CN115976138A - 新型闭合线性双链dna的体外制备技术 - Google Patents

Abstract

提供了一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：(a)提供一条含目标序列和至少两个限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，(b)用限制性内切酶消化双链DNA，产生一条两端均具有非回文粘端的目标DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，(c)提供茎环DNA，其分别具有与目标DNA的粘端互补配对的粘端，其中所述茎环DNA的环状部分中的核苷酸是修饰的，(d)连接目标DNA和茎环DNA形成闭合线性双链DNA。

Description

新型闭合线性双链DNA的体外制备技术

技术领域

本发明属于核酸制备领域，特别涉及使用可产生非回文结构粘端的限制性内切酶体外高效制备一种稳定的新型闭合线性双链脱氧核糖核酸(DNA)的方法。

背景技术

传统基于DNA的基因载体大多由各类微生物质粒改造而来，不可避免的含有与目的基因无关的微生物DNA序列和抗性基因序列。当这些产品被广泛使用时，这些序列就会进入宿主(如人)体内，或者通过平行基因转移整合进致病细菌或宿主的基因组，从而带来难以估计的潜在安全性问题。例如，传统DNA疫苗是以环状质粒在细菌(通常为大肠杆菌)中生长形式来构建，质粒中来自细菌的复制原点序列，原核启动子，原核抗生素基因序列等都会进入人体，可能通过平行基因转移整合到人和致病细菌的基因组，产生不可忽视的安全隐患，影响疫苗安全性。因而在生产DNA疫苗时，需要尽可能避免引入非抗原基因的其他附加序列。

这些多余的序列可以通过常规的酶切线性化后再纯化去除，但开环的线性化目标DNA的稳定性也会下降。也可以把开环的线性目标DNA再连接成两端闭合的DNA来增加稳定性，然而现有的常规酶切和连接技术由于会产生大量的连接副产物，实际获得目标闭合线性双链DNA的生产效率很低，分子量和带电量相似的目标DNA和副产物DNA也难以高效的分离纯化，很难实现放大的规模化工业生产。

最近几年，出现了一种生产不含细菌序列的DNA载体的技术，其中DNA只包含所需最小序列，包括抗原序列、启动子和polyA尾，这种新型DNA是DNA双链末端由磷酸二酯键连接闭合的线性DNA，被称为doggybone DNA(dbDNA)。与传统质粒DNA相比，dbDNA依赖于体外滚环复制的酶促反应，产生不含细菌序列的末端闭合线性双链DNA，末端的闭合性使之在细胞内较之开放末端的常规线性DNA更稳定，半衰期更长。然而，这种以滚环复制形式进行扩增的过程涉及体外聚合酶反应，大量的体外扩增反应很容易出现碱基错配或突变，从而引入新的安全性和产物一致性问题。对于长片段抗原序列，扩增过程需要的时间更长，这种不确定性的积累也会更明显。通过细菌制备传统质粒时，由于细菌内天然具有复杂的错配/突变修复系统，突变率远低于体外扩增反应。此外，质粒DNA在细菌中进行复制的过程中，DNA可以被甲基化和其他修饰，会进一步提高DNA的稳定性和表达效率。然而，这些修饰过程在体外滚环复制的扩增系统中也是不具备的，因而缺乏甲基化等修饰的dbDNA在DNA的稳定性及表达效率上也可能存在难以避免的短板。因此，本领域需要新的设计和方法来简便和快速的制备不含细菌序列的DNA载体。

发明内容

本发明设计了一种新型稳定的闭合线性双链DNA，命名为金箍棒DNA(GoldenCudgel DNA，缩写为GC-DNA)，并涉及使用特定的可产生非回文结构粘端的限制性内切酶来制备GC-DNA的方法。所述方法较之传统的酶切/连接方法具有更高效易行，产量高，副产物少，更便于进行工业级放大和生产的优势。与dbDNA制备方法相比，所述GC-DNA制备方法可以直接从常规质粒通过简单的步骤准确去掉来自细菌的多余序列，制备高纯度、质粒级别的低突变率、抗核酸酶、保留质粒上原有修饰且高稳定性的闭合线性双链DNA。

在一个方面，本发明提供了一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：

(a)提供一条含目标序列和分别在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA(如质粒或PCR产物等)，其中所述限制性内切酶可在目标序列两端切割该双链DNA，产生两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，

(b)用所述限制性内切酶消化所述双链DNA，产生一条两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有与所述线性目标双链DNA序列两端的非回文结构突出的粘端分别互补配对的突出的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的

(d)连接(b)获得的线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和

(e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列。

在一个方面，本发明提供了通过本发明所述方法获得或可获得的闭合线性双链DNA，其中在所述线性闭合双链DNA末端的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的。

在一个方面，本发明提供了一种质粒DNA，其包含给定序列或目标序列和在给定序列或目标序列两端具有限制性内切酶的酶切位点的双链DNA序列，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与给定序列或目标序列之间，其中所述限制性内切酶可在给定序列或目标序列两端切割该质粒DNA，产生两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对。优选地，所述质粒包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明可在无细胞环境下生产闭合线性双链DNA，不仅可替代传统质粒DNA，而且可作为DNA药物进行体内表达基因产物，具有广泛的应用前景。同样，由于本发明生产的闭合线性双链DNA安全性高、稳定性好，且流程简单，是DNA疫苗中DNA来源的一个良好选择；另外，由于本发明生产的闭合线性双链DNA结构简单，且表达目的蛋白，可应用于基因编辑治疗或细胞治疗领域。

附图说明

图1：GC-DNA生产流程示意图。

图2：质粒DNA图谱(A)及组成模式图(B)。实施例中制备GC-DNA的质粒DNA是通过人工基因合成和亚克隆获得(安徽通用生物公司)，即在目标DNA序列两侧与细菌序列之间分别添加一个BsmBI酶切位点而且这两个BsmBI酶切位点的序列是反向的。感兴趣的DNA序列包含启动子(CMV启动子)、报告基因(绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO：3)的CDS区)及polyA尾。

图3：BsmBI酶切位点设计。A为BsmBI识别序列及切割位点。B为实施例中涉及的DNA接头序列，及酶切后产物模式图。C为连接体系中不同片段连接模式图，其中a为茎环接头与目的片段连接模式图，由于碱基互补配对，可连接为闭合线性双链DNA；b为茎环接头与非目的片段连接模式图，由于碱基不互补配对，不能连接；c为目的片段自连模式图，由于目的片段末端不互补配对，不能发生自连；d为目的片段与非目的片段连接模式图，由于连接体系中保持了BsmBI酶活性，片段连接后又被切开，所以不能形成连接产物。

图4：茎环接头形成模式图。接头引物经过高温退火后，可形成茎环结构，接头5’末端有游离末端。星号表示硫代磷酸酯修饰，可提高末端环状单链区的抗酶解能力。

图5：GC-DNA形成及鉴定。线性DNA与茎环接头连接之后，样品进行纯化。用Exo III核酸外切酶对样品经行鉴定，连接成功的DNA不会被Exo III降解。样品1为质粒DNA(阳性对照)，样品2为酶切产物(阴性对照)，样品3为线性DNA与茎环接头连接产物。箭头为目的条带位置。

图6：连接体系中线性DNA与茎环接头摩尔比对GC-DNA形成影响。样品1为质粒DNA(阳性对照)，样品2为酶切产物(阴性对照)，样品3-6为不同连接体系的连接产物(线性DNA与茎环接头摩尔比分别约为1:1.5、1:3、1:6、1:12)。箭头为目的条带位置。

图7：通过PCR法生产GC-DNA。A为PCR产物凝胶电泳图；B为Exo III鉴定GC-DNA的凝胶电泳图。箭头部分为目的条带。

图8：高效液相色谱(HPLC)纯化GC-DNA。将PCR法生产获得的GC-DNA经过分子筛色谱柱进行纯化，由于不同条带大小不同，经过色谱柱时需要的时间有差异，可将不同大小DNA进行分离。A为HPLC峰图及收集的不同样品的凝胶电泳图。B为收集的不同样品的浓度检测结果。

