CN101365484A - 通过给药非复制型载体化疫苗而进行的对禽类的免疫 - Google Patents

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Abstract

本发明通常涉及免疫学领域和疫苗技术领域。更具体的是，本发明涉及用于将禽类免疫原和抗原例如禽流感递送到禽类内的重组人腺病毒载体。本发明还提供了在包括禽胚胎在内的禽类个体中导入并表达禽类免疫原的方法，以及在禽类个体中引起针对禽类免疫原的免疫原性反应的方法。

Description

通过给药非复制型载体化疫苗而进行的对禽类的免疫
相关申请的交叉引用
本申请要求了并入本申请作为参考的于2005年8月15日提交的编号为60/708,524的U.S.临时申请作为优先权。
同时还记载了于2002年1月18日提交的编号为10/052,323的美国专利申请；于2002年4月5日提交的编号为10/116,963的美国专利申请；于2003年1月16日提交的编号为10/346,021的美国专利申请以及美国专利Nos.6,706,693；6,716,823；6,348,450，和于1998年8月13日提交的PCT/US98/16739，这些都并入本文作为参考。
所有这些申请，专利以及正文所引用的每篇文献，和这些申请和专利中所引用的所有文件(“申请所引用的文献”)，申请所引用的文献中引用或参考的每篇文献，在正文中或是在申请和专利的进行(prosecution)过程中的文献，和在它们的进行(prosecution)过程中支持可专利性前景的论据，均并入本文作为参考。
发明领域
本发明通常涉及免疫学和疫苗技术的领域。更具体的是，本发明涉及重组的非复制性载体，例如用于向禽类递送例如禽流感病毒抗原等禽类免疫原和抗原的E1-缺陷性人腺病毒载体。本发明还提供了在包括禽类胚胎在内的禽类个体中导入并表达禽类免疫原的方法，以及在禽类个体中引发对免疫原的免疫反应的方法。
发明背景
禽流感(AI)是一种感染禽类、其它动物和人类的严重的病原体。自1997以来，已经发生了多次AI病毒向人类递送的事件(Subbarao.等人，1998；Ungchusak等人.，2005)。也有证据表明禽流感病毒与人流感病毒之间的基因重组在病史中已经出现多次(Kawaoka等人，1989)。由于禽类与人类亲密接触，因此人们相信能够跨越种间屏障进入人类种群的新AI病毒菌株的产生会继续成为公共卫生的关注的问题。
禽类的大量接种疫苗看来是最有希望预防AI病毒传播并且减少人类传染病风险的方法。在过去的几年里，在一些国家已经进行了用灭活的完整病毒疫苗对禽类的接种。这些AI疫苗是由从被感染的卵中获得的amnio-鸟囊液制得的，然后通过福尔马林或β-丙内酯来灭活(Tollis and Di Trani，2002)。然而，新AI病毒菌株的无法预测的出现，病毒向一种对鸡胚高度致命的形式的进化(Wood等人，2002)，以及致命AI菌株通过生物恐怖分子的可能传播使得快速发展以及即使供应安全有效的AI疫苗成为一项至关紧要且仍然十分困难的任务。此外，不可能将区域被感染的小鸡与那些之前经相同菌株的灭活的AI病毒免疫的小鸡区分开(Normile，2004)。
一种编码AI病毒的血凝素(HA)的实验性重组鸡痘病毒在翅-蹼(wing-web)穿刺后已经保护了小鸡以抵抗H5N2 AI病毒的感染，尽管血凝抑制(HI)血清学反应可忽略(Beard等人，1992)。通过翅蹼接种了活的表达HA的重组牛痘病毒的小鸡也形成了对致命性AI病毒具有抗性的保护性免疫，检测到了低水平的血清HI抗体(Chambers等人，1988)。尽管具有向消化道的趋向性的水禽来源的AI分离物已经作为经口腔的AI疫苗接种到小鸡中(Crawford等人，1998)，但由于这种病毒类型固有的动态进化，估计这些分离物并不能广泛有效地抵抗新的AI病毒菌株。
禽类已经通过皮下注射由杆状病毒载体表达的HA蛋白质(Crawford等人，1999)以及用基因枪将表达HA的表达质粒接种到皮肤中(Fynan等人.，1993)而获得免疫。这些AI疫苗能够保护禽类不呈现出临床表征和死亡，并且能够减少含有同源性HA的活化(challenge)病毒的呼吸道和肠道的复制。也有证据表明来自于表达HA的含有非病原性流感病毒主链的新城疫病毒载体或重组流感病毒的低成本气溶胶AI疫苗(Swayne，2003)可能有效(Lee等人，2004；Webby等人，2004)。
上述AI疫苗中的大多数倚赖于劳动密集型的肠道外的递送。经口的和气溶胶AI疫苗在大量接种中对家禽类个体递送同一剂量时出现了不相容性。一些疫苗中使用的复制载体由于带来非自然的微生物形式而给环境造成了生物危害。重组流感病毒疫苗通过同时在环境中循环的重配(reassortant)流感病毒与野生型AI病毒之间的重组甚至会产生有害的重配(reassortments)(Hilleman，2002)。
目前有几种值得注意的以往使用重组腺病毒(“Ad”)载体作为疫苗的理由。Ad载体能够在原地转换有丝分裂的细胞和有丝分裂期后的细胞。此外，含有高滴度病毒的Ad原种(stocks)(即，高于1012pfu[噬斑形成单位]/ml)的制备易于产生，这使得在原位以高感染复数(MOI)转导细胞成为可能。Ad载体也已经有被证明的安全记录，该记录基于它们作为疫苗的长期使用而获得。而且，Ad病毒能够引起基因的高水平表达(至少作为原始的暴发(initial burst))，并且复制缺陷性Ad载体能够使用本领域公知的技术容易地被进行生物工程化，被制造以及储存。
由于Ad载体对特异性受体的高亲合性以及它避开红细胞浆质途径的能力，基于Ad的疫苗要比DNA疫苗更有效(Curiel，1994)。Ad载体通过将其的纤维与被发现位于鸡细胞的表面上的柯萨奇病毒以及腺病毒受体(CAR)结合可以转导部分鸡胚(Tan等人，2001)。此外，至少一种Ad的成分，异己酮，免疫原性高，并且能够给予外源抗原辅助活性(Molinier-Frenkel等人，2002)。
基于Ad的疫苗模拟其能力中的自然感染来诱导主要组织相容性复合体(MHC)I类限制性T-细胞反应，而由于该载体只表达了病原体基因的亚片段，因此减弱了逆转成毒性的可能性。这种“选择性表达”可以解决将被免疫但未被感染的动物与它们相对应的被感染的动物区分的问题，这是因为不能使用不是由该载体编码的病原体的特异性标记物来区分这两种情况。值得注意的是，由于相关抗原基因可以直接从野生样品中扩增和克隆，因此载体化的疫苗的产生不需要病原体的繁殖(Rajakumar等人，1990)。这对生产例如H5N1等高毒性的AI菌株尤为重要，这是因为这种菌株太危险，难以繁殖(Wood等人，2002)。除了上述标准外，商业关注因素主要集中在家禽业。目前的AI疫苗单独花费约每只家禽7分，这还不算注射飞禽的劳动(Normile，2004)。
不能复制的E1/E3-缺陷型人Ad血清型5(Ad5)-衍生的载体已经在哺乳动物中获得了广泛的研究(Graham and Prevec，1995)。尽管鸡已经通过皮下或皮内注射编码抗原的禽类Ad鸡胚胎致死性孤儿(CELO)病毒载体获得免疫(Francois等人，2004)，然而CELO载体具有低坚持服药率(compliance rate)，并且由于其能够在鸡细胞中复制，因此可能有害。由于CELO没有可确认的E1，E3和E4区域(Chiocca等人，1996)，无法复制的CELO载体在当时并不作为用于免疫的载体而存在。本发明通过提供一种安全且有效的用于基因递送的方法来保护禽类不受众多疾病的困扰，从而防止禽类病原体向人类传播，借此提出了这种需要。
发明简述
目前已经令人惊讶地表明人腺病毒-载体化的疫苗的肌肉以及卵内的递送能够快速，安全以及有效地免疫禽类。针对几种禽类病原体对禽类进行的大规模免疫对于预防巨大经济损失以及阻止例如禽流感病毒等禽类病原体向人群传播至关重要。用机械化注射器进行的疫苗或免疫原性组合物的卵内递送，是一种以即时的方式对禽类进行大规模免疫的非劳动密集型方法。与其它卵内禽类疫苗不同，人腺病毒-载体化疫苗或免疫原性组合物的生产不需要致命性病原体的繁殖，不包括能够在禽类中复制的免疫原或载体的传播。而且，用这种疫苗或免疫原性组合物进行的免疫使得经免疫的与自然感染的动物区分开来。
一方面，本发明提供了重组人腺病毒表达载体，该载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
优选的是，所属人腺病毒序列来自于人腺病毒血清型5。该人腺病毒序列可来源于复制缺陷型腺病毒、非复制型腺病毒、可复制型腺病毒或野生型腺病毒。
所述启动子序列可选自下组病毒启动子：禽类启动子，CMV启动子，SV40启动子，β-肌动蛋白启动子，白蛋白启动子，EF1-α启动子，PγK启动子，MFG启动子，和劳斯肉瘤病毒启动子。
一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原可以来源于，例如禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，传染性喉气管炎病毒等疱疹病毒，禽类传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，包括禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘和dovepox的痘病毒，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽类流感，也就是血凝素，核蛋白质，基质和神经氨酸酶。
更优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于血凝素亚型3、5、7或9。
本发明的另一方面提供了一种用于体内递送到禽类个体的免疫原性组合物或疫苗，其包括一种兽医学上可接受的载体或赋形剂和一种包括并表达DNA序列，与一个与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列的腺病毒重组人腺病毒表达载体。
优选的是，腺病毒DNA序列来源于腺病毒血清型5(Ad5)。
优选的是，所述人腺病毒序列来源于腺病毒血清型5。人腺病毒序列可来源于复制缺陷型腺病毒。
启动子序列可选自：禽类启动子，CMV启动子，SV40启动子，β-肌动蛋白启动子，白蛋白启动子，EF1-α启动子，PγK启动子，MFG启动子，和劳斯肉瘤病毒启动子。
一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原可以来源于，例如禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，传染性喉气管炎病毒等疱疹病毒，禽类传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，包括禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘和dovepox的痘病毒，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽类流感，也就是血凝素，核蛋白质，基质和神经氨酸酶。
更优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于血凝素亚型3、5、7或9。
所述免疫原性组合物或疫苗可再包括佐剂。
所述免疫原性组合物或疫苗可再包括另外的疫苗。
本发明的另一个方面提供了一种在细胞中导入和表达一个或多个禽类抗原或免疫原的方法，所述方法包括用重组人腺病毒表达载体接触所述细胞，并在足以在细胞中表达一种或多种禽抗原或免疫原的条件下培养细胞，所述载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
优选的是，所述细胞是293细胞或PER.C6细胞。
优选的是，一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，禽疱疹病毒，传染性喉气管炎病毒，禽传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种禽病毒。
优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素，核蛋白质，基质或神经氨酸酶。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
本发明的另一个方面提供了一种在禽胚胎中导入和表达一种或多种禽流感抗原或免疫原的方法，包括用重组人腺病毒表达载体接触所述禽胚胎，从而获得一种或多种禽流感抗原或免疫原在禽胚胎中的表达，所述载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种禽病毒。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素，核蛋白质，基质或神经氨酸酶。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
在禽胚胎中导入和表达一种或多种禽流感抗原或免疫原的方法优选可通过卵内递送发生。
本发明的另一方面提供了一种在禽类个体中引起免疫原性反应的方法，其包括对禽类个体施加一种免疫有效量的本发明的组合物。
然而，本发明的另一方面提供了一种在禽类个体中引起免疫原性反应的方法，所述方法包括用一种免疫有效量的免疫原性组合物感染禽类个体，所述组合物包括含有并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列的重组人腺病毒表达载体，其中一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原以足以在禽类个体中引起针对一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的免疫原性反应的水平被表达。
优选的是，一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，禽疱疹病毒，传染性喉气管炎病毒，禽传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素，核蛋白质，基质或神经氨酸酶。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
该方法还包括施加另外的疫苗。
