, Difco) 또는 XLD Agar(XLD, Difco), E. coli 등 장내세균 분리를 위해 MacConkey Agar(MacConkeyA, Difco)를 사용하였다.
유해 미생물 분리 및 동정 방법 또한 유용 미생물과 동일한 방법으로 처리하여 최종 동정 하였다.
각 유용 미생물은 배추 김치 ,열무 김치, 파 김치, 파인애플 박, 한약재 부산물, 분뇨 등의 샘플로부터 배양 결과 각 배지 내에서 총 69개 균주를 분리 하였고 그 중 단일집락 형태에 따라 bacillus sp. 5주, Yeast sp. 2주, lactobacillus sp. 3주를 선정하여 API kit 및 16S-rRNA sequencing & 18S rRNA ITS region Sequencing 을 실시하였고, 또한 유해 미생물은 분뇨 샘플로부터 얻어진 E. coli 및 Salmonella sp .로 추정되는 10주를 선정하여 위 방법과 동일하게 동정하였다.
유용 미생물인 bacillus sp. 5주, Yeast sp . 2주, lactobacillus sp. 3주를 API kit를 이용하여 동정한 결과 bacillus subtillis 4주, bacillus licheniformis 1주를 동정하였다.
5주 모두 동정률은 99% 이상으로 확인되었으며, Yeast sp . 2주는 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia anomala(Candida pellicurosa)로 99 %이상으로 확인되었고, lactobacillus sp. 3주는 Lactobaciilus plantarum, lactobacillus paracasei, lactobacillus fermentum 99.8%이상으로 동정 되었다. 최종 동정하기 위하여 16S rRNA 또는 18S rRNA ITS region Sequencing 수행하여 BLAST search 한 결과 생화학적 실험 동정 결과와 똑같이 동정 되었다. 이로써 유용미생물은 bacillus sp. 5주, Yeast sp . 2주, lactobacillus sp. 3주를 B-1, B-2, B-3, B-4, B-5, Y-1, Y-2, L-1, L-2, L-3로 각각 명명하고 사료첨가제 개발에 있어 최종 유용미생물로 선정하기 위하여 생리적 및 물리적 특성 실험에 사용하였다. 하기 표 1에 상기 미생물의 블라스트(BLAST)를 기재하였다.
Strains Accession Description Score
(bits)		 Identities (%)
B-1 KC757129.1 bacillus subtilis strain GRSW1_B1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2575 100
B-2 JX042469.1 bacillus subtilis strain ACL12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2549 100
B-3 KC172009.1 bacillus subtilis strain JF33 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2586 100
B-4 JX123316.1 bacillus subtilis strain B4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2383 100
B-5 AB743877.1 bacillus licheniformis gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: BCJ 2556 100
Y-1 JN887919.1 Saccharomyces cerevisiae strain Wu-Y2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence 1353 99
Y-2 FJ865436.1 Pichia anomala isolate M10 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; 1029 100
L-1 JX426117.1 lactobacillus plantarum strain CTBRBL22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2582 100
L-2 JF965377.1 lactobacillus paracasei strain BIM B-552D 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2623 100
L-3 JX272056.1 lactobacillus fermentum strain 6.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2614 100
(상기 표 1에서 Identities 값은 0.01%를 반올림하여 구한 값으로 나타내었다.)
유해미생물의 API 20E 결과는 Salmonella sp. 3주로 동정 되었으나 정확한 분류를 알아보기 위하여 유전적 분석인 16S rRNA Sequencing을 수행한 결과 Salmonella sp. 3주, E. coli 4주, Proteus sp. 3주(proteus sp, proteus mirabilis)로 최종 동정 되었다. 또한, Bacteriophage 분리를 위하여 위의 동정된 유해 미생물과 한국 수의유전자원은행으로부터 닭과 돼지로부터 분리한 Salmonella gallinarum, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis 3주를 분양 받아 사용하였다.
실시예 2: Bacteriophage 분리 및 동정
유해 미생물의 용균성 Bacteriophage 분리를 위해 사용된 분리원으로는 전라북도 지역 중 총 4개 지역(군산, 정읍, 김제, 부안)을 중심으로 한 양계, 축사, 양돈장 분뇨, 오수 및 주변 환경수 등을 이용 하였다. 각 Sample은 여과지를 이용하여 1차 적으로 불순물을 제거하고 500ml씩 추출 하여 Bacteriophage 분리에 사용하였다.
선행 연구를 통하여 얻어진 Salmonella sp. 및 E. coli를 Brain heart Infusion agar(BHIA) 상에 37 ℃에서 24시간 배양 후 단일 집락을 선택하여 Brain heart Infusion broth(BHIB) 재 배양 하였다. 그리고 10 mM CaCl2가 첨가 된 BHIC both에 접종하여 37 ℃에서 대수 증식기까지 배양 후 1차 여과 된 sample을 첨가하고 동일한 조건으로 12시간 배양 하였다. Sample이 첨가된 배양액을 5000 rpm, 30min 원심분리하고 상등액을 0.45 ㎛ syringe filter를 이용하여 1차 filtering 후 균을 완벽히 제거하기 위하여 2차로 0.2 ㎛ syringe filter를 사용하였다.
Filtering 된 sample은 BHI agar에 유해 미생물을 1ml정도 취하여 spreading하게 분주하고 5분 정도 건조 한 다음 filtering 된 sample을 10 ㎕ 취하여 건조 시킨 plate위에 떨어트려 동일한 조건으로 건조하고 37 ℃에서 12-24시간 동안 배양 하면서 monolayer spot plaque 형성을 확인하였다.
spot이 형성된 sample은 SM bffer를 이용하여 10진 희석 한 다음 plaque assay를 수행하고 single plaque를 순수 분리하였다. 순수 분리 된 Bacteriophage는 Target 미생물과 재 혼합 배양하고 0.45 ㎛ syringe filter 또는 0.2 ㎛ syringe filter 이용하여 반복적 수행으로 Bacteriophage를 증폭하였다. 증폭된 Bacteriophage를 농축시키기 위해 20% polyehthylene glycol 6000(PEG 6000)과 3% NaCl을 넣고 4 ℃에서 하룻밤 정치한 후 10,000 rpm에서 30분 원심 분리 하는 PEG 침전법을 사용하였다.
본 연구를 통해 전북 4개 지역 중심으로 양계, 축사, 양돈장 오수 및 분변 등 130여개의 샘플로부터 Salmonella sp. 와 E. coil, Proteus sp.의 용균성 Bacteriophage를 분리한 결과 총 11개의 용균성 Bacteriophage를 분리 하였으며, 용균성 Bacteriophage의 plaque morphology는 Table 9와 같다. plaque의 형태로는 크게 두 가지 형태로 분리 되며 지름이 약 4 mm 정도 크기의 clear한 용균성 Bacteriophage와 지름이 약 2 mm이하 인 clear 형태와 unclear 형태를 갖는 Bacteriophage로 나뉘어 분리 하였다.
