KR20150061653A - 프로바이오틱 및 프리바이오틱 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 축산업에서 유익할 수 있는 생성물 및 조성물에 관한 것이다. 상기 생성물 및 조성물은 미생물, 예컨대, 박테리아, 및 특히 프로바이오틱 박테리아를 포함한다. 따라서, 본원에서는 미생물 균주뿐만 아니라, 숙련된 독자가 본 발명에서 유용한 추가의 균주를 찾을 수 있게 하는 선정 기준을 제공한다. 균주뿐만 아니라, 상기를 포함하는 조성물은 동물, 가축, 특히, 예컨대, 돼지에게 투여될 수 있다. 투여는 생후 1일째에 이루어질 수 있다. 본 발명의 생성물 또는 조성물 투여에 의해 동물 성장을 촉진시킬 수 있고, 동물의 체중을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 화합물 또는 조성물에 의해 박테리아 감염을 예방 또는 치료할 수 있다.
Description
갓 태어난 동물, 특히 (집약) 농장에서의 갓 태어난 동물은 박테리아 등에 감염되기 쉽다. 이러한 감염은 체중 감소와 관련된 설사를 유발할 수 있고, 심한 경우에는 심지어 갓 태어난 동물을 사망에 이르게 할 수 있다. 예를 들어, 수년 전, 갓 태어난 새끼 돼지에서의 설사 사례가 스페인의 다른 지리적 여건의 돈축 농업에서 기술되었다. 상기 설사는 이들 동물에서의 증상인 반면, 상기 증상의 원인 인자는 종종 밝히기 어려운 것으로 여겨진다. 갓 태어난 돼지에서의 많은 설사 사례에서, 예를 들어, 가능하게는 비바람직한/원치않는 박테리아 균주, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 단독으로 또는 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 또는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)과 함께 단리시킬 수 있지만, 설사는 보통 출생 직후에 검출되며, 통상의 치료법 및 예방 방법은 흔히 효과적이지 못하다.
어느 특정 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 장내 세균 불균형(이는 또한 장내 세균총 이상으로도 명명된다)이 원인 인자가 될 수 있다고 여겨진다. 장내 세균 불균형이란 신체 또는 체내 미생물 불균형과 관련된 병증을 의미한다. 농장 동물에서, 특히 돼지의 경우, 장내 세균 불균형은 암퇘지 사육 중의 항생제의 무분별한 사용으로 유발될 수 있고, 이는 갓 태어난 새끼 돼지의 장내 세균총을 변경시킬 수 있다.
이러한 항생제 사용의 단점을 고려해 볼 때, 축산업에서는 항생제 사용을 줄이도록 권고되고 있다. 한편, 이어서, 통상 사용되는 항생제를 대체하도록 갓 태어난 동물을 치료하는 대체 방법이 필요할 것이다.
2005년 이래 EU는 돼지 육종에서 성장 촉진제로서 항생제 사용을 줄이도록 권고하여 왔기 때문에(2005년 3월 4일 법령 (EC) 번호 378/2005에 의해 개정), 동물 육종가들은 (농장) 동물, 특히 어릴 때 그의 일반 건강 상태를 개선시킬 수 있는 대안을 절실히 요구하고 있다. 본 발명자들은 이러한 문제에 대한 해결안을 제공하며, 상기 해결안은 하기에 기술된다. 따라서, 본 발명이 최근 방법에 의해 유발된 몇 가지 문제들을 해결하였으며, 유익한 효과는 하기에 상세하게 설명될 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 3종, 더욱 바람직하게, 4종 이상, 예컨대, 4종, 별법으로, 5종 이상, 예컨대, 5종, 별법으로, 6종 이상, 예컨대, 6종, 별법으로, 7종 이상, 예컨대, 7종, 별법으로, 8종 이상, 예컨대, 8종의 미생물(들), 바람직하게, 박테리아, 및 더욱 바람직하게, 락트산 박테리아를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 락트산 박테리아는 이상적으로는 하기 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10); CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)으로부터 선택되며, 이들은 모두 CECT에 기탁되었다. 한 실시양태에서, 본 조성물은 하나 이상의 균주를 포함하며, 각 균주들은 적어도 하기 조건 a., 및 바람직하게, 두 조건 a. 및 b. 모두, 및 가장 바람직하게, 조건 a., b. 및 c. 모두를 충족시킨다:
a. 하기 억제대 중 1 이상의 억제대에 의해 입증되는 항미생물 활성을 보이는 조건: (i) 살모넬라(Salmonella)의 경우, 10 mm 이상, 예를 들어, 14 mm 이상, (ii) 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 경우, 9 mm 이상, 바람직하게, 10 mm 이상, (iii) 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 경우, 9 mm 이상, 바람직하게, 10 mm 이상, (iv) 에스케리키아 콜라이의 경우, 10 mm 이상, 예를 들어, 18 mm 이상;
b. pH=3.5, 또는 별법으로, pH=2.5에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건;
c. 0.45% 담즙 추출물의 존재 하에, 바람직하게, pH=8에서 4시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건.
본 발명의 조성물은 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것, 및/또는 갓 태어난 포유동물(바람직하게, 새끼 돼지)의 체중을 증가시키는 방법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 방법에서, 본 조성물은 포유동물에게 투여된다.
본 발명은 또한 미생물, 바람직하게, 박테리아, 및 더욱 바람직하게, 락트산 박테리아를 제공한다. 락트산 박테리아는 이상적으로는 하기 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10), CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)으로부터 선택되며, 이들은 모두 에퀄롱 CYL S.L.(AQUILON CYL S.L.)에 의해 CECT(스패니시 타입 컬쳐 콜렉션(Spanish Type Cultures Collection))에 기탁되었다. 괄호 안의 AqSyn 번호는 본 발명자가 균주에 배정한 것이며, 이는 각 균주에 대하여 같은 뜻으로 사용될 수 있다.
CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09) 및 CECT 8166(AqSyn10)은 2012년 6월 20일 기탁되었다. CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)은 2013년 5월 16일 기탁되었다.
특정 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8164(AqSyn09) 및 CECT 8166(AqSyn10) 중 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 3종을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); 및 CECT 8166(AqSyn10) 4종 모두를 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10); CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 하나 이상, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종을 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 3종, 더욱 바람직하게, 4종 이상, 예컨대, 4종을 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17) 및 CECT 8349(AqSynJ55)를 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 CECT 8347(AqSynJ 2); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 4종 모두를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물 중에 포함되어 있는 1종 이상의 균주, 예컨대, 조성물 중에 포함되어 있는 1종, 및/또는 2종, 및/또는 3종, 및/또는 4종, 및/또는 5종, 및/또는 6종, 및/또는 7종, 및/또는 8종의 균주, 및 바람직하게, 균주들 모두 항생제 내성이 없고, 즉, 상기 균주는 적절한 표준 항생제 처리에의 노출 후에는 생존이 불가능하다.
어느 경우에서든, "포함한다"라는 것은 임의적으로 추가의 박테리아 균주가 존재한다거나, 또는 추가의 박테리아 균주가 존재하지 않는다는 것으로 이해될 수 있다. 심지어 추가의 박테리아 균주가 존재하지 않는 경우에도, "포함한다"라는 것은 임의적으로 추가의 다른 성분, 즉, 박테리아 이외의 다른 성분이 존재한다는 것을 의미할 수 있다.
다른 성분(또는 다른 성분들)은 어느 방식으로든 한정되지 않는다. 바람직한 측면에서, 1종 이상의 프리바이오틱(prebiotic) 화합물이 즉, 다른 성분으로서 본 발명의 조성물 중에 포함된다.
다른 균주들로 이루어진 조성물을 고려해 볼 때, 임의의 혼합비가 가능하다. 혼합비는 콜로니 형성 단위(CFU: colony forming unit)로 하기와 같이 표시되며, CFU는 개별 균주들을 혼합하기 전에 적합하게 결정된다. 한 실시양태에서, 균주의 비는 동일하거나, 동일하지 않을 수 있으며, 예컨대, 3종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:(0.1-10):(0.1-10), 4종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:1:(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10) 등이다. 또 다른 실시양태에서, 균주의 비는 대략 또는 실질적으로 동일하거나, 예컨대, 3종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:1:1, 및 4종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:1:1:1 등이다. 조성물은 조성물 내로 혼입되는 각 균주를 (콜로니 계수로 결정된) 각 박테리아 양으로 혼합함으로써 제조될 수 있다. 혼입되는 균주는 개별 균주의 스톡으로서 제공될 수 있으며, 이는 각각 예를 들어, 동결 건조물 형태일 수 있다. 상이한 스톡이 상이한 농도(CFU/g)를 가지는 경우, 각각은 적절한 양(g)으로 사용되며, 이로써 원하는 조성물은 각 균주를 원하는 CFU로 가지게 된다. 그의 일례는 하기에 제시되어 있다.
프리바이오틱스는 당업계에 주지되어 있고, 본 발명에서 사용될 때, 프리바이오틱은 그와 같이 특별히 한정되지 않지 않는다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 조성물 중의 1종 이상의 프리바이오틱 생성물은 하기 화합물 및 조성물: 베타-글루칸, 만난-올리고당, 이눌린, 올리고프럭토스, 갈락토올리고당(GOS), 락툴로스, 락토수크로스, 갈락토트리오스, 프럭토-올리고당(FOS), 셀로비오스, 셀로덱스트린, 사이클로덱스트린, 말티톨, 락티톨, 글리코실수크로스, 비타민 E 또는 그의 변이체(여기서, 변이체는 알파, 베타, 감마, 델타 토코페롤, 토코트리에놀 및 토코모노에놀로부터 선택된다)로부터 선택된다. 임의적으로, 만난-올리고당 및/또는 이눌린이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물을 치료하는 방법에서 상기 기술된 조성물의 용도를 제공한다. 동물, 포유동물, 및/또는 특히, 가축 치료가 바람직할 수 있다. 바람직하게, 동물은 비인간 동물이고, 더욱 바람직하게, 수이나(Suina) 아목으로부터(수이나 아목(이는 또한 수이포르메스(Suiformes)로도 알려져 있다)은 수이다에(Suidae) 과 및 타야수이다에(Tayassuidae) 과의 돼지 및 페커리를 포함하는 포유동물 계통이다)의 것이다. 야생 또는 가축용 돼지(swine 또는 pig)가 특히 바람직할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조성물이 인간에게 투여된다.