优选的是，感染的方法通过卵内递送发生。
本发明的另一个方面提供了一种在禽类个体中引起免疫原性反应的方法，其包括用一种免疫有效量的免疫原性组合物感染禽类个体，所述组合物包括含有并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列的重组人腺病毒表达载体，其中一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原以足以在禽类个体中引起针对一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的免疫原性反应的水平被表达。
优选的是，一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，禽疱疹病毒，传染性喉气管炎病毒，禽传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素，核蛋白质，基质或神经氨酸酶。
更优选的是，所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
该方法还包括施加另外的疫苗。
优选的是，所述禽类个体通过翅-蹼，翅尖，胸肌，或大腿肌肉组织的皮下注射被感染。
所述禽类个体也可以在卵内被感染。
本发明的另一个方面提供一种对禽类个体接种的方法，包括在卵内施加重组人腺病毒，其含有并表达编码禽类个体的病原体的抗原的异源核酸分子。
优选的是，该人腺病毒包括源于腺病毒血清型5的序列。
优选的是，所述人腺病毒包括源于复制缺陷型腺病毒的序列，非复制型腺病毒，可复制型腺病毒，或野生型腺病毒。
优选的是，所述禽类病原体的抗原来源于禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，禽疱疹病毒，传染性喉气管炎病毒，禽传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
更优选的是，所述禽类病原体的抗原来源于禽流感。
更优选的是，所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素，核蛋白质，基质，或神经氨酸酶，
更优选的是，所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素亚型3、5、7或9。
所述方法还包括施加另外的疫苗。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于将免疫原性组合物递送到禽类胚胎的卵内的给药装置，其中该装置含有一种表达一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的重组人腺病毒表达载体，其中该装置将重组人腺病毒递送到禽。
优选的是，该人腺病毒表达载体包括衍生自腺病毒血清型5的序列。
优选的是，该人腺病毒表达载体包括衍生自复制缺陷型腺病毒，非复制型人腺病毒，可复制型腺病毒，或野生型腺病毒的序列。
优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒，传染性囊病病毒，马雷克病病毒，禽疱疹病毒，传染性喉气管炎病毒，禽传染性支气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘，和dovepox，禽多瘤病毒，新城病病毒，禽肺病毒，禽鼻气管炎病毒，禽网状内皮组织增生病毒，禽逆转录病毒，禽内源性病毒，禽成红血细胞增多症病毒，禽肝炎病毒，禽贫血症病毒，禽肠炎病毒，帕切科病病毒，禽白血病病毒，禽细小病毒，禽轮状病毒，禽造血细胞组织增生病毒，禽肌腱膜纤维肉瘤病毒，禽成髓细胞过多症病毒，禽成髓细胞过多症相关病毒，禽髓细胞瘤病病毒，禽肉瘤病毒，或禽脾坏死病毒。
更优选的是，所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感。
更优选的是，所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素，核蛋白质，基质或神经氨酸酶。
更优选的是，所关注的禽流感抗原或免疫原选自血凝素亚型3、5、7或9。
所述方法还可包括施用另外的疫苗。
这些以及其它实施方式被公开或者包括于以下详细说明中，或由其显而易见得到。
附图的简要说明
通过实施例给出了以下详细说明，但不会将本发明限制于某个具体实施方式，可以结合附图来理解所述详细说明，它们均并入本文作为参考，其中：
图1描述了通过卵内免疫小鸡以及肌肉内注射表达禽流感HA的重组腺病毒载体。组1代表9天大的含胚鸡蛋，组2代表18天大的含胚鸡蛋，体积为200μl，剂量为5×1010pfu/蛋。在组3，将100μl所述表达禽流感HA的病毒载体肌肉内注射到4周大的小鸡中，剂量为2.5×1010pfu/动物。
图2描述了在培养的10或18天在卵内接种了AdTW68.H5的28天大的SPF小鸡中检测到的血细胞凝集抑制抗体效价(点)，以及在培养的10或18天在卵内进行了疫苗接种并且孵化后15天通过鼻途径被加强免疫(boost)的小鸡中检测到的血细胞凝集抑制抗体效价(点)。条，几何平均log2[HI效价]。在未实验的对照组小鸡中没有检测到HI效价(数据未示出)。
图3分别表示在孵化后23天和29天的SPF小鸡中的血细胞凝集抑制抗体，这些小鸡或是胚胎形成18天只在卵内接种AdTW68.H5.D23和D29(7只鸡)，或是在卵内接种AdTW68.H5.D23和D29并在孵化后15天鼻内加强免疫(boost)(12只鸡)，孵化后23天和29天HI效价；点，各个鸟中的log2[HI效价]；条，几何平均log2[HI效价][HI效价]。在孵化后23天和29天，未实验的11组对照组小鸡中没有检测到HI效价(数据未示出)。
图4表示在卵内对第18天的白色来亨鸡胚胎的疫苗接种。用1011vp的AdTW68.H5进行卵内接种疫苗(在卵内)。在单独的组中，在孵化后15天通过在鼻内以同样剂量滴灌AdTW68.H5对在卵内接种了疫苗的家禽加强免疫(boost)(在卵内+鼻内加强免疫)。以没有经过免疫的未实验的胚胎作为阴性对照(对照)。以致命剂量的高病原性A/Ck/Queretaro/14588-19/95(H5N2)AI病毒菌株通过鼻后孔缝隙在鼻内攻击34天大的小鸡。使用Logrank检验(Prism 4.03，GraphPadSoftware)测定了生存中统计学上重要的变化。与未接种疫苗的对照相比(P<0.001)，使用或没有使用鼻内加强免疫在卵内接种AdTW68.H5都显著地保护了小鸡(100％)以避免致命的AI病毒带来的危险。
图5描述了通过定量的实时RT-PCR(16)测定用这种高病原性AI病毒鼻内攻击后，被接种免疫的鸡和对照鸡中的口咽样本中的A/Ck/Queretaro/14588-19/95病毒RNA。如图3中描述的那样对小鸡进行疫苗接种。在感染后2，4和7天收集试样。在接种了疫苗的小鸡和未接种疫苗的对照组中，疫苗负载在第7天达到显著差异(P<0.05)。
图6是一幅描述第18天在卵内通过以3×108ifu的剂量接种AdTW68.H5载体进行接种疫苗的图。通过Sartobind Q5膜(SartoriusNorth America，Inc.，Edgewood，NY)纯化Ad5载体，并重悬于A195缓冲液(Evans，2004)。第25天分析预攻击血清HI抗体。减号(-)表示死于攻击的禽类；加号(+)表示在攻击后生存的禽类。与死亡者相比，幸存者显著地提高了预攻击血清HI活性(P<0.001)(不成对t-检验；Prism 4.03)。所有纯对照禽类以及经对照载体AdCMV-tetC免疫的鸟类没有生产可检测到的HI抗体效价。
图7是一幅描述第18天在卵内通过以3×108ifu的剂量接种AdTW68.H5载体进行接种疫苗的图。通过Sartobind Q5膜(SartoriusNorth America，Inc.，Edgewood，NY)纯化Ad5载体，并重悬于A195缓冲液(Evans，2004)。通过第31天在鼻内施加105EID50的H5N1 AI病毒A/Swan/Mongolia//244L/2005对对照和被免疫的禽类进行攻击。
发明的详细内容
本发明的公开内容中，“包括”，“包含”“含有”“具有”等等可具有归于美国专利法中的含义，并且可以指包括等等；“基本由......组成含有”同样具有归于美国专利法中的含义，并且该术语是无限制的，允许存在所描述之外的含义，只要所描述的基础的或新的性质没有被所描述之外的含义的存在而改变，但是不包括现有技术的实施方式。
术语“核酸”或“核酸序列”是指单链形式或双链形式的脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。该术语包括核酸，即寡核苷酸，包括天然核苷酸的已知的类似物。该术语也包括具有合成的主链的核酸类似的结构，参见，例如，Eckstein，1991；Baserga等人，1992；Milligan，1993；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，1997；Strauss-Soukup，1997；和Samstag，1996。
这里所使用的“重组体”是指合成的多核苷酸或者另外在体外操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中生产基因产品的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组方式”也包括将具有来自不同来源的编码区域或域或启动子序列的核酸连结到表达盒或载体以表达例如本发明的载体中的多肽编码序列的可诱导的或组成型的表达。
当提到核酸时使用的术语“异源的”是指在自然界中不常发现的细胞或病毒中的核酸；或者，包括通常在自然界中所发现的彼此之间的同源关系中并没有被发现的两条或更多亚序列，或者经重组设计以至其表达水平，或与细胞其它核酸或其它分子的物理关系，或结构在自然界中不常见。本文中所使用的一个相似的术语是“外源的”。例如，异源核酸通常由重组生产，其具有来自于以自然界中无法发现的方式排列的不相关的基因的两种或多种序列；例如，插入于本发明的基于腺病毒的载体的与启动子序列可操纵地连接的人类基因。作为一个例子，所关注的异源核酸能够编码一种免疫原性基因产品，其中该腺病毒以疫苗或疫苗组合物形式治疗性地或预防性地被施予。异源序列可以包括各种启动子和序列的各种组合，这些启动子和序列的例子描述于本文的详述中。
“抗原”是由免疫系统识别并引起免疫反应的物质。本文中使用的一个类似术语是“免疫原”。
本发明的上下文中的“禽类个体”指的是鸟纲中的任意和所有家养和野生成员，其包括，但不限于新颌总目(Neognathae)和古颌总目(Palaeognathae)。新颌总目(Neognathae)包括，其中，雁形目(Anseriformes)，雨燕目(Apodiformes)，Buceroformes，夜鹰目(Caprimulgiformes)，鸻形目(Charadriiformes)，鹳形目(Ciconiiformes)，鼠鸟目(Coliiformes)，鸽形目(Columbiformes)，Coraciifomies，鹃形目(Cuculiformes)，隼形目(Falconiformes)，鹟鴷目(Galbuliformes)，鸡形，目(Galliformes)，潜鸟目(Gaviiformes)，鹤形目(Gruiformes)，蕉鹃目(Musophagiformes)，Opisthocomiformes，Passeriforaies，鹈形目(Pelecaniformes)，红鹳目(Phoenicopteriformes)，啄木鸟目(Piciformes)，鸊鷉目(Podicipediformes)，信天翁目(Procellariiformes)，鹦形目(Psittaciformes)，企鹅目(Sphenisciformes)，鸮形目(Strigiformes)，Trochiliforaies，Trogoniformes，咬鹃目(Turniciformes)，和戴胜目(Upupiformes)。古颌总目包括无翼鸟目(Apterygiformes)，鹤鸵目(Casuariiformes)，恐鸟目(Dinornithiformes)，美洲鸵目(Rheiformes)，驼形目(Struthioniformes)，和Tiniamiformes。禽类个体可包括成年禽类，雏和禽类胚胎/蛋。
基因或核酸的“表达”不止包括细胞基因表达，还包括在克隆系统中或在其它环境中的核酸的转录和翻译。
如这里所使用的，“载体”是一种允许或助于一种实体从一种环境转移到另一种环境中的工具。通过实施例，重组DNA技术中使用的某些载体允许实体，例如DNA的一个片段(例如异源的DNA片段，例如异源的cDNA片段)，转移到靶细胞中。本发明包括重组载体，所述重组载体可包括病毒载体，细菌载体，原生动物载体，DNA载体，或重组体。
至于用于在载体中表达的外源DNA(例如，编码所关注的表位和/或抗原和/或治疗性)以及提供这种外源DNA的文献，用于提高核酸分子表达的转录和/或翻译因子，以及例如“所关注的表位”，“治疗性”，“免疫反应”，“免疫应答”，“保护性免疫反应”，“免疫组合物”，“免疫原性组合物”，和“疫苗组合物”，及其它，参考公开于1999-11-23的U.S.专利No.5,990,091，和WO 98/00166和WO 99/60164，以及它们所引用的文献和该美国专利和上述PCT申请的进行(prosecution)过程中记录的文献；所有这些文献都并入本文作为参考。因此，在本发明实施中可以查阅并入本文作为参考的U.S.专利No.5,990,091，和WO 98/00166和WO 99/60164以及其所引用的文献以及该美国专利和上述PCT申请的进行(prosecution)过程中记录的文献，以及这里或其它地方引用的其它文献；在其中所引用的所有外源核酸分子，启动子和载体可用于本发明的实施中，出于这种考虑，也同时提及U.S.专利Nos.6,706,693；6,716,823；6,348,450；U.S.专利申请系列号10/424,409；10/052,323；10/116,963；10/346,021；和PCT/US98/16739中的于1999-2-25公开的WO 99/08713。
