KR100489859B1

KR100489859B1 - 가금티프스 치료 및 예방용 유산균 및 이를 이용하는 가금티프스 치료방법

Info

Publication number: KR100489859B1
Application number: KR10-2003-0011670A
Authority: KR
Inventors: 라정찬; 강경선; 소재성; 김승철; 윤현식; 이종은; 장정은; 정다연
Original assignee: 알앤엘생명과학주식회사
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2005-05-17
Also published as: KR20040076351A

Abstract

본 발명은 가금티프스를 유발하는 살모넬라 갈리나륨 (Salmonella gallinarum)에 대해 항균활성을 가지는 미생물인 락토바실러스 파라카세이 KLB58 (Lactobacillus paracasei KLB58) 균주 및 이를 이용한 가금티프스의 예방과 치료방법에 관한 것으로, 가금티프스의 병원균인 살모넬라 갈리나륨에 대하여 항균활성을 가지는 대사산물을 생산하는 신규 락토바실러스 파라카세이 KLB58 (L. paracasei KLB58)를 분리, 동정하여 임상에 적용하여본 결과 L. paracasei KLB58 균주 또는 이의 배양액 (이 균주의 대사산물)을 사료나 음용수에 첨가하여 급여함으로써 살모넬라 갈리나륨에 의한 가금티프스의 예방과 치료하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과를 얻을 수 있다.

Description

가금티프스치료 및 예방용 유산균 및 이를 이용하는 가금티프스 치료방법{Viable lactobacilli and method for the treatment and protection of fowl typhoid}

본 발명은 닭에게 가금티프스를 유발하는 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성을 가지는 미생물인 L. paracasei 균주 및 이를 이용한 가금티프스의 예방과 방제 방법에 관한 것으로, 살모넬라 갈리나륨에 대하여 항균활성을 가지는 대사산물을 생산하는 신규 L. paracasei KLB58 균주 또는 이의 배양액(이 균주의 대사산물)을 사료나 음용수에 첨가하여 급여함으로써 살모넬라 갈리나륨에 의한 가금티프스의 예방과 치료방법에 관한 것이다.

축산업에서 성장 촉진, feed converison 효율성 증대, 그리고 장내 감염 방지 등을 목적으로 항생제를 광범위하게 사용하여 유익한 장내 미생물 생태계의 불균형과 항생제 내성 균주의 출현을 초래하였다. 최근 European commission은 동물의 성장 촉진제로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 금지하여 특히, 양계에서는 병원균 차단을 위해 항균력을 갖는 정장제를 적극 권장하고 있는 실정이다 (Council of eht European Communities. J. Eur. Commun., L351/4:2821, 1998). 현재 우리나라에서도 동물용의 사료 첨가제로 사용되는 생균제, 인체 의약품용으로 사용되는 정장제 또는 유산균제재 및 건강보조식품 (유산균식품) 형태로 이용되고 있다. 실제 한국사료협회는 최근 4년간(1999년-2001년)의 총 배합사료 생산이 꾸준히 증가하여 한 해에 15,000천톤 이상을 생산하였으며, 특히 99년 26.3%를 점유하는 양계용 배합사료의 경우 약 4,000 천톤의 생산을 보고하였다. 더불어 사료용 생균제를 포함한 축사 환경 개선을 위한 여러 제품들을 300여개 업체에서 생산하고 있으며, 16억원 이상이 연별 소비되고 있는 실정이다. 그 외 인체 내 건강 유지 차원에서 위장 내 기회성 감염을 줄이거나 감염 치료에 유용하므로 미생물을 요구르트 등의 발효 유제품에 함유하여 장내균총 개선을 도모하는 것은 널리 알려진 사실이다 (Tannock, G. W. et al., Appl. Environ. Microviol. 54:2871, 1988).

