CN113897389A - 一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113897389A
CN113897389A CN202110760575.3A CN202110760575A CN113897389A CN 113897389 A CN113897389 A CN 113897389A CN 202110760575 A CN202110760575 A CN 202110760575A CN 113897389 A CN113897389 A CN 113897389A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adenovirus
gene
grna
pad29
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110760575.3A
Other languages
English (en)
Inventor
陈平
张婷婷
李娜
钟鑫涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd filed Critical Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Publication of CN113897389A publication Critical patent/CN113897389A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用，通过构建包含复制子、抗性基因的穿梭质粒，制备Ad29腺病毒环化质粒，并通过CRISPR/Cas9技术，找到最合适的敲除位点，设计最佳的特异性靶向gRNA，特异性敲除Ad29腺病毒E1、E3基因，更高效、便利地制得复制缺陷型Ad29腺病毒载体。该腺病毒在人群中流行度小，平均中和滴度低，可用于制备新冠疫苗，稳定性强，并能诱导很强的体液免疫以及细胞免疫。

Description

一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用
本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；主张中国在先申请,申请号:202010945735.7，申请日2020年9月10日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学领域，具体而言，涉及一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
腺病毒是双链DNA病毒，呈无囊膜的球形结构，其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列，每个病毒颗粒包含一个36kb的线性双链DNA，两端各有一个100～600bp的反向末端重复序列(inverted terminal re-peat，ITR)。腺病毒基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1～E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1～L5基因。腺病毒的E1基因是复制增殖的必需基因，E3基因可以对抗宿主的免疫系统，敲除腺病毒的E1、E3后，腺病毒无法在正常细胞中进行增殖，丧失复制能力，敲除而其主要的表位抗原Hexon、Fiber等不受影响，因此采用复制缺陷的腺病毒作为载体，具有较高的安全性。同时，复制缺陷型的腺病毒载体可以在互补的细胞株中进行增殖，常见的互补细胞株例如表达Ad5E1基因的293细胞。在已经敲除E1、E3的基础上，进一步敲除E4，可以进一步提高腺病毒载体的容量，降低免疫原性。
腺病毒作为载体，其具有高安全性、有效的基因转导性和大规模生产的高效性等优点，在疫苗制备、基因治疗等领域具有十分广泛的应用。在全球范围内已有数百项临床试验采用腺病毒作为载体，占各类载体总和的24.8％，应用量居于首位。腺病毒5型(Ad5)、2型(Ad2)是当前被研究最多的两个腺病毒载体，但是普通人群往往会因为既往的腺病毒感染而产生腺病毒的中和抗体，这些中和抗体会限制腺病毒载体进入人机体细胞，使其无法行使免疫或者治疗功能，从而限制了传统的Ad5和Ad2腺病毒载体的应用水平。研究发现，非洲、南美以及我国等发展中国家的人群中Ad5、Ad2的中和抗体阳性率很高，甚至超过90％，这导致了Ad5和Ad2腺病毒载体的应用局限性。研究发现，来自于腺病毒D亚群的Ad29腺病毒，其能够避免Ad5预存的免疫性，又能在Ad5E1互补的细胞系中生长至高效价，并能够在初免—加强疫苗策略中诱导体液和细胞介导的免疫应答，因此，敲除腺病毒复制相关基因后的复制缺陷型Ad29腺病毒载体不仅可以用于研发，还可以用于大规模生产，是Ad2和Ad5腺病毒载体的良好替代品。
当前，复制缺陷型腺病毒载体的构建通常采用传统的分子操作方法，包括如下步骤：(i)应用cosmid将野生型腺病毒基因组(～35kb)组装到质粒载体上(～3kb)得到腺病毒载体；(ii)使用不同的专用穿梭质粒，通过多步骤同源重组敲除不同部位的目的基因组片段而得到复制缺陷型腺病毒载体，该方法操作复杂繁琐，需要设计多个穿梭质粒，耗时很长。当前亟待构建一种复制缺陷型Ad腺病毒载体以提高腺病毒载体在制备用于免疫和基因治疗的药物中的应用，同时亟待开发一种能够高效、方便地构建复制缺陷型腺病毒载体的方法。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体，通过构建包含复制子、抗性基因的穿梭质粒，制备Ad29腺病毒环化质粒，并通过CRISPR/Cas9技术，找到最合适的敲除位点，设计最佳的特异性靶向敲除Ad29腺病毒E1、E3基因的gRNA，特异性敲除Ad29腺病毒E1、E3基因，更高效、便利地制得复制缺陷型Ad29腺病毒载体。该载体在人群中没有预存抗体存在，可用于制备新冠疫苗，稳定性强，并能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
本发明所述的Ad29腺病毒是指人类腺病毒29型，其序列如Seq ID NO.15所示。
一方面，本发明提供了一种基于Ad29腺病毒构建的环状载体，为环状质粒，包含复制子、抗性基因，所述复制子、抗性基因的序列分别如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2所示。
人类腺病毒29型基因组是长约35,000bp的线性DNA，难以对其进行有效地分子操作，因此需要构建Ad29腺病毒环状质粒，才能让其在细菌中有效复制。
现有的方法构建环状质粒是通常采用cosmid(噬菌体)的方法，应用cosmid将野生型腺病毒基因组(～35kb)组装到质粒载体上(～3kb)得到腺病毒载体，因此需要购买相应的试剂盒，噬菌体还可能对实验室产生污染。
穿梭质粒通常用于表达载体，用于运载需要表达的基因至目的质粒中。
本发明创造性地采用穿梭质粒来构建Ad29腺病毒环状质粒，从而提供了一种更加便利的制备Ad29腺病毒环状质粒的方法。
由于Ad29腺病毒基因组的首尾存在ITR末端重复序列，大约为140bp，因此构建环状质粒的过程更加复杂，因重复片段容易缺失，通常会导致制备的Ad29腺病毒环状载体出现基因的缺失，导致腺病毒基因组不完整而不能在真核系统中复制。
本发明通过将细菌中复制相关的元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)，连接Ad29基因组的左臂～1400bp片段，与右臂～1400bp的片段，并在BJ5183感受态进行同源重组，通过大量筛选，成功获得具备完整基因组的Ad29腺病毒环状质粒，能让其在细菌中有效复制。
本发明构建环状质粒的方法优点在于：1、不需要购买试剂盒，也避免使用噬菌体可能对实验室的污染；2、增加了EGFP荧光序列，可以检验TP0的转染效率；3、更加灵活，可以根据自己的需要构建自己所需要的元件。
进一步地，所述环状质粒还包括荧光表达框，所述荧光表达框为RSV promoter、EGFP、BGHpolyA中的任意一种。
为了监测质粒在细胞中的转染效率，增加了绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，在转染到细胞后的TP0代通过荧光量的多少即可判断载体的转染效率。可以理解，这些并不是穿梭质粒所必须的，例如抗性基因(kanamycin)、绿色荧光表达框(RSVpromoter、EGFP、BGHpolyA)，当然，最为不必须的是绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)。
另一方面，本发明提供了一种Ad29腺病毒载体环状质粒的构建方法，主要通过构建穿梭质粒pAd29-shuttle，线性化后与Ad29腺病毒基因进行同源重组，制备Ad29腺病毒环状质粒，所述穿梭质粒pAd29-shuttle包含复制子、抗性基因和荧光表达框，所述穿梭质粒pAd29-shuttle的序列如Seq ID NO.3所示。
本发明通过构建穿梭质粒pAd29-shuttle，经过大量筛选，成功获得具备完整基因组的Ad29腺病毒环状质粒。
再一方面，本发明提供了一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体，所述载体缺失E1和E3基因，或缺失E1、E3、E4基因。
进一步地，所述复制缺陷型Ad29腺病毒载体的序列如Seq ID NO.10所示。
再一方面，本发明提供了一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体的构建方法，包含以下步骤：
1)制备Ad29腺病毒载体环状质粒；
2)利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体的E1基因，获得了E1基因缺失的Ad29腺病毒载体pAd29△E1；
3)再利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体pAd29△E1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的Ad29腺病毒载体pAd29△E1△E3。
进一步地，步骤2)所述CRISPR/cas9敲除E1基因的上游靶向序列(Seq ID NO.4)和下游靶向序列(Seq ID NO.19)，设计E1A-gRNA和E1B-gRNA，所述E1A-gRNA和E1B-gRNA的序列分别如Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示。
进一步地，步骤3)所述CRISPR/cas9敲除E3基因的上游靶向序列(Seq ID NO.7)和下游靶向序列(Seq ID NO.20)，设计E3A-gRNA和E3B-gRNA，所述E3A-gRNA和E3B-gRNA的序列分别如Seq ID NO.8、Seq ID NO.9所示。
现有的腺病毒载体构建普遍采用穿梭质粒，需要寻找单一的酶切位点。本发明创造性地采用CRISPR/cas9来构建重组腺病毒载体，通过比对，选择合适的E1、E3敲除位点，根据E1、E3序列的位置，敲除的基因碱基的数量，选择CRISPR位点，并设计了最佳的gRNA，从而完成重组腺病毒载体的构建。
Ad29复制相关的基因为E1、E3、E4基因，E1基因与PIX相邻，E1基因由E1A、E1B以及其相关启动子基因组成，其上游为非结构蛋白区域，下游位置为PIX基因，PIX下游为非开放性阅读框，不编码蛋白质。使用特异性的gRNA与Cas9蛋白，裂解E1基因的双链DNA以及PIX基因下游非开放性阅读框的双链DNA，通过双酶切，即实现对E1基因的敲除，同时使用人类HPRT intron基因作为无意义序列(stuffer序列)对切开的序列进行连接，获得了E1基因缺失的Ad29质粒，命名为pAd29△E1。HPRT intron基因序列是人类基因组的内含子，其不编码氨基酸，不表达任何基因，从而不会影响腺病毒的包装以及不会对外源基因的表达产生影响。
pAd29△E1质粒为E1基因敲除后的质粒，本实施例采用实施例3获得的pAd29△E1基础上对复制相关的E3基因进行敲除。E3基因的上游为腺病毒29型的pVIII蛋白序列，E3下游为Fiber蛋白序列，pVIII蛋白与Fiber蛋白均是29型腺病毒的结构蛋白，任何一个蛋白的破坏均导致腺病毒无法包装。
为了保证E3基因能够被完全敲除，选择切割位点分别位于E3基因的上游和下游，即被切除的片段大于E3基因片段，使得被切除的片段包括全部的E3基因，从而保证全部的E3基因被敲除。具体地，首先使用特异性的gRNA与Cas9蛋白分别在位于E3基因上游的pVIII蛋白序列与位于E3基因下游的Fiber蛋白序列处进行切割，从而获得缺失了全部E3基因以及缺失部分pVIII序列与Fiber序列的载体片段，然后将被切除的部分pVIII序列与Fiber序列进行融合(命名为pVIII-fiber片段)，将融合的pVIII-fiber片段连接至切除了E3基因的载体片段上，即获得完全敲除E3基因的腺病毒29型质粒，命名为pAd29△E1△E3，此时，由于被切除的pVIII序列与Fiber序列被补入，不会对腺病毒的包装产生影响。
再一方面，本发明提供了一种Ad29腺病毒疫苗，所述疫苗在如上所述的复制缺陷型Ad29腺病毒载体的基因缺失区，包含目的基因。
进一步地，所述基因缺失区为E1。
进一步地，所述目的基因为病毒、细菌、肿瘤的基因或基因片段。
进一步地，所述目的基因为新型冠状病毒S基因。
进一步地，所述的复制缺陷型Ad29腺病毒载体具有如序列表Seq ID NO.10所示的核苷酸序列。
进一步地，构建得到的重组腺病毒疫苗pAd29-S具有如序列Seq ID NO.18所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明提供了一种表达新型冠状病毒S基因的重组Ad29腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(a)构建如在前述所述的复制缺陷型Ad29腺病毒载体的E1区域穿梭质粒pS29E1(Seq ID NO.16)；(c)构建表达新冠病毒COVID-19完整S蛋白的穿梭质粒pS29E1-nCOV-S；
(c)穿梭质粒pS29E1-nCOV-S与腺病毒载体质粒pAd29△E1△E3同源重组，构成重组腺病毒载体pAd29-S(Seq ID NO.18)。
再一方面，本发明提供了一种重组Ad29腺病毒载体的穿梭质粒pS29E1，所述pS29E1具有如序列Seq ID NO.16所示的核苷酸序列。
为了获得更好的同源重组效果，本发明通过大量实验选择最佳的左臂右臂序列，并选择了启动子，同时采用4个片段的无缝克隆的方法获得一个整体穿梭质粒，可以更好地表达外源基因，并能更好地完成同源重组，从而制备重组Ad29腺病毒疫苗。
再一方面，本发明提供了一种重组Ad29腺病毒载体的包装方法，将pAd29-S用I-sceI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293细胞，收集细胞悬液。
本发明的有益效果主要体现在：
1)提供了一种全新的复制缺陷型Ad29腺病毒载体，该腺病毒在人群中流行度低，在10％左右；E1、E3的敲除具有安全性，同时与293细胞中人类腺病毒5型E1有十分高的差异性，可以极大地避免恢复突变(RCA)，更具有安全性。
2)创造性地通过穿梭质粒构建了Ad29腺病毒环状载体。
3)提供了全新的Ad29腺病毒载体的CRISPR/cas9的构建方法，自主设计最佳敲除位点和gRNA，避免了过去载体构建用穿梭质粒敲除，需要找单一的酶切位点的困扰，构建方法简便高效，周期短。
4)构建的新型冠状病毒疫苗，经过几十代的传代，疫苗的稳定性很强，没有观察到突变；
5)构建的新型冠状病毒疫苗在小鼠模型中能诱导很强的体液免疫以及细胞反应。
附图说明
图1为实施例1中Ad29腺病毒DNA的琼脂糖凝胶验证结果图。
图2为实施例2中pACYC-kan(2058bp)、RSV(351bp)、EGFP-BGHpolyA(1127bp)、Leftarm(1409bp)、Right arm(1361bp)扩增产物琼脂糖验证结果图，其中M为2000bp Marker；1为片段Left arm；2为片段pACYC-kan；3为片段RSV；4为片段EGFP-BGHpolyA；5为片段Rightarm。
图3为实施例2中穿梭质粒pAd29-shuttle抗性筛选菌落XhoI、PacI酶切鉴定结果图，其中M1：15000bp Marker；lane1-lane4为1-4号质粒XhoI酶切鉴定；lane5-lane8为1-4号质粒PacI酶切鉴定；M2：2000bp Marker。
图4为实施例2中环状质粒pAd29经XhoI酶切验证结果图。
图5为实施例2中环状质粒pAd29经BamHI酶切验证结果图。
图6为实施例3中E1A-gRNA、E1B-gRNA以及cas9“双酶切”pAd29载体质粒结果图，其中泳道1为E1A-gRNA、E1B-gRNA以及cas9“双酶切”pAd29载体质粒结果，出现了目的大小在2500bp-5000bp的被“双酶切”切开的E1片段。
图7为实施例3中HPRT片段的扩增结果图。
图8为实施例3中pAd29△E1转化子菌落PCR验证结果图8，其中M：Marker，1-8：菌落。
图9为实施例3中挑选阳性菌落，提取质粒酶切验证结果图，其中M：Marker，1-7：菌落。
图10为实施例4中由29-pVIII-gRNA、29-fiber-gRNA和cas9蛋白“双酶切”切开的pAd29△E1质粒的琼脂糖验证结果图，其中M为Marker，泳道1为切开的pAd29△E1质粒。
图11为实施例4中pVIII-fiber片段琼脂糖凝胶电泳验证结果图，其中M为Marker，1为pVIII-fiber片段。
图12为实施例4中PCR扩增方式对pAd29△E1△E3转化子进行菌落PCR验证结果图，其中M为Marker，泳道1-8、9-24为菌落。
图13为实施例4中挑取阳性克隆菌落，提取质粒进行XhoI酶切验证结果图，其中M为Marker，泳道1-2为Ad29△E1△E3质粒。
图14为实施例5中CMV-MCS-SV40(Seq ID NO.13)外源基因表达序列元件、穿梭质粒左臂、puc origin(Seq ID NO.14)元件、穿梭质粒右臂片段琼脂糖验证结果图，其中M：2000bp ladder；泳道1：CMV-MCS-SV40(Seq ID NO.13)外源基因表达序列元件；泳道2：穿梭质粒左臂；泳道3：puc origin(Seq ID NO.14)元件；泳道4：穿梭质粒右臂。
图15为实施例5中穿梭质粒pS29E1 XhoI酶切验证结果图，其中M：15000bpladder；泳道1：pS29E1质粒XhoI酶切结果。
图16为实施例5中酶切载体pS29E1 BamHI、HindIII酶切验证结果图，其中M：15000ladder；泳道1：pS29E1 BamHI、HindIII酶切后；泳道1：spike序列PCR扩增后结果
图17为实施例5中穿梭质粒pS29E1-nCOV-S BamHI、HindIII酶切验证结果图，其中M：15000bp ladder；泳道1-5：pS29E1-nCOV-S质粒BamHI、HindIII酶切结果
图18为实施例6中pAd29-nCOV-S质粒XhoI、PacI酶切验证结果图，其中M：15000bpladder；泳道1：pAd29-nCOV-S PacI酶切；泳道2：pAd29-nCOV-S XhoI酶切。
图19为实施例7中pAd29-nCOV-S转染293细胞后的TP0至TP4的细胞照片。
图20为实施例11中pAd29-nCOV-S病毒感染293细胞表达新冠spike蛋白琼脂糖凝胶电泳验证结果图，其中M，预染Maker；泳道1，293细胞空白对照；泳道2，pAd29-nCOV-S病毒感染293细胞。
图21为实施例13中用间接ELISA法检测小鼠血清中针对pAd29-nCOV-S的目的蛋白spike蛋白的IgG抗体滴度结果示意图。
图22为实施例13中pAd29-nCOV-S疫苗诱导的CD8+T细胞反应示意图。
图23为实施例13中pAd29-nCOV-S疫苗诱导的CD4+T细胞反应示意图。
图24为实施例13中pAd29-nCOV-S疫苗诱导的细胞免疫反应代表图。
图25为实施例13中空白对照免疫反应代表图。
图26为实施例4构建的pAd29△E1△E3质粒图谱。
图27为实施例5构建的pS29E1质粒图谱。
图28为实施例5构建的pS29E1-nCOV-S质粒图谱。
术语解释
1、Ad29腺病毒，又称“人29型腺病毒”。
2、复制缺陷型Ad29腺病毒，又称“复制缺陷型人29型腺病毒”，是指缺失腺病毒复制增殖的必需基因的腺病毒，该腺病毒无法在正常细胞中进行增殖，丧失复制能力，但可以在包装细胞中被拯救，在本发明中具体是指缺失E1基因、E3基因，或是缺失E1基因、E3基因和E4基因的腺病毒。
3、外源基因，是指非29型腺病毒来源的任何基因，外源基因可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。外源基因表达框可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子，所述外源基因的编码序列可以是但不限于红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、病毒抗原、shRNA等的编码序列。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，腺病毒29型的基因序列来自NCBI，序列号为JN226754，总DNA长度为35214bp，购自ATCC。在本发明中所使用的试剂盒为赛默飞GeneArtTM Precision gRNASynthesis Kit，InvitrogenTM TrueCutTM Cas9 Protein v2，TranscriptAidTM Enzyme Mix等，购买自赛默飞公司。在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
实施例1人类腺病毒29型基因组的获得
1、人类腺病毒29型腺病毒的选择
人类腺病毒5型E1缺失载体的反式补体细胞系是HEK293，HEK293细胞来源于人胚肾细胞，该细胞中插入了人类腺病毒5型的E1A和E1B基因，核苷酸序列为1到4344bp，插入位点为19号染色体q13.2区域。
HEK293细胞系的缺点是在病毒制剂中可能产生恢复突变(RCA)的污染。这是因为第一代Ad5载体的第400到3500个碱基被敲除，但仍然与细胞DNA保持显著的同源性，会发生双交叉重组事件，产生野生的腺病毒。
为了防止RCA的产生，有2种方式，一是构建只含有人类腺病毒5型505-4034碱基的细胞系取代293细胞，从而与敲除第400到3500个碱基的第一代Ad5载体没有同源部分而不会产生双交叉重组；二是构建与293细胞系中的人类腺病毒5型的1到4344碱基同源性小差异性大的腺病毒载体，由于其碱基的差异性而不会产生恢复突变。
因此，本发明选择了人类腺病毒29型腺病毒作为疫苗的载体。经过同源性比对，人类29型腺病毒E1区域与HEK293细胞系中的人类5型腺病毒第1到4344个碱基的同源性为58.7％，差异明显，不会产生恢复突变。
2、野生型Ad29病毒液的制备
Ad29病毒、A549细胞购自ATCC，A549细胞属于贴壁培养的方式，培养于F-12K完全培养基，T-175cm2细胞培养瓶，37℃，5％CO2培养箱；将购买的病毒液做100倍稀释，将T-175cm2细胞培养瓶中的培养液倒掉，利用8mL 1×PBS冲洗两次细胞培养瓶，将残留在细胞瓶中的血清洗掉。最后将100倍稀释的病毒液加入细胞培养瓶中，接种完成后放入37℃培养箱中吸附1小时。吸附完毕后每瓶细胞中加入32mL F-12K完全培养基(F-12K+4％FBS+1％Gln)，置37℃培养箱中培养，72小时后回收细胞。将回收的细胞悬液反复冻融3次，经2000g/min低速离心30min，收集上清，即为收获的野生型Ad29病毒液。
3、病毒液的浓缩
使用20mL病毒液，利用300MWCO的Vivaspin 20将上清浓缩至3.5mL，加入7.5U/mLBenzonase，37℃水浴反应30min；将浓缩后的3.5mL病毒液纯化，仍然在Vivaspin 20中加入10mL FFB缓冲液(缓冲液组成为：10mM Tris pH 7.8，75mM NaCl，5％蔗糖)，1200g/min离心30min，弃去下层柱管中的液体，继续加入10mL FFB缓冲液，离心，重复3-5次，收获病毒液。
3、腺病毒基因组提取与检测
采用Hirt Virual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，向纯化后的3.5mL病毒浓缩液中加入87.5μL的20％的SDS，吹打混匀。再在混合液中加入87.5μL的20mg/mL的蛋白酶K。置于55℃水浴中孵育4小时。4小时后，加入1mL的5M NaCl，55℃水浴孵育2小时。混合液中加入4mL酚氯仿异戊醇，翻转混匀，经3200g/min在4℃离心10min。吸取上清至新的15mL离心管中。加入0.8倍体积的异丙醇，吹打混匀。然后，将混合液于4℃下12000g/min离心10min。缓慢弃掉上清，然后加入1mL 70％的乙醇，混匀，在4℃下12000g/min离心10min。缓慢弃掉上清，自然风干残留的酒精，然后加入50μL的Elution Buffer溶解DNA。琼脂糖凝胶验证DNA质量，结果如图1所示，证明获得高质量的Ad29腺病毒基因组。
实施例2含有荧光标记的腺病毒穿梭质粒构建
人类腺病毒29型基因组是长约35,000bp的线性DNA，难以对其进行有效地分子操作。因此，需要将在细菌中复制相关的元件，复制子(pACYC)、抗性基因(kanamycin)，连接Ad29基因组的左边～1400bp片段，与右边～1400bp的片段，通过在BJ5183感受态进行同源重组，构成环状质粒，能让其在细菌中有效复制；同时为了监测质粒在细胞中的转染效率，增加了绿色荧光表达框(RSV promoter、EGFP、BGHpolyA)，在转染到细胞后的TP0代通过荧光量的多少判断大载体的转染效率。
1、构建腺病毒基因组DNA环状化的穿梭质粒pAd29-shuttle
①对Ad29的shuttle进行构建，为了确保保留更多的单一的酶切位点，排除干扰，同时构建左右臂，并且对进行大肠杆菌复制元件基因和Ad30左臂、右臂基因的获得：pACYC-kan、RSV、EGFP-BGHpolyA、Left arm、Right arm；引物设计如下所示：
Left Arm-F：gtttcaagctcaggtccaaag
Left Arm-pACYC-R：GTCTGACGCTCAGTGGAACCAAttaattaacatcatcaataatataccccac
pACYC-F：TTGGTTCCACTGAGCGTCAG
Kan-R：GCCGTCCCGTCAAGTCAGC
RSV-F：TTACGCTGACTTGACGGGACGGCttagggttaggcgttttgcg
RSV-EGFP-R：tcgcccttgctcaccatggtggctgggtctccctatagtgagt
EGFP-F：gccaccatggtgagcaagg
EGFP-R：AGACGAAAGGGCCTCGTGAT
EGFP-right arm-F：CGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTttaattaacatcatcaataatataccccaca
Right arm-R：acctttggacctgagcttgaaacatttaaataaattgttggtgtaagtccactc
②将pACYC-kan(2000bp)、RSV(400bp)、EGFP-BGHpolyA(1100bp)、Left arm(1400bp)、Right arm(1400bp)分别PCR，进行胶回收，扩增产物琼脂糖验证如图2所示，其中M为2000bp Marker；1为片段Left arm；2为片段pACYC-kan；3为片段RSV；4为片段EGFP-BGHpolyA；5为片段Right arm。
③使用博迈德BM smealess cloning kit将其进行无缝克隆。
④卡那霉素抗性进行筛选，选择菌落进行XhoI、PacI酶切鉴定；酶切结果如图3所示，其中，M1：15000bp Marker；lane1-lane4为1-4号质粒XhoI酶切鉴定；lane5-lane8为1-4号质粒PacI酶切鉴定M2：2000bp Marker。2号质粒正确，成功构建穿梭质粒pAd29-shuttle。
2、穿梭质粒pAd29-shuttle与提取的人类腺病毒29型基因组进行同源重组获得最终的环状质粒pAd29
1)SwaI线性化穿梭质粒Ad29-shuttle，酶切体系：穿梭质粒pAd29-shuttle 3μg；NdeI 2μL；buffer cutsmart 4μL；补水至40μL。反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液40μL；去磷酸化酶1μL；去磷酸化buffer 5μL；补水至50μL。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng提取的腺病毒基因组DNA共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证，结果如图4所示，6、7、30号质粒正确。
6)再进行BamHI酶切鉴定；结果如图5所示，6、7、30正确，成功构建环状质粒pAd29。
实施例3 CRISPR/cas9对Ad29腺病毒E1区域的切除
Ad29复制相关的基因为E1、E3、E4基因，E1基因与PIX相邻，E1基因由E1A、E1B以及其相关启动子基因组成，其上游为非结构蛋白区域，下游位置为PIX基因，PIX下游为非开放性阅读框，不编码蛋白质。使用特异性的gRNA与Cas9蛋白，裂解E1基因的双链DNA以及PIX基因下游非开放性阅读框的双链DNA，通过双酶切，即实现对E1基因的敲除，同时使用人类HPRT intron基因作为无意义序列(stuff序列)对切开的序列进行连接，获得了E1基因缺失的Ad29质粒，命名为pAd29△E1。HPRT intron基因序列是人类基因组的内含子，其不编码氨基酸，不表达任何基因，从而不会影响腺病毒的包装以及不会对外源基因的表达产生影响。
(一)目的基因E1以及gRNA设计、CRISPR靶序列的选择
1、E1基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E1基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E1基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择CCTCGTTAGGGTCGTCATCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为E1A-gRNA。
2、E1B下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E1B下游非编码序列的约300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择TTATTTGACAACCCGCCTGC作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为E1B-gRNA。
(二)E1A-gRNA和E1B-gRNA的DNA扩增
1、E1A-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGTCGTTAGGGTCGTCATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2、E1B-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGTCGTTAGGGTCGTCATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增E1A-gRNA和E1B-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增E1A-gRNA的DNA模板和PIX-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增，试剂盒中含有TracrFragment+T7 Primer Mix，以及80nt的恒定的crRNA/tracrRNA序列。
(1)引物设计
29-E1A-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGTCGTTAGGGTCGTCA
29-E1A-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACTGATGACGACCCTAACGA
29-PIX-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGATTTGACAACCCGCC
29-PIX-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACGCAGGCGGGTTGTCAAAT
(2)扩增E1A-gRNA和E1B-gRNA的DNA模板
①准备0.3μM的E1A-gRNA-F/R引物混合工作液
10μM的29-E1A-gRNA-F引物3μL，10μM的29-E1A-gRNA-R引物3μL，补充水至100μL。
②准备0.3μM的29-PIX-gRNA-F/R引物混合工作液
10μM的29-PIX-gRNA-F引物3μL，10μM的29-PIX-gRNA-R引物3μL，补充水至100μL。
③PCR反应体系
E1A-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μL，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μL，0.3μM29-E1A-gRNA-F/R引物混合工作液1μL，补水至25μL。
29-PIX-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μL，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μL，0.3μM29-PIX-gRNA-F/R引物混合工作液1μL，补水至25μL。
④PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
(三)体外转录获得E1A-gRNA和E1B-gRNA
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得E1A-gRNA和E1B-gRNA。
1、体外转录获得E1A-gRNA、E1B-gRNA
体外转录获得E1A-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μL，E1A-gRNA DNA模板6μL，5XTranscriptAidTM Reaction Buffer 4μL，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μL。于37℃孵育4小时后加入1μL的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得PIX-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μL，PIX-gRNA DNA模板6μL，5XTranscriptAidTM Reaction Buffer 4μL，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μL。于37℃孵育4小时后加入1μL的DNase I，于37℃孵育15分钟。
2、体外转录产物的纯化
(1)将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μL；
(2)加入100μL的Binding buffer，充分混匀；
(3)加入300μL的乙醇(>96％)，充分混匀；
(4)将混合液转移到the Gene JETTM RNA Purification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；
(5)加入700μL的Wash Buffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；
(6)加入700μL的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次；
(7)14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中；
(8)在柱子中心加入10μL的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTM Enzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的E1A-gRNA和E1B-gRNA的RNA序列如下所示：
E1A-gRNA:GUCGUUAGGGUCGUCAUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
E1B-gRNA:GUCGUUAGGGUCGUCAUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
(四)酶切pAd29载体
1、使用E1A-gRNA、E1B-gRNA和cas9双酶切pAd29载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg；E1A-gRNA 6μg；PIX-gRNA 6μg；pAd29载体质粒3μg；NEB buffer 3.1 5μL；补充水至50μL。
上述酶切反应分别于37℃孵育过夜。取5μL样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果如图6所示：泳道1为E1A-gRNA、E1B-gRNA以及cas9“双酶切”pAd29载体质粒结果，出现了目的大小在2500bp-5000bp的被“双酶切”切开的E1片段。
(五)使用含有Ad29 overlap的引物扩增HPRT片段并引入SWaI酶切位点
HPRT片段序列来自NCBI，序列号为AH007435.2，基因序列如SEQ ID No.11所示。
含有Ad29 overlap的引物序列如下所示：
29-pIX-HRPT-F：atcccggcaggcgggttgtcaaacacttttgcatatagtatacatg
29-E1A-HRPT-SwaI-R：gatctggaggtagatgcccatgaATTTAAATcttgcatttctcagtc
扩增体系为：10μM 29-pIX-HRPT-F引物1μL；10μM 29-E1A-HRPT-SwaI-R引物1μL；模板HPRT(100ng/μL)0.5μL；Q5高保真酶25μL；补水至50μL。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，30sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。HPRT片段的扩增结果如图7所示，完成扩增。
(六)胶回收切除E1片段的pAd29载体质粒和HPRT片段
(七)载体连接
使用NEB的Gibson使HRPT片段与敲除E1后的pAd29载体质粒片段连接，连接体系如下所示：胶回收产物pAd29载体质粒片段200ng，胶回收产物HPRT片段50ng，Gibson预混液10μL，补水至20μL。于50℃，孵育40分钟。
(八)转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μL连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
(九)菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对pAd29△E1转化子进行菌落PCR验证，结果如图8所示，其中M：Marker，1-8：菌落，由图8可见，2、3、4、5、7、8为阳性菌落。
(十)质粒酶切验证
挑取7个阳性克隆菌落，提取质粒，进行酶切验证，酶切结果如图9所示，其中M：Marker，1-7：菌落。从图9可以看出，质粒XhoI酶切结果正确，同时测序结果正确，因此1、2、6号质粒是阳性质粒，即获得了pAd29△E1质粒。
实施例4 CRISPR/cas9对pAd29△E1质粒E3区域的切除
(一)选择CRISPR的目的序列
1、E3上游基因pVIII CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入pVIII基因的后400个碱基，软件自动分析序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E3基因序列的长度，选择CCGCCTGCTCCAACAATATC作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为29-pVIII-gRNA。
2、E3下游基因Fiber CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入Fiber序列碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择AACAAGCTAGCTATTCTAGT作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为E3-down-gRNA。
(二)29-pVIII-gRNA和E3-down-gRNA的DNA扩增
1、29-pVIII-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGGCCTGCTCCAACAATATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2、29-fiber-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGCAAGCTAGCTATTCTAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计上下游引物进行DNA模板扩增
(1)引物设计
29-pVIII-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGCCTGCTCCAACAAT
29-pVIII-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACGATATTGTTGGAGCAGGC
29-fiber-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGCAAGCTAGCTATTCT
29-fiber-gRNA-R：TTCTAGCTCTAAAACACTAGAATAGCTAGCTTG
(2)扩增29-pVIII-gRNA和29-fiber-gRNA的DNA模板
①准备0.3μM的29-pVIII-gRNA-F/R引物混合工作液
10μM的29-pVIII-gRNA Forward引物3μL；10μM的29-pVIII-gRNA Reverse引物3μL；补充水至100μL。
②准备0.3μM的29-fiber-gRNA-F/R引物混合工作液
10μM的29-fiber-gRNA Forward引物3μL；10μM的29-fiber-gRNA Reverse引物3μL；补充水至100μL。
③PCR反应体系
29-pVIII-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μL；Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μL；0.3μM29-pVIII-gRNA-F/R引物混合工作液1μL；补水至25μL。
29-fiber-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μL；Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μL；0.3μM 29-fiber-gRNA-F/R引物混合工作液1μL；补水至25μL。
④PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix进行转录。
1、体外转录29-pVIII-gRNA、29-fiber-gRNA
体外转录29-pVIII-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μL；29-pVIII-gRNA DNA模板6μL；5X TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μL；TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μL。于37℃孵育4小时后加入1μL的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录29-fiber-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μL；29-fiber-gRNADNA模板6μL；5X TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μL；TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μL。于37℃孵育4小时后加入1μL的DNase I，于37℃孵育15分钟。
2、体外转录产物的纯化
(1)将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μL；
(2)加入100μL的Binding buffer，充分混匀；
(3)加入300μL的乙醇(>96％)，充分混匀；
(4)将混合液转移到the Gene JETTM RNA Purification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；
(5)加入700μL的Wash Buffer1(加入13ml乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；
(6)加入700μL的Wash Buffer2(加入30ml乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次；
(7)14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5ml的收集管中；
(8)在柱子中心加入10μL的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
转录获得的29-pVIII-gRNA和29-fiber-gRNA的RNA序列如下所示：
29-pVIII-gRNA:GGCCUGCUCCAACAAUAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU
29-fiber-gRNA:GCAAGCUAGCUAUUCUAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
(四)使用29-pVIII-gRNA、29-fiber-gRNA和cas 9蛋白“双酶切”pAd29△E1质粒
50μL反应体系如下：Cas9蛋白3μg；29-pVIII-gRNA 6μg；29-fiber-gRNA6μg；pAd29△E1质粒3μg；NEB buffer 3.1 5μL；补充水至50μL。于37℃孵育过夜。
(五)回收cas9蛋白“双酶切”切开的pAd29△E1质粒
使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收由29-pVIII-gRNA、29-fiber-gRNA和cas9蛋白“双酶切”切开的pAd29△E1质粒，如图10所示，其中M为Marker，泳道1为切开的pAd29△E1质粒。从图10可以看出，pAd29△E1质粒已经被切开，大片段为需要被胶回收的目的片段，小片段为被敲除的包含E3基因的片段。
(六)设计引物，使用融合PCR扩增pVIII-fiber片段
29Fiber-F：tacctttaatccatctcctact
29Fiber-R：tgttgattaaaatcccagaaac
29fiber-pVIII-F：gtttctgggattttaatcaacatcagtcgtagccgtccacc
29pVIII-R：accagatattgttggagcagg
1、PCR扩增pVIII和fiber片段(两个片段有重叠的碱基)
pVIII片段的扩增体系为：10μM引物29fiber-pVIII-F 1μL，10μM引物29pVIII-R 1μL，模板pAd29载体质粒(100ng/μL)0.5μL，Q5高保真酶25μL，补水至50μL。
fiber片段的扩增体系为：10μM引物29Fiber-F 1μL，10μM 29Fiber-R引物1μL，模板pAd29载体质粒(100ng/μL)0.5μL，Q5高保真酶25μL，补水至50μL。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
使用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化扩增的pVIII和fiber片段。
2、使用PCR扩增融合序列获得融合pVIII-fiber片段
融合体系为：10μM引物29fiber-pVIII-F 1μL，10μM引物29pVIII-R 1μL，模板pVIII片段(100ng/ul)0.5μL，模板fiber片段(100ng/ul)0.5μL，Q5高保真酶25μL，补水至50μL。
PCR反应程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，30sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
3、使用Axygen AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化pVIII-fiber片段。
4、采用琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图11所示，其中M为Marker，1为pVIII-fiber片段，获得了特异性的pVIII-fiber片段，所述pVIII-fiber片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.12所示。
(七)载体连接
使用NEB的Gibson使pVIII-fiber片段与敲除了全部E3片段、部分pVIII片段和部分fiber片段后的载体连接，连接体系为：胶回收产物pAd29△E1载体片段200ng；PCR纯化产物pVIII-fiber片段150ng；2XGibson 10μL；补充水至20μL。50℃孵育40min。
(八)转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μL连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
(九)菌落PCR进行转化子筛选
采用PCR扩增方式对pAd29△E1△E3转化子进行菌落PCR验证。
反应体系为：10μM 29Fiber-F引物1μL，10μM 29pVIII-R引物1μL，Q5高保真酶10μL，补水至20μL，挑取单克隆菌落于反应体系中。
PCR反应程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，30sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
采用琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图12所示，其中M为Marker，泳道1-8、9-24为菌落，泳道8、24出现了阳性条带。
(十)质粒酶切验证
挑取上述2个阳性克隆菌落，提取质粒，进行XhoI酶切验证，验证结果如图13所示，可见酶切正确，测序结果也显示正确，即获得了pAd29△E1△E3质粒，其质粒图谱如图26所示。
实施例5构建E1区域表达新冠S蛋白的穿梭质粒pS29E1-nCOV-S
1、构建E1区域通用的穿梭质粒pS29E1
①PCR扩增E1区域的左臂、右臂、复制相关元件、抗性基因，引物设计如下：
PIX-CMV-F：cgcccactactcactcgacctaTTAATAGTAATCAATTACGGGGT
SV40-leftarm-R：tttcgattgcggtgtttttttcCGGGATCGGTGATCACCGAT
leftarm-F：gaaaaaaacaccgcaatcgaaac