본 발명은 또한 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 및/또는 갓 태어난 포유동물, 바람직하게, 새끼 돼지의 체중을 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 미생물, 바람직하게, 박테리아, 및 더욱 바람직하게, 락트산 박테리아를 포함하는 조성물을 제공한다. 별법으로, 조성물은 갓 태어난 포유동물, 바람직하게, 새끼 돼지의 성장을 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 것이다.
박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법, 및/또는 체중을 증가시키는 방법, 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물은 박테리아 균주 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10); CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법, 및/또는 체중을 증가시키는 방법, 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물은 (기술된 임의의 실시양태에서) 상기 기술된 특정 조성물이다.
박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법, 및/또는 체중을 증가시키는 방법, 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 조성물은 출생 후 처음 14일 이내에, 더욱 바람직하게, 출생 후 처음 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일 이내에, 및 가장 바람직하게, 출생 후 처음 2일 이내에, 또는 출생 후 처음 1일(24시간) 이내에 투여될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 조성물은 예를 들어, 경구적으로 투여될 수 있다. 조성물은 임의 형태, 예컨대, 동결 건조된 형태, 액체 형태 또는 분무된 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물을 제조하는 데 동결 건조된 박테리아가 사용될 경우, 이때, 동결 건조된 박테리아로 이루어진 상기의 예비 조성물을 예컨대, 멸균 등장성 염수 용액으로 재수화시킬 수 있고, 이로써, 원하는 총 농도(CFU/ml)를 가지는 최종 조성물을 수득할 수 있다.
용이하게 사용될 수 있도록 하기 위해, 조성물은 투여 형태일 수 있다. 예를 들어, 각 용량은 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상의 콜로니 형성 단위(CFU)의 박테리아를 포함한다(109 이상이 바람직할 수 있다). 용량은 0.1 내지 100 ml, 바람직하게, 0.2 내지 50 ml, 더욱 바람직하게, 0.5 내지 20 ml, 더욱 바람직하게, 1.0 내지 10 ml, 더욱 바람직하게, 1.5 내지 5 ml 범위, 및 더욱 더 바람직하게, (실질적으로) 2 ml의 부피를 가질 수 있다. 109 이상의 CFU를 가지는 2 ml의 용량이 특히 바람직할 수 있다.
임의 횟수의 용량이 투여될 수 있고, 당업자는 각 농장에서의 요구에 따라 치료 기간을 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동물에게 투여되는 용량의 총 횟수는 10회 이하, 예컨대, 하기: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회로부터 선택되는 임의의 횟수, 또는 상기 횟수 중 어느 하나(단, 10회 제외)를 상기 횟수 중 어느 하나와 조합한 임의의 범위이되, 단, 두번째 횟수가 더 크다(예컨대, 1 내지 3회 용량). 동물 1마리당 총 2회 용량이 특히 바람직할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 용량은 출생 후 처음 24시간 내에 투여되고, 제2 용량은 후속 24시간 내에 투여된다. 임의적으로, 이는 단 2회 용량이다. 또 다른 옵션에서, 추가 용량은 하기와 같이 투여된다.
본 발명의 조성물은 포유동물의 병증, 예컨대, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 병증은 박테리아 감염에 기인하는 설사(대장균증 포함), 갓 태어난 동물의 클로스트리디움 디피실 설사, 클로스트리디움 퍼프린겐스 A형 및 C형으로부터 선택된다. 또한, 심지어 (박테리아) 감염이 상기 설사에 대한 원인 인자인 것으로 (아직) 입증되지 않은 경우에도, 본 조성물을 설사를 앓는 동물에게 투여할 수 있다.
도 1: 실시예 1에 기술된 바와 같이, 상이한 PCR 패턴은 보통 구별되는 박테리아 종(레인 1-5, 7: 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 레인 8-11: 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 레인 6: 분자량 마커)을 대상으로 한다.
도 2: 예시 실시예의 억제대.
도 2: 예시 실시예의 억제대.
하기 상세한 설명은 본 발명의 개별적인 특징의 구체적이고/이거나, 바람직한 변형을 개시한다. 본 발명은 또한 본 발명의 2가지 이상의 특징에 대해 기술된 2가지 이상의 구체적이고/이거나, 바람직한 변형을 조합함으로써 생성된 실시양태를 특히 바람직한 실시양태로 고려한다.
달리 명백하게 언급하지 않는 한, "포함한다"라는 용어는 본 명세서의 문맥상 "포함한다"에 의해 도입된 목록의 구성원 이외에도 추가의 구성원이 임의적으로 존재할 수 있다는 것을 나타내는 것으로 사용된다. 그러나, "포함하는"이라는 용어는 추가의 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포괄하는 본 발명의 구체적인 실시양태로서 의도되며, 즉, 상기 실시양태의 목적에 있어 "포함한다"는 "~으로 이루어진"이라는 의미를 갖는 것으로 이해된다.
달리 명백하게 언급하지 않는 한, 본 출원에서 상대적인 양들은 모두 중량/중량 기초로 표시된 것이다. 일반 용어로 특징이 규명되는 성분들의 상대적인 양을 표시한다는 것은 상기 일반 용어에 포함되는 모든 구체적인 변이체 또는 구성원의 총량을 나타내는 것을 의미한다. 일반 용어에 의해 정의되는 특정 성분이 특정의 상대적인 양으로 존재한다고 언급된 경우, 및 상기 성분이 일반 용어에 포함되는 구체적인 변이체 또는 구성원인 것으로 추가로 특징이 규명된 경우, 일반 용어에 포함되는 어떤 다른 변이체 또는 구성원도 추가적으로 존재하지 않으며, 이로써, 일반 용어에 포함되는 성분의 상대적인 총량은 언급된 상대적인 양을 초과하고; 더욱 바람직하게는, 일반 용어에 포함되는 어떤 다른 변이체 또는 구성원도 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명은 프로바이오틱스(probiotics) 및 프리바이오틱스의 개념을 통합함으로써 신바이오틱스(synbiotics)를 제공한다. 이제 본 발명자들이 면역 조절제 효과를 가진 박테리아 및 조성물에 대한 새로운 치료학적 창을 연다. 미생물 또는 조성물은 생애 초기 단계, 예컨대, 새끼 돼지일 때 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 축산업에서 유익할 수 있는 생성물 및 조성물에 관한 것이다. 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 프로바이오틱 처리가 생산성 면에서 항생제를 이용한 처리와 적어도 동등하게 효과적이고, 아마 십중팔구는 (표준 항생제 처리와 비교하여) 더 우수하다는 것은 매우 중요한 관찰 결과이다. 본 발명자들의 공헌은 총 처리 비용과, 법적 압력 및 환경적 영향의 양쪽 모두에 기인하여 막대한 경제적 효과를 미친다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 미생물, 바람직하게, 박테리아는 유익한 효과를 가진 미생물이다. 이는 바람직하게는 락트산 박테리아이다. 하기 선정 기준 a. 내지 c.를 따르는 한, 심지어 미생물의 비박테리아 종도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 효모 역시 프로바이오틱 특성을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다.
비록 본원에 기술된 기능적 파라미터가 가장 중요한 선정 기준이기는 하지만, 미생물 종에 관한 한, 락트산 박테리아가 바람직하다. 락트산 박테리아(LAB: lactic acid bacteria)는 그의 일반적인 대사적 및 생리학적 특징에 관련되는 그람 음성, 내산성 박테리아의 계통군을 포함한다. 천연적으로는 부식 식물 및 락트산 생성물뿐만 아니라, 동물 배설물에서 발견되는 상기 박테리아는 탄수화물 발효의 주요 대사 최종 생성물로서 락트산을 생산한다. 락트산 박테리아는 그가 어느 식품에나 흔히 존재하고, 그가 포유동물의 점막 표면의 건강한 미소세균총에 기여하는 바, 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질이다(GRAS 등급). 락트산 박테리아는 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 루코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라게노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 및 와이셀라(Weisella) 속 중에서 선택된다. 락토바실러스 및/또는 엔테로코커스가 바람직할 수 있다. 락토바실러스가 바람직하다. 본원에서 바람직한 박테리아는 바람직하게 그람 양성이고, 카탈라제 음성인 것이다. 박테리아가 그람 양성인지 여부는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 테스트될 수 있다. 그람 염색법은 상이한 "착색제"(염료)로 연속 염색하고, 양성 또는 음성 여부를 체크하기 위해 시료를 세척하는 것으로 이루어진다. 박테리아가 카탈라제 음성인지 여부는 하기와 같이 테스트된다: 카탈라제 테스트는 배양 시료 또는 사면 아가에 과산화수소를 첨가하는 것을 포함한다. 해당 박테리아가 카탈라제를 생산할 경우, 상기 박테리아는 과산화수소를 전환시킬 것이며, 산소 기체가 방출될 것이다. 기체 방출로 기포가 형성되며, 이들 기포를 통해 양성 반응(카탈라제 양성 박테리아)을 보인다는 것을 알 수 있다.
본원에서 바람직한 락트산 박테리아는 하기 기술되는 바와 같이, 바람직하게는 MRS 배지 중에서, 및 더욱 바람직하게는 산성화된 MRS 아가 중에서 성장할 수 있다. MRS 배지는 락트산 박테리아, 특히, 락토바실러스 종(Lactobacillus sp .)의 성장을 촉진시키기 위해 생성되었다. 대다수의 그람 음성 박테리아의 성장은 불리하게 하는 것으로 여겨진다. 그러나, 락트산 박테리아 이외의 다른 박테리아는 궁극적으로는 MRS 중에서 성장할 수 있으며, 따라서, 콜로니가 그람 양성에 속하고, 카탈라제 음성 박테리아인지 체크하는 것은 권고할 만하거나, 또는 심지어는 필수적이다.
본원에서 바람직한 락트산 박테리아는 가능하게는 프로바이오틱 박테리아일 수 있다. "프로바이오틱"에 대하여 가장 널리 용인되는 정의는 1998년 Fueller에 의해 내려졌는데, 그는 프로바이오틱을 "숙주 동물의 장내 미생물 균형을 개선시킴 으로써 숙주 동물에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물 사료 보충제"로 기술하였다. 일반적으로, 프로바이오틱스는 살아있는 미생물이다. 상이한 프로바이오틱스는 장에서 상이한 작용을 하고, 따라서, 상이한 프로바이오틱스는 함께 작용함으로써 유익한 효과를 제공할 수 있다고 여겨진다. 다른 정보원에서는 인간 또는 동물에 대해 미치는 건강상의 이점이 이미 입증된 상기 미생물이라고 프로바이오틱스를 정의한다. 프로바이오틱스 선정 기준은 ["Report of a Joint FAO WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization, 2001, Cordoba, Argentina]에 공개되어 있다. 살아있는 박테리아 사용이 가지는 이점은 널리 기술되어 있다.