숙주 저해 결과 수의유전자원은행으로부터 분양받은 Salmonella gallinarum(KSG), Salmonella enteritidis(KSE), Salmonella typhimurium(KST)과 Salmonella sp.를 lysis시키는 것으로 나타났으며, 분리된 Bacteriophage는 같은 숙주 범위 외에서도 Lysis를 유발하는 것으로 확인 되었다. Gssp1는 Salmonella sp. 그룹 과 E. coli 그룹 모두 lysis를 유발 하지만, Proteus sp. 그룹에서는 lysis 현상을 찾아보지 못하였다. 또한 Gsep 1, 2는 E. coli 그룹과 Proteus sp. 그룹 모두 lysis를 유발 하였지만 Salmonella sp. 그룹은 lysis 시키지 못 하였다. 이러한 현상은 Bacteriophage의 숙주 특이성으로 생각되어진다. 그러나 각 host strain 간에 lysis 유발 시키는 특성을 이용하여 분리된 Bacteriophage들을 cocktail 형식으로 혼합하여 사용하면 Salmonella sp., E. coli, Proteus sp.의 유해 균주의 제어에 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
실험예 1: 유용 미생물의 생리적 특성 분석
(1) 내산성 시험
Probiotics 생균제로써의 조건 중 가장 기본적으로 갖추어야 할 부분은 산에 대한 내성력을 갖추어 생존력이 높아야 한다는 점이다. 즉 구강으로 섭취하게 되는 probiotics는 식도를 거쳐 제일 먼저 위에 도착하게 되어 위산과 맞다드려 진다. 이때 위산에 견디지 못하면 probiotics 생균으로 사용가치를 잃어버리게 되므로 자연 생태계 및 각 시료에서 분리한 유용 미생물에 대하여 내산성 대하여 특성을 조사하였다.
각 미생물에 배양에 맞는 배지를 0.1 M HCl을 이용하여 pH 2, 3, 4, 5로 제조 한 다음 최종 배지 양에 각 미생물 배양액을 10% 접종하고 37 ℃에서 배양 하였다. 배양된 혼합 샘플을 1ml 씩 취하여 Spetrophotometer를 이용하여 620 nm에 매 3시간 간격으로 24시간 동안 측정하였다.
도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 배추김치 ,열무김치, 파김치, 파인애플 박, 한약재 부산물, 분뇨 등에서 분리한 유용 미생물을 pH 2, 3, 4, 5 조건으로 24시간 측정 결과 bacillus 그룹인 B-1, B-2, B-3, B-4, B-5의 경우 pH 5 조건에서는 거의 성장에 변화가 없으나, pH 3 이하에서는 성장에 어느 정도 영향을 끼치는 것으로 나타났다. 그러나 pH 4 또는 pH 3 범위에서도 늦게 성장하는 점을 보아 내산성을 띄는 것으로 판단되었다(도 1 참조).
Yeast의 경우 두 종 모두 pH 3 이상 조건에서 성장에 대한 영향을 미치지는 못한 것으로 나타나 안정적인 활성으로 보였으며, pH 2 에서도 초기에 성장을 하지 못 하였지만 24시간 이후 성장하는 것을 확인됨에 따라 강한 산성 조건에서도 내산성을 가지는 것으로 확인되었다(도 2참조).
lactobacillus 그룹인 L-1, L-2, L-3의 경우 pH 5 조건에서는 가장 안정적인 활성을 보이며 점차 시간이 지나갈수록 pH 3, 4 조건에서도 안정적인 활성 조건을 보이는 것으로 확인 되었다(도 3참조).
일반적으로 probiotics 생균제로 쓰이는 균주들은 pH 3 이하에 내산성을 조건을 가져야하는 것으로 알려져 있으므로 이에 본 연구 시험 결과 B-1, B-2, B-3, B-4, B-5, Y-1, Y-2, L-1, L-2, L-3 의 균주들은 pH 3이상의 내산성을 가지고 있으므로 생균제 급이 시, 장내까지 도달 할 수 있을 것으로 판단된다.
(2) 내담즙성 시험
Probiotics 생균제로 사용하기 위한 또 하나의 조건은 십이지장에서 분비 되는 담즙산에 대한 내성이다. 담즙산은 간에서 합성되어 십이지장으로 분비되는 지방분해 요소로서 세균의 성장과 증식을 억제 하는 기능을 지니고 있으며 특히 장내 유래세균이 아닌 경우 담즙산에 저항성이 없다고 보고되고 있으므로 본 발명에서는 하기 실험을 수행하였다.
내담즙성 시험은 유용 미생물을 각각의 배지에 bile salt(Sigma, USA)를 0.1%, 0.5%, 1%(w/v) 첨가 한 후 분리 된 유용 미생물 균주(2 × 108 CFU/ml)를 접종 하여 37 ℃에서 6, 12, 24시간 배양하며, 각 첨가 배지에서 100 ㎕ 취하여 10 배의 희석 배수로 연속적으로 희석하여 각각의 배지에 도말하고 37 ℃에서 24-48 시간 배양 후 생균수를 측정 하였다.
도 4 및 6에 나타낸 바와 같이, 상기 내산성을 지닌 유용 미생물들을 담즙산이 포함된 각 배지에 성장도를 측정한 결과, bacillus 그룹인 B-1, B-2, B-3, B-4, B-5의 경우 초기 6시간 까지 많은 영향을 받는 것으로 보였으나 점진적으로 성장하는 것을 확인 할 수 있었으며, 대체적으로 0.5% 이상 담즙산이 첨가된 그룹은 초기 균수 보다 다소 생균수의 값이 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다. bacillus 그룹 중 B-3, B-4는 담즙산에 농도 간(0.1-1%)에 가장 안정적인 활성으로 보였다(도 4 참조).
Yeast의 경우 시험 결과 담즙산에 대한 저항성은 다른 그룹의 유용미생물 보다 가장 안정적인 활성도를 보였다(도 5 참조). 이러한 결과는 유 등(2006)이 보고한 kefir로부터 분리된 Yeast에 대해 0.1-1%의 내담즙산 시험과 유사한 결과를 보였다. Y-1, Y-2 모두 강한 내산성을 지니고 있어 담즙산에 농도에 변함없이 성장하는 것을 알 수 있었다.
lactobacillus 그룹인 L-1, L-2, L-3의 경우는 0.1% Bile salt 첨가배지에서는 거의 변함없이 성장도를 유지 하는 것으로 나타났으나 0.5% Bile salt 이상 첨가그룹에서는 0.1% 그룹 보다 다소 떨어지는 것으로 나타났다(도 6 참조). 그러나 L-1을 제외한 나머지 두 균주는 1% Bile salt에서도 104 CFU/ml 이상으로 존재함으로써 내담즙성을 가지는 것으로 판단된다.
이들 결과를 고려해 볼 때 선발 균주는 담즙이 존재하는 인공적인 환경에서 높은 생존력을 보여 생균제로 사용 가능할 것으로 보였다.
(2) 내열성 시험
생균제 제품 가공처리 과정이 보통 50 ℃ 이상에서 이루어지는 점을 감안 할 때 내열성에 대한 고려가 반드시 필요한 부분이다. 일반적으로 생균제 제제의 가공 과정에서 가장 문제가 되는 것이 미생물의 안정성과 더불어 보존성이 거론되고 있다. 또한 제품 출하 시 상온에서 유통 저장되고 보관기간이 길어지는 경우, 균주의 급격한 활력저하와 사멸율이 커지는 점을 고려해야 될 부분이라 보고되고 있으므로 본 발명에서는 하기 실험을 수행하였다.
자연 생태계 및 각 시료에서 분리한 유용 미생물에 대하여 열에 대한 내성을 조사하기 위하여, 유용 미생물을 각각의 배지에서 24 시간 배양 하고 배양액을 1 ml씩 취하여 50 ℃에서 30, 60, 90, 120, 150 분간 항온 수조에 정치 시켰다. 매 측정 시간 마다 배양된 샘플 100 ㎕ 취하여 10배의 희석 배수로 연속적으로 희석하여 각각의 배지에 도말 하고 37 ℃에서 24-48시간 배양 후 생균수를 측정 하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 분리된 균주는 120분간의 50 ℃ 열처리 시 Y-2를 제외 한 모든 균주에서 90% 이상에 생존율을 보여 상당한 내열성을 나타냈다. 그러나 효모 그룹인 Y-2는 60분 동안 103 CFU/ml 이상을 유지 하였으나, 그 이상의 시간에서는 소멸 되었다. 일반적으로 효모는 40 ℃이상에서는 생존율이 감소한다고 보고되고 있다. 하지만 본 연구에서 분리된 Y-2의 경우 50 ℃에서 120분 이상 사멸하지 않았으며 오히려 증가하는 것으로 보아 강한 내열성이 있는 것으로 나타났다. 분리된 유용 미생물 10주에 대한 시험 결과 내열성 강한 편으로 펠렛형 사료의 제조시나 상온의 유통 및 저장 단계에 안정할 것으로 판단된다.