leftarm-R：ttaattaaCATCATCAataatatac
leftarm-puc-F：tatattatTGATGATGttaattaaGGGTGCCTAATGAGTGAGCT
puc-right-arm-R：cgcaggcgggacagaggagggaGACGTCAGGTGGCACTTTTC
right-arm-F：tccctcctctgtcccgcct
right-arm-R：taggtcgagtgagtagtggg
②使用Axygen胶回收试剂盒将以上4个片段进行纯化；如图14所示：M：2000bpladder；泳道1：CMV-MCS-SV40(Seq ID NO.13)外源基因表达序列元件；泳道2：穿梭质粒左臂；泳道3：puc origin(Seq ID NO.14)元件；泳道4：穿梭质粒右臂。
③使用北京博迈德基因技术有限公司BM smealess cloning kit对4个片段进行连接；氨苄抗性筛选后，提取质粒，使用XhoI酶切，琼脂糖电泳鉴定，如图15所示，酶切结果正确；M：15000bp ladder；泳道1：pS29E1质粒XhoI酶切结果。成功构建穿梭质粒pS29E1，其载体质粒如图27所示。
4、表达新冠病毒COVID-19 Spike蛋白的穿梭质粒pS29E1-nCOV-S的构建
1)PCR扩增新冠病毒spike(Seq ID NO.17)基因，设计引物如下：
pS29E1-S-F：GTACCTAATACGACTCACTATACGGATCCgccaccATGTTCGTGTTTCTG
pS29E1-S-HindIII-R：CTCGAGAGCGGCCGCAATCGATaagcttTCAGGTGTAGTGCAGCTTCAC
PCR扩增体系：
Q5酶25ul，10uM引物pS29E1-S-F 1ul，10uM引物pS29E1-S-HandIII-R 1ul，模板pCDNA3.1-S 50ng，补水至50ul；
PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min10s，35个循环；72℃，5min。
使用胶回收纯化片段。
2)酶切载体pS29E1并进行胶回收
载体酶切反应体系：载体pS29E1 2ug，BamHI、HindIII各1ul；10×cutsmartbuffer 5ul；补水至50ul。
反应条件：37℃，1h；65℃，20min灭活。
使用胶回收纯化片段。
纯化产物凝胶电泳检测，如图16所示，M：15000ladder；泳道1：pS29E1BamHI、HindIII酶切后；泳道1：spike序列PCR扩增后；
3)使用北京博迈德基因技术有限公司BM smealess cloning kit对载体与片段进行连接；氨苄抗性筛选后，提取质粒，使用BamHI、HindIII酶切，琼脂糖电泳鉴定，如图17所示，酶切结果正确；M：15000bp ladder；泳道1-5：pS29E1-nCOV-S质粒BamHI、HindIII酶切结果；成功构建穿梭质粒pS29E1-nCOV-S，其载体质粒如图28所示。
实施例6同源重组获得人类腺病毒29型载体疫苗质粒pAd29-nCOV-S
1、穿梭质粒pS29E1-nCOV-S与腺病毒载体质粒pAd29△E1△E3的同源重组
1)PacI和SwaI对穿梭质粒pS29E1-nCOV-S和腺病毒载体质粒pAd29△E1△E3进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS29E1-nCOV-S 3μg；PacI 2μL；buffer cutsmart 4μL；补水至40μL。
B、腺病毒载体质粒pAd29△E1△E3 3ug；SwaI 2μL；Buffer 3.1 4μL；补水至40μL。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μL；去磷酸化酶1μL；去磷酸化buffer 5μL；补水至50μL。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证。
6)将阳性质粒转化至DH5a感受态，挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI、PacI酶切验证，如图18所示。M：15000bp ladder；泳道1：pAd29-nCOV-S PacI酶切；泳道2：pAd29-nCOV-S XhoI酶切。成功构建人类腺病毒29型载体疫苗质粒pAd29-nCOV-S(Seq ID NO.10)。
实施例7重组腺病毒pAd29-nCOV-S的包装
使用293细胞(购于ATCC，批号：70009859)包装pAd29-nCOV-S载体质粒，操作步骤如下所示：
准备293细胞：转染前一天准备细胞，将待转染的293细胞接种到6孔板中，0.5x106/孔，于37℃，5％CO2静置培养24小时，转染当天细胞有40-50％汇合率。
质粒pAd29-nCOV-S线性化：将待转染的质粒用I-sceI酶切，于37℃孵育40min后，65℃灭活20min。
转染：用100μL无血清培养基将线性化的2μg质粒和PEI分别稀释；向PEI稀释液中加入质粒稀释液，反复吸取5次或涡旋10秒钟混匀，室温下孵育10分钟后形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出细胞培养液，加入新鲜的生长培养基2mL，10分钟后将转染复合物加到换了新鲜培养基的细胞中。
细胞培养：将转染后的293细胞于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72-96小时；病毒质粒转染72-96小时后收集6孔板细胞悬液于15ml离心管中即TP0。
持续接毒：将收集的细胞悬液在-80℃反复冻融3次，4℃、2000g离心10分钟，取上清500μL感染293细胞(293细胞需要提前一天准备)，37℃、5％CO2孵育60分钟，补充2mL的FBS的培养基，37℃、5％CO2培养培养72小时，收集细胞悬液即TP1；重复之前的步骤，收集细胞悬液即TP2。持续接毒直至TP4。
细胞病变：当293细胞培养从TP0至TP4后，细胞逐渐病变，直至293细胞完全病变。TP0至TP4引起的细胞病变情况分别如图19所示，TP4已完全病变。
实施例8新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S滴度的检测
准备293细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.05％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，接种6孔板中(5×105/mL，每孔2ml)，于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24小时后，待细胞贴壁生长成单层细胞，弃去培养基，用无血清DMEM维持液对重组的腺病毒作10-3～10-6倍连续稀释，每个稀释度接种2孔，每孔250uL，感染1小时后，弃上清，补充完全培养基，然后于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24h后，弃上清，用PBS洗细胞，每孔1mL，弃PBS后，每孔加1mL冷甲醇固定，室温10min，弃甲醇，再用PBS冲洗细胞，每孔1mL，加腺病毒抗体-FITC，每孔1ml，室温1h后，再次用PBS冲洗细胞，每孔1mL，两遍后每孔加1mL PBS，荧光显微镜下计数(200倍,10个连续视野)。计算：病毒滴度(FFU/mL)＝平均数×1013×4×10(-n)。pAd29-nCOV-S病毒的FFU为5X107FFU/mL。
实施例9新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S稳定性的检测
准备293细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.05％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，将293细胞种入6孔板中(5×105cells/mL，2mL/孔)，室温孵育1小时使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。用pAd29-nCOV-S病毒颗粒进行感染，感染的滴度为1×108FFU/孔。293细胞48小时后发生病变后，收集细胞，反复冻融3次后2000g离心，收集上清，将收集的上清检测FFU，后重新感染新的293细胞，直至30代。将收集的第5、10、15、20、25、30代次的病毒液进行检测，发现病毒的基因组仍然完整，说明复制缺陷型pAd29-nCOV-S病毒能够在293细胞中稳定包装。
实施例10新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S恢复突变(RCA)的检测
pAd29-nCOV-S病毒RCA检测，检测方法如下：
1、准备pAd29-nCOV-S病毒液，并测其病毒滴度，测定病毒颗粒浓度，病毒液加1％benzonase(Benzonase7.5～15units/mL病毒液)消化宿主细胞的DNA，37℃水浴40min。用300Kd的超滤离心管，经1000g，30min离心，1×PBS洗脱收集病毒颗粒，测A260，颗粒浓度＝A260×1.1×1012VP/mL。
2、病毒感染，准备A549细胞的6孔板，每孔细胞为2.5×105/孔，弃培养基，PBS清洗一次，将腺病毒按照1×109vp/孔接种病毒，感染A549细胞，野生型腺病毒5型为对照，37℃，5％CO2，1h后，弃去病毒液，补足5％完全培养基，37℃，5％CO2培养48h。
3、免疫染色，弃细胞上清，PBS表面冲洗细胞，用冰甲醛固定，放置-20℃，20min，1×PBS清洗三遍，每遍5min，每孔加入2ml 1％BSA-PBS溶液，放置摇床，孵育1h。弃去上清，加入腺病毒5型荧光抗体(1:500稀释)，孵育1h，1×PBS清洗三遍，每遍5min。
用10倍荧光显微镜观察，使用公式计算RCA
RCA＝(average positive cell field)×(374field/well)×(dilutionfactor))/Total VPs in 0.5ml viral sample
判断标准为RCA的水平小于1RCA/3×1010vp。经过统计pAd29-nCOV-S的RCA的水平小于1RCA/3×1010vp，说明本发明所制备的复制缺陷型pAd29-nCOV-S病毒在293TD37细胞中能够稳定包装，不会转化为野生型或转化为野生型的几率较低。
实施例11新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S蛋白表达检测
提前一天准备293细胞，置于12孔细胞培养板中，使用新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S病毒感染293细胞，48小时后细胞发生病变，收集全部的1ml细胞，使用PBS洗涤，制样，用于Western Blot检测；Western Blot使用spike蛋白片段S1的抗体作为一抗用于检测目的蛋白，S1的抗体是采购自北京义翘神州科技股份有限公司。实验结果如图20所示，该疫苗可以清晰可见spike蛋白，如图20所示：M，预染Marker；泳道1，293细胞空白对照；泳道2，pAd29-nCOV-S病毒感染293细胞；由此可见新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S的目的蛋白spike蛋白能够在人类细胞中高效表达。
实施例12腺病毒Ad29预存免疫检测
人群中普遍存在针对AdHu5的中和抗体，约有三分之一的人群成年时已对其产生免疫性，而人群中却没有新型Ad29腺病毒的抗体，因此人体注射该新型Ad29腺病毒载体疫苗并不会被预存免疫中和，能产生足够的抗体。通过中和抗体实验，可以验证该结果。实验设计如表3所示，实验步骤如下：
(1)前一日铺96孔板，制备A549细胞悬液，使细胞浓度约为4.8×105个/mL(每个96孔板按照4.8×106个细胞准备)，用8道排枪加到96孔细胞培养板中，每孔100μl，置37℃，5％CO2培养箱中，静培；
(2)第二日，接种野生型病毒(Ad29，Ad5-Wild-F2),取1.5ml灭菌EP管，稀释按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8(900μl无血清培养基+100μl病毒液)，倍比稀释，注意每步稀释更换Tip，并在涡旋振荡器上混匀5s，备用；
(3)96孔板的细胞，用真空泵连接200μl tip弃上清，然后1×PBS洗细胞，再次弃上清；
(4)感作细胞，100μl/孔，作用2h，弃上清，补充5％FBS的完全培养基，200μl/孔，37℃，5％CO2，静培，5-7日观察其病变，根据Reed-Muench法进行计算TCID50；
中和实验
(1)分装人血清1200μl/1.5EP管，兔血清500μl/1.5EP管，在水浴锅中进行56℃，30mi灭活；
(2)稀释血清：8道移液器吸取110μl无血清F12K培养基至96孔板，其中第一列和第七列空着，待血清灭活后，分别取110μl血清至第一列和第二列中，将第二列混匀后取110μl到第三列，以此类推倍比稀释至第六列，弃最后的110μl的稀释液，共6个稀释度为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6，以上所述准备两份，备用；
(3)稀释病毒：按照200TCID50/100μl，准备所用病毒液，
(4)混合物：病毒和血清，将稀释的病毒液吸到10cm平皿中，8道排枪吸取110μl病毒液到稀释好的待检血清中，(110μl血清+110μl病毒)，37℃，5％CO2，1hrs；
(5)2hrs后，用真空泵连接200μl Tip，弃96孔板的细胞上清,吸取200μl 1×PBS洗细胞，吸取上述混合物100μl感作细胞，平行2个孔，每个血清稀释度共计4孔37℃，5％CO2，反应2hrs；
(6)2hrs后，用真空泵连接200μl Tip，弃以上混合物，补充200μl 5％FBS,37℃，5％CO2静至培养，5-7日判定结果，以致使50％细胞病变的血清稀释度为中和效价；
(7)实验设置阴、阳性对照和空白对照，本次阳性血清对照为Ad5的兔血清。
分别采用腺病毒Ad29和人类5型腺病毒进行中和抗体实验，阳性血清病毒液各个稀释度均未病变、阴性血清病毒液各个稀释度均病变，实验成立，具体结果如表1和表2所示，其中表1为Ad29中和抗体实验细胞病变情况，表2为hAd5中和抗体实验细胞病变情况。
表1：Ad29中和抗体实验细胞病变情况
Figure BDA0003149570990000171
Figure BDA0003149570990000181
Figure BDA0003149570990000191
表2：hAd5中和抗体实验细胞病变情况
Figure BDA0003149570990000192
Figure BDA0003149570990000201
结果说明：阳性血清均未病变、阴性病毒液各个稀释度均病变，实验成立，由表1可以看出，使用Ad29腺病毒在人群的24个血清样本中，24人中，3人有中和抗体，中和效价为1:4、1:16和1:32，占12.5％；由表2可以看出，而使用人类5型腺病毒，24个血清样本中，有15人有中和抗体，中和效价为1:8～1:128以上，占总人数的62.5％。这说明若是使用Ad29腺病毒做为疫苗载体，由于Ad29腺病毒在人群中的流行度低(在10％左右)，平均中和抗体滴度也显著低于腺病毒5型的中和滴度，预存免疫的影响力低，能达到更好的免疫效果。
实施例13新冠重组腺病毒疫苗pAd29-nCOV-S在小鼠模型上的免疫学评价
13.1疫苗体液免疫反应检测
20只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成3组，每组5只。根据表3所示分组情况对小鼠进行pAd29-nCOV-S疫苗免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表3：疫苗免疫检测小鼠分组情况
Figure BDA0003149570990000211
小鼠于免疫后14天采血，分离血清，SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1抗体滴度检测试剂盒(小鼠)，货号：KIT007，用于检测小鼠血清样本中的anti-SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1抗体水平。
检测原理为：采用间接ELSA方法，包被新型冠状病毒S1蛋白于固相载体上,加入待检测样本进行孵育，样本中的抗新型冠状病毒的抗体与固相载体上的蛋白结合,经过洗板后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG的抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，读取450m吸光度(OD值)，450m处OD值与样品中的抗新型冠状病毒抗体含量呈正相关。
计算检测样本所需酶标条，从铝箔袋取出,剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存，用1×洗涤缓冲液洗板,300μ/孔浸泡lmin，拍干酶标板,进行下一次清洗，共洗板5次加入待测样本，血清用1×稀释缓冲液进行1:2000稀释，100/孔，室温孵育2小时，弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300uL/孔浸泡1min，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板5次。用1x稀释缓冲液将抗小鼠IgG的抗体-HRP1:100稀释使用，100ul/孔加入酶标板中，混匀，室温孵育1小时。弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300μl/孔浸泡lmin，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板5次。将预先配制的底物液加入酶标板中，200μl/孔，混匀，室温避光孵育20分钟。加入50/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。读取OD450mm的光吸收值。
检测结果如图21所示：小鼠肌肉注射pAd29-nCOV-S疫苗2周后，针对spike蛋白，能够产生较高浓度的IgG抗体。注射1*10^8FFU剂量疫苗的小鼠血清与阴性对照组有显著差异，注射1*10^7FFU剂量疫苗的小鼠血清与对照也有显著差异，且高剂量组引起的体液免疫反应更高。(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)
13.2细胞免疫反应检测
10只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组5只。根据表4所示分组情况对小鼠进行pAd29-nCOV-S疫苗免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表4：疫苗免疫检测小鼠分组情况
Figure BDA0003149570990000212
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用穿梭质粒pS29E1-nCOV-S转染的BHK21细胞刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD4、CD8，细胞内细胞因子包括IFNγ、IL2、TNF。使用流式细胞仪(CyExpert)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经目的蛋白刺激后表达IFNγ、IL2、TNF的水平。
pAd29-nCOV-S诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图22、图23所示，代表性结果如图24至图25所示，其中图24为肌肉注射pAd29-nCOV-S后细胞免疫反应代表图，图25为空白对照免疫反应代表图。结果表示：小鼠免疫后14天，脾细胞经Spike蛋白刺激后，CD8+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于pAd29-EGFP载体对照组(Control)(P<0.05)。CD4+T细胞经过刺激后，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平也均显著高于pAd29-EGFP载体对照组(Control)(P<0.05)。
13.3SARS-CoV-2假病毒模拟中和抗体实验
SARS-CoV-2假病毒中和检测试剂盒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司，其原理是：将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。假病毒通过表面S蛋白感染靶细胞并表达报告荧光素酶基因。中和剂(如抗体)可以阻断S蛋白和ACE2的结合，从而阻止假病毒对宿主细胞的感染。通过检测报告基因荧光素酶的表达量，能推断出病毒被阻断的程度，从而进行中和剂的筛选或验证。
实验步骤为：将细胞免疫反应检测试验中采集的小鼠血清、阳性对照、阴性对照稀释后与牺牲好的HRP-RBD以1:1的方式混合，37℃孵育30分钟；取100ul混合物于对应的孔板中，37℃孵育15分钟；用260ul的1X Wash缓冲液洗涤孔板4次；加入100ul TMB缓冲液，20-25℃避光孵育15分钟；加入50ul终止缓冲液；OD450读取吸光度。结果如下表5所示：
表5：SARS-CoV-2假病毒模拟中和抗体实验
OD450 稀释度 抑制率 结果
阳性对照 0.0902 1：100 94.78％ /
阴性对照 1.7283 1：100 0.00％ /
10^8 1号 0.1151 1：100 93.34％ 阳性
10^8 2号 0.1056 1：100 93.89％ 阳性
10^8 3号 0.1106 1：100 93.60％ 阳性
10^8 4号 0.1123 1：100 93.50％ 阳性
10^8 5号 0.1003 1：100 94.20％ 阳性
10^7 1号 0.3028 1：100 82.48％ 阳性
10^7 2号 0.3931 1：100 77.26％ 阳性
10^7 3号 0.3119 1：100 81.95％ 阳性
10^7 4号 0.3056 1：100 82.32％ 阳性
10^7 5号 0.2546 1：100 85.27％ 阳性
其中，质控：阳性对照<0.3，阴性对照>1.0；抑制率＝(1-样本OD值/阴性对照OD值)*100％；判定：抑制率≥20％为阳性，Inhibition<20％为阴性。
综上所述，在小鼠注射10^8FFU、10^7FFU(经PBS缓冲液稀释)的pAd29-nCOV-S疫苗后，小鼠能够引起强烈的体液免疫反应，以及细胞免疫反应，与对照组均有显著的差异。同时，采集的血清在做模拟中和抗体实验中，能够起到阻断的作用。结果说明，我们的pAd29-nCOV-S疫苗对新冠病毒能有保护作用。对新冠疫苗的开发具有指导性意义。
序列表
<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司
<120> 一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用
<150> 2020106427453
<151> 2020-07-06
<150> 2020109457357
<151> 2020-09-10
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac 60
gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac 120
cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa 180
ccggcgcatg acttcaagac taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg 240
tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 300
gtcggactga acggggggtt cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga 360
actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa 420
accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga gggagccgcc agggggaaac gcctggtatc 480
tttatagtcc tgtcgggttt cgccaccact gatttgagcg tcagatttcg tgatgcttgt 540
caggggggcg gagcctatgg aaaaacggct ttgccgcggc cctctcactt ccctgttaag 600
tatcttcctg gcatcttcca ggaaatctcc gccccgttcg taagccattt ccgctcgccg 660
cagtcgaacg accgagcgta gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaatata tcctgtatca 720
catattctgc tgacgcaccg gtgcagcctt ttttctcctg ccacatgaag cacttcactg 780
acaccctcat cagtgccaac atagtaagcc agtatacact ccgcta 826
<210> 2
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 60
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120
tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360
gctgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540
gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780
ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816
<210> 3
<211> 6332
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttcaagct caggtccaaa ggttcatccc cacccatgtc atgtaacaag tcctcaattt 60
tttcaacagc tgctcgcctc tcgccactgg ctctgactgg ggtgggtctg tgcacttgca 120
ggggcgtgtc atctgtgaga tcagggggag acgggtggtc ttcttctgag ggtgatgact 180
catcctctga caccggacct agaaacaaaa ataaaccaca cttagcacag ctgttcaagc 240
aatacacagt gatgtgttaa gcactcagcc tctctcacat tcactccact tactgtaaat 300
aaagctgaaa gtctgtttca tatagcacaa agcgcatgat gcgttcgggt ctccagactt 360
atcccggtgg tactggcatt ttctacagcc ctccactggc tcggtagaat tttcaatcac 420
tacttgttcc tccacaatca cacaagcata gtctgagatc agagccatgg tctgctcacc 480
ccgttcatcc tctgaatcgc tgggaggaaa accttcctca taacaccgga ggtctagttc 540
gtcctcctct tccaattcag gtatgggtga cagagtcggt gtatgaagtg gagtagattc 600
gttggctatg tcagcctgaa gaatcataga ttctggaaat attaaattca cagcctcctc 660
gttagggtcg tcatcatggg catctacctc cagatcatag agatcctgaa gtgtgggtcc 720
cagctcgaac ggacttggat gcagttcgtc ctccaatact gtatccacaa agtcctccag 780
cataagcaca gccagctcac cgggcacagt tgaaggcagg aggcgcaggt gtctcatttt 840
tctcggtctc tgggagcgga gctcagagaa atctctactc gctggcactc aagagtggcc 900
tcttgacgga ctcgactggt ttaaataccc tgcggatcag ctgatctgtg acataaacac 960
cggactttga cacggacgcg gaaattcgcg aaaaaaacac cgcaatcgaa acccccacgt 1020
aatcggtcaa agtctctcgg ccctcggtaa atattccgcc ctgggaggga ccggtatttt 1080
tcgcttttca cttcctcatt cagttttcgc gccaaaatga cctaatttca cttgcatccg 1140
cccagaatta cctcatatcc gggcgtggcc gcgggaaaat cggccgtttc cgggtctaaa 1200
gtccgctttt ttatacgtca tcagccccgc gacttgcttc cgggctaggc cacgcctccg 1260
cggcgaccgt taacgccgtg cgtcgtgacg tcatttgcat cgtcttctct cgtccaatca 1320
gcgttggctc cgccccaaaa ccgttaaaat tcaaaagctc atttgcatat taacttttgt 1380
ttactttgtg gggtatatta ttgatgatgt taattaattg gttccactga gcgtcagacc 1440
ccttaataag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct tgctctgaaa 1500
acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc aactctttga 1560
accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca gtttagcctt 1620
aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc tgctgccagt 1680
ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 1740
cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac tgcctacccg 1800
gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa tgacaccggt 1860
aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa acgcctggta 1920
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt cgtgatgctt 1980
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgg ctttgccgcg gccctctcac ttccctgtta 2040
agtatcttcc tggcatcttc caggaaatct ccgccccgtt cgtaagccat ttccgctcgc 2100
cgcagtcgaa cgaccgagcg tagcgagtca gtgagcgagg aagcggaata tatcctgtat 2160
cacatattct gctgacgcac cggtgcagcc ttttttctcc tgccacatga agcacttcac 2220
tgacaccctc atcagtgcca acatagtaag ccagtataca ctccgctagc gctgaggtct 2280
gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca 2340
gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 2400
gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 2460
caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccacgtt gtgtctcaaa atctctgatg 2520
ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa 2580
cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg 2640
attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg 2700
gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct 2760
gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg 2820
gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc 2880
atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc 2940
tgattcaggt gaaaatattg ctgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat 3000
tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc 3060
acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc 3120
tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt 3180
cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg 3240
tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa 3300
ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga 3360
taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga 3420
attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg acggcttagg 3480
gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcaatg tagtcttatg 3540
caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta gcaacatgcc ttacaaggag 3600
agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg gtacgatcgt gccttattag 3660
gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg gacgaaccac tgaattgccg cattgcagag 3720
atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacctctg gctaactaga gaacccactg 3780
cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga gacccagcca ccatggtgag 3840
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 3900
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 3960
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 4020
caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 4080
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 4140
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 4200
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 4260
gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 4320
ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 4380
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 4440
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 4500
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg 4560
ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 4620
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 4680
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 4740
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 4800
catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct 4860
agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaatag ggataacagg gtaatataca 4920
aaaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctttaatta aatcatcaat aatatacccc 4980
acaaagtaaa caaaagttaa tatgcaaatg agcttttgaa ttttaacggt tttggggcgg 5040
agccaacgct gattggacga gaagcggtga tgcaaatgac gtcacgacgc acggctgacg 5100
ctcgccgcgg aggcgtggcc ggacatggaa gccattttgg acgtgggcaa gatggcgccc 5160
tacggctaag ttacatgtaa tggcggaagt gacgtaacgt gggaacccgg aagttgagtc 5220
acgaaatcga tacgaggaag tgagaacgcg gaagtgtttt cgcgaaaaac acccagggcg 5280
tgtgtgtttt ttttggcggg gtttttagac ctttggtcat tacgtcagtg taaggactgc 5340
ctttaaatag ggagctgggt tagtgggtag tcagtcgctg ctgttggcgc ttgtactgct 5400
gtgctctctg tctactggta agcgggctgc gctatggctg aatctctgta tgctttcata 5460
gatagccctg gagggattgc tcccgtccag gaagggacta gcaatagata taatttcttt 5520
tgccccgaat ctttccacat tcctccacat ggggtggttt tggttcacct aagagtgagc 5580
gtgctgattc ctaatggcta ccaaggcaga tttatggcct tgaatgacta ccattccagg 5640
ggcatactaa cccagtccga tgtgatcttt gctgggagaa gacaggagct aactgtgctg 5700
ctctttaacc acacggatcg atttttgtat gtccgagagg gccacccggt gggcactttg 5760
ctgctggaga gagtgatttt tccttcagtg agactggcca ctctggttta gtgcatgctt 5820
tctgtttttc agactctcat ctctactaac catgcttgag cgacgcgctg tcagctacca 5880
cattgtggtc cctggggccc tagtgactta tttagaggac ttttccatta ctgctatgat 5940
tagagagcac ctacctcgct ttatcactca cctcttggaa ggaatcaccg gtgacacaaa 6000
gagagcttat tccagcgtgc agtttttggg tgctagcttt ggagctttaa agtactccat 6060
cacgcttgcc agtcccacgc ttagccctgg ctctgaattg gcatctgtag tggccgagga 6120
cttgagtgac tttttacagc tgacgctgag acgcgagctc agggcagagg gcagaaactc 6180
attgaatctt gttgttttga acatgctgca ggtggtggag cagccagatc tgttgctatt 6240
atgaaggtct gcctgattat gaaagtggag ggggcgctgt gggaactttt ccacatgtgc 6300
ggagtggact tacaccaaca atttatttaa at 6332
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctcgttagg gtcgtcatca 20
<210> 5
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gucguuaggg ucgucaucag uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 6
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gucguuaggg ucgucaucag uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgcctgctc caacaatatc 20
<210> 8
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggccugcucc aacaauaucg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuu 98
<210> 9
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaagcuagc uauucuagug uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 10
<211> 31744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttaattaatt ggttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 60
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 120
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 180
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 240
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 360
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 420
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 480
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 540
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 600
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 660
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 720
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 780
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 840
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 900
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 960
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 1020
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 1080
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 1140
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1200
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1260
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1320
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1380
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1440
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1500
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gctgatgcgc 1560
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1620
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1680
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1740
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1800
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1860
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1920
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1980
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2040
gcattacgct gacttgacgg gacggcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt 2100
acgggccaga tatacgcaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta 2160
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 2220
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt 2280
ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac 2340
ataaacctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 2400
cactataggg agacccagcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 2460
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 2520
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2580
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2640
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2700
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2760
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2820
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2880
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2940
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 3000
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 3060
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3120
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3180
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3240
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3300
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3360
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3420
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3480
cgcattaata gggataacag ggtaatatac aaacgaggcc ctttcgtctt taattaacat 3540
catcaataat ataccccaca aagtaaacaa aagttaatat gcaaatgagc ttttgaattt 3600