图9：GC-DNA功能验证。图为转染48小时后的图片，左侧为对照组的荧光视野图，右侧为闭合线性双链DNA的荧光视野图。

图10：GC-DNA稳定性验证，显示与转染细胞3天后相比，转染细胞7天后的细胞内GFP基因的DNA序列相对含量。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。本发明中未作具体说明的实验方法，均根据《分子克隆实验指南》(第四版)J.萨姆布鲁克一书中具体方法进行，或者按照相关产品说明书进行。本发明中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。

本文中，DNA序列、核苷酸序列、核酸序列可以互换使用，是指脱氧核糖核酸分子的核苷酸排列顺序。

除非另有说明，本文中提及核酸序列时从左至右为5′至3′方向；提及氨基酸序列时从左至右为氨基至羧基方向。除非特别指明或者根据上下文能够确定，本文中提及DNA序列的结构或组成时均是指在双链DNA分子的一条链上。特别地，提及包含在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点时，这两个酶切位点可以在同一条链上，也可以分别在两条链上。

本发明利用能产生非回文结构粘端的限制性内切酶(包含但不限于Type IIS类限制性内切酶)，设计了连接目的片段和茎环接头的粘端，有效的避免了副产物。当经过限制性内切酶进行酶切并获得目的片段后，与茎环接头进行连接可以有效形成闭合末端并且能有效抑制错误连接产物的生成。此外，为进一步提高GC-DNA的稳定性，本发明在茎环接头的环状部分的核苷酸上增加了硫代磷酸酯修饰，抑制核酸酶对环状部分的降解，使形成的闭合线性双链DNA在体内更加稳定，提高基因表达效率。

在一个方面，本发明提供了一种制备能够抗核酸酶降解的闭合线性双链DNA的方法，包括：

(a)提供一条含目标序列和在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA(如质粒或PCR产物等)，其中所述限制性内切酶可在目标序列两端切割该双链DNA，产生两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，

(b)用所述限制性内切酶消化所述线性目标双链DNA，产生一条两端均具有非回文结构的突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有与所述线性目标双链DNA序列两端的非回文结构的突出的粘端分别互补配对的突出的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(d)连接(b)获得的线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和

(e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列。

如本文所用，DNA是指脱氧核糖核酸，主链由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核苷酸(A)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(G)、脱氧胞嘧啶核苷酸(C)、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T))通过3’,5’-磷酸二酯键连接形成的线形或环形多聚体。DNA可以包含本领域已知的合适修饰，例如甲基化、硫代等。

如本文所用，双链DNA是指两条链至少部分(例如除末端的粘端和单链环状部分外)、优选全部序列是碱基互补配对的DNA分子。

如本文所用，线性双链DNA是指存在5’端和3’端的双链DNA，其不是环状DNA分子。当线性双链DNA完全变性时，将形成两条DNA单链。线性双链DNA可以含有作为其一部分的单链环状部分。

如本文所用，闭合线性双链DNA是指线性双链DNA的5’端和3’端通过单链环状部分被闭合的DNA分子，即“金箍棒(Golden Cudgel)”结构(如图1所示)。由此，所述闭合线性双链DNA的序列包含单链环状部分-线性双链DNA序列部分-单链环状部分。特别地，所述单链环状部分的一或多个核苷酸是被修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的。当该DNA完全变性时，将形成单链环状DNA。

本领域已知如何产生具有粘端的DNA分子，例如通过酶切、扩增等方法。

如本文所用，彼此不互补配对是指两个核酸序列不能通过碱基配对形成双链DNA。例如图3B中目的片段所示。

如本文所用，目标DNA和目标序列可互换使用，是指具有感兴趣的DNA序列的任何DNA序列，所述感兴趣的DNA序列例如包括蛋白质编码序列、启动子序列、调控序列、转基因插入序列等。

在本文中，具有两个粘端的线性目标双链DNA可以具有两个5’突出的粘端、两个3’突出的粘端、或者一个5’突出的粘端和一个3’突出的粘端。

如本文所用，粘端是指DNA分子(5’或3’)末端的单链未配对序列。

如本文所用，5’突出的粘端是指在DNA分子的5’端的单链未配对核苷酸序列；3’突出的粘端是指在DNA分子的3’端的单链未配对核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述粘端的长度可为4-10个核苷酸，优选为4、5、6个核苷酸。

在一个实施方案中，所述粘端主要由G和C组成，例如G+C含量占粘端中总核苷酸含量的50％以上，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或者甚至100％。例如，粘端长度为10个核苷酸时，G+C数目为6、7、8、9或10个，或者粘端长度为6个核苷酸时，G+C数目为4、5或6个，或者粘端长度为4个核苷酸时，G+C数目为3或4个。

在一个特别优选的实施方案中，粘端仅由G和C组成。在一个特别优选的实施方案中，粘端序列为CGGC。

在一个优选实施方案中，所述线性目标双链DNA优选具有两个相同的5’突出的粘端或者两个相同的3’突出的粘端。由于形成了具有两个相同的突出的粘端的DNA分子，因此只需提供一种具有互补粘端的茎环DNA接头，连接后即可闭合所述线性目标双链DNA的两端，形成闭合线性双链DNA分子。

在一个实施方案中，所述线性目标双链DNA的突出的粘端可由特定限制性内切酶消化DNA产生。

限制性内切酶是指能够识别特定核苷酸序列并且切割DNA的一类酶。识别序列是指限制内切酶在催化DNA切割前首先识别的双链DNA中的特异序列，之后该酶在相应的特定位点(切割位点)切割DNA。

如本文所用，限制性内切酶的酶切位点包括识别序列和切割位点，识别序列和切割位点位置上可以重叠也可以是独立的，这取决于限制性内切酶的类型。本领域已知限制性内切酶的酶切位点即识别序列和切割位点，例如参见Wil A M Loenen等，“Highlightsof the DNA cutters:a short history of the restriction enzymes”，Nucleic AcidsRes.,Jan 2014:42(1):3-19.doi:10.1093/nar/gkt990。因此，根据本领域已知技术知识，本领域技术人员可以选择合适的限制性内切酶，以产生本文所述两端均具有非回文结构的突出的粘端且这两个粘端不能彼此互补配对的线性目标双链DNA。

如本文所用，切割位点位于识别序列与目标序列之间是指所述限制性内切酶识别位点远离目标序列的一端需要比切割位点远离目标序列的一端离目标序列更远，从而切割后靠近目标序列一侧将不含或缺失部分识别位点。

特别地，可用于本发明的限制性内切酶是能够产生非回文结构突出的粘端例如5’突出的粘端或3’突出的粘端的限制性内切酶，而且所述限制性内切酶识别位点远离目标序列的一端需要比切割位点远离目标序列的一端离目标序列更远，从而切割后靠近目标序列一侧将不含或缺失部分识别位点，而且该识别位点不会在和茎环连接后重新恢复。可用于本发明的限制性内切酶例如包括但不限于BsmBI，BaeI，BbsI，BspQI，FspEI，I-CeuI等。优选产生的粘端长度不少于4个碱基，且G/C含量不低于50％。

本文所述限制性内切酶包括但不限于识别连续的非对称序列并且在识别位点之外切割DNA的Type IIS类限制性内切酶。在一个优选实施方案中，所述限制性内切酶选自Type IIS类限制性内切酶，例如BsmBI。

如本文所用，回文序列或回文结构是指一段DNA序列，与其互补序列在以相同方向(例如5’至3’方向)读取时具有相同的序列。例如，5’-ACCTAGGT-3’是回文序列或回文结构。

在一个优选的实施方案中，所述线性目标双链DNA具有的两个突出的粘端相同但彼此不互补配对(非回文结构)，例如两个相同的非回文5’突出的粘端或者两个相同的非回文3’突出的粘端。

在本文中，DNA具有两个相同的非回文5’突出的粘端是指该双链DNA两端各有一个5’突出的粘端，在以相同方向(例如均从5’至3’方向)读取时，突出部分的序列具有相同的核酸序列，例如图3B中目的片段所示。同理，如本文所用，DNA具有两个相同的非回文3’突出的粘端是指该双链DNA两端各有一个3’突出的粘端，在以相同方向(例如均从3’至5’方向)读取时，突出部分的序列具有相同的核酸序列。