(4) 세포외 효소 시험
미생물이 분비하는 Protease, Cellulase, Amylase 등의 가수 분해 효소는 전분 및 단백질 같은 고분자 물질의 분해를 통한 소화력의 증진과 다양한 유기산, 올리고당, 펩톤, 펩티드, 미량 원소와 각종 생리 활성물질을 공급하여 가축의 성장 촉진을 도모 한다고 있으므로 본 발명에서는 하기 실험을 수행하였다.
유용 미생물의 세포외 효소 활성 시험은 Protease(단백질 분해 효소), Amylase(탄수화물 분해 효소), Cellulase(섬유소 분해 효소)에 대하여 조사하였다.
각 분해 효소의 측정용 배지로는 Protease의 경우 Skim milk를 LB agar에 2%정도 첨가하여 제조하였으며, Amylase는 Soluble starch를 LB agar에 2%정도 첨가 제조하고, Cellulase는 CMC(Carboxymethyl cellulose)를 위와 같은 방법으로 제조하여 사용하였다. 각 측정용 배지에 유용 미생물을 10 ㎕씩 한 방울 정도 떨어트려 37 ℃에서 24-48시간 배양 하며 효소 활성에 의해서 분해되는 clear zone 크기를 측정하였다.
본 연구에서 분리 된 유용 미생물 10주에 대하여 단백질 분해 효소 (Protase), 탄수화물 분해 효소 (Amylase), 섬유소 분해 효소(Cellulase)분비능을 측정한 결과, bacillus 그룹의 경우 B-5를 제외한 모든 효소능 시험에서 가장 효소활성이 높게 나타났다. B-5의 경우 다른 bacillus 보다는 미약하나 Yeast, lactobacillus 효소능과 비교 시 높은 활성도를 보였다. Yeast 그룹의 경우 Y-2만 Cellulase의 분해능이 우수한 것으로 보였으며, 나머지 효소능은 관찰되지 않았다(data not sown). lactobacillus 그룹의 경우 L-1, L-2는 세 가지 효능에서 관찰되었고, L-3의 경우 Protease, Cellulase 효소만 분비하는 것으로 나타났다. 이중 L-1은 세 가지 효소능에 효소활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
따라서, 생균제로 사용하기 위하여 내산성 및 내담즙산, 내열성이 갖추어야 되지만 생균제의 사용되는 균주의 효소능 또한 앞으로는 생균제 이용에 있어 갖추어 진다면 동물들의 소화기능 및 흡수율을 증가시키고 사료의 효율을 높여 고품질의 가축생산을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 2: 분리 된 Bacteriophage 생리적 특성 및 물리적 특성
(1) 온도 및 pH 안정성 조사
106 PFU/ml 인 분리된 phage 액 0.1 ml를 0.1 M HCl 이용하여 pH 2, 3, 4, 5, 7, 10으로 조정한 SM buffer 0.9 ml에 넣고 37 ℃에서 24시간 반응 시킨 뒤 각 pH의 phage 액과 균액을 흡착시켜 생성되는 plaque 수를 측정하여 pH안정성을 조사하였고, 106 PFU/ml 인 분리된 phage 액 0.1 ml를 SM buffer 0.9 ml에 첨가하여 4 ℃, 20 ℃, 37 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ 항온수조에서 반응시킨 뒤 2, 4, 6, 12시간 간격으로 각 온도의 phage 액과 균액을 흡착시켜 생성되는 plaque 수를 측정하여 온도 안정성으로 조사하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, Salmonella sp .로부터 분리된 bacteriophage 3 종을 가지고 pH 2-10으로 조정한 SM buffer에서 24시간 37 ℃에서 반응시킨 결과, Salmonella sp .로부터 분리된 bacteriophage 모두 pH 4-7 범위까지 모두 안정적이었으며, pH 3 조건에서 103 PFU/ml 이상으로 생존하였으며 염기성 조건 보다 산성 조건에 더 생존율이 좋은 것을 알 수 있었다. 그러나 pH 2 범위에서는 생존하지 못한 것으로 나타났다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 온도의 안정성을 조사하기 위하여 4 ℃, 20 ℃, 37 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ 항온수조에서 반응시킨 결과, Salmonella sp .로부터 분리된 bacteriophage 모두 4-37 ℃에서는 안정적으로 나타났다. 그러나 50 ℃에서는 4시간 까지 안정적이었으나, 그 이후 시간부터 점차 감소하는 경향을 보였으며, Gssp2, Gssp3는 60 ℃에서도 6시간 이상 생존하는 것으로 나타나 상당한 내열성을 가지고 있는 것으로 판단된다.
(2) 분리 Bacteriophage의 형태학적 특성
분리된 Bacteriophage의 형태학적 특성을 분석하기 위해 농축 된 Bacteriophage액을 순수 정제 하였다. 정제 과정은 CsCl 밀도구배 원심 분리법를 이용하였다. CsCl의 구배를 ρ 1.70/1.50/1.45/1.40/1.30/1.20으로 하고 그 위에 전 처리한 Bacteriophage액을 올린 후 70,000 × g(Beckman, LE-80K ultracentrifuge, USA), 4 ℃에서 8시간 동안 원심 분리 한 후 20-gause 주사기로 ρ 1.45-1.40사이에 buffy coat의 Bacteriophage 층을 회수하고 세척하여 정제 하였다. 정제한 Bacteriophage는 0.2 syringe filter로 여과 하였으며 여과된 Bacteriophage 샘플을 1010 PFU/ml 수준으로 2% Uranyl acetate 및 lead citrate를 이용하여 negative stain을 수행 한 후 100 kV 하에서 투과 전자 현미경(HITACHI H-7650, JAPAN)을 통해 형태학적 특성을 확인 하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 분리된 용균성 (A) Salmonella spp. bacteriophage(Gssp1), (C) Salmonella spp. bacteriophage(Gssp3)는 둥글고 긴 head와 짧은 tail를 가진 형태이고, Gsep5는 둥근 육각형의 head와 짧은 tail를 가진 형태로 이들은 podoviridae family에 속하는 것으로 확인되었다. 또한 (B) Salmonella spp. bacteriophage(Gssp2) 및 (E) Proteus spp bacteriophage (Gspp1)은 둥근 육각형의 head와 긴 비수축성 tail를 가진 형태였으며, siphoviridae family에 속하는 것으로 나타났다.
(D) Escherichia coli bacteriophage(Gsep5)는 둥근 육각형의 head와 짧은 tail를 가진 형태로 이들은 podoviridae family에 속하는 것으로 확인되었다. 그러나 Gssp3와 Gsep5는 같은 그룹에 속하지만 bacteriophage head의 크기가 서로 상이하게 나타나, 같은 family에서도 다양한 Bacteriophage가 존재한다는 것을 알 수 있었다.