taacggtttt ggggcggagc caacgctgat tggacgagaa gcggtgatgc aaatgacgtc 3660
acgacgcacg gctgacgctc gccgcggagg cgtggccgga catggaagcc attttggacg 3720
tgggcaagat ggcgccctac ggctaagtta catgtaatgg cggaagtgac gtaacgtggg 3780
aacccggaag ttgagtcacg aaatcgatac gaggaagtga gaacgcggaa gtgttttcgc 3840
gaaaaacacc cagggcgtgt gtgttttttt tggcggggtt tttagacctt tggtcattac 3900
gtcagtgtaa ggactgcctt taaataggga gctgggttag tgggtagtca gtcgctgctg 3960
ttggcgcttg tactgctgtg ctctctgtct actggtaagc gggctgcgct atggctgaat 4020
ctctgtatgc tttcatagat agccctggag ggattgctcc cgtccaggaa gggactagca 4080
atagatataa tttcttttgc cccgaatctt tccacattcc tccacatggg gtggttttgg 4140
ttcacctaag agtgagcgtg ctgattccta atggctacca aggcagattt atggccttga 4200
atgactacca ttccaggggc atactaaccc agtccgatgt gatctttgct gggagaagac 4260
aggagctaac tgtgctgctc tttaaccaca cggatcgatt tttgtatgtc cgagagggcc 4320
acccggtggg cactttgctg ctggagagag tgatttttcc ttcagtgaga ctggccactc 4380
tggtttagtg catgctttct gtttttcaga ctctcatctc tactaaccat gcttgagcga 4440
cgcgctgtca gctaccacat tgtggtccct ggggccctag tgacttattt agaggacttt 4500
tccattactg ctatgattag agagcaccta cctcgcttta tcactcacct cttggaagga 4560
atcaccggtg acacaaagag agcttattcc agcgtgcagt ttttgggtgc tagctttgga 4620
gctttaaagt actccatcac gcttgccagt cccacgctta gccctggctc tgaattggca 4680
tctgtagtgg ccgaggactt gagtgacttt ttacagctga cgctgagacg cgagctcagg 4740
gcagagggca gaaactcatt gaatcttgtt gttttgaaca tgctgcaggt ggtggagcag 4800
ccagatctgt tgctattatg aaggtctgcc tgattatgaa agtggagggg gcgctgtggg 4860
aacttttcca catgtgcgga gtggacttac accaacaatt tgtagaaata attcaaggct 4920
ggaaaaatga gaattacctg ggaatggtga atgagtgtaa cctgatgatt gatgaaatcg 4980
atggagggcc agcctttaat gtgattctta tgctggatgt acgcgtagag ccactgctcg 5040
aagccacagt cgagcacctt gaaaatagag taggttttga cctggctgtc tgtttccacc 5100
agcacagcgg cggggaacgc tgtcacctgc gtgacttgca ctttatcgtc cttcgagacc 5160
gcttggaata aaaatggttc ttccagttct tcccccacct cctctgaatg atagaccagg 5220
ctgcattaac tggattggga tggcctacaa tgtcctggct gatgtgttaa ggggaatccg 5280
catggacaga acttttgttt catcagatgc tgaggagctg ctcgagaacc tgcgggaatg 5340
gctgtacttc agttggatga ctgagcgtca gcagcggaaa gacaggagaa ggagaggtat 5400
ctgctgttca agggcccatt tctgctggca gaagtacgac aaggtacgca agagaatcca 5460
ctacaatgca aaccgaggat cagtcgagct tgctccgcca tcatccatac cgcagggccc 5520
gtttaccacg atctgatgag gagaccaggg cctcactgac tgaacaacac cccctgttgc 5580
ccgattgtga tcatgctgaa tatcataatg taagttctgt tcgcggatta ccatgtgctg 5640
ctggctttac cctgctccaa gagtttccag tcccctggga tatgattctg actccagagg 5700
aaataaaaat tttaaaaaga tgtatgtcag tgtgcctgtg ccccgctacc cttgacctgg 5760
tgagagctca gatggtgagc gggtacgagc gctggatcct gcattgccac tgttcatccc 5820
cgggctccct gcagtgtcgg gcgggaggca ccctgctggc cgtgtggttc aggagagtca 5880
tttacgggtg tatgttcaac cagcgcttcc catggtaccg ccagattgtg aacagagaca 5940
tgcccaaaga gatcatgtat atgggcagtg tgttcatgag gggcaggcac ctgatatatt 6000
gccgcatctg gtacgatggt cacgtgggtt ccatcatccc caacatgagc tttggctgga 6060
gcaccctgaa ttatgggctg ctgaataaca tggtgattat gtgctgcact tactgtgaga 6120
acatggcaga gatcaggatg cggtgctgtg cccgacgcac caggagactg atgctgaagg 6180
ctgtggggat catagtcaga gagacttgtg atcccgatcc catctgcagc agccgcaccg 6240
agccccggcg gcagagactg ttgagggcgc tgatggaaag gcacagaccc atcctgtttt 6300
ccgagtatga atctgtgcgt tcttctcgtt ccaccagact gtgaccttgg actgcgaggc 6360
ccgcttggat gacttttcag aggacggctt catctcaatc accgaccccc gtttggctcg 6420
ccaggaaact gtgtggctta tagacactaa atccagttct cgtgctaatc agaacattcc 6480
cctatttaag gccacccgtg ctgagagaat tgtttacact gtgaaatggg ctggtggtgg 6540
gagactgact acccgtgctg gtgtaaaaat caataaagat acatgaaaat tttcaaatga 6600
gaacatgttt attggtcttt cattcttggg cgatatagga gaaggtaaat gaagtagaat 6660
caaaagggat attgtcatag tccttggtcc atgaatagtt aaaagtgata gaataagcac 6720
tatctgcttc attattaaaa gtaattttaa ttacaactgg attatatggc tgattatcta 6780
agtagatatt tccatatata gtgttccttg cataaatttt agactgatca gttgtagctt 6840
tagcataagc tagtaaatta ggcataaatc caattgcatt tttatatggc tctggaagaa 6900
tagagtctcc acttctaaag tttaggtact gtttttcaat gtttgaattt tccaatagaa 6960
ctccattttg atcaaacagt agtttgatgt taaatgattt aggtagggat gggtctgttt 7020
tgttattaag gatcttgaac tttccgttga ctataattag agatacattt gccaaaatct 7080
gacttccgca ctttgtcagt accaaagtta gttttgagtc tttttctata tctatcttac 7140
aatttggaga agggtctaaa gttgtccaaa gtgtgcggat gtcatgttta ttgttccatg 7200
ctactaaata acctttatca tcaaaagtta aaccacctcc ttctccaatt ctcacacata 7260
aaccgactcc tttattgcta ccatcgtcat tttttaattc ttcatttcca attcctttgc 7320
cagtcaaaac tacaagatag tttaacaaac ctggcaaatc agatattgat ctatctatta 7380
cctttaatcc atctcctact agaatagcta gcttgttatc tctgacatca aatggaggtg 7440
ctaaagccaa ttccagtttt ttgtctgttc caacttgcaa tggagcctta gggtttacac 7500
ttaggtttcc actatcttgt tccacagtta gtccccctcc caccttgagt gagacatccc 7560
cattagtgat ggcgattggg tcagccagtt tgagtgacag gaccccaggt gggaagtttt 7620
tgaatccatc ggatgagaca aaggggggag taaggaaggg gatattctga ttccgcgcgt 7680
agccataggg gtagacgggg ttgaagtcat cttccacccg gagcctcttt gacatctgag 7740
agggaagaca atgaaaattg tggaccagga atttgacatc cctttcaagg tgtggaggaa 7800
gttcgccgcc cgccgaggac tggagtacca gagctgggag gagggtaccg aggtgctgct 7860
gaacaactac accagagaca tactttcaga tttcaagtaa gtgatcttta ttgaatcatt 7920
aattccaatg atttattctt atgagtaatt gtgggagggg aatggggtaa ggggctgatt 7980
ggtttctggg attttaatca acatcagtcg tagccgtcca ccgcttctct cactgcgtcg 8040
aagttcggta tgaactcgtc cgggtagagg cctggcgatc ccgagaaggg gttgaagtag 8100
accgagggca caaactcctc cacaaactgg agggttccga tgcctccgga gcgaggctcc 8160
gaagagctgc tctgcaaggt caggtaggcc tggttgggag tgaaggagga tctcccggct 8220
ccggctagtt ggaacactcc gtccggtcgc agaccgatcg aagagctcac caactcgtcg 8280
ttgagctgtg tgcctctgcc tcggatcacc agggttttta tacccgattg tgggcggagc 8340
gggcaccggg aagcgccgcc ggccagctgg acacctgagt tagtcatgcg gacttcggcc 8400
agtgcgtcac gcggaagtag tacggtagtc ggcccgggga tttcctgata caccagggtg 8460
gagggccaat tacgcgggtt gagctttgcc ctgggcgtgg aggtgaccgc cgcctgctcc 8520
aacaatatct ggtttcgatg actgcggacc ccgttgaccc gtgagatcat cgaggggccg 8580
gcactgagcc agttcatgcg ggtggagtag tcctgggagg cgcccgcggc caggcccatc 8640
tggggctgat agctccacat gtaaggtgtg ggaatctcct tgctcatggt ggcgatgagg 8700
taattcccgc cttttttccg ggtgggcgcg ccttagtctt taagagtgag cgcgcagtac 8760
ttgtggaaca gagcctcggc gtcttcgaga gtgcgctgca gctgatcttc gtttttgtgg 8820
tacaagcaac tgcgggtgag cgagcgcaga gaccgatttt ttactttgag ctcttgctgc 8880
tgacctcgac tctgctgaaa aatggcataa agagtgggga agatccggtt cctcagctcc 8940
ctggtggtca atggctcgtt cgccgcgatc ctcaggcctc ctcctcctcc ggcgactcct 9000
cttacttgct ttttcttagc tgtgaaggtg acggtagtaa tgcaacacgt tgcgggggat 9060
gttcaccccg cggtggaaga gcaggtagcg gcgggcgaaa gcgatgttcc ccccgcagtc 9120
ttgcaagcag gcgatgatcg cggctttgtg ggccctccat gatcggtagc cctgccgctc 9180
gtgcttaccg tcacccttca ctcgatccca tctacgagga ggcttggccg gagctgcgga 9240
ggttgtatcc gtgaccgccg gggctgccgg cgcggatggt gcggcgacgg gctgctctgt 9300
tgcctgctcc tcttccacct cttccaattc ttcctcctct gtactctcct cctcccattc 9360
ttcctcctct gcctggctgt cccattcttc ttccatctcc tcctccacta gcggcttctt 9420
cctcggcatg ctgggggaga cccgggttga gcacctcgcc cgtctggggg tccaggtaga 9480
cccctctacc ctttttcaga agaaactctt ggcgggattt ttggatggcg tgcaattggg 9540
cgaggatggc gccctgggtg atgacgcagg ccgtgagatc cgcgtgctgc gggcgcgatt 9600
ggtcctcgaa gaactttatc tcgtgggcgt ggtagtcctc gggtacaaat ttgcgcaggt 9660
acgcggaagt ccacaacccc ggcgtgagtt tcagcggagc ggtggactcc tgcggacctt 9720
gcagctcgaa ggtaccgatg acctgggttt cgctcaggag ctgggggttg cagaccaggg 9780
agcggtgcgg ggagcacagg ttgcagcggc agtggcactc gagcagcccc tcgccgctca 9840
cgtcctcgat cacatccgag tggtaggcga tgtagttggc cagctgcaag aggtagcagt 9900
ggctccacag cggcggggga cactcgcggt agctcagcgg gacaaagtcg gaggggaagg 9960
cgttgcaggt ggcgggcagc atcccagatc gctcgagaat gaaagtgcgg tagttttgca 10020
acatgctctg gctcatgaag tcgggcagcc cgcctttcag cgtctgcctc aggcgctcgg 10080
ggaaaacgat ctcggccagg tcggcggcgg tggtccgctc gtcgaagccc gtccacagct 10140
ttttgaggtt tctagcaaga agcttgtcca gctccttcag gttctcgtcc tcgagacact 10200
gctgccacac gcccatggcc gcttgccagg tgtggcagag gaatagaaag acgcagtcgc 10260
ggacgtagtc ccgccgcgcc tcgcccttca gggtcgagtg gagcacggtc tgccccaggc 10320
ggttctcgtg caggatcccc aggcaggaga ccaggttggt cagctccacg ttggagatct 10380
tgcaggcctg cctgacaaaa ccgtgcctga aagtgtagtg cagggtctcc tcgaccttgc 10440
gcagggtctc ggggtcgctg aagaagcgac gcatgcattc cagctcgagg gtgaccagga 10500
ccacggccag catgagcttg cgccgctgct ccagggcctg ggggtcgcgg gtccctagcc 10560
agcgcgcgag catctcgtcg ctgaccacgg gctgggcgtc ctcggggcgc tgctcctgac 10620
tttcatcgag ggcctcgatg tggggcatga tgagctgatc catgatgcga cgcatgacct 10680
tgggcgggag gttgacggcg gggtaggcga aatgggtgag ctcgacgctg cgcttgagca 10740
cggccagcct ggcgttgtcg ccttccaact ctaccagggc gctagtgtga ccctcttcct 10800
ctgctgtttc tttcagagcg ttcgccgcgc gtgtctcgtc ccgaccgagc ccttcgaaga 10860
tcttgggcac ctcttccagg gaagcgatat caggtatgca cgcgccgggc cccagagcga 10920
ggagcgcgtc ggcgcgggtg cggttggcgc ggcaggagac ggggatcttt tggttcttga 10980
aaaagatgtg ataggtggcg agggcctcgg ggaccgcgaa gacggggtag aagttgagac 11040
gcgggttggg ctcgcaggtg ccgttgggct ggcgtttggg gggcacgcgc ggcgagaaga 11100
ggttgagctc gtaggcccga cacagctcct cgacgctgag gggggtttcg ctccggtcgg 11160
ccagggcgtc ccggaggatg agggactggc gctgcaggtg tttcagcagc acatcctcct 11220
ctcctcccag gtagccatgc tcgagcccag cgtcggtctc ctcctggcct gcgtcttgct 11280
cgtgctcctg ttcatcctgt gggggttcta gacgagccgg ctcttccaag cccaggtcct 11340
gctcgatttt gggttgctcg tgggtggtta agtcctcctc ctgctcctgc ttacgcggct 11400
ccatcttccc ctaggaaaca atggccggcg gcagtcagga cgtgcgccgg ttcatggacc 11460
gagaggccac tccgccccgg ggccacggtt cagcgcgcta tccgccggag caggagagga 11520
gcccctcgcc gccacctcct ctgcccacca agcgccgaaa gtatcagcgg gtgggctccg 11580
ggtcttccga ggaggacgtg gtccccgtgg acagccctcc aaaaaagaag caagccagga 11640
agaccaagca tgtgaccaag gtagaccccg acgaagagat gccccaggaa gatgccgtga 11700
tcgtgggagt gggattcagc cagccgccgg ttctgttgaa ggaaggcaag gacggaaaac 11760
gcatcgtcga gccagcgacc cccggtattc tgaacgtgca caaccccctg agtctgcctc 11820
tggtctcgtc ctgggagaag ggcatggatg ccatgaacgt gctgatggaa cgctaccgcg 11880
tcgacagcgg cctgcgcgat gcttacaagc tcatgcccga gcagaccgag atcttccaaa 11940
agatgtgcca gacctggatg aacgaggagg cccgcggtct gcaactgacc ttcaccaccc 12000
agaagagctt tagcaccatc atgggtcgcc tgttgcaagg ttacatcttc agccatagcg 12060
ggatcgcgca taagaactgg gagtgcaccg gctgcgccct gtgggatcac ggctgcaccg 12120
aggtggaagg ccagctcaag tgtctgcatg ggacggtgat gatccacaag gaccacgtgg 12180
tggagatgga tgtgaccagt gagaacggac agcgcgcgtt gaaggagcag cccagcaagg 12240
ccaaggtgac ccagaaccgc tggggtcgga gcgtggtgca actgaccagc catgacgcgc 12300
gctgctgcgt gcatgatgcc gggtgcggga ataaccagtt cagcgggaag agctgcggcc 12360
tgtttttcag cgagggggcc aaggcccagc aagctttcaa gcagatcgcg gccttcgtca 12420
aggccctcta cccgaatatg cagcgcggcg cggggatgat gctgatgccc gtgcactgcg 12480
agtgtaacca caagcctcag agcgtgccat tcctgggccg ccagctgtgc aagatgaccc 12540
cgttcggcct gagcaacgcc gaggacctgg acaaggatca gatcagcgac aagagcgtgc 12600
tggccagcgt caagtacccc agtctgatgg tgttccagtg ctgcaacccc gtgtaccgca 12660
actcgcgcgc gcagagcacc ggccccaact gcgatttcaa gatctccgcc ccggacatgc 12720
tgggcgccct gcagatgagc cggcgcatgt ggagcgagac cttccccgag attcctgtac 12780
ccaaactggt gatccccgag ttcaagtggc agcccaagta ccagtaccgc aacgtggccc 12840
tccccagcgc ggcgcacaac gacgagcgcg agaacccctt cgacttttaa ataacttgca 12900
tatactccag tgcatgtaaa ataaaagtgc tgtttattga gatacacgca gttgtttcat 12960
tttatcaaaa gcggtggcgt gttcgatggc ggcgcggtgg gagcgaaagt agggggagtg 13020
acgcgcgagg aagcggtaga gctcctcctg gttgcgccgg agggtgggca gcacctgtgg 13080
cgactgtagc atgccgttgg gcacccccgt cagcaagttc atggtggggt ttccgtccat 13140
gggtcggtcg ggccagtgca cgaaggcatg caagaacatg caacagaaaa gtccgcaggc 13200
ggcggagtcg ggcccctgca cggtctgggt ggactgctcg agactgagac agcgatcggg 13260
cgaggaggca agcgcgctgc ggcgcagcat ggcctcgtac tcgaagctgt aaatctgctt 13320
gagccggcgg tccgagaacc caaaggggtc gaacatgtag caggtgcgcg agcgcgggtt 13380
ccagccgaag gcgagccagt gcacgcctcc ggtctcgcgg ccggccgtgt tgacgatggc 13440
gcaggccagc ttgttgccgg cgaggaagcc cgggaagcgc ttgtcgtggg tgcccaaaaa 13500
gtagggcccg cagcccaggt cgcgcacgat ggccgcgagc tctcgttcgc tggagccgct 13560
catgcttagg tggtggcgtt gccggcggag aagggcgtgc gcaggtagac ggcctcgatg 13620
acgccgcggt gcggctggtg cactctgacc acgtcgaaaa cttcgaagag aagatagagg 13680
agggtgggct catccatggg gtccacctcg aaggtcatgt cgagcgcgtg ggccgagttg 13740
gcgtagagca tgttctgacc caggtcggta agggcgccca tggacatgaa gttgctggag 13800
aaggggatgc gccacatgac cctgtcgcag aggaactttt tctgggtgac ggaggggact 13860
gcggtggagc caatgagcgg gtaggggaag ttggcggggt agggctgtcc ctgacgcatg 13920
gtgggtgcga ggtagccggt gaagcccgag ttgttgtgct ggaagggcag ggtgactgcc 13980
ttgtagtcct tgtagttgat ctcatcgacc acctgcctgc tcatgggctg gaagttgcgg 14040
aagaaggagt acatgcggtc cttgtaaccc tcgggcacgt aaaagccctg gtagccgatg 14100
ttgtagtggg agagcatctg gacgaggaac cagtccttgg tcatgttgca ttgggccacg 14160
ttgtagccct ccccgtcgac gctgcgcttg atctcgaact cgttcggcgt gagcagccgg 14220
tcgttgccgg gccagctgac cgaggagtcg aacatgatgg agaccttctt gaaggtgtgg 14280
ttgaggtaga aggtcccgtc gaggtagggg atggagcccg agtagacaaa gtaggggtcg 14340
aaacccgagc cgagggaagg agtttccttg gttttcaggc gagtgaaact ccagccgcga 14400
aaggcggccc agttgcgcga ggggatggag atgggcacgt tggtggcctt ggccgggatg 14460
gggtagagca tgttggcggc tgagaggtag tcgttgaagg actggtcgtt ggtgtcgttg 14520
cgcagcatgg cttccagggt ggaggcggtg ttgtgtgcca tggggaagaa ggtggcgtag 14580
aggttgacgc tgtcgaagcg gacggaggcg ccgtcgacgc gcaggtcgtt gccaagggaa 14640
ctctgcagga tcatgttgac atccttgcgg aagttccact cgtaggtgta ggagcccggg 14700
agcaggagca ggttcttgat ggcaaagaac ttttggggca cttggatgtg gaagggcacg 14760
tagcggccgt tgcccagcag catggaacgg tagcgcagac ccgcgttgcg gtggtggttg 14820
aaggggttga cgttgtccat ggggtccagg gaccagcgcg cgccgatgtt gatgtaggcg 14880
tccaccagcg agggggccac cacgcggccg ttcatgtact cgtaggtgtt ggtgttggtg 14940
ggcagcgtga cgttggccgg cgtgtacttg taggagtcgg gcaggtacag cgccacgttc 15000
gagtacagaa aactcttcca caggttggcc tggaggttga tctccatggc gtagatgttg 15060
cccttgcata tttggtttcg atctgccaca ttggtgtctt tttcccattc gctctcttga 15120
tccccatctt gtccattttt aacttttaca ccttcataag cagcattggt gccagaccca 15180
tccaatggga agcaatagtt gggaagttca tcttccacac cgtgattctc aatgatcctg 15240
acatcgggat catagctgtc caccgcagag ttccacatgc taaagtacct ggttctgtcg 15300
cccagagaat ctagcaagag ctggtaagac agctctgtgt ttctgtcttg caagtcgacc 15360
acagcattca actgagaagc ctgaccggcc agcacaccca tgttgccagt gctgttgtag 15420
tacatgagac ccacaaagtt gtccctgaag ccgatgtagt taggtctgtt gggcatggac 15480
tgctgaacca agttgatttc tgaactgtca tcatctttgc ctggtttata caccacgtgg 15540
gtgtccgggg tttcaagatt aacattttca gtgcacataa caatgtctgc tttgtattcc 15600
gttccaccac ctgttaaagt tcctcccgga gtatcaaaga atgctaggtc tatgtcaaaa 15660
tcttcttgac ttttttcagg gtctcttagt tttgcctgtc ctcctttttc atttgtgggt 15720
ctggcaaatg agccatagca tggtttcatc ttggtttcct ttttaagagc ccttcctcca 15780
tagaaggctt ctgtttcctg ccagttttct tctcctactt gaggctctgg ttgatacagc 15840
ttattagcat atatcgggtc ttgtttgcca tttgtagtat ctgttccaat ttgcaaaccg 15900
ctaattgtaa tgttttctcc acccatagga gctacaccat aagtatgtgt ttccttttga 15960
tctccagcat tggccttttt ctgttcccac tgactggagt tgggggcgcc cttgggggcc 16020
agactgttgt aggccgtgcc cgagtagggt ttgaagctgg gaccgcggtc caggacgccg 16080
cggatgtcaa agtaagtgct ggccatgtct agcacccggt tgtcgcccac ggccagagtg 16140
aagcgcgcct tgtacgagta cgtggtgtcc tcgcgatcca cgggcacgaa gcgcagcgtc 16200
agacgctggg accggtccgt ggtcacatcg tgggtcgggg ccaccgtggg gttcctaaac 16260
ttgttgccca ggctgaagta cgtgtcggtg gcgcgggcaa actgcaccag acccgggctc 16320
aggtactccg aggcgtcctg cccggcgatg tgcatgtacg cccactgcgg catcatcgag 16380
ggggtggcca tcttcttctc tggcggtaag gcacatacaa gttaagctct ccctttagtg 16440
tcctctttcc tctctcaaaa gcatcggcgg cgcttcagac ttttcactcc caggcccacg 16500
atactgtgca gcgtgctctg ccagttctgg gcctggcggc gggcggggac gcggcgcacg 16560
gcggtcgcca ccgggggggc ctgcacgacc ggagctgcct taggtggagc gggcgcgggt 16620
ggtggaggca ggtcaagggt ggcaggtttc atcacacccg tggccagcgg cgcgatgatg 16680
cgcgtggtgg gcatgccggc cttgacggcc tcctcgtacg agggcggctc gtccacctgc 16740
agggtagtct cctccgcgtc gggccgcggc cgcttctcgc ccctgggcgg aggatgcgcg 16800
cttgcatctt ccatctccac caccgtggcg gcgggcgggc gcgggtccag gcggctgttt 16860
atctcgcgct gcacggcctg gttcgcgatg tccaccaccc cgttaatgcc cgaggccagc 16920
ccgtccacca ccttctgctg gaagttctgg tctgcgagct tttccctcaa catctgcccc 16980
gtgctactat tccaggcctt gttcccatag gtccggagcg tcgagccgaa atttttaagc 17040
ccgctccaga cactgctcca attgaaggcg cccccgttca gctggctggt gccgatctcg 17100
ttccaggtgc ccatgaacgg ccgcgtgccg tgccgcggag ccagggacgc aaaattgatg 17160
tcttccattc taaaaatata caggaccagg tgtgtcagag tctaaagagg ctttattcgc 17220
acatcaacgg cgctgcgacg cctgcagcgc aacggaagct atgcccggga tcgtgccgat 17280
ggccgcggcg attataggga tgagcgcggg caggaacccg ccactcaggc gcctgcgcat 17340
ggcccgccgc cggcggcggt tcaggccgct gcctgccatg cctctcctgc ggcgggatct 17400
tcctcggtaa ttcgggactg ggatgcgcag gcggcaagtg agagccatct ctctgcaaca 17460
gtatcacagc acacggatta aaggatgctg gggtggtagc gcacggtggg cagaacgagc 17520
gagcggcccc ggcgcgtggt gacgcggcgc acgcgggcgg gggccagacg gcggcgggtg 17580
gtggtgcggc ggcggcgttt gctggctggg cgcctgcggc tggcgtagta ccgggtgccg 17640
cggtagcccg gcgtcgggat gatggaagga tgcaacacgt agttgggcat cagccggctg 17700
gcggcgcccc atcttcgcct cctgggaggc tcggtagccg tggcggcggt agaagtggag 17760
acggtagcgg tggaggctgg gagccagggg tcggtctgca cctcgatgct ggtcgagggt 17820
tttttgtcga catccatgtc ggtggggatc tgaatgtcca cggtctgcac gcccaggccc 17880
ggcgccacct gcttgatggg gcgcaccttg acctcgggct ccacatccat tttcacggtg 17940
tccagcacgt cctccacgcg ccggcgcttg ggcaccatga tctgcatggt cgggtacatg 18000
ctctcgccct cgcgcttgac cccgcggctc ggcagcagca ccgcctgggg cagcacctgc 18060
tgcagggtca cgggcttcag gctcggcgtg gggttgctct cgtccagcgg cagcgagatc 18120
agctcctctt cgcgcgaccg cttcccgtag gcgaactcgc ctgcccgctc cgccgcctgg 18180
tccaggatgt cgtcgtcgcc gtacacctcg tcatagctac gcttgctcct gaccgaggac 18240
cgctcgccgg gcgtgaacac caccgccgtg ccgggccgca acacgcgctg caccctgcgc 18300
cccttccaat ttacgcgccg ccgcggagcg aactcgcgca caaactctac tgccccctcg 18360
tccacctcat cctttttttt aacccgcttg attttgcggg gtttctggtc cgcctggggt 18420
ggtccgtaaa tctccggggc gacgacctgg agcatctcct ccttgatttt gcgctttgac 18480
atcgtcgctt gcgggggagg acacaagcat tagatcaggg acgaggagga cgggtgcgca 18540
cgggcacgcg cacgcccgtg acggagtcgc gcacccagta cacgtttccg cgcctgggtc 18600
tggtcatgct agagatggcc gcggcggcgg cggcggccgc tcgtctgcga gtcctgcctg 18660
cggggggtgc agtggcagcg cggcgcgcgg ctcgcatcat ggcccggcgg cccgtgcgtc 18720
tggcgcggcg cagtagagcc cgggcggcgc gcatggcggg cgtgctccgg tggcgcctgg 18780
cgatccgtcg ccgccgactc ttgcgtctgg catagtcgcg cgcgtcggcc accacgctgt 18840
caatgaccgc gtccacggtc gagggggcgg gggtgtagtt gcgcgcgtcg gcgaccaccg 18900
agtcgatgac gtcgtcaacg gtggtgcgca cggcagcggc gggagtccgc ccacgcttgt 18960
aagcgcccca gggagcgcgg aagtggccgc ggacgcggac ggggtgctgc tgggagcgct 19020
tcttggctcc tccgtacatg gtgctgggcc tagtaagacc ccagccggtg ttattgctgg 19080
gcgagatgag aatagacatt ttttagaagg tgcgactgga aagcacacgc ggcgcgacta 19140
tgcccagggc cttgtagacg tagggacagg tgcggcgacg ggcgtcagtg acggtcactc 19200
gctggactcc gcggatactg ctgcgcagcg gtagcgtccc gtgatctgtg agagcaggca 19260
cgttttcact gacggtggtg atggtgggcg cgggcgggcg gcagaggatc tggttgtcgg 19320
ggaagcggtt gaagacgtgg gtgagggagg tgtagctgcg gatgagctgg gagtagacgg 19380
cgaggtcgtt gtaaaagctc ttggcgcgga agggcatgag ctcggcgccg accacggggt 19440
agttgctgac ttgctgggta gagcggaagg tgaccgggtc ttgcatgagg tccggcagcg 19500
accagtagac ttgctccgcg ccgcaagtga cgtccggggt ggtgagcagc gtccacgact 19560
gcaccccctt ctcggggtcc ccgtaggtat aggacaggta ccagcttcgg tacagggtgt 19620
catgggtgtc cttgatcagg ttgtaacttc tgttgctctc atccttttca attggtacga 19680
tcactagctc cttttcagct gctttttctt gagctacagt gaggtgggta tcgcctctag 19740
tgacagcacc atctccctga tgctttgcag cttccttggc agcatcctca agttccttct 19800
tgctatccag atattttttg gtatccagga gagcggggat gttaccccct tctagatcct 19860
catacatgat tctgaagccc tcttggaaag gttgcttctt gcgaatgccc aggagattgc 19920
tcaggcggct ctcggtgaag tccaccccgc agcccggcag cagcaccacg tccgggtgga 19980
aggcctcgta ggtgtagacc cctggcataa ccagcttggt caccgggtcc cagcccagct 20040
tgaaattcct gctgtcaaac ttgactccga tatcgctctc cagcacgcca ttttgccgcc 20100
ccacttgcaa gtagttttcc aagatggcgt tgttcatcag gtctatggtc atggtctcgg 20160
aaaagttgcc ctcgggcagg gtaaactcaa accactcata ctctaagata tccttgctta 20220
aatctgttgc ttctaccccc tgtgggtgtt tcctagccac catcacccgc gccttaaact 20280
tgctggtgaa catgtactcg ttcacattgg gcatgttggt gtgcagaatg gtcttcagat 20340
caccgcccca ccgcgaccgc tcgtcaaaat ttatcgtctg cgtgctggcc tcggcggggg 20400
tgaaatcgtt gttctgcacc accgtggtca ggaagttgct gtggtcgttt tggtagttca 20460
gggaagcgat gtccgccgac ttgttgtcca ccaagtacac gcgagtggtg tcgtactgcg 20520
gagccagctc cgagtaacga atgctgtttc tgccctccgt aggagccata taccgcggag 20580
gcacaaacgg aacctccagg gtcgcctgcg ccatcacgct ctcgtacgag ggaggaggag 20640
aggaagacac caccgcacgc ctcatctcta acaaggaaga gaacgcacgc tatggccttg 20700
gtgagtttta ttttgcattt caaaacatcc gccgccccag tttgggctgc agatgcgcga 20760
acgggttggc cccaccgctc ccgcccaagt ccagcacgct gctatcgtcg gccgagtcct 20820
cgtcgtccca caccaggccc cgctgccggt cgtggcgctg tcgccgcggc gcgggcgcgt 20880
ccctatggtc ctgagcgtag gtcttccagc ggttcagttt gtccaccaga ctctctatcc 20940
cgttattggc catggcgttc ttggcccgcg gcggctgcag cagcgagtcg ttcaggtact 21000
cgtcctcgcc cagcaagcgc ggtcggctaa ccctgccgct gttcaccgag cccggcaagc 21060
tatgcaaact ccctaagcta ggaaaggggc ttcttcccac agcgccctcg ctcggcgtgc 21120
gcactgcttc ctgtctcttt tgaaaggcgg gcgagaacac cgcgctgtcc acgtcgtccc 21180
acaggaaccc gtcgttggga tcgggcatgt cgtactcgcc cgtgtagaac cccggcggcg 21240
ggagccagtg cgggttcaat atggcattgg taaagtagtc cgtgttcatg gccgccgcgc 21300
ggtgcaggta gtccatcagc ttattgatga acggccggtt ggcggcgtac atgctaggtt 21360
ccatgttgcg cgcggtcatg tccagcgcag cgctgggggt ggcgccctcc tgcatcagga 21420
acagccctac gctctgctgc acatatctca ggatcctttc ctcctcggcc gacagtgcgt 21480
actgcgccgg gatcttctgc tgtctattgg tcagcaaaaa gttcagggtg gccctcagac 21540
tgtcggtgtc gttctgcccc agcgcgcggc tcacgctcgt gatctcctgg aaggtctgct 21600
cgtccacctg cgcctggcct atggcctcgc ggtacagcgt cagcaggtgg cccaggtacg 21660
agttgcggtt cacgctgccg ctgtcggtga agggcgcgat cagcagcagc agcagccgcg 21720
agttgggcgt cagcaagctg ctcaccgtcg accggtcgcc cacgggcgcc tgcacgcccc 21780
acagccctcg caggttcttg aaagcctggc tcaggttcac cgtctgcaag ccctgccggc 21840
tcgtctggaa aaagtagtcc gggcccgact ggtacacctc gctctggggc acctcggtca 21900
ccatcagccg cagcgcgctg ataaagttgg tgtaatcgtc ctgcccgcgc ggcacgttcg 21960
ccggctgcgt cgccaggaag gcgttcagcg ccaccagcga gcccaggccc tcgttcttga 22020
accgctcgcg ctgcgccacg gcctcgcgca cgtccgtcac cagccggtcc aggttggact 22080
gcacgttcgt gctgttgtag cggcccacgc gctccagcag ggcgttgtac accagcccgg 22140
cctcgtcggg acggatggcc ttgttctccg ccagcgcgtt cacgatcgcc agcaccttct 22200
cgtgcgtggg gttggtccga gaggggacca ccgcctccag aatggccgag agtctgttgg 22260
cctgcggctg ttgtctaaag gactcggggt tgcgggtcgt cagggccatg atgcgttgca 22320
tcgcggcctc ccagtcgtcc gatgctagac cggacggctg gctttgcagc gccgccctta 22380
tggcggggtc cggggcttgc tgggacatct aaaaacacat cacggaggcg tcagtacccc 22440
gcagcgggtg catcctcctc ctcttcctct tcctcatcca agtcctctgg accgtaggcg 22500
gcctccaagg cgcgccggct cggctgccaa tgcaggtccg cccccatgtc gaagtaggac 22560
tcctcgccgc cggcggcgcc ccctaccagc gcccggcgca ggctcagcat cagctcgcgg 22620
tcgctcagct cgcgccgccg gctcgtgctc acggccttgt ggatgcggtc gttgcggtac 22680
acgcccaggt cgtcgctcag cgtcagcacc ttgagcgcca tgcgcatgta aaagctgtct 22740
atcttcacct ccttgtctat gggcacgtac ggcgtcttgt aaatcttgcg cgcgtaaaac 22800
ttgcccaggc tcagcaccga gtagttgatc gccgccacct tctcggccag gctcaagctg 22860
cgctcctgca ctacgatgct ctgcaagatg ttaatcagct ccagcagcca gcgaccctcg 22920
ggctcggcga tgttcagcag cgcctccctg aacgcctcgt tgtccctgct gtgctgcacc 22980
accaggaaca gctgcgccgt cagaggcttg ctgtctgggt tctgcacgat ggcctccgcc 23040
aggtcccaca ggtgcatcag acccagggcc acctcctcgc gcgcgatcag cgtgcgcacg 23100
tggttgttga aactcttttg gaagttgcgc tcctgcttca ccgtctgctc gtaggccgtc 23160