미 농무성의 보고에 따르면 미국은 살모넬라 식중독에 의해 발생하는 생산손실 및 의료비 지출이 연간 약 12억 ~ 16억 달러에 달하는 손실을 입고 있으며, 살모넬라 식중독의 주 원인은 오염된 가금류로서 1992년 1년간 미국에서 발생한 1,920,000건의 살모넬라 식중독 중 약 50%가 육류와 가금규로부터 발생하였다 (USDA, 1992). 미 농무성의 식품안전검사국에서 전국의 가금류 가공공장을 조사한 결과 가송대상인 살아있는 닭의 3~4%가 살모넬라에 오염되어 있었으며, 가공한 직후에는 2차 오염 등에 의하여 약 35%의 가금류가 살모넬라에 오염되었다고 보고함으로써 소비자가 얼마나 심각하게 살모넬라 오염에 노출되어 있는가를 강조하였다 (Green, S. S., Private Communication. Science, Food safety and inspection Service, U.S. Department of Agreculture, Washington, D.C. 1987). Bailey(1993)가 "살모넬라에 오염되지 않은 닭을 가공공장에 제공하는 것이 가공된 닭의 오염을 줄이는 가장 좋은 방법"이라 주장한 것으로 보아 닭을 키울 때부터 살모넬라를 통제하는 것이 필수 요건이라 생각된다. 부화실, 계사 및 사료관리들이 제어방법이 될 수 있는데, Blankenship 등(1993)은 가금류 제품의 살모넬라 오염을 감소시키기 위해서는 특히 가금류 장내에 살모넬라가 전이증식되는 것을 억제해야 한다고 강조하였다 (Bailey, J.S., Poultry Sci. 72:1169, 1993; Blankenship, L.Cl, Bailey, J.S. et al., Poultry Sci. 72:1667, 1993).

Schlessinger(1975)는 자연 장내균총의 가장 중요한 기능은 외부로부터 침입한 병원성세균 등의 미생물이 장벽에 colonization되는 것을 방지하는데 있다고 주장하였으며, Nurmi와 Rantala(973)는 만약 이들 보호 미생물균총이 갓 부화한 병아리에 투여된다면 이 병아리들은 단시간 내에 살모넬라의 장내 침입에 대한 저항성을 가질 수 있다고 최초로 "Nurmi concept"를 발표하였다. 또는 "경쟁적 제어(Competitive exclusion)"가 가금류의 살모넬라 감염을 줄일 수 있는 유익한 방법임을 제안하였다. 살모넬라는 주로 맹장에 colonization 되므로(Hudault et al. 1985) Nurmi culture를 이용하는 가장 손쉬운 방법은 닭의 맹장에 존재하는 자연 장내균총을 순수 배양한 후 재 혼합하여 부화된 병아리에게 경구투여하는 것이라 제안되었다 (Schlessinger, D., In Microbiology, America Society for microbiology, Washington D.C., 110, 1973; Nurmi, E. and Rantala, Nature, 241:210, 1987;. Stabric, S., Food Technol. 41:93, 1987; Hudault, S. et al., Can. J. Microbiol. 31: 832, 1985).

유산균은 장관과 비뇨생식기의 미생물 생태계의 균형 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 lactobacilli의 병원성 세균에 대한 중요한 특징은 다음과 같다. Lactobacilli는 숙주에 대해 부착능을 가지며, 병원성 세균의 장내 부착을 방해하거나 억제한다. 또한 대수로 존재하며 여러 유기산을 생성하여 배양액의 산성화로 병원성 세균을 무력화시키며, 과산화수소를 생성하여 세포에 강한 상화작용 및 단백질 구조를 파괴하여 병원균을 사멸시킨다. 또한 일부 유산균들은 bacteriocin 등의 항균 단백질을 생성하여 물리적, 화학적 타격으로 병원균의 성장을 저지시킨다. 또한 안전하며 균형 잡힌 미생물의 생태계를 유지한다 (Eschebatch, D.A. et al., J. Clin. Microbiol. 27:251, 1989; Kim, W.J. et al., J. MIcrobiol. Biotechnol., 4:151, 1994; Salminen, S. et al., Antonie van Leeuwenhoek. 70:347, 1996).

