KR102065181B1 - 클로스트리디오이데스 디피실레에 항균 활성을 갖는 락토바실러스 속 WiKim0093 균주 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

클로스트리디오이데스 디피실레에 항균 활성을 갖는 락토바실러스 속 WiKim0093 균주 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 속 WiKim0093(Lactobacillus sp. WiKim0093) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 속 WiKim0093은 유해 병원균(클로스트리디오이데스 디피실레)에 대해 항균 활성을 갖는 프로바이오틱스로서, 사람 또는 동물의 유해 병원균 감염 질환의 예방 및 치료, 정장 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.

Description

클로스트리디오이데스 디피실레에 항균 활성을 갖는 락토바실러스 속 WiKim0093 균주 및 이를 포함하는 조성물 {Lactobacillus sp. WiKim0093 having antibacterial activity against Clostridioides difficile and composition comprising the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 속 WiKim0093 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
클로스트리디오이데스 디피실레(Clostridioides difficile)로 재분류된 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)는 그람 양성, 혐기성, 포자생성 간균으로, 장기간 항생제 치료를 하는 병원 입원 환자의 이상 증상 중 설사의 주요한 기회 감염 균주이다. 상기 균주는 1978년 클로스트리디움 디피실레 대장염(Clostridium difficile colitis, CDC)의 원인으로 처음 기술되었다. 주로 사람의 설사 치료에 항생제와 연관되어 클로스트리디오이데스 디피실레의 자연적인 생성 과정이나 병원성 메커니즘 등에 대해서 연구가 빠르게 진행되어 왔다. 현재 인간의 CDAD(Clostridium difficile-associated disease)는 약 5-25%가 항생제와 관련된 설사와 항생 물질 투여 후에 일어나는 위막성 장염, 두 증후군과 관련이 있으며, 주로 반코마이신(vancomycin)과 메트로니다졸(metronidazole)이 발생 원인으로 알려져 있다. CDAD의 발생 원인은 사람의 장에서 항생제의 사용으로 정상 균총의 균형이 파괴되어 장내 상재균 분포가 변화되면서 상재균에 의해 억제되어 있던 클로스트리디오이데스 디피실레가 과성장되어 생성된 균체 내 독소(enterotoxin)에 의해 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).
병원성 클로스트리디오이데스 디피실레는 감염된 환자의 설사에서 클로스트리디오이데스 디피실레가 배출된 후 포자를 형성하여 체외에서 오랜 기간 생존할 수 있다. 이러한 생리학적 특징으로 인해 클로스트리디오이데스 디피실레는 장기간 환경에 오염될 수 있으며, 이러한 오염원으로부터 아포가 정상인의 구강을 통해 추가적인 감염을 일으킴으로써 병원 내에서 클로스트리디오이데스 디피실레가 집단 발병할 수 있다.
한편, 락토바실러스 속 균주는 인체 내에서 유익한 역할을 하는 프로바이오틱스로서, 특히, 위 장관 면역 증강 등의 생리활성을 가진다고 알려져 있다. 하지만 락토바실러스 균주의 클로스트리디오이데스 디피실레에 대한 항균 활성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.
Sherris Medical Microbiology(4th), McGraw Hill, pp.322-324, 2004
본 발명은 항균 활성이 우수한 락토바실러스 속 유산균을 제공하고자 한다.
이에, 본 발명자들은 프로바이오틱스로서 클로스트리디오이데스 디피실레(Clostridioides difficile)에 대한 우수한 항균 효과를 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 속 WWiKim0093(Lactobacillus sp. WiKim0093)를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 락토바실러스 속 WiKim0093(Lactobacillus sp. WiKim0093)는 김치 유래의 락토바실러스 속 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 속 WiKim0093를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 프로바이오틱스로서 우수하며, 유해 병원균에 대해 우수한 항균 효과를 나타내는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석 결과, GenBank Accession No. CP027194 내지 CP027197의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 미생물은 Lactobacillus 속 균주들과 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.
따라서, 상기 16S rRNA 유전자의 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606)로 명명하였으며, 국립농업과학원에 2018년 3월 18일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 81074BP). 본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606)은 락토바실러스 속 WiKim0093(Lactobacillus sp. WiKim0093)과 상호교환적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 속 WiKim0093(Lactobacillus sp. WiKim0093)의 유전체 서열은 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606)의 organism name으로 GenBank Accession No. CP027194 내지 CP027197을 통해 NCBI에 공개되었다.
본 발명의 락토바실러스 속 WiKim0093는 그람 양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultative anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 세포는 간균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 락토바실러스 속 WiKim0093는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