최근, "프리바이오틱스"의 개념이 도입되었다; 프리바이오틱스는 위장관내 특정 미생물의 성장을 증가시키는 비소화성 식품 성분이다. "신바이오틱스"는 1종 이상의 프로바이오틱 및 1종 이상의 프리바이오틱을 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 유익한 박테리아(예컨대, 프로바이오틱스)의 성장을 장려하는 것으로 이해된다. 예시적인 일례로서, 발효된 유제품이 살아있는 박테리아 및 그에 필요한 식품 공급원을 함유하는 바, 상기 유제품이 흔히 신바이오틱스로 간주된다. 비록 프리바이오틱스 및 프로바이오틱스와 관련된 이점이 바람직할 수는 있지만, 소비되는 프리바이오틱 및 프로바이오틱의 유형 및 양뿐만 아니라, 특정 프로바이오틱스와 특정 프리바이오틱스의 구체적인 조합에 따라 이점을 달라지기 때문에 연구자들은 일반적인 결론을 도출해내는 데 있어 신중을 기한다. 따라서, 강력한 신바이오틱스는 엄선된 프리바이오틱스와 프로바이오틱 박테리아의 특정 균주의 조합에 기초한다. 이로써 포유동물에게 중요한 건강상의 이점을 가져올 수 있다.
특정 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 신바이오틱스가 인간에서 사용하기 위한 것으로 제안되었고, 프로바이오틱스에 대한 선정 기준은 예를 들어, 문헌["Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization, 2001, Cordoba, Argentina]에 개시되어 있다.
본 발명은 동물, 특히, 농장 동물에 대해 건강상의 이점을 보이는 잠재능을 가지는 미생물, 특히, 박테리아를 사용한다. 바람직하게, 동물은 가축용 동물, 가축화된 동물, 또는 그 자체가 가축용 또는 가축화된 동물은 아니지만(즉, 야생), 가축과 동일한 종 또는 속에 속하는 동물이다. 예를 들어, 야생 피그는 가축용 돼지와 동일한 종에 속하기 때문에 상기 정의에 포함될 것이다. 치료될 수 있는 가축에 대한 일부 예로는 제한 없이, 개, 고양이 및 다른 애완동물, 말, 소, 닭 및 다른 가금류, 돼지, 양, 염소를 포함한다. 바람직하게, 동물은 농장 동물이고, 농장 동물은 제한 없이, 말, 소, 닭 및 다른 가금류, 돼지, 양, 염소를 포함한다. 더욱 바람직하게, 동물은 수이나 아목으로부터의 것이다. 수이나 아목(이는 또한 수이포르메스로도 알려져 있다)은 수이다에 과 및 타야수이다에 과의 돼지 및 페커리를 포함하는 포유동물 계통이다. 야생 또는 가축용 돼지(swine 또는 pig)가 특히 바람직할 수 있다.
본 발명에 적합한 균주는 하기와 같이 확인할 수 있다.
본 발명의 균주를 얻기 위한 제1 단계: 단일 균주 단리
제1 단계에서, 미생물(바람직하게, 박테리아)을 함유하는 시료를 단리시킨다. 임의의 미생물 공급원이 적합할 수 있으며, 이는 가장 넓은 의미에서 자연으로부터의 임의의 비멸균 시료일 수 있다. 공급원은 (가축용) 동물로부터의 것, 예컨대, 생후 처음 30일이 경과한 어린 동물로부터의 것, 또는 그의 모체로부터의 것일 수 있다. 별법으로, 공급원은 야생 동물(예컨대, 야생 수퇘지)로부터의 것, 예컨대, 포획된 야생 수퇘지로부터 수집된 시료일 수 있다. 적합한 공급원은 모체 동물(예컨대, 암퇘지)로부터의 초유, 갓 태어난 동물(예컨대, 새끼 돼지)로부터의 태변 시료, 가축용 또는 야생 동물로부터의 장벽 세척액 또는 천연 장내 락트산 박테리아를 포함한다. 시료 중에 함유되어 있는 미생물(예컨대, 박테리아)을 장내 미생물의 성장에 적합한 것으로 당업계에 주지되어 있는 성장용 배지, 예컨대, MRS 배지에서 성장시킬 수 있다. 미생물을 스트리킹할 수 있고, 이를 통해 단일 콜로니를 단리시킬 수 있을 것이다. 단일 콜로니를 채취할 수 있고, 각 균주를 적합한 배지(예를 들어, 처음에 사용된 것과 동일한 것) 중에서 추가로 증식시킬 수 있다.
상기 단일 콜로니의 균주를 임의적으로 당업계에 공지된 방법에 의해 그람 염색법에 의해 테스트하고/하거나(균주가 그람 양성인지 여부를 선정하고/하거나), 상기 기술된 바와 같이 카탈라제 활성 존재에 대해 테스트한다(그리고, 균주가 카탈라제 음성인지 여부를 선정한다).
본 발명의 균주를 얻기 위한 제2 단계:
시험관내(in vitro)
테스트
본 발명에 유용한 것으로 선정되기 위해서는, 바람직하게는 상기 기술된 제1 단계로부터 기원하는 미생물 균주는 먼저 여기 기재된 후 하기에서 상세하게 설명되는 하기 기준 중 1 이상을 충족시켜야 한다:
a. 원치않는 박테리아에 대한 활성;
b. 내산성;
c. 담즙산염 내성;
항목 a.에서 c.로인 것인 것이 우선 순위를 나타내며; 즉, 기준 a.를 충족시키는 것이 가장 요구되고, 기준 a. 및 b.를 충족시키는 것이 두 번째로 가장 요구되며, 기준 a. 내지 c. 모두를 충족시키는 것이 가장 바람직하다. 선정 기준은 하기에서 상세하게 설명된다.
(i) 원치않는 박테리아에 대한 활성
원치않는 박테리아에 대한 시험관내 스크리닝을 수행한다. 하기: 살모넬라 종, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코커스 아우레우스 및 에스케리키아 콜라이 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 박테리아가 "원치않는" 것이다. 바람직하게, 살모넬라 종은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 더욱 바람직하게, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움(Typhimurium)이다.
원치않는 박테리아에 대한 활성은 스폿 온 론 어세이(spot on lawn assay)에 따라 테스트하며, 이는 하기에 기술된다. 테스트하고자 하는 각 균주의 밤새도록 배양된 액체 배양물(MRS)을 MRS 아가 상에 10 ㎕의 단일 스폿으로 적용시키고, 혐기 조건 하에 30℃에서 24 h 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션시킨 후, 원치않는 박테리아 중 하나(1%: 100 ml 배지 중 밤새도록 배양된 배양물 1 ml)가 접종된 7 ml의 반고체 BHI 아가(0.7%)로 플레이트를 덮는다. 테스트하고자 하는 특정의 한 균주를 함유하는 별도의 플레이트를 각각 원치않는 박테리아 종 중 하나로 오버레이시킨다. 상기의 각 테스트는 3중으로 실시한다. 원치않는 박테리아의 최적의 성장 온도에서 또는 그에 근접한 온도에서 24 h 동안 인큐베이션시킨 후(본원에서 언급된 각 원치않는 박테리아에 대한 최적의 성장 온도는 당업계에 공지되어 있다), 억제를 입증하기 위해 시료를 조사한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 먼저 억제대가 존재하는지 여부를 체크한다. 존재할 경우, 억제대의 직경을 광학적으로 측정한다. 억제대가 정확하게 환형으로 보이지 않는 경우, 억제대의 최단 직경을 측정하는 법칙을 사용하여 억제대를 측정한다. 최종적으로, 3중으로 실시된 실험의 산술 평균을 산정하고, 하기 기준을 충족시키는지 여부를 체크한다.
기준: 균주는 양성으로 선정되기 위해서는 하기 조건 [(i), (ii), (iii), (iv)] 중 1 이상을 충족시켜야 한다:
(i) 살모넬라의 경우, 억제대 10 mm 이상, 예를 들어, 14 mm 이상.
(ii) 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 억제대 9 mm 이상, 바람직하게, 10 mm 이상.
(iii) 스타필로코커스 아우레우스의 경우, 억제대 9 mm 이상, 바람직하게, 10 mm 이상.
(iv) 에스케리키아 콜라이의 경우, 억제대 10 mm 이상, 예를 들어, 18 mm 이상.
9 mm 이상은 10 mm 이상, 11 mm 이상, 12 mm 이상, 13 mm 이상, 14 mm 이상, 15 mm 이상, 16 mm 이상, 17 mm 이상, 18 mm 이상, 19 mm 이상, 20 mm 이상, 21 mm 이상, 22 mm 이상, 23 mm 이상, 24 mm 이상, 25 mm 이상을 포함한다.
10 mm 이상은 11 mm 이상, 12 mm 이상, 13 mm 이상, 14 mm 이상, 15 mm 이상, 16 mm 이상, 17 mm 이상, 18 mm 이상, 19 mm 이상, 20 mm 이상, 21 mm 이상, 22 mm 이상, 23 mm 이상, 24 mm 이상, 25 mm 이상, 26 mm 이상, 27 mm 이상, 28 mm 이상, 29 mm 이상, 30 mm 이상, 35 mm 이상을 포함한다.
14 mm 이상은 15 mm 이상, 16 mm 이상, 17 mm 이상, 18 mm 이상, 19 mm 이상, 20 mm 이상, 19 mm 이상, 20 mm 이상, 25 mm 이상, 30 mm 이상을 포함한다.
18 mm 이상은 19 mm 이상, 20 mm 이상, 21 mm 이상, 22 mm 이상, 23 mm 이상, 24 mm 이상, 25 mm 이상, 26 mm 이상, 27 mm 이상, 28 mm 이상, 29 mm 이상, 30 mm 이상, 35 mm 이상을 포함한다.
수개의 균주를 포함하는 조성물은 또한 상기 기준에 대해 테스트될 수 있고, 상기 조성물은 본원에 기술된 의학적 용도 중 임의의 것에 적합한 것으로 선정될 수 있도록 하기 위해서는 기준 [(i), (ii), (iii), (iv)] 모두를 충족시켜야 한다. 또한, 상기 조성물은, 모두가 기준 (i), (ii), (iii), (iv) 중 1 이상을 충족시키는 개별 미생물 균주를 조합함으로써 적합하게 제조될 수 있다고 예상할 수 있지만; 실제로 그러한지 여부는 실험을 통해 테스트되어야 한다.