유산균의 정장제로의 효과는 동물임상실험을 진행한 여러 보고에 의해 확인되었다. 가금류에 직접 투여된 유산균이 장내 생태계의 균형을 조절하고, 병원성 세균의 성장을 저해하는 항균 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 가금류의 생체량 증가와 성장 촉진, 산란율의 증가와 더불어 계란의 질적 향상 등의 세부적인 사항도 보고되고 있다 (Bruce, A.W. and G. Reid., Can. J. Microbiol., 34:339, 1988; Jin, L. Z. et al., J. Appl, Bacteriol. 81:201, 1996; Nchashon, S. N. et al., Poultry Sci., 73:1712, 1994; Tortuero, F., Poulty Sci., 52:197, 1973; Tannock, S.W. et al., App. Environ. Microbiol., 54:2871, 1988).

가금티프스를 예방하는 방법으로는 양계장내 외부인이나 차량 등의 출입시 철저한 소독과 특히 개, 고양이, 야생조류 등의 접근을 막기 위해 구조물을 설치하고 쥐나 곤충 등을 구제하고, 양계장 내부를 항상 청결히 하고 소독을 철저히 하며, 종계를 통해 전염될 수 있기 때문에 병아리 구입시 가금티프스가 발생하지 않은 종계장에서 구입하고 출처가 불분명한 중추 및 성계구입을 삼가고, 가급적 성계와 병아리를 따로 격리 사육한다. 가금티푸스의 예방약으로 사균겔백신과 오일백신 2종류가 있으나, 가격이 너무 비싸서 적용이 거의 이루어지지 않고 있으며, 가금티프스로 의심되면 원인균에 대한 약제감수성시험결과에 따라 유효한 약제를 선발한 후 치료하되, 치료약제로는 앰피실린, 아목사실린, 세파로틴, 가나마이신, 테트라싸이클린, 겐타마이신, 바이트릴 등을 음수 또는 사료에 첨가하는 방법이 있으며, 2가지를 병행하는 것도 효과적이다. 그러나 가금티프스의 예방과 치료를 위해서 많은 양의 항생제가 사료에 첨가되어 급여되고 있으며, 이로 인해 여러 항생제와 그 유도체들이 가축의 체내에 잔류하게 되고 이를 섭취한 인간에게도 좋지않은 영향을 미치게 된다. 또한, 항생제 사용으로 인해 가축의 장내 정상 미생물균총이 파괴되어 질병에 대한 면역력이 저하되므로 더 많은 양의 항생제를 투여하게 되는 악순환이 계속된다. 그러므로, 최근에는 항생제의 사용을 줄이고 가축의 장내 균총을 건전하게 유지시키는 동시에 병원균에 대한 항균효과를 가지는 생균제를 이용하려는 추세에 있다.

본 발명은 이러한 추세에 부응하여 가금티프스 병원균인 살모넬라 갈리나륨의 생육을 억제시키는 미생물인 L. paracasei KLB58을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 L. paracasei KLB58을 함유하는 사료첨가제를 제공하는데 있으며 또 다른 목적은 미생물 항균활성이 있는 상기 L. paracasei KLB58을 이용하여 가금티프스를 치료 및 예방하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 한국인의 체내에서 우점균으로 서식하는 유산간균을 분리하여 가금티프스를 유발하는 살모넬라 갈리나륨에 항균활성이 우수한 균주를 선별한 후 동정하고, 상기균주의 분류를 위해 16s rDNA의 염기서열을 분석하고 그 특징을 조사한 후, 생균제제로 투여하기 위하여 임상에 직접 적용함으로써 본 발명 균주 L. paracasei KLB58의 가금티프스 예방효과를 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 가금티프스의 병원균인 살모넬라 갈리나륨에 대하여 항균활성을 가지는 대사산물을 생산하는 신규 Lactobacillus paracasei KLB58 균주는 단간균으로서 세포 크기가 0.5×1.0㎛ 정도이며, 카탈라아제를 생성하지 않고, 운동성이 없고, 그람염색에 양성반응을 나타내며 포자를 형성하지 않으며 세포외 다당류를 생성하는 것으로 특징지어진다.