(3) Bacteriophage의 DNA 추출 및 확인
정제한 Bacteriophage를 0.5 M EDTA와 10% SDS, proteinase K(2.5 mg/ml)을 처리하여 65 ℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 동량의 phenol, phenol/chloroform, chloroform으로 각각 처리하였으며 이어서 3 M sodium acetate를 첨가하고 실온에서 2배 absolute ethanol를 넣은 후 70 ℃에서 15분간 저장하여 DNA를 침전 시켰다. 침전물에 70% ethanol 1 ml을 처리한 후 원심분리 하여 침전물을 건조시키고 TE완충액에 용해 시켜 70 ℃에 보관하였다. 추출한 Bacteriophage 핵산을 ethdium bromide 5 /ml가 첨가된 1% agarose gel에서 100 V의 전압으로 전기영동 한 후 UV-transilluminator(SL-20, USA)에서 관찰하였다. 또 추출된 Bacteriophage 핵산이 DNA인지 RNA인지를 확인하기 위하여 각각 DNase 100 /ml 및 RNase 100 /ml으로 37 ℃에서 2시간 처리한 핵산과 대조군으로 효소를 처리 하지 않은 핵산을 함께 1% agarose gel에 전기영동 시킨 후 UV 하에서 관찰 하였다.
각 Bacteriophage의 phage chromosome를 추출하여 전기영동을 수행한 결과 Salmonella sp .로부터 분리된 Bacteriophage의 크기는 각각 서로 다른 크기의 genomic DNA를 가지고 있는 것으로 나타났으며, E. coli bacteriophage 1종, Proteus sp . bacteriophage 1종의 genomic DNA는 유사한 크기를 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 그러나 같은 family에 속하나 서로 다른 숙주 저해 특성을 나타내고 있어 서로 다른 Bacteriophage로 판단된다. 그리고 분리한 Bacteriophage의 DNase와 RNase를 처리한 결과 DNase를 처리한 것은 효소에 의해서 분해되어 밴드를 관찰할 수 없었으며 RNase를 처리한 것은 Bacteriophage 핵산과 동일한 위치에 밴드가 확인되었다. 그 결과 모든 Bacteriophage 핵산은 DNA로 구성된 것을 확인하였다.
(4) Bacteriophage의 구조 단백질 분석
Bacteriophage 구조 단백질 분석은 정제된 Bacteriophage액 20 에 5배 농축의 loading buffer를 넣은 후 100 ℃에서 5분간 가열하여 단백질들의 시스테인결합을 끊어 순수하게 단백질 크기로만 분리하고 아크릴아미이드 등이 첨가된 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 100 V로 50분간 SDSPAGE하였다. 그리고 Coomassie blue법으로 2시간 염색한 후 10% acetate와 15% methanol을 섞은 탈색액으로 탈색시켜 밴드를 확인 후 gel은 gel dry-film에 부착시켜 Bacteriophage의 구조 단백질을 관찰하였다.
Salmonella sp .로부터 분리된 bacteriophage 3주 및 E. coli bacteriophage 2주, Proteus sp . bacteriophage 1주의 구조단백질을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과, Salmonella sp ., E. coli, Proteus sp . Bacteriophage들은 다양한 구조 단백질 분획을 가지고 있는 것으로 확인됐다. GSSP1, GSSP3, GSPP1은 같은 Family에 속하지만 서로 다른 형태를 가지고 있으므로 구조 단백질 분획 및 단백질의 양 또한 서로 다르게 보유 하고 있는 것으로 판단된다.
실험예 3: Bactriophage -유용 미생물 복합제의 살균능력 평가
Bactriophage-유용 미생물을 복합제의 살균능력을 분석하기 위하여 in vitro상에서 실험을 수행하였다. 실험은 4개의 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다. 각 실험군은 BHI broth 5 ㎖에 표 2와 같이 첨가 후 30 ℃에서 배양하였다. 배양 0, 6, 12, 18, 24시간 및 48시간째에 각각의 sample에서 100 ㎕ 취하여 10배의 희석 배수로 연속적으로 희석하고 SS agar 또는 XLD agar에 평판 도말법을 이용하여 각각의 배지에 도말하고 37 ℃에서 24-48시간 배양 후 Salmonella 의 생균수를 측정 하였다.
Bactriophage-유용 미생물을 복합제의 살균능력을 분석하기 위한 샘플 처리구
Group Sample 처리 농도
실험군 1 Salmonella sp.(2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, bacillus sp, Yeast sp, lactobacillus sp(BLY)(1×107 CFU/㎖) 100 ㎕, Salmonella sp. bacteriophage (2×105 PFU/㎖) 100 ㎕
실험군 2 Salmonella sp.(2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, bacillus sp, Yeast sp, lactobacillus sp(1×107 CFU/㎖) 100 ㎕
실험군 3 Salmonella sp.(2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, Salmonella sp. bacteriophage(2×105 PFU/㎖) 100 ㎕
대조군 Salmonella sp.(2×108 CFU/㎖) 100 ㎕
도 11에 나타낸 바와 같이, in vitro 상에서 Salmonella sp.로부터 분리된 bacteriophage-유용미생물 혼합액(BLY)을 결합시켜 살균 능력에 대한 평가 결과는 Fig. 24에 나타내었다. Salmonella sp. bacteriophage와 BLY 및 Salmonella sp.를 처리한 샘플에서는 배양 6시간째부터 Salmonella sp.의 생균수를 확인한 결과 초기 균수 값보다 급격히 줄어있는 것을 알 수 있었으며, 12시간까지는 유지 상태로 존재하고 그 이후부터 급격히 감소하여 24시간째는 Salmonella sp.의 검출이 되지 않았다. Salmonella sp. bacteriophage와 BLY를 첨가한 샘플은 12시간까지 Salmonella sp.만 첨가된 대조군 샘플과 같이 증가되었으나 그 이후 시간에서는 Salmonella sp.를 증식을 억제 시켰으며 점차 시간이 지날수록 천천히 감소되는 것을 확인 하였다. Salmonella sp. bacteriophage와 Salmonella sp.를 첨가한 샘플에서는 6시간째의 Salmonella sp.의 검출수가 가장 낮게 나왔지만 점차 시간이 지날수록 대조군 샘플과 같아지는 현상을 보였다.
따라서, 생균 복합액과 Bacteriophage에 조합은 생균제 단일적으로 사용보다는 복합적으로 사용을 한다면 기존 생균제 투여시 장내에 유해 세균을 Bacteriophage가 빠르게 억제시켜 유용한 미생물이 장내에 빠르게 균총화 및 점착을 이를 수 있게 할 수 있을 것으로 판단된다.
1. 선천적 면역반응 실험(이하, 실험예 4 내지 8)
(1) 실험동물
병아리는 50±20 g의 건강한 암컷을 ㈜동우(DONGWOO Co., Ltd.)에서 분양받은 것으로 육추기(주식회사 다나와) 1대 당 50마리 이하로 수용하고 35±1 ℃에서 5일 간 순치시킨 후에 실험에 사용하였다.
(2) 실험사료
본 연구에서는 ㈜리틀펫에서 구입한 병아리 사료를 기초사료로 사용하였으며 총 4가지의 실험사료를 표 3과 같이 제조하였다. 모든 사료는 실온에 보관하며 사용하였으며 실험이 종료될 때까지 사료의 품질이 일정하게 유지됨을 확인하였다.
기초사료에 Bactriophage-생균제 복합제 첨가 처리구
Group 기초사료 첨가 농도
실험군 1 bacillus sp.(2×107 CFU/g), lactobacillus sp.(2×107 CFU/g), Yeast sp.(2×107 CFU/g), Salmonella sp. bacteriophage(2×107 PFU/g)
실험군 2 bacillus sp.(2×107 CFU/g), lactobacillus sp.(2×107 CFU/g), Yeast sp.(2×107 CFU/g)
실험군 3 Salmonella sp. bacteriophage(2×107 PFU/g)
대조군 Basic feed
기초사료에 첨가될 Bacteriophage생균제 복합제(BLY-Ph)의 적정농도를 결정하기 위하여 bacillus sp(2×107 CFU/g), lactobacillus sp(2×107 CFU/g), Yeast sp(2×107 CFU/g) 및 phage(2×107 PFU/g)를 기초사료에 0.1%, 0.2% 및 0.5%로 혼합 첨가하여 21수씩 할당 된 각 group에 10일, 20일 및 30일간 사료를 공급하면서 각각의 성장률과 선천성 면역반응을 비교하였다.