如这里所使用的，术语“免疫原性组合物”和“免疫组合物”和“免疫原性或免疫学组合物”包括任何引起针对由本发明的腺病毒载体和病毒表达的所关注的抗原或免疫原的免疫反应的组合物；例如，在施加给个体后，引起针对所关注的靶免疫原或抗原的免疫反应。术语“疫苗的组合物”和“疫苗”和“疫苗组合物”包括任意诱发针对所关注的抗原的保护性的免疫反应或有效预防抗原的组合物，例如，在施加或注射到个体中后，引发针对靶抗原或免疫原的保护性的免疫反应，或提供有效保护以对抗由本发明的腺病毒表达的抗原或免疫原。术语＂兽医组合物＂是指包括用于兽医用途的表达治疗性蛋白质的载体的任意组合物，例如红细胞生成素(EPO)或免疫调节蛋白质，例如，干扰素(IFN)。与之相似，术语“药物组合物”是指含有用于表达治疗性蛋白质的载体的任意组合物。
“免疫有效量”是指当施予某个体时，产生针对所关注的基因的免疫反应的编码所关注的基因的重组载体的量或浓度。
“循环重组形式”指的是在两个或更多个亚型或菌株中已经历了基因重组合的重组病毒。本发明的正文中所使用的其它术语为“杂交形式”，“重组形式”和“重配形式”。
“临床分离物”指的是，例如，通常使用的分离自被感染的个体的病毒的实验室菌株，并且要强调的是它们与高生长供体病毒的适应实验室的主要菌株同时存在于实验室细胞或个体。
“旷野分离物”是指从环境中或从被感染的个体中分离的病毒。
本发明的方法可以适当以预防接种的方式应用于预防疾病或者提供以治疗性接种方式减轻疾病的症状。
本发明的重组载体可以单独或作为免疫学或免疫原性组合物的一部分施加给个体。本发明的重组载体可以通过体内表达蛋白质被用于向目的个体递送或施加一种或多种蛋白质。
有人指出本发明中的免疫学产品和/或抗体和/或表达产物可以在体外表达并以免疫学产品和/或表达产物和/或抗体可被常规使用的方式被使用，而且那些表达免疫学产品和/或表达产物和/或抗体的细胞能够在体外被使用，例如，这些用途和应用可包括诊断学，检测，体外诊断(例如，其中，表达所述基因产品和/或免疫反应的细胞在体外被扩展并被重新导入到宿主或动物)等，参见U.S.专利No.5,990,091，WO 99/60164和WO 98/00166其所引用的文献。而且，由其中的方法分离的表达的抗体或基因产品，或者按照其中给药方法在体外扩展的细胞中分离的表达的抗体或基因产品可以以组合物形式被给药，与给药亚基表位或抗原或疗法或抗体以诱导免疫，刺激治疗反应和/或刺激被动免疫相类似。
此处使用的术语“人腺病毒”，是指包括所有腺病毒科(Adenoviridae)家族的人腺病毒，该家族包括Mastadeno病毒属的成员。迄今为止，超过五十腺病毒的人血清型已经获得了鉴定(参见，例如，Fields等人，Virology 2，Ch.67(3d ed.，Lippincott-Raven Publishers))。腺病毒可以有血清群A，B，C，D，E，或F。人腺病毒可以是血清型1(AdI)，血清型2(Ad2)，血清型3(Ad3)，血清型4(Ad4)，血清型6(Ad6)，血清型7(Ad7)，血清型8(Ad8)，血清型9(Ad9)，血清型10(AdIO)，血清型11(AdI 1)，血清型12(AdI 2)，血清型13(AdI 3)，血清型14(AdH)，血清型15(AdI 5)，血清型16(AdI 6)，血清型17(AdI 7)，血清型18(AdI8)，血清型19(AdI 9)，血清型19a(AdI 9a)，血清型19p(AdI 9p)，血清型20(Ad20)，血清型21(Ad21)，血清型22(Ad22)，血清型23(Ad23)，血清型24(Ad24)，血清型25(Ad25)，血清型26(Ad26)，血清型27(Ad27)，血清型28(Ad28)，血清型29(Ad29)，血清型30(Ad30)，血清型31(Ad31)，血清型32(Ad32)，血清型33(Ad33)，血清型34(Ad34)，血清型35(Ad35)，血清型36(Ad36)，血清型37(Ad37)，血清型38(Ad38)，血清型39(Ad39)，血清型40(Ad40)，血清型41(Ad41)，血清型42(Ad42)，血清型43(Ad43)，血清型44(Ad44)，血清型45(Ad45)，血清型46(Ad46)，血清型47(Ad47)，血清型48(Ad48)，血清型49(Ad49)，血清型50(Ad50)，血清型51(Ad51)，或优选的是，血清型5(Ad5)，但不限于这些例子。
也被本发明所考虑的还有可包括来自于一种以上的腺病毒血清型的亚病毒颗粒的重组载体，免疫原性组合物和重组腺病毒。例如，众所周知的是腺病毒载体能够呈现被改变的对特异性组织或细胞类型的趋向性(Havenga，MJ.E.等人，2002)，因此，混合并匹配不同的腺病毒衣壳，即，来源于各种腺病毒血清型的纤维或penton蛋白质可能是危险的。含有纤维和penton的腺病毒衣壳的修饰可能产生具有与未修饰的腺病毒不同趋向的腺病毒载体。感染细胞的能力被修饰并被最佳化的腺病毒载体可使得治疗或预防剂量显著减少，导致局部和浸染毒性减少。
腺病毒是一种非包膜的DNA病毒。源自腺病毒的载体有许多使它们特别有利于基因转移的特征。如这里所使用的，“重组腺病毒载体”是一种携带一种或多种异源的核苷酸序列(例如，两个，三个，四个，五个或更多异源的核苷酸序列)的腺病毒载体。例如，腺病毒的生物学的特征具体在于：腺病毒与严重的人类病理无关，这种病毒对于将基因转导到宿主细胞中极为有效，该病毒可感染大量细胞，其宿主范围很广，这种病毒可较为容易地被大量生产，而且通过在病毒基因组中的早期区域1(“E1”)的缺失可以使这种病毒成为复制缺陷性和/或非复制型。
腺病毒的基因组是一种大约有36,000个碱基对(“bp”)的线性双链DNA分子，其中每一条链的5’-末端共价连接了一种55-kDa末端蛋白质。Ad DNA含有相同的大约为100bp的反向末端序列(＂ITRs＂)，其具体的长度取决于血清型。病毒的复制起点位于正好在基因在末端的ITRs内。DNA合成出现在两个阶段。首先，复制通过链取代并产生一个子代双分子和一个父代被取代的链而进行。被取代的链是单链，可形成一种“锅柄”中间体，这使得复制起始并产生一条子代双分子。作为选择，复制可以从基因组的两端同时进行，避免需要形成锅柄结构。
在生产性感染周期中，病毒基因在两个阶段被表达：早期阶段和晚期阶段，早期阶段为直到病毒DNA复制的阶段，晚期阶段为病毒DNA复制的起始相一致的阶段。在早期阶段，由区域E1，E2，E3和E4编码的基因产品被表达，所述基因产品执行许多制备用于合成病毒结构蛋白质的细胞(Berk，AJ.，1986)的功能。在晚期，除早期基因产品之外，晚期病毒基因也被表达，宿主细胞DNA和蛋白质合成被关闭。因此，这种细胞就成为用于生产病毒DNA和病毒结构蛋白质的细胞(Tooze，J.，1981)。
腺病毒的E1区是在感染靶细胞后表达的腺病毒的第一个区域。该区域由两个转录单元组成，E1A和E1B基因，二者均为原生(胚胎的)啮齿类培养物的致癌转化所需要。E1A基因产物的主要功能是诱导休眠细胞进入细胞周期并重新开始细胞的DNA合成，并转录性激活E1B基因和该病毒基因组的其它早期区域(E2，E3和E4)。单独以E1A基因转染初生细胞可以诱导无限繁殖(永生)，但不能产生完整的转化。然而，E1A的表达，在大多数情况下，导致细胞程序化死亡(细胞凋亡)的诱导，只是偶尔获得永生(Jochemsen等人，1987)。细胞凋亡的诱导的防止以及完整的形态学转化的发生需要E1B基因的共表达。在已经建立的永生的细胞系中，E1A的高水平表达在缺少E1B下可引起完整的转化(Roberts，B.E.等人，1985)。
E1B编码的蛋白质辅助E1A重新定向细胞的功能使得病毒可进行复制。E1B 55 kD和E4 33 kD蛋白质形成基本位于细胞核的复合物，它们起到抑制宿主蛋白质中的合成并且利于病毒基因表达的作用。它们的主要影响是建立病毒mRNAs由细胞核到细胞质的选择性转移，所述转移伴随着感染的晚期阶段的开始。E1B 21 kD蛋白质对于生产性感染周期的正确的瞬间控制十分重要，因而防止宿主细胞在病毒生活周期完成之前提前死亡。不能够表达E1B 21 kD基因产品的突变的病毒显示出缩短的感染周期，所述周期伴随着宿主细胞的染色体DNA过度降解(deg-表型)并呈现增强的细胞病理效应(cyt-表型；Telling等人，1994)。当E1A基因也被突变时，deg和cyt表型受到抑制，这表明这些表型是E1A的功能(White，E.等人，1988)。而且，E1B 21 kDa蛋白质减慢了E1A接通其它病毒基因的速率。E1B 21 kD抑制这些倚赖于E1A的功能的机制还不不了解。
与之相反，例如，逆转录病毒，腺病毒不整合到宿主的基因组中，能够感染非分裂细胞，并能够在体内有效转移重组基因(Brody等人，1994)。这些特征使得腺病毒成为将靶抗原或免疫原在体内基因转移到细胞，组织或需要的个体中的有吸引力的候选者。
优选含有多个缺失的腺病毒载体来提高载体的携带能力并减少重组生成能够复制的腺病毒(RCA)的可能性。当腺病毒含有多个缺失时，并不需要每种缺失，如果单独存在，会产生复制缺陷性和/或非复制型腺病毒。只要其中的一种缺失使腺病毒成为复制缺陷或非复制，为了其它目的还可以包括其它额外的缺失，例如，提高腺病毒基因组对异源的核苷酸序列的携带能力，优选的是，多于一种的缺失预防功能蛋白质的表达并使得腺病毒成为复制缺陷或非复制。更优选的是，所有这些缺失都是使得腺病毒成为复制缺陷型和/或非复制型和/或减毒的缺失。然而，本发明还包括能够复制和/或野生型腺病毒和腺病毒载体，即包括所有对在一个个体中感染和复制所必需的腺病毒基因。
使用腺病毒重组体的本发明的实施方式可包括E1-缺陷型或缺失型，或E3-缺陷型或缺失型，或E4-缺陷型或缺失型或含有E1和E3，或E1和E4，或E3和E4的缺失的腺病毒载体，或E1，E3和E4被缺失，或所有病毒基因均被缺失的“gutless”腺病毒载体。该腺病毒载体可含有在E1，E3，或E4基因中的突变，或含有在这些或所有腺病毒基因中的缺失。E1突变增加了载体的安全限度，因为E1-缺陷性腺病毒突变体据说在有抵抗性的细胞中为复制缺陷型和/或非复制型，而且最低限度地被高度减毒了。E3突变通过破坏腺病毒向下调节MHC I类分子的机制提高了抗原的免疫原性。E4突变通过抑制晚期基因表达减少腺病毒载体的免疫原性，因此可使得使用相同载体的重复的再次接种疫苗成为可能。本发明包括E1，或E3，或E4，或E1和E3，或E1和E4被缺失或发生突变的任意血清型或血清群的腺病毒载体。这些腺病毒基因的缺失或突变导致这些蛋白质的活性受损或基本完全丧失。
这种“gutless”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的另一种类型的载体。其复制需要辅助病毒和表达Eia和Cre的特殊的人293细胞系，并且需要并不存在于自然环境中的条件；该载体丧失了所有的病毒基因，因此该载体作为疫苗载体是非-免疫原性，并且可以被接种多次以行再次免疫。这种“gutless”腺病毒载体也含有用于容纳目的抗原或免疫原的36kb空间，从而可以将大量抗原或免疫原共转移到细胞中。
本领域中其它已知的其它毒载体系统包括AdEasy系统(He等人，1998)，以及其后的经修饰的AdEasier系统(Zeng等人，2001)，它们被开发成在293细胞中通过使供体载体与Ad辅助载体之间的同源重组在例如BJ5183这样的大肠杆菌细胞中发生并过夜快速产生重组Ad载体。PAdEasy包括腺病毒结构序列，所述序列当以反式与例如表达目的抗原或免疫原的pShuttle-CMV供体载体提供时，导致抗原或免疫原(例如，免疫原和/或抗原)包裹在腺病毒衣壳内。pAdEasy的序列在本领域中是公知的且公众可获得的，且通过Stratagene可商业获得。
本发明可采用AdHigh系统而获得(美国专利临时申请系列号60/683,638)。AdHigh是一种安全，快速且有效地生产高效价的重组腺病毒的方法，该方法没有产生可对禽类个体有害或致命的RCA的风险。而且，RCA可对人具有免疫性，并且在食物链中也不希望有它存在。在大肠杆菌细胞中用腺病毒主链质粒生产重组体后，AdHigh系统采用例如pAdHigh这样的改良的穿梭质粒来提高无RCA腺病毒在例如PER.C6细胞这样的感受细胞中的生产。这些穿梭质粒含有用以便于插入例如禽流感免疫原或抗原的等禽免疫原或抗原多连接子或多克隆位点。可以容易地实施腺病毒穿梭质粒与例如pAdEasy等腺病毒辅助质粒在细菌细胞中的重组(也就是，BJ5183)来生产表达本发明的禽抗原或免疫原的重组人腺病毒。通过克隆和限制性分析生产重组载体的方法是本领域技术人员熟知的。
例如RGD基序这样的特定的序列基序可插入于腺病毒载体中的H-I环中以提高其感染力。该序列已经显示出对于某种细胞外基质和附着蛋白与称为整联蛋白的细胞表面受体的超家族的相互作用必不可少。RGD基序的插入在免疫缺失的个体中可能是方便有利的。通过将特异性抗原或免疫原或其片断插入于例如上述这样的腺病毒载体构建腺病毒重组体。所述腺病毒重组体被用作免疫剂以转换脊椎动物的细胞。(参见，例如U.S.专利申请系列号No.10/424,409，并入本文作为参考)。
本发明的腺病毒载体有利于在体内和体外转移表达禽抗原或免疫原的核酸。尤其是，这种有创造力的载体可被方便地用于将核酸转移到动物中，更优选禽和哺乳动物细胞。目的核酸包括编码肽和蛋白质的核酸，优选治疗性(例如用于医疗或兽医用途)或免疫原性(例如用于疫苗)肽或蛋白质。
优选的是，编码目的抗原或免疫原的密码子为“最佳的”密码子，即密码子为那些常常出现，也就是高度表达的禽基因，而不是那些常常被被例如流感使用的密码子。这些密码子的选择提供了所述抗原或免疫原在人或禽细胞中有效的表达。在其它的实施方式中，例如，当目的抗原或免疫原在细菌，酵母或其它表达系统中表达时，密码子选择模式被改变成呈现对在抗原或免疫原被表达的生物中的高度表达的基因所偏好的密码子。许多物种中的高度表达的基因的密码子选择模式在文献中是已知的(例如Nakamura等人，1996；Wang等人，1998；McEwan等人1998)。
作为另一种选择，该腺病毒载体可被用于感染培养中的细胞以表达所希望的基因产品，例如生产一种目的蛋白质或肽。优选的是，所述蛋白质或肽被分泌到培养基中，并使用本领域公知的技术以及本申请所提供的技术从中被纯化。导向蛋白质的胞外分泌的信号肽序列在本领域中已知，并且编码所述信号肽的核苷酸序列可通过本领域公知的技术被可操纵地连接到编码目的肽或蛋白质的核苷酸序列上。作为选择，这些细胞可被溶解，所表达的重组蛋白质可以从细胞溶解物中被纯化。优选的是，所述细胞为动物细胞，更优选为禽或哺乳动物细胞。同样优选的有，能够通过腺病毒进行转导的细胞。