在本文中，所述线性目标双链DNA两端的粘端序列不是回文序列。由此，在产生的线性目标双链DNA中，两个相同粘端的一个与另一个不是互补的，从而不能自发有效的形成双链，不会优先被T4-DNA聚合酶连接起来产生副产物。

如本文所用，茎环DNA是指具有单链环状部分、双链部分和粘端的DNA分子。当茎环DNA完全变性时，形成线性单链DNA分子。本发明所述茎环DNA仅具有一个粘端。优选地，本发明所述茎环DNA仅具有一个单链环状部分。

在本文中，茎环DNA包括突出的粘端，其与本发明所述的线性目标双链DNA的突出的粘端互补，且后续与所述线性目标双链DNA连接后不会重新生成原目标序列两端的特殊限制性内切酶的酶切位点。

如本文所述，茎环DNA的粘端通过与线性目标双链DNA的粘端互补配对，可以高效连接并提高GC-DNA产量。

在本文中，具有与所述线性目标双链DNA的粘端互补的突出的粘端的茎环DNA是指茎环DNA具有的粘端能够与线性目标双链DNA的粘端互补形成双链。由于茎环DNA只有一个粘端，因此，如果线性目标双链DNA具有两个不同的粘端，则需要提供两种茎环DNA，分别具有与所述线性目标双链DNA两个不同的粘端互补的粘端。

根据DNA碱基配对原理，茎环DNA的粘端和与其互补的线性目标双链DNA的粘端均为5’突出的粘端或3’突出的粘端，即如果线性目标双链DNA的粘端是5’突出的粘端，则与其互补的茎环DNA的粘端也是5’突出的粘端，而如果线性目标双链DNA的粘端是3’突出的粘端，则与其互补的茎环DNA的粘端也是3’突出的粘端。由此，目标DNA的粘端与茎环DNA的粘端可以形成双链，从而将有助于茎环DNA与目标DNA的连接，提高形成闭合线性目标双链DNA分子的效率。

在一个实施方案中，茎环DNA长度可为20-50个核苷酸，优选为20-40个核苷酸，更优选为20-30个核苷酸，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸。

在一个实施方案中，茎环DNA中的环状部分长度可为5-20个核苷酸残基，优选为含5-15个核苷酸残基，更优选为含10-15个核苷酸残基，例如含10、11、12、13、14、15个核苷酸残基。

本领域已知可以修饰核苷酸以抵抗核酸酶的降解，包含但不限于硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基和醛基等修饰。例如，硫代磷酸酯修饰是指将核苷酸的磷酸键中一个非桥连的氧原子置换为硫原子，加入硫代磷酸酯键后核苷酸序列稳定性更好，能抵抗核酸酶的降解，因而可以增强核酸分子的体内稳定性。本领域已知如何进行硫代修饰，如可以通过向引物合成公司直接订购指定数目和位置的带修饰的寡核苷酸接头。

为增加茎环DNA和/或形成的闭合DNA的稳定性，茎环DNA中环状部分的核苷酸是被修饰的。在一个实施方案中，茎环DNA的环状部分中的一或多个、甚至全部的核苷酸是被修饰的，例如是硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰的。优选地，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个、甚至全部的核苷酸是硫代磷酸酯修饰的。

在一个实施方案中，茎环DNA包含如下核苷酸序列：

gccgATCGCGAG*A*G*G*G*T*T*G*A*CTCGCGAT(SEQ ID NO：5)，其中星号表示的核苷酸中的一或多个、优选全部是被修饰的，例如是硫代磷酸酯修饰的。

具有与线性目标双链DNA粘端互补的突出的粘端的茎环DNA可以以任何合适的方法产生，包括例如扩增(如PCR)、合成、经内切酶消化等。产生具有特定序列的DNA分子是本领域熟知的。

如本文所用，连接是指将一个DNA分子与另一个DNA分子结合形成新的DNA分子。连接可以通过本领域已知的任何合适技术进行，例如使用T4-DNA连接酶、T3-DNA连接酶、T7-DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热稳定5’AppDNA连接酶等。本领域已知用于连接核酸分子的连接酶，包括但不限于T4-DNA连接酶。

在一个实施方案中，在连接时，线性目标双链DNA和茎环DNA的摩尔比例可以是任何合适的比例，例如1:1至1:15，1:1至1:14，1:1至1:13，1:1至1:12，1:1至1:11，1:1至1:10，1:1至1:9，1:1至1:8，1:1至1:7，1:1至1:6，1:2至1:15，1:2至1:14，1:2至1:13，1:2至1:12，1:2至1:11，1:2至1:10，1:2至1:9，1:2至1:8，1:2至1:7，1:2至1:6，1:3至1:15，1:3至1:14，1:3至1:13，1:3至1:12，1:3至1:11，1:3至1:10，1:3至1:9，1:3至1:8，1:3至1:7，1:3至1:6。在一个实施方案中，在连接时，线性目标双链DNA和茎环DNA的摩尔比例为1:3至1:6，在此范围内，出人意料地，闭合线性双链DNA的连接效率和产物纯度明显优于其他比例范围。

在一个优选的实施方案中，在存在所述限制性内切酶的情况下，连接所述线性目标双链DNA和茎环DNA，其中所述限制性内切酶可以切割连接副产物(如重新环化的含所述限制性内切酶酶切位点的质粒DNA或重新连接成的两端含所述限制性内切酶酶切位点的目标序列的原始PCR产物)，从而提高所需闭合线性双链DNA的产量和抑制连接副产物的产生。优选地，所述目标序列内、所述线性目标双链DNA内、所述闭合线性双链DNA内均不含有所述限制性内切酶的酶切位点。

如本文所用，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA可以采用本领域已知的任何合适方法或手段进行，例如层析、HPLC、沉淀等。在一个实施方案中，可以使用核酸外切酶，例如Exonuclease III(Exo III)。所述核酸外切酶，例如Exo III能够去除连接后体系中的非闭合线性双链DNA，以纯化所需的闭合线性双链DNA。

在一个实施方案中，本发明提供了一种制备能够抗核酸酶降解的闭合线性双链DNA的方法，包括：

(a)提供一条含目标序列和分别在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中所述限制性内切酶可在目标序列两端切割该双链DNA，产生具有非回文结构的5’突出的粘端和3’突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，

(b)用所述限制性内切酶消化所述线性目标双链DNA，产生一条具有非回文结构的粘端的5’突出的粘端和3’突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(c)提供具有与所述线性目标双链DNA的5’突出粘端互补配对的5’突出粘端的茎环DNA和具有与所述线性目标双链DNA的3’突出粘端互补配对的3’突出粘端的茎环DNA，其中所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(d)连接所述线性目标双链DNA和茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和

(e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的酶切位点。

在一个实施方案中，本发明提供了一种制备能够抗核酸酶降解的闭合线性双链DNA的方法，包括：

(a)提供一条含目标序列和分别在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中所述限制性内切酶可在目标序列两端切割该双链DNA，产生具有非回文结构的两个5’突出的粘端或两个3’突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，

(b)用所述限制性内切酶消化所述线性目标双链DNA，产生具有非回文结构的两个5’突出的粘端或两个3’突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有与所述线性目标双链DNA序列的粘端互补配对的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(d)连接(b)获得的所述线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和

(d)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的酶切位点。

在一个优选的实施方案中，所述线性目标双链DNA具有的两个相同的5’突出的粘端或两个相同的3’突出的粘端，其中所述粘端的序列不是回文序列。

在一个实施方案中，如下提供所述具有彼此不互补配对的两个突出的粘端的线性目标双链DNA：

(i)提供一条具有第一限制性内切酶的酶切位点、目标DNA序列、第二限制性内切酶的酶切位点的互补序列的双链DNA(例如线性双链DNA)，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，

(ii)用所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶消化所述双链DNA，产生一条两端均具有非回文结构粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，其中，除所述第一和第二酶切位点中的识别序列外，所述双链DNA、所述线性目标双链DNA和/或形成的闭合线性双链DNA中不含有所述第一和第二限制性内切酶的识别序列。