(3) 혈청 수집
혈청 수집을 위해 병아리의 동맥구에서 혈액을 채취하였다. 혈액은 4 ℃에서 24시간 동안 응고시킨 후 1200×g에서 5분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 lysozyme 활성 분석에 사용하였다.
(4) 백혈구 분리
백혈구의 수집방법은 Santarem 등(1997)의 방법을 약간 수정하여 사용하였다. 백혈구 수집을 위해 병아리를 개복하여 F낭과 비장을 적출하였다. 적출한 F낭과 비장은 mesh에 통과시켜 잘게 쪼갠 후 Histopaque-1077(Sigma)을 이용하여 2500×g에서 30분간 원심분리 한 후 buffy-coat층에서 백혈구를 수집하였으며 Dulbecco’s modified Eagle’ medium(DMEM)으로 30×g에서 5분간 2회 세척하였다. 분리된 세포는 혈구계산판(FORTUNA, GERMANY)을 이용하여 세포수(106 cell/㎖)를 확인하였으며 세포를 이용한 모든 실험에 사용되었다.
실험예 4: Bacteriophage-생균제 복합제의 가금류 성장률 측정
사료 농도별 및 사료 죵류별 실험에서 각 group당 병아리의 중량을 실험 전 처음 측정 하였으며 10일, 20일 및 30일간 사료를 공급한 후 최종 중량을 측정하여 각각의 총 증체량을 사육수수로 나누어 1수당 최종무게로 산출하였다. Robertson 등(2000), Felix and Sudharsan(2004) 및 Venkat 등(2004)의 방법에 따라 증체량, 증체율, 특수성장률 및 사료효율을 다음과 같이 산출하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
Weight gain(g) = Final weight(g) - Initial weight(g)
Percent weight gain(PWG) = [100 ×(Final weight - Initial weight)/Initial weight]
Specific growth rate(SGR) = [{LN Final weight(g) - LN Initial weight(g)}/DAY] × 100
Feed conversion ratio(FCR) = Total feed given(g) / Weight gain(g)
(1) 사료 농도별 성장률
DAYS Treatments
Control 0.1%(BLY+P) 0.2%(BLY+P) 0.5%(BLY+P)
Initial weight(g) 0 58 58 58.1 58.57
Final weight(g) 10 352.86 361.66 368.24 373.58
20 584.29 592.39 601.27 605.57
30 1025.71 1032.3 1042.37 1048.64
weight gain(g) 10 294.86 303.66 310.14 315.01
20 526.29 534.39 543.17 547
30 967.71 974.3 984.27 990.07
PWG(%) 10 508.38 523.55 533.80 537.84
20 907.40 921.36 934.89 933.93
30 1668.47 1679.83 1694.10 1690.40
SGR(%) 10 18.06 18.3 18.48 18.63
20 11.55 11.62 11.69 11.73
30 9.58 9.6 9.63 9.65
FCR 10 1.32 1.29 1.26 1.24
20 1.68 1.65 1.62 1.61
30 1.94 1.93 1.91 1.90
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph 첨가사료에 의해 30일 동안 육계를 사육한 결과 육계는 대조군을 비롯하여 모든 BLY-Ph 처리그룹에서 100% 생존하였다. 육계의 성장률은 10일, 20일, 30일째 모두 대조군에 비해 BLY-Ph 처리그룹에서 높았으며 또한 농도 의존적으로 성장률이 증가하는 것으로 관찰되었다. 특수성장률과 증체율도 BLY-Ph 처리군이 대조군에 비해 높은 것으로 나타났다. 사료효율은 대조군과 BLY-Ph 처리군간 큰 차이는 나타나지 않았지만, BLY-Ph 처리군이 대조군에 비해 더 좋았다. 성장률은 BLY-Ph 0.5% 처리군이 BLY-Ph 0.2% 처리군 보다 높았으며, BLY-Ph 0.2% 처리군은 BLY-Ph 0.1% 처리군보다 높았다. 사육 10일째에서는 0.5% BLY-Ph 그룹이 0.2% 처리 그룹에 비해 약 5 g정도 증체의 차이를 보이고 0.2% 처리 그룹은 0.1% 처리 그룹보다 약 7 g정도 더 증체되었음을 알 수 있었다. 사육일수가 지날수록 0.2% BLY-Ph 그룹이 0.1% 처리그룹에 비해 성장률의 차이가 더욱 커지는 것으로 나타났다. BLY-Ph 첨가사료는 0.1%, 0.2% 및 0.5% 각각을 첨가하여 급이 하였을 시 모든 그룹에서 나타나는 성장률이 일반사료에 비해 증가하였지만 0.2%와 0.5% 그룹 간에는 큰 변화가 없었으며 0.1%와 0.2%그룹 간에는 확실한 차이가 있는 것으로 나타났다.
(2) 사료 종류별 성장률
DAYS Treatments
Control Phage BLY BLY+Phage
Initial weight(g) 0 37 37.34 36.67 36.67
Final weight(g) 10 233.33 241.38 249.76 253.85
20 555.5 561.25 563.75 575.6
30 822.5 828 833.5 842.5
weight gain(g) 10 196.33 204.04 213.09 217.18
20 518.5 523.91 527.08 538.93
30 785.5 790.66 796.83 805.83
PWG(%) 10 530.62 546.44 581.1 592.26
20 1401.35 1403.07 1437.36 1469.67
30 2122.97 2117.46 2172.97 2197.51
SGR(%) 10 18.42 18.66 19.19 19.35
20 13.54 13.55 13.66 13.77
30 10.34 10.33 10.41 10.45
FCR 10 1.48 1.44 1.37 1.34
20 1.67 1.66 1.64 1.6
30 1.99 1.98 1.96 1.94
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 육계를 4가지의 사료 유형별로 30일 동안 사육한 결과 대조군을 비롯한 모든 그룹에서 100% 생존하였다. 육계의 성장률은 10일, 20일 및 30일째 모두 BLY, Ph 및 대조군 처리그룹에 비해 BLY-Ph 처리그룹에서 평균적으로 높게 나타났다. 또한 특수성장률과 증체율도 BLY-Ph 처리그룹이 다른 그룹에 비해 높았으며 사료효율 또한 다른 그룹에 비해 BLY-Ph 처리그룹에서 가장 높은 것으로 나타났다. 증체량은 BLY-Ph 처리그룹이 BLY 처리그룹 보다 높았으며 BLY 처리그룹은 Ph만 처리한 그룹보다 높은 것으로 관찰되었고, Ph만 처리한 그룹은 대조군보다 높은 성장률을 나타내었다.
실험예 5: 가금류를 이용한 Bacteriophage-생균제 복합제의 Reactive oxygen intermediates(ROI) 활성 측정
ROI는 superoxide anion(O2), hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl-radical(OH·)과 같은 활성산소 유도체들로서 식세포작용에 있어서 중요한 역할을 하고(Babior, 1984), 비 특이적 면역반응의 일종으로 백혈구의 식세포 작용에 의해서 생기는 중간대사 산물인 활성산소의 생성유무와 수준을 측정하기 위해 nitroblue tetrazolium(NBT)의 환원 능력을 조사하였다(Secombes 등 1988).