这些细胞包括PER.C6细胞，911细胞和HEK293细胞。本发明还包括禽细胞的用途，这些细胞例如，但不限于禽胚胎成纤维细胞，例如DF-I细胞，例如并入本文作为参考的U.S.专利Nos.6,872,561；6,642,042；6,280,970和6,255,108中描述的禽干细胞，禽淋巴母细胞，禽上皮细胞，其中，例如来源于鸡胚的细胞株CHCC-OU2(Ogura，H.等人，1987；日本专利公开9-173059)，源于鹌鹑的细胞株QT-35(日本专利公开9-98778)。任何能够用于感染，转染或其它基因转移类型的禽细胞都能够用于实施本发明。
用于培养宿主细胞的培养基包括通常用于组织培养的培养基，其中，例如M199-earle base，Eagle MEM(E-MEM)，Dulbecco MEM(DMEM)，SC-UCM1 02，UP-SFM(GIBCO BRL)，EX-CELL302(Nichirei)，EX-CELL293-S(Nichirei)，TFBM-01(Nichirei)，ASF 104。适于特定的细胞类型的培养基可以在美国典型培养物保藏中心(ATCC)或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)找到。培养基可以补充例如L-谷氨酰胺等氨基酸，盐，例如两性霉素B(
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)，青霉素-链霉素等抗真菌或抗细菌剂，动物血清等等。细胞培养基可任选为无血清。
本发明还提供了作为疫苗有用的载体。所述免疫原或抗原可存在于腺病毒衣壳中，作为选择，所述抗原可以由导入于重组腺病毒基因组并由所述有创造力的腺病毒携带的抗原或免疫原所表达。该腺病毒载体可以提供任何目的抗原或免疫原。本文也对免疫原的例子给出了详述。
所述抗原或免疫原优选与适当的表达控制序列操作性相关。表达载体包括表达控制序列，例如复制起点(可以为细菌起点，例如来源于细菌载体，如pBR322，或真核起点，例如自主复制序列(ARS))，启动子，增强子和必要的信息加工位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酰化位点，包装信号和转录中止序列。
例如，本发明的重组腺病毒载体可含有适当的转录/翻译控制信号和聚腺苷酰化信号(例如，来源于牛生长激素的聚腺苷酰化信号，SV40聚腺苷酰化信号)，它们与要导入到靶细胞中的抗原或免疫原序列可操纵地连接。大量启动子/增强子元件可被使用，这取决于所需的水平和组织特异性表达。所述启动子可以是组成型的或可诱导型的(例如，金属硫蛋白启动子)，这取决于所需要的表达的模式。所述启动子可以是自身的或异源的，可以是天然的或是合成的序列。异源是指在转录起始区域所导入到的野生型宿主中没有发现该转录起始区域。挑选出能够在靶细胞或目的组织中发挥作用的启动子。脑特异性，肝特异性和肌肉特异性(包括骨骼肌，心肌，平滑肌和/或横膈膜特异性)启动子也包含于本发明中。哺乳动物和禽启动子也是优选的。
所述启动子优选可为“早期”启动子。“早期”启动子在本领域中已知，并且被定义为驱使基因在缺少蛋白质重新合成下快速且瞬间表达的启动子。该启动子也可以是“强”或“弱”启动子。术语“强启动子”和“弱启动子”在本领域中已知，而且由启动子处的转录起始(每分钟的次数)的相对频率所定义。“强”或“弱”启动子可以由它对RNA聚合酶的亲和性来定义。
更优选的是，所述抗原或免疫原与例如，人细胞巨化病毒(CMV)主要即时早期启动子，猿病毒40(SV40)启动子，β-肌动蛋白启动子，白蛋白启动子，延伸因子1-α(EF1-α)启动子，PγK启动子，MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子操作性相联系。其它表达控制序列包括源于免疫球蛋白基因，腺病毒，牛乳头状瘤病毒，疱疹病毒等等的启动子。除了任意禽病毒启动子之外，任意哺乳动物病毒启动子也可用于实施本发明。在病毒来源的禽启动子中，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的即时早期(即，ICP4，ICP27)基因的启动子，马雷克病病毒，(即，gB，gC，pp38，pp14，ICP4，Meq)或火鸡的疱疹病毒的(即，gB，gC，ICP4)的早期(即，胸苷激酶，DNA解旋酶，核糖核苷酸还原酶)或晚期(即，gB，gD，gC，gK)基因的启动子可以在本发明和载体中使用。而且，选择一种以足够高的水平表达目的抗原或免疫原以诱导或引起对该抗原或免疫原的免疫原性反应的合适的启动子对于本领域技术人员而言完全在本领域技术人员的范围内，不需要过度的试验。
已经考虑到的是，用CMV启动子驱动异源的核苷酸转录可在免疫活性的动物中导致表达的下调(参见，例如Guo等人，1996)。因此，将抗原或免疫原序列与例如不会产生抗原或免疫原表达的下调的改良的CMV启动子可操纵地连接也是优选的。
本发明的载体还可以包括多连接子或多克隆位点(“MCS”)，它们可有利地位于启动子的下游。所述多连接子提供了一个与启动子序列一起位于“框内”的用于插入抗原或免疫原分子的位点，使得将启动子序列＂可操纵地连接＂到目的抗原或免疫原上。多克隆位点和多连接子对于本领域技术人员是众所周知的。这里所使用的术语“可操纵地连接”是指所描述的元件处于允许它们以它们预期的方式行使功能的关系中。
取决于载体，当用于在体外扩增和纯化重组载体时，编码抗生素抗性的选择性标记可出现，并位于在商业上可获得的AdEasy，AdEasier和AdHigh腺病毒系统中，以监控供体载体和腺病毒辅助载体之间的同源重组。这种AdEasy，AdEasier和AdHigh系统有助于供体载体和腺病毒辅助载体之间位于ITR序列的同源重组。每个载体都含有一种不同的抗生素抗性基因，而且通过双重选择可选择表达重新组合的载体的重组体。能够整合到本发明的载体中的这些抗生素抗性基因的例子，其中包括，但不限于氨苄青霉素，四环素，新霉素，zeocin，卡那霉素，博来霉素，潮霉素，氯霉素。
在有多于一个抗原或免疫原的实施方式中，所述抗原或免疫原序列可与单个上游启动子和一个或多个下游内部核糖体进入部位(IRES)序列可操纵地连接(例如，小核糖核酸病毒EMC IRES序列)。
在抗原或免疫原序列要在靶细胞中被转录然后翻译的本发明的实施方式中，特定的起始信号是插入的蛋白质编码序列的有效翻译通常所需要的。这些异源翻译控制序列，可以是各种来源的，可以是天然的和合成的，其包括ATG起始密码子和邻近序列。
任意来源于禽病原体的禽抗原或免疫原可被用于本发明的方法和重组载体中。优选的抗原或免疫原，其中包括，但不限于源于禽流感病毒的抗原或免疫原，例如血凝素，神经氨酸酶，基质和核蛋白质抗原或免疫原，传染性囊病病毒抗原，例如VP1，VP1s1，VP1s2，VP2(Heine，H.G.等人，1991；Dormitorio，T.V.等人，1997；和Cao，Y.C.等人，1998)，VP2S，VP3，VP4，VP4S和VP5，如胸苷激酶，gA，gB，gC，gD，gE，gH，gI和gL等马雷克病病毒抗原(Coussens等人1988)；Ross等人1989)；Ross等人1991)；国际公开号WO 90/02803(1990)；Brunovskis和Velicer，1995)；和Yoshida等人1994)，包括gA，gB，gD，gE，gI和gG在内的疱疹病毒例如传染性喉气管炎病毒抗原(Veits，J.等人2003)，刺突糖蛋白，完整的膜蛋白质M，小膜蛋白质E和聚蛋白质(Casais，R.等人2003)等禽传染性支气管炎病毒抗原，衣壳，sigma NS，sigma A，sigma B和sigma C蛋白质等禽呼肠孤病毒抗原(Spandidos，D.A.等人，1976)，例如胸苷激酶等包括禽痘，鸟痘，金丝雀痘，鸽痘，鹌鹑痘在内的痘病毒和dovepox抗原，VP1，VP2，VP3和VP4等禽多瘤病毒抗原(Rott，O.等人1988)，例如HN，P，NP，M，F和L蛋白质等新城疫病毒抗原(Alexander，DJ.中综述，1990)，禽肺病毒抗原SH，F，G和N(Seal，B.S.，2000)，例如糖蛋白，基质，融合和核衣壳等禽鼻气管炎病毒抗原(Cook，J.K.，1990)，例如p29，被膜，gag，蛋白酶，和聚合酶等禽网状内皮组织增殖病毒抗原(Dornburg，R.1995)，包括禽癌病毒在内的禽逆转录病毒抗原gag，pol，和env，禽内源病毒gag，pol，env，衣壳和蛋白酶(Rovigatti，U.G.等人，1983)，禽成红血细胞增多症病毒gag，erbA，erbB(Graf，T.等人，1983)，禽肝炎病毒核心蛋白质pol和表面蛋白质(Cova，L.等人，1993)，禽贫血症病毒VP1，VP2，VP3(Rosenberger，J.K.等人，1998)，禽肠炎病毒抗原-聚合酶，52K蛋白质，penton，IIIa和核心蛋白质(Pitcovski，J.等人，1988)，帕切科病病毒IE蛋白质，糖蛋白K，解旋酶，糖蛋白N，VP11-12，糖蛋白H，胸苷激酶，糖蛋白B和核磷蛋白(Kaleta E.F.，1990)，禽白血病病毒抗原-被膜，gag和聚合酶(Graf，T.等人，1978)，禽细小病毒，如NSP1，NSP2，NSP3，NSP4，VP1，VP2，VP3，VP4，VP5，VP6和VP7等禽轮状病毒抗原(Mori，Y.等人，2003；Borgan，M.A.等人，2003)，例如被膜，gag和聚合酶等禽造血细胞组织增生病毒抗原(Bieth，E.等人，1992)；禽肌腱膜纤维肉瘤病毒(Kawai，S.等人，1992)，禽成髓细胞瘤病毒抗原p15，p27，被膜，gag和聚合酶，核衣壳和gs-b(Joliot，V.等人，1993)，禽成髓细胞瘤相关病毒(Perbal，B.，1995)，禽髓细胞瘤病病毒(Petropoulos，C.J.，1997)，例如p19和被膜等禽肉瘤病毒抗原(Neckameyer，W.S.等人，1985)，和禽脾坏死病毒gag，被膜和聚合酶(Purchase，H.G.等人，1975)。
其它可以在本发明的内容中使用的免疫原/抗原包括来自于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)菌株的细菌抗原，例如39 kDa囊状蛋白质(AIi，H.A.等人，2004；Rimler，R.B.2001)，16-kDa外膜蛋白质(Kasten，R.W.，等人，1995)，脂多糖(Baert，K.等人，2005)，大肠杆菌，例如1型菌毛，P菌毛和curli(Roland，K.等人，2004)；F1菌毛粘附素，P菌毛粘附素，气杆菌素(aerobactin)受体蛋白质和脂多糖(Kariyawasam，S.等人，2002)，鸡败血枝原体(Mycoplasmagallisepticum)，例如主要膜抗原pMGA(已知为P67；Jan，G.等人，2001；Noormohammadi，A.H.等人，2002a)，TM-I(Saito，S.等人，1993)，粘附素(Barbour，E.K.等人，1989)，P52(Jan，G.等人，2001)血清平板凝集(SPA)抗原(Ahmad，I.等人，1988)，雉枝原体(Mycoplasmagallinaceum)，鸡枝原体(Mycoplasma gallinarum)，火鸡枝原体(Mycoplasma gallopavonis)，关节液枝原体(Mycoplasma synoviae)，包括例如主要膜抗原等抗原MSPB(Noormohammadi，A.H.等人，2002b)和165-kDa蛋白质(Ben Abdelmoumen，B.等人，1999)，吐绶鸡枝原体(Mycoplasma meleagridis)，衣阿华枝原体(Mycoplasma iowae)，小鸡枝原体(Mycoplasma pullorum)，摹仿枝原体(Mycoplasma imitans)，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)例如鞭毛蛋白，(膜)孔蛋白(porins)，OmpA，SEF21和SEF14菌毛(Ochoa-Reparaz，J.等人，2004)，例如表达SEF14和SEF21等的侵害性沙门氏菌(Gallinarum)和鼠伤害沙门氏菌(Typhimurium)等肠沙门氏菌(Salmonella enterica)血清变型(Li，W.等人，2004)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，例如鞭毛蛋白，67-kDa抗原，Cj aA，Cj aC，和Cj aD蛋白质(Widders，P.R.等人，1998；Wyszynska，A.等人，2004)，副鸡噬血菌(Haemophilus paragallinarum)例如血清群A，B和C抗原如血凝素(Yamaguchi，T.等人，1988)，鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)，例如疫苗抗原(Higgins，D.A.等人，2000)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)菌株例如血清变型A和6B并表达例如主要外膜蛋白质(MOMP)(Vanrompay，D.等人，1999)，包括66-64kDa蛋白质抗原的朱红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Timoney，J.F.等人，1993)，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix insidiosa)例如菌苗(Bigland，CH.and Matsumoto，JJ.，1975)，流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)，例如抗原P39和细菌铁蛋白(bacterioferrin)(Al-Mariri，A.等人，2001)，鹅疏螺旋体(Borrelia anserina)例如22-kDa主要外表面蛋白质(Sambri，V.等人，1999)，外膜蛋白质P66(Bunikis，J.等人，1998)和OspC(Marconi，R.T.等人，1993)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，粪便链球菌(Streptococcus faecalis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