별법으로, 아가 웰 확산 검정법을 사용하여 억제대를 측정할 수 있다. 본 방법에서는 무세포 상청액을 중화시킴으로써 낮은 글루코스 MRS 브로쓰에서 생산될 수 있는 임의의 미량의 락트산을 제거한다. 혐기 조건 하에서 성장시킨, 테스트하고자 하는 종의 정체기 배양물을 원심분리(5,000 g/20 min/4℃)에 의해 수거하고, 1 M NaOH를 이용하여 무세포 상청액의 pH를 6.5로 조정한다. 상청액을 필터 멸균시킨다(0.20 mm; 밀리포어 리미티드(Millipore Ltd.: 잉글랜드 하트퍼드셔)). [대략] 105 콜로니 형성 단위(CFU)/ml의, (i), (ii), (iii), (iv)에 기재된 원치않는 박테리아가 접종된 아가 플레이트로 절단된 7 mm 직경의 웰에 무세포 상청액(30 ㎕)을 첨가한다. 이어서, 아가 플레이트를 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 웰 주변의 억제대 직경을 측정하고, 선정 기준은 상기 (i), (ii), (iii), (iv) 하에 기술된 바와 같으며, 균주는 양성으로 선정되기 위해서는 그 조건 중 1 이상을 충족시켜야 한다.
정보를 위해: 상기 검정법은 문헌[Kawai et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911]; [Dortu et al. 2008. Letters in Applied Microbiology, 47:581-586]; [Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 37:94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125-1132]에 기술된 것에 기초한다.
(ii) 내산성
산은 위액을 모방하는 것으로 간주될 수 있고, 그에 대한 내성은 하기와 같이 테스트된다. 6-8 x 108 CFU/ml의 각 균주의 MRS 중 100 ㎕의 초기 현탁액을 적절한 양의 12 N HCl 첨가시 산성화된, 산성화된 MRS(pH=3.5, 또는 별법으로, pH=2.5) 중에 현탁시키고, 110 rpm으로 교반하면서, 37℃에서 인큐베이션시킨다. 0, 3 및 6시간째에 콜로니 계수(CFU/ml)에 의해 시료를 테스트한다.
기준: 균주는 상기 배지 중에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력(테스트 이전과 비교하여 테스트 이후 50% 이상, 또는 55% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 95% 이상의 CFU , 가장 바람직하게, 테스트 이전과 비교하여 테스트 이후 50% 이상의 CFU )을 유지할 수 있어야 한다. 참조를 위해: 유사한 프로토콜은 문헌[Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91:253-260]에 간략하게 기술되어 있다.
(iii) 담즙산염 내성
포유동물의 천연 소장 조건의 모의 실험
6-8 x 108 CFU/ml의 박테리아 균주의 MRS 중 100 ㎕의 초기 현탁액을 모의 소장액(예컨대, pH=8(NaOH 첨가시 조정된 pH)의 MRS 및 0.45% 담즙 추출물(바일(Bile) 추출물, 돼지. B8631-100G. 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH))) 중에 현탁시키고, 110 rpm으로 교반하면서, 37℃에서 인큐베이션시킨다. 1, 2 및 4시간째에 콜로니 계수(CFU/ml)에 의해 시료를 테스트하였다.
기준: 4시간 동안 모의 소장액(0.45% 담즙산염 , 임의적으로 pH=8)에의 노출 후, 생존력을 상실하지 않아야 한다(또는 본질적으로 생존력을 상실하지 않아야 하고, 즉, 바람직하게, 50% 이상의 CFU , 예컨대, 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 75%, 또는 80%, 또는 95% 이상의 CFU ). 유사한 프로토콜은 문헌[Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91:253-260]에 간략하게 기술되어 있다.
임의적으로, 상기 기준 a. 내지 c.에 의해 양성으로 확인된 균주는 또한 그의 상피 표면에의 부착성 및 동물(예컨대, 돼지) 위장관에서의 존속성에 대해서도 테스트될 수 있다. 부착 특성이 우수한 균주가 성능이 가장 우수할 것으로 여겨진다.
임의적으로, 상기 기준 a. 내지 c.에 의해 양성으로 확인된 균주는 추가적으로 예컨대, 최소 항생체 농도 테스트(VetMIC 마이크로플레이트 테스트)에 의해 그의 항생제 내성 프로파일에 대하여 테스트되고/되거나, 상이한 내성 유전자에 대해 PCR을 수행함으로써 유전자형 내성 테스트가 실시된다(문헌[Egervaern et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97:189-200]). 항생제 내성이 없는(내성 유전자의 부재 또는 불활성/기능 상실) 박테리아가 농장 동물에 적용하기에 가장 적합한 것으로 여겨진다.
본 발명의 락트산 박테리아는 하기 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10), CECT 8347(AqSynJ12), CECT 8348(AqSynJ17), CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)로부터 선택될 수 있다. 이들 균주는 모두 프로바이오틱 특성을 가지며, 따라서, 이는 본원에서 프로바이오틱스로 지칭될 수 있다고 여겨진다. 각 균주들은 본 발명자들에 의해 상기 선정 기준에 따라 단리되었다. CECT는 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션을 의미하고, 괄호 안의 AqSyn 번호는 본 발명자가 균주에 배정한 것이며, 이는 각 균주에 대하여 같은 뜻으로 사용될 수 있다. 각 박테리아는 테스트되었고, 이는 상기 기준 a. 내지 c. 중 1 이상을 충족시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따라 유익한 특성을 가지는 추가의 균주를 찾을 경우, 본 발명에 적합한 것으로 선정되도록 하기 위해서는 임의의 상기 균주는 상기 기준 a. 내지 c. 중 1 이상을 충족시키면 충분한 것일 수 있다. 본 발명은 또한 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 3종, 더욱 바람직하게, 4종 이상, 예컨대, 4종, 별법으로, 5종 이상, 예컨대, 5종, 별법으로, 6종 이상, 예컨대, 6종, 별법으로, 7종 이상, 예컨대, 7종, 별법으로, 8종 이상, 예컨대, 8종의 상기 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 상이한 균주는 장관에서 상이한 작용을 하며, 따라서, 상이한 균주는 함께 작용하여 유익한 효과를 제공할 수 있다고 여겨진다.
특정 실시양태에서, 본 조성물은 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 하기 3종의 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8164(AqSyn09) 및 CECT 8166(AqSyn10)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09) 및 CECT 8166(AqSyn10)을 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10); CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 하나 이상, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종을 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 1종 이상, 예컨대, 1종, 바람직하게, 2종 이상, 예컨대, 2종, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 3종, 더욱 바람직하게, 4종 이상, 예컨대, 4종을 포함한다.
대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17) 및 CECT 8349(AqSynJ55)를 포함한다. 대체 실시양태에서, 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ 2); CECT 8348(AqSynJ17); 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 하기 3종의 균주: CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)을 포함한다. 대체 실시양태에서, 본 조성물은 CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 4종 모두를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 조성물 중에 포함된 균주 중 1종 이상, 예컨대, 본 조성물 중에 포함된 1종 및/또는, 2종 및/또는, 3종 및/또는, 4종 및/또는, 5종 및/또는, 6종 및/또는, 7종 및/또는, 8종의 균주는 항생제 내성이 없고, 즉, 적절한 표준 항생체 처리에 노출된 후에는 생존이 불가능하다.
항생제 내성을 평가하고자 하는 시험관내 최소 억제 농도(MIC: minimal inhibitory concentration) 테스트를 제안된 모든 균주에 대하여 수행할 수 있다. 평가되는 항생제는 하기의 것일 수 있다:
암피실린, 반코마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜.
감수성 균주로부터 내성 균주를 구별하기 위한 목적으로, 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority: EFSA)의 동물 사료에 사용되는 첨가물 및 제품 또는 물질에 관한 패널(Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed: FEEDAP)은 미생물학적 컷 오프 값을 정의한다. 미생물학적 컷 오프 값은 단일의 분류학적 단위(종 또는 속)에 속하는 박테리아 집단 중 선택된 항미생물제의 MIC의 분포를 연구함으로써 설정된다. 일반 감수성 집단으로부터 뚜렷이 벗어나는 집단 중 일부를 내성인 것으로 분류한다. 본 발명의 균주의 항생제 내성을 평가하는 데 사용될 수 있는 미생물학적 컷 오프 값은 ["Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance", EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. EFSA Journal 2012;10(6):2740]에서 정의된 것이다.
어느 경우에서든 "포함한다"라는 것은 임의적으로 추가의 박테리아 균주가 존재한다거나, 또는 어떤 추가의 박테리아 균주도 존재하지 않는다는 것으로 이해될 수 있다. 비록 어떤 추가의 박테리아 균주도 존재하지 않을지라도, "포함한다"라는 것은 임의적으로 추가의 다른 성분, 즉, 박테리아 이외의 임의의 성분이 존재한다는 것을 의미할 수 있다.
다른 성분(또는 다른 성분들)은 어느 방식으로든 한정되지 않는다. 바람직한 측면에서, 1종 이상의 프리바이오틱 화합물이 즉, 다른 성분으로서 본 발명의 조성물 중에 포함된다. 매우 넓은 개념에서, 프리바이오틱스는 프로바이오틱스에 의해 대사될 수 있는 모든 식품 공급원이다. 바람직하게, 프리바이오틱스는 포유동물에 의해 비소화성이거나, 난소화성이다. 따라서, 포유동물에 의해 흡수된 후, 비소화성 프리바이오틱스는 소장을 통과하여 대장으로 진입하여 상기 구획에서 프로바이오틱스의 성장을 자극시킬 수 있다. 따라서, 프리바이오틱스는 프로바이오틱스에 대한 식품 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 다수가 비소화성 탄수화물인 프리바이오틱스가 장관 내부에서 프로바이오틱스의 성장을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 프리바이오틱스는 천연적으로 예를 들어, 양파, 전곡, 바나나, 마늘, 꿀, 부추, 아티초크, 강화 식품 및 음료뿐만 아니라, 식이 보충제에서 발견된다. 프리바이오틱스는 당업계에 주지되어 있으며, 따라서, 본 발명에서 사용될 때, 프리바이오틱스에 대한 특별한 제한은 없다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 조성물 중 1종 이상의 프리바이오틱 생성물은 하기 화합물 및 조성물: 비소화성 탄수화물, 베타-글루칸, 만난-올리고당, 이눌린, 올리고프럭토스, 갈락토올리고당(GOS), 락툴로스, 락토수크로스, 갈락토트리오스, 프럭토-올리고당(FOS), 셀로비오스, 셀로덱스트린, 사이클로덱스트린, 말티톨, 락티톨, 글리코실수크로스, 비타민 E 또는 그의 변이체여기서, 변이체는 알파, 베타, 감마, 델타 토코페롤, 토코트리에놀 및 토코모노에놀로부터 선택된다)로부터 선택된다. 임의적으로, 만난-올리고당 및/또는 이눌린이 바람직할 수 있다.