优选地，所述方法包括在存在所述限制性内切酶的情况下连接所述目标DNA和茎环DNA以形成闭合线性双链DNA。

如本文所用，“互补序列”是指与给定序列能够以相反方向(即5’-3’/3’-5’)以A-T或G-C形式互补，从而形成双链DNA的序列，例如5’-ATGC-3’和5’-GCAT-3’彼此是互补序列。

本文中，提及DNA含有一个给定序列的互补序列是指所述给定序列的互补序列在所述DNA上以5’至3’方向存在。例如，DNA含有序列5’-ATGC-3’的互补序列是指所述DNA(以5’至3’方向)含有序列5’-GCAT-3’。例如，图3B上图所示的核苷酸序列的两端序列所示。

如本文所用，“粘端”是在本文所述限制性内切酶识别特定识别序列后，在所述酶的切割位点处切割，形成的突出的单链未配对末端。本领域技术人员根据本领域已知的限制性内切酶的酶切位点特性，可以设计所需的突出的粘端。所述酶的切割位点和识别序列可以是不同的序列，也可以是识别序列的一部分，只要酶切割DNA后能够形成所需的突出的粘端即可。在一个特别优选的实施方案中，所述限制性内切酶在识别位点以外的碱基处切割DNA双链(即切割位点不在识别序列内)，形成粘端，例如选自Type IIS类限制性内切酶的酶，特别优选BsmBI。由此，可以更加灵活设计酶切位点，以形成所需的突出的粘端。

为尽量少的在产生的所需DNA中引入多余序列，在酶切之后产生的线性目标双链DNA含有非目标DNA序列越少越好。为此，设计限制性内切酶的酶切位点，从而在酶切后，除形成突出的粘端序列外，其余酶切位点的序列(例如识别序列)不存在于产生的线性目标双链DNA中。为此，将酶切位点的切割位点置于酶切位点的识别序列和目标序列之间。由此，在用所述酶消化后，至少部分识别序列不存在于获得的线性目标双链DNA中。

对于切割位点位于识别序列下游(3’端)的限制性内切酶而言，双链DNA在一条链的末端应包含5’-识别序列-切割位点-目标序列或其互补序列-3’或5’-目标序列或其互补序列-切割位点的互补序列-识别序列的互补序列-3’，由此酶切后，至少部分识别序列不会存在于包含目标序列的DNA片段中。

对于切割位点位于识别序列上游(5’端)的限制性内切酶而言，双链DNA在一条链的末端应包含5’-目标序列或其互补序列-切割位点-识别序列-3’或5’-识别序列的互补序列-切割位点的互补序列-目标序列或其互补序列-3’，由此酶切后，至少部分识别序列不会存在于包含目标序列的DNA片段中。

因此，在一个实施方案中，提供一条含目标序列和在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中在每个末端，酶切位点的切割位点位于其识别序列和目标序列之间并且两个酶切位点的序列是反向的。

本文中，所述“两个序列是反向的”是指两个序列中的一个序列(5’-3’方向)位于双链DNA中的一条链上，而另一个序列(5’-3’方向)位于互补链上。

在一个实施方案中，所述双链DNA在同一条链上包含：第一限制性内切酶的识别序列-目标序列-第二限制性内切酶的切割位点的互补序列。在一个优选的实施方案中，所述双链DNA在同一条链上包含：第一限制性内切酶的识别序列-第一限制性内切酶的切割位点-目标序列-第二限制性内切酶的切割位点的互补序列-第二限制性内切酶的识别序列的互补序列。如此，酶消化后，识别序列不再保留在所需的线性目标双链DNA片段上。

本领域技术人员可以根据本领域已知关于限制性内切酶的知识选择合适的限制性内切酶并且设计酶切位点，从而在限制性内切酶消化DNA后形成所需的突出的粘端，并满足除在双链DNA两端的酶切位点中的识别序列外，本发明所述目标序列、线性目标双链DNA和闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列的要求。

以BsmBI酶为例，如图3A所示，BsmBI酶的酶切位点为：CGTCTCN1N2N3N4N5，其中识别序列为CGTCTCN1，其切割位点为N2N3N4N5，该酶在N1的3’和识别序列下游第4个核苷酸碱基的互补配对碱基的5’位置，从而可以形成具有4个核苷酸的5’突出的粘端(N2N3N4N5)，其中N1-N5为任意核苷酸碱基。由此，可以根据需要设计切割位点序列N2N3N4N5的序列组成，从而形成所需的突出的粘端序列。因此，特别优选这种在识别序列之外的位点切割DNA的限制性内切酶。

在一个实施方案中，所述双链DNA在一条链上包含BsmBI酶切位点(CGTCTCN1N2N3N4N5(SEQ ID NO：11)，其中N1-N5为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一)、目标DNA序列和另一限制性内切酶的酶切位点的互补序列(例如所述BsmBI酶切位点的互补序列：N5’N4’N3’N2’N1’GAGACG(SEQ ID NO：12)，其中N1’-N5’分别为与N1-N5配对的核苷酸碱基)，条件是产生的两个突出的粘端是非回文结构的且不能彼此互补配对，优选N2-N5中至少3个或所有4个选自G和C。

在一个优选的实施方案中，所述双链DNA在一条链上包含CGTCTCN1N2N3N4N5(SEQID NO：11)、目标DNA序列和N5’N4’N3’N2’N1’GAGACG(SEQ ID NO：12)，其中N1-N5为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一，N1’-N5’分别为与N1-N5配对的核苷酸碱基，条件是N2N3N4N5不是回文序列，优选N2-N5中至少3个或所有4个选自G和C。

在进一步优选的实施方案中，所述双链DNA在一条链上包含CGTCTCTCGGC(SEQ IDNO：4)、目标DNA序列和GCCGAGAGACG(SEQ ID NO：13)。

可以使用本领域已知的任何合适的方法产生所述的两端分别具有特定核苷酸序列的DNA(例如线性双链DNA)分子，包括例如但不限于扩增(例如PCR)、分子连接等。

以开环双链DNA或闭合双链DNA作为模板DNA，其中可以设计引物，以包括特定序列和特异于感兴趣的DNA序列上下游的互补序列，从而通过扩增技术例如PCR产生所述两端分别具有所述特定序列的DNA。

在一个实施方案中，如下提供所述两端均具有非回文结构且不能彼此互补配对的粘端的线性目标双链DNA：

(1)提供感兴趣的双链DNA，

(2)提供一对引物，该对引物分别包含限制性内切酶的酶切位点及感兴趣的DNA序列上游序列或下游序列，以感兴趣的DNA序列为模板，进行PCR扩增，条件是用所述限制性内切酶消化所述线性目标双链DNA后产生两个突出的粘端，这两个粘端均是非回文结构的且不能彼此互补配对，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与感兴趣的双链DNA之间，

(3)用所述限制性内切酶消化步骤(2)获得的PCR扩增产物，产生所述两端均具有非回文结构且不能彼此互补配对的粘端的线性目标双链DNA。

在一个实施方案中，可以将目标双链DNA克隆入具有两个酶切位点的质粒中，使得目标序列的两端各具有一个酶切位点，当使用识别所述酶切位点的限制性内切酶酶切质粒时可产生两端均具有非回文结构突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对。

在一个实施方案中，如下提供所述两端均具有非回文结构且不能彼此互补配对的粘端的线性目标双链DNA：

(1)提供模板质粒DNA，该模板质粒DNA中在给定序列两侧各含有至少一个酶切位点，对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与给定序列之间，使用识别所述酶切位点的限制性内切酶酶切质粒DNA时可产生一个在两端具有非回文结构的突出的粘端的DNA片段，且这两个粘端不能彼此互补配对，优选所述酶切位点不存在于所述质粒序列的其他位置，

(2)将线性目标双链DNA克隆入所述质粒，使其两侧各具有所述至少一个酶切位点之间，

(3)用使用识别所述酶切位点的限制性内切酶消化步骤(2)获得的质粒，获得一条两端均具有非回文结构突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对。