本发明还包括源自禽原生动物抗原的免疫原/抗原，其中，例如，但不限于堆形艾美耳球虫(Eimeria acewulina)如3-IE抗原(Lillehoj，H.S.等人，2005；Ding，X.等人，2004)，顶复体抗原(Constantinoiu，CC.等人，2004)和乳酸脱氢酶(Schaap，D.等人，2004)，巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)例如gam56和gam82(Belli，S.I.等人，2004)，56和82kDa抗原蛋白质(Belli，S.I.等人，2002)和EmTFP250(Witcombe，D.M.等人，2004)，毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)例如35-kD蛋白质(Tajima，O.等人，2003)，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)例如TA4和SO7基因产品(Wu，S.Q.等人，2004；Pogonka，T.等人，2003)和12-kDa乱囊壁蛋白质(Karim，MJ.等人，1996)，Eimeria vermiformis，腺型艾美耳球虫(Eimeria adenoeides)，卡氏住白细胞虫(Leucocytozoon caulleryi)例如R7外膜抗原(Ito，A.，等人，2005)，鸟疟疾(Plasmodium relictum)，鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)例如CSP蛋白质(Grim，K.C.等人，2004)和17-和32-kDa蛋白质抗原(Langer，R.C.等人，2002)，和长疟原虫(Plasmodium elongatum)。
本发明的优选实施方式使用禽流感病毒抗原或免疫原。本发明还提供了一种表达各种禽抗原或免疫原的重组载体，例如，以单次注入可保护禽类抵抗多种禽疾病的多价疫苗或免疫原性组合物。
禽流感病毒被传播到人，猪，马，甚至海洋哺乳动物，其成为对于人流感大流行的出现的关键因素。流感病毒属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，基于它们的核蛋白质(NP)和基质(M1)蛋白质中的抗原性区别被分类为A，B和C。AU禽流感病毒被分类为A。而且，亚型是基于两种表面糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性。目前，15 HA和9 NA亚型在流感A病毒中被鉴定(Murphy，B.R.等人，1996；Rohm，C.等人，1996b)。Hal区域的氨基酸序列，其负责HA抗原性，其在亚型与亚型的差异有30％或更多(Rohm，C.等人，1996b)。结果所有HA和NA亚型的病毒在禽类中被发现，哺乳动物流感病毒的病毒亚型是有限的。
禽流感A病毒是通过它们的毒性被定义的：能引起禽疫的高毒性型和通常只引起轻度疾病或无症状感染的无毒性型。在极少情况下，然而，在实验室有低病原性的病毒在野生引起严重疾病的暴发。尽管如此，与这些病毒相关的患病率和死亡率往往比由致命病毒引起的患病率和死亡率更低。
高毒性禽流感病毒已经在如下国家的家禽中引起暴发：澳大利亚(1976[H7](Bashiruddin，J.B.等人，1992)；1985[H7](Cross，G.M.，1987；Nestorowicz，A.等人，1987)，1992[H7](Perdue，MX.等人，1997)，1995[H7]，and 1997[H7])，英国(1979[H7](Wood，G.W.，等人，1993)和1991[H5](Alexander，DJ.等人，1993)，美国(1983 to 1984[H5](Eckroade，RJ.等人，1987)，Ireland(1983 to 1984[H5])(Kawaoka，Y.等人，1987)，德国(1979[H7](Rohm，C.等人，1996a)，Mexico(1994 to1995[H5](Garcia，M.等人，1996；Horimoto，T.等人，1995)，巴基斯坦(1995[H7](Perdue，MX.等人，1997)，意大利(1997[H5])和香港(1997[H5](Claas，EJ.等人，1988)。并不希望被任何理论限制，据信所有的病原性禽流感A病毒为H5或H7亚型，尽管该亚型特异性的理由仍然不为人知。NA亚型与毒性病毒似乎没有联系。另外两种亚型，H4[A/Chicken/Alabama/7395/75(H4N8)](Johnson，D.C.等人，1976)和H10[A/Chicken/Germany/N/49(H10N7)]，已经从处于严重的类禽疫暴发中的鸡中被分离出来。
流感A病毒十分相似(Lamb，R.A.等人，1996)。通过电子显微镜，该病毒为多晶，包括一般为球形(直径大约为120nm)和丝状的病毒粒子。刺突的两种完全不同的类型(长度大约为16nm)，相应于HA和NA分子，存在于病毒粒子的表面。这两种糖蛋白通过疏水性氨基酸的短序列(跨膜区域)锚定在源于宿主细胞的原生质膜的脂类被膜上。HA是I类糖蛋白，含有一个N-末端胞外(结构)域(ectodomain)和一个C-末端锚，而NA是II类糖蛋白，其含有一种N-近端的锚和一个C-末端的胞外(结构)域(ectodomain)。HA使得病毒粒子依附到细胞表面唾液酸低聚糖(sialyl oligosaccharides)(Paulson，J.C.，1985)，并且负载其红血球凝聚活性(Hirst，G.K.，1941)。HA引出在抗感染的保护中十分重要的病毒-中和抗体。NA是一种唾液酸酶(Gottschalk，A.，1957)，其通过清除细胞和病毒粒子表面唾液酸(sialyloligosaccharides中由HA识别的初级基序)来防止病毒粒子聚集(Paulson，J.C，1985)。NA的抗体在保护宿主方面也十分重要(Webster，R.G.，等人，1988)。
除了HA和NA之外，有限数量的M1蛋白质被整合到病毒粒子中(Zebedee，S.L.等人，1988)。它们形成四聚物，具有H1离子通道活性，并且，当在内涵体中被低pH激活时，使病毒粒子的内部酸化，有助于其脱壳(Pinto，L.H.等人，1992)。位于被膜内的M1蛋白质被认为在装配和出芽中起作用。单链RNA分子的八个片段(反义或互补于mRNA)包含于病毒的被膜中，与NP和病毒聚合酶的三个亚基相联系(PB1，PB2和PA)，一起形成一种参与RNA复制和转录的核糖核蛋白(RNP)复合体。NS2蛋白质，现已知存在于病毒粒子中(Richardson，J.C.等人，1991；Yasuda，J.等人，1993)，被认为通过与M1蛋白质(Ward，A.C.等人，1995)的相互作用在RNP从细胞核向外输出中起作用(O′Neill，R.E.等人，1998)。NS1蛋白质，流感A病毒唯一的非结构蛋白质有许多功能，包括剪接的调节，细胞mRNA的细胞核输出和翻译的刺激(Lamb，R.A.等人，1996)。据信其主要的功能为抵抗宿主的干扰素活性，由于敲除了NS1的病毒尽管在非干扰素缺陷细胞中没有母代病毒生长有效，但仍可存活(Garcia-S astre，A.等人，1988)。
本发明中有用的禽流感免疫原或抗原包括但不限于HA，NA和M1，NS2，和NS1。特别优选的禽流感免疫原或抗原为HA和NA。所述禽流感免疫原或抗原可源自AI的任意已知菌株，包括所有的禽流感A菌株，临床分离物，野生分离物和其重配(reassortments)。这些菌株和亚型的例子包括但不限于H10N4，H10N5，H10N7，H10N8，H10N9，H11N1，H11N13，H11N2，H11N4，H11N6，H11N8，H11N9，H12N1，H12N4，H12N5，H12N8，H13N2，H13N3，H13N6，H13N7，H14N5，H14N6，H15N8，H15N9，H16N3，H1N1，H1N2，H1N3，H1N6，H2N1，H2N2，H2N3，H2N5，H2N7，H2N8，H2N9，H3N1，H3N2，H3N3，H3N4，H3N5，H3N6，H3N8，H4N1，H4N2，H4N3，H4N4，H4N5，H4N6，H4N8，H4N9，H5N1，H5N2，H5N3，H5N7，H5N8，H5N9，H6N1，H6N2，H6N4，H6N5，H6N6，H6N7，H6N8，H6N9，H7N1，H7N2，H7N3，H7N5，H7N7，H7N8，H8N4，H8N5，H9N1，H9N2，H9N3，H9N5，H9N6，H9N7，H9N8和H9N9。本发明还涉及被突变的或改变的禽流感免疫原或抗原，其中，所述禽流感免疫原或抗原反映抗原性漂移和抗原性转变。
流感病毒的抗原性通过点突变(抗原性漂移)逐步改变或者通过基因重配(reassortment)(抗原性转变)彻底改变(Murphy，B.R.等人，1996)。对HA和NA的免疫压力被认为驱动抗原性漂移。非人流感病毒对人的直接传播或感染同一细胞的两种不同的流感病毒的基因的重配(reassortment)均可引起抗原性转变(Webster，R.G.等人，1982)。理论上，所述病毒的8种不同的基因片段的移动(shuffling)可产生256种不同的RNA组合。在实验室条件下在体外和在体内，基因重配(reassortment)(Webster，R.G.等人，1975)都有案可查。更重要的是，相对而言，混合感染常常出现在自然界中，并且会引起基因重配(reassortment)，产生新的野生(fields)分离物，杂合形式或重配(reassortant)形式(Bean，WJ.等人，1980；Hinshaw，V.S.等人，1980；Young，J.F.，等人，1979)。之前流行的病毒的再次出现是另一种机制，通过该机制抗原性转变可能出现。
因此，本发明也关注于经历了抗原性漂移或抗原性转变的禽流感免疫原或抗原的用途，包括禽流感的临床分离物，禽流感的野生或环境分离物，禽流感的杂合形式和重配(reassortant)形式。而且，本发明包括本发明所公开的载体和方法中的多于一种的禽流感免疫原或抗原的用途，所述免疫原或抗原以独立的重组载体或在同一重组载体中进行递送以便提供一种刺激或调节针对一种或多种禽流感菌株和/或杂种(hybrids)的免疫反应的多价禽流感疫苗或免疫原性组合物。
许多驯养的和野生的禽类受到流感病毒感染。它们包括鸡，火鸡，鸭，珍珠鸡，家鹅，鹌鹑，野鸡，山鹑，八哥，雀形目鸟，鹦鹉，相思鹦鹉，鸥，shorebirds，海鸟和鸸鹋(Easterday，B.C.等人，1997；Webster，R.G.等人，1988)。一些被感染的鸟类出现流感的症状，而其它的却没有。在驯养的禽类中，火鸡最常涉及于流感暴发中；鸡也涉及其中，但频率却低些。禽流感A病毒在鸟类中产生一系列症状，由无症状到轻微的上呼吸道感染到蛋产量的损失，再到快速致死的系统性疾病(Eckroade，RJ.等人，1987)。疾病的严重性取决于多种因素，包括病毒的毒性，免疫状况和伴随着细菌感染和施加于宿主的压力宿主的饮食。取决于在鸡和火鸡中的它们的病原性，禽流感A病毒被分类为剧毒(能够引起禽疫)或无毒(引起轻度或无症状的疾病)。甚至当对一种禽类具有高病原体性时，流感A病毒不可能对另的禽类具有病原性(Alexander，DJ.等人，1986)。例如，鸭子通常对在鸡中致命的病毒具有抗性。作为另一个例子，很容易杀死鸡和火鸡的A/火鸡/爱尔兰/1378/85(H5N8)在鸭子中却不会引起疾病症状，尽管如此，它还是会在被感染的鸟类的许多内部器官和血中被检测到(Kawaoka，Y.等人，1987)。
流感病毒由肠道被分泌到被感染的鸟类的粪便中(Kida，H.，等人，1980；Webster，R.G.等人，1978)。其传播方式可以是直接的或间接的；它们包括与气溶胶和其它病毒污染物质接触。由于被感染的鸟类在它们的粪便中分泌大量病毒，许多不同的物质都会被污染(例如，食物，水，装置和笼子)并有助于病毒的传播。水源传播可提供一种使禽流感病毒在天然的水禽栖息地一年一年地永存下去的机制。由商售的禽类所证明的典型的体征和症状，例如受高病原性的禽流感病毒感染的家禽的体征和症状包括蛋量减产，呼吸病征，水泡音，过度流泪，窦炎，无毛皮肤的青紫(尤其是肉冠和垂肉)，头和脸的水肿，褶的羽毛，腹泻，和神经系统混乱。
出现的特征的数量取决于鸟类的种类和年龄，病毒的毒株和伴随的细菌感染(Easterday，B.C.等人，1997；Webster，R.G.等人，1988)。偶尔，鸟也会不出现任何疾病病征地死亡(Alexander，DJ.等人，1993；Wood，G.W.，等人，1994)。被注射了高病原性病毒的鸡的肉眼损伤和组织学损伤十分相似，但并没有显示出某种菌株变异(Alexander，DJ.等人，1986；Mo，LP.等人，1997；Swayne，D.E.等人，1997)。所报道的案例间的一些差异可反映实验条件中的差异，包括接种路线，鸡的品种和年龄以及病毒的剂量。微脉管内皮的膨胀，系统性充血，多灶性出血，血管周围的单核细胞渗透和血栓形成通常在被高毒性病毒感染的鸡中被观察到。这些病毒在脉管内皮和血管周围薄壁组织细胞中有效复制，这是一种可能对病毒传播和系统性感染十分重要的性质(Kobayashi，Y.等人，1996；Suarez，D.L.等人，1998)。除了其它器官中的有坏死变化和炎性变化的细胞之外，病毒抗原也可以在坏死的心肌细胞中被发现(Kobayashi，Y.等人，1996)。
本发明还涉及在细胞中表达一种或多种抗原或免疫原的方法。作为实验室设置的初步步骤，抗原或免疫原可以由编码蛋白质和肽的异源的核苷酸序列所替代，所述核苷酸序列包括编码报告蛋白质(例如，酶)的核苷酸序列。报告蛋白质在本领域中已知，其包括但不限于绿色荧光蛋白质，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶，荧光酶，碱性磷酸酶和氯霉素乙酰基转移酶基因。许多这种报告蛋白质以及它们检测的方法都作为许多商售的诊断试剂盒的一部分包括于其中。目的抗原或免疫原可编码一种反义核酸，小干扰RNAs(siRNAs)，核酶或其它非翻译RNAs，例如“向导”RNAs(Gorman等人，1998)等等。