상이한 균주의 조성과 관련하여, 임의의 혼합비가 가능하다. 혼합비는 콜로니 형성 단위(CFU)로 표시되며, 이는 개별 균주를 혼합하기 전에 적합하게 결정된다. 한 실시양태에서, 균주의 비는 동일하거나, 동일하지 않을 수 있으며, 예컨대, 3종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:(0.1-10):(0.1-10), 4종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10) 등이다. 또 다른 실시양태에서, 균주의 비는 대략 또는 실질적으로 동일하며, 예컨대, 3종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:1:1, 4종의 균주들로 이루어진 조성물의 경우, 1:1:1:1 등이다. 조성물은 조성물 내로 혼입되는 각 균주를 (콜로니 계수로 결정된) 각 박테리아 양으로 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물을 치료하는 방법에서 조성물의 용도를 제공한다. 동물, 포유동물, 및/또는 특히, 가축 치료에 바람직할 수 있다. 바람직하게, 동물은 수이나 아목으로부터(수이나 아목은 수이다에 과 및 타야수이다에 과의 돼지 및 페커리를 포함하는 포유동물 계통이다)의 것이다. 야생 또는 가축용 돼지(swine 또는 pig)가 특히 바람직할 수 있다. 이는 또한 반야생 조건에서 서식하는 돼지, 즉, 연중 대부분은 야외에서 서식하고, 그들 자신의 먹이를 찾는 가축용 돼지 종을 포함한다. 조성물은 상기 기술된 기탁된 균주 중 1종 이상을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명은 또한 갓 태어난 포유동물, 바람직하게, 새끼 돼지의 체중을 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 락트산 박테리아를 포함하는 조성물을 제공한다. 별법으로, 조성물은 갓 태어난 포유동물, 바람직하게, 새끼 돼지의 성장을 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 것이다. 별법으로, 조성물은 갓 태어난 포유동물, 바람직하게, 새끼 돼지에서 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 1종 이상, 바람직하게, 2종 이상, 더욱 바람직하게, 3종 이상, 예컨대, 4종 또는 4종 초과의 상이한 락트산 박테리아 균주가 조성물 중에 포함된다. 본 문단에 기술된 용도를 위한 조성물의 경우, 각 락트산 박테리아는 상기 기술된 기준 a. 내지 c.(원치않는 박테리아에 대한 활성; 내산성; 담즙산염 내성) 1 이상을 충족시켜야 한다. 기준 a.와 관련하여, 상기 언급된 최소 억제대는 전형적으로 원치않는 박테리아 (i) 내지 (iv) 모두에 대하여 관찰된다. 바람직하게, 조성물은 복수 개(예컨대, a. 및 b.) 및 바람직하게는 상기 기준 모두(a. 내지 c.)를 충족시켜야 한다. 상기 방법에서 어떤 항생제도 동물에게 투여되지 않는 것이 또한 가능하다. 프로바이오틱 조성물 또는 신바이오틱 조성물(즉, 1종 이상의 프리바이오틱 화합물을 포함하는 것)이 상기 방법에서 사용될 수 있다
본 발명의 조성물인 조성물은 살아있는 미생물, 바람직하게, 박테리아를 포함한다. 특히, 체중을 증가시키는 방법 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법 및/또는 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물은 박테리아 균주 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10); CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55); 및 CECT 8350(AqSynJ59) 중 1종 이상, 예컨대, 1종, 및/또는 2종, 및/또는 3종, 및/또는 4종, 및/또는 5종, 및/또는 6종, 및/또는 7종, 및/또는 8종을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 체중을 증가시키는 방법 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법 및/또는 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물은 (기술된 임의의 실시양태에서) 상기 기술된 특정 조성물이다.
체중을 증가시키는 방법 및/또는 성장을 촉진시키기 위한 방법 및/또는 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 조성물은 출생 후 처음 14일 이내에, 더욱 바람직하게, 출생 후 처음 13일, 또는 12일, 또는 11일, 또는 10일, 또는 9일, 또는 8일, 또는 7일, 또는 6일, 또는 5일, 또는 4일, 또는 3일, 또는 2일 이내에, 및 가장 바람직하게, 출생 후 처음 2일 이내에, 또는 출생 후 처음 1일(24시간) 이내에 투여될 수 있다.
임의의 투여 경로가 적합하지만, 경구 투여가 바람직할 수 있다. 가장 전형적으로, 용량은 동물이 상기 용량을 확실하게 삼킬 수 있도록 하기 위해 모든 동물의 입에 직접 제공된다. 별법으로, 조성물은 또한 식품 보충제로서 제공될 수 있으며, 즉, 동물의 일일 사료에 첨가될 수 있다.
조성물은 임의 형태, 예컨대, 동결 건조된 형태, 액체 형태 또는 분무된 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물을 제조하는 데 동결 건조된 박테리아가 사용될 경우, 이때, 동결 건조된 박테리아로 이루어진 상기의 예비 조성물을 멸균 등장성 염수 용액으로, 또는 멸균수로, 또는 멸균 성장 배지로 재수화시킬 수 있고, 이로써, 원하는 총 농도(CFU/ml)를 가지는 최종 조성물을 수득할 수 있다.
용이하게 사용될 수 있도록 하기 위해, 조성물은 투여 형태일 수 있다. 예를 들어, 각 용량은 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상의 콜로니 형성 단위(CFU)의 미생물(박테리아)을 포함한다; 109 이상의 용량이 바람직할 수 있다. 용량은 0.1 내지 100 ml, 바람직하게, 0.2 내지 50 ml, 더욱 바람직하게, 0.5 내지 20 ml, 더욱 바람직하게, 1.0 내지 10 ml, 더욱 바람직하게, 1.5 내지 5 ml 범위, 및 더욱 더 바람직하게, (실질적으로) 2 ml의 부피를 가질 수 있다. 109 이상의 CFU를 가지는 2 ml의 용량이 특히 바람직할 수 있다.
임의 횟수의 용량이 투여될 수 있고, 당업자는 각 농장에서의 요구에 따라 치료 기간을 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동물에게 투여되는 용량의 총 횟수는 10회 이하, 예컨대, 하기: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회로부터 선택되는 임의의 횟수, 또는 상기 횟수 중 어느 하나(단, 10회 제외)를 상기 횟수 중 어느 하나와 조합한 임의의 범위이되, 단, 두번째 횟수가 더 크다(예컨대, 1 내지 3회 용량). 동물 1마리당 총 2회 용량이 특히 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 임의적으로 생애 초기 단계에 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물을 사용함으로써 상기 조성물에 대한 신규한 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 용량은 출생 후 처음 24시간 내에 투여되고, 제2 용량은 후속 24시간 내에 투여된다. 임의적으로, 이는 단 2회 용량이다. 또 다른 옵션에서, 추가 용량은 하기와 같이 투여된다.
본 발명의 조성물은 포유동물의 병증, 예컨대, 박테리아 감염 또는 장내 세균 불균형을 치료 또는 예방하는 데 특히 적합하다. 감염은 소화관의 감염일 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 상기 감염은 임의의 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 단독으로, 또는 클로스트리디움 퍼프린겐스 또는 클로스트리디움 디피실과의 조합으로 유발될 수 있다. 다른 원인 인자로는 살모넬라, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코커스 아우레우스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 병증은 박테리아 감염에 기인하는 설사(대장균증 포함), 갓 태어난 동물의 클로스트리디움 디피실 설사, 클로스트리디움 퍼프린겐스 A형 및 C형으로부터 선택될 수 있다. 연쇄구균성 수막염 또한 치료될 수 있다. 또한, 심지어 (박테리아) 감염이 상기 설사에 대한 원인 인자인 것으로 (아직) 입증되지 않은 경우에도, 본 조성물을 설사를 앓는 동물에게 또는 설사를 앓을 위험이 있는 동물에게 투여할 수 있다. 설사를 앓을 위험이 있는 동물이란 최근 12개월, 6개월, 3개월 또는 1개월 동안 설사가 관찰된 부지에서 서식하고 있는 (또는 그 부지에서 태어난) 동물로서 간주될 수 있다.
본 발명자의 결과를 통해 본 발명의 생성물 및 조성물의 사용이 유익한 효과가 있다는 것이 확인된다. 하기의 개념 증명 실시예에 제시된 바와 같이, 단지 통상의 항생제 처리만을 수행한 다른 주간들보다도 치사율(%)은 분명히 더 낮았다(실시예 참조). 따라서, 바람직하게, 본 발명의 조성물은 동시에 항생제(들)로 처리되지 않은 동물에게 투여된다.
본 발명은 또한 미생물, 바람직하게, 박테리아, 및 더욱 바람직하게, 락트산 박테리아를 제공한다. 락트산 박테리아는 이상적으로 하기 균주: CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09); CECT 8166(AqSyn10), CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59)으로부터 선택되며, 이들은 모두 CECT에 기탁되었다.
본 출원은 하기 항목을 포함한다:
1. 갓 태어난 포유동물(바람직하게, 새끼 돼지)의 체중을 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 조성물로서, 각 균주는 적어도 하기 조건 a., 바람직하게는 두 조건 a 및 b 모두, 가장 바람직하게는 조건 a., b., 및 c. 모두를 충족시키는 것인 조성물:
a. 스폿 온 론 어세이에 의해 측정되는 억제대에 의해 입증되는 바와 같이, 하기 항미생물 활성 중 1 이상을 가지는 조건: (i) 살모넬라의 경우, 14 mm 이상의 억제대, (ii) 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 9 mm 이상의 억제대, (iii) 스타필로코커스 아우레우스의 경우, 9 mm 이상의 억제대, (iv) 에스케리키아 콜라이의 경우, 18 mm 이상의 억제대;
b. pH=2.5에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건;
c. 0.45% 담즙 추출물의 존재 하에 및 pH=8에서 4시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건.
2. 하기 균주로부터 선택되는 락트산 박테리아:
a. 기탁 번호 CECT 8163으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn04);
b. 기탁 번호 CECT 8165로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn06);
c. 기탁 번호 CECT 8164로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn09); 및
d. 기탁 번호 CECT 8166으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn10).
3. 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상, 더욱 바람직하게는 3종 이상, 보다 더욱 바람직하게는 항목 2의 박테리아 균주 모두를 포함하는 조성물.