所述两个粘端的序列可以相同或不同，优选是相同的。

在一个优选的实施方案中，上述步骤(3)获得一条具有非回文结构且彼此不互补的两个5’突出的粘端的线性目标双链DNA，更优选地，获得一条具有两个相同的非回文结构的5’突出的粘端的目标DNA。

在一个优选的实施方案中，上述步骤(3)获得一条具有非回文结构且彼此不互补的两个3’突出的粘端的线性目标双链DNA，更优选地，获得一条具有两个相同的非回文结构的3’突出的粘端的目标DNA。

如本文所用，质粒能够在生物体内复制的环状双链DNA载体，其包含复制起点、克隆位点，以及任选包含选择标记，例如抗生素抗性基因。本文所述质粒包含能够所述限制性内切酶的两个酶切位点，其中所述两个酶切位点的识别序列位于双链DNA的不同链上，由此所述内切酶切割所述质粒DNA可以获得具有彼此不互补的两个突出的粘端的目标DNA片段。

在一个实施方案中，所述质粒在同一条链上包含BsmBI酶切位点CGTCTCN₁N₂N₃N₄N₅及其互补序列，其中N₁-N₅为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一，并且N₂-N₅中至少3个或所有4个选自G和C，条件是N₂N₃N₄N₅不是回文序列。

在一个实施方案中，所述质粒在同一条链上包含DNA序列CGTCTCTCGGC(SEQ IDNO：4)及其互补序列。

在一个实施方案中，所述质粒包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

如本文所用，将目标双链DNA克隆入质粒中是指将目标DNA序列通过本领域已知的合适手段(例如使用限制性内切酶)插入在所需位置，即所述目标双链DNA的序列两端分别与所述酶切位点连接。

如本文所用，消化是在适合限制性内切酶切割DNA核酸分子的条件下，将酶与DNA分子孵育，使得限制性内切酶识别DNA分子中的限制性内切酶识别序列并相应切割DNA分子。本领域已知特定酶所需的消化条件，例如pH、温度、辅离子例如镁离子等的存在与否等。

优选地，进行连接时，在反应体系中同时存在所述限制性内切酶。这样可以有效防止被切开的部分序列重新连接回初始序列。由此，酶切后无需纯化，可以直接配制连接体系进行连接反应。

在一个方面，本发明提供了通过本发明的方法获得或可获得的线性闭合DNA。在一个实施方案中，所述线性闭合DNA的序列包含茎环部分-目标双链DNA序列部分-茎环部分，其中所述茎环部分的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的。通过本文所述方法获得的线性闭合DNA能够抗核酸酶降解，具有提高的稳定性。

在一个方面，本发明提供了一种质粒DNA，其包含第一限制性内切酶的酶切位点、给定序列或目标序列和第二限制性内切酶的酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与给定序列或目标序列之间，其中该质粒被所述第一和第二限制性内切酶消化后能够产生一条两端均具有非回文结构突出的粘端的线性双链DNA片段，且这两个粘端不能彼此互补配对。优选地，所述质粒被所述限制性内切酶消化后产生一条具有两个5’突出的粘端或两个3’突出的粘端、特别是两个相同的5’突出的粘端或两个相同的3’突出的粘端的DNA片段，并且所述突出的粘端的序列不是回文序列。

如本文所用，给定序列是指将目标DNA克隆入质粒中时被目标DNA替换的DNA序列，其可以是任何合适的DNA序列，包括例如原核序列、多克隆位点等。

所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶可以相同或不同，优选是相同的。

在一个实施方案中，所述质粒在同一条链上包含DNA序列CGTCTCN₁N₂N₃N₄N₅及其互补序列，其中N₁-N₅为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一，并且N₂-N₅中至少3个或所有4个选自G和C，条件是N₂N₃N₄N₅不是回文序列，优选地，N₂N₃N₄N₅为CGGC。

在一个实施方案中，所述质粒在同一条链上包含DNA序列CGTCTCTCGGC(SEQ IDNO：4)及其互补序列。

在一个实施方案中，所述质粒包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明公开的闭合线性双链DNA生产方法与现有方法相比，简单快捷且避免目的序列发生错配或突变，确保序列准确性。另外，本发明证明了通过本发明所述方法生产的闭合线性双链DNA具有表达蛋白的正常功能。因此，根据本发明的方法产生的闭合线性双链DNA可替代传统质粒DNA，具有广泛的应用前景，例如由于本发明方法简单并且生产的闭合线性GC-DNA安全性高、稳定性好，可以用于DNA疫苗领域；另外，GC-DNA也可广泛应用于基因编辑、基因治疗或细胞治疗等领域。

如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。

如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％。

本文公开的范围应该认为也具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度均适用这点。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例中涉及的主要材料包括安徽通用生物公司合成的质粒DNA(SEQ ID NO：1)及接头引物(SEQ ID NO：5)、BsmBI快速内切酶及缓冲液(美国ThermoFisher Scientific公司)、T4-DNA连接酶及缓冲液(南京诺唯赞生物技术有限公司)、Exo III核酸外切酶及缓冲液(美国ThermoFisher Scientific公司)、50×TAE缓冲液(上海生工生物工程公司)、核酸染料(上海生工生物工程公司)、琼脂糖(上海生工生物工程公司)、DNA Ladder(美国ThermoFisher Scientific公司)、293T细胞(美国ATCC中心)、聚乙烯亚胺(PEI，美国Sigma-Aldrich公司)等。

实施例1：GC-DNA产生和鉴定

1.产生线性DNA：

本实施例中使用的线性DNA是通过限制性内切酶法从模板质粒DNA中获得。所述模板质粒通过安徽通用生物公司进行基因合成和亚克隆获得，质粒上包含启动子、报告基因及polyA尾等目的序列，并且在两端添加Type IIS类限制性内切酶BsmBI的酶切位点以便将目的序列与细菌序列分隔开(图2B)。模板质粒DNA图谱见图2，核苷酸序列见SEQ IN NO：1。具体过程为：

通过无内毒素质粒大提试剂盒(北京天根生化科技有限公司)获得大量质粒DNA，按说明书配制酶切体系：将质粒DNA与BsmBI及缓冲液(美国ThermoFisher Scientific公司)混合均匀，工作温度下反应1至2小时。反应结束后，无需进行纯化，直接进行后续操作。

BsmBI酶切示意图见图3A-3C。

2.产生茎环接头：

引物序列(SEQ IN NO：5)从安徽通用生物公司合成获得。引物经过高温退火，最终形成茎环接头，且该茎环接头的末端存在可与线性目标DNA结合的粘端(图4所示)。为提高DNA的稳定性，在合成引物过程中在环区的核苷酸上加上硫代磷酸酯修饰，这种修饰可以阻止单链环的部分被核酸酶降解。将引物用无核酶水稀释后(1μM)进行退火反应，通过保持在95℃下5至10分钟来进行变性，接着缓慢降温以使茎环接头最大化形成，最终温度可降低至4℃。

3.GC-DNA形成及鉴定：

将适当包含T4-DNA连接酶(5μl/100μl反应体系)和连接缓冲液(南京诺唯赞生物技术有限公司)加入退火后的引物(即茎环接头)(20μl/100μl反应体系)和酶切后获得的线性DNA(10μg/100μl反应体系)混合物中。在16℃温度下反应16小时，或直接过夜孵育。

然后，通过乙醇沉淀法或者商品化纯化回收试剂盒对获得的连接产物进行纯化。取0.3至1μg纯化产物，加入适当Exo III核酸外切酶(美国ThermoFisher Scientific公司)及其缓冲液，混合均匀后，在37℃下反应15分钟。以正常质粒DNA为阳性对照组，及以经过酶切或PCR获得的样品为阴性对照组。反应结束后，通过凝胶电泳对样品进行检测，保持样品上样质量一致。

结果见图5，经过Exo III核酸外切酶处理后，阳性对照组中条带未消失，而阴性对照组中条带完全消失，表明Exo III核酸外切酶可用来区分闭合DNA与线性DNA。在纯化的连接产物中，经过Exo III核酸外切酶处理后，条带依然存在，表明纯化产物中存在闭合线性双链DNA。