F낭과 비장에서 분리한 백혈구 200 ㎕를 96 well plate에 넣고 30×g에서 5분간 원심분리 하였다. PBS로 2회 세척한 후 phorbol myristate acetate(PMA, 1㎍/㎖)를 첨가한 NBT(1㎍/㎖)를 각각 100 ㎕씩 첨가하여 25 ℃의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 30×g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한 후 PBS를 첨가하여 2회 세척하였다. 세척 된 백혈구에 70% methanol로 고정하고 PBS로 2번 세척 후 120 ㎕ KOH와 140 ㎕ dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma)를 첨가 후 Micro plate reader(Sunrise, TECAN)로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(1) 사료 농도별 ROI 활성
도 12에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph를 0.1%, 0.2% 및 0.5%를 각각 첨가한 사료를 30일 동안 공급하고 10일, 20일 및 30일 째에 육계의 F낭과 비장에서 분리한 백혈구를 대상으로 ROI의 생성물을 대조군과 비교하였다. 농도별로 BLY-Ph를 첨가한 사료를 공급한 그룹에서의 ROI의 수치는 0.1%를 제외하곤 모두 유의성 있게 높게 나타났다(p < 0.05). 사료 공급 후 10일, 20일 및 30일 째의 0.5% BLY-Ph 그룹에서는 각각 대조군과 0.1% 및 0.2%를 첨가한 그룹에 비하여 가장 높은 유의적인 차이(p < 0.05)가 관찰되었다. BLY-Ph 0.2% 첨가 그룹에서도 0.5%보단 낮은 수치를 보여주었지만 대조군과 0.1% 그룹에 비해 높은 유의적인 차이를 나타내었다(p < 0.05). 0.5%를 첨가한 그룹은 0.2와 0.1%를 첨가한 그룹보다 월등히 높은 것으로 나타났다. 또한 0.2%를 첨가한 그룹도 0.1%와 대조군 그룹에 비해 상당히 높은 ROI 활성을 나타내었다. 이상의 결과들로 보아 phage와 복합 생균제를 혼합하여 사료에 첨가하여 육계에 공급하였을 때 선천적 면역반응 중 세포성 면역의 중요한 지표가 되는 ROI 활성이 농도 의존적으로 상당히 증가(p < 0.05)하는 것으로 나타났다.
(2) 사료 종류별 ROI 활성
도 13에 나타낸 바와 같이, 4개의 그룹으로 사료를 공급한 그룹에서의 ROI의 수치는 Ph그룹을 제외하고 BLY와 BLY-Ph 그룹이 대조군에 비교하여 유의성 있게 높게 나타났다(p < 0.05). BLY-Ph 그룹은 10일, 20일 및 30일째 모두 BLY 그룹보다 유의적으로 높은 수치(p < 0.05)를 보여주었다. 반면, Ph를 공급한 그룹은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Ph를 첨가한 그룹은 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았지만 평균적으로는 조금 높은 수치를 나타내었다. BLY를 처리한 그룹은 대조군과 Ph를 처리한 그룹보다 높은 유의적인 차이를 보이는 것으로 확인되었다.
실험예 6: 가금류를 이용한 Bacteriophage-생균제 복합제의 Phagocytosis 활성 측정
백혈구의 phagocytic activity (PA)는 Sib 등(2012)의 방법을 약간 수정하여 측정하였다. Chamber slide (Thermo scientific, Nunc)에 분리한 백혈구를 200 ㎕씩 분주한 후 25 ℃의 암실에서 12시간 동안 배양하였다. 배양 후에 zymosan(1×106 cell/㎖, Sigma)을 well당 10 ㎕씩 분주한 후 25 ℃의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에 30×g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한 후 PBS를 첨가하여 2회 세척하였다. 세척 된 백혈구를 70% methanol로 고정하고 30×g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. Camber slide의 덮개와 well 을 분리하여 상온에서 건조시킨 후 고무를 제거하여 다시 건조 시켜주었다. 건조 후에 wright giemsa stain염색 용액을 첨가하여 2분간 염색하고, wright giemsa stain염색액이 있는 상태에서 완충액을 같은 양을 첨가하여 4분간 처리하였다. 물로 충분히 세척하여 여분의 염색액을 완전히 제거한 후 건조 시켜주었다. 건조 후에 광학현미경(Olympus)으로 검경하였다. 무작위로 100마리의 백혈구 숫자를 센 후 zymosan을 잡아먹은 백혈구의 수를 세어 아래와 같은 공식을 이용하여 PA를 구하였고 식세포작용을 한 백혈구의 숫자를 zymosan의 수로 나누어 phagocytosis index(PI)를 구하였다.
phagocytosis activity (PA) = 탐식 세포 수 / 총 세포 수 × 100
phagocytosis index (PI) = zymosan의 수 / 탐식 세포 수
(1) 사료 농도별 Phagocytosis 활성
도 14에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph가 첨가된 사료를 공급한 그룹들 중 0.5% 그룹에서 가장 높은 PA 활성이 나타났으며 0.2%를 첨가한 그룹도 대조군과 0.1%를 첨가한 그룹에 비해 유의적으로 높은 활성 차이(p < 0.05)를 나타내었다. 그러나 0.1%를 첨가한 그룹은 대조군에 비해 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p > 0.05). PI는 10일째를 제외하곤 BLY-Ph를 0.2%와 0.5% 첨가한 그룹에서 대조군과 0.1%그룹에 비해 모두 유의적인 차이를 보여주었다(p < 0.05). 10일째에서도 평균적으로는 차이가 나타났지만 확률적인 차이를 보여주지 못하였다. 또한 0.1%그룹은 대조군과 10일, 20일 및 30일 모두 평균적으로는 높았으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 0.2%와 0.5%의 phage와 복합 생균제를 첨가했을 때 대식세포의 식세포 활동을 증가시키는 것으로 나타났다.
(2) 사료 종류별 Phagocytosis 활성
도 15에 나타낸 바와 같이, PA는 BLY-Ph가 첨가된 사료를 공급한 그룹은 10일, 20일 및 30일째 모두 대조군 그룹과 비교하여 상당히 유의성 있는 높은 수준을 나타내었다(p < 0.05). 반면, Ph가 첨가된 사료를 공급한 그룹은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. BLY가 첨가된 사료를 공급한 그룹은 10일째에만 대조군에 비교하여 유의적인 차이(p < 0.05)를 나타내었고 20일과 30일째에는 큰 유의적인 차이는 없었다. 이러한 결과는 앞의 ROI 활성 결과와 유사하게 나타났으며, phagocytosis 또한 phage와 생균제의 혼합 첨가 급이시 상승작용이 일어난 것으로 판단된다.
실험예 7: 가금류를 이용한 Bacteriophage-생균제 복합제의 Lysozyme 활성 측정
Lysozyme은 동물의 조직, 침, 눈물, 알의 흰자 등에 들어있는 항균효소의 하나로, 세균 세포벽의 성분인 peptidoglycan의 N-acetylgiucosamine, N-acetylmuramic acid 상호간에 β(1→4) glycosidie bond를 가수분해하여 세균 세포를 죽이는 항 세균성 효소이다. 채취한 혈청을 이용하여 Sheikhzadeh 등(2012)의 방법을 응용하여 분석하였다. 96 well plate에 0.2M citrate phosphate buffer(pH 5.8)에 2 mg/㎖의 Micrococcus lysodeikticus(Sigma)를 부여시킨 용액을 well당 70 ㎕와 혈청 30 ㎕를 분주한 후 0분부터 4분까지 반응시켜 감소하는 흡광도의 양을 Micro plate reader(Sunrise, TECAN) 405 nm에서 측정하였다. 이때 1 unit은 분당 0.001의 흡광도가 감소하는 양으로 표현하였다.