4. 항목 3에 있어서, 하기 3종의 균주를 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 조성물:
i. 기탁 번호 CECT 8163으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn04);
ii. 기탁 번호 CECT 8164로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn09); 및
iii. 기탁 번호 CECT 8166으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn10).
5. 항목 4에 있어서, 항목 1의 균주 4종 모두를 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 조성물.
6. 항목 3 내지 항목 5 중 어느 하나의 항목에 있어서, 1종 이상의 프리바이오틱 생성물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
7. 항목 6에 있어서, 1종 이상의 프리바이오틱 생성물은 하기 화합물 및 조성물: 베타-글루칸, 만난-올리고당, 이눌린, 올리고프럭토스, 갈락토올리고당(GOS), 락툴로스, 락토수크로스, 갈락토트리오스, 프럭토-올리고당(FOS), 셀로비오스, 셀로덱스트린, 사이클로덱스트린, 말티톨, 락티톨, 글리코실수크로스, 비타민 E 또는 그의 변이체(여기서, 변이체는 알파, 베타, 감마, 델타 토코페롤, 토코트리에놀 및 토코모노에놀로부터 선택된다)로부터 선택되며, 만난-올리고당 및/또는 이눌린이 바람직한 것인 조성물.
8. 항목 3 내지 항목 7 중 어느 하나의 항목에 있어서, 인간 또는 동물, 바람직하게는 포유동물 및/또는 가축, 더욱 바람직하게는 돼지를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것인 조성물.
9. 항목 1에 있어서, 조성물은 항목 3 내지 항목 7 중 어느 하나의 항목에 따른 조성물인 것인 조성물.
10. 항목 1 또는 항목 9에 있어서, 조성물은 출생 후 처음 14일 이내에, 더욱 바람직하게는 출생 후 처음 13, 12, 11, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3일 이내에, 가장 바람직하게는 출생 후 처음 2일 이내에 투여되는 것인 조성물.
11. 항목 1, 항목 9 및 항목 10 중 어느 하나의 항목에 있어서, 경구 투여용인 조성물.
12. 항목 1 및 항목 9 내지 항목 11 중 어느 하나의 항목에 있어서, 동결 건조된 형태, 액체 형태 또는 분무된 형태인 조성물.
13. 항목 1 및 항목 9 내지 항목 12 중 어느 하나의 항목에 있어서, 조성물은 투여 형태로 제공되며, 각 투여량은 109 이상의 콜로니 형성 단위(CFU)를 포함하는 것인 조성물.
14. 항목 13에 있어서, 2회 용량으로 투여하기 위한 것인 조성물.
15. 항목 14에 있어서, 제1 용량은 출생 후 처음 24시간 내에 투여되고, 제2 용량은 후속 24시간 내에 투여되는 것인 조성물.
16. 항목 1 및 항목 9 내지 항목 15 중 어느 하나의 항목에 있어서, 박테리아 감염, 예컨대, 박테리아 감염에 기인하는 설사(대장균증 포함), 갓 태어난 동물의 클로스트리디움 디피실 설사, 클로스트리디움 퍼프린겐스 A형 및 C형을 치료 또는 예방하기 위한 것인 조성물.
재료 및 방법
MRS 배지: MRS 배지 제조법을 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션(CECT: www.cect.org)으로부터 입수한 제조법에 따라 하기와 같이 제공하였다: 펩톤 10.0 g, 쇠고기 추출물 10.0 g, 효모 추출물 5.0 g, 글루코스 20.0 g, 시트르산 암모늄 2.00 g, 아세트산 나트륨 5.00 g, MgSO4.7H2O 0.20 g, MnSO4.H2O 0.05 g, K2HPO4 2.00 g, [아가 분말(고체 배지인 경우에만) 15 g,] 증류수 1 L.
BHI(브레인 하트 인퓨젼(Brain Heart Infusion)) 배지 제조법을 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션(CECT: www.cect.org)으로부터 입수한 제조법에 따라 하기와 같이 제공하였다: 송아지 뇌 침출물 고체 12.5 g, 쇠고기 심장 침출물 고체 5.0 g, 프로테오스 펩톤 10.0 g, 글루코스 2.0 g, NaCl 5.0 g, HNa2P04 2.5 g, 증류수 1 L, [아가 분말 (고체 배지인 경우에만) 15 g].
항생제 처리: 전형적으로, 각 돼지 농장은 갓 태어난 새끼 돼지를 항생제 및 가능하게는 철 보충제로 처리한다. 일반적으로, 각 돼지 농장은 그의 동물에 대하여 상이한 "표준" 처리법을 가진다(그들은 일반적으로 태어날 때부터 항생제 용량 및 철 보충제를 주사한다). 하기 실험에서는 각 농장의 표준 처리법을 사용하였다. 항생제는 또한 일반적으로 새끼 돼지에서 전체적으로 확립된 프로토콜 없이 매일 설사, 절름발이, 호흡기 증상 및 많은 다른 인자에 의해 산발적으로 사용된다.
실시예
실시예
1A: 균주 기원
박테리아 균주를 하기와 같이 단리시키고, 확인하였다.
암퇘지로부터의 초유 및 갓 태어난 새끼 돼지로부터의 태변 시료로부터 CECT 8163(AqSyn04); CECT 8165(AqSyn06); CECT 8164(AqSyn09) 및 CECT 8166(AqSyn10) 박테리아 균주를 단리시켰다. 스페인의 위생 품질이 높은 돼지 농장에서 시료를 채취하였다.
시료를 호기 및 혐기 방식으로 드 맨, 로고사, 샤페(De Man, Rogosa, Sharpe: MRS) 아가 플레이트에서 24시간 동안 37℃에서 성장시키고, 상이한 형태의 그람 양성, 카탈라제 음성 콜로니를 단리시켰다. 콜로니 모두 박테리아 균주에 속하였다. 더욱 정확하게, 61개의 상이한 박테리아 균주를 단리시켰다. 문헌[Berthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161:97-106]에 기술된 바와 같이, 16S/23S rRNA 스페이서 영역을 표적화하는 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 각각 하나씩 증폭시켰다.
증폭 및 전기영동 후, 뚜렷이 구분된 밴드를 정제하고, 서열을 분석하였다. 상이한 PCR 패턴은 도 1에 제시되어 있다. 서열을 분석함으로써 균주를 수개의 박테리아 종으로 배정하였다.
1.1 균주의 특징 규명
특정 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 실질적으로는 균주 간에 차이가 존재할 수 있다고 여겨진다. 동일한 종의 균주를 구별하기 위해, 기질의 탄수화물 발효 패턴을 기술하기 위한 목적으로 제조사의 설명서에 따라 API 50 CH 테스트(바이오메리유(Biomerieux), REF 50 300)를 수행함으로써 같은 종의 균주 사이의 차이를 확인하였다.
탄수화물 발효 패턴에 의해 61개의 균주로부터 10개의 상이한 군이 관찰될 수 있으며, 이를 통해 10개의 상이한 균주가 존재한다는 것을 확인하였다. 각 군에서 하나를 일례로 취하여 그에 대해 하기의 시험관내 방법을 수행하였다.
10개의 균주는 락토바실러스 루테리 종 및 엔테로코커스 파에시움 종에 속하였다.
1. 락토바실러스 루테리
2. 락토바실러스 루테리
3. 락토바실러스 루테리
4. 락토바실러스 루테리(AqSyn04)
5. 락토바실러스 루테리
6. 락토바실러스 루테리(AqSyn06)
7. 엔테로코커스 파에시움
8. 엔테로코커스 파에시움
9. 엔테로코커스 파에시움(AqSyn09)
10. 엔테로코커스 파에시움(AqSyn10).
동물(특히, 돼지) 건강을 개선시키는 데 있어서 그의 사용 가능성을 체크하기 위해 상기 10개의 균주를 추가로 테스트하였다(하기 섹션 1.2를 참조할 수 있다).
1.2 균주 선정
섹션 1.1에 기술된 바와 같이 확인된 10개의 균주를 추가로 테스트하였다. 항미생물성 및 내성 기준의 조합이 이전 균주들 중에서 적합한 균주를 찾는 데 도움이 될 수 있다고 가정하였다. 따라서, 각각의 균주에 대해 "선정 시험관내 테스트" 하에 상기 기술된 테스트 a. 내지 c.를 각각 수행하였다.
본 발명자들이 끊임없이 노력하여 연구한 결과, "선정 시험관내 테스트" 하에 상기 기술된 기준 a. 내지 c.가 본 발명에 적합한 균주를 확인하는 데 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 기준 a. 내지 c.에 따라 균주를 테스트하였다. 시험관내 테스트를 통해 특히 유익한 특성을 가진 4개의 균주가 밝혀졌다. 본 결과는 하기에 기재되어 있다.
| 시험관내 테스트 결과 | ||||
| AqSyn04 | AqSyn06 | AqSyn09 | AqSyn10 | |
| a. (i) 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 억제대 [mm] | 17 | 14 | 17 | 17 |
| a. (ii) 리스테리아 모노사이토게네스 억제대 [mm] | 12 | 9 | 23 | 17 |
| a. (iii) 스타필로코커스 아우레우스 억제대 [mm] | 9 | 9 | 11 | 13 |
| a. (iv) 에스케리키아 콜라이 억제대 [mm] | 21 | 18 | 27 | 24 |
| b. 내산성(유/무) | 유 | 유 | 유 | 유 |
| c. 담즙산염 내성(유/무) | 유 | 유 | 유 | 유 |
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 시험관내 테스트 후, 4개의 균주(2개의 락토바실러스 루테리(AqSyn04, AqSyn06) 및 2개의 엔테로코커스 파에시움(AqSyn09, AqSyn1O))가 확인되었다. [나머지 6개의 균주에 대한 결과, 즉, 기준 a. 내지 c. 중 1 이상을 충족시키지 못한 균주는 상기 표에 제시되어 있지 않다].
실시예 2A에 기술되는 바와 같이, 상기 균주의 조성물을 그로부터 제조하였다.
실시예
1B: 균주 기원
박테리아 균주를 하기와 같이 단리시키고, 확인하였다.
야생 수퇘지 장의 장벽 세척액으로부터 CECT 8347(AqSynJ12); CECT 8348(AqSynJ17); CECT 8349(AqSynJ55) 및 CECT 8350(AqSynJ59) 박테리아 균주를 단리시켰다.
시료를 호기 및 혐기 방식으로 디 맨, 로고사, 샤페(MRS) 아가 플레이트에서 24시간 동안 37℃에서 성장시키고, 상이한 형태의 그람 양성, 카탈라제 음성 콜로니를 단리시켰다. 콜로니 모두 박테리아 균주에 속하였다. 더욱 정확하게, 61개의 상이한 박테리아 균주를 단리시켰다. 문헌[Berthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161:97-106]에 기술된 바와 같이, 16S/23S rRNA 스페이서 영역을 표적화하는 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 각각 하나씩 증폭시켰다.