4.线性目标DNA与茎环接头连接摩尔比：

通常，连接体系中线性目标DNA与茎环接头的摩尔比例会影响连接效率，即GC-DNA产率。本发明比较了不同摩尔比列连接产物的差异。

具体实施过程为：将线性目标DNA与茎环接头按1:1至1:15范围的不同摩尔比混合，然后加入适当T4-DNA连接酶和连接缓冲液；在16℃下反应16小时，或直接过夜孵育。反应结束后，通过乙醇沉淀法或者商品化纯化回收试剂盒对获得的连接产物进行纯化。然后取0.3至1μg纯化产物，加入适当Exo III核酸外切酶(美国ThermoFisher Scientific公司)及其缓冲液，混合均匀后，在37℃下反应15分钟。同时以正常质粒DNA为阳性对照组，及以经过酶切或PCR获得的样品为阴性对照组。反应结束后，通过凝胶电泳对样品进行检测，保持样品上样质量一致。

结果见图6，经过Exo III核酸外切酶处理后，阳性对照组中条带未消失，而阴性对照组中条带完全消失，表明反应完全。经过Exo III核酸外切酶处理后，不同比例连接产物均有条带，而1:1.5组的条带相比其他组较弱，1:3及1:6组的条带相对较强，表明线性目标DNA与茎环接头的摩尔比在1:3至1:6范围时，连接效率较强。此外，与未进行Exo III核酸外切酶处理的样品相比，1:3至1:6摩尔比范围的连接产物条带亮度变化较小，表明产物中闭合线性双链DNA(GC-DNA)比例较高。

实施例2：

1.PCR法快速制备GC-DNA：

根据模板质粒中目的片段序列设计PCR引物(SEQ IN NO：6和7)，引物中含有使用的限制性内切酶BsmBI的识别序列。使用PCR高保真酶(南京诺唯赞生物技术有限公司)，根据说明书配制PCR体系并进行PCR反应。反应完成后，可通过凝胶电泳检测PCR产物(SEQ IDNO：8)。结果见图7A，该PCR产物除了目的条带，产物中还有2条非特异性条带，这与引物特异性有关，可以通过更换引物或者提高退火温度来减少非特异性条带的产生。

然后通过凝胶电泳或者PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收。接着如实施例1所述酶切及连接法制备GC-DNA进行后续操作，即用限制性内切酶BsmBI对PCR产物进行酶切，并与茎环接头进行连接。连接完成后，用Exo III核酸外切酶对产物进行鉴定。结果见图7B，Exo III核酸外切酶反应后，GC-DNA中目的条带存在，表明通过PCR法可获得GC-DNA。

2.GC-DNA纯化：

为了获得更高纯度线性闭合DNA，用Exo III核酸外切酶对样品进行处理或者通过层析柱对样品进行进一步纯化。在此，对于PCR法制备的GC-DNA，由于PCR产物中存在非特异性条带，根据不同条带大小不同，利用分子筛色谱柱(苏州赛分科技股份有限公司)对体外连接产物进行纯化。

根据高效液相色谱仪(HPLC)及分子筛色谱柱说明书进行操作，流动相为Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)。当开始出峰时，收集样品，每20秒收集一管样品，结束后可以进行浓度检测或凝胶电泳检测。结果见图8，HPLC纯化后，所用分子筛色谱柱可明显将小条带分离。样品纯化效果与色谱柱灵敏度有关，更换适合的分子筛色谱柱，有可能获得更高纯度的闭合线性双链DNA。

3.GC-DNA细胞转染及功能验证：

为了验证获得的GC-DNA是否能表达目的蛋白，将获得的GC-DNA进行细胞转染，并在荧光显微镜下观察报告基因(绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO：3))是否表达。

具体实施过程为：转染前一天将293T细胞进行传代接种，细胞培养及传代方法参照《细胞培养技术》(兰容、周珍辉主编)中具体方法进行，所涉及的试剂均来源于商业化产品。当细胞汇合度达到70至80％时，将准备好的GC-DNA(1μg)通过转染导入细胞中，转染方法可以选择例如脂质体转染、钙转、PEI转染或电转。转染48小时后，可观察细胞中GFP表达。

结果见图9，闭合线性双链DNA(GC-DNA)转染后，绿色荧光蛋白可正常表达，表明生产的闭合线性双链DNA(GC-DNA)可以和传统质粒载体一样表达蛋白。

4.GC-DNA稳定性验证

为了验证GC-DNA的稳定性，本发明将获得的GC-DNA进行细胞转染，并将细胞培养7天，通过荧光定量PCR检测细胞中DNA序列的相对含量，并与转染质粒DNA及线性DNA的分组进行比较(通过测试各分组中均包含的GFP基因序列的相对含量，SEQ ID NO：3)。

具体实施过程为：转染前一天将293T细胞进行传代接种，细胞培养及传代方法参照《细胞培养技术》(兰容)中具体方法进行，所涉及的试剂均来源于商业化产品。当细胞密度达到70至80％时，将准备好的GC-DNA、线性DNA或质粒DNA(1μg)通过转染导入细胞中，转染方法可以选择例如脂质体转染、钙转、PEI转染或电转。细胞培养3天及7天后收集细胞，细胞沉淀溶于缓冲液中保存，缓冲液可选择PBS或TE缓冲液等。收集到的细胞样品经过反复冻融3次后，离心并收集上清。根据荧光定量试剂盒说明书(诺唯赞)进行荧光定量PCR检测。

最初通过转染进入细胞的外源DNA在细胞内会逐渐被降解，也会通过细胞分裂不断被稀释。转染7天后，相同数量细胞中的外源DNA含量比转染3天后明显下降(二者相对比值小于100％)，但GC-DNA组中转染7天后的外源DNA含量相对转染3天后的百分比明显高于环状质粒组及线性DNA组(结果见图10)。这表明本发明生产的GC-DNA在细胞内的稳定性明显高于环状质粒及线性DNA。

本发明的序列

质粒DNA核苷酸序列(SEQ IN NO:1)

ggccaacaatatcatgatattgttattcgtctctcggctctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgttgtacgggccagatatcgcgttgacattgatttaaattgatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatgcctgactaattttttttatttatgcagaggccgagcccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggccgttaacgacatcgtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgaccggttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagacatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagaattttgtaatacgactcactatagggcggccgggattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccggcgcgccagatctcaagcttaactagctagcggaccgacgcgtacgcggccgctcgagatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaggtttatccgatccaccggatctagataagataaacggccggccgcggtctgtacaagtaggattcgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgatcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcatccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagcatgtgaattcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggatgcatagccgagagacgaataacaatatcatgatattgttggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctggctccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaataataccgcgactcccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttacgcaacgttgttgccatcgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctcctatcgttgtcagaagtaagttcgccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactgggctgtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcgcccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggt

绿色荧光蛋白核苷酸序列(SEQ IN NO:2)

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa

绿色荧光蛋白氨基酸序列(SEQ IN NO:3)

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

含有BsmBI酶识别位点的DNA序列(SEQ IN NO:4)

5’-CGTCTCTCGGC-3’

茎环接头引物序列(SEQ IN NO:5)

gccgATCGCGAG*A*G*G*G*T*T*G*A*CTCGCGAT(星号表示硫代修饰)

PCR上游引物序列(SEQ IN NO:6)

CGTCTCTCGGCTCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCG

PCR下游引物序列(SEQ IN NO:7)

CGTCTCTCGGCTCACATGCTGCTAGAGA

PCR扩增片段核苷酸序列(SEQ IN NO:8)

cgtctctcggctctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagacatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagaattttgtaatacgactcactatagggcggccgggattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccggcgcgccagatctcaagcttaactagctagcggaccgacgcgtacgcggccgctcgagatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaggtttatccgatccaccggatctagataagataaacggccggccgcggtctgtacaagtaggattcgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgatcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcatccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagcatgtgagccgagagacg

GFP_qPCR上游引物序列(SEQ IN NO:9)