(1) 사료 농도별 Lysozyme 활성
도 16에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph 첨가 그룹들 중 0.2%와 0.5%의 그룹에서 10일, 20일 및 30일째 모두 0.1% 그룹과 대조군에 비해 유의적인 차이(p < 0.05)를 보여주었다. BLY-Ph를 0.1% 첨가한 그룹에서는 대조군보다 평균적으로는 차이가 나타났지만 20일째에서만 대조군과 비교하여 유의적인 차이(p < 0.05)가 나타났고 10일째와 30일째에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. BLY-Ph를 0.2%와 0.5%를 첨가한 그룹은 시간이 지날수록 조금씩 증가하며 대조군보다 활성이 더 높다. BLY-Ph의 첨가는 투여 기간 동안 지속적으로 증가하는 것으로 보아 장기적으로 투여하여도 육계의 면역 기능을 향상시킬 것으로 생각된다.
(2) 사료 종류별 Lysozyme 활성
도 17에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph를 첨가한 그룹이 10일, 20일 및 30일째 모두 BLY, Ph 및 대조군 그룹보다 상당히 높은 유의성 있는 수치를 나타내었다(p < 0.05). BLY를 첨가한 그룹은 Ph와 대조군 그룹에 비해 유의적으로 높은 수치를 보였으나(p < 0.05) Ph를 첨가한 그룹은 대조군과 유의적인 차이가 없었지만 평균적으로는 차이를 나타내었다.
실험예 8: 가금류를 이용한 Bacteriophage-생균제 복합제의 Superoxide dismutase 활성 측정
Superoxide dismutase(SOD)는 가장 중요한 항산화 효소 중 하나이다. SOD는 과산화물 음이온을 과산화수소와 산소분자로의 변화를 촉진 시킨다. 또한 활성산소와 같은 독성 영향에 맞서 세포방어의 중요한 역할을 한다. SOD의 샘플수집 방법은 Min Gu 등(2011)의 방법을 응용하여 분석하였다.
병아리를 개복하여 간을 적출한 뒤 mesh에 통과시켜 잘게 쪼갠 후 4 ℃에서 10분간 1000×g에서 원심분리 하여 상층액을 수집하였다. 상층액은 초음파분쇄기를 이용하여 20%의 음파에서 5분간 sonication 시켜준 뒤 12000×g에서 5분간 원심분리 하였다. 그 상층액은 SOD 분석 실험에 사용되었다. SOD 분석에 있어 과산화물음이온은 수용성 formazan 염료를 생성하는 xanthine(Sigma) 및 NBT(Sigma)를 이용하였다. 과산화물 음이온의 생성은 xanthine과 xanthine oxidase(XOD, 1unit/㎖)의 활동에 의해 생성되어 이것은 SOD에 의해 억제된다. 96 well plate 에 다음과 같은 방법으로 시약을 첨가하여 Micro plate reader(Sunrise, TECAN)로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Superoxide dismutase 활성 처리 과정
experimental blank control
0.05 mM NaCO3 240 ㎕ 240 ㎕ 240 ㎕
3 mM xanthine 10 ㎕ 10 ㎕ 10 ㎕
3 mM EDTA 10 ㎕ 10 ㎕ 10 ㎕
Bovine Serum Albumin 10 ㎕ 10 ㎕ 10 ㎕
0.75 mM NBT 10 ㎕ 10 ㎕ 10 ㎕
sample 10 ㎕ 10 ㎕
D·W 10 ㎕
Stirring at 25 ℃ for 10min
xanthine oxidase(XOD) 20 ㎕ 20 ㎕
D·W 20 ㎕
Incubate at 25 ℃ for 20 min
6 mM CuCl2 10 ㎕ 10 ㎕ 10 ㎕
Check ABS at 620 nm
측정 후에 억제율은 다음과 같은 공식을 이용하여 구하였다.
억제율(%) = [1-(experimental-blank)/control] × 100
(1) 사료 농도별 Superoxide dismutase 활성
도 18에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph 첨가 그룹들 중 0.5% 그룹에서 10일, 20일 및 30일째 모두 대조군에 비해 유의적인 차이(p < 0.05)가 나타났다. 그러나 0.2% 그룹에 있어서 20일 및 30일 째에는 유의적 차이(p < 0.05)가 나타났지만 10일째에는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다(p > 0.05). 반면 0.1% 그룹은 사육기간 내내 대조군에 비해 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p > 0.05). 이러한 결과는 0.5와 0.2%의 phage와 복합 생균제의 첨가 급이는 대조군과의 확실한 차이를 보여주지만 0.1% 그룹은 대조군과의 큰 차이를 나타내지 않으므로 0.2%와 0.5%의 첨가급이가 가장 효과적인 것으로 생각된다.
(2) 사료 종류별 Superoxide dismutase 활성
도 19에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph를 첨가한 그룹은 10일째에 BLY를 첨가한 그룹과 유의적인 차이가 나타나지 않았지만 20일째와 30일째에서는 유의적인 차이(p < 0.05)를 보여주었다. BLY를 첨가한 그룹은 30일째를 제외하곤 대조군과 비교하여 모두 유의적인 차이를 나타냈지만(p < 0.05), Ph를 첨가한 그룹과는 10일, 20일 및 30일 모두 대조군과 유의적인 차이는 없었지만 평균적으로는 더 높은 수치를 나타내었다.
실험예 9: 항균 효과에 따른 성장률 측정
Salmonella sp .를 병아리에 감염시켰을 때 성장률에 미치는 BLY와 Phage의 효과를 알아보기 위해 감염 후의 성장률 변화를 조사하였다.
BLY-Ph, BLY, Ph 및 C의 4개의 그룹에 각각 7일 간 사료를 공급한 후 Salmonella sp.를 2×109 CFU/ml으로 각각 혼합하여 Sonde를 이용하여 감염시킨 뒤 1일, 7일, 14일 및 28일 째에 병아리의 체중을 측정하였다. 각각의 group에서 7수씩 병아리의 중량을 측정한 후 감염 전에 수행했던 방법과 동일하게 증체량, 증체율, 특수성장률 및 사료효율을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
DAYS Treatments
Control Phage BLY BLY+Phage
Initial weight(g) 0 50.94 50.94 50.94 50.94
Final weight(g) 1 184.8 189.4 192.6 194.8
7 265.26 268.16 273.68 278
14 327.5 329.17 338.33 343.75
28 966.67 971.67 1001.67 1011.67
weight gain(g) 1 133.86 138.46 141.66 143.86
7 214.32 217.22 222.74 227.06
14 276.56 278.23 287.39 292.81
28 915.73 920.73 950.73 960.73
PWG(%) 1 262.78 271.80 278.09 282.41
7 420.73 426.42 437.26 445.74
14 542.91 546.19 564.17 574.81
28 1797.66 1807.48 1866.37 1886.01
SGR(%) 1 16.13 16.38 16.63 16.75
7 11.79 11.86 12 12.14
14 6.64 6.68 6.75 6.82
28 7 7.02 7.1 7.12
FCR 1 1.27 1.23 1.20 1.18
7 1.54 1.52 1.48 1.45
14 1.88 1.87 1.81 1.76
28 2.2 2.18 2.11 2.09
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 최초무게는 모든 그룹에서 큰 편차 없이 거의 비슷하였으나 감염 후 1 일째부터 모든 그룹에서 대조군과 차이가 나타났으며 Ph 그룹은 약 4g, BLY 그룹은 약 8 g, BLY-Ph 그룹은 약 10 g 정도의 차이를 보여주었다. 시간이 지남에 따라 BLY-Ph와 BLY 그룹은 대조군과 비교해 더욱 큰 차이가 나타남을 알 수 있었다. 또한 증체율과 특수성장률에 있어서도 대조군을 비롯한 다른 그룹들과 비교해 볼 때 BLY-Ph 그룹에서 평균적인 차이가 나타남을 알 수 있었다. 사료효율은 대조군과 비교해 볼 때 약 0.1의 차이가 나타났다. 이러한 결과들로부터 BLY와 Ph 그룹 각각은 BLY-Ph 그룹보다 성장성은 낮지만 BLY 그룹이 Ph 그룹보다 높은 것을 알 수 있으며 BLY-Ph 그룹의 Bacteriophage와 복합 생균제가 단독적으로 작용하였을 때 보다는 복합적으로 작용했을 때 장내 환경을 유익균에 적합한 환경으로 만드는 상승효과를 발휘함으로써 Salmonella와 같은 유해균이 감염되더라도 대조군을 비롯한 다른 그룹들 보다 더 높은 성장성이 유지될 수 있다.