accaggttgg ccgccgccac gtgtgcgcgc gcggggctga tccccgtctg ctcattcggc 23220
tcgaaatcct cgtcgcgcag cacgcgctgg cggtccaggc cctcgcgcag ctccctgccc 23280
gcccgaaacc ggcagtcgcg catctcctcg ggctcctccc cgctgcggtc cctgaacagg 23340
ttctgcgcag gcacgtacgc cgggcgcacg tccttctgca gctgcacgcg ggggtgtcgc 23400
tccggggacg gcgcccccag tcttgccagc ccttcgccct cttccaagtc catctctgtc 23460
tgtggctggc tagcgccggc gcctgctacg gccgcggtcg cggtggtcgc cgggggggtg 23520
ggacgcattt ggcgcaggac gggatgcatc tggcaaaaag aaaaaagggg gctcgctccc 23580
gtaactggag aagtcggctg gctgtgggtc tttaaatcgg cggggtgacc aagtcccgct 23640
cgccgcggcc gtcctcgaac cgggttctgc cgcgactcaa ccctggcgat gcttctccag 23700
actacgggcg cgagccacta cccggcaggg ttttcggtcg ctttcaagtc tagcgacccc 23760
cctcggccag caaaaagggc tctccgccgt atcctggcgg ctatcgggct cgggtcgaga 23820
cgggagtgcc aataccacgt tagtcgcggc tccagcctga ttcgagggga ctcgaaccgg 23880
ggtacacacg cggcctaacc cgtttgcgtt ccgccaggct acggaggaag agcccgctca 23940
accgctttcg tttttgcctc tagagcgtca atgactgcgc gcgtctcacc ggccagaccg 24000
tgccgaccat ggactatttc ctgccgctgc gcaacatctg gaaccgcgtc cgcgagttcc 24060
cgcgcgcctc caccaccgcc gccggcatca cctggatgtc ccgctacctc tacggctacc 24120
accgcctcat gctcgaggac ctggccccgg gcgcgccggc cacccagcgc tggccgctct 24180
accgccagcc gccaccgcac ttcctagtcg gctaccagta cctcgtgcgc acctgcaacg 24240
actacgtctt cgactcgcgc gccttctcgc ggatcaggta ctccgaggtc gtgcaacccg 24300
gcctgcagac cgtcaactgg tcgctcatgg ccaactgcac ctacaccatc aacaccgggg 24360
cctaccaccg cttcgtcgac atggacgact tccaggacac cctcacccgc gtgcaacagg 24420
ccatcctcgc cgagcgcgtc gtcgccgacc tggcgcttgt gcaaccgctc aggggcgtcg 24480
gggtcacccg catggaagac tccgcctccg ccagtgatga cattgagagg ctcatgcatg 24540
actactacaa gaacctgagc cggtgtcagg gccaggcctg gggcatggcc gagcggctcc 24600
gcatccagca agcgggaccc aaggacctgg tcctcctcgc caccatccgc cgcctcaaaa 24660
acgcctactt caattacatc atcagcaacc gcaattctaa cagcgtccac ggggctacta 24720
cgtgtttgag cttaccttgc gactgcgatt ggctagacgc tttcctcgaa agattctccg 24780
atccggtcga tctcgacgcg ctcacgtccc ctacaccgca attgataaga tgcatcgtca 24840
gcgccctatc gctgcccaat ggggacccgc cccattaccg ggagatgacc ggcggcgtct 24900
tcacgctgcg tcctcgcgaa cggggtcgcg ccgtcaccga aaccatgcgt cgccgccgcg 24960
gggagatgat cgagcgcttc gtcgaccgtc tcccggtgcg tcgccgtcgt cgtcgggccc 25020
cgccaccacc accgccccca gaggaagaaa tagaagaaga ggtcgtcatg gaagaagagg 25080
aagaggagga ggcccccggg gatttcgagc gcgaggtgcg cgccaccatc gccgagctca 25140
tccggctcct ggaagacgag ctcacggtct cggcccgcaa cgcccagttt ttcaacttcg 25200
ccgtggattt ctacgaagcc atggaaaggc tggaggccat cggcgacatc agcgagatgc 25260
ccctgcgccg ctggatcatg tacttcttcg tcaccgagca catcgccacc accctcaact 25320
acctcttcca gcgcctgcgc aactacgccg tcttcacgcg gcacgtggag ctcaacctcg 25380
cgcaggtggt catgcgcgcg cgcgacgcag acggggacgt agtctacagc cgcgtctgga 25440
acgagagcgg gctgggcgcc ttctcgcagc tcatgggtcg catctcaaat gacctcgccg 25500
ccaccgtcga gcgcgcgggc cgcggcgatc tccaggagga ggagatcgag cagttcatgt 25560
ccgagatcgc ctaccaggac aactcgggcg acgtgcaaga gatcctgcgt caggccgccg 25620
tcaatgacgc cgagattgat tctgttgaac tgtctttcag gttcaaagtc acggggccgg 25680
tggtcttcac gcagaggcgg cagatccagg atgtcaaccg ccgcgtcgtc gcgcacgcca 25740
gcgctctcag ggcgcagcac cgggacctgc ccgagcgcca cgccgacgtg cctctgccgc 25800
ccctgcccgc ggggccggaa ccgccgctgc cgccgggagc acgtccgcga caccgcttct 25860
aaaagcgcac cgcggcacgg tcgtggcccc gcgcagctac gggctcatgc aatgcgtgga 25920
cacggccacc aactccccag tggaaatcaa gtaccatctg catctcaagc acgccctcac 25980
ccgcctctac gaggtcaacc tcagaaccct gcccccggac ctggatctcc gcgacaccat 26040
ggacagctcc caactgcgcg ccctcgtctt cgctctccgc ccccgccgcg ccgagatctg 26100
gacctggctc ccgcgcgggc tcgtcagcct ctccgtcctc gaggagcccc agggtgagtc 26160
ccacgcaggc gaacatgaaa accaccagcc agggccgcca ctcctgaagt tcctcctcaa 26220
gggacgcgct gtgtatctcg tggatgaggt acagcccgtg cagcgctgcg agtactgcgg 26280
acgcttttac aagcatcagc acgagtgctc ggttcgccgg cgggatttct actttcatca 26340
catcaacagc cactcgtcca actggtggca ggaaatccag ttcttcccaa tcggctctca 26400
tcctcgcacg gagaggctct ttgtcaccta cgatgtagaa acctacacct ggatggggtc 26460
cttcggcaag cagctcgtcc ccttcatgct ggtcatgaaa ttctccgggg accccgagct 26520
gatcgccctg gctcgcgatc tcgccgtgcg cttacgctgg gatcgctggg agcgggaccc 26580
cctcaccttc tactgcgtca caccagaaaa gatggccgtg ggccagcagt tccgcctctt 26640
tcgcgacgag ctccagaccc tcatggcccg cgagctctgg gcttccttca tgcaagccaa 26700
cccacatctc caggagtggg cgctcgagca gcacggcctg caatgccccg aggacctcac 26760
ctacgaggag ctcaaaaagc tgccgcacat caaaggccgc ccgcgattca tggaactcta 26820
catcgtcggg cacaacatca acggcttcga cgagatcgtc ctcgccgccc aggtgatcaa 26880
caaccgagcc tccgtcccgg gccctttccg catcacccgc aatttcatgc cgcgggcagg 26940
caagattctc ttcaatgacg tcactttcgc tctgcctaac cccctctcga agaagcgcac 27000
cgatttcgag ctctgggagc acggcggctg cgacgactcg gacttcaagt accagttctt 27060
gaaagtcatg gtcagggaca ccttcgccct gacgcacacc tcgctccgca aggccgctca 27120
agcttacgcc ctccccgtgg agaagggctg ctgtccctac aaggccgtga accatttcta 27180
catgctgggc tcttaccgtg cggacgatcg aggattcccg ctccgggagt actggaagga 27240
tgacgaggag tacgccctca accgcgagct gtgggagaag aaaggagaag cgggttatga 27300
catcatccgc gaaacgctgg actactgcgc catggacgtc ctcgtcaccg ccgagctcgt 27360
cgccaagctg caagactcct acgcgcactt catccgcgac tcggtccgcc tgccccacgc 27420
ccactttaac atcttccaac ggcccaccat ctcctccaac tcgcatgcca tctttcgcca 27480
gatcgtcttc cgcgccgagc agccccagcg caccaatctc ggccccgcct tcttggcccc 27540
ctcgcatgag ttgtatgact acgtgcgcgc cagcatccgc ggggggcgct gttatcccac 27600
ctacatcggc atcctctcgg agcccatcta tgtctatgac atctgcggca tgtacgcctc 27660
cgccctcacg catcccatgc cctggggtcc gcccctcaac ccctacgagc gagcgctggc 27720
cgcccgcgag tggcagatgg ccttggatga tgcatcctca aaaatagatt attttgacaa 27780
ggaactctgt ccgggcatct tcaccatcga tgcggacccc cctgacgagc atctgcttga 27840
tgtgctgcca ccgttctgct cgcgcaaggg cggcagactc tgctggacca acgagcccct 27900
gcgcggcgag gtggccacca gcgtggacct ggtcaccctg cataaccgcg gctggcgcgt 27960
caggatcgtg cccgacgagc gcaccaccgt cttcccggaa tggaagtgcg tcgcgcgcga 28020
gtatgtccag ctcaacatcg cggccaagga gcgcgccgac cgtgacaaaa atcagacaat 28080
gagatccatc gccaagcttc tctccaacgc cctctatggc tccttcgcca ccaagcttga 28140
caataaaaaa attgtctttt ctgaccagat ggatgaaagt ctcctaaaaa gcatcgcggc 28200
agggcaggcc aacatcaaat cctcctcgtt tctagaaact gacaacctga gtgccgaggt 28260
catgcccgct ctcgagaggg aatacctacc ccaacagctg gcgctcgtgg acagcgacgc 28320
ggaagagagt gaggacgagc acagacccgc ccccttttat acccccccgt cggggacccc 28380
cggtcacgtg gcctacacct acaagccaat caccttcttg gatgcggagg agggggacat 28440
gtgtctgcac acggtggaaa aggtggaccc cctggtggac aacgaccgct acccctcgca 28500
cgtggcctcc tttgtcttgg cgtggacgcg cgcctttgtc tcagagtggt ccgagtttct 28560
ctacgaggag gaccgcggga cgcccctgca ggacaggcca atcaagtccg tctacgggga 28620
caccgacagc ctgtttgtca ccgagcgcgg acacagactc atggagacgc gaggtaagaa 28680
gcgcatcaaa aagaacgggg gaaaactggt ttttgacccc gagcagccag agctcacctg 28740
gctcgtcgag tgcgagaccg tctgcgccca ctgcggagcg gacgctttcg ctcccgagtc 28800
cgtctttctc gcccccaagc tctacgccct gcaatccctc ctctgtcccg cctgcgggcg 28860
ctcttccaag ggcaagctcc gcgccaaggg ccacgccgcc gaggccctca actacgagct 28920
catggtcaac tgctatctcg ccgactcgca gggcgaagac cgtgcccgtt tcagcaccag 28980
caggatgagt ctcaagcgca cccttgcaag cgcccagcca ggggcccacc ccttcaccgt 29040
gacggagacc accctcactc ggaccctgag accctggaag gacatgacgc tggccgcgct 29100
ggacgcccat cgtctcgtgc cctacagtcg cagtcgtccc aacccccgaa acgaggaagt 29160
ctgctggatc gagatgccgt agagcacgtc accgagctct gggaccgcct ggagctcctc 29220
tcgcagaccc tcgccaagat gcccatggcc gacggactca agcccctgaa aaactttgct 29280
tccctgcaag agctcctctc gctgggcggg gaccgcctcc tcggcgagct cgttcgggaa 29340
aacctccaag tcagagacat gctcaacgag gtggcccccc tcctccggga cgacggcagc 29400
tgcatgtcct tgaactacca cctgcaaccc gtcatcgggg tcatctacgg cccgaccggg 29460
tgcggcaagt cccagctgtt gagaaacctg ctctcttcgc agctcatcac cccagccccg 29520
gaaaccgttt ttttcatcgc cccgcaggtg gacatgatcc ccccctccga gatgaaagcc 29580
tgggagatgc agatctgtga ggggaacttc gccccggggc ccgagggaac catcgtcccc 29640
caatctggca ccctccgccc caaattcatt aaaatgtctt atgatgatct cacccaggag 29700
cataattatg atgtatctga ccccagaaac gtctttgcca aagccgcagc ccacgggccc 29760
atcgccatca tcatggatga atgcatggaa aacctgggcg ggcacaaggg cgtctccaaa 29820
ttcttccacg cattcccttc caagttgcat gacaagttcc ccaagtgcac gggctacacc 29880
gtcctggtgg tcctgcacaa catgaacccc cggcgggatc tgggtggcaa catcgccaac 29940
ctcaagatcc aggccaaact gcacatcatc tccccccgca tgcatccctc ccagctcaac 30000
cgcttcgcca atacctacac caaggggctc cccgtggcca tcagtctcct tctcaaagac 30060
atcatccagc accacgccca gcgcccctgc tatgactgga tcatctacaa cacgacccca 30120
gagcacgagg ccatgcagtg gtgctacctc cacccccggg acgggctcat gcccatgtac 30180
ctcaacatcc aatcccacct ctaccgggtc ctggaaaaaa tccaccgcac tctcaatgat 30240
cgggagaggt ggaccagggc ctaccgcgcg cgaaaaaata aataataaag atgctttgct 30300
gtttggatca gaatctgtgt ttattgaatc atttattttg ctgctgttgc tgctcgcgga 30360
gctcggacac ctgctgggtc agggcggcca gctggcggct cagggcttcc agctcggcca 30420
gcagggccag cagtttctcc tcggcgatga tggaactggg cacagagggg ctgctgccgc 30480
tgctgggcat gtagctcgag gccagtctcg tcgctgtcat ggcagctgcg gctgccgcgg 30540
ctgcggcggt gctgtcgagc gacgagctcc ccacggtcgc gtaggtcatg gtcgaggaat 30600
ttgctggaag cactgggcgc ccatccaccg tcgatcccat cacattctga cgaactccgg 30660
cccatcccgg cacacttttg catatagtat acatgcataa accagtgctt gagaagaaat 30720
gtgtacagaa ggctgaaagg agagaacttt agtcttcttg tttatggcct ccatagttag 30780
aatattttat aacacaaata ttttgatatt ataattttaa aataaaaaca cagaatagcc 30840
agacatacaa ggcaagcatt caataccagg tgaggttttt cactgtaatt gacttaatgg 30900
aaaattttca agctagatgt gcataataat aaaaatctga ccttgccttc atgtgattca 30960
gccccagccc attaccctgt ttaggactga gaaatgcaag atttaaattc atgggcatct 31020
acctccagat catagagatc ctgaagtgtg ggtcccagct cgaacggact tggatgcagt 31080
tcgtcctcca atactgtatc cacaaagtcc tccagcataa gcacagccag ctcaccgggc 31140
acagttgaag gcaggaggcg caggtgtctc atttttctcg gtctctggga gcggagctca 31200
gagaaatctc tactcgctgg cactcaagag tggcctcttg acggactcga ctggtttaaa 31260
taccctgcgg atcagctgat ctgtgacata aacaccggac tttgacacgg acgcggaaat 31320
tcgcgaaaaa aacaccgcaa tcgaaacccc cacgtaatcg gtcaaagtct ctcggccctc 31380
ggtaaatatt ccgccctggg agggaccggt atttttcgct tttcacttcc tcattcagtt 31440
ttcgcgccaa aatgacctaa tttcacttgc atccgcccag aattacctca tatccgggcg 31500
tggccgcggg aaaatcggcc gtttccgggt ctaaagtccg cttttttata cgtcatcagc 31560
cccgcgactt gcttccgggc taggccacgc ctccgcggcg accgttaacg ccgtgcgtcg 31620
tgacgtcatt tgcatcgtct tctctcgtcc aatcagcgtt ggctccgccc caaaaccgtt 31680
aaaattcaaa agctcatttg catattaact tttgtttact ttgtggggta tattattgat 31740
gatg 31744
<210> 11
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttgcatttc tcagtcctaa acagggtaat gggctggggc tgaatcacat gaaggcaagg 60
tcagattttt attattatgc acatctagct tgaaaatttt ccattaagtc aattacagtg 120
aaaaacctca cctggtattg aatgcttgcc ttgtatgtct ggctattctg tgtttttatt 180
ttaaaattat aatatcaaaa tatttgtgtt ataaaatatt ctaactatgg aggccataaa 240
caagaagact aaagttctct cctttcagcc ttctgtacac atttcttctc aagcactggt 300
ttatgcatgt atactatatg caaaagtg 328
<210> 12
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tacctttaat ccatctccta ctagaatagc tagcttgtta tctctgacat caaatggagg 60
tgctaaagcc aattccagtt ttttgtctgt tccaacttgc aatggagcct tagggtttac 120
acttaggttt ccactatctt gttccacagt tagtccccct cccaccttga gtgagacatc 180
cccattagtg atggcgattg ggtcagccag tttgagtgac aggaccccag gtgggaagtt 240
tttgaatcca tcggatgaga caaagggggg agtaaggaag gggatattct gattccgcgc 300
gtagccatag gggtagacgg ggttgaagtc atcttccacc cggagcctct ttgacatctg 360
agagggaaga caatgaaaat tgtggaccag gaatttgaca tccctttcaa ggtgtggagg 420
aagttcgccg cccgccgagg actggagtac cagagctggg aggagggtac cgaggtgctg 480
ctgaacaact acaccagaga catactttca gatttcaagt aagtgatctt tattgaatca 540
ttaattccaa tgatttattc ttatgagtaa ttgtgggagg ggaatggggt aaggggctga 600
ttggtttctg ggattttaat caacatcagt cgtagccgtc caccgcttct ctcactgcgt 660
cgaagttcgg tatgaactcg tccgggtaga ggcctggcga tcccgagaag gggttgaagt 720
agaccgaggg cacaaactcc tccacaaact ggagggttcc gatgcctccg gagcgaggct 780
ccgaagagct gctctgcaag gtcaggtagg cctggttggg agtgaaggag gatctcccgg 840
ctccggctag ttggaacact ccgtccggtc gcagaccgat cgaagagctc accaactcgt 900
cgttgagctg tgtgcctctg cctcggatca ccagggtttt tatacccgat tgtgggcgga 960
gcgggcaccg ggaagcgccg ccggccagct ggacacctga gttagtcatg cggacttcgg 1020
ccagtgcgtc acgcggaagt agtacggtag tcggcccggg gatttcctga tacaccaggg 1080
tggagggcca attacgcggg ttgagctttg ccctgggcgt ggaggtgacc gccgcctgct 1140
ccaacaatat ctggt 1155
<210> 13
<211> 1126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 60
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 120
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 180
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 240
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 300
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 360
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 420
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 480
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 540
ggaggtctat ataagcagag ctcgtcgacg agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 600
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg 660
cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc 720
ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcacttgag gtgtggcagg cttgagatct 780
ggccatacac ttgagtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc 840
ccaggtccaa ctgcagccgg tacctaatac gactcactat acggatccct gatcactgca 900
gaattcgata tcaagcttat cgattgcggc cgctctcgag tctagctagt ctagactagc 960
tagaaagatc cgggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1020
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 1080
tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcg gtgatcaccg atcccg 1126
<210> 14
<211> 38751
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaattaatt ggttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 60
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 120
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 180
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 240
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 360
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 420
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 480
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 540
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 600
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 660
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 720
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 780
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 840
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 900
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 960
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 1020
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 1080
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 1140
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1200
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1260
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1320
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1380
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1440
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1500
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gctgatgcgc 1560
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1620
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1680
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1740
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1800
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1860
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1920
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1980
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2040
gcattacgct gacttgacgg gacggcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt 2100
acgggccaga tatacgcaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta 2160
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 2220
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt 2280
ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac 2340
ataaacctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 2400
cactataggg agacccagcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 2460
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 2520
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2580
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2640
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2700
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2760
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2820
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2880
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2940
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 3000
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 3060
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3120
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3180
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3240
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3300
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3360
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3420
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3480
cgcattaata gggataacag ggtaatatac aaacgaggcc ctttcgtctt taattaacat 3540
catcaataat ataccccaca aagtaaacaa aagttaatat gcaaatgagc ttttgaattt 3600
taacggtttt ggggcggagc caacgctgat tggacgagaa gcggtgatgc aaatgacgtc 3660
acgacgcacg gctgacgctc gccgcggagg cgtggccgga catggaagcc attttggacg 3720
tgggcaagat ggcgccctac ggctaagtta catgtaatgg cggaagtgac gtaacgtggg 3780
aacccggaag ttgagtcacg aaatcgatac gaggaagtga gaacgcggaa gtgttttcgc 3840
gaaaaacacc cagggcgtgt gtgttttttt tggcggggtt tttagacctt tggtcattac 3900
gtcagtgtaa ggactgcctt taaataggga gctgggttag tgggtagtca gtcgctgctg 3960
ttggcgcttg tactgctgtg ctctctgtct actggtaagc gggctgcgct atggctgaat 4020
ctctgtatgc tttcatagat agccctggag ggattgctcc cgtccaggaa gggactagca 4080
atagatataa tttcttttgc cccgaatctt tccacattcc tccacatggg gtggttttgg 4140
ttcacctaag agtgagcgtg ctgattccta atggctacca aggcagattt atggccttga 4200
atgactacca ttccaggggc atactaaccc agtccgatgt gatctttgct gggagaagac 4260
aggagctaac tgtgctgctc tttaaccaca cggatcgatt tttgtatgtc cgagagggcc 4320
acccggtggg cactttgctg ctggagagag tgatttttcc ttcagtgaga ctggccactc 4380
tggtttagtg catgctttct gtttttcaga ctctcatctc tactaaccat gcttgagcga 4440
cgcgctgtca gctaccacat tgtggtccct ggggccctag tgacttattt agaggacttt 4500
tccattactg ctatgattag agagcaccta cctcgcttta tcactcacct cttggaagga 4560
atcaccggtg acacaaagag agcttattcc agcgtgcagt ttttgggtgc tagctttgga 4620
gctttaaagt actccatcac gcttgccagt cccacgctta gccctggctc tgaattggca 4680
tctgtagtgg ccgaggactt gagtgacttt ttacagctga cgctgagacg cgagctcagg 4740
gcagagggca gaaactcatt gaatcttgtt gttttgaaca tgctgcaggt ggtggagcag 4800
ccagatctgt tgctattatg aaggtctgcc tgattatgaa agtggagggg gcgctgtggg 4860
aacttttcca catgtgcgga gtggacttac accaacaatt tgtagaaata attcaaggct 4920
ggaaaaatga gaattacctg ggaatggtga atgagtgtaa cctgatgatt gatgaaatcg 4980
atggagggcc agcctttaat gtgattctta tgctggatgt acgcgtagag ccactgctcg 5040
aagccacagt cgagcacctt gaaaatagag taggttttga cctggctgtc tgtttccacc 5100
agcacagcgg cggggaacgc tgtcacctgc gtgacttgca ctttatcgtc cttcgagacc 5160
gcttggaata aaaatggttc ttccagttct tcccccacct cctctgaatg atagaccagg 5220
ctgcattaac tggattggga tggcctacaa tgtcctggct gatgtgttaa ggggaatccg 5280
catggacaga acttttgttt catcagatgc tgaggagctg ctcgagaacc tgcgggaatg 5340
gctgtacttc agttggatga ctgagcgtca gcagcggaaa gacaggagaa ggagaggtat 5400
ctgctgttca agggcccatt tctgctggca gaagtacgac aaggtacgca agagaatcca 5460
ctacaatgca aaccgaggat cagtcgagct tgctccgcca tcatccatac cgcagggccc 5520
gtttaccacg atctgatgag gagaccaggg cctcactgac tgaacaacac cccctgttgc 5580
ccgattgtga tcatgctgaa tatcataatg taagttctgt tcgcggatta ccatgtgctg 5640
ctggctttac cctgctccaa gagtttccag tcccctggga tatgattctg actccagagg 5700
aaataaaaat tttaaaaaga tgtatgtcag tgtgcctgtg ccccgctacc cttgacctgg 5760
tgagagctca gatggtgagc gggtacgagc gctggatcct gcattgccac tgttcatccc 5820
cgggctccct gcagtgtcgg gcgggaggca ccctgctggc cgtgtggttc aggagagtca 5880
tttacgggtg tatgttcaac cagcgcttcc catggtaccg ccagattgtg aacagagaca 5940
tgcccaaaga gatcatgtat atgggcagtg tgttcatgag gggcaggcac ctgatatatt 6000
gccgcatctg gtacgatggt cacgtgggtt ccatcatccc caacatgagc tttggctgga 6060
gcaccctgaa ttatgggctg ctgaataaca tggtgattat gtgctgcact tactgtgaga 6120
acatggcaga gatcaggatg cggtgctgtg cccgacgcac caggagactg atgctgaagg 6180
ctgtggggat catagtcaga gagacttgtg atcccgatcc catctgcagc agccgcaccg 6240
agccccggcg gcagagactg ttgagggcgc tgatggaaag gcacagaccc atcctgtttt 6300
ccgagtatga atctgtgcgt tcttctcgtt ccaccagact gtgaccttgg actgcgaggc 6360
ccgcttggat gacttttcag aggacggctt catctcaatc accgaccccc gtttggctcg 6420
ccaggaaact gtgtggctta tagacactaa atccagttct cgtgctaatc agaacattcc 6480
cctatttaag gccacccgtg ctgagagaat tgtttacact gtgaaatggg ctggtggtgg 6540
gagactgact acccgtgctg gtgtaaaaat caataaagat acatgaaaat tttcaaatga 6600
gaacatgttt attggtcttt cattcttggg cgatatagga gaaggtaaat gaagtagaat 6660
caaaagggat attgtcatag tccttggtcc atgaatagtt aaaagtgata gaataagcac 6720
tatctgcttc attattaaaa gtaattttaa ttacaactgg attatatggc tgattatcta 6780
agtagatatt tccatatata gtgttccttg cataaatttt agactgatca gttgtagctt 6840
tagcataagc tagtaaatta ggcataaatc caattgcatt tttatatggc tctggaagaa 6900
tagagtctcc acttctaaag tttaggtact gtttttcaat gtttgaattt tccaatagaa 6960
ctccattttg atcaaacagt agtttgatgt taaatgattt aggtagggat gggtctgttt 7020
tgttattaag gatcttgaac tttccgttga ctataattag agatacattt gccaaaatct 7080
gacttccgca ctttgtcagt accaaagtta gttttgagtc tttttctata tctatcttac 7140
aatttggaga agggtctaaa gttgtccaaa gtgtgcggat gtcatgttta ttgttccatg 7200
ctactaaata acctttatca tcaaaagtta aaccacctcc ttctccaatt ctcacacata 7260
aaccgactcc tttattgcta ccatcgtcat tttttaattc ttcatttcca attcctttgc 7320
cagtcaaaac tacaagatag tttaacaaac ctggcaaatc agatattgat ctatctatta 7380
cctttaatcc atctcctact agaatagcta gcttgttatc tctgacatca aatggaggtg 7440
ctaaagccaa ttccagtttt ttgtctgttc caacttgcaa tggagcctta gggtttacac 7500
ttaggtttcc actatcttgt tccacagtta gtccccctcc caccttgagt gagacatccc 7560
cattagtgat ggcgattggg tcagccagtt tgagtgacag gaccccaggt gggaagtttt 7620
tgaatccatc ggatgagaca aaggggggag taaggaaggg gatattctga ttccgcgcgt 7680
agccataggg gtagacgggg ttgaagtcat cttccacccg gagcctcttt gacatctgag 7740
agggaagaca atgaaaattg tggaccagga atttgacatc cctttcaagg tgtggaggaa 7800
gttcgccgcc cgccgaggac tggagtacca gagctgggag gagggtaccg aggtgctgct 7860
gaacaactac accagagaca tactttcaga tttcaagtaa gtgatcttta ttgaatcatt 7920
aattccaatg atttattctt atgagtaatt gtgggagggg aatggggtaa ggggctgatt 7980
ggtttctggg attttaatca acatcagttc atggggagaa ggtcgcggag tccgcaaagg 8040
gtcttgagga gggagtagat gcactcgggg ctttcgcagg agcagtggat gcaaccgctg 8100
gcctcgcccg actgctgggt gatgactatg gggttgatgc ccaccatgca ggtgaacttc 8160
tgcttctgct ggggcagctc ataggcgagg cgatgctgct tgccgccgga cacgagctcg 8220
taggtgatct ttgcctgttt gaccaggcag aagatgccct tcttgcactg gtggatgttg 8280
atggcatcaa ggagctcctt ggcggcccgc tcctgctgct gacggacgcg cagttgcagg 8340
atgcgctgct cggaggcctg gccgtccatc tcgaggtcca ggtggtcagt catcgccgcc 8400
ggttatgtga aagtagctaa cagtggaagg gggtcgggga gggggctctt ctaagtactg 8460
aatcagggga aactgatttc tgcggggagg aggtgtgggt ggtggcgtgg aggctagtga 8520
actgctttct agtgtgtatg tgaatgcctc aacagagttc cagccgagat caaaacaggg 8580
gtagatcatg atggcaaaga aagtgcagga gcagaccatg actatcccca caatcaccaa 8640
gtaataggat ggcatatcca ttttagcatc atagcagtct aagaaattcc atagctccac 8700
aaatttgcac ttagagtaat catcatcagc gagggcaggg gagaggaggg atagcagtat 8760
gagcagagtc tgcatggtca aatgagcctt aagattctgg ctacgttctc gtccctgtat 8820
tcgggactgt ggtggagata attgtagcgc gcgcagcacc agtcgatgag ctgcaggaag 8880
gtgacgacca ggcagacaat gctgcagacg caggtgcagg tgagcagggc aaagaggagg 8940