CAGTGCTTCAGCCGCTACCC

GFP_qPCR下游引物序列(SEQ IN NO:10)

GCTCGATGCGGTTCACCAG

序列表

<110> 宜明（苏州）细胞生物科技有限公司

<120> 新型闭合线性双链DNA的体外制备技术

<130> I2022TC6779CB

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7648

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 质粒

<400> 1

ggccaacaat atcatgatat tgttattcgt ctctcggctc tgcttagggt taggcgtttt 60

gcgctgcttc gcgttgtacg ggccagatat cgcgttgaca ttgatttaaa ttgatcccgc 120

ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgc ctgactaatt ttttttattt 180

atgcagaggc cgagcccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 240

ttggaggccg ttaacgacat cgtctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 300

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 360

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 420

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 480

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 540

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 600

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 660

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 720

tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 780

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagcg cgaccggttt 840

tgcctgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact 900

agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc 960

ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa 1020

aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagggaaacc agaggagctc 1080

tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg 1140

gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc 1200

gtcagtatta agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg 1260

ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc 1320

gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta 1380

caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc 1440

ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata 1500

gaggaagagc aaaacaaaag taagaccacc gcacagcaag cggccggccg ctgatcttca 1560

gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag 1620

taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag 1680

aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca 1740

ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag 1800

tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca 1860

cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg 1920

atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc 1980

cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga 2040

tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat 2100

cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt 2160

tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag 2220

taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta 2280

ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca 2340

ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag 2400

tgaacggatc ggcactgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat 2460

tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata 2520

gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg 2580

gtttattaca gggacagcag agatccagtt tggttagtac cgggcccgct ctagacatgt 2640

ccaatatgac cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 2700

gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 2760

ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 2820

atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 2880

gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat 2940

gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact 3000

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 3060

accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 3120

gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaataac 3180

cccgccccgt tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 3240

gctcgtttag tgaaccgtca gaattttgta atacgactca ctatagggcg gccgggattc 3300

gtcgactgga tccggtaccg aggagatctg ccgccgcgat cgccggcgcg ccagatctca 3360

agcttaacta gctagcggac cgacgcgtac gcggccgctc gagatggtga gcaagggcga 3420

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 3480

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 3540

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 3600

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 3660

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 3720

ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 3780

gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 3840

caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 3900

caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 3960

cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 4020

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 4080

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaggtttat ccgatccacc 4140

ggatctagat aagataaacg gccggccgcg gtctgtacaa gtaggattcg tcgagggacc 4200

taataacttc gtatagcata cattatacga agttatacat gtttaagggt tccggttcca 4260

ctaggtacaa ttcgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga 4320

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 4380

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 4440

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 4500

gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 4560

cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 4620

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 4680

ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 4740

gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 4800

gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 4860

cctttgggcc gcctccccgc atcgataccg tcgacctcga tcgagaccta gaaaaacatg 4920

gagcaatcac aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg ctagaagcac 4980

aagaggagga ggaggtgggt tttccagtca cacctcaggt acctttaaga ccaatgactt 5040

acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 5100

ttcactccca acgaagacaa gatatccttg atctgtggat ctaccacaca caaggctact 5160

tccctgattg gcagaactac acaccagggc cagggatcag atatccactg acctttggat 5220

ggtgctacaa gctagtacca gttgagcaag agaaggtaga agaagccaat gaaggagaga 5280

acacccgctt gttacaccct gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag agagaagtat 5340

tagagtggag gtttgacagc cgcctagcat ttcatcacat ggcccgagag ctgcatccgg 5400

actgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag 5460

ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc 5520

gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa 5580

tctctagcag catgtgaatt cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 5640

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 5700

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 5760

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 5820

gggatgcggt gggctctatg gatgcatagc cgagagacga ataacaatat catgatattg 5880

ttggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 5940

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 6000

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 6060

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 6120

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 6180

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 6240

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 6300

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 6360

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 6420

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 6480

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 6540

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 6600

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 6660

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 6720

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctggct ccccgtcgtg tagataacta 6780

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat aataccgcga ctcccacgct 6840

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 6900

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 6960

gtagttcgcc agttaatagt ttacgcaacg ttgttgccat cgctacaggc atcgtggtgt 7020

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7080

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctcct atcgttgtca 7140

gaagtaagtt cgccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 7200

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactgggct gtactcaacc aagtcattct 7260

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 7320

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 7380

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcgcccaact 7440

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 7500

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 7560

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 7620

gtatttagaa aaataaacaa ataggggt 7648

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 绿色荧光蛋白核苷酸序列

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 绿色荧光蛋白氨基酸序列

<400> 3

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1               5                   10                  15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

            20                  25                  30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

        35                  40                  45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

    50                  55                  60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65                  70                  75                  80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

                85                  90                  95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

            100                 105                 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

        115                 120                 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

    130                 135                 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145                 150                 155                 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

                165                 170                 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

            180                 185                 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

        195                 200                 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

    210                 215                 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225                 230                 235

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BsmBI+酶识别位点+粘端序列

<400> 4

cgtctctcgg c 11

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 茎环接头引物序列

<220>

<221> modified_base

<222> (12)..(20)

<220>

<221> modified_base

<222> (12)..(20)

<223> 硫代磷酸酯修饰

<400> 5

gccgatcgcg agagggttga ctcgcgat 28

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR上游引物序列

<400> 6

cgtctctcgg ctctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcg 44

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR下游引物序列

<400> 7

cgtctctcgg ctcacatgct gctagaga 28

<210> 8

<211> 5424

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR扩增片段核苷酸序列

<400> 8

cgtctctcgg ctctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga 60

tatcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcagc gcgttttgcc 660

tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 720

aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 780

ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 840

tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc 900

gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga 960

gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca 1020

gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa 1080

agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag 1140

ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca aatactggga cagctacaac 1200

catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta gcaaccctct 1260

attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac aagatagagg 1320

aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc cggccgctga tcttcagacc 1380

tggaggagga gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa 1440

aattgaacca ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa 1500

aagagcagtg ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat 1560

gggcgcagcg tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca 1620

gcagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt 1680

ctggggcatc aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca 1740

acagctcctg gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg 1800

gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga 1860

gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca 1920

aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg 1980

gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg 2040

aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca 2100

gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc 2160

cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa 2220

cggatcggca ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc agtattcatc cacaatttta 2280

aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa 2340

cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt 2400

attacaggga cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg cccgctctag acatgtccaa 2460

tatgaccgcc atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 2520

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 2580

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 2640

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 2700

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg 2760

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc 2820

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca 2880

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 2940

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg 3000

ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 3060

gtttagtgaa ccgtcagaat tttgtaatac gactcactat agggcggccg ggattcgtcg 3120

actggatccg gtaccgagga gatctgccgc cgcgatcgcc ggcgcgccag atctcaagct 3180

taactagcta gcggaccgac gcgtacgcgg ccgctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag 3240

ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 3300

ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 3360

atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 3420

ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 3480

gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 3540

aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 3600

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 3660

agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 3720

atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 3780

cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 3840

ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 3900

gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag gtttatccga tccaccggat 3960

ctagataaga taaacggccg gccgcggtct gtacaagtag gattcgtcga gggacctaat 4020

aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atacatgttt aagggttccg gttccactag 4080

gtacaattcg atatcaagct tatcgataat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 4140

ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 4200

cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 4260

tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 4320

actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 4380

tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 4440

gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4500

aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4560

tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4620

ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4680

tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgatcga gacctagaaa aacatggagc 4740

aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgattgt gcctggctag aagcacaaga 4800

ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 4860

ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 4920

ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 4980

tgattggcag aactacacac cagggccagg gatcagatat ccactgacct ttggatggtg 5040

ctacaagcta gtaccagttg agcaagagaa ggtagaagaa gccaatgaag gagagaacac 5100

ccgcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag aagtattaga 5160

gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacatggcc cgagagctgc atccggactg 5220

tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 5280

cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 5340

gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 5400

tagcagcatg tgagccgaga gacg 5424

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP_qPCR上游引物序列

<400> 9

cagtgcttca gccgctaccc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP_qPCR下游引物序列