실험예 10: 생균수 측정
병아리에 Salmonella sp.를 감염시킨 후 생체 내의 병원균에 미치는 BLY와 Phage의 항균효과를 알아보고자 하였다. 병아리를 4개의 group으로 나누어 각각 육추기에 한 group당 28수씩 무작위로 수용하였다. 온도는 처음에 35±1 ℃로 유지하고 5일 간격으로 2±1 ℃씩 낮춰주었다. 병아리의 배설물은 하루에 한 번씩 청소해 주었고 음수량은 300 ㎖의 물통을 하루에 2번씩 12시간 간격으로 3통을 급이 하였다. 사료량은 일령별로 제한 급이를 시켜주었다. BLY-Ph, BLY, Ph는 기초사료에 0.2%를 첨가하여 7일간 사료공급하고 대조군은 기초사료만 공급 후 Sonde를 이용하여 Salmonella sp.(1×107 CFU/㎖)3종을 혼합감염 시켜주었다. 공격 감염 이후에도 각각의 사료별로 30일간 사료를 공급하였다. 공격 감염 이후 1일, 7일, 14일 및 30일째에 각각의 group에서 7수씩 맹장을 적출하였다(Lee 등, 2012). 적출한 각각의 맹장으로부터 1 g씩을 수거하여 멸균된 50㎖ 시험관에 PBS 10㎖을 넣고 균질화 하였다. 균질화 시킨 시험관은 voltexing 하여 PBS로 1:9로 10배씩 단계희석한 후 SS agar에 평판도말법으로 Salmonella sp.의 생균수를 측정하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, BLY-Ph, BLY, Ph 및 C의 4개의 그룹에 각각 7일 간 사료를 공급한 후 Salmonella sp.를 2×109 CFU/ml으로 각각 혼합하여 Sonde를 이용하여 감염시켜준 뒤 1일, 7일, 14일 및 28일에 생균수를 측정한 결과이다. 항균효과는 감염 후 1일째부터 효과가 나타나고 있다. 1일째에 대조군과 Ph그룹의 생균수는 차이가 없었다. 이것은 phage가 병원성 세균의 증식의 억제가 가능하다(Yongsheng et al., 2008)는 보고와 상이한 결과를 보여주었다. 이것은 (Yongsheng et al., 2008)의 연구와 다르게 장내에 phage가 낮은 농도로 존재하기 때문인 것으로 판단되며 phage의 농도가 낮기 때문에 Salmonella에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 생각된다. BLY그룹과 BLY-Ph그룹은 대조군과 유의적인 차이를 나타내었다(p < 0.05).
통계 분석
데이터를 평균과 표준편차(Mean±S.D.)로 표현하였으며 PRIMER(Mc Graw-Hill, Inc., ver. 1.5)의 one way analysis of variance를 이용하여 분석을 실시하고 Duncan New Multiple Range Test를 이용하여 유의성 검정을 실시하였다. 각 group간의 유의성의 판단 기준은 P < 0.05일 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

Claims (18)

  1. (1) 바실러스 속, (2) 락토바실러스 속, (3) 이스트 속 및 (4) 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 바실러스 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되고,
    상기 (2) 락토바실러스 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되며,
    상기 (3) 이스트 속은 2×105-2×109 CFU/g의 농도로 포함되고,
    상기 (4) 파지는 2×105-2×109 PFU/g의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (1) 바실러스 속은 바실러스 서브틸러스 및 바실러스 리케니포르미스 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 (2) 락토바실러스 속은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 페르멘텀 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 (3) 이스트 속은 사카로미세스 세레비시아 및 피치아 아노말라 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (1) 바실러스 속은 유전자은행 등록번호 KC757129.1, JX042469.1. KC172009.1, JX123316.1 및 AB743877.1 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 (2) 락토바실러스 속은 유전자은행 등록번호 JX426117.1, JF965377.1 및 JX272056.1 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 (3) 이스트 속은 유전자은행 등록번호 JN887919.1 및 FJ865436.1 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (4) 파지는 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이, 프로테우스 속 중에서 선택되는 1종 이상의 균에 대하여 특이적으로 용균 현상을 보이는 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리오파지는 포도비리대 과 또는 시포비리데 과인 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 박테리오파지는
    (a) 물 시료에 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 종 중에서 선택되는 1종 이상의 균과 뇌심장침출액(BHI)을 첨가한 후, 배양하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 배양이 완료된 시료에 박테리아를 첨가한 후, 배양하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양이 완료된 시료를 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여과하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 여과물을 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 종 중에서 선택되는 1종 이상의 균이 도말되어 있는 BHI 배지에 접종한 후, 상기 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 이.콜라이 및 프로테우스 종 중에서 선택되는 1종 이상의 균을 첨가하여 중층배지를 만든 후, 증폭시켜 파지를 여과하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이틱스 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 축산용 프로바이오틱스 조성물은 오리, 닭, 거위, 꿩, 메추라기, 칠면조, 소, 젖소, 말, 당나귀, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼 및 고양이 중에서 선택되는 1종 이상의 축산 가축인 것을 특징으로 하는 축산용 프로바이오틱스 조성물.
  9. 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 유효성분으로 함유하는 축산용 사료첨가제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 사료첨가제는 축산 가축의 양식에 사용되는 것을 특징으로 하는 축산용 사료첨가제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 사료첨가제는 오리, 닭, 거위, 꿩, 메추라기, 칠면조, 소, 젖소, 말, 당나귀, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼 및 고양이 중에서 선택되는 1종 이상의 축산 가축인 것을 특징으로 하는 축산용 사료첨가제.
  12. 제9항에 있어서, 상기 사료 첨가제는 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 축산용 사료첨가제.
  13. 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 포함하는 사료첨가제를 사료 전체 중량을 기준으로, 0.1-1 중량%의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 축산용 사료.
  14. 축산 농가에서, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물 또는 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산 가축의 식방법.
  15. 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 축산 가축에 급이하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산 가축의 살모넬라 속, 이.콜라이, 프로테우스 종 중에서 선택되는 1종 이상에 의한 감염성 질병을 예방하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 살모넬라 속 미생물은 살모넬라 겔리나움, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 콜레라수이스, 살모넬라 타이피수이스, 살모넬라 더비 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 감염성 질병을 예방하는 방법.
  17. 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 사료를 축산 가축에 급여하는 단계를 포함하는 축산 가축의 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 사료는 5 내지 20 mg/kg/day의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법.
KR20130101167A 2013-08-26 2013-08-26 바실러스 속, 락토바실러스 속, 이스트 속 및 파지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 축산용 프로바이오틱스 조성물 KR20150024116A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220032179A (ko) * 2020-09-07 2022-03-15 주식회사 동우크리스탈 활성생물소재를 포함하는 반려동물용 살균 조성물
WO2023146038A1 (ko) * 2022-01-28 2023-08-03 국민대학교산학협력단 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름
US20230392216A1 (en) * 2018-09-13 2023-12-07 Gnubiotics Sciences Sa Microbiome markers and uses thereof

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