本发明的重组载体和方法还包括可倚赖于重组载体或免疫原性组合物的递送调节免疫反应的治疗性蛋白质或佐剂分子的用途。这些治疗性蛋白质或佐剂分子可包括但不限于免疫调节子，例如白细胞介素，干扰素和共刺激分子。本领域已知的在禽类个体中调节免疫反应的禽细胞因子为鸡干扰素-α(IFNα)(Karaca，K.等人，1998；Schijns，V.E.等人，2000)，鸡干扰素-γ(IFNγ)，鸡白细胞介素-1β(Ch1L-1β)(Karaca，K.等人，1998)，鸡白细胞介素-2(ChIL-2)(Hilton，L.S.等人，2002)，和鸡骨髓-单核细胞生长因子(cMGFl York，JJ.等人，1996；Djeraba，A.等人，2002)。免疫调节分子可以与有创造力的免疫原性组合物一同给药，或者作为选择，免疫调节分子的核酸可以在本发明的重组载体中与禽免疫原或抗原一起共表达。
所述异源序列的受试个体中的表达，即禽流感免疫原，可在个体中产生针对所述抗原或免疫原的表达产物的免疫反应。因此，本发明的本发明的重组载体可以在免疫组合物或疫苗中被使用从而提供一种引起免疫反应的方式，该免疫反应可以是保护性免疫但并不必须是保护性免疫。本发明上下文中所使用分子生物学技术已由Sambrook等人(2001)描述。
作为另一种选择，或是额外的，本发明所包含的免疫原性或免疫组合物中，编码抗原或免疫原的核苷酸序列可以在编码跨膜区域的部分中有所删除。然而，作为另一种选择，或是额外的，所述载体或免疫原性组合物可再含有一种编码例如人或禽tPA这样的异源tPA信号序列的核苷酸序列和/或一种稳定化的例如兔β-珠蛋白基因的内含子II这样的内含子，并在宿主细胞中进行表达。
本发明还提供了一种在体外或在体内将异源核苷酸序列传输和/或施加到细胞内的方法。根据该方法，细胞被本发明的重组人腺病毒载体所感染(如本文详细描述的)。该细胞可以通过病毒转导的自然过程被所述腺病毒载体感染。作为选择，所述载体可通过本领域中其它已知的方法被导入到细胞中。例如，该细胞可以与目的腺病毒载体(如下文所述)接触，并被另一种交替的机制所吸收，例如，由受体介导的内吞作用。作为另一种实施例，采用一种抗体或其它结合蛋白质，该载体可被靶向于一种内在化的细胞表面蛋白质上。
载体可以以能够实现基因产品(例如，表位，抗原，治疗剂和/或抗体)组合物所指的量施加到禽类个体中。当然，本发明面对上下文中所举例的剂量，对于任何要施加给禽个体的组合物，包括其成分，对于任何特殊的施加方法，优选测定：毒性，例如通过测定合适的禽模型中的致命剂量(LD)和LD50；并且，确定引起适当的反应的组合物的剂量，其中成分的浓度和施加组合物的时机的选择，例如通过血清滴定法及其分析，例如通过ELISA和/或血清中和(seroneutralization)分析。这些测定不需要超出本领域技术人员的实验，这种公开的内容和文件都引入本文。
本发明的组合物的例子包括用于孔(口)或粘膜的，例如口腔，鼻，肛门，阴道的，经口的，胃内给药的等液体制剂，例如悬浮液，溶液，喷雾剂，糖浆剂或酏剂；和用于肠胃外，皮肤外(epicutaneous)，皮下(即，通过下颈)，皮内，腹膜内，肌肉内(即，通过翅-蹼，翅尖，胸和大腿肌肉组织穿刺)，鼻内或静脉给药(例如，可注射的给药)的制剂，例如无菌悬浮液或乳剂。本申请涉及于2004年4月6日出版的美国专利第6,716,823号；于2004年3月16日出版的美国专利第6,706,693号；2002年2月19日出版的美国专利第6,348,450号；美国申请系列号10/052,323和10,116,963；和10/346,021，这些内容都并入本文作为参考，这些文献公开了通过递送的非侵害性方式进行的免疫原性或疫苗组合物的免疫和递送，也就是皮肤外和鼻内给药。对禽类的给药和递送的其它方法包括在饮用水或水中投放重组载体或免疫原性组合物，其中疫苗的剂量可选自101至104/动物之间。
对于肌肉内注射，给药可发生在胸部(pectoral)，腿(大腿上部/横侧腹肌肉组织)，翅-蹼(翼膜)，翅下(腋窝)和翅尖。所使用的针的长度和直径(标准尺)应该是能够使得疫苗递送导所选择的肌肉的中心的长度和直径。
给药的一种特别有效的方法为卵内递送(Gildersleeve，R.P.，1993a；Gildersleeve，R.P.等人，1993b；Sharma，J.M.，1985；Sharma，J.M.等人，1984)。卵内递送作为一种用于禽类的大量免疫的有前景的方法，正在兴起。这是因为以均一剂量的疫苗通过机器注射器进行给药既省劳动力又省时间(Johnston et al，1997；Oshop et al，2002)。迄今为止，超过80％的美国大批生产的肉用仔鸡在卵内经机械注射器处理以对抗马雷克病(Wakenell等人，2002)。该方法也被越来越多地采用来给药传染性囊病(IBD)和新城疫(ND)疫苗。在鸡中DNA疫苗的卵内递送也引起免疫反应(Kapczynski等人，2003；Oshop等人，2003)和一种复制性的α病毒-载体化的疫苗(Schultz-Cherry等人，2000)。与它们的复制对应物相比，DNA和病毒载体化的卵内疫苗和免疫原性组合物不太可能杀死或伤害胚胎，特别是，Ad载体由于它们不能在卵内复制因此具有更高的坚持服药率。
机械化的系统，装置和设备，例如像这样的商业上可获得的机械化的系统，装置和设备，缓缓地以精确测定的量注射化合物，疫苗和免疫原性组合物而不对发育的胚胎引起创伤，从而通过自动化和减少活禽生产成本，减少鸡的管理，提高孵卵所的易管理性。
Figure A200680038344D00411
和其它机械化的系统，装置或设备，通过以下方式进行运作：将注射头缓缓降低到蛋的顶部，一个小直径的空心冲头在蛋壳上钻开一个小孔。针通过管下降到被控制的深度(通常2.54cm)，将预先确定体积的少量疫苗，免疫原性组合物或化合物递送到胚胎中，然后针被抽出，并在灭菌洗涤剂中进行清洗。在卵内递送疫苗和基因的方法可以在下列文献中找到：美国专利第4,458,630号；RE 35973；6,668,753；6,601,534；6,506,385；6,395,961；6,286,455；6,244,214；6,240,877；6,032,612；5,784,992；5,699,751；5,438,954；5,339,766；5,176,101；5,136,979；5,056,464；4,903,635；4,681,063；于2003年10月16日提交的美国申请系列号10/686,762；于2002年8月9日提交的10/216,427；于2002年2月13日提交的10/074/714；和于2002年1月9日提交的10/043,025，这些内容都明确地并入本文作为参考。因此，本发明包括一种用于对本文所描述的重组载体疫苗或免疫原性组合物进行卵内递送或给药的设备或装置。该装置或设备任选可包括本发明的重组人腺病毒载体或免疫原性组合物，即可以预先载有用于对禽类进行卵内给药的载体或免疫原性组合物。
本发明还包括有创造力的组合物的连续给药或所述方法的连续施行，例如有创造力的组合物的定期给药，例如对某种状况进行治疗或处理期间和/或增大剂量给药免疫组合物期间和/或最初的增强给药法(prime-boost regimens)期间；且连续给药的时间和方式不用过度试验就可确定。
而且，本发明包括组合物以及制备和使用载体的方法，包括在体内和/或体外生产基因产品和/或免疫制品和/或抗体的方法(例如，后两者，举例来说，在从经按照本发明的给药的宿主的细胞中分离出来后，例如在该细胞的随意膨胀后)，以及这些基因和/或免疫制品和/或抗体的用途，包括在诊断，化验，治疗，处理等中的用途。
通过将载体和一种合适的载体或稀释剂混合配制载体组合物；同样通过混合基因和/或免疫制品和/或抗体和一种合适的载体或稀释剂配制基因产品和/或免疫制品和/或抗体组合物；参见例如美国专利第5,990,091号，WO 99/60164，WO 98/00166，它们所引用的文献以及本文引用的其它文献，以及本文的其它教导(例如，涉及载体，稀释剂等等)。
在这些组合物中，所述重组载体可以与一种合适的兽医学或药学上可接受的载体，稀释剂或例如无菌水，生理盐水，葡萄糖等等赋形剂混合。所述组合物也可以是被冻干的。根据所希望的给药途径和制备，所述组合物可含有辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，佐剂，胶化或粘度提高添加剂，防腐剂，增味剂，着色剂等等。
已知DMSO提高疫苗和免疫原性组合物的效能，尤其是涉及载体或含有载体的免疫原性组合物的卵内递送。DMSO被认为增加细胞膜的渗透性提高来提高疫苗的效能(Oshop等人，2003)。其它能够渗透细胞的试剂或添加剂，减少羊水的粘性，并呈现比可用于疫苗或免疫原性组合物的配制的DMSO更高的坚持服药率，尤其是通过卵内递送给药时。已经显示出，许多蛋白质的吸收，例如胰岛素，leptin和生长激素，在鼻内给药后由于十四烷基麦芽糖苷(TDM)等表面活性剂而增加，且没有明显的副作用(Arnold，等人，2004)。本发明因而包括TDM在所述方法中使用以及这里所描述的组合物。
含有0.125％ TDM的配方能缓和细胞形态中的变化，而更高浓度的TDM(即0.5％)能够瞬间引起更广泛的变化。人们认为由于哺乳动物中的粘滞的鼻涕和含胚的禽蛋的羊水，TDM提高载体在卵内的递送。Arnold，等人(2004)所描述的TDM的安全分布(safety profile)对于提高被免疫禽类的健康和对进入食物链的适应性特别有利。
要给药的载体的数量随给药个体和处理的条件而各不相同，就体重来说，每天可由一个或几个微克变化至几百个或几千个微克，且疫苗或免疫原性组合物的剂量优选在101-106噬斑形成单位(PFU)/鸟之间，优选102-105 PFU/鸟之间。对于注射，当在翅蹼给药时，含有上述效价的疫苗，当用兽医学上可接受的液体例如生理盐水稀释至终体积约为0.1ml或0.01ml。本发明的载体和方法使得卵内接种和对1天大的小鸡的接种以及更大的鸡和成年鸡的接种成为可能。
载体可没有侵害性地以能够实现基因产物(例如，表位，抗原，治疗剂和/或抗体)组合物所需(stated for)的量被给药到禽类个体。当然，本发明关注于上文和下文这些列举的剂量，对于任何要施加到禽类个体的包括其成分在内的组合物而言，对于任何具体的给药方法，优选测定：毒性，例如通过测定适当的禽类模型中的致死剂量(LD)和LD50；和引起适当反应的组合物的剂量，其成分的浓度以及施加组合物的时机，例如通过血清滴定法及其分析，例如通过ELISA和/或血清中和(seroneutralization)分析。这些测定不需要超出本领域技术人员的实验，这种公开的内容和文件都引入本文。
重组载体可以以足以获得相应于本文描述的和或本文所引用的文献中描述的剂量的体内表达的合适量被给药。例如，病毒悬浮液的适当范围可以根据经验来确定。如果多于一种基因产物通过多于一种的重组体被表达，每种重组体可以以在这些量的范围中被给药；或者，每种重组体可以以组合的方式给药，重组体的总量包括这些量。
在本发明所使用的载体或质粒组合物中，剂量可以是如本文引用的文献中或本文所描述的或者本文所参考或引用的文献的中所引用的文献所描述的剂量。优选的是，所述剂量应当是足以引起与所述抗原直接存在的组合物相似的反应的质粒的量；或是具有与这些组合物中的剂量类似的表达的量；或具有与在体内通过重组组合物获得的表达类似的表达的量。
然而，引起适当的免疫反应的组合物的剂量，其成分的浓度和组合物的给药时机，可以通过例如血清的抗体滴定法这样的方法测定，例如通过ELISA和/或血清中和(seroneutralization)化验分析。这些测定不需要超出本领域技术人员的实验，这种公开的内容和文件都引入本文。而且，连续给药的时机也同样用所述公开和现有技术中可确定的方法确定，不需要过度的实验。
本发明所关注的免疫原性或免疫组合物也可以含有佐剂。合适的佐剂包括fMLP(N-甲酰基-蛋氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸；美国专利第6,017,537)和/或丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和/或一种马来酐和烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物可以是交联的，例如与糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物以术语“卡波姆(carbomer)”的名义是已知的(Pharmeuropa，Vol.8，No.2，June1996)。本领域的技术人员可以参考美国专利第2,909,462号(并入本文作为参考)，其讨论了这种与含有至少3个羟基的多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物：在一种实施方式中，多羟基化化合物含有不超过8个羟基；在另一个实施方式中，至少三个羟基的氢原子被含有至少两个碳原子的不饱和脂肪基替代；在另一个实施方式中，被含有约2-约4个碳原子的基团，例如乙烯基，烯丙基和其它烯键式不饱和基团替代。所述不饱和基团自身可含有其它取代基，例如甲基。这些产品的商品名为(Noveon Inc.，Ohio，USA)，特别适于做为佐剂来使用。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联，提到了产物
Figure A200680038344D00442
 974P，934P和971P。
至于马来酐和烯基衍生物的共聚物，提到了
Figure A200680038344D00443
制品(Monsanto)，其为马来酐和乙烯的共聚物，可以是线性或交联，例如与二乙烯基醚交联。此外，还参考美国专利第6,713,068号和Regelson，W.等人，1960；并入本文作为参考)。
美国专利第6,713,068描述了含有季铵盐的阳离子脂类，该专利的内容并入本文作为参考，这种含有季铵盐的阳离子脂类也可以在本发明的方法和组合物中使用。在这些阳离子脂类中，优选DMRIE(N-(2-羟基乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷基氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，优选的是，与一种中性脂类相联系，优选的是DOPE(二油酰基-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994)以形成DMRIE-DOPE。