<400> 10

gctcgatgcg gttcaccag 19

<210> 11

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BsmBI酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

cgtctcnnnn n 11

<210> 12

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BsmBI酶切位点的互补序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

nnnnngagac g 11

<210> 13

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO:4的互补序列

<400> 13

gccgagagac g 11

Claims (12)

1.一种制备闭合线性双链DNA的方法，包括：

(a)提供一条含目标序列和在目标序列两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，其中所述限制性内切酶切割该双链DNA时可产生两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(b)用所述限制性内切酶消化所述双链DNA，产生一条两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(c)提供茎环DNA，所述茎环DNA分别具有一个与所述线性目标双链DNA两端的粘端互补配对的突出的粘端，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(d)连接(b)获得的线性目标双链DNA和(c)的茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选在存在所述限制性内切酶的情况下进行连接，和

(e)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

其中，除在(a)的双链DNA中酶切位点中的识别序列外，所述目标序列、所述线性目标双链DNA、所述闭合线性双链DNA均不含有所述限制性内切酶的识别序列。

2.权利要求1的方法，其中：

-(a)中的双链DNA的一条链上包含：第一限制性内切酶的识别序列-第一限制性内切酶的切割位点-目标序列-第二限制性内切酶的切割位点的互补序列-第二限制性内切酶的识别序列的互补序列，优选所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶是相同的，和/或

-所述线性目标双链DNA两端的粘端的序列是相同的，和/或

-所述线性目标双链DNA具有两个5’突出的粘端或两个3’突出的粘端，优选两个相同的5’突出的粘端或两个相同的3’突出的粘端。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括：

(i)提供目标序列，提供一对引物，该对引物分别包含限制性内切酶的酶切位点序列及目标序列的上游或下游序列，以目标序列为模板进行扩增，从而产生所述线性目标双链DNA；或者

(iii)提供目标序列，提供质粒DNA，该质粒DNA包含给定序列和分别位于给定序列两端的至少两个酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，将所述目标序列克隆入所述质粒的所述至少两个酶切位点之间，从而产生所述线性目标双链DNA。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中使用连接酶连接所述目标DNA和茎环DNA以形成闭合线性双链DNA，优选地，所述连接酶选自T4-DNA连接酶、T3-DNA连接酶、T7-DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶和热稳定5’AppDNA连接酶。

5.权利要求1-4任一项的方法，其包括：

(1)提供感兴趣的线性双链DNA，

(2)提供质粒DNA，该质粒DNA包含给定序列和分别位于给定序列两端的至少两个酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与目标序列之间，优选所述至少两个酶切位点是相同的，

(3)将所述感兴趣的线性双链DNA克隆入所述质粒的所述至少两个酶切位点之间，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与感兴趣的线性双链DNA之间，

(4)用分别识别所述酶切位点的限制性内切酶消化所述质粒，获得一条两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(5)提供分别具有一个与所述线性目标双链DNA的粘端互补的突出的粘端的茎环DNA，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(6)优选在存在所述限制性内切酶的情况下，使用连接酶将步骤(4)中获得的线性目标双链DNA和步骤(5)中的茎环DNA连接以形成闭合线性双链DNA，和

(7)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA，

优选地，其中一个酶切位点包含序列：CGTCTCN₁N₂N₃N₄N₅(SEQ ID NO：11)，其中N₁-N₅独立地为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一，条件是N₂N₃N₄N₅不是回文序列，优选N₂-N₅中至少3个或所有4个选自G和C，更优选地，一个酶切位点包含序列CGTCTCTCGGC，

更优选地，所述质粒具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.权利要求1-4任一项的方法，其包括：

(1)提供感兴趣的线性双链DNA，

(2)提供一对引物，该对引物分别包含限制性内切酶的酶切位点及感兴趣的DNA序列上游序列或下游序列，以感兴趣的线性双链DNA为模板，进行扩增，产生一条含感兴趣的线性双链DNA和在感兴趣的线性双链DNA两端的限制性内切酶的酶切位点的双链DNA，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与感兴趣的线性双链DNA之间，其中所述限制性内切酶切割该双链DNA时可产生两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(3)用所述限制性内切酶消化扩增产物双链DNA，产生一条两端均具有非回文突出的粘端的线性目标双链DNA，且这两个粘端不能彼此互补配对，

(4)提供分别具有一个与所述线性目标双链DNA的粘端互补的突出的粘端的茎环DNA，其中，所述茎环DNA的环状部分中的一或多个核苷酸是修饰的，例如被硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰，优选是硫代磷酸酯修饰的，

(5)优选在存在所述限制性内切酶的情况下，使用连接酶将步骤(3)中获得的线性目标双链DNA和步骤(4)中的茎环DNA连接以形成闭合线性双链DNA，和

(6)任选地，分离和/或纯化形成的闭合线性双链DNA。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述突出的粘端的长度为4-10个核苷酸，优选为4-6个核苷酸，更优选为4个核苷酸，和/或所述突出的粘端主要由G和C组成，优选G+C含量占突出的粘端中总核苷酸含量的50％以上，更优选所述突出的粘端仅由G和C组成，例如所述突出的粘端序列为CGGC。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述限制性内切酶选自能产生非回文结构粘端的酶，例如选自BsmBI，BaeI，BbsI，BspQI，FspEI和I-CeuI，

优选地，所述限制性内切酶是BsmBI并且所述限制性内切酶的酶切位点包含CGTCTCN₁N₂N₃N₄N₅，其中N₁-N₅独立地为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一并且N₂-N₅中至少3个或所有4个选自G和C，条件是N₂N₃N₄N₅不是回文序列，更优选地，所述酶切位点为CGTCTCTCGGC(SEQ ID NO：4)。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述茎环DNA的长度为个20-50个核苷酸，优选为20-40个核苷酸，更优选为20-30个核苷酸，和/或所述茎环DNA的环状部分长度为5-20个核苷酸，优选为5-15个核苷酸，更优选为10-15个核苷酸，

更优选地，所述茎环DNA包含序列：

GCCGATCGCGAG*A*G*G*G*T*T*G*A*CTCGCGAT(SEQ ID NO：5)，其中星号表示的核苷酸中的一或多个、优选全部是被修饰的，例如是硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰的，优选是硫代磷酸酯修饰的。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中，在连接时，所述目标DNA和茎环DNA的摩尔比例为1:1至1:15，优选为1:3至1:6。

11.通过权利要求1-10任一项的方法获得或可获得的线性闭合双链DNA，其中所述线性闭合双链DNA的环状部分的一或多个核苷酸是修饰的，例如是硫代磷酸酯、羧基、氨基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基或醛基修饰的，优选是硫代磷酸酯修饰的。

12.一种质粒，其包含给定序列或目标序列和分别在给定序列或目标序列两端的至少两个限制性内切酶的酶切位点，其中对于每个酶切位点，其切割位点位于其识别序列与给定序列或目标序列之间，其中所述限制性内切酶在切割该质粒时，产生一条两端均具有非回文结构突出的粘端的线性双链目标DNA片段，且这两个粘端不能彼此互补配对，

优选地，所述质粒在一条链上包含：第一限制性内切酶的识别序列-第一限制性内切酶的切割位点-目标序列-第二限制性内切酶的切割位点的互补序列-第二限制性内切酶的识别序列的互补序列，更优选地，所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶是相同的，

优选地，所述质粒被所述限制性内切酶消化后产生一条具有两个5’突出的粘端或两个3’突出的粘端、更优选两个相同的5’突出的粘端或两个相同的3’突出的粘端的线性双链目标DNA片段，

优选地，所述质粒包含序列CGTCTCN₁N₂N₃N₄N₅及其互补序列，其中N₁-N₅独立地为脱氧核糖核苷酸A、T、C、G任一并且N₂-N₅中至少3个或所有4个选自G和C，条件是N₂N₃N₄N₅不是回文序列，更优选地，N₂N₃N₄N₅为CGGC，更优选地，所述质粒包含序列CGTCTCTCGGC(SEQ ID NO：4)，更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

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