증폭 및 전기영동 후, 뚜렷이 구분된 밴드를 정제하고, 서열을 분석하였다. 서열을 분석함으로써 균주를 수개의 박테리아 종으로 배정하였다.
1.1 균주의 특징 규명 및 선정
1. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(AqSynJ12)
2. 락토바실러스 루테리(AqSynJ17)
3. 락토바실러스 뮤코사에(Lactobacillus mucosae)(AqSynJ55)
4. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)(AqSynJ59)
"선정 시험관내 테스트" 하에 상기 기술된 기준 a. 내지 c.에 따라 시험관내 테스트를 수행함에 따라 특히 유익한 특성을 가진 4개의 균주가 밝혀졌다. 본 결과는 하기에 기재되어 있다.
| AqSynJ12 | AqSynJ17 | AqSynJ55 | AqSynJ59 | |
| a. (i) 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 억제대 [mm] | 15 | 11 | 14 | 13 |
| a. (ii) 리스테리아 모노사이토게네스 억제대 [mm] | 13 | 10 | 15 | 13 |
| a. (iii) 스타필로코커스 아우레우스 억제대 [mm] | 10 | 10 | 9 | 9 |
| a. (iv) 에스케리키아 콜라이 억제대 [mm] | 18 | 16 | 20 | 21 |
| b. 내산성(유/무) | 유 | 유 | 유 | 유 |
| c. 담즙산염 내성(유/무) | 유 | 유 | 유 | 유 |
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 야생 수퇘지로부터의 균주는 선정 기준을 충족시킨다. 또한, 상기 확인된 균주에는 항생제 내성이 없다.
항생제 내성을 평가하고자 하는 시험관내 최소 억제 농도(MIC) 테스트를 상기 균주(AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55, AqSynJ59)에 대해 수행하였다. 평가된 항생제는 하기와 같았다:
암피실린, 반코마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜.
본 발명의 균주의 항생제 내성을 평가하는 데 사용된 미생물학적 컷 오프 값은 문헌["Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance", EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. EFSA Journal 2012;10(6):2740]에서 정의된 것이다.
실시예 2A에 기술되는 바와 같이, 상기 균주의 조성물을 그로부터 제조하였다(조성물 D 및 E).
실시예
2A: 본 발명에 따른
프로바이오틱
조성물 및 본 발명에 따른
신바이
오틱 조성물 제조
균주 AqSyn04, AqSyn06, AqSyn09, AqSyn10을 각각 발효에 의해 MRS 브로쓰 배양물 중에서 성장시키고, 수거하고, 동결 건조시켰다. 콜로니를 계수함으로써 최종 생성물의 생존력을 체크하였다. 임의적으로 프리바이오틱 화합물을 첨가하여 상기 균주 4종 모두를 함유하는 조성물을 제조하였다. 하기 조성물을 제조하였다:
| 조성물 A: (2 ml 중 2.5 x 108 CFU의 각 균주) | |
| 성분 | 2 ml 용량당 정량 |
| AqSyn04 락토바실러스 루테리 | 0.0035 g |
| AqSyn06 락토바실러스 루테리 | 0.0035 g |
| AqSyn09 엔테로코커스 파에시움 | 0.0016 g |
| AqSyn10 엔테로코커스 파에시움 | 0.00029 g |
모든 균주는 동결 건조된 형태로 사용되었다. 조성물 A는 프로바이오틱으로 간주될 수 있다.
| 조성물 B: (2 ml 중 2.5 x 108 CFU의 각 균주) | |
| 성분 |
2 ml 용량당 정량
(g) |
| AqSyn04 락토바실러스 루테리 | 0.0035 |
| AqSyn06 락토바실러스 루테리 | 0.0035 |
| AqSyn09 엔테로코커스 파에시움 | 0.0016 |
| AqSyn10 엔테로코커스 파에시움 | 0.00029 |
| 이눌린 | 0.01 |
| β 글리칸 및 MOS | 0.01 |
| 탈지 분유 | 0.02 |
모든 균주는 동결 건조된 형태로 사용되었다. 조성물 B는 신바이오틱으로 간주될 수 있다.
추가로, 4종의 박테리아 균주 중 단 3종(AqSyn04, AqSyn09, AqSyn10)만을 함유하는 조성물 C를 하기와 같이 제조하였다.
| 조성물 C: (2 ml 중 3.3 x 108 CFU의 각 균주) | |
| 성분 |
2 ml 용량당 정량
(g) |
| AqSyn04 락토바실러스 루테리 | 0.0047 |
| AqSyn09 엔테로코커스 파에시움 | 0.0021 |
| AqSyn10 엔테로코커스 파에시움 | 0.00038 |
| 이눌린 | 0.01 |
| β 글리칸 및 MOS | 0.01 |
| 탈지 분유 | 0.02 |
모든 균주는 동결 건조된 형태로 사용되었다. 조성물 C는 신바이오틱으로 간주될 수 있다.
조성물로 혼입시키고자 하는 각 균주를 (콜로니를 계수함으로써 측정된) 동일한 박테리아 양(상기 언급된 각각의 값(g))으로 혼합하여 조성물을 제조하고, 언급된 추가의 성분을 첨가하고(예컨대, 조성물 B, 조성물 C), 그렇게 수득된 각 조성물을 등장성 염수 용액으로 재수화시켜 2 ml 용량 중 109 CFU를 함유하는 최종 조성물(그 안에 모든 균주를 전부 함유)을 수득하였다.
실시예
2B: 본 발명에 따른
프로바이오틱
조성물 및 본 발명에 따른
신바이
오틱 조성물 제조
균주 균주 AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55, AqSynJ59를 각각 발효에 의해 MRS 브로쓰 배양물 중에서 성장시키고, 수거하고, 동결 건조시켰다. 콜로니를 계수함으로써 최종 생성물의 생존력을 체크하였다. 임의적으로 프리바이오틱 화합물을 첨가하여 상기 균주 4종 모두를 함유하는 조성물을 제조하였다. 하기 조성물을 제조하였다:
| 조성물 D: (2 ml 중 2.5 x 108 CFU의 각 균주) | |
| 성분 | 2 ml 용량당 정량 |
| AqSynJ12 락토바실러스 퍼멘텀 | 0.173 g |
| AqSynJ17 락토바실러스 루테리 | 0.04 g |
| AqSynJ55 락토바실러스 뮤코사에 | 0.008 g |
| AqSynJ59 락토바실러스 플란타룸 | 0.002 g |
모든 균주는 동결 건조된 형태로 사용되었다. 조성물 D는 프로바이오틱으로 간주될 수 있다.
| 조성물 E: (2 ml 중 2.5 x 108 CFU의 각 균주) | |
| 성분 | 2 ml 용량당 정량 (g) |
| AqSynJ12 락토바실러스 퍼멘텀 | 0.173 |
| AqSynJ17 락토바실러스 루테리 | 0.04 |
| AqSynJ55 락토바실러스 뮤코사에 | 0.008 |
| AqSynJ59 락토바실러스 플란타룸 | 0.002 |
| 이눌린 | 0.01 |
| β 글리칸 및 MOS | 0.01 |
| 탈지 분유 | 0.02 |
모든 균주는 동결 건조된 형태로 사용되었다. 조성물 E는 신바이오틱으로 간주될 수 있다.
실시예
3: 항생제 투여 없이 새끼 돼지에게 투여(제1 개념 증명)
2,400마리의 암퇘지와 만성 설사 문제가 있는 갓 태어난 새끼 돼지가 있는, 사모라 지방(스페인)에 위치하는 농장 옆의 돼지 농장에서 제1 개념 증명을 수행하였다. 하기와 같이, 7배 새끼(78마리의 새끼 돼지)는 조성물 A를 받았고(실시예 2A 참조), 또 다른 7배 새끼(81마리의 새끼 돼지)는 대조군으로서 그대로 유지시켰다.
조성물 A를 투여받은 새끼 돼지는 항생제 처리 없이 출생일부터 생후 14일째까지 매일 1 용량(실시예 2A 참조)을 받았다.
150 mg의 아목시실린 및 40,000 UI의 겐타마이신을 함유하는 시판용 제품 1 ml를 IM 주사하여 대조군을 처리하였다. 상기 군에서 설사를 앓는 새끼 돼지는 그가 설사를 보인 날 동안 매일 1회에 걸쳐 상기 처리를 받았다.
| 조성물 A | 항생제 처리(대조군) | |
| 평균 설사 시간(일) | 3.14 | 5.29 |
| 평균 1일 증가량 (0일째부터 9일째)(g) |
178 | 141 |
| 이유에 의한 평균 1일 증가량 (23일)(g) |
225 | 170 |
| 이유에 의한 평균 체중(g) | 6.70 | 5.47 |
제1 개념 증명은 매우 주목할 만한 결과를 나타내었는데, 이는 본 발명의 치료가 예상 밖의 효능이 있음을 보여주는 것이었다. 상기 결과에 따라, 본 발명자들은 병원체 세균총에서의 예상되는 효과뿐만 아니라, 새끼 돼지의 자연 면역계의 자극을 가정하였다. 특정 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 투여된 조성물이 소화기 병원체 및 가능하게는 상기 소화기 감염에 대한 새끼 돼지의 자연 반응에 대해서도 직접적으로 영향을 미친다고 이해할 수 있다.
실시예 4: 상이한 투여 요법으로 새끼 돼지에게로의 투여(제2 개념 증명 )
본 실험은 사모라(스페인)의 실시예 3과 동일한 농장에서 수행하였다. 간략하면, 본 발명자들은 조성물 A가 갓 태어난 새끼 돼지의 선천 면역계에 미치는 영향을 입증하고자 하였다. 새끼 돼지의 상이한 생애 초기 단계에서 투여하는 것 또한 조사하였다. 새끼 돼지의 생애 초기에는 동물의 세균총은 아직 미성숙한 것으로 이해된다.