taggtgggga agggcccgag acagtcgggc gaggcgtgcg agacggccgc gaaggcagcg 9000
cacacgttga atagacagaa aaggatgtta aataggaaga acctaggaat catggctgaa 9060
tcaccatact gaaaaagaga agagaagatt ccttagaccc ccttccactt ggagaggctg 9120
aggatccccg attactggcc tgtagatggg tctcctagat ttttctctgg ctttgcagca 9180
gacaaagtac agaagaacca caagaataaa gatcccacaa acaaccagaa aagtaatttg 9240
aatatccaaa cctgagtaag gctggccatg catcaatgat actccggttt cattagtcca 9300
agcaagcgaa gttaaatttg cagtgctgct gaaggcactt gaggtagcct ctgtctgttc 9360
agtagtactt tcctctctta acaaatacct aaccaataca gtactattct gcactgtagt 9420
gtgagttgtg gtctcagtag ttgtactggc tgtggtggtt ggatgtgtag tgggtacagt 9480
ggtaggctgc gttgtcctaa ctgtgggagc cttagtagtt ggcagctcaa taattgtcag 9540
attataaaaa gataatttct gatactcata atttccagaa tcttcaaatg ttgtcttgtt 9600
atttttatat accatttttt tcatttcatt tttatagctt tctgccttga ttgtgccaga 9660
agtaatatta gcagtggcag taattgtaat gcttccatta ctgaagcatt tataggctgt 9720
aacattccat tcacagatat ttttccatcc atctttatga tatcttgtcc atgtagtttg 9780
tggataagtc ccattcaatg taattttacc acctctagtg acattaacat taatcattgc 9840
agctgaacta agtgtgacta tgctaatcag aacgcaagct gtgaaagcct tcatggttct 9900
gaaatgaaag tgactgagtc tcagtaagag aagctgagta gtgggtctac catatgattg 9960
tatgcccttg gacgcttgcg gcagcagatg tagcacagaa tgacaatgat cagagttatg 10020
aagcccgcaa tcacacccac cacgattgcc acagtagttg atggaatttt gtcattgtct 10080
tgattataat caatttgcaa ttcaaatctg tgtttctgat caggagtagt aggcctggtg 10140
tacggctgaa ttttcacatt ttgagaattc gtagtgttta cttttactct gtatcttttg 10200
ccgttgcctc cgtcattagt accatagtaa actccctcat aaagtttagt tacattgatt 10260
agggttaggt tttgattgtc acacttacag tttaacttat atccaggttc acatggtctt 10320
tttaaatcat catcatacca agtgaccttt ccatctggcc caagtaatgt taagttagac 10380
ccactagaaa ctgtaatcag ttttgcttca ggtgtgtgcg gctttagttt tgatggcctc 10440
ctgtgtgtcg ccttctgttt gtcattagct ttcttttgac ttgtctcttt ttgcccctcc 10500
tgtttctgcc caccctgttt atgctcattt tgtttttgcc cagtttgttt ttgttctgtt 10560
tgtctactct gatcttcgat tttcatctcc cctgattttg gaaaaccatc tgtcactaca 10620
acctcatacc aagttctttt agttccctgg tgattatagc caagataagc cccatcatgt 10680
gtaagattta taaacaacag tgtaagattt tgcacgtcac atgtatgatt aaattctgca 10740
tgttcaactt tttttccatc gcagaattta tttccttctc cgtcatacca agtaactggt 10800
attcctggag gtccaactaa tgttttattc tctcccatat taacatatac atactctgga 10860
cctgactgtg gctttacagt agcaggagga ggcggtataa ctatgacttt atagtcttcc 10920
ttatgagtac tctgtctatt ataacccatg tatgtccttt catgggtttt gttcacatga 10980
attagtgtaa ggttttgctc attacactca tgtcttattt gaggattctt aactgtattt 11040
ccatcacaga actgcattcc ctgtttatca taccaggtga ctggcgtatc tgagggtccc 11100
actaaagtta tattagccca ccatgtagca ttgatagtat gaaatcctgc ctgactaaaa 11160
gctacaagaa gagagagcag cacgatacgg atcactgtat tcatgatgct gtggaaagaa 11220
aaacatttat agcaattttt ccttttccag atttccatac ctgggcttgt gcctcaggaa 11280
ccatattata gcccctacca gcagacctga cattgcacag gccatgatca caaaagccaa 11340
agaaaaccca accatgttct ccttggtagg gggccacaag ccatgaagtc tagccacatg 11400
cagtgtgata tcacacatga cttcaaaaat gaatttgaaa ccgaaagtgt gatttccatt 11460
gctaccatgg acagtgaccg tgtagttctg ctcatctcct ggttcccaat cgcccaccca 11520
tgcatttccc atggtcttat tcttgaatgt gatgttgaga ggacatgtat gctcgcattt 11580
gatgactact gtgcatatca cactcctctc attgcctgtg gtgatgttac atcgtggctg 11640
ttcgtggcat gacagtacac ccccaaccag ggaaaggata atcagcaaga gccccttcat 11700
ggttcctccc aacaatgtat gacccagcaa ataaagattt tgatttcgat ccagcaagga 11760
aggtaataca gcaccgctat gcacccaccc aggaccaccc ctaaaatcaa atacccaacc 11820
gcttcaatat gtttaccccc ctctgttaga gagggaaccc agagctcacc tccggtttta 11880
ggagtgttag tatcagaaag aaggttagat gtttctggag cggctgtgct gctgccggta 11940
acgttcacca aagtgaaagt gtggaagcaa ggtccgctct ggcagtggta ggttccctct 12000
acaaaaggat tgtagagtac tagcttagtc tttctggtgg tgtaagttag tccactggta 12060
aggttgttgg gtatttcaat accgtcgttg gcgcaggtgt tggagaccgc gaaggaagtg 12120
ttctcaaaga gccagaggat gtatttgtcc cctggtctgc agttgagttt tacctcagtc 12180
tgattggtaa ggttgaaggt ctcgttgcga gtgcgacgac acgggatccc agagtattgt 12240
aggagtttag cttttattaa actcagcaca cagagtacag caaaaattct catgcaactt 12300
cggggtagga cagatgcagt agacggtgta ggtggtggcg ccccggtcac gctcgaccag 12360
gaagggttgc tgggtgaaga acctgaccag gtgagactcg gtggtgccct ctacggtgat 12420
ccgcactccg tgtgcagggc cgttggggtg ctcctcggga aactcaaagt agatgagtcc 12480
gcagctctcc cgggcgaagc agcgcaggcg gcggcagtgg tccagatgcc tcaaccgagc 12540
gagctcagcc gagtcaccat gggacattca gtcgtagccg tccaccgctt ctctcactgc 12600
gtcgaagttc ggtatgaact cgtccgggta gaggcctggc gatcccgaga aggggttgaa 12660
gtagaccgag ggcacaaact cctccacaaa ctggagggtt ccgatgcctc cggagcgagg 12720
ctccgaagag ctgctctgca aggtcaggta ggcctggttg ggagtgaagg aggatctccc 12780
ggctccggct agttggaaca ctccgtccgg tcgcagaccg atcgaagagc tcaccaactc 12840
gtcgttgagc tgtgtgcctc tgcctcggat caccagggtt tttatacccg attgtgggcg 12900
gagcgggcac cgggaagcgc cgccggccag ctggacacct gagttagtca tgcggacttc 12960
ggccagtgcg tcacgcggaa gtagtacggt agtcggcccg gggatttcct gatacaccag 13020
ggtggagggc caattacgcg ggttgagctt tgccctgggc gtggaggtga ccgccgcctg 13080
ctccaacaat atctggtttc gatgactgcg gaccccgttg acccgtgaga tcatcgaggg 13140
gccggcactg agccagttca tgcgggtgga gtagtcctgg gaggcgcccg cggccaggcc 13200
catctggggc tgatagctcc acatgtaagg tgtgggaatc tccttgctca tggtggcgat 13260
gaggtaattc ccgccttttt tccgggtggg cgcgccttag tctttaagag tgagcgcgca 13320
gtacttgtgg aacagagcct cggcgtcttc gagagtgcgc tgcagctgat cttcgttttt 13380
gtggtacaag caactgcggg tgagcgagcg cagagaccga ttttttactt tgagctcttg 13440
ctgctgacct cgactctgct gaaaaatggc ataaagagtg gggaagatcc ggttcctcag 13500
ctccctggtg gtcaatggct cgttcgccgc gatcctcagg cctcctcctc ctccggcgac 13560
tcctcttact tgctttttct tagctgtgaa ggtgacggta gtaatgcaac acgttgcggg 13620
ggatgttcac cccgcggtgg aagagcaggt agcggcgggc gaaagcgatg ttccccccgc 13680
agtcttgcaa gcaggcgatg atcgcggctt tgtgggccct ccatgatcgg tagccctgcc 13740
gctcgtgctt accgtcaccc ttcactcgat cccatctacg aggaggcttg gccggagctg 13800
cggaggttgt atccgtgacc gccggggctg ccggcgcgga tggtgcggcg acgggctgct 13860
ctgttgcctg ctcctcttcc acctcttcca attcttcctc ctctgtactc tcctcctccc 13920
attcttcctc ctctgcctgg ctgtcccatt cttcttccat ctcctcctcc actagcggct 13980
tcttcctcgg catgctgggg gagacccggg ttgagcacct cgcccgtctg ggggtccagg 14040
tagacccctc tacccttttt cagaagaaac tcttggcggg atttttggat ggcgtgcaat 14100
tgggcgagga tggcgccctg ggtgatgacg caggccgtga gatccgcgtg ctgcgggcgc 14160
gattggtcct cgaagaactt tatctcgtgg gcgtggtagt cctcgggtac aaatttgcgc 14220
aggtacgcgg aagtccacaa ccccggcgtg agtttcagcg gagcggtgga ctcctgcgga 14280
ccttgcagct cgaaggtacc gatgacctgg gtttcgctca ggagctgggg gttgcagacc 14340
agggagcggt gcggggagca caggttgcag cggcagtggc actcgagcag cccctcgccg 14400
ctcacgtcct cgatcacatc cgagtggtag gcgatgtagt tggccagctg caagaggtag 14460
cagtggctcc acagcggcgg gggacactcg cggtagctca gcgggacaaa gtcggagggg 14520
aaggcgttgc aggtggcggg cagcatccca gatcgctcga gaatgaaagt gcggtagttt 14580
tgcaacatgc tctggctcat gaagtcgggc agcccgcctt tcagcgtctg cctcaggcgc 14640
tcggggaaaa cgatctcggc caggtcggcg gcggtggtcc gctcgtcgaa gcccgtccac 14700
agctttttga ggtttctagc aagaagcttg tccagctcct tcaggttctc gtcctcgaga 14760
cactgctgcc acacgcccat ggccgcttgc caggtgtggc agaggaatag aaagacgcag 14820
tcgcggacgt agtcccgccg cgcctcgccc ttcagggtcg agtggagcac ggtctgcccc 14880
aggcggttct cgtgcaggat ccccaggcag gagaccaggt tggtcagctc cacgttggag 14940
atcttgcagg cctgcctgac aaaaccgtgc ctgaaagtgt agtgcagggt ctcctcgacc 15000
ttgcgcaggg tctcggggtc gctgaagaag cgacgcatgc attccagctc gagggtgacc 15060
aggaccacgg ccagcatgag cttgcgccgc tgctccaggg cctgggggtc gcgggtccct 15120
agccagcgcg cgagcatctc gtcgctgacc acgggctggg cgtcctcggg gcgctgctcc 15180
tgactttcat cgagggcctc gatgtggggc atgatgagct gatccatgat gcgacgcatg 15240
accttgggcg ggaggttgac ggcggggtag gcgaaatggg tgagctcgac gctgcgcttg 15300
agcacggcca gcctggcgtt gtcgccttcc aactctacca gggcgctagt gtgaccctct 15360
tcctctgctg tttctttcag agcgttcgcc gcgcgtgtct cgtcccgacc gagcccttcg 15420
aagatcttgg gcacctcttc cagggaagcg atatcaggta tgcacgcgcc gggccccaga 15480
gcgaggagcg cgtcggcgcg ggtgcggttg gcgcggcagg agacggggat cttttggttc 15540
ttgaaaaaga tgtgataggt ggcgagggcc tcggggaccg cgaagacggg gtagaagttg 15600
agacgcgggt tgggctcgca ggtgccgttg ggctggcgtt tggggggcac gcgcggcgag 15660
aagaggttga gctcgtaggc ccgacacagc tcctcgacgc tgaggggggt ttcgctccgg 15720
tcggccaggg cgtcccggag gatgagggac tggcgctgca ggtgtttcag cagcacatcc 15780
tcctctcctc ccaggtagcc atgctcgagc ccagcgtcgg tctcctcctg gcctgcgtct 15840
tgctcgtgct cctgttcatc ctgtgggggt tctagacgag ccggctcttc caagcccagg 15900
tcctgctcga ttttgggttg ctcgtgggtg gttaagtcct cctcctgctc ctgcttacgc 15960
ggctccatct tcccctagga aacaatggcc ggcggcagtc aggacgtgcg ccggttcatg 16020
gaccgagagg ccactccgcc ccggggccac ggttcagcgc gctatccgcc ggagcaggag 16080
aggagcccct cgccgccacc tcctctgccc accaagcgcc gaaagtatca gcgggtgggc 16140
tccgggtctt ccgaggagga cgtggtcccc gtggacagcc ctccaaaaaa gaagcaagcc 16200
aggaagacca agcatgtgac caaggtagac cccgacgaag agatgcccca ggaagatgcc 16260
gtgatcgtgg gagtgggatt cagccagccg ccggttctgt tgaaggaagg caaggacgga 16320
aaacgcatcg tcgagccagc gacccccggt attctgaacg tgcacaaccc cctgagtctg 16380
cctctggtct cgtcctggga gaagggcatg gatgccatga acgtgctgat ggaacgctac 16440
cgcgtcgaca gcggcctgcg cgatgcttac aagctcatgc ccgagcagac cgagatcttc 16500
caaaagatgt gccagacctg gatgaacgag gaggcccgcg gtctgcaact gaccttcacc 16560
acccagaaga gctttagcac catcatgggt cgcctgttgc aaggttacat cttcagccat 16620
agcgggatcg cgcataagaa ctgggagtgc accggctgcg ccctgtggga tcacggctgc 16680
accgaggtgg aaggccagct caagtgtctg catgggacgg tgatgatcca caaggaccac 16740
gtggtggaga tggatgtgac cagtgagaac ggacagcgcg cgttgaagga gcagcccagc 16800
aaggccaagg tgacccagaa ccgctggggt cggagcgtgg tgcaactgac cagccatgac 16860
gcgcgctgct gcgtgcatga tgccgggtgc gggaataacc agttcagcgg gaagagctgc 16920
ggcctgtttt tcagcgaggg ggccaaggcc cagcaagctt tcaagcagat cgcggccttc 16980
gtcaaggccc tctacccgaa tatgcagcgc ggcgcgggga tgatgctgat gcccgtgcac 17040
tgcgagtgta accacaagcc tcagagcgtg ccattcctgg gccgccagct gtgcaagatg 17100
accccgttcg gcctgagcaa cgccgaggac ctggacaagg atcagatcag cgacaagagc 17160
gtgctggcca gcgtcaagta ccccagtctg atggtgttcc agtgctgcaa ccccgtgtac 17220
cgcaactcgc gcgcgcagag caccggcccc aactgcgatt tcaagatctc cgccccggac 17280
atgctgggcg ccctgcagat gagccggcgc atgtggagcg agaccttccc cgagattcct 17340
gtacccaaac tggtgatccc cgagttcaag tggcagccca agtaccagta ccgcaacgtg 17400
gccctcccca gcgcggcgca caacgacgag cgcgagaacc ccttcgactt ttaaataact 17460
tgcatatact ccagtgcatg taaaataaaa gtgctgttta ttgagataca cgcagttgtt 17520
tcattttatc aaaagcggtg gcgtgttcga tggcggcgcg gtgggagcga aagtaggggg 17580
agtgacgcgc gaggaagcgg tagagctcct cctggttgcg ccggagggtg ggcagcacct 17640
gtggcgactg tagcatgccg ttgggcaccc ccgtcagcaa gttcatggtg gggtttccgt 17700
ccatgggtcg gtcgggccag tgcacgaagg catgcaagaa catgcaacag aaaagtccgc 17760
aggcggcgga gtcgggcccc tgcacggtct gggtggactg ctcgagactg agacagcgat 17820
cgggcgagga ggcaagcgcg ctgcggcgca gcatggcctc gtactcgaag ctgtaaatct 17880
gcttgagccg gcggtccgag aacccaaagg ggtcgaacat gtagcaggtg cgcgagcgcg 17940
ggttccagcc gaaggcgagc cagtgcacgc ctccggtctc gcggccggcc gtgttgacga 18000
tggcgcaggc cagcttgttg ccggcgagga agcccgggaa gcgcttgtcg tgggtgccca 18060
aaaagtaggg cccgcagccc aggtcgcgca cgatggccgc gagctctcgt tcgctggagc 18120
cgctcatgct taggtggtgg cgttgccggc ggagaagggc gtgcgcaggt agacggcctc 18180
gatgacgccg cggtgcggct ggtgcactct gaccacgtcg aaaacttcga agagaagata 18240
gaggagggtg ggctcatcca tggggtccac ctcgaaggtc atgtcgagcg cgtgggccga 18300
gttggcgtag agcatgttct gacccaggtc ggtaagggcg cccatggaca tgaagttgct 18360
ggagaagggg atgcgccaca tgaccctgtc gcagaggaac tttttctggg tgacggaggg 18420
gactgcggtg gagccaatga gcgggtaggg gaagttggcg gggtagggct gtccctgacg 18480
catggtgggt gcgaggtagc cggtgaagcc cgagttgttg tgctggaagg gcagggtgac 18540
tgccttgtag tccttgtagt tgatctcatc gaccacctgc ctgctcatgg gctggaagtt 18600
gcggaagaag gagtacatgc ggtccttgta accctcgggc acgtaaaagc cctggtagcc 18660
gatgttgtag tgggagagca tctggacgag gaaccagtcc ttggtcatgt tgcattgggc 18720
cacgttgtag ccctccccgt cgacgctgcg cttgatctcg aactcgttcg gcgtgagcag 18780
ccggtcgttg ccgggccagc tgaccgagga gtcgaacatg atggagacct tcttgaaggt 18840
gtggttgagg tagaaggtcc cgtcgaggta ggggatggag cccgagtaga caaagtaggg 18900
gtcgaaaccc gagccgaggg aaggagtttc cttggttttc aggcgagtga aactccagcc 18960
gcgaaaggcg gcccagttgc gcgaggggat ggagatgggc acgttggtgg ccttggccgg 19020
gatggggtag agcatgttgg cggctgagag gtagtcgttg aaggactggt cgttggtgtc 19080
gttgcgcagc atggcttcca gggtggaggc ggtgttgtgt gccatgggga agaaggtggc 19140
gtagaggttg acgctgtcga agcggacgga ggcgccgtcg acgcgcaggt cgttgccaag 19200
ggaactctgc aggatcatgt tgacatcctt gcggaagttc cactcgtagg tgtaggagcc 19260
cgggagcagg agcaggttct tgatggcaaa gaacttttgg ggcacttgga tgtggaaggg 19320
cacgtagcgg ccgttgccca gcagcatgga acggtagcgc agacccgcgt tgcggtggtg 19380
gttgaagggg ttgacgttgt ccatggggtc cagggaccag cgcgcgccga tgttgatgta 19440
ggcgtccacc agcgaggggg ccaccacgcg gccgttcatg tactcgtagg tgttggtgtt 19500
ggtgggcagc gtgacgttgg ccggcgtgta cttgtaggag tcgggcaggt acagcgccac 19560
gttcgagtac agaaaactct tccacaggtt ggcctggagg ttgatctcca tggcgtagat 19620
gttgcccttg catatttggt ttcgatctgc cacattggtg tctttttccc attcgctctc 19680
ttgatcccca tcttgtccat ttttaacttt tacaccttca taagcagcat tggtgccaga 19740
cccatccaat gggaagcaat agttgggaag ttcatcttcc acaccgtgat tctcaatgat 19800
cctgacatcg ggatcatagc tgtccaccgc agagttccac atgctaaagt acctggttct 19860
gtcgcccaga gaatctagca agagctggta agacagctct gtgtttctgt cttgcaagtc 19920
gaccacagca ttcaactgag aagcctgacc ggccagcaca cccatgttgc cagtgctgtt 19980
gtagtacatg agacccacaa agttgtccct gaagccgatg tagttaggtc tgttgggcat 20040
ggactgctga accaagttga tttctgaact gtcatcatct ttgcctggtt tatacaccac 20100
gtgggtgtcc ggggtttcaa gattaacatt ttcagtgcac ataacaatgt ctgctttgta 20160
ttccgttcca ccacctgtta aagttcctcc cggagtatca aagaatgcta ggtctatgtc 20220
aaaatcttct tgactttttt cagggtctct tagttttgcc tgtcctcctt tttcatttgt 20280
gggtctggca aatgagccat agcatggttt catcttggtt tcctttttaa gagcccttcc 20340
tccatagaag gcttctgttt cctgccagtt ttcttctcct acttgaggct ctggttgata 20400
cagcttatta gcatatatcg ggtcttgttt gccatttgta gtatctgttc caatttgcaa 20460
accgctaatt gtaatgtttt ctccacccat aggagctaca ccataagtat gtgtttcctt 20520
ttgatctcca gcattggcct ttttctgttc ccactgactg gagttggggg cgcccttggg 20580
ggccagactg ttgtaggccg tgcccgagta gggtttgaag ctgggaccgc ggtccaggac 20640
gccgcggatg tcaaagtaag tgctggccat gtctagcacc cggttgtcgc ccacggccag 20700
agtgaagcgc gccttgtacg agtacgtggt gtcctcgcga tccacgggca cgaagcgcag 20760
cgtcagacgc tgggaccggt ccgtggtcac atcgtgggtc ggggccaccg tggggttcct 20820
aaacttgttg cccaggctga agtacgtgtc ggtggcgcgg gcaaactgca ccagacccgg 20880
gctcaggtac tccgaggcgt cctgcccggc gatgtgcatg tacgcccact gcggcatcat 20940
cgagggggtg gccatcttct tctctggcgg taaggcacat acaagttaag ctctcccttt 21000
agtgtcctct ttcctctctc aaaagcatcg gcggcgcttc agacttttca ctcccaggcc 21060
cacgatactg tgcagcgtgc tctgccagtt ctgggcctgg cggcgggcgg ggacgcggcg 21120
cacggcggtc gccaccgggg gggcctgcac gaccggagct gccttaggtg gagcgggcgc 21180
gggtggtgga ggcaggtcaa gggtggcagg tttcatcaca cccgtggcca gcggcgcgat 21240
gatgcgcgtg gtgggcatgc cggccttgac ggcctcctcg tacgagggcg gctcgtccac 21300
ctgcagggta gtctcctccg cgtcgggccg cggccgcttc tcgcccctgg gcggaggatg 21360
cgcgcttgca tcttccatct ccaccaccgt ggcggcgggc gggcgcgggt ccaggcggct 21420
gtttatctcg cgctgcacgg cctggttcgc gatgtccacc accccgttaa tgcccgaggc 21480
cagcccgtcc accaccttct gctggaagtt ctggtctgcg agcttttccc tcaacatctg 21540
ccccgtgcta ctattccagg ccttgttccc ataggtccgg agcgtcgagc cgaaattttt 21600
aagcccgctc cagacactgc tccaattgaa ggcgcccccg ttcagctggc tggtgccgat 21660
ctcgttccag gtgcccatga acggccgcgt gccgtgccgc ggagccaggg acgcaaaatt 21720
gatgtcttcc attctaaaaa tatacaggac caggtgtgtc agagtctaaa gaggctttat 21780
tcgcacatca acggcgctgc gacgcctgca gcgcaacgga agctatgccc gggatcgtgc 21840
cgatggccgc ggcgattata gggatgagcg cgggcaggaa cccgccactc aggcgcctgc 21900
gcatggcccg ccgccggcgg cggttcaggc cgctgcctgc catgcctctc ctgcggcggg 21960
atcttcctcg gtaattcggg actgggatgc gcaggcggca agtgagagcc atctctctgc 22020
aacagtatca cagcacacgg attaaaggat gctggggtgg tagcgcacgg tgggcagaac 22080
gagcgagcgg ccccggcgcg tggtgacgcg gcgcacgcgg gcgggggcca gacggcggcg 22140
ggtggtggtg cggcggcggc gtttgctggc tgggcgcctg cggctggcgt agtaccgggt 22200
gccgcggtag cccggcgtcg ggatgatgga aggatgcaac acgtagttgg gcatcagccg 22260
gctggcggcg ccccatcttc gcctcctggg aggctcggta gccgtggcgg cggtagaagt 22320
ggagacggta gcggtggagg ctgggagcca ggggtcggtc tgcacctcga tgctggtcga 22380
gggttttttg tcgacatcca tgtcggtggg gatctgaatg tccacggtct gcacgcccag 22440
gcccggcgcc acctgcttga tggggcgcac cttgacctcg ggctccacat ccattttcac 22500
ggtgtccagc acgtcctcca cgcgccggcg cttgggcacc atgatctgca tggtcgggta 22560
catgctctcg ccctcgcgct tgaccccgcg gctcggcagc agcaccgcct ggggcagcac 22620
ctgctgcagg gtcacgggct tcaggctcgg cgtggggttg ctctcgtcca gcggcagcga 22680
gatcagctcc tcttcgcgcg accgcttccc gtaggcgaac tcgcctgccc gctccgccgc 22740
ctggtccagg atgtcgtcgt cgccgtacac ctcgtcatag ctacgcttgc tcctgaccga 22800
ggaccgctcg ccgggcgtga acaccaccgc cgtgccgggc cgcaacacgc gctgcaccct 22860
gcgccccttc caatttacgc gccgccgcgg agcgaactcg cgcacaaact ctactgcccc 22920
ctcgtccacc tcatcctttt ttttaacccg cttgattttg cggggtttct ggtccgcctg 22980
gggtggtccg taaatctccg gggcgacgac ctggagcatc tcctccttga ttttgcgctt 23040
tgacatcgtc gcttgcgggg gaggacacaa gcattagatc agggacgagg aggacgggtg 23100
cgcacgggca cgcgcacgcc cgtgacggag tcgcgcaccc agtacacgtt tccgcgcctg 23160
ggtctggtca tgctagagat ggccgcggcg gcggcggcgg ccgctcgtct gcgagtcctg 23220
cctgcggggg gtgcagtggc agcgcggcgc gcggctcgca tcatggcccg gcggcccgtg 23280
cgtctggcgc ggcgcagtag agcccgggcg gcgcgcatgg cgggcgtgct ccggtggcgc 23340
ctggcgatcc gtcgccgccg actcttgcgt ctggcatagt cgcgcgcgtc ggccaccacg 23400
ctgtcaatga ccgcgtccac ggtcgagggg gcgggggtgt agttgcgcgc gtcggcgacc 23460
accgagtcga tgacgtcgtc aacggtggtg cgcacggcag cggcgggagt ccgcccacgc 23520
ttgtaagcgc cccagggagc gcggaagtgg ccgcggacgc ggacggggtg ctgctgggag 23580
cgcttcttgg ctcctccgta catggtgctg ggcctagtaa gaccccagcc ggtgttattg 23640
ctgggcgaga tgagaataga cattttttag aaggtgcgac tggaaagcac acgcggcgcg 23700
actatgccca gggccttgta gacgtaggga caggtgcggc gacgggcgtc agtgacggtc 23760
actcgctgga ctccgcggat actgctgcgc agcggtagcg tcccgtgatc tgtgagagca 23820
ggcacgtttt cactgacggt ggtgatggtg ggcgcgggcg ggcggcagag gatctggttg 23880
tcggggaagc ggttgaagac gtgggtgagg gaggtgtagc tgcggatgag ctgggagtag 23940
acggcgaggt cgttgtaaaa gctcttggcg cggaagggca tgagctcggc gccgaccacg 24000
gggtagttgc tgacttgctg ggtagagcgg aaggtgaccg ggtcttgcat gaggtccggc 24060
agcgaccagt agacttgctc cgcgccgcaa gtgacgtccg gggtggtgag cagcgtccac 24120
gactgcaccc ccttctcggg gtccccgtag gtataggaca ggtaccagct tcggtacagg 24180
gtgtcatggg tgtccttgat caggttgtaa cttctgttgc tctcatcctt ttcaattggt 24240
acgatcacta gctccttttc agctgctttt tcttgagcta cagtgaggtg ggtatcgcct 24300
ctagtgacag caccatctcc ctgatgcttt gcagcttcct tggcagcatc ctcaagttcc 24360
ttcttgctat ccagatattt tttggtatcc aggagagcgg ggatgttacc cccttctaga 24420
tcctcataca tgattctgaa gccctcttgg aaaggttgct tcttgcgaat gcccaggaga 24480
ttgctcaggc ggctctcggt gaagtccacc ccgcagcccg gcagcagcac cacgtccggg 24540
tggaaggcct cgtaggtgta gacccctggc ataaccagct tggtcaccgg gtcccagccc 24600
agcttgaaat tcctgctgtc aaacttgact ccgatatcgc tctccagcac gccattttgc 24660
cgccccactt gcaagtagtt ttccaagatg gcgttgttca tcaggtctat ggtcatggtc 24720
tcggaaaagt tgccctcggg cagggtaaac tcaaaccact catactctaa gatatccttg 24780
cttaaatctg ttgcttctac cccctgtggg tgtttcctag ccaccatcac ccgcgcctta 24840
aacttgctgg tgaacatgta ctcgttcaca ttgggcatgt tggtgtgcag aatggtcttc 24900
agatcaccgc cccaccgcga ccgctcgtca aaatttatcg tctgcgtgct ggcctcggcg 24960
ggggtgaaat cgttgttctg caccaccgtg gtcaggaagt tgctgtggtc gttttggtag 25020
ttcagggaag cgatgtccgc cgacttgttg tccaccaagt acacgcgagt ggtgtcgtac 25080
tgcggagcca gctccgagta acgaatgctg tttctgccct ccgtaggagc catataccgc 25140
ggaggcacaa acggaacctc cagggtcgcc tgcgccatca cgctctcgta cgagggagga 25200
ggagaggaag acaccaccgc acgcctcatc tctaacaagg aagagaacgc acgctatggc 25260
cttggtgagt tttattttgc atttcaaaac atccgccgcc ccagtttggg ctgcagatgc 25320
gcgaacgggt tggccccacc gctcccgccc aagtccagca cgctgctatc gtcggccgag 25380
tcctcgtcgt cccacaccag gccccgctgc cggtcgtggc gctgtcgccg cggcgcgggc 25440
gcgtccctat ggtcctgagc gtaggtcttc cagcggttca gtttgtccac cagactctct 25500
atcccgttat tggccatggc gttcttggcc cgcggcggct gcagcagcga gtcgttcagg 25560
tactcgtcct cgcccagcaa gcgcggtcgg ctaaccctgc cgctgttcac cgagcccggc 25620
aagctatgca aactccctaa gctaggaaag gggcttcttc ccacagcgcc ctcgctcggc 25680
gtgcgcactg cttcctgtct cttttgaaag gcgggcgaga acaccgcgct gtccacgtcg 25740
tcccacagga acccgtcgtt gggatcgggc atgtcgtact cgcccgtgta gaaccccggc 25800
ggcgggagcc agtgcgggtt caatatggca ttggtaaagt agtccgtgtt catggccgcc 25860
gcgcggtgca ggtagtccat cagcttattg atgaacggcc ggttggcggc gtacatgcta 25920
ggttccatgt tgcgcgcggt catgtccagc gcagcgctgg gggtggcgcc ctcctgcatc 25980
aggaacagcc ctacgctctg ctgcacatat ctcaggatcc tttcctcctc ggccgacagt 26040
gcgtactgcg ccgggatctt ctgctgtcta ttggtcagca aaaagttcag ggtggccctc 26100
agactgtcgg tgtcgttctg ccccagcgcg cggctcacgc tcgtgatctc ctggaaggtc 26160
tgctcgtcca cctgcgcctg gcctatggcc tcgcggtaca gcgtcagcag gtggcccagg 26220
tacgagttgc ggttcacgct gccgctgtcg gtgaagggcg cgatcagcag cagcagcagc 26280
cgcgagttgg gcgtcagcaa gctgctcacc gtcgaccggt cgcccacggg cgcctgcacg 26340
ccccacagcc ctcgcaggtt cttgaaagcc tggctcaggt tcaccgtctg caagccctgc 26400
cggctcgtct ggaaaaagta gtccgggccc gactggtaca cctcgctctg gggcacctcg 26460
gtcaccatca gccgcagcgc gctgataaag ttggtgtaat cgtcctgccc gcgcggcacg 26520
ttcgccggct gcgtcgccag gaaggcgttc agcgccacca gcgagcccag gccctcgttc 26580
ttgaaccgct cgcgctgcgc cacggcctcg cgcacgtccg tcaccagccg gtccaggttg 26640
gactgcacgt tcgtgctgtt gtagcggccc acgcgctcca gcagggcgtt gtacaccagc 26700
ccggcctcgt cgggacggat ggccttgttc tccgccagcg cgttcacgat cgccagcacc 26760
ttctcgtgcg tggggttggt ccgagagggg accaccgcct ccagaatggc cgagagtctg 26820
ttggcctgcg gctgttgtct aaaggactcg gggttgcggg tcgtcagggc catgatgcgt 26880
tgcatcgcgg cctcccagtc gtccgatgct agaccggacg gctggctttg cagcgccgcc 26940
cttatggcgg ggtccggggc ttgctgggac atctaaaaac acatcacgga ggcgtcagta 27000
ccccgcagcg ggtgcatcct cctcctcttc ctcttcctca tccaagtcct ctggaccgta 27060
ggcggcctcc aaggcgcgcc ggctcggctg ccaatgcagg tccgccccca tgtcgaagta 27120
ggactcctcg ccgccggcgg cgccccctac cagcgcccgg cgcaggctca gcatcagctc 27180
gcggtcgctc agctcgcgcc gccggctcgt gctcacggcc ttgtggatgc ggtcgttgcg 27240
gtacacgccc aggtcgtcgc tcagcgtcag caccttgagc gccatgcgca tgtaaaagct 27300
gtctatcttc acctccttgt ctatgggcac gtacggcgtc ttgtaaatct tgcgcgcgta 27360
aaacttgccc aggctcagca ccgagtagtt gatcgccgcc accttctcgg ccaggctcaa 27420
gctgcgctcc tgcactacga tgctctgcaa gatgttaatc agctccagca gccagcgacc 27480
ctcgggctcg gcgatgttca gcagcgcctc cctgaacgcc tcgttgtccc tgctgtgctg 27540
caccaccagg aacagctgcg ccgtcagagg cttgctgtct gggttctgca cgatggcctc 27600
cgccaggtcc cacaggtgca tcagacccag ggccacctcc tcgcgcgcga tcagcgtgcg 27660
cacgtggttg ttgaaactct tttggaagtt gcgctcctgc ttcaccgtct gctcgtaggc 27720
cgtcaccagg ttggccgccg ccacgtgtgc gcgcgcgggg ctgatccccg tctgctcatt 27780
cggctcgaaa tcctcgtcgc gcagcacgcg ctggcggtcc aggccctcgc gcagctccct 27840
gcccgcccga aaccggcagt cgcgcatctc ctcgggctcc tccccgctgc ggtccctgaa 27900
caggttctgc gcaggcacgt acgccgggcg cacgtccttc tgcagctgca cgcgggggtg 27960
tcgctccggg gacggcgccc ccagtcttgc cagcccttcg ccctcttcca agtccatctc 28020
tgtctgtggc tggctagcgc cggcgcctgc tacggccgcg gtcgcggtgg tcgccggggg 28080
ggtgggacgc atttggcgca ggacgggatg catctggcaa aaagaaaaaa gggggctcgc 28140
tcccgtaact ggagaagtcg gctggctgtg ggtctttaaa tcggcggggt gaccaagtcc 28200
cgctcgccgc ggccgtcctc gaaccgggtt ctgccgcgac tcaaccctgg cgatgcttct 28260
ccagactacg ggcgcgagcc actacccggc agggttttcg gtcgctttca agtctagcga 28320
cccccctcgg ccagcaaaaa gggctctccg ccgtatcctg gcggctatcg ggctcgggtc 28380
gagacgggag tgccaatacc acgttagtcg cggctccagc ctgattcgag gggactcgaa 28440