하기 실시예에서는, 본 발명의 락토바실러스 속 WiKim0093가 유해 병원균에 대한 항균 테스트에서 높은 항균력을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 속 WiKim0093의 서열 분석을 통해 상기 WiKim0093가 박테리오신인 카르노신(carnocin) CP52 유전자를 가지고 있는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 락토바실러스 속 WiKim0093는 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도뿐만 아니라 유해 병원균의 항균을 위한 용도로 다양하게 활용될 수 있다.
이에, 본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 속 WiKim0093는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 생균으로 존재하는 락토바실러스 속 WiKim0093 균주를 포함하는 경구 투여용 조성물일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균 감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1,000억 마리를 투여할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과와 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명은 또한 락토바실러스 속 WiKim0093, 이의 배양물 또는 이로부터 생산되는 박테리오신을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항균용 조성물은 클로스트리디오이데스 디피실레, 바실러스 세레우스, 스트렙토코커스 상귀니스, 대장균, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스 및 살모넬라 티피뮤리움으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유해 병원균에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있다.
한 구체예에서, 상기 항균용 조성물은 클로스트리디오이데스 디피실레에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 클로스트리디오이데스 디피실레는 설사를 유발하는 대표적인 유해 병원균으로, 장내독소[독소 A(toxin A)], 세포독소[독소 B(toxin B)] 및 2성분 독소(binary toxin)를 생산하여 설사와 염증 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 포함하는 유해 병원균에 의한 감염 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 속 WiKim0093는 이러한 유리한 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 유산균 스타터에 포함될 수 있다.
이에, 본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디오이데스 디피실레에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 감염 질환으로는 설사, 독성거대결장, 천공, 패혈증 또는 위막성 대장염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디오이데스 디피실레에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 활용될 경우, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료, 바 등의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 속 WiKim0093 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 사료를 제공한다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 속 WiKim0093 균주의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다. 균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나 감쇄(attenuation) 상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액 등을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 속 WiKim0093는 유해 병원균(클로스트리디오이데스 디피실레)에 대해 우수한 항균 활성을 나타내므로, 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화, 위장 질환 및 유해 병원균에 의한 감염 질환의 예방 및 치료 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다. 나아가 발효용 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 락토바실러스 속 WiKim0093 균주의 계통학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 속 WiKim0093 (수탁번호 KACC 81074BP) 균주의 Clostridioides difficile JCM 1296T에 대한 항균력을 확인한 결과이다. (A) 대조군, (B) 락토바실러스 속 WiKim0093 배양액 처리군.
도 3은 락토바실러스 속 WiKim0093 (수탁번호 KACC 81074BP) 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KACC 10097), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis KACC 11301), 대장균(Escherichia coli KACC 11598), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCCM 11335) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium KCCM 16862) 각각에 대한 항균력 조사결과이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 락토바실러스 속 균주의 분리 및 동정
김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였고, PCR 조건은 denaturation 95℃ 1분, annealing 45℃ 1분, extension 72℃ 1분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 염기서열분석기를 이용하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify) 데이터베이스를 이용하여 해당 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열과 가장 유사도(similarity)가 높은 세균을 검색하는 방법을 통해 수행되었다.