본 발명은 한국인에게서 분리한 100여개의 유산간균 (lactobacilli)으로부터 살모넬라 갈리나륨에 대한 생장 억제능력이 가장 우수한 본 발명 균주 L. paracasei KLB58를 분리하고 선발하는 달계; 상기 분리한 균주의 16s rDNA를 염기서열 분석하고 그 특성을 조사하는 단계; 상기 본 발명 L. paracasei KLB58균주의 생균제제로서의 사용가능성 여불를 알아보기 위하여 가금티프스 예방효과를 알아보기 위해 임상실험을 실시하는 단계로 구성된다.

실시예 1 : 살모넬라 갈리나륨 생장 억제 능력이 뛰어난 Lactobacillus paracasei KLB58 균주의 분리 특성 및 동정

한국인에게서 분리한 100여개의 유산간균으로부터 미생물 살모넬라 갈리나륨과 살모넬라 엔테리티디스에 생장억제 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 동정하였다.

분리된 유산간균을 MRS 배지(Difco)에서 배양하였으며, 배양액을 5㎕씩 떨어뜨려서 colony가 형성되게 한 후 항균활성을 측정하는 direct and deferred technique을 이용하여 저해환의 크기로 항균활성을 측정한 결과 살모넬라 갈리나륨과 살모넬라 엔테리티디스에 강한 항균활성을 가지 균주를 분리(도1)하였으며, 이 균주는 그람염색, 형태관찰, 카달라아제 반응시험, 포자형성우뮤, 운동성시험과 16s rDNA sequencing 분석을 이용하여 동정한 결과 Lactobacillus paracasei로 밝혀졌으며 그 16s rDNA의 염기서열은 도2와 같다. 분석한 도2의 16sDNA 염기서열은 national Center for Biotechnological information의 Genebank의 AF243168번으로 등록하였다. 상기 균주를 Lactobacillus paracasei로 판명된 상기 본 발명균주를 Latobacillus paracasei KLB58이라 명명하고, 생명공학연구소 미생물 기탁센터 내 유전자은행에 기탁하였다(KCTC10373BP).

실시예 2 : Lactobacillus paracasei KLB58의 독성시험 및 임상시험

항균활성 측정 결과 선별된 유산간균을 1일령 갈색 산란용 병아리 및 35주령 SPF 닭(Sun Rise사 유래)에 투여하여 각각의 시험을 진행하였다. 백두사료 어린병아리 사료 및 수원축협 산란용 사료를 사용하였다.

제1단계 : 안전성 시험

35주령 SPF 닭 50수를 10수의 1개 시험군과 20수의 대조군으로 나누고 산란용 사료(수원축협)를 무제한 급여하였다. 시험군의 닭은 유산균 제제를 수당 1㎖ (2.0×10⁹CFU/㎖)씩 경구로 1회 투여하였고 대조군에는 증류수를 5㎖씩 경구로 투여하였다. 시험 제제 투여 3일 전부터 투여 후 32일까지 임상증상을 관찰하고 주 2회 산란율을 조사하였다. 본 실험은 발명균주에 대하여 경구경로에서의 급성독성정도를 파악함으로써 독성에 관한 기초자료를 도출함을 목적으로 실시하였으며, 그 결과 유산균제 투여 후 32일간 대조군을 포함한 어느 시험군에서도 폐사를 포함한 임상증상은 관찰되지 않았다. 시험기간 중 평균 산란율은 시험군 82.5%, 대조군 78.9%로 시험별로 약간의 차이가 있었으나 대조군과 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 따라서 본 발명균주 배양액을 상기농도로 경구투여시에 독성이 관찰되지 않았다.