실시예 3에서와 같이, 조성물 A를 출생 당일 7배 새끼(65마리의 새끼 돼지)에게 제공하였고, 제2군의 7배 새끼(84마리의 새끼 돼지)는 생후 1일째 및 2일째에서 조성물 A를 받았고(임의의 항생제 적용), 제3군의 7배 새끼(80마리의 새끼 돼지)는 대조군으로서 취하였다. 오직 대조군만이 항생제 처리를 받았으며, 조성물 A를 받은 군은 어떤 항생제 적용도 없었다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 대조군에서와 같이 유사한 체중 증가에 도달할 수 있다는 것을 입증하였다.
| 조성물 A 1회 용량 |
조성물 A 2회 용량 |
항생제 처리 (대조군) |
|
| 평균 설사 시간(일) | 4.1 | 4.3 | 1 |
| 이유에 의한 평균 1일 증가량 (19-22일)(g) |
147 | 198 | 187 |
| 이유에 의한 평균 체중(g) | 5.47 | 5.36 | 5.58 |
| 치사율(%) | 4(6.15) | 1(1.19) | 4(5) |
본 결과, 2회 용량으로 투여하는 것이 유익한 것으로 나타났다. 특히, 새끼 돼지 출생 후 아주 이른 초기 단계에서 이중으로 적용하는 것이 항생제를 사용하지 않고도 소화기 질환으로부터 동물을 보호할 수 있으며, 치사율도 감소될 수 있다.
이 시점에서 추가로 중요한 관찰 결과는 테스트된 프로바이오틱 투여가 생산성 면에 있어서는 항생제를 사용한 처리와 적어도 동등하게 효과적이라는 점이다.
실시예
5: 새끼 돼지에의 투여 및 면역계에 대한 영향(제3 개념 증명)
제3 개념 증명은 무르시아 지방에 위치하는 농장에서 수행하였다. 농장에는 2,400마리의 암퇘지와 설사 문제가 있는 막 태어난 새끼 돼지가 있었다. 이러한 소화기 문제는 에스케리키아 콜라이 및 클로스트리디움 디피실에 의해 유발되는 것으로 진단되었다.
상기 농장에서 새끼 돼지(본 실험에서 대조군 새끼 돼지)에 대한 일반적인 처리는 출생 직후 100 mg의 툴라트로마이신을 주사하는 것이었다. 이후, 수유 기간 동안 설사를 보인 새끼 돼지를 또한 그가 설사를 보인 날 동안 1일 1회로 스피라마이신(25 mg/kg 생체중) 및 콜리스틴(5 mg/kg 생체중)을 이용하여 경구적으로 처리하였다.
본 실험에서, 항생제 처리 없이 조성물 A를 29배 새끼에 2회, 즉, (1) 출생 직후 및 (2) 생후 2일째에 투여하였다. 34배 새끼는 일반 농장 방법에 따라 처리하였다.
| 이유에 의한 생산 지수 | ||
| 조성물 A | 일반 처리 (대조군) |
|
| 배 새끼 | 29 | 34 |
| 한배 새끼당 설사를 보이는 평균 일수 |
1.51 | 2.88 |
| 한배 새끼당 치사율 | 0.68 | 1.08 |
제3 개념 증명을 통해 특히 항생제 사용 없이도 갓 태어난 새끼 돼지에서 초기의 소화기 장애 관리를 개선시킬 수 있다는 가능성이 입증되었다.
실시예
6: 새끼 돼지에의 투여 및 면역계에 대한 영향(제4 개념 증명)
다음의 개념 증명은 농장의 일상에 따른 정규 작업으로서 생성물을 테스트하는 것을 목표로 하였다. 본 실험은 우에스카 지방의 5,500 암퇘지 농장에서 수행하였다. 물류적 사실에 기인하여 대조군을 유지할 수는 없었다. 특정 주간(2012년 13주째)에 태어난 새끼 돼지 모두에게 조성물 B를 제공하고, 생산성 지표를 실험 이전 및 그 이후의 주간에서의 것과 비교하였다. 상기 농장에서는 설사를 보인 새끼 돼지에 대한 일반적인 처리는 100 mg의 암피실린 및 250,000 IU 메탄술포네이트 나트륨 콜리스틴을 함유하는 시판용 제품을 1일당 1 ml씩 3일 동안 투여하는 것이었다.
(A) 설사 사례는 초산 암퇘지 중 80%(종래와 같이 조성물 B로 처리하지 않은 경우) 및 일부 다산 암퇘지에서 관찰되었다. 새끼 돼지의 나이는 3 내지 5세였다. 모든 설사 사례가 항생제 비처리 하에서 사라졌다.
본 발명자의 결과를 통해 본 발명의 생성물 및 조성물의 사용이 유익한 효과가 있다는 것이 확인되었다. 단지 통상의 항생제 처리만을 수행한 다른 주간들보다도 치사율(%)은 분명히 더 낮았다.
실시예 7 :
1,200마리의 고 다산성(hyper prolific) 모체(1회 출산당 평균 14마리의 살아서 태어난 새끼 돼지) 및 주당 56회 출산(주당 784마리의 새끼 돼지)이 있는, 사라고사(스페인)의 농장에서 조성물 E를 사용하여 생체내 실험을 수행하였으며, 생후 1주 미만인 새끼 돼지가 수유기일 때 설사라는 주기적인 문제를 안고 있음에도 불구하고, 새끼 돼지를 20 kg까지 성장시킨 후, 다른 농장으로 공급하는 것을 목표로 하였다. 농장주는 표준 방식으로 새끼 돼지를 관리하고, 출생시 및 생후 2일째에 배 새끼 모두에게 생성물(상기 조성물 E)을 투여하였다. 조성물 E로 처리한 결과는 조성물 A, B 및 C를 사용하여 얻은 결과와 유사하였다.
Claims (18)
- 갓 태어난 포유동물(바람직하게는 새끼 돼지)에서 박테리아 감염에 의해 유발되는 설사를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 조성물로서, 각 균주는 적어도 하기 조건 a., 바람직하게는 두 조건 a 및 b 모두, 가장 바람직하게는 조건 a., b., 및 c. 모두를 충족시키는 것인 조성물:
a. 스폿 온 론 어세이(spot on lawn assay)에 의해 측정되는 억제대에 의해 입증되는 바와 같이, 하기 항미생물 활성 중 1 이상을 가지는 조건: (i) 살모넬라(Salmonella)의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (ii) 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iii) 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iv) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 경우, 10 mm 이상의 억제대;
b. pH=3.5에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건;
c. 0.45% 담즙 추출물의 존재 하에서 4시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건. - 제1항에 있어서, 1종 이상의 균주, 바람직하게는 모든 균주가 항생제 내성이 없는 것인 조성물.
- 하나 이상의 미생물 균주를 포함하는 조성물로서, 각 균주는 적어도 하기 조건을 충족시키는 것인 조성물:
a. 스폿 온 론 어세이에 의해 측정되는 억제대에 의해 입증되는 바와 같이, 하기 항미생물 활성 중 1 이상을 가지는 조건: (i) 살모넬라의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (ii) 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iii) 스타필로코커스 아우레우스의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iv) 에스케리키아 콜라이의 경우, 10 mm 이상의 억제대;
b. pH=3.5에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건;
c. 0.45% 담즙 추출물의 존재 하에서 4시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건. - 제3항에 있어서, 각 균주는 적어도 하기 조건을 충족시키는 것인 조성물:
a. 스폿 온 론 어세이에 의해 측정되는 억제대에 의해 입증되는 바와 같이, 하기 항미생물 활성 모두를 가지는 조건: (i) 살모넬라의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (ii) 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iii) 스타필로코커스 아우레우스의 경우, 10 mm 이상의 억제대, (iv) 에스케리키아 콜라이의 경우, 10 mm 이상의 억제대;
b. pH=3.5에서 3시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건; 및
c. 0.45% 담즙 추출물의 존재 하에서 4시간의 인큐베이션 동안 본질적으로 동일한 생존력을 유지할 수 있는 조건. - 하기 균주로부터 선택되는 락트산 박테리아:
a. 기탁 번호 CECT 8163으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션(Spanish Type Cultures Collection)에 기탁된 균주(AqSyn04);
b. 기탁 번호 CECT 8165로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn06);
c. 기탁 번호 CECT 8164로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn09); 및
d. 기탁 번호 CECT 8166으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSyn10);
e. 기탁 번호 CECT 8347로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ12);
f. 기탁 번호 CECT 8348로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ17);
g. 기탁 번호 CECT 8349로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ55); 및
h. 기탁 번호 CECT 8350으로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ59). - 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상, 더욱 바람직하게는 3종 이상, 보다 더욱 바람직하게는 4종 이상의, 제5항의 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
- 제6항에 있어서, 하기 4종의 균주를 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 조성물:
i. 기탁 번호 CECT 8347로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ12);
ii. 기탁 번호 CECT 8348로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ17);
iii. 기탁 번호 CECT 8349로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ55);
iv. 기탁 번호 CECT 8349로 스패니시 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 균주(AqSynJ55). - 제6항 또는 제7항에 있어서, 1종 이상의 프리바이오틱 생성물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제8항에 있어서, 1종 이상의 프리바이오틱 생성물은 하기 화합물 및 조성물: 베타-글루칸, 만난-올리고당, 이눌린, 올리고프럭토스, 갈락토올리고당(GOS), 락툴로스, 락토수크로스, 갈락토트리오스, 프럭토-올리고당(FOS), 셀로비오스, 셀로덱스트린, 사이클로덱스트린, 말티톨, 락티톨, 글리코실수크로스, 비타민 E 또는 그의 변이체(여기서, 변이체는 알파, 베타, 감마, 델타 토코페롤, 토코트리에놀 및 토코모노에놀로부터 선택된다)로부터 선택되며, 만난-올리고당 및/또는 이눌린이 바람직한 것인 조성물.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 또는 동물, 바람직하게는 포유동물 및/또는 가축, 더욱 바람직하게는 돼지를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것인 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물은 제6항 내지 제9항에 따른 조성물인 것인 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 출생 후 처음 14일 이내에, 더욱 바람직하게는 출생 후 처음 13, 12, 11, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3일 이내에, 가장 바람직하게는 출생 후 처음 2일 이내에 투여되는 것인 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여용인 조성물.
- 제1항, 제2항, 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 건조된 형태, 액체 형태 또는 분무된 형태인 조성물.
- 제1항, 제2항, 제10항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 투여 형태로 제공되며, 각 투여량은 109 이상의 콜로니 형성 단위(CFU)를 포함하는 것인 조성물.
- 제15항에 있어서, 2회 용량으로 투여하기 위한 것인 조성물.
- 제16항에 있어서, 제1 용량은 출생 후 처음 24시간 내에 투여되고, 제2 용량은 후속 24시간 내에 투여되는 것인 조성물.
- 제1항, 제2항, 제10항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 감염, 예컨대, 박테리아 감염에 기인하는 설사(대장균증 포함), 갓 태어난 동물의 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 설사, 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) A형 및 C형을 치료 또는 예방하기 위한 것인 조성물.
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