重组疫苗或免疫原性或免疫组合物可以配制成水包油乳剂的形式。这种水包油乳剂可以基于例如轻液状石蜡油(欧洲Pharmacopea型)；类异戊二烯油例如角鲨烷，角鲨烯，EICOSANETM或四十四烷；烯烃的低聚产生的油，例如异丁烯或癸烯；含有线性烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，丙三醇三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯类，例如异硬脂酸酯。所述油优选与乳化剂结合使用以形成乳剂。所述乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如山梨聚糖，二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)，甘油，聚甘油，丙二醇和油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，它们可任选地被乙氧基化，所述乳化剂可以是聚氧化丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如
Figure A200680038344D00444
产品，例如L121。所述佐剂可以为乳化剂，微团形成剂和油的混合物，这种混合物可以以名为
Figure A200680038344D00445
(IDECPharmaceuticals，San Diego，CA)获得。
表达一种或多种目的抗原或免疫原的重组腺病毒或重组腺病毒载体，例如根据本发明的载体，可以以液体形式于
Figure A200680038344D0044125346QIETU
，或者以冷冻干燥或冻干形式，在稳定的存在下被保存和/或保藏和储存。冷冻干燥可以按照已知的标准冷冻干燥程序进行。药学上可接受的稳定剂可以是SPGA(磷酸蔗糖谷氨酸白蛋白；Bovarnick，等人，1950)，碳水化合物(例如，山梨醇，甘露醇，乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，海藻糖)，谷氨酸钠(Tsvetkov，T.等人，1983；Israeli，E.等人，1993)，蛋白胨等蛋白质，白蛋白或酪蛋白，含有脱脂奶等试剂的蛋白质(Mills，CK.等人，1988；Wolff，E.等人，1990)，和缓冲液(例如磷酸缓冲液，碱金属磷酸缓冲液)。可使用佐剂和/或载体或赋形剂来使得冻干制品可溶。
本发明可通过下述非限制性的实施例被进一步描述，这些实施例以说明本发明的各个实施方式的方式给出，并不意味以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：编码A/Panama/2007/99 HA的Ad载体的构建
流感病毒菌株，A/Panama/2007/99(H3N2)(SEQ ID NOs：1，2)，是在2003-2004年间筛选出来用于疫苗生产的，由疾病控制中心(Centers for Disease Control)提供(CDC)。血凝素(HA)基因通过以下方式克隆：逆转录流感RNA，然后用采用表1中的下述引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增HA基因。
表1：Ad载体构建中使用的引物
 
引物 序列
5’HA 5’-CACACAGGTACCGCCATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC-3’(SEQ ID NO：9)
3’HA 5’-CACACAGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3’(SEQ ID NO：10)
这些引物含有退火到A/Panama/2007/99 HA基因的5’和3’端的序列，和对应于紧挨着HA起始ATG密码子的上游的真核核糖体结合位点的序列(Kozak，1986)，和用于随后的克隆的Kpn1位点。含有完整的HA基因的Kpn1片段以正确的方向被插入到pShuttle-CMV的Kpn1位点中(He等人，1998)(T.He提供)，处于人细胞巨化病毒(CMV)早期启动子转录控制下。
使用一种如前人(Zeng等人，2001)所述的简化的重组系统，在人293细胞中生产了编码A/Panama/2007/99 HA(AdPNM2007/99.H3)的E1/E3-缺陷型Ad5载体。通过对HA插入体和载体之间的5’和3’端连接进行测序，验证AdPNM2007/99.H3载体的有效性。在鼻内给药AdPNM2007/99.H3后，抗A/Panama/2007/99的HI抗体在小鼠体内引发。
实施例2.通过在卵内和肌肉内注射重组Ad载体对鸡进行免疫
通过免疫接种人Ad-载体化的疫苗对鸡进行的免疫迄今为止还没有报道过。由于Ad5不能在鸟中自然发现，这种载体被认为无法感染鸡细胞和/或在鸡细胞中有效复制。令人惊讶的是，肌肉注射AdPNM2007/99.H3两周后，在所有3只鸡中均获得了512的血清HI效价(图1)。
当将AdPNM2007/99.H3载体注射到9天大和18天大的含胚鸡蛋时，前者的血清HI效价达到8和16，孵化后两星期的后者中HI效价达到<4，4和8。该结果提示E1/E3-缺陷型人Ad5载体由于其转染禽细胞的能力以及无法在禽细胞中复制，因此可用作禽类的疫苗载体。通过卵内接种引发的相对低的HI效价可归因于，其中，剂量和胚胎的阶段。Ad5载体通过将其纤维结合到在鸡细胞表面发现的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)可具有鸡胚的转化部分(Tan等人，2001)。因为Ad是一种能够通过在内化后破坏核内体保护载体DNA的有效载体，因此在只转导一部分细胞后，可引起免疫反应(Curiel，1994)。此外，至少一种Ad组分，异己酮，具有高免疫原性，并给外源抗原提供佐剂活性(Molinier-Frenkel等人，2002)。
将AdPNM2007/99.H3载体以200[mu]1的体积，5×1010pfu/蛋的剂量分别注射到9天大(组1)和18天大(组2)含胚鸡蛋的羊膜中。每组6个蛋；然而，组1中只孵化出两只禽，组2只孵出3只禽。孵化后两周以前人描述方式测定了血清HI效价(Van Kampen等人，2005)。组3中，将AdPNM2007/99.H3载体肌肉内以100μl的体积，2.5×1010pfu/动物的剂量注射到3只4周大的鸡中。免疫后两周测定HI效价。
组1(卵内免疫9天大的胚胎)中，HI效价达到8和16；组2中(卵内免疫18天大的胚胎)，HI效价达到<4(任意指定效价为2)，4和8；组3(肌肉内免疫4周大的鸡)中，在三只鸡中HI效价均达到512。图1以log2标度表示HI效价。正方形对应组1中各个鸡的HI效价；而三角形对应于组2中各个鸡中的HI效价。圆圈对应于组3中各个鸡的HI效价。
实施例3.编码A/Turkey/Wisconsin/68 H基因TAdTW68.H5)的Ad 载体的构建
编码AI病毒菌株的H的A/Turkey/WI/68H(SEQ ID NOs：3，4)的DNA模板，由USDA Southeast Poultry Research Laboratory，AthensGA提供，使用下表2中的引物进行PCR。
表2：构建Ad载体时使用的引物
 
引物 序列
5’HA 5’-CACACAAAGCTTGCCGCCATGGAAAGAATAGTGATTGC-3’(SEQ ID NO：10)
3’HA 5’-CACACAGGATCCATCTGAACTCACAATCCTAGATGC-3’(SEQ ID NO：11)
这些引物含有退火到A/Turkey/Wisconsin/68 H基因的5’和3’端的序列，紧挨着H起始ATG密码子的上游的真核核糖体结合位点(Kozak，1986)，和唯一的用于随后的克隆的限制性位点。含有完整的H基因的片段以正确的方向被插入到穿梭质粒pAd Apt(由Crucell，Leiden，The Netherlands提供)的Hindlll-BamHI位点，处于人细胞巨化病毒(CMV)早期启动子转录控制下。通过按前人所述方式(Shi等人，2001)将pAdApt-TW68.H5与Ad5主链质粒pAdEasyl(He等人，1998)共转染，在人PER.C6细胞(由Crucell提供)中产生了一种编码A/Turkey/Wisconsin/68H基因(AdTW68.H5)的无RCA的E1/E3-缺陷型Ad载体。通过对H插入体和载体之间的5’和3’端连接进行测序，验证AdTW68.H5载体的有效性。
Ad-载体化卵内AI疫苗可被快速生产，并在极好的安全分布内大量地给药到鸡群中，应兴起的AI传染病的要求。在连同层析介导的纯化(Konz，2005)和不需要冷冻机长期保存的缓冲液(Evans，2004)的无血清悬浮生物反应器(Lewis，2006)中，无RCA的Ad5载体在已明确表征的PER.C6细胞系中的大规模生产应当大幅极少Ad5载体的生产成本。使用培养细胞代替含胚蛋作为用于疫苗生产的基质十分重要，尤其是在AI暴发时当受精卵短缺时。该Ad5-载体化AI疫苗之所以按照DIVA策略，是因为该载体只编码病毒HA。因此，通过酶联免疫吸附测定进行的血清HI抗体的分析和抗-AI核蛋白质的测量使得AI疫苗或病毒的暴露的测定快速进行。
尽管可以通过由含有非病原体性流感病毒主链的新城疫病毒载体(Swayne，2003)或重配(reassortant)流感病毒(Lee，2004)表达HA来制备气溶胶AI疫苗，无RCA的Ad5-载体化卵内AI疫苗提供了一种能够通过均一剂量的非复制型AI疫苗的自动化给药抑制被免疫的禽类的HPAI病毒感染的独特平台，与DIVA策略相一致。与产生回复体的风险相关的且允许遗传修饰的生物在环境中的目标物种和非目标物种中传播的复制中的重组载体不同，无RCA的Ad5载体不会在野外传播。与可产生不想要的与另一种同时流行的野生流感病毒(Hilleman，2002)的重配(reassortment)的AI病毒疫苗不同，Ad5的DNA基因组不可能经历与流感病毒的分段的RNA基因组的重配(reassortment)。
实施例4.在卵内接种AdTW68.H5
在卵内接种按前人所述方式进行(Senne，1998；Sharma等人，1982)。在接种前，对光检查所有胚胎的生存能力，标记接种位点，并用含有3.5％碘的70％的乙醇溶液清除。用装有尖头电极的旋转转头在壳上打孔。用1ml注射器按照羊膜-尿囊路线进行接种。接种后，用熔化的石蜡封口。
实施例5.AdTW68.H5的血清学二次接种
在SPF含胚鸡蛋中二次传代AI菌株A/Turkey/WI/68使效价达到10，胚胎感染剂量为50％/ml。检测氨尿囊液(Amnioallantoic fluids)的红血球凝集活性。按前人描述方法使用AI病毒的4个血细胞凝集单位的血细胞凝集抑制测定各体血清样本中的抗体效价(Swayne等人，1998，Thayer等人，1998)。
实施例6.AI基因组的取样和定量
来自于各个禽类的口咽样本悬浮于1.0ml的脑心浸液培养基中(Difco，Detroit，Mich.)，并保藏于-70℃。用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取RNA(Qiagen)。用特异于A型流感病毒基质RNA的引物进行定量的实时RT-PCR，按前人所述方式(Spackman，2002)。使用由已知量的对照的A/Ck/Queretaro/14588-19/95 RNA(1010-1060EID50/mL)产生的标准曲线，从周期阈值中以内插法计算病毒RNA。
实施例7.通过卵内接种AdTW68.H5对鸡进行免疫，然后进行孵 化后加强免疫
在胚胎的第10或18天通过将含有1011病毒颗粒/ml(vp/ml)的300μl的AdTW68.H5给药到SPF含胚蛋中进行对鸡的通过接种的免疫。每组孵化的鸡被平均分为两组：在孵化后15天一半鸡经鼻途经再次接种相同剂量的AdTW68.H5，剩下的鸡没有受到孵化后加强免疫的处理(booster application)。孵化后28天这些鸡组中获得的血清中检测到的HI抗体效价示于图2。
胚胎的第10天卵内进行了接种的鸡的HI效价在2log2至7log2(平均值为4.2)之间变化；经孵化后加强免疫处理的在胚胎第10天进行了接种的鸡的效价在2log2至9log2(平均值为5.5)之间变化；在胚胎第18天进行了接种的鸡的效价在2log2至9log2(平均值为5.5)之间变化；在胚胎第18天进行了接种并在孵化后15天后加强免疫(boosted)的鸡的HI值在2log2和8log2(平均值为5.7)之间。总体来说，在卵内给药人Ad-载体化AI疫苗在鸡内引起了针对AI的强免疫反应，而将这种载体化疫苗鼻内滴注到鸡中，如最近所证明的(Gao，2006)，并没有效果。
实施例8.在卵内接种AdTW68.H5使之免于遭受高病原性禽流感 菌株HPAI A/Ck/Oueretaro/19/95(H5N2)的致命攻击
在接种第18天以与实施例7中描述的AdTW68.H5的相同剂量，通过卵内途径免疫19个SPF鸡胚胎。孵化的鸡通过翅标被逐个鉴定。一组12只鸡通过鼻途径在孵化后15天被加强免疫(boosted)，剩下的7只鸡没有被加强免疫。在23天和29天大时从每只经翅标的鸡中获得血样，并通过针对禽流感菌株A/Turkey/Wisconsin/6的抗体的HI进行检测。总的来说，在这些鸡中检测到的HI抗体效价(图3)与之前试验中获得的值相似(图2)。大多数鸡的效价达到了之5log2。只在卵内接种的鸡的效价在孵化后23天达到5log2至9log2之间(图3)。孵化后29天，这些鸡的抗体效价获得了维持或获得提高。与鼻内加强免疫同时在卵内接种显示出抗体效价在孵化后23天在3log2至9log2之间变化(图3)。与前组相似，大多数鸡在孵化后29天，效价提高了1log2或2log2阶段。
通过口咽接种以105胚胎感染剂量(EID50)的HPAIA/Ck/Queretaro/19/95(H5N2)(Horimoto，1995，Garcia，1998)以生物安全等级3+facilities进行攻击(challenge)。该攻击菌株的H基因与Ad-载体化疫苗中使用的AI菌株A/Tk/WI/68的H(GenBank登录号U79448 & U79456)(SEQ ID NOs：5，6，7，8)具有90.1％核苷酸同一性，有94.4％推测的氨基酸相似性。
总共30只鸡在孵化34后天被攻击，这其中包括7只经卵内接种的鸡和12只卵内接种然后又在孵化15天后鼻内加强免疫(boosted)的鸡，和11只未经接种免疫的对照。