제2단계 : 임상시험

1일령 갈색 산란용 병아리를 32수씩 2개 시험군으로 나누고 1일령부터 시험 종료 시까지(35일령) 시험 제제를 사료(백두사료 어린병아리 사료)에 섞어 투여하였으며 대조군은 시험 제제를 투여하지 않았다. 유산균 제제는 배양액 3㎖를 90㎖의 증류수에 희석하여 3kg의 사료에 분무하여 시험사료를 만들었으며 2~3일 간격으로 신선하게 만들어 급여하였다.

모든 방어능 시험용 병아리는 14일령에 살모넬라 갈리나륨(SG) 야외분리주 99-197(Ch2P3)로 수당 10⁸CFU씩(100㎕) 구강으로 공격 접종하였다. SG 접종 21일 후까지(35일령)의 폐사율을 조사하고 생존한 병아리에 대해서는 비장에서 공격균(SG)의 재분리 빈도를 조사하였다. 체중은 공격접종 직전에는 (14일령) 시험군별로 측정하였으며 시험 종료시에는 생존한 닭에 대해서만 개체별로 측정하였다.

SG 공격접종 후 시험군별 폐사율은 대조군이 40%였는데 반하여 유산균제 투여군은 13.3%로 대조군에 비하여 유의적으로 낮은 폐사율을 보였다. SG 공격접종 21일 후 생존한 시험계로부터 SG 재분리 빈도는 대조군 27.8%에 비하여 유산균제 투여군은 11.5%로 낮았으나 통계적 유의차는 인정되지 않았다. SG 공격접종 21일 후 생존한 닭의 평균 에서도 유의적인 차이는 인정되지 않았다 (표 1). 경군 유산균 제제 가금티프스 원인균인 살모넬라 갈리나륨(SG) 공격접종에 대하여 방어증이 인정되었다.

[표1] 본 발명 L. paracasei KLB58 균주 배양액의 급여 후 처리구별 체중증가율

	폐사율(%)	평균 체중(14일령, g)	평균 체중 (±SD)(35일령, g)	평균 증체량(14~35일령, g)	SG균 재분리빈도(생존계 비장)
유산균제제	4/30(13.3%)	124.8	346.7(±61.5)	221.9	3/26(11.5%)
대조군	12/30(40.0%)	128.7	350.9(±94.3)	222.2	5/18(27.8%)

상술한 바와 같이 본 발명에서는 닭의 분변으로부터 균주를 분리하고 배양하여 배양액을 얻고, 이를 가금티프스 발병균을 피검균으로 하여 항균활성을 측정한 결과 가금티프스를 예방 및 방제하는 효과가 우수한 대사산물을 생산하는 것을 발견하여 가금티프스를 유용하게 예방 및 방제하는 효과를 얻을 수 있었다.

도 1은 L. paracasei KLB58 균주의 (A) 살모넬라 엔테리티디스와 (B)살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성을 direct and deferred technique법으로 측정한 사진으로 플레이트 가운데 58번이라고 명명되어 있는 균주의 주변으로 보이는 저해환이 L. paracasei KLB58이 생성하는 항균물질에 의해서 살모넬라 갈리나륨과 살모넬라 엔테리티디스가 성장억제를 받는 사진이다. 도 2는 항균활성이 있는 본 발명 L. paracasei KLB58의 16s rDNA의 염기서열을 나타낸다.

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Claims

가금티프스의 병원균인 살모넬라 갈리나륨과 살모넬라 엔테리티디스에 대하여 항균활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) KLB58 (KCTC 10373BP).
락토바실러스 파라카세이 KLB58 균주 또는 이의 배양액(이 균주의 대사산물)을 사료나 음용수에 첨가하여 급여하는 것을 특징으로 하는 가금티프스의 예방 또는 치료 방법.