본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석 결과, GenBank Accession No. CP027194 내지 CP027197의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 균주는 Lactobacillus mudanjiangensis, Lactobacillus pentosus 등의 Lactobacillus 속 균주들과 가장 높은 계통분류학적 유연 관계를 보였다(도 1).
이에, 본 발명의 미생물을 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606)으로 명명하였으며, 국립농업과학원에 2018년 3월 18일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 81074BP).
실시예 2: 락토바실러스 속 WiKim0093의 항균 활성 확인
상기 실시예 1을 통해 분리한 락토바실러스 속 WiKim0093의 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 접종하여 30℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 원심분리를 통해 균주와 상층액을 분리하였고, 상층액을 0.2㎕ pore size 필터를 사용하여 세균이 완전히 제거된 균주 배양액을 준비하였다. 배양액은 진공농축기를 사용하여 2배 농축하였다.
상기 락토바실러스 속 WiKim0093의 항균 활성을 확인하기 위해, 유해 병원균으로 클로스트리이오이데스 디피실레(Clostridioides difficile) JCM 1296T을 준비하였다. 상기 유해 병원균을 CDC 배지(BD BBL™ CDC Anaerobe 5%, Sheep Blood Agar - Becton Dickinson)에 도말하고, 종이 디스크를 유해 병원균이 도말된 배지 위에 접종하였다. 농축한 락토바실러스 속 WiKim0093 배양액 100㎕를 종이디스크에 흡수시켰고, 24시간 후 유해 병원균의 배양 및 락토바실러스 속 WiKim0093에 의한 배양억제 여부를 확인하였다(도 2). 이때 도 2의 (A)는 락토바실러스 속 WiKim0093의 배양액을 처리하지 않은 대조군의 결과이며, (B)는 락토바실러스 속 WiKim0093의 배양액을 처리한 실험군의 결과이다.
그 결과, 도 2에서 보는 것과 같이, 락토바실러스 속 WiKim0093 배양액을 처리한 군의 종이디스크에서 클로스트리디오이데스 디피실레 배양 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
또한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KACC 10097), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis KACC 11301), 대장균(Escherichia coli KACC 11598), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCCM 11335) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium KCCM 16862) 병원성 균주는 TSA(Tryptic Soy Agar: Difco, USA) 배지에서 각각 배양 후, 6mm 깊이의 홈에 제균된 배양상등액 100㎕를 접종하여 억제환을 확인함으로써 상기 유해균에 대한 락토바실러스 속 WiKim0093의 항균력을 확인하였다.
그 결과, 클로스트리디오이데스 디피실레(Clostridioides difficile) 및 여러 병원성 미생물에 성장 억제 능력을 가짐을 확인하였다(도 2 및 도 3).
실시예 3: 락토바실러스 속 WiKim0093의 박테리오신 유전체 분석
상기 락토바실러스 속 WiKim0093의 유전체분석을 위해 추출된 DNA를 Pacific Biosciences(PacBio)를 통해 시퀀싱 분석하였다. 분석 결과, 상기 락토바실러스 속 WiKim0093은 NCBI’s Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAP)를 통해 1개의 chromosome (2,449,069bp)과 3개의 plasmid를 가지며, 16개의 rRNA(5S, 16S, 23S)를 포함하는 것으로 동정되었다. 이에, 락토바실러스 WiKim0093의 유전체는 NCBI의 CP027194-CP027197로 등록되었다. 특히 락토바실러스 WiKim0093의 유전체의 박테리오신 여부는 Bagel4(http://bagel4.molgenrug.nl/index.php)를 통해 분석한 결과, Carnobacterium piscicola에서 생성되어 동정된 Carnocin_CP52과 63.16%의 상동성을 지닌 Lactobacillus에서는 신규한 박테리오신을 생성하는 균주로 동정되었다 (표 1).
Figure 112018097617238-pat00001
락토바실러스 속 CBA3606의 박테리오신 유전체 분석
국립농업과학원 KACC81074BP 20180318

Claims (13)

  1. 수탁번호 KACC 81074BP의 락토바실러스 속 CBA3606{Lactobacillus sp. CBA3606}.
  2. 락토바실러스 속 CBA3606 (Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP), 이의 배양물 또는 이로부터 생산되는 박테리오신을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis) 중 하나 이상의 균주에 대한 항균용 조성물.
  3. 삭제
  4. 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis) 중 하나 이상의 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    상기 식품은 건강기능식품인 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 식품은 음료, 바 또는 발효유인 조성물.
  8. 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis) 중 하나 이상의 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물.
  12. 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP) 또는 이의 배양물로 이루어진 것인 발효용 유산균 스타터.
  13. 락토바실러스 속 CBA3606(Lactobacillus sp. CBA3606; 수탁번호 KACC 81074BP) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.
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