在14天的试验时间里从始至终每天观察被攻击的鸡的患病率和死亡率。攻击后两天在11只对照鸡中的10只中观察到了AI的临床表征，包括鸡冠和垂肉的肿胀，结膜炎，厌食和体温过低。两天后，对照组中的大多数幸存者出现鸡冠坏死，垂肉肿胀，腹泻，脱水，嗜水，小腿皮下出血。经接种疫苗的鸡中没有显示出疾病的病征。所有经AdTW68.H5(19/19)接种的(只在卵内和在卵内+鼻内加强免疫)鸡都幸免于攻击(图4)。
通过实时逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)定量测定攻击后2，4和7天收集的咽拭子(oropharyngeal swabs)中的被攻击的鸡的A/Chicken/Queretaro/19/95的病毒基因组。在攻击后第7天，经接种和未经接种的鸡之间的AI病毒基因组的浓度有显著差异(p<0.05)(图5)。经免疫的鸡中缺少可检测到的病毒RNA提供了卵内接种引起了能够控制AI病毒在一周之内离体的免疫反应的证据。
这些结果总的来说，表明在卵内经编码来源于不同流感病毒(人和禽来源)的H基因的无RCA人Ad载体免疫的鸡出现抗同源AI病毒的效价，这些鸡受到保护以对抗相同H型的高病原性AI病毒菌株的致命性攻击。
实施例9.卵内接种AdTW68.H5使之免于受到高病原性禽流感菌 株A/Swan/Mongolia/244L/2005(H5N1)的致命性攻击
为了测定AdTW68.H5-载体化AI疫苗能够提供保护以对抗最近的H5N1 HPAI病毒菌株，31只鸡在卵内以2×108ifu的剂量在卵内接种了AdTW68.H5载体。对照组包括10只接种了编码不相关的抗原(破伤风毒素C-片段)的Ad5载体(AdCMV-tetC)(Shi等人，2001)的鸡和10只暴露于Ad5载体的鸡。
在第31天，用H5N1 AI病毒A/Swan/Mongolia/244L/2005攻击对照和经免疫的鸡(攻击菌株的HA与A/Turkey/Wisconsin/68菌株的HA的89％推测的HA氨基酸序列具有相似性)。如图6所示，卵内免疫在第25天引发抗体，范围在1log2至6log2之间。未接种(10/10)和经AdCMV-tetC-免疫的(10/10)鸡没有产生出可检测得到的HI抗体，所有都在攻击后9天内死于AI，而68％(21/31)的经AdTW68.H5-免疫的鸡在攻击后10天幸存下来而没有出现临床病征(图7)。值得注意的是，HI效价为>3 log2(图6)免疫组中的7只鸡还是被高致命性的H5N1 AI病毒杀死。这可能是针对H5N1 AI病毒的存活率可以通过卵内接种编码具有更接近的抗原性的HA的Ad5载体而提高。
这些结果证明卵内接种了编码禽H5 HA的无RCA的人Ad5载体可引发抗HPAI病毒的保护性免疫。本发明优选的实施方式已经进行了详细的描述，应当理解的是，由所附加的权利要求所定义的本发明并不受上述陈述的具体细节限制，因为这些内容的许多明显的改变可不远离本发明的实质和范围。
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Claims (62)

1.重组人腺病毒表达载体，其包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述腺病毒DNA序列来源于腺病毒血清型5(Ad5)。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述腺病毒DNA序列选自复制缺陷型腺病毒、非复制型腺病毒、可复制型腺病毒或野生型腺病毒。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子序列选自病毒启动子、禽启动子、CMV启动子、SV40启动子、β-肌动蛋白启动子、白蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞过多症病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾坏死病毒。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种禽病毒。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
9.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
10.一种用于体内递送给禽类个体的免疫原性组合物或疫苗，其包括兽医学上可接受的载体或赋形剂和重组人腺病毒表达载体，该表达载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
11.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述腺病毒DNA序列来源于腺病毒血清型5(Ad5)。
12.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述腺病毒DNA序列选自复制缺陷型腺病毒、非复制型腺病毒、可复制型腺病毒或野生型腺病毒。
13.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述启动子序列选自启动子、禽启动子、CMV启动子、SV40启动子、β-肌动蛋白启动子、白蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子。
14.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞瘤病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒、或禽脾坏死病毒。
15.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种禽病毒。
16.根据权利要求10的免疫原性组合物或疫苗，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
17.根据权利要求16的免疫原性组合物或疫苗，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
18.根据权利要求17的免疫原性组合物或疫苗，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3或5。
19.根据权利要求10的组合物或疫苗，其还包括佐剂。
20.根据权利要求10的组合物或疫苗，其还包括另外的疫苗。
21.一种在细胞中导入和表达一种或多种禽抗原或免疫原的方法，所述方法包括将细胞与重组人腺病毒表达载体接触并在足以在细胞中表达一种或多种禽抗原或免疫原的条件下培养细胞，所述表达载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列。
22.根据权利要求21的方法，其中所述细胞为293细胞。
23.根据权利要求21的方法，其中所述细胞为PER.C6细胞。
24.根据权利要求21的方法，其中所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞过多症病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾坏死病毒。
25.根据权利要求24的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种腺病毒。
26.根据权利要求24的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
27.根据权利要求26的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
28.根据权利要求27的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
29.一种在禽胚胎中导入和表达一种或多种禽流感抗原或免疫原的方法，所述方法包括将禽胚胎与重组人腺病毒表达载体接触，所述载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列，从而在禽胚胎中获得一种或多种禽流感抗原或免疫原的表达。
30.根据权利要求29的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于一种或多种禽病毒。
31.根据权利要求29的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
32.根据权利要求31的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
33.根据权利要求32的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
34.根据权利要求29的方法，其还包括给药另外的疫苗。
35.根据权利要求29的方法，其中接触通过卵内递送发生。
36.在禽类个体中引起免疫原性反应的方法，所述方法包括将免疫有效量的权利要求10-20中任意一项的组合物给药到禽类个体。
37.一种在禽类个体中引发针对禽流感的免疫原性反应的方法，其包括对禽类个体给药免疫有效量的权利要求10-20中任意一项的组合物。
38.在禽类个体中引起免疫原性反应的方法，所述方法包括用免疫有效量的免疫原性组合物感染禽类个体，所述组合物包括重组人腺病毒表达载体，该载体包括并表达腺病毒DNA序列，和与编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列可操纵地连接的启动子序列，其中一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原以足以在禽类个体中引起针对一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的免疫原性反应的水平被表达。
39.根据权利要求38的方法，其中所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞过多症病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾坏死病毒。
40.根据权利要求39的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列来源于禽流感。
41.根据权利要求40的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
42.根据权利要求41的方法，其中所述编码一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的外源序列选自血凝素亚型3、5、7或9。
43.根据权利要求38的方法，其还包括另外的疫苗。
44.根据权利要求38的方法，其中禽个体通过肌肉注射翅-蹼、翅尖、胸肌或大腿肌肉组织被感染。
45.根据权利要求38的方法，其中禽个体在卵内被感染。
46.一种对禽类个体接种的方法，所述方法包括在卵内给予含有并表达编码禽类个体病原体的抗原的异源核酸分子的重组人腺病毒。
47.根据权利要求46的方法，其中所述人腺病毒含有源于腺病毒血清型5的序列。
48.根据权利要求46的方法，其中所述人腺病毒含有源于复制缺陷型腺病毒、非复制型腺病毒、可复制型腺病毒或野生型腺病毒的序列。
49.根据权利要求46的方法，其中所述禽类病原体的抗原来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞过多症病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾坏死病毒。
50.根据权利要求49的方法，其中所述禽类病原体的抗原来源于禽流感。
51.根据权利要求50的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
52.根据权利要求50的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素亚型3、5、7或9。
53.根据权利要求46的方法，其还包括给予另外的疫苗。
54.一种用于将免疫原性组合物递送到禽类胚胎的卵内给药的装置，其中所述装置含有表达一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原的重组人腺病毒表达载体，该装置将这种重组人腺病毒递送到禽胚胎。
55.根据权利要求54的装置，其中所述人腺病毒表达载体含有源于腺病毒血清型5的序列。
56.根据权利要求54的装置，其中所述人腺病毒表达载体含有源于复制缺陷型腺病毒、非复制型人腺病毒、可复制型腺病毒或野生型腺病毒的序列。
57.根据权利要求54的装置，其中所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感病毒、传染性囊病病毒、马雷克病病毒、禽疱疹病毒、传染性喉气管炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘、鸟痘、金丝雀痘、鸽痘、鹌鹑痘和dovepox、禽多瘤病毒、新城病病毒、禽肺病毒、禽鼻气管炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽逆转录病毒、禽内源性病毒、禽成红血细胞增多症病毒、禽肝炎病毒、禽贫血症病毒、禽肠炎病毒、帕切科病病毒、禽白血病病毒、禽细小病毒、禽轮状病毒、禽造血细胞组织增生病毒、禽肌腱膜纤维肉瘤病毒、禽成髓细胞过多症病毒、禽成髓细胞过多症相关病毒、禽髓细胞瘤病病毒、禽肉瘤病毒或禽脾坏死病毒。
58.根据权利要求57的方法，其中所述一种或多种所关注的禽类抗原或免疫原来源于禽流感。
59.根据权利要求58的方法，其中所述禽流感抗原或免疫原选自血凝素、核蛋白质、基质或神经氨酸酶。
60.根据权利要求58的方法，其中所述关注的禽流感抗原或免疫原选自血凝素亚型3、5、7或9。
61.根据权利要求58的方法，其还包括施加另外的疫苗。
62.一种免疫禽宿主的方法，所述方法包括接种编码一种或多种病原体来源的抗原的非复制型表达载体。
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