ccggggtaca cacgcggcct aacccgtttg cgttccgcca ggctacggag gaagagcccg 28500
ctcaaccgct ttcgtttttg cctctagagc gtcaatgact gcgcgcgtct caccggccag 28560
accgtgccga ccatggacta tttcctgccg ctgcgcaaca tctggaaccg cgtccgcgag 28620
ttcccgcgcg cctccaccac cgccgccggc atcacctgga tgtcccgcta cctctacggc 28680
taccaccgcc tcatgctcga ggacctggcc ccgggcgcgc cggccaccca gcgctggccg 28740
ctctaccgcc agccgccacc gcacttccta gtcggctacc agtacctcgt gcgcacctgc 28800
aacgactacg tcttcgactc gcgcgccttc tcgcggatca ggtactccga ggtcgtgcaa 28860
cccggcctgc agaccgtcaa ctggtcgctc atggccaact gcacctacac catcaacacc 28920
ggggcctacc accgcttcgt cgacatggac gacttccagg acaccctcac ccgcgtgcaa 28980
caggccatcc tcgccgagcg cgtcgtcgcc gacctggcgc ttgtgcaacc gctcaggggc 29040
gtcggggtca cccgcatgga agactccgcc tccgccagtg atgacattga gaggctcatg 29100
catgactact acaagaacct gagccggtgt cagggccagg cctggggcat ggccgagcgg 29160
ctccgcatcc agcaagcggg acccaaggac ctggtcctcc tcgccaccat ccgccgcctc 29220
aaaaacgcct acttcaatta catcatcagc aaccgcaatt ctaacagcgt ccacggggct 29280
actacgtgtt tgagcttacc ttgcgactgc gattggctag acgctttcct cgaaagattc 29340
tccgatccgg tcgatctcga cgcgctcacg tcccctacac cgcaattgat aagatgcatc 29400
gtcagcgccc tatcgctgcc caatggggac ccgccccatt accgggagat gaccggcggc 29460
gtcttcacgc tgcgtcctcg cgaacggggt cgcgccgtca ccgaaaccat gcgtcgccgc 29520
cgcggggaga tgatcgagcg cttcgtcgac cgtctcccgg tgcgtcgccg tcgtcgtcgg 29580
gccccgccac caccaccgcc cccagaggaa gaaatagaag aagaggtcgt catggaagaa 29640
gaggaagagg aggaggcccc cggggatttc gagcgcgagg tgcgcgccac catcgccgag 29700
ctcatccggc tcctggaaga cgagctcacg gtctcggccc gcaacgccca gtttttcaac 29760
ttcgccgtgg atttctacga agccatggaa aggctggagg ccatcggcga catcagcgag 29820
atgcccctgc gccgctggat catgtacttc ttcgtcaccg agcacatcgc caccaccctc 29880
aactacctct tccagcgcct gcgcaactac gccgtcttca cgcggcacgt ggagctcaac 29940
ctcgcgcagg tggtcatgcg cgcgcgcgac gcagacgggg acgtagtcta cagccgcgtc 30000
tggaacgaga gcgggctggg cgccttctcg cagctcatgg gtcgcatctc aaatgacctc 30060
gccgccaccg tcgagcgcgc gggccgcggc gatctccagg aggaggagat cgagcagttc 30120
atgtccgaga tcgcctacca ggacaactcg ggcgacgtgc aagagatcct gcgtcaggcc 30180
gccgtcaatg acgccgagat tgattctgtt gaactgtctt tcaggttcaa agtcacgggg 30240
ccggtggtct tcacgcagag gcggcagatc caggatgtca accgccgcgt cgtcgcgcac 30300
gccagcgctc tcagggcgca gcaccgggac ctgcccgagc gccacgccga cgtgcctctg 30360
ccgcccctgc ccgcggggcc ggaaccgccg ctgccgccgg gagcacgtcc gcgacaccgc 30420
ttctaaaagc gcaccgcggc acggtcgtgg ccccgcgcag ctacgggctc atgcaatgcg 30480
tggacacggc caccaactcc ccagtggaaa tcaagtacca tctgcatctc aagcacgccc 30540
tcacccgcct ctacgaggtc aacctcagaa ccctgccccc ggacctggat ctccgcgaca 30600
ccatggacag ctcccaactg cgcgccctcg tcttcgctct ccgcccccgc cgcgccgaga 30660
tctggacctg gctcccgcgc gggctcgtca gcctctccgt cctcgaggag ccccagggtg 30720
agtcccacgc aggcgaacat gaaaaccacc agccagggcc gccactcctg aagttcctcc 30780
tcaagggacg cgctgtgtat ctcgtggatg aggtacagcc cgtgcagcgc tgcgagtact 30840
gcggacgctt ttacaagcat cagcacgagt gctcggttcg ccggcgggat ttctactttc 30900
atcacatcaa cagccactcg tccaactggt ggcaggaaat ccagttcttc ccaatcggct 30960
ctcatcctcg cacggagagg ctctttgtca cctacgatgt agaaacctac acctggatgg 31020
ggtccttcgg caagcagctc gtccccttca tgctggtcat gaaattctcc ggggaccccg 31080
agctgatcgc cctggctcgc gatctcgccg tgcgcttacg ctgggatcgc tgggagcggg 31140
accccctcac cttctactgc gtcacaccag aaaagatggc cgtgggccag cagttccgcc 31200
tctttcgcga cgagctccag accctcatgg cccgcgagct ctgggcttcc ttcatgcaag 31260
ccaacccaca tctccaggag tgggcgctcg agcagcacgg cctgcaatgc cccgaggacc 31320
tcacctacga ggagctcaaa aagctgccgc acatcaaagg ccgcccgcga ttcatggaac 31380
tctacatcgt cgggcacaac atcaacggct tcgacgagat cgtcctcgcc gcccaggtga 31440
tcaacaaccg agcctccgtc ccgggccctt tccgcatcac ccgcaatttc atgccgcggg 31500
caggcaagat tctcttcaat gacgtcactt tcgctctgcc taaccccctc tcgaagaagc 31560
gcaccgattt cgagctctgg gagcacggcg gctgcgacga ctcggacttc aagtaccagt 31620
tcttgaaagt catggtcagg gacaccttcg ccctgacgca cacctcgctc cgcaaggccg 31680
ctcaagctta cgccctcccc gtggagaagg gctgctgtcc ctacaaggcc gtgaaccatt 31740
tctacatgct gggctcttac cgtgcggacg atcgaggatt cccgctccgg gagtactgga 31800
aggatgacga ggagtacgcc ctcaaccgcg agctgtggga gaagaaagga gaagcgggtt 31860
atgacatcat ccgcgaaacg ctggactact gcgccatgga cgtcctcgtc accgccgagc 31920
tcgtcgccaa gctgcaagac tcctacgcgc acttcatccg cgactcggtc cgcctgcccc 31980
acgcccactt taacatcttc caacggccca ccatctcctc caactcgcat gccatctttc 32040
gccagatcgt cttccgcgcc gagcagcccc agcgcaccaa tctcggcccc gccttcttgg 32100
ccccctcgca tgagttgtat gactacgtgc gcgccagcat ccgcgggggg cgctgttatc 32160
ccacctacat cggcatcctc tcggagccca tctatgtcta tgacatctgc ggcatgtacg 32220
cctccgccct cacgcatccc atgccctggg gtccgcccct caacccctac gagcgagcgc 32280
tggccgcccg cgagtggcag atggccttgg atgatgcatc ctcaaaaata gattattttg 32340
acaaggaact ctgtccgggc atcttcacca tcgatgcgga cccccctgac gagcatctgc 32400
ttgatgtgct gccaccgttc tgctcgcgca agggcggcag actctgctgg accaacgagc 32460
ccctgcgcgg cgaggtggcc accagcgtgg acctggtcac cctgcataac cgcggctggc 32520
gcgtcaggat cgtgcccgac gagcgcacca ccgtcttccc ggaatggaag tgcgtcgcgc 32580
gcgagtatgt ccagctcaac atcgcggcca aggagcgcgc cgaccgtgac aaaaatcaga 32640
caatgagatc catcgccaag cttctctcca acgccctcta tggctccttc gccaccaagc 32700
ttgacaataa aaaaattgtc ttttctgacc agatggatga aagtctccta aaaagcatcg 32760
cggcagggca ggccaacatc aaatcctcct cgtttctaga aactgacaac ctgagtgccg 32820
aggtcatgcc cgctctcgag agggaatacc taccccaaca gctggcgctc gtggacagcg 32880
acgcggaaga gagtgaggac gagcacagac ccgccccctt ttataccccc ccgtcgggga 32940
cccccggtca cgtggcctac acctacaagc caatcacctt cttggatgcg gaggaggggg 33000
acatgtgtct gcacacggtg gaaaaggtgg accccctggt ggacaacgac cgctacccct 33060
cgcacgtggc ctcctttgtc ttggcgtgga cgcgcgcctt tgtctcagag tggtccgagt 33120
ttctctacga ggaggaccgc gggacgcccc tgcaggacag gccaatcaag tccgtctacg 33180
gggacaccga cagcctgttt gtcaccgagc gcggacacag actcatggag acgcgaggta 33240
agaagcgcat caaaaagaac gggggaaaac tggtttttga ccccgagcag ccagagctca 33300
cctggctcgt cgagtgcgag accgtctgcg cccactgcgg agcggacgct ttcgctcccg 33360
agtccgtctt tctcgccccc aagctctacg ccctgcaatc cctcctctgt cccgcctgcg 33420
ggcgctcttc caagggcaag ctccgcgcca agggccacgc cgccgaggcc ctcaactacg 33480
agctcatggt caactgctat ctcgccgact cgcagggcga agaccgtgcc cgtttcagca 33540
ccagcaggat gagtctcaag cgcacccttg caagcgccca gccaggggcc caccccttca 33600
ccgtgacgga gaccaccctc actcggaccc tgagaccctg gaaggacatg acgctggccg 33660
cgctggacgc ccatcgtctc gtgccctaca gtcgcagtcg tcccaacccc cgaaacgagg 33720
aagtctgctg gatcgagatg ccgtagagca cgtcaccgag ctctgggacc gcctggagct 33780
cctctcgcag accctcgcca agatgcccat ggccgacgga ctcaagcccc tgaaaaactt 33840
tgcttccctg caagagctcc tctcgctggg cggggaccgc ctcctcggcg agctcgttcg 33900
ggaaaacctc caagtcagag acatgctcaa cgaggtggcc cccctcctcc gggacgacgg 33960
cagctgcatg tccttgaact accacctgca acccgtcatc ggggtcatct acggcccgac 34020
cgggtgcggc aagtcccagc tgttgagaaa cctgctctct tcgcagctca tcaccccagc 34080
cccggaaacc gtttttttca tcgccccgca ggtggacatg atccccccct ccgagatgaa 34140
agcctgggag atgcagatct gtgaggggaa cttcgccccg gggcccgagg gaaccatcgt 34200
cccccaatct ggcaccctcc gccccaaatt cattaaaatg tcttatgatg atctcaccca 34260
ggagcataat tatgatgtat ctgaccccag aaacgtcttt gccaaagccg cagcccacgg 34320
gcccatcgcc atcatcatgg atgaatgcat ggaaaacctg ggcgggcaca agggcgtctc 34380
caaattcttc cacgcattcc cttccaagtt gcatgacaag ttccccaagt gcacgggcta 34440
caccgtcctg gtggtcctgc acaacatgaa cccccggcgg gatctgggtg gcaacatcgc 34500
caacctcaag atccaggcca aactgcacat catctccccc cgcatgcatc cctcccagct 34560
caaccgcttc gccaatacct acaccaaggg gctccccgtg gccatcagtc tccttctcaa 34620
agacatcatc cagcaccacg cccagcgccc ctgctatgac tggatcatct acaacacgac 34680
cccagagcac gaggccatgc agtggtgcta cctccacccc cgggacgggc tcatgcccat 34740
gtacctcaac atccaatccc acctctaccg ggtcctggaa aaaatccacc gcactctcaa 34800
tgatcgggag aggtggacca gggcctaccg cgcgcgaaaa aataaataat aaagatgctt 34860
tgctgtttgg atcagaatct gtgtttattg aatcatttat tttgctgctg ttgctgctcg 34920
cggagctcgg acacctgctg ggtcagggcg gccagctggc ggctcagggc ttccagctcg 34980
gccagcaggg ccagcagttt ctcctcggcg atgatggaac tgggcacaga ggggctgctg 35040
ccgctgctgg gcatgtagct cgaggccagt ctcgtcgctg tcatggcagc tgcggctgcc 35100
gcggctgcgg cggtgctgtc gagcgacgag ctccccacgg tcgcgtaggt catggtcgag 35160
gaatttgctg gaagcactgg gcgcccatcc accgtcgatc ccatcacatt ctgacgaact 35220
ccggcccatc ccggcaggcg ggttgtcaaa taagggctaa aaagcccccc ttcgaaggcc 35280
ccgccggtcc cgttcatgat gtctgcagaa aagcaaaaag accctcgtaa gacacccgcc 35340
tttatagtca ccttagccac gcccactact cactcgacct acctctaatc tgtgtcctcc 35400
ccactggagc tgaactcggt cccggtacag gccatcacca ggtggtctgg tctcagctcc 35460
tcggtcacat ccagggccac tggctgcatc ctggtgtgtc tgcccccgca ctcgcaagcg 35520
cgcaccctgg acttggtctc atcgtatctc aggatcttgt acaccgagac atccatgtca 35580
aagatgccgt tcaggttcac cctggagaag gcatcgttct ccaacagcag cttggtctgg 35640
ctaaagttgc actggtacgg ctggaaggtg ccccttctgg ctcccaggtg catatggcac 35700
ttgatcagca ggttattctc aaacactggc cacttctttc tggggtggga ggtcacatgg 35760
atgttcttca ggatatggca gacccccgaa tcgcaggtca gcatgttgta catgcgctca 35820
tccgtgcagc ccttcaccat attatgcttc agagaggctg tgcccttcac caggcagaag 35880
cagcccgtct ccagggaaga gcagtgtctc actctagcat tgccctcggt agagactccc 35940
aggtagcatt tctcaaacac acactgcttc acagacatct cgctcttggg tcttccgacc 36000
acgcccatcc agcagccata aaacttacat cccctgatct tggaagcgcc ccagacctct 36060
gcgcacatat tgttgaagcc gaagaaactg cagccatgca gggtcatgtg gctgttggcc 36120
atgaacagca ccccattaaa cttctctcca ttgaacttca tgttcatgaa gatcatggaa 36180
ttcatattca tcactcctgc tctcattccc atcatgcaac acctgaaggc ggccttgtcc 36240
agggtatcga tgaccacctc tgccccgttc cccgagatgt agcaggcatg tctgatattc 36300
acggtcttgg tcactatgta cttgcaatct gggcgcaggg ctatcttggc atacttctta 36360
atagcctcct cccaatcctc atctgggttc aaccaatggg tttttatctg ctccaggcca 36420
tatttatcct gcatcaggcc caactcatcc ctgcactcct gctgtagctc gtaccaggta 36480
aggcgctctg ggcgcttccg attcatcagg ctggccgtca gctcggtcat catcccggta 36540
ttacccccat cgctcctctc cctcttaact cccctggcca tggatgtcag caccttgcta 36600
agctctgggt acaggctgga tacctgattc aatccagctc ctcttccgac ggagggtcca 36660
ggccgctcct cgggttctcg tccatggcct gcctcatttc ttcctccaac atggatgttt 36720
gtctgtgtag acgaagaaga cccggagctg ctggctgtag aagccagtaa ttcaagattc 36780
tctgtccccg ctgcctgatc caggccctcc acaggtgcat ggctgcgaag tccaggatgt 36840
agcccctgct cagttgggtg tcctggctcc atttgtcaac cagaaaaacc acaaaagcaa 36900
ccccggctgt agtgcgccct gggctggaaa aatcaaggct gtggagtacc ctttcctgga 36960
aaagggactg gtggccaaga ttcagagaat ctagcaggcc agagcagtca gcaaaaatat 37020
tttcaaattc ctctttataa tccttcttaa ctgtgtacac caggcgagat agaggagttc 37080
caaaccagtg tctccagaac ccggagcacc cgtctgaact atcctctaca agccggcgtg 37140
tcttgctaaa gtctgcaagg atagtccaca catccatcag gaactccctg aaggtctgtg 37200
cccagtgccc aggtgttgcc acttatatag gactaagccc cgcccatgag tcataaacca 37260
caccttgcat gcgtcacata tacttttatt gtacaacttt atttacacat gactaagcgc 37320
agctgcgcct agttcctggg gcgtttcaag ctcaggtcca aaggttcatc cccacccatg 37380
tcatgtaaca agtcctcaat tttttcaaca gctgctcgcc tctcgccact ggctctgact 37440
ggggtgggtc tgtgcacttg caggggcgtg tcatctgtga gatcaggggg agacgggtgg 37500
tcttcttctg agggtgatga ctcatcctct gacaccggac ctagaaacaa aaataaacca 37560
cacttagcac agctgttcaa gcaatacaca gtgatgtgtt aagcactcag cctctctcac 37620
attcactcca cttactgtaa ataaagctga aagtctgttt catatagcac aaagcgcatg 37680
atgcgttcgg gtctccagac ttatcccggt ggtactggca ttttctacag ccctccactg 37740
gctcggtaga attttcaatc actacttgtt cctccacaat cacacaagca tagtctgaga 37800
tcagagccat ggtctgctca ccccgttcat cctctgaatc gctgggagga aaaccttcct 37860
cataacaccg gaggtctagt tcgtcctcct cttccaattc aggtatgggt gacagagtcg 37920
gtgtatgaag tggagtagat tcgttggcta tgtcagcctg aagaatcata gattctggaa 37980
atattaaatt cacagcctcc tcgttagggt cgtcatcatg ggcatctacc tccagatcat 38040
agagatcctg aagtgtgggt cccagctcga acggacttgg atgcagttcg tcctccaata 38100
ctgtatccac aaagtcctcc agcataagca cagccagctc accgggcaca gttgaaggca 38160
ggaggcgcag gtgtctcatt tttctcggtc tctgggagcg gagctcagag aaatctctac 38220
tcgctggcac tcaagagtgg cctcttgacg gactcgactg gtttaaatac cctgcggatc 38280
agctgatctg tgacataaac accggacttt gacacggacg cggaaattcg cgaaaaaaac 38340
accgcaatcg aaacccccac gtaatcggtc aaagtctctc ggccctcggt aaatattccg 38400
ccctgggagg gaccggtatt tttcgctttt cacttcctca ttcagttttc gcgccaaaat 38460
gacctaattt cacttgcatc cgcccagaat tacctcatat ccgggcgtgg ccgcgggaaa 38520
atcggccgtt tccgggtcta aagtccgctt ttttatacgt catcagcccc gcgacttgct 38580
tccgggctag gccacgcctc cgcggcgacc gttaacgccg tgcgtcgtga cgtcatttgc 38640
atcgtcttct ctcgtccaat cagcgttggc tccgccccaa aaccgttaaa attcaaaagc 38700
tcatttgcat attaactttt gtttactttg tggggtatat tattgatgat g 38751
<210> 15
<211> 5608
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 60
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 120
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 180
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 240
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 300
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 360
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 420
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 480
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 540
ggaggtctat ataagcagag ctcgtcgacg agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 600
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg 660
cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc 720
ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcacttgag gtgtggcagg cttgagatct 780
ggccatacac ttgagtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc 840
ccaggtccaa ctgcagccgg tacctaatac gactcactat acggatccct gatcactgca 900
gaattcgata tcaagcttat cgattgcggc cgctctcgag tctagctagt ctagactagc 960
tagaaagatc cgggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1020
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 1080
tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcg gtgatcaccg atcccggaaa aaaacaccgc 1140
aatcgaaacc cccacgtaat cggtcaaagt ctctcggccc tcggtaaata ttccgccctg 1200
ggagggaccg gtatttttcg cttttcactt cctcattcag ttttcgcgcc aaaatgacct 1260
aatttcactt gcatccgccc agaattacct catatccggg cgtggccgcg ggaaaatcgg 1320
ccgtttccgg gtctaaagtc cgctttttta tacgtcatca gccccgcgac ttgcttccgg 1380
gctaggccac gcctccgcgg cgaccgttaa cgccgtgcgt cgtgacgtca tttgcatcgt 1440
cttctctcgt ccaatcagcg ttggctccgc cccaaaaccg ttaaaattca aaagctcatt 1500
tgcatattaa cttttgttta ctttgtgggg tatattattg atgatgttaa ttaagggtgc 1560
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 1620
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 1680
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 1740
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 1800
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1860
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 1920
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 1980
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 2040
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 2100
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 2160
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 2220
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 2280
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 2340
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 2400
tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 2460
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 2520
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 2580
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 2640
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 2700
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 2760
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 2820
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 2880
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 2940
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 3000
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 3060
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 3120
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 3180
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 3240
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 3300
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 3360
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 3420
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 3480
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 3540
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 3600
tccccgaaaa gtgccacctg acgtctccct cctctgtccc gcctgcgggc gctcttccaa 3660
gggcaagctc cgcgccaagg gccacgccgc cgaggccctc aactacgagc tcatggtcaa 3720
ctgctatctc gccgactcgc agggcgaaga ccgtgcccgt ttcagcacca gcaggatgag 3780
tctcaagcgc acccttgcaa gcgcccagcc aggggcccac cccttcaccg tgacggagac 3840
caccctcact cggaccctga gaccctggaa ggacatgacg ctggccgcgc tggacgccca 3900
tcgtctcgtg ccctacagtc gcagtcgtcc caacccccga aacgaggaag tctgctggat 3960
cgagatgccg tagagcacgt caccgagctc tgggaccgcc tggagctcct ctcgcagacc 4020
ctcgccaaga tgcccatggc cgacggactc aagcccctga aaaactttgc ttccctgcaa 4080
gagctcctct cgctgggcgg ggaccgcctc ctcggcgagc tcgttcggga aaacctccaa 4140
gtcagagaca tgctcaacga ggtggccccc ctcctccggg acgacggcag ctgcatgtcc 4200
ttgaactacc acctgcaacc cgtcatcggg gtcatctacg gcccgaccgg gtgcggcaag 4260
tcccagctgt tgagaaacct gctctcttcg cagctcatca ccccagcccc ggaaaccgtt 4320
tttttcatcg ccccgcaggt ggacatgatc cccccctccg agatgaaagc ctgggagatg 4380
cagatctgtg aggggaactt cgccccgggg cccgagggaa ccatcgtccc ccaatctggc 4440
accctccgcc ccaaattcat taaaatgtct tatgatgatc tcacccagga gcataattat 4500
gatgtatctg accccagaaa cgtctttgcc aaagccgcag cccacgggcc catcgccatc 4560
atcatggatg aatgcatgga aaacctgggc gggcacaagg gcgtctccaa attcttccac 4620
gcattccctt ccaagttgca tgacaagttc cccaagtgca cgggctacac cgtcctggtg 4680
gtcctgcaca acatgaaccc ccggcgggat ctgggtggca acatcgccaa cctcaagatc 4740
caggccaaac tgcacatcat ctccccccgc atgcatccct cccagctcaa ccgcttcgcc 4800
aatacctaca ccaaggggct ccccgtggcc atcagtctcc ttctcaaaga catcatccag 4860
caccacgccc agcgcccctg ctatgactgg atcatctaca acacgacccc agagcacgag 4920
gccatgcagt ggtgctacct ccacccccgg gacgggctca tgcccatgta cctcaacatc 4980
caatcccacc tctaccgggt cctggaaaaa atccaccgca ctctcaatga tcgggagagg 5040
tggaccaggg cctaccgcgc gcgaaaaaat aaataataaa gatgctttgc tgtttggatc 5100
agaatctgtg tttattgaat catttatttt gctgctgttg ctgctcgcgg agctcggaca 5160
cctgctgggt cagggcggcc agctggcggc tcagggcttc cagctcggcc agcagggcca 5220
gcagtttctc ctcggcgatg atggaactgg gcacagaggg gctgctgccg ctgctgggca 5280
tgtagctcga ggccagtctc gtcgctgtca tggcagctgc ggctgccgcg gctgcggcgg 5340
tgctgtcgag cgacgagctc cccacggtcg cgtaggtcat ggtcgaggaa tttgctggaa 5400
gcactgggcg cccatccacc gtcgatccca tcacattctg acgaactccg gcccatcccg 5460
gcaggcgggt tgtcaaataa gggctaaaaa gccccccttc gaaggccccg ccggtcccgt 5520
tcatgatgtc tgcagaaaag caaaaagacc ctcgtaagac acccgccttt atagtcacct 5580
tagccacgcc cactactcac tcgaccta 5608
<210> 16
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgacaacc 60
agaacacagc tgccccctgc ctacacaaac tcctttacaa gaggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttca gaagcagcgt gctgcacagc acacaggacc tgtttctgcc ctttttctcc 180
aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg agcggcacaa acggcacaaa gagatttgat 240
aaccccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcct ccaccgagaa gtccaacatc 300
atcaggggct ggatcttcgg caccacactg gacagcaaga cccagtccct gctgatcgtg 360
aacaatgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgtgagttcc agttctgcaa tgaccctttt 420
ctgggcgtgt actatcacaa gaataataag tcctggatgg agtccgagtt cagggtgtac 480
tcctccgcca acaactgcac cttcgagtac gtgagccagc cctttctgat ggatctggag 540
ggcaagcagg gcaactttaa gaatctgagg gagttcgtgt ttaagaacat cgacggctac 600
ttcaagatct acagcaagca cacccctatc aatctggtga gagatctgcc ccagggcttc 660
tccgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca atatcaccag gtttcagacc 720
ctgctggccc tgcacaggag ctacctgaca cctggcgata gctccagcgg ctggaccgcc 780
ggagccgctg cttactacgt gggctacctg cagcccagaa catttctgct gaagtacaat 840
gagaatggca caatcaccga cgccgtggac tgtgccctgg accccctgtc cgagacaaag 900
tgcaccctga agtccttcac cgtggagaag ggcatctacc agacaagcaa tttcagggtg 960
cagcctaccg agtccatcgt gaggttccct aacatcacaa acctgtgccc ttttggcgag 1020
gtgttcaacg ccacaaggtt tgccagcgtg tacgcctgga acaggaagag gatcagcaac 1080
tgcgtggccg attactccgt gctgtacaat tccgcctcct tttccacctt caagtgttac 1140
ggcgtgagcc ctacaaagct gaacgatctg tgcttcacca atgtgtacgc cgatagcttt 1200
gtgatcaggg gcgatgaggt gagacagatc gcccctggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgtgtga tcgcctggaa tagcaataat 1320
ctggatagca aggtgggcgg caattacaac tacctgtaca gactgttcag aaagagcaat 1380
ctgaagcctt ttgagaggga tatctccacc gagatctacc aggccggcag caccccctgc 1440
aacggcgttg agggcttcaa ttgttacttt cccctgcagt cctacggctt ccagcctacc 1500
aacggcgtgg gctaccagcc ctacagagtg gtggtgctga gctttgagct gctgcacgcc 1560
cctgccacag tgtgcggccc taagaagagc accaatctgg tgaagaataa gtgcgtgaac 1620
tttaatttca acggcctgac cggcacaggc gtgctgaccg agagcaataa gaagttcctg 1680
ccttttcagc agttcggcag agatatcgcc gatacaaccg atgccgtgag agatccccag 1740
accctggaga tcctggacat caccccttgt tccttcggcg gcgtgagcgt gatcaccccc 1800
ggcacaaata cctccaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg cacagaggtg 1860
cccgtggcca tccacgccga ccagctgacc cccacctgga gggtgtacag cacaggctcc 1920
aacgtgttcc agacaagagc cggctgcctg atcggcgccg agcacgttaa taactcctac 1980
gagtgcgata tccctatcgg cgccggcatc tgcgccagct accagaccca gacaaattcc 2040
cctagaaggg ccaggtccgt ggcctcccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100
gccgagaatt ccgtggccta ctccaacaac tccatcgcca tccctaccaa tttcaccatc 2160
tccgtgacca cagagatcct gcctgtgagc atgacaaaga cctccgtgga ctgtaccatg 2220
tacatctgcg gcgatagcac agagtgttcc aacctgctgc tgcagtacgg ctccttctgt 2280
acccagctga acagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag acacctccta tcaaggattt cggcggcttt 2400
aacttctccc agatcctgcc cgaccccagc aagccctcca agagatcctt catcgaggac 2460
ctgctgttta ataaggtgac cctggccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgt 2520
ctgggcgata tcgccgccag ggatctgatc tgtgcccaga agttcaatgg cctgacagtg 2580
ctgccccccc tgctgacaga cgagatgatc gcccagtaca caagcgccct gctggccggc 2640
acaatcacct ccggctggac ctttggcgcc ggcgctgctc tgcagatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct acagattcaa tggcatcggc gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caactccgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc 2820
accgccagcg ccctgggaaa gctgcaggac gtggtgaatc agaatgccca ggccctgaat 2880
accctggtga agcagctgag cagcaatttc ggcgccatct cctccgtgct gaacgacatc 2940
ctgtccagac tggacaaggt ggaggccgag gtgcagatcg ataggctgat cacaggtaga 3000
ctgcagagcc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggccgccga gatcagagcc 3060
tccgccaacc tggccgccac caagatgtcc gagtgcgtgc tgggccagtc caagagagtg 3120
gatttctgcg gcaagggcta ccacctgatg agctttcctc agagcgcccc tcacggcgtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccctgcc 3240
atctgtcacg atggcaaggc ccactttcct agggagggcg tgtttgtgag caatggcaca 3300
cactggttcg tgacccagag aaacttttac gagccccaga tcatcaccac cgacaatacc 3360
tttgtgagcg gcaactgcga tgtggtgatc ggcatcgtga ataataccgt gtacgatccc 3420
ctgcagcctg agctggacag ctttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480
tcccccgacg tggacctggg cgatattagc ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg acaggctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagtccct gatcgacctg 3600
caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttt 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gacaagctgc 3720
tgtagctgcc tgaagggctg ctgctcctgt ggctcctgtt gtaagttcga cgaggatgac 3780
tccgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct ga 3822
<210> 17
<211> 36167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttaattaatt ggttccactg agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt 60
tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt 120
tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag 180
tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc 240
tctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga 300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat 360
acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca 420
aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca 480
cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 540
actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 600
gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc 660
tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc 720
agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc 780
cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa 840
gccagtatac actccgctag cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat 900
accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag 960
ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg 1020
cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac 1080
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 1140
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 1200
ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1260
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 1320
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1380
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1440
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 1500
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gctgatgcgc 1560
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1620
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1680
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1740
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1800
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1860
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1920
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1980
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2040
gcattacgct gacttgacgg gacggcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt 2100
acgggccaga tatacgcaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta 2160
acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg 2220
gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt 2280
ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac 2340
ataaacctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 2400
cactataggg agacccagcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 2460
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 2520
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 2580
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 2640
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 2700
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 2760
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2820
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2880
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2940
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 3000
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 3060
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3120
gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3180
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3240
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3300
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3360
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3420
ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3480
cgcattaata gggataacag ggtaatatac aaacgaggcc ctttcgtctt taattaacat 3540
catcaataat ataccccaca aagtaaacaa aagttaatat gcaaatgagc ttttgaattt 3600
taacggtttt ggggcggagc caacgctgat tggacgagaa gcggtgatgc aaatgacgtc 3660
acgacgcacg gctgacgctc gccgcggagg cgtggccgga catggaagcc attttggacg 3720
tgggcaagat ggcgccctac ggctaagtta catgtaatgg cggaagtgac gtaacgtggg 3780
aacccggaag ttgagtcacg aaatcgatac gaggaagtga gaacgcggaa gtgttttcgc 3840
gaaaaacacc cagggcgtgt gtgttttttt tggcggggtt tttagacctt tggtcattac 3900
gtcagtgtaa ggactgcctt taaataggga gctgggttag tgggtagtca gtcgctgctg 3960
ttggcgcttg tactgctgtg ctctctgtct actggtaagc gggctgcgct atggctgaat 4020
ctctgtatgc tttcatagat agccctggag ggattgctcc cgtccaggaa gggactagca 4080
atagatataa tttcttttgc cccgaatctt tccacattcc tccacatggg gtggttttgg 4140
ttcacctaag agtgagcgtg ctgattccta atggctacca aggcagattt atggccttga 4200
atgactacca ttccaggggc atactaaccc agtccgatgt gatctttgct gggagaagac 4260
aggagctaac tgtgctgctc tttaaccaca cggatcgatt tttgtatgtc cgagagggcc 4320
acccggtggg cactttgctg ctggagagag tgatttttcc ttcagtgaga ctggccactc 4380
tggtttagtg catgctttct gtttttcaga ctctcatctc tactaaccat gcttgagcga 4440
cgcgctgtca gctaccacat tgtggtccct ggggccctag tgacttattt agaggacttt 4500
tccattactg ctatgattag agagcaccta cctcgcttta tcactcacct cttggaagga 4560
atcaccggtg acacaaagag agcttattcc agcgtgcagt ttttgggtgc tagctttgga 4620
gctttaaagt actccatcac gcttgccagt cccacgctta gccctggctc tgaattggca 4680
tctgtagtgg ccgaggactt gagtgacttt ttacagctga cgctgagacg cgagctcagg 4740
gcagagggca gaaactcatt gaatcttgtt gttttgaaca tgctgcaggt ggtggagcag 4800
ccagatctgt tgctattatg aaggtctgcc tgattatgaa agtggagggg gcgctgtggg 4860
aacttttcca catgtgcgga gtggacttac accaacaatt tgtagaaata attcaaggct 4920
ggaaaaatga gaattacctg ggaatggtga atgagtgtaa cctgatgatt gatgaaatcg 4980
atggagggcc agcctttaat gtgattctta tgctggatgt acgcgtagag ccactgctcg 5040
aagccacagt cgagcacctt gaaaatagag taggttttga cctggctgtc tgtttccacc 5100
agcacagcgg cggggaacgc tgtcacctgc gtgacttgca ctttatcgtc cttcgagacc 5160
gcttggaata aaaatggttc ttccagttct tcccccacct cctctgaatg atagaccagg 5220
ctgcattaac tggattggga tggcctacaa tgtcctggct gatgtgttaa ggggaatccg 5280
catggacaga acttttgttt catcagatgc tgaggagctg ctcgagaacc tgcgggaatg 5340
gctgtacttc agttggatga ctgagcgtca gcagcggaaa gacaggagaa ggagaggtat 5400
ctgctgttca agggcccatt tctgctggca gaagtacgac aaggtacgca agagaatcca 5460
ctacaatgca aaccgaggat cagtcgagct tgctccgcca tcatccatac cgcagggccc 5520
gtttaccacg atctgatgag gagaccaggg cctcactgac tgaacaacac cccctgttgc 5580
ccgattgtga tcatgctgaa tatcataatg taagttctgt tcgcggatta ccatgtgctg 5640
ctggctttac cctgctccaa gagtttccag tcccctggga tatgattctg actccagagg 5700
aaataaaaat tttaaaaaga tgtatgtcag tgtgcctgtg ccccgctacc cttgacctgg 5760
tgagagctca gatggtgagc gggtacgagc gctggatcct gcattgccac tgttcatccc 5820
cgggctccct gcagtgtcgg gcgggaggca ccctgctggc cgtgtggttc aggagagtca 5880
tttacgggtg tatgttcaac cagcgcttcc catggtaccg ccagattgtg aacagagaca 5940
tgcccaaaga gatcatgtat atgggcagtg tgttcatgag gggcaggcac ctgatatatt 6000
gccgcatctg gtacgatggt cacgtgggtt ccatcatccc caacatgagc tttggctgga 6060
gcaccctgaa ttatgggctg ctgaataaca tggtgattat gtgctgcact tactgtgaga 6120
acatggcaga gatcaggatg cggtgctgtg cccgacgcac caggagactg atgctgaagg 6180
ctgtggggat catagtcaga gagacttgtg atcccgatcc catctgcagc agccgcaccg 6240
agccccggcg gcagagactg ttgagggcgc tgatggaaag gcacagaccc atcctgtttt 6300
ccgagtatga atctgtgcgt tcttctcgtt ccaccagact gtgaccttgg actgcgaggc 6360
ccgcttggat gacttttcag aggacggctt catctcaatc accgaccccc gtttggctcg 6420
ccaggaaact gtgtggctta tagacactaa atccagttct cgtgctaatc agaacattcc 6480
cctatttaag gccacccgtg ctgagagaat tgtttacact gtgaaatggg ctggtggtgg 6540
gagactgact acccgtgctg gtgtaaaaat caataaagat acatgaaaat tttcaaatga 6600
gaacatgttt attggtcttt cattcttggg cgatatagga gaaggtaaat gaagtagaat 6660
caaaagggat attgtcatag tccttggtcc atgaatagtt aaaagtgata gaataagcac 6720
tatctgcttc attattaaaa gtaattttaa ttacaactgg attatatggc tgattatcta 6780
agtagatatt tccatatata gtgttccttg cataaatttt agactgatca gttgtagctt 6840
tagcataagc tagtaaatta ggcataaatc caattgcatt tttatatggc tctggaagaa 6900
tagagtctcc acttctaaag tttaggtact gtttttcaat gtttgaattt tccaatagaa 6960
ctccattttg atcaaacagt agtttgatgt taaatgattt aggtagggat gggtctgttt 7020
tgttattaag gatcttgaac tttccgttga ctataattag agatacattt gccaaaatct 7080
gacttccgca ctttgtcagt accaaagtta gttttgagtc tttttctata tctatcttac 7140
aatttggaga agggtctaaa gttgtccaaa gtgtgcggat gtcatgttta ttgttccatg 7200
ctactaaata acctttatca tcaaaagtta aaccacctcc ttctccaatt ctcacacata 7260
aaccgactcc tttattgcta ccatcgtcat tttttaattc ttcatttcca attcctttgc 7320
cagtcaaaac tacaagatag tttaacaaac ctggcaaatc agatattgat ctatctatta 7380
cctttaatcc atctcctact agaatagcta gcttgttatc tctgacatca aatggaggtg 7440
ctaaagccaa ttccagtttt ttgtctgttc caacttgcaa tggagcctta gggtttacac 7500
ttaggtttcc actatcttgt tccacagtta gtccccctcc caccttgagt gagacatccc 7560
cattagtgat ggcgattggg tcagccagtt tgagtgacag gaccccaggt gggaagtttt 7620
tgaatccatc ggatgagaca aaggggggag taaggaaggg gatattctga ttccgcgcgt 7680
agccataggg gtagacgggg ttgaagtcat cttccacccg gagcctcttt gacatctgag 7740
agggaagaca atgaaaattg tggaccagga atttgacatc cctttcaagg tgtggaggaa 7800
gttcgccgcc cgccgaggac tggagtacca gagctgggag gagggtaccg aggtgctgct 7860
gaacaactac accagagaca tactttcaga tttcaagtaa gtgatcttta ttgaatcatt 7920
aattccaatg atttattctt atgagtaatt gtgggagggg aatggggtaa ggggctgatt 7980
ggtttctggg attttaatca acatcagtcg tagccgtcca ccgcttctct cactgcgtcg 8040
aagttcggta tgaactcgtc cgggtagagg cctggcgatc ccgagaaggg gttgaagtag 8100
accgagggca caaactcctc cacaaactgg agggttccga tgcctccgga gcgaggctcc 8160
gaagagctgc tctgcaaggt caggtaggcc tggttgggag tgaaggagga tctcccggct 8220
ccggctagtt ggaacactcc gtccggtcgc agaccgatcg aagagctcac caactcgtcg 8280
ttgagctgtg tgcctctgcc tcggatcacc agggttttta tacccgattg tgggcggagc 8340
gggcaccggg aagcgccgcc ggccagctgg acacctgagt tagtcatgcg gacttcggcc 8400
agtgcgtcac gcggaagtag tacggtagtc ggcccgggga tttcctgata caccagggtg 8460
gagggccaat tacgcgggtt gagctttgcc ctgggcgtgg aggtgaccgc cgcctgctcc 8520
aacaatatct ggtttcgatg actgcggacc ccgttgaccc gtgagatcat cgaggggccg 8580
gcactgagcc agttcatgcg ggtggagtag tcctgggagg cgcccgcggc caggcccatc 8640
tggggctgat agctccacat gtaaggtgtg ggaatctcct tgctcatggt ggcgatgagg 8700
taattcccgc cttttttccg ggtgggcgcg ccttagtctt taagagtgag cgcgcagtac 8760
ttgtggaaca gagcctcggc gtcttcgaga gtgcgctgca gctgatcttc gtttttgtgg 8820
tacaagcaac tgcgggtgag cgagcgcaga gaccgatttt ttactttgag ctcttgctgc 8880
tgacctcgac tctgctgaaa aatggcataa agagtgggga agatccggtt cctcagctcc 8940
ctggtggtca atggctcgtt cgccgcgatc ctcaggcctc ctcctcctcc ggcgactcct 9000
cttacttgct ttttcttagc tgtgaaggtg acggtagtaa tgcaacacgt tgcgggggat 9060
gttcaccccg cggtggaaga gcaggtagcg gcgggcgaaa gcgatgttcc ccccgcagtc 9120
ttgcaagcag gcgatgatcg cggctttgtg ggccctccat gatcggtagc cctgccgctc 9180
gtgcttaccg tcacccttca ctcgatccca tctacgagga ggcttggccg gagctgcgga 9240
ggttgtatcc gtgaccgccg gggctgccgg cgcggatggt gcggcgacgg gctgctctgt 9300
tgcctgctcc tcttccacct cttccaattc ttcctcctct gtactctcct cctcccattc 9360
ttcctcctct gcctggctgt cccattcttc ttccatctcc tcctccacta gcggcttctt 9420
cctcggcatg ctgggggaga cccgggttga gcacctcgcc cgtctggggg tccaggtaga 9480
cccctctacc ctttttcaga agaaactctt ggcgggattt ttggatggcg tgcaattggg 9540
cgaggatggc gccctgggtg atgacgcagg ccgtgagatc cgcgtgctgc gggcgcgatt 9600
ggtcctcgaa gaactttatc tcgtgggcgt ggtagtcctc gggtacaaat ttgcgcaggt 9660
acgcggaagt ccacaacccc ggcgtgagtt tcagcggagc ggtggactcc tgcggacctt 9720
gcagctcgaa ggtaccgatg acctgggttt cgctcaggag ctgggggttg cagaccaggg 9780
agcggtgcgg ggagcacagg ttgcagcggc agtggcactc gagcagcccc tcgccgctca 9840
cgtcctcgat cacatccgag tggtaggcga tgtagttggc cagctgcaag aggtagcagt 9900
ggctccacag cggcggggga cactcgcggt agctcagcgg gacaaagtcg gaggggaagg 9960
cgttgcaggt ggcgggcagc atcccagatc gctcgagaat gaaagtgcgg tagttttgca 10020
acatgctctg gctcatgaag tcgggcagcc cgcctttcag cgtctgcctc aggcgctcgg 10080
ggaaaacgat ctcggccagg tcggcggcgg tggtccgctc gtcgaagccc gtccacagct 10140
ttttgaggtt tctagcaaga agcttgtcca gctccttcag gttctcgtcc tcgagacact 10200
gctgccacac gcccatggcc gcttgccagg tgtggcagag gaatagaaag acgcagtcgc 10260
ggacgtagtc ccgccgcgcc tcgcccttca gggtcgagtg gagcacggtc tgccccaggc 10320
ggttctcgtg caggatcccc aggcaggaga ccaggttggt cagctccacg ttggagatct 10380
tgcaggcctg cctgacaaaa ccgtgcctga aagtgtagtg cagggtctcc tcgaccttgc 10440
gcagggtctc ggggtcgctg aagaagcgac gcatgcattc cagctcgagg gtgaccagga 10500
ccacggccag catgagcttg cgccgctgct ccagggcctg ggggtcgcgg gtccctagcc 10560
agcgcgcgag catctcgtcg ctgaccacgg gctgggcgtc ctcggggcgc tgctcctgac 10620
tttcatcgag ggcctcgatg tggggcatga tgagctgatc catgatgcga cgcatgacct 10680
tgggcgggag gttgacggcg gggtaggcga aatgggtgag ctcgacgctg cgcttgagca 10740
cggccagcct ggcgttgtcg ccttccaact ctaccagggc gctagtgtga ccctcttcct 10800
ctgctgtttc tttcagagcg ttcgccgcgc gtgtctcgtc ccgaccgagc ccttcgaaga 10860
tcttgggcac ctcttccagg gaagcgatat caggtatgca cgcgccgggc cccagagcga 10920
ggagcgcgtc ggcgcgggtg cggttggcgc ggcaggagac ggggatcttt tggttcttga 10980
aaaagatgtg ataggtggcg agggcctcgg ggaccgcgaa gacggggtag aagttgagac 11040
gcgggttggg ctcgcaggtg ccgttgggct ggcgtttggg gggcacgcgc ggcgagaaga 11100
ggttgagctc gtaggcccga cacagctcct cgacgctgag gggggtttcg ctccggtcgg 11160
ccagggcgtc ccggaggatg agggactggc gctgcaggtg tttcagcagc acatcctcct 11220
ctcctcccag gtagccatgc tcgagcccag cgtcggtctc ctcctggcct gcgtcttgct 11280
cgtgctcctg ttcatcctgt gggggttcta gacgagccgg ctcttccaag cccaggtcct 11340
gctcgatttt gggttgctcg tgggtggtta agtcctcctc ctgctcctgc ttacgcggct 11400
ccatcttccc ctaggaaaca atggccggcg gcagtcagga cgtgcgccgg ttcatggacc 11460
gagaggccac tccgccccgg ggccacggtt cagcgcgcta tccgccggag caggagagga 11520
gcccctcgcc gccacctcct ctgcccacca agcgccgaaa gtatcagcgg gtgggctccg 11580
ggtcttccga ggaggacgtg gtccccgtgg acagccctcc aaaaaagaag caagccagga 11640
agaccaagca tgtgaccaag gtagaccccg acgaagagat gccccaggaa gatgccgtga 11700
tcgtgggagt gggattcagc cagccgccgg ttctgttgaa ggaaggcaag gacggaaaac 11760
gcatcgtcga gccagcgacc cccggtattc tgaacgtgca caaccccctg agtctgcctc 11820
tggtctcgtc ctgggagaag ggcatggatg ccatgaacgt gctgatggaa cgctaccgcg 11880
tcgacagcgg cctgcgcgat gcttacaagc tcatgcccga gcagaccgag atcttccaaa 11940
agatgtgcca gacctggatg aacgaggagg cccgcggtct gcaactgacc ttcaccaccc 12000
agaagagctt tagcaccatc atgggtcgcc tgttgcaagg ttacatcttc agccatagcg 12060
ggatcgcgca taagaactgg gagtgcaccg gctgcgccct gtgggatcac ggctgcaccg 12120
aggtggaagg ccagctcaag tgtctgcatg ggacggtgat gatccacaag gaccacgtgg 12180
tggagatgga tgtgaccagt gagaacggac agcgcgcgtt gaaggagcag cccagcaagg 12240
ccaaggtgac ccagaaccgc tggggtcgga gcgtggtgca actgaccagc catgacgcgc 12300
gctgctgcgt gcatgatgcc gggtgcggga ataaccagtt cagcgggaag agctgcggcc 12360
tgtttttcag cgagggggcc aaggcccagc aagctttcaa gcagatcgcg gccttcgtca 12420
aggccctcta cccgaatatg cagcgcggcg cggggatgat gctgatgccc gtgcactgcg 12480
agtgtaacca caagcctcag agcgtgccat tcctgggccg ccagctgtgc aagatgaccc 12540
cgttcggcct gagcaacgcc gaggacctgg acaaggatca gatcagcgac aagagcgtgc 12600
tggccagcgt caagtacccc agtctgatgg tgttccagtg ctgcaacccc gtgtaccgca 12660
actcgcgcgc gcagagcacc ggccccaact gcgatttcaa gatctccgcc ccggacatgc 12720
tgggcgccct gcagatgagc cggcgcatgt ggagcgagac cttccccgag attcctgtac 12780
ccaaactggt gatccccgag ttcaagtggc agcccaagta ccagtaccgc aacgtggccc 12840
tccccagcgc ggcgcacaac gacgagcgcg agaacccctt cgacttttaa ataacttgca 12900
tatactccag tgcatgtaaa ataaaagtgc tgtttattga gatacacgca gttgtttcat 12960
tttatcaaaa gcggtggcgt gttcgatggc ggcgcggtgg gagcgaaagt agggggagtg 13020
acgcgcgagg aagcggtaga gctcctcctg gttgcgccgg agggtgggca gcacctgtgg 13080
cgactgtagc atgccgttgg gcacccccgt cagcaagttc atggtggggt ttccgtccat 13140
gggtcggtcg ggccagtgca cgaaggcatg caagaacatg caacagaaaa gtccgcaggc 13200
ggcggagtcg ggcccctgca cggtctgggt ggactgctcg agactgagac agcgatcggg 13260
cgaggaggca agcgcgctgc ggcgcagcat ggcctcgtac tcgaagctgt aaatctgctt 13320
gagccggcgg tccgagaacc caaaggggtc gaacatgtag caggtgcgcg agcgcgggtt 13380
ccagccgaag gcgagccagt gcacgcctcc ggtctcgcgg ccggccgtgt tgacgatggc 13440
gcaggccagc ttgttgccgg cgaggaagcc cgggaagcgc ttgtcgtggg tgcccaaaaa 13500
gtagggcccg cagcccaggt cgcgcacgat ggccgcgagc tctcgttcgc tggagccgct 13560
catgcttagg tggtggcgtt gccggcggag aagggcgtgc gcaggtagac ggcctcgatg 13620
acgccgcggt gcggctggtg cactctgacc acgtcgaaaa cttcgaagag aagatagagg 13680
agggtgggct catccatggg gtccacctcg aaggtcatgt cgagcgcgtg ggccgagttg 13740
gcgtagagca tgttctgacc caggtcggta agggcgccca tggacatgaa gttgctggag 13800
aaggggatgc gccacatgac cctgtcgcag aggaactttt tctgggtgac ggaggggact 13860
gcggtggagc caatgagcgg gtaggggaag ttggcggggt agggctgtcc ctgacgcatg 13920
gtgggtgcga ggtagccggt gaagcccgag ttgttgtgct ggaagggcag ggtgactgcc 13980
ttgtagtcct tgtagttgat ctcatcgacc acctgcctgc tcatgggctg gaagttgcgg 14040
aagaaggagt acatgcggtc cttgtaaccc tcgggcacgt aaaagccctg gtagccgatg 14100
ttgtagtggg agagcatctg gacgaggaac cagtccttgg tcatgttgca ttgggccacg 14160
ttgtagccct ccccgtcgac gctgcgcttg atctcgaact cgttcggcgt gagcagccgg 14220
tcgttgccgg gccagctgac cgaggagtcg aacatgatgg agaccttctt gaaggtgtgg 14280
ttgaggtaga aggtcccgtc gaggtagggg atggagcccg agtagacaaa gtaggggtcg 14340
aaacccgagc cgagggaagg agtttccttg gttttcaggc gagtgaaact ccagccgcga 14400
aaggcggccc agttgcgcga ggggatggag atgggcacgt tggtggcctt ggccgggatg 14460
gggtagagca tgttggcggc tgagaggtag tcgttgaagg actggtcgtt ggtgtcgttg 14520
cgcagcatgg cttccagggt ggaggcggtg ttgtgtgcca tggggaagaa ggtggcgtag 14580
aggttgacgc tgtcgaagcg gacggaggcg ccgtcgacgc gcaggtcgtt gccaagggaa 14640
ctctgcagga tcatgttgac atccttgcgg aagttccact cgtaggtgta ggagcccggg 14700
agcaggagca ggttcttgat ggcaaagaac ttttggggca cttggatgtg gaagggcacg 14760
tagcggccgt tgcccagcag catggaacgg tagcgcagac ccgcgttgcg gtggtggttg 14820
aaggggttga cgttgtccat ggggtccagg gaccagcgcg cgccgatgtt gatgtaggcg 14880
tccaccagcg agggggccac cacgcggccg ttcatgtact cgtaggtgtt ggtgttggtg 14940
ggcagcgtga cgttggccgg cgtgtacttg taggagtcgg gcaggtacag cgccacgttc 15000
gagtacagaa aactcttcca caggttggcc tggaggttga tctccatggc gtagatgttg 15060
cccttgcata tttggtttcg atctgccaca ttggtgtctt tttcccattc gctctcttga 15120
tccccatctt gtccattttt aacttttaca ccttcataag cagcattggt gccagaccca 15180
tccaatggga agcaatagtt gggaagttca tcttccacac cgtgattctc aatgatcctg 15240
acatcgggat catagctgtc caccgcagag ttccacatgc taaagtacct ggttctgtcg 15300
cccagagaat ctagcaagag ctggtaagac agctctgtgt ttctgtcttg caagtcgacc 15360
acagcattca actgagaagc ctgaccggcc agcacaccca tgttgccagt gctgttgtag 15420
tacatgagac ccacaaagtt gtccctgaag ccgatgtagt taggtctgtt gggcatggac 15480
tgctgaacca agttgatttc tgaactgtca tcatctttgc ctggtttata caccacgtgg 15540
gtgtccgggg tttcaagatt aacattttca gtgcacataa caatgtctgc tttgtattcc 15600
gttccaccac ctgttaaagt tcctcccgga gtatcaaaga atgctaggtc tatgtcaaaa 15660
tcttcttgac ttttttcagg gtctcttagt tttgcctgtc ctcctttttc atttgtgggt 15720
ctggcaaatg agccatagca tggtttcatc ttggtttcct ttttaagagc ccttcctcca 15780
tagaaggctt ctgtttcctg ccagttttct tctcctactt gaggctctgg ttgatacagc 15840
ttattagcat atatcgggtc ttgtttgcca tttgtagtat ctgttccaat ttgcaaaccg 15900
ctaattgtaa tgttttctcc acccatagga gctacaccat aagtatgtgt ttccttttga 15960
tctccagcat tggccttttt ctgttcccac tgactggagt tgggggcgcc cttgggggcc 16020
agactgttgt aggccgtgcc cgagtagggt ttgaagctgg gaccgcggtc caggacgccg 16080
cggatgtcaa agtaagtgct ggccatgtct agcacccggt tgtcgcccac ggccagagtg 16140
aagcgcgcct tgtacgagta cgtggtgtcc tcgcgatcca cgggcacgaa gcgcagcgtc 16200
agacgctggg accggtccgt ggtcacatcg tgggtcgggg ccaccgtggg gttcctaaac 16260
ttgttgccca ggctgaagta cgtgtcggtg gcgcgggcaa actgcaccag acccgggctc 16320
aggtactccg aggcgtcctg cccggcgatg tgcatgtacg cccactgcgg catcatcgag 16380
ggggtggcca tcttcttctc tggcggtaag gcacatacaa gttaagctct ccctttagtg 16440
tcctctttcc tctctcaaaa gcatcggcgg cgcttcagac ttttcactcc caggcccacg 16500
atactgtgca gcgtgctctg ccagttctgg gcctggcggc gggcggggac gcggcgcacg 16560
gcggtcgcca ccgggggggc ctgcacgacc ggagctgcct taggtggagc gggcgcgggt 16620
ggtggaggca ggtcaagggt ggcaggtttc atcacacccg tggccagcgg cgcgatgatg 16680
cgcgtggtgg gcatgccggc cttgacggcc tcctcgtacg agggcggctc gtccacctgc 16740
agggtagtct cctccgcgtc gggccgcggc cgcttctcgc ccctgggcgg aggatgcgcg 16800
cttgcatctt ccatctccac caccgtggcg gcgggcgggc gcgggtccag gcggctgttt 16860
atctcgcgct gcacggcctg gttcgcgatg tccaccaccc cgttaatgcc cgaggccagc 16920
ccgtccacca ccttctgctg gaagttctgg tctgcgagct tttccctcaa catctgcccc 16980
gtgctactat tccaggcctt gttcccatag gtccggagcg tcgagccgaa atttttaagc 17040
ccgctccaga cactgctcca attgaaggcg cccccgttca gctggctggt gccgatctcg 17100
ttccaggtgc ccatgaacgg ccgcgtgccg tgccgcggag ccagggacgc aaaattgatg 17160
tcttccattc taaaaatata caggaccagg tgtgtcagag tctaaagagg ctttattcgc 17220
acatcaacgg cgctgcgacg cctgcagcgc aacggaagct atgcccggga tcgtgccgat 17280
ggccgcggcg attataggga tgagcgcggg caggaacccg ccactcaggc gcctgcgcat 17340
ggcccgccgc cggcggcggt tcaggccgct gcctgccatg cctctcctgc ggcgggatct 17400
tcctcggtaa ttcgggactg ggatgcgcag gcggcaagtg agagccatct ctctgcaaca 17460
gtatcacagc acacggatta aaggatgctg gggtggtagc gcacggtggg cagaacgagc 17520
gagcggcccc ggcgcgtggt gacgcggcgc acgcgggcgg gggccagacg gcggcgggtg 17580
gtggtgcggc ggcggcgttt gctggctggg cgcctgcggc tggcgtagta ccgggtgccg 17640
cggtagcccg gcgtcgggat gatggaagga tgcaacacgt agttgggcat cagccggctg 17700
gcggcgcccc atcttcgcct cctgggaggc tcggtagccg tggcggcggt agaagtggag 17760
acggtagcgg tggaggctgg gagccagggg tcggtctgca cctcgatgct ggtcgagggt 17820
tttttgtcga catccatgtc ggtggggatc tgaatgtcca cggtctgcac gcccaggccc 17880
ggcgccacct gcttgatggg gcgcaccttg acctcgggct ccacatccat tttcacggtg 17940
tccagcacgt cctccacgcg ccggcgcttg ggcaccatga tctgcatggt cgggtacatg 18000
ctctcgccct cgcgcttgac cccgcggctc ggcagcagca ccgcctgggg cagcacctgc 18060
tgcagggtca cgggcttcag gctcggcgtg gggttgctct cgtccagcgg cagcgagatc 18120
agctcctctt cgcgcgaccg cttcccgtag gcgaactcgc ctgcccgctc cgccgcctgg 18180
tccaggatgt cgtcgtcgcc gtacacctcg tcatagctac gcttgctcct gaccgaggac 18240
cgctcgccgg gcgtgaacac caccgccgtg ccgggccgca acacgcgctg caccctgcgc 18300
cccttccaat ttacgcgccg ccgcggagcg aactcgcgca caaactctac tgccccctcg 18360
tccacctcat cctttttttt aacccgcttg attttgcggg gtttctggtc cgcctggggt 18420
ggtccgtaaa tctccggggc gacgacctgg agcatctcct ccttgatttt gcgctttgac 18480
atcgtcgctt gcgggggagg acacaagcat tagatcaggg acgaggagga cgggtgcgca 18540
cgggcacgcg cacgcccgtg acggagtcgc gcacccagta cacgtttccg cgcctgggtc 18600
tggtcatgct agagatggcc gcggcggcgg cggcggccgc tcgtctgcga gtcctgcctg 18660
cggggggtgc agtggcagcg cggcgcgcgg ctcgcatcat ggcccggcgg cccgtgcgtc 18720
tggcgcggcg cagtagagcc cgggcggcgc gcatggcggg cgtgctccgg tggcgcctgg 18780
cgatccgtcg ccgccgactc ttgcgtctgg catagtcgcg cgcgtcggcc accacgctgt 18840
caatgaccgc gtccacggtc gagggggcgg gggtgtagtt gcgcgcgtcg gcgaccaccg 18900
agtcgatgac gtcgtcaacg gtggtgcgca cggcagcggc gggagtccgc ccacgcttgt 18960
aagcgcccca gggagcgcgg aagtggccgc ggacgcggac ggggtgctgc tgggagcgct 19020
tcttggctcc tccgtacatg gtgctgggcc tagtaagacc ccagccggtg ttattgctgg 19080
gcgagatgag aatagacatt ttttagaagg tgcgactgga aagcacacgc ggcgcgacta 19140
tgcccagggc cttgtagacg tagggacagg tgcggcgacg ggcgtcagtg acggtcactc 19200
gctggactcc gcggatactg ctgcgcagcg gtagcgtccc gtgatctgtg agagcaggca 19260
cgttttcact gacggtggtg atggtgggcg cgggcgggcg gcagaggatc tggttgtcgg 19320
ggaagcggtt gaagacgtgg gtgagggagg tgtagctgcg gatgagctgg gagtagacgg 19380
cgaggtcgtt gtaaaagctc ttggcgcgga agggcatgag ctcggcgccg accacggggt 19440
agttgctgac ttgctgggta gagcggaagg tgaccgggtc ttgcatgagg tccggcagcg 19500
accagtagac ttgctccgcg ccgcaagtga cgtccggggt ggtgagcagc gtccacgact 19560
gcaccccctt ctcggggtcc ccgtaggtat aggacaggta ccagcttcgg tacagggtgt 19620
catgggtgtc cttgatcagg ttgtaacttc tgttgctctc atccttttca attggtacga 19680
tcactagctc cttttcagct gctttttctt gagctacagt gaggtgggta tcgcctctag 19740
tgacagcacc atctccctga tgctttgcag cttccttggc agcatcctca agttccttct 19800
tgctatccag atattttttg gtatccagga gagcggggat gttaccccct tctagatcct 19860
catacatgat tctgaagccc tcttggaaag gttgcttctt gcgaatgccc aggagattgc 19920
tcaggcggct ctcggtgaag tccaccccgc agcccggcag cagcaccacg tccgggtgga 19980
aggcctcgta ggtgtagacc cctggcataa ccagcttggt caccgggtcc cagcccagct 20040
tgaaattcct gctgtcaaac ttgactccga tatcgctctc cagcacgcca ttttgccgcc 20100
ccacttgcaa gtagttttcc aagatggcgt tgttcatcag gtctatggtc atggtctcgg 20160
aaaagttgcc ctcgggcagg gtaaactcaa accactcata ctctaagata tccttgctta 20220
aatctgttgc ttctaccccc tgtgggtgtt tcctagccac catcacccgc gccttaaact 20280
tgctggtgaa catgtactcg ttcacattgg gcatgttggt gtgcagaatg gtcttcagat 20340
caccgcccca ccgcgaccgc tcgtcaaaat ttatcgtctg cgtgctggcc tcggcggggg 20400
tgaaatcgtt gttctgcacc accgtggtca ggaagttgct gtggtcgttt tggtagttca 20460
gggaagcgat gtccgccgac ttgttgtcca ccaagtacac gcgagtggtg tcgtactgcg 20520
gagccagctc cgagtaacga atgctgtttc tgccctccgt aggagccata taccgcggag 20580
gcacaaacgg aacctccagg gtcgcctgcg ccatcacgct ctcgtacgag ggaggaggag 20640
aggaagacac caccgcacgc ctcatctcta acaaggaaga gaacgcacgc tatggccttg 20700
gtgagtttta ttttgcattt caaaacatcc gccgccccag tttgggctgc agatgcgcga 20760
acgggttggc cccaccgctc ccgcccaagt ccagcacgct gctatcgtcg gccgagtcct 20820
cgtcgtccca caccaggccc cgctgccggt cgtggcgctg tcgccgcggc gcgggcgcgt 20880
ccctatggtc ctgagcgtag gtcttccagc ggttcagttt gtccaccaga ctctctatcc 20940
cgttattggc catggcgttc ttggcccgcg gcggctgcag cagcgagtcg ttcaggtact 21000
cgtcctcgcc cagcaagcgc ggtcggctaa ccctgccgct gttcaccgag cccggcaagc 21060
tatgcaaact ccctaagcta ggaaaggggc ttcttcccac agcgccctcg ctcggcgtgc 21120
gcactgcttc ctgtctcttt tgaaaggcgg gcgagaacac cgcgctgtcc acgtcgtccc 21180
acaggaaccc gtcgttggga tcgggcatgt cgtactcgcc cgtgtagaac cccggcggcg 21240
ggagccagtg cgggttcaat atggcattgg taaagtagtc cgtgttcatg gccgccgcgc 21300
ggtgcaggta gtccatcagc ttattgatga acggccggtt ggcggcgtac atgctaggtt 21360
ccatgttgcg cgcggtcatg tccagcgcag cgctgggggt ggcgccctcc tgcatcagga 21420
acagccctac gctctgctgc acatatctca ggatcctttc ctcctcggcc gacagtgcgt 21480
actgcgccgg gatcttctgc tgtctattgg tcagcaaaaa gttcagggtg gccctcagac 21540
tgtcggtgtc gttctgcccc agcgcgcggc tcacgctcgt gatctcctgg aaggtctgct 21600
cgtccacctg cgcctggcct atggcctcgc ggtacagcgt cagcaggtgg cccaggtacg 21660
agttgcggtt cacgctgccg ctgtcggtga agggcgcgat cagcagcagc agcagccgcg 21720
agttgggcgt cagcaagctg ctcaccgtcg accggtcgcc cacgggcgcc tgcacgcccc 21780
acagccctcg caggttcttg aaagcctggc tcaggttcac cgtctgcaag ccctgccggc 21840
tcgtctggaa aaagtagtcc gggcccgact ggtacacctc gctctggggc acctcggtca 21900
ccatcagccg cagcgcgctg ataaagttgg tgtaatcgtc ctgcccgcgc ggcacgttcg 21960
ccggctgcgt cgccaggaag gcgttcagcg ccaccagcga gcccaggccc tcgttcttga 22020
accgctcgcg ctgcgccacg gcctcgcgca cgtccgtcac cagccggtcc aggttggact 22080
gcacgttcgt gctgttgtag cggcccacgc gctccagcag ggcgttgtac accagcccgg 22140
cctcgtcggg acggatggcc ttgttctccg ccagcgcgtt cacgatcgcc agcaccttct 22200
cgtgcgtggg gttggtccga gaggggacca ccgcctccag aatggccgag agtctgttgg 22260
cctgcggctg ttgtctaaag gactcggggt tgcgggtcgt cagggccatg atgcgttgca 22320
tcgcggcctc ccagtcgtcc gatgctagac cggacggctg gctttgcagc gccgccctta 22380
tggcggggtc cggggcttgc tgggacatct aaaaacacat cacggaggcg tcagtacccc 22440
gcagcgggtg catcctcctc ctcttcctct tcctcatcca agtcctctgg accgtaggcg 22500
gcctccaagg cgcgccggct cggctgccaa tgcaggtccg cccccatgtc gaagtaggac 22560
tcctcgccgc cggcggcgcc ccctaccagc gcccggcgca ggctcagcat cagctcgcgg 22620
tcgctcagct cgcgccgccg gctcgtgctc acggccttgt ggatgcggtc gttgcggtac 22680
acgcccaggt cgtcgctcag cgtcagcacc ttgagcgcca tgcgcatgta aaagctgtct 22740
atcttcacct ccttgtctat gggcacgtac ggcgtcttgt aaatcttgcg cgcgtaaaac 22800
ttgcccaggc tcagcaccga gtagttgatc gccgccacct tctcggccag gctcaagctg 22860
cgctcctgca ctacgatgct ctgcaagatg ttaatcagct ccagcagcca gcgaccctcg 22920
ggctcggcga tgttcagcag cgcctccctg aacgcctcgt tgtccctgct gtgctgcacc 22980
accaggaaca gctgcgccgt cagaggcttg ctgtctgggt tctgcacgat ggcctccgcc 23040
aggtcccaca ggtgcatcag acccagggcc acctcctcgc gcgcgatcag cgtgcgcacg 23100
tggttgttga aactcttttg gaagttgcgc tcctgcttca ccgtctgctc gtaggccgtc 23160
accaggttgg ccgccgccac gtgtgcgcgc gcggggctga tccccgtctg ctcattcggc 23220
tcgaaatcct cgtcgcgcag cacgcgctgg cggtccaggc cctcgcgcag ctccctgccc 23280
gcccgaaacc ggcagtcgcg catctcctcg ggctcctccc cgctgcggtc cctgaacagg 23340
ttctgcgcag gcacgtacgc cgggcgcacg tccttctgca gctgcacgcg ggggtgtcgc 23400
tccggggacg gcgcccccag tcttgccagc ccttcgccct cttccaagtc catctctgtc 23460
tgtggctggc tagcgccggc gcctgctacg gccgcggtcg cggtggtcgc cgggggggtg 23520
ggacgcattt ggcgcaggac gggatgcatc tggcaaaaag aaaaaagggg gctcgctccc 23580
gtaactggag aagtcggctg gctgtgggtc tttaaatcgg cggggtgacc aagtcccgct 23640
cgccgcggcc gtcctcgaac cgggttctgc cgcgactcaa ccctggcgat gcttctccag 23700
actacgggcg cgagccacta cccggcaggg ttttcggtcg ctttcaagtc tagcgacccc 23760
cctcggccag caaaaagggc tctccgccgt atcctggcgg ctatcgggct cgggtcgaga 23820
cgggagtgcc aataccacgt tagtcgcggc tccagcctga ttcgagggga ctcgaaccgg 23880
ggtacacacg cggcctaacc cgtttgcgtt ccgccaggct acggaggaag agcccgctca 23940
accgctttcg tttttgcctc tagagcgtca atgactgcgc gcgtctcacc ggccagaccg 24000
tgccgaccat ggactatttc ctgccgctgc gcaacatctg gaaccgcgtc cgcgagttcc 24060
cgcgcgcctc caccaccgcc gccggcatca cctggatgtc ccgctacctc tacggctacc 24120
accgcctcat gctcgaggac ctggccccgg gcgcgccggc cacccagcgc tggccgctct 24180
accgccagcc gccaccgcac ttcctagtcg gctaccagta cctcgtgcgc acctgcaacg 24240
actacgtctt cgactcgcgc gccttctcgc ggatcaggta ctccgaggtc gtgcaacccg 24300
gcctgcagac cgtcaactgg tcgctcatgg ccaactgcac ctacaccatc aacaccgggg 24360
cctaccaccg cttcgtcgac atggacgact tccaggacac cctcacccgc gtgcaacagg 24420
ccatcctcgc cgagcgcgtc gtcgccgacc tggcgcttgt gcaaccgctc aggggcgtcg 24480
gggtcacccg catggaagac tccgcctccg ccagtgatga cattgagagg ctcatgcatg 24540
actactacaa gaacctgagc cggtgtcagg gccaggcctg gggcatggcc gagcggctcc 24600
gcatccagca agcgggaccc aaggacctgg tcctcctcgc caccatccgc cgcctcaaaa 24660
acgcctactt caattacatc atcagcaacc gcaattctaa cagcgtccac ggggctacta 24720
cgtgtttgag cttaccttgc gactgcgatt ggctagacgc tttcctcgaa agattctccg 24780
atccggtcga tctcgacgcg ctcacgtccc ctacaccgca attgataaga tgcatcgtca 24840
gcgccctatc gctgcccaat ggggacccgc cccattaccg ggagatgacc ggcggcgtct 24900
tcacgctgcg tcctcgcgaa cggggtcgcg ccgtcaccga aaccatgcgt cgccgccgcg 24960
gggagatgat cgagcgcttc gtcgaccgtc tcccggtgcg tcgccgtcgt cgtcgggccc 25020
cgccaccacc accgccccca gaggaagaaa tagaagaaga ggtcgtcatg gaagaagagg 25080
aagaggagga ggcccccggg gatttcgagc gcgaggtgcg cgccaccatc gccgagctca 25140
tccggctcct ggaagacgag ctcacggtct cggcccgcaa cgcccagttt ttcaacttcg 25200
ccgtggattt ctacgaagcc atggaaaggc tggaggccat cggcgacatc agcgagatgc 25260
ccctgcgccg ctggatcatg tacttcttcg tcaccgagca catcgccacc accctcaact 25320
acctcttcca gcgcctgcgc aactacgccg tcttcacgcg gcacgtggag ctcaacctcg 25380
cgcaggtggt catgcgcgcg cgcgacgcag acggggacgt agtctacagc cgcgtctgga 25440
acgagagcgg gctgggcgcc ttctcgcagc tcatgggtcg catctcaaat gacctcgccg 25500
ccaccgtcga gcgcgcgggc cgcggcgatc tccaggagga ggagatcgag cagttcatgt 25560
ccgagatcgc ctaccaggac aactcgggcg acgtgcaaga gatcctgcgt caggccgccg 25620
tcaatgacgc cgagattgat tctgttgaac tgtctttcag gttcaaagtc acggggccgg 25680
tggtcttcac gcagaggcgg cagatccagg atgtcaaccg ccgcgtcgtc gcgcacgcca 25740
gcgctctcag ggcgcagcac cgggacctgc ccgagcgcca cgccgacgtg cctctgccgc 25800
ccctgcccgc ggggccggaa ccgccgctgc cgccgggagc acgtccgcga caccgcttct 25860
aaaagcgcac cgcggcacgg tcgtggcccc gcgcagctac gggctcatgc aatgcgtgga 25920
cacggccacc aactccccag tggaaatcaa gtaccatctg catctcaagc acgccctcac 25980
ccgcctctac gaggtcaacc tcagaaccct gcccccggac ctggatctcc gcgacaccat 26040
ggacagctcc caactgcgcg ccctcgtctt cgctctccgc ccccgccgcg ccgagatctg 26100
gacctggctc ccgcgcgggc tcgtcagcct ctccgtcctc gaggagcccc agggtgagtc 26160
ccacgcaggc gaacatgaaa accaccagcc agggccgcca ctcctgaagt tcctcctcaa 26220
gggacgcgct gtgtatctcg tggatgaggt acagcccgtg cagcgctgcg agtactgcgg 26280
acgcttttac aagcatcagc acgagtgctc ggttcgccgg cgggatttct actttcatca 26340
catcaacagc cactcgtcca actggtggca ggaaatccag ttcttcccaa tcggctctca 26400
tcctcgcacg gagaggctct ttgtcaccta cgatgtagaa acctacacct ggatggggtc 26460
cttcggcaag cagctcgtcc ccttcatgct ggtcatgaaa ttctccgggg accccgagct 26520
gatcgccctg gctcgcgatc tcgccgtgcg cttacgctgg gatcgctggg agcgggaccc 26580
cctcaccttc tactgcgtca caccagaaaa gatggccgtg ggccagcagt tccgcctctt 26640
tcgcgacgag ctccagaccc tcatggcccg cgagctctgg gcttccttca tgcaagccaa 26700
cccacatctc caggagtggg cgctcgagca gcacggcctg caatgccccg aggacctcac 26760
ctacgaggag ctcaaaaagc tgccgcacat caaaggccgc ccgcgattca tggaactcta 26820
catcgtcggg cacaacatca acggcttcga cgagatcgtc ctcgccgccc aggtgatcaa 26880
caaccgagcc tccgtcccgg gccctttccg catcacccgc aatttcatgc cgcgggcagg 26940
caagattctc ttcaatgacg tcactttcgc tctgcctaac cccctctcga agaagcgcac 27000
cgatttcgag ctctgggagc acggcggctg cgacgactcg gacttcaagt accagttctt 27060
gaaagtcatg gtcagggaca ccttcgccct gacgcacacc tcgctccgca aggccgctca 27120
agcttacgcc ctccccgtgg agaagggctg ctgtccctac aaggccgtga accatttcta 27180
catgctgggc tcttaccgtg cggacgatcg aggattcccg ctccgggagt actggaagga 27240
tgacgaggag tacgccctca accgcgagct gtgggagaag aaaggagaag cgggttatga 27300
catcatccgc gaaacgctgg actactgcgc catggacgtc ctcgtcaccg ccgagctcgt 27360
cgccaagctg caagactcct acgcgcactt catccgcgac tcggtccgcc tgccccacgc 27420
ccactttaac atcttccaac ggcccaccat ctcctccaac tcgcatgcca tctttcgcca 27480
gatcgtcttc cgcgccgagc agccccagcg caccaatctc ggccccgcct tcttggcccc 27540
ctcgcatgag ttgtatgact acgtgcgcgc cagcatccgc ggggggcgct gttatcccac 27600
ctacatcggc atcctctcgg agcccatcta tgtctatgac atctgcggca tgtacgcctc 27660
cgccctcacg catcccatgc cctggggtcc gcccctcaac ccctacgagc gagcgctggc 27720
cgcccgcgag tggcagatgg ccttggatga tgcatcctca aaaatagatt attttgacaa 27780
ggaactctgt ccgggcatct tcaccatcga tgcggacccc cctgacgagc atctgcttga 27840
tgtgctgcca ccgttctgct cgcgcaaggg cggcagactc tgctggacca acgagcccct 27900
gcgcggcgag gtggccacca gcgtggacct ggtcaccctg cataaccgcg gctggcgcgt 27960
caggatcgtg cccgacgagc gcaccaccgt cttcccggaa tggaagtgcg tcgcgcgcga 28020
gtatgtccag ctcaacatcg cggccaagga gcgcgccgac cgtgacaaaa atcagacaat 28080
gagatccatc gccaagcttc tctccaacgc cctctatggc tccttcgcca ccaagcttga 28140
caataaaaaa attgtctttt ctgaccagat ggatgaaagt ctcctaaaaa gcatcgcggc 28200
agggcaggcc aacatcaaat cctcctcgtt tctagaaact gacaacctga gtgccgaggt 28260
catgcccgct ctcgagaggg aatacctacc ccaacagctg gcgctcgtgg acagcgacgc 28320
ggaagagagt gaggacgagc acagacccgc ccccttttat acccccccgt cggggacccc 28380
cggtcacgtg gcctacacct acaagccaat caccttcttg gatgcggagg agggggacat 28440
gtgtctgcac acggtggaaa aggtggaccc cctggtggac aacgaccgct acccctcgca 28500
cgtggcctcc tttgtcttgg cgtggacgcg cgcctttgtc tcagagtggt ccgagtttct 28560
ctacgaggag gaccgcggga cgcccctgca ggacaggcca atcaagtccg tctacgggga 28620
caccgacagc ctgtttgtca ccgagcgcgg acacagactc atggagacgc gaggtaagaa 28680
gcgcatcaaa aagaacgggg gaaaactggt ttttgacccc gagcagccag agctcacctg 28740
gctcgtcgag tgcgagaccg tctgcgccca ctgcggagcg gacgctttcg ctcccgagtc 28800
cgtctttctc gcccccaagc tctacgccct gcaatccctc ctctgtcccg cctgcgggcg 28860
ctcttccaag ggcaagctcc gcgccaaggg ccacgccgcc gaggccctca actacgagct 28920
catggtcaac tgctatctcg ccgactcgca gggcgaagac cgtgcccgtt tcagcaccag 28980
caggatgagt ctcaagcgca cccttgcaag cgcccagcca ggggcccacc ccttcaccgt 29040
gacggagacc accctcactc ggaccctgag accctggaag gacatgacgc tggccgcgct 29100
ggacgcccat cgtctcgtgc cctacagtcg cagtcgtccc aacccccgaa acgaggaagt 29160
ctgctggatc gagatgccgt agagcacgtc accgagctct gggaccgcct ggagctcctc 29220
tcgcagaccc tcgccaagat gcccatggcc gacggactca agcccctgaa aaactttgct 29280
tccctgcaag agctcctctc gctgggcggg gaccgcctcc tcggcgagct cgttcgggaa 29340
aacctccaag tcagagacat gctcaacgag gtggcccccc tcctccggga cgacggcagc 29400
tgcatgtcct tgaactacca cctgcaaccc gtcatcgggg tcatctacgg cccgaccggg 29460
tgcggcaagt cccagctgtt gagaaacctg ctctcttcgc agctcatcac cccagccccg 29520
gaaaccgttt ttttcatcgc cccgcaggtg gacatgatcc ccccctccga gatgaaagcc 29580
tgggagatgc agatctgtga ggggaacttc gccccggggc ccgagggaac catcgtcccc 29640
caatctggca ccctccgccc caaattcatt aaaatgtctt atgatgatct cacccaggag 29700
cataattatg atgtatctga ccccagaaac gtctttgcca aagccgcagc ccacgggccc 29760
atcgccatca tcatggatga atgcatggaa aacctgggcg ggcacaaggg cgtctccaaa 29820
ttcttccacg cattcccttc caagttgcat gacaagttcc ccaagtgcac gggctacacc 29880
gtcctggtgg tcctgcacaa catgaacccc cggcgggatc tgggtggcaa catcgccaac 29940
ctcaagatcc aggccaaact gcacatcatc tccccccgca tgcatccctc ccagctcaac 30000
cgcttcgcca atacctacac caaggggctc cccgtggcca tcagtctcct tctcaaagac 30060
atcatccagc accacgccca gcgcccctgc tatgactgga tcatctacaa cacgacccca 30120
gagcacgagg ccatgcagtg gtgctacctc cacccccggg acgggctcat gcccatgtac 30180
ctcaacatcc aatcccacct ctaccgggtc ctggaaaaaa tccaccgcac tctcaatgat 30240
cgggagaggt ggaccagggc ctaccgcgcg cgaaaaaata aataataaag atgctttgct 30300
gtttggatca gaatctgtgt ttattgaatc atttattttg ctgctgttgc tgctcgcgga 30360
gctcggacac ctgctgggtc agggcggcca gctggcggct cagggcttcc agctcggcca 30420
gcagggccag cagtttctcc tcggcgatga tggaactggg cacagagggg ctgctgccgc 30480
tgctgggcat gtagctcgag gccagtctcg tcgctgtcat ggcagctgcg gctgccgcgg 30540
ctgcggcggt gctgtcgagc gacgagctcc ccacggtcgc gtaggtcatg gtcgaggaat 30600
ttgctggaag cactgggcgc ccatccaccg tcgatcccat cacattctga cgaactccgg 30660
cccatcccgg caggcgggtt gtcaaataag ggctaaaaag ccccccttcg aaggccccgc 30720
cggtcccgtt catgatgtct gcagaaaagc aaaaagaccc tcgtaagaca cccgccttta 30780
tagtcacctt agccacgccc actactcact cgacctatta atagtaatca attacggggt 30840
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 30900
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 30960
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 31020
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 31080
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 31140
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 31200
atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 31260
atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 31320
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 31380
gtcgacgagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 31440
acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa 31500
cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccaccc 31560
ccttggcttc acttgaggtg tggcaggctt gagatctggc catacacttg agtgacaatg 31620
acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca ggtccaactg cagccggtac 31680
ctaatacgac tcactatacg gatccgccac catgttcgtg tttctggtgc tgctgcctct 31740
ggtgagctcc cagtgcgtga acctgacaac cagaacacag ctgccccctg cctacacaaa 31800
ctcctttaca agaggcgtgt actaccccga caaggtgttc agaagcagcg tgctgcacag 31860
cacacaggac ctgtttctgc cctttttctc caacgtgaca tggttccacg ccatccacgt 31920
gagcggcaca aacggcacaa agagatttga taaccccgtg ctgcccttca acgatggcgt 31980
gtactttgcc tccaccgaga agtccaacat catcaggggc tggatcttcg gcaccacact 32040
ggacagcaag acccagtccc tgctgatcgt gaacaatgcc accaacgtgg tgatcaaggt 32100
gtgtgagttc cagttctgca atgacccttt tctgggcgtg tactatcaca agaataataa 32160
gtcctggatg gagtccgagt tcagggtgta ctcctccgcc aacaactgca ccttcgagta 32220
cgtgagccag ccctttctga tggatctgga gggcaagcag ggcaacttta agaatctgag 32280
ggagttcgtg tttaagaaca tcgacggcta cttcaagatc tacagcaagc acacccctat 32340
caatctggtg agagatctgc cccagggctt ctccgccctg gagccactgg tggatctgcc 32400
catcggcatc aatatcacca ggtttcagac cctgctggcc ctgcacagga gctacctgac 32460
acctggcgat agctccagcg gctggaccgc cggagccgct gcttactacg tgggctacct 32520
gcagcccaga acatttctgc tgaagtacaa tgagaatggc acaatcaccg acgccgtgga 32580
ctgtgccctg gaccccctgt ccgagacaaa gtgcaccctg aagtccttca ccgtggagaa 32640
gggcatctac cagacaagca atttcagggt gcagcctacc gagtccatcg tgaggttccc 32700
taacatcaca aacctgtgcc cttttggcga ggtgttcaac gccacaaggt ttgccagcgt 32760
gtacgcctgg aacaggaaga ggatcagcaa ctgcgtggcc gattactccg tgctgtacaa 32820
ttccgcctcc ttttccacct tcaagtgtta cggcgtgagc cctacaaagc tgaacgatct 32880
gtgcttcacc aatgtgtacg ccgatagctt tgtgatcagg ggcgatgagg tgagacagat 32940
cgcccctggc cagaccggca agatcgccga ctacaactac aagctgcccg acgacttcac 33000
cggctgtgtg atcgcctgga atagcaataa tctggatagc aaggtgggcg gcaattacaa 33060
ctacctgtac agactgttca gaaagagcaa tctgaagcct tttgagaggg atatctccac 33120
cgagatctac caggccggca gcaccccctg caacggcgtt gagggcttca attgttactt 33180
tcccctgcag tcctacggct tccagcctac caacggcgtg ggctaccagc cctacagagt 33240
ggtggtgctg agctttgagc tgctgcacgc ccctgccaca gtgtgcggcc ctaagaagag 33300
caccaatctg gtgaagaata agtgcgtgaa ctttaatttc aacggcctga ccggcacagg 33360
cgtgctgacc gagagcaata agaagttcct gccttttcag cagttcggca gagatatcgc 33420
cgatacaacc gatgccgtga gagatcccca gaccctggag atcctggaca tcaccccttg 33480
ttccttcggc ggcgtgagcg tgatcacccc cggcacaaat acctccaacc aggtggccgt 33540
gctgtaccag gacgtgaact gcacagaggt gcccgtggcc atccacgccg accagctgac 33600
ccccacctgg agggtgtaca gcacaggctc caacgtgttc cagacaagag ccggctgcct 33660
gatcggcgcc gagcacgtta ataactccta cgagtgcgat atccctatcg gcgccggcat 33720
ctgcgccagc taccagaccc agacaaattc ccctagaagg gccaggtccg tggcctccca 33780
gagcatcatc gcctacacca tgagcctggg cgccgagaat tccgtggcct actccaacaa 33840
ctccatcgcc atccctacca atttcaccat ctccgtgacc acagagatcc tgcctgtgag 33900
catgacaaag acctccgtgg actgtaccat gtacatctgc ggcgatagca cagagtgttc 33960
caacctgctg ctgcagtacg gctccttctg tacccagctg aacagagccc tgacaggcat 34020
cgccgtggag caggacaaga acacacagga ggtgttcgcc caggtgaagc agatctacaa 34080
gacacctcct atcaaggatt tcggcggctt taacttctcc cagatcctgc ccgaccccag 34140
caagccctcc aagagatcct tcatcgagga cctgctgttt aataaggtga ccctggccga 34200
cgccggcttc atcaagcagt acggcgactg tctgggcgat atcgccgcca gggatctgat 34260
ctgtgcccag aagttcaatg gcctgacagt gctgcccccc ctgctgacag acgagatgat 34320
cgcccagtac acaagcgccc tgctggccgg cacaatcacc tccggctgga cctttggcgc 34380
cggcgctgct ctgcagatcc ctttcgccat gcagatggcc tacagattca atggcatcgg 34440
cgtgacccag aacgtgctgt acgagaacca gaagctgatc gccaaccagt tcaactccgc 34500
catcggcaag atccaggaca gcctgagcag caccgccagc gccctgggaa agctgcagga 34560
cgtggtgaat cagaatgccc aggccctgaa taccctggtg aagcagctga gcagcaattt 34620
cggcgccatc tcctccgtgc tgaacgacat cctgtccaga ctggacaagg tggaggccga 34680
ggtgcagatc gataggctga tcacaggtag actgcagagc ctgcagacct acgtgacaca 34740
gcagctgatc agggccgccg agatcagagc ctccgccaac ctggccgcca ccaagatgtc 34800
cgagtgcgtg ctgggccagt ccaagagagt ggatttctgc ggcaagggct accacctgat 34860
gagctttcct cagagcgccc ctcacggcgt ggtgtttctg cacgtgacct acgtgcccgc 34920
ccaggagaag aacttcacca cagcccctgc catctgtcac gatggcaagg cccactttcc 34980
tagggagggc gtgtttgtga gcaatggcac acactggttc gtgacccaga gaaactttta 35040
cgagccccag atcatcacca ccgacaatac ctttgtgagc ggcaactgcg atgtggtgat 35100
cggcatcgtg aataataccg tgtacgatcc cctgcagcct gagctggaca gctttaagga 35160
ggagctggat aagtacttca agaatcacac ctcccccgac gtggacctgg gcgatattag 35220
cggcatcaat gccagcgtgg tgaacatcca gaaggagatc gacaggctga acgaggtggc 35280
caagaatctg aacgagtccc tgatcgacct gcaggagctg ggcaagtacg agcagtacat 35340
caagtggccc tggtacatct ggctgggctt tatcgccggc ctgatcgcca tcgtgatggt 35400
gaccatcatg ctgtgctgca tgacaagctg ctgtagctgc ctgaagggct gctgctcctg 35460
tggctcctgt tgtaagttcg acgaggatga ctccgagcct gtgctgaagg gcgtgaagct 35520
gcactacacc tgaaagctta tcgattgcgg ccgctctcga gtctagctag tctagactag 35580
ctagaaagat ccgggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 35640
atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 35700
ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc ggtgatcacc gatcccggaa aaaaacaccg 35760
caatcgaaac ccccacgtaa tcggtcaaag tctctcggcc ctcggtaaat attccgccct 35820
gggagggacc ggtatttttc gcttttcact tcctcattca gttttcgcgc caaaatgacc 35880
taatttcact tgcatccgcc cagaattacc tcatatccgg gcgtggccgc gggaaaatcg 35940
gccgtttccg ggtctaaagt ccgctttttt atacgtcatc agccccgcga cttgcttccg 36000
ggctaggcca cgcctccgcg gcgaccgtta acgccgtgcg tcgtgacgtc atttgcatcg 36060
tcttctctcg tccaatcagc gttggctccg ccccaaaacc gttaaaattc aaaagctcat 36120
ttgcatatta acttttgttt actttgtggg gtatattatt gatgatg 36167
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttatttgaca acccgcctgc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aacaagctag ctattctagt 20

Claims (12)

1.一种Ad29腺病毒载体，其特征在于，为环状质粒，包含复制子、抗性基因，所述复制子、抗性基因的序列分别如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的Ad29腺病毒载体，其特征在于，还包括荧光表达框，所述荧光表达框为RSV promoter、EGFP、BGHpolyA中的任意一种。
3.如权利要求2所述的Ad29腺病毒的构建方法，其特征在于，主要通过构建穿梭质粒pAd29-shuttle，线性化后与Ad29腺病毒基因进行同源重组，制备Ad29腺病毒环状质粒，所述穿梭质粒pAd29-shuttle包含复制子、抗性基因和荧光表达框，所述穿梭质粒pAd29-shuttle的序列如Seq ID NO.3所示。
4.一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体，其特征在于，缺失E1和E3基因，或缺失E1、E3、E4基因。
5.一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)制备Ad29腺病毒载体环状质粒；
2)利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体的E1基因，获得了E1基因缺失的Ad29腺病毒载体pAd29△E1；
3)再利用CRISPR/cas9敲除Ad29腺病毒载体pAd29△E1的E3基因，获得缺失E1和E3基因的Ad29腺病毒载体pAd29△E1△E3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述CRISPR/cas9敲除E1基因的上游靶向序列和下游靶向序列，设计E1A-gRNA和E1B-gRNA，所述E1A-gRNA和E1B-gRNA的序列分别如Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述CRISPR/cas9敲除E3基因的上游靶向序列和下游靶向序列，设计29-pVIII-gRNA和29-fiber-gRNA，所述29-pVIII-gRNA和29-fiber-gRNA的序列分别如Seq ID NO.8、Seq ID NO.9所示。
8.一种Ad29腺病毒疫苗，其特征在于，在如权利要求1所述的复制缺陷型Ad29腺病毒载体的基因缺失区，包含目的基因。
9.如权利要求8所示的疫苗，其特征在于，所述基因缺失区为E1；所述目的基因为病毒、细菌、肿瘤的基因或基因片段。
10.如权利要求10所示的疫苗，其特征在于，所述目的基因为新型冠状病毒S基因，所述的复制缺陷型Ad29腺病毒载体具有如序列表Seq ID NO.10所示的核苷酸序列；构建得到的重组腺病毒疫苗pAd29-S具有如序列Seq ID NO.18所示的核苷酸序列。
11.一种重组腺病毒疫苗pAd29-S的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)构建pAd29△E1△E3的E1区域穿梭质粒pS29E1；
(b)构建表达新冠病毒COVID-19完整S蛋白的穿梭质粒pS29E1-nCOV-S；
(c)穿梭质粒pS29E1-nCOV-S与腺病毒载体质粒pAd29△E1△E3同源重组，构成重组腺病毒载体pAd29-S。
12.一种重组Ad29腺病毒载体的穿梭质粒，其特征在于，所述pS29E1具有如序列Seq IDNO.16所示的核苷酸序列。
CN202110760575.3A 2020-07-06 2021-07-06 一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用 Pending CN113897389A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010642745 2020-07-06
CN2020106427453 2020-07-06
CN2020109457357 2020-09-10
CN202010945735 2020-09-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113897389A true CN113897389A (zh) 2022-01-07

Family

ID=79187539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110760575.3A Pending CN113897389A (zh) 2020-07-06 2021-07-06 一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113897389A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1189855A (zh) * 1995-06-29 1998-08-05 史密斯克莱·比奇曼生物公司 抗丙型肝炎病毒的疫苗
CN101365484A (zh) * 2005-08-15 2009-02-11 瓦克辛公司 通过给药非复制型载体化疫苗而进行的对禽类的免疫
CN102014948A (zh) * 2008-02-07 2011-04-13 安德鲁·贝克 腺病毒向性的调节

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1189855A (zh) * 1995-06-29 1998-08-05 史密斯克莱·比奇曼生物公司 抗丙型肝炎病毒的疫苗
CN101365484A (zh) * 2005-08-15 2009-02-11 瓦克辛公司 通过给药非复制型载体化疫苗而进行的对禽类的免疫
CN102014948A (zh) * 2008-02-07 2011-04-13 安德鲁·贝克 腺病毒向性的调节

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100379654B1 (ko) 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터
JP2023081975A (ja) アデノ随伴ウイルスベクターの産生方法
Berkner et al. Generation of adenovirus by transfection of plasmids
KR20230091894A (ko) 부위 특이적 표적화 요소를 통한 프로그램 가능한 첨가(paste)를 사용하는 부위 특이적 유전 공학을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
US6838285B2 (en) Site specific recombinase based method for producing adenoviral vectors
JP2022505095A (ja) アデノ随伴ウイルスベクタープロデューサー細胞株
JP2001504325A (ja) 回帰的配列シャフリングおよび選択による遺伝子治療の最適化のための方法
Schleef et al. Production of non viral DNA vectors
CN115968300A (zh) 用于体内转导的载体和方法
CN106755100A (zh) 可控性hiv‑1基因组靶向编辑系统和其靶向载运系统
JP2024515651A (ja) 選択マーカーのないプラスミドシステム及びその生産方法
EP1356062B1 (en) Generation of human cytomegalovirus yeast artificial chromosome recombinants
CN113897389A (zh) 一种复制缺陷型Ad29腺病毒载体及其构建方法和应用
CN102352371B (zh) 一种pC系列质粒及其构建方法和应用
CN115976138A (zh) 新型闭合线性双链dna的体外制备技术
KR20220018410A (ko) 세포질에서 자가전사가 가능하고 유전체 편집을 제공하는 rna/dna 시스템
CN116323955A (zh) 通过crispr/cas介导的体内末端解析拯救重组腺病毒
KR20230054840A (ko) rAAV 비리온의 유도 생산을 위한 안정화된 세포주
KR100928105B1 (ko) 재조합 아데노바이러스의 제조방법 및 아데노바이러스뱅크
CN113897388B (zh) 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
CZ296600B6 (cs) Virový vektor obsahující replikující se DNA, zpusob prípravy této DNA a farmaceutická kompozice obsahující virový vektor
US20200157567A1 (en) Viral Vector
CN113897388A (zh) 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
Schleef NON-VIRAL DNA VECTORS
CN116286684A (zh) 一种快速构建马立克氏疱疹病毒感染性克隆的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination