CN111511928A - 偶联到单一支持物或标签的线性双链dna和用于制备所述线性双链dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及线性双链DNA，其在其非编码链的3'末端偶联到单个支持物或标签，以及制备所述线性双链DNA的方法。本发明还涉及所述线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途，并且还涉及体外制备RNA的方法。本发明还涉及用于RNA体外转录的生物反应器。

Description

偶联到单一支持物或标签的线性双链DNA和用于制备所述线 性双链DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种线性双链DNA，其包含编码序列元件，所述编码序列元件在其非编码链的3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
本发明还涉及一种用于制备上述线性双链DNA的方法。几种方法包括将修饰的脱氧核苷酸添加到线性双链DNA的3'末端并将所述修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签的步骤。通过核酸内切酶消化所获得的线性双链DNA导致线性双链DNA，其仅在其非编码链的3'末端包含支持物或标签。另一种方法包括向线性双链DNA的每条链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸，然后进行核酸内切酶酶切，以获得在非编码链的3'末端带有单个标签的线性双链DNA。还有一种方法包括在具有平端和粘端的线性双链DNA的平端特异性地向所述非编码链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸，并且还包括经由所述经修饰的脱氧核苷酸将所述DNA偶联到支持物或标签。还可以用连接了标签的脱氧核苷酸获得上述非编码链的3'末端的特异性添加。本发明提供了包含用于执行上述方法的必要组分的试剂盒。
包含编码序列元件和在其非编码链的3'末端的支持物或标签的线性双链DNA用于RNA体外转录的用途也是本发明的一部分。此外，本发明还提供了一种体外制备RNA的方法，包括提供如上所述的双链线性DNA作为模板DNA是本发明的一部分。另外，本发明涉及一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包含如上所述的线性双链DNA。
背景技术
基于RNA的疗法是现代医药的最有前景和快速发展的领域之一，因此核糖核酸分子(RNA)代表了一类新兴药物。基于RNA的疗法为各种疾病的治疗提供高度特异性和单独的治疗选项，并且可以例如用于免疫治疗、基因治疗和遗传疫苗接种。因此，需要以合理的价格制备大量的高品质RNA。
通常，RNA是使用合适的DNA模板通过RNA体外转录反应产生的。为了获得适用于基于RNA的治疗剂的均质RNA，RNA必须具有独特的长度，这是通过在体外转录反应中精确终止RNA来实现的。控制RNA体外转录终止的常见方式是在RNA编码序列之后立刻对DNA模板进行线性化。这样就实现了所谓的失控(run-off)RNA体外转录。
为了获得适合在治疗中使用的高级RNA，必须进行各种质量控制步骤，例如确保DNA模板的正确线性化，以及随后通过DNA消化和随后的RNA纯化从RNA产物中除去DNA模板。
因此，RNA制备中的一个关键步骤是生成合适的DNA模板，这在工业规模是主要的成本因素。然而，目前，DNA模板通常只能用于单次RNA体外转录反应，随后需要通过DNAse消化而被破坏并且通过RNA纯化去除，以确保基于RNA的治疗剂的功效和安全性。在最终的基于RNA的治疗剂中残留量的DNA可能会诱导先天免疫系统的激活，并且具有在患者中充当致癌基因的可能。
因此，需要提供一种可再次使用的DNA模板，它在没有破坏的情况下可以容易且有效地从RNA体外转录反应分离。
Marble和Davis描述了从与琼脂糖微珠(bead)相关联的DNA模板进行的RNA体外转录，并且因此可以通过使用温和的离心回收微珠来再次使用。特别地，要在RNA体外转录反应中使用的DNA模板通过DNA模板的非模板链的5'末端的单个生物素与链霉亲和素包被的琼脂糖微珠相关联(Marble and Davis,Biotechnol.Prog.1995,11,393-396)。此外，Liu和Price描述了从DNA模板进行的RNA体外转录，所述DNA模板与链霉亲和素包被的顺磁性颗粒通过5'结合的生物素相关联，所述生物素已经通过聚合酶链式反应(PCR)使用生物素化引物添加到DNA模板中(Liu and Price,Promega Notes,64,1997,21-26)。Fujita和Silver描述了从线性双链DNA模板进行的RNA体外转录，该线性双链DNA模板一端有T7或T3 RNA聚合酶启动子，另一端有单个生物素部分连接到链霉亲和素包被的顺磁性微珠(Fujita andSilver,Biotechniques Rapid Dispatches,14(4)1993,608-617)。Fujita和Silver结论是，当DNA被定向成使得转录朝向微珠进行且DNA通过生物素-dUTP或生物素-dATP部分连接在非模板链的3'末端，合成的RNA的收率和质量大致相当于在溶液中制备的RNA。
如上所述的DNA模板(例如，琼脂糖或磁性颗粒)的基于PCR的关联性具有缺点：关联性是序列依赖性的(例如，必须为每个单独的DNA构建体设计不同的引物对)，并且DNA模板的基于PCR的制备是容易出错的。此外，上述实验室方法不适合在工业规模上大量制备RNA。
尽管已知化学的、非基于PCR的DNA固定化技术，但这些技术不提供DNA与单个支持物或标签的定向偶联。然而，当将DNA模板与支持物或标签偶联以容易且有效地将所述模板从RNA体外转录反应分离时，重要的是，这种偶联以定向方式进行，例如不损害RNA聚合酶(RNAP)的高效失控，这确保了均匀长度的RNA产物(参见图1)。
因此，当前没有方法可用于，在线性DNA模板生成(例如，在从生物体制备DNA之后)后，将支持物或标签与其进行定向非序列、非基于PCR的偶联。
因此，需要提供高质量的线性DNA模板，其在线性DNA模板的期望末端与支持物或标签相关联，并且其可以以相对低的成本大量制备，使得在工业规模上的RNA体外转录将变得可行。
发明内容
本发明通过提供如下在本发明的第一方面中描述的线性双链DNA，以及通过提供如在方面2A-2D中描述的制备所述线性双链DNA的方法，来解决上述需求。在第三和第四方面中，本发明涉及本发明的方面1的DNA用于RNA体外转录的用途和包括使用方面1的DNA的用于体外制备RNA的方法。本发明还涉及用于RNA体外转录的生物反应器和包含使人能够根据本发明的方面2A-2D的方法制备本发明的方面1的线性双链DNA的部分的试剂盒。
以下章节中提到的所有实施方案涉及本章节的具体方面。
第一方面：在其非编码链的3'末端偶联到单个支持物或标签的线性双链DNA
在第一方面，本发明涉及包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含由所述编码链编码的编码序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含由所述编码链编码的编码序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，并且其中所述标签是偶联到所述DNA的唯一标签。
在一个具体实施方案中，与互补编码链的5'末端相比，在其3'末端偶联到支持物或标签的非编码链具有至少一个，优选正好一个脱氧核苷酸悬突。适宜地，所述至少一个脱氧核苷酸悬突是至少一个脱氧腺苷，特别是正好一个脱氧腺苷。
线性双链DNA可以是线性化DNA质粒，例如线性化细菌DNA质粒、线性化DoggyboneTMDNA(dbDNA)、线性合成DNA、PCR扩增DNA、线性化病毒DNA或线性真核DNA，例如线性人DNA。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种线性双链DNA，其在其非编码链的3'末端通过三唑偶联到支持物或标签。所述三唑可以是1,2,3-三唑。在优选的实施方案中，特别是在具有DNA的炔脱氧核苷酸的叠氮化物激活支持物或标签的环加成(叠氮化物-炔Huisgen环加成)反应中形成所述三唑。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及一种线性双链DNA，其在其非编码链的3'末端通过二氢吡嗪部分偶联到支持物或标签。
在另一个具体实施方案中，所述支持物选自由磁性微珠或颗粒、纳米微珠或纳米颗粒、琼脂糖Agarose、琼脂糖Agarose微珠或颗粒、玻璃、玻璃微珠或颗粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组。在一个优选的实施方案中，所述支持物是磁性微珠或颗粒。
在另一具体实施方案中，所述标签选自由生物素、PEG和FLAG组成的组。在一个优选的实施方案中，所述标签是生物素。在一个特别优选的实施方案中，所述生物素与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
在另一个具体实施方案中，所述线性双链DNA的编码序列元件侧翼为5'UTR和/或3'UTR。在优选的实施方案中，所述3'UTR衍生自白蛋白基因，优选人白蛋白基因，或人α-或β-珠蛋白基因。WO2016/107877和WO2017/036580中描述了另外的合适的3'-UTR，特别是根据专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：1-24和SEQ ID NO：49-318或根据专利申请WO2017/036580的SEQ ID NO：152-204的3'-UTR元件。在另一个优选实施方案中，所述5'UTR衍生自32L4核糖体蛋白32L4TOP。在一个特别优选的实施方案中，所述3'UTR衍生自白蛋白且所述5'UTR衍生自32L4核糖体蛋白32L4TOP。WO2016/107877和WO2017/036580中描述了另外的合适的5'-UTR，特别是根据专利申请WO2016/107877的SEQ ID NO：25-30和SEQ ID NO：319-382或专利申请WO2016/036580的SEQ ID NO：1-151。
所述线性双链DNA还可以包括RNA的核细胞质转运所涉及的组蛋白-茎-环结构。组蛋白茎-环序列可优选地衍生自专利申请WO2012/019780的式(I)或(II)。根据另一优选实施方案，如本文所定义的RNA可包含衍生自专利申请WO2012/019780的具体式(Ia)或(IIa)中的至少之一的至少一个组蛋白茎-环序列。此外，线性双链DNA可以包含将聚A尾编码为3'UTR的一部分的至少50个腺嘌呤的伸展区(stretch)和/或将聚C-尾编码为3'UTR的一部分的至少20个胞嘧啶的伸展区和/或在启动子序列元件的3'末端的间隔序列，以将其与支持物或标签分离。此外，线性双链DNA可以关于其GC含量进行优化，以使其更稳定。
在另一具体实施方案中，双链DNA包含在编码序列元件5'的RNA聚合酶启动子序列元件。在一个优选的实施方案中，RNA聚合酶启动子序列元件选自T3、T7、Sny5或SP6 RNA聚合酶启动子序列。
在第二方面，本发明涉及制备第一方面的线性双链DNA的方法(2A-2E)。
第二方面：制备上述DNA的方法
第二方面的方面2A：DNA的消化(c)随后偶联(d)
在方面2A中，本发明涉及用于制备如本发明的方面1中所述的线性双链DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含序列元件的线性双链DNA，所述序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件，(b)向所提供的DNA的每条链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸，(c)在所述酶切位点切割DNA，以从所述编码链的3'末端去除所述经修饰的脱氧核苷酸；和(d)将所述非编码链的3'末端的剩余经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联。
因此，在方面2A中，本发明涉及一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA与识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(d)将步骤(c)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
上述方法的示例性图示可以在图2中找到。
第二方面的方面2B：与DNA偶联(c)随后消化(d)
在方面2B中，本发明涉及一种制备如本发明的方面1中所述的线性双链DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供线性双链DNA，所述线性双链DNA包含由所述编码链编码的序列元件，在所述3'末端随后为酶切位点元件，(b)将经修饰的脱氧核苷酸添加到所提供的DNA的每条链的3'末端，但(c)与方面2A中所述的方法相反，所述经修饰的脱氧核苷酸直接偶联到支持物或标签，和(d)直到那时在所述酶切位点切割在其3'末端偶联到支持物或标签的所述DNA，以从所述编码链的3'末端移除所述支持物或标签。
因此，在方面2B中，本发明涉及用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过在每条链的所述3'末端的所述经修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签；
(d)温育在步骤(c)中获得的DNA与识别所述酶切元件的限制性内切酶，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
以下实施方案涉及如方面2A和2B中所述的方法。
在一个具体实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸选自由炔脱氧核苷酸、叠氮化物脱氧核苷酸、氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸、反式-环辛烯脱氧核苷酸和乙烯基脱氧核苷酸组成的组。
在另一个具体实施方案中，在步骤(b)中能够在链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸的酶是DNA聚合酶。在一个优选的实施方案中，所述DNA聚合酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、酿酒酵母DP1 DNA聚合酶、哺乳动物DNAβ聚合酶、工程化DNA聚合酶、DNA聚合酶I大(Klenow)片段和末端转移酶组成的组。在一个特别优选的实施方案中，所述DNA聚合酶是水生栖热菌DNA聚合酶。由于水生栖热菌DNA聚合酶将腺嘌呤核苷酸排他地添加到双链线性DNA的平头的3'末端，应当理解，如果使用水生栖热菌DNA聚合酶，则在步骤(a)中提供的线性化DNA必须在所述编码序列元件的5'末端包括至少一个平端。
通常，期望当将经修饰的核苷酸添加到DNA链的3'末端时，DNA聚合酶不具有3'-5'外切核酸酶活性。因此，工程化DNA聚合酶可以被基因工程化以消除与许多DNA聚合酶相关联的3'至5'校读外切核酸酶活性。工程化DNA聚合酶的实例是New England BioLabs(NEB)的Vent(exo-)DNA聚合酶和Deep Vent(exo-)DNA聚合酶以及invitrogen的
Figure BDA0002548513960000081
Tfiexo(-)DNA聚合酶。
在一个具体实施方案中，所述支持物选自由磁性微珠或颗粒、纳米微珠或纳米颗粒、琼脂糖Agarose、琼脂糖Agarose微珠或颗粒、玻璃、玻璃微珠或颗粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组。在一个优选的实施方案中，所述支持物是磁性微珠或颗粒。
在另一具体实施方案中，所述标签选自由生物素、PEG和FLAG组成的组。在一个优选的实施方案中，所述标签是生物素。
在另一具体实施方案中，在前述方法的偶联步骤中使用的支持物或标签是活化的支持物或活化的标签。
在一个实施方案中，所述活化的支持物或标签选自由炔活化的支持物或标签、叠氮化物活化的支持物或标签、氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签、四嗪活化的支持物或标签、以及反式-环辛烯活化的支持物或标签组成的组。
“点击化学”描述了在化学反应性基团对之间的快速且高度选择性的反应(“点击”)，并且广泛用于诸如生物科学、药物发现、材料科学和放射性化学等领域。点击化学反应是高度选择性的和生物正交的(这意味着反应物和产物的反应性基团都不与诸如DNA的生物分子的官能团相互作用)。它们在生理条件(中性pH，水溶液和环境温度)下发生，导致副产物很少或没有，因此不需要精心加工或纯化产物，因此产生高收率。
在一个具体实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸经金属催化的叠氮化物-炔点击化学(MAAC)、Cu(I)-催化的叠氮化物-炔点击化学反应(CuAAC)、应变促进的叠氮化物-炔点击化学反应(SPAAC)或四嗪-烯连接与活化的支持物或标签偶联。用于催化点击反应的合适金属例如是Cu、Ru、Ag、Au、Ir、Ni、Zn和Ln。
在一个优选的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸通过CuAAC、SPAAC或四嗪-烯连接与活化的支持物或标签偶联。
点击化学的最突出的例子是CuAAC反应，其中末端炔活化的分子与叠氮化物活化的分子反应，在Cu(I)离子存在下形成三唑部分。可利用不同的铜源，例如CuSO4、CuBr或CuOAc。优选地，使用水溶性CuSO4。
在一个具体的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是炔脱氧核苷酸，并且所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。在一个实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸选自乙炔基-dNTP，例如2-乙炔基-dNTP和5-乙炔基-dNTP，和炔丙基-dNTP，例如N6-炔丙基-dNTP、γ-[(炔丙基)-亚氨基]-dNTP和3'-(O-炔丙基)-dNTP。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
在优选的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基脱氧核苷酸，优选乙炔基-脱氧-腺苷三磷酸(乙炔基-dATP)。
在一个具体的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且所述活化的支持物或标签是炔活化的支持物或标签。在优选的实施方案中，所述叠氮化物脱氧核苷酸选自由8-叠氮基-dNTP、γ-(2-叠氮基乙基)-dNTP、γ-(6-叠氮基乙基)-dNTP、γ-[(6-叠氮基己基)-亚氨基]-dNTP、N6-(6-叠氮基)己基-dNTP、N6-(6-叠氮基)己基-3'-dNTP、3'-叠氮基-2',3'dNTP(azNTP)、5-叠氮基甲基-dNTP、叠氮化物-PEG4-氨基烯丙基-dNTP、5-叠氮基-C3 dNTP、5-叠氮基-PEG4-dNTP和3'-O-叠氮基甲基-dNTP组成的组。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
CuAAC反应对DNA的潜在问题是Cu(I)离子可能产生DNA链断裂并因此损伤DNA。然而，克服该问题可以通过使用Cu(I)-螯合配体，例如三[(l-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)、3-[4-[[双[[l-(3-羟丙基)三唑-4-基]甲基]氨基]甲基]三唑-l-基]丙-l-醇(THPTA)、2-(4-((双((l-(叔丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-l-基)乙酸(BTTAA)及其叔丁基模拟物TTTA。这些配体不仅保护DNA免受氧化损伤，而且通过稳定Cu(I)氧化态中的铜离子来加速CuAAC反应。
在一个具体实施方案中，在Cu(I)-TBTA、Cu(I)-THPTA(TBTA的水溶性替代物)、Cu(I)-BTTAA或Cu(I)-TTTA的存在下进行偶联步骤。在优选实施方案中，在Cu(I)-TBTA或Cu(I)-THPTA存在下进行偶联步骤。在最优选的实施方案中，在Cu(I)-THPTA存在下进行偶联步骤。
使用乙二胺四乙酸(EDTA)是在偶联步骤之后络合和除去Cu(I)离子的方法。
在一个具体的实施方案中，执行另外的洗涤步骤，以在偶联步骤之后通过与EDTA络合除去Cu(I)。
CuAAC的无铜替代物是SPAAC，与末端炔烃相比，依赖于使用具有极少活化能的应变环辛炔的反应。在不需要外源催化剂的情况下，应变的环辛炔与叠氮化物活化的分子反应。
在一个具体的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸，并且所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。在优选实施方案中，所述氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸为5-DBCO-PEG4-dNTP。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在最优选的实施方案中，所述氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸是5-DBCO-PEG4-dATP。
在另一个具体实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且所述活化的支持物或标签是氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签。在优选的实施方案中，所述叠氮化物脱氧核苷酸选自由8-叠氮基-dNTP、γ-(2-叠氮基乙基)-dNTP、γ-(6-叠氮基乙基)-dNTP、γ-[(6-叠氮基己基)-亚氨基]-dNTP、N6-(6-叠氮基)己基-dNTP、N6-(6-叠氮基)己基-3'-dNTP、3'-叠氮基-2',3'dNTP(azNTP)、5-叠氮基甲基-dNTP、叠氮化物-PEG4-氨基烯丙基-dNTP、5-叠氮基-C3 dNTP、5-叠氮基-PEG4-dNTP和3'-O-叠氮基甲基-dNTP组成的组。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
另一种无毒的非常有效的反应是四嗪-烯连接，其中四嗪活化的分子与末端或应变的烯烃活化的分子反应。然后两个分子通过二氢吡嗪连接。
在一个具体的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是反式-环辛烯，并且所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。在优选的实施方案中，所述反式-环辛烯脱氧核苷酸是5-TCO-PEG4-dNTP。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在一个特别优选的实施方案中，所述反式-环辛烯脱氧核苷酸是5-TCO-PEG4-dATP。
在另一个具体实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是乙烯基脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。在优选的实施方案中，所述乙烯基脱氧核苷酸是5-乙烯基-dNTP。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在一个特别优选的实施方案中，所述乙烯基脱氧核苷酸是5-乙烯基-dATP。
在上述方法的步骤(b)或(c)中获得的线性双链DNA在其酶切位点的消化将导致两个DNA片段。为了将在非编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或支持物或标签的线性双链DNA片段与在编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或支持物或标签的线性双链DNA分离，可以在酶切之后进行另外的洗涤步骤。在一个具体的实施方案中，通过DNA片段的尺寸实现分离。在一个优选的实施方案中，使用AMPure XP微珠(Beckman Coulter)除去较小的片段。
在一个具体的实施方案中，酶切位点元件选自XbaI、PurII或EcoRI位点。优选地，酶切位点元件是EcoRI位点，并且所使用的限制性内切酶是EcoRI。
在另一个具体实施方案中，酶切位点元件位于期望RNA聚合酶在RNA体外转录过程中失控的位置。换句话说，酶切位点元件位于期望终止RNA体外转录反应以产生限定尺寸的RNA产物的位置。
第二方面的方面2C：标记DNA(b)随后消化(c)
尽管“点击”反应在温和条件下发生，几乎没有副产物并且主要是无毒的，但是有时希望不是通过化学方法而是通过酶手段单方面标记DNA。
在方面2C中，本发明涉及用于制备如本发明的方面1中所述的线性双链DNA的方法，尤其涉及线性双链DNA的制备，其中所述非编码链的3'末端偶联到标签。方面2C的方法包括以下步骤：(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件，(b)不同于上述方面2A和2B的方法，向所述DNA的每条链的3'末端添加已经链接到标签的脱氧核苷酸，以及(c)切割步骤(b)中获得的DNA，以从编码链的3'末端移除支持物或标签。
因此，在方面2C中，本发明涉及一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA和识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到标签。
在一个具体实施方案中，所述连接了标签的脱氧核苷酸选自由生物素-脱氧核苷酸和PEG-脱氧核苷酸组成的组。在优选的实施方案中，所述连接了标签的脱氧核苷酸是生物素-dNTP或PEG-dNTP。碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在更优选的实施方案中，所述连接了标签的脱氧核苷酸是生物素-dNTP(生物素化dNTP)。在甚至更优选的实施方案中，所述生物素-dNTP(生物素化的dNTP)是生物素-dATP(生物素化的dATP)。
在另一具体实施方案中，在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、酿酒酵母DP1 DNA聚合酶、哺乳动物DNAβ聚合酶、工程化DNA聚合酶、DNA聚合酶I大(Klenow)片段和末端转移酶组成的组。在优选的实施方案中，在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶是水生栖热菌DNA聚合酶或终端转移酶。在一个特别优选的实施方案中，在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶是水生栖热菌DNA聚合酶。由于水生栖热菌DNA聚合酶将腺嘌呤核苷酸排他地添加到双链线性DNA的平头的3'末端，应当理解，如果使用水生栖热菌DNA聚合酶，则在步骤(a)中提供的线性化DNA必须在编码序列元件的5'末端包括至少一个平端。
如已经提到的，在步骤(b)中获得的线性双链DNA在其酶切位点的消化将导致两个DNA片段。为了将在非编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA片段与在编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA分离，可以在酶切之后执行另外的洗涤步骤。在一个具体的实施方案中，通过DNA片段的尺寸实现分离。在一个优选的实施方案中，使用AMPure XP微珠(Beckman Coulter)除去较小的片段。
在一个具体的实施方案中，酶切位点元件选自XbaI、PurII或EcoRI位点。优选地，酶切位点元件是EcoRI位点，并且所使用的限制性内切酶是EcoRI。
在另一个具体实施方案中，酶切位点元件位于期望RNA聚合酶在RNA体外转录过程中失控的位置。
第二方面的方面2D和2E：DNA的特异性偶联/标记
酶偶联或标记DNA的甚至更快的方法是，尤其通过提供包含由编码链编码的序列元件的线性双链DNA，来特异性地偶联和/或标记线性双链DNA的非编码链的3'末端，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端。
因此，在方面2D中，本发明涉及一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够将所述经修饰的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
在方面2E中，本发明涉及一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够将连接了标签的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA。
以下实施方案涉及如方面2D和2E中所描述的方法。
在一个具体的实施方案中，能够将经修饰的脱氧核苷酸或连接了标签的脱氧核苷酸排他地添加到平端而不是粘端的酶是水生栖热菌DNA聚合酶或Invitrogen的
Figure BDA0002548513960000141
Tfi exo(-)DNA聚合酶。
在另一个具体的实施方案中，所述DNA的编码序列元件的粘端3'处于期望RNA聚合酶在RNA体外转录过程中失控的位置。
第三方面：本发明的方面1的线性双链DNA的用途
在第三方面，本发明涉及线性双链DNA的用途，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述DNA包含由所述编码链编码的编码序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是在RNA体外转录反应中偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途，所述线性双链DNA在其非编码链的3'末端通过三唑偶联到支持物或标签。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途，所述线性双链DNA在其非编码链的3'末端通过二氢吡嗪部分偶联到支持物或标签。
在另一具体实施方案中，偶联到要用于RNA体外转录反应的线性双链DNA的非编码链的3'末端的支持物选自由磁性微珠或颗粒、纳米微珠或纳米颗粒、琼脂糖Agarose、琼脂糖Agarose微珠或颗粒、玻璃、玻璃微珠或颗粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组。在一个优选的实施方案中，偶联到要用于RNA体外转录反应的线性双链DNA的非编码链的3'末端的支持物是磁性微珠或颗粒。
在另一个具体实施方案中，偶联到要用于RNA体外转录反应的线性双链DNA的非编码链的3'末端的标签选自由生物素、PEG和FLAG组成的组。在一个优选的实施方案中，所述标签是生物素。在一个特别优选的实施方案中，所述生物素与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。这在图4中举例示出。
在另一个具体实施方案中，要用于RNA体外转录反应的线性双链DNA的编码序列元件侧翼为5'UTR和/或3'UTR。在一个优选的实施方案中，所述3'UTR衍生自白蛋白。在另一个优选实施方案中，所述5'UTR衍生自32L4核糖体蛋白32L4 TOP。在本发明的方面1中规定了该上下文中的其它合适的UTRs。
在一个特别优选的实施方案中，所述3'UTR衍生自白蛋白，并且所述5'UTR衍生自32L4核糖体蛋白32L4 TOP。
在另一具体实施方案中，要用于RNA体外转录的双链DNA包含在编码序列元件5'的RNA聚合酶启动子序列元件。在一个优选的实施方案中，所述RNA聚合酶启动子序列元件选自T3、T7、Sny5或SP6RNA聚合酶启动子序列。
第四方面：使用本发明的方面1的双链线性DNA作为模板在体外制备RNA的方法
在第四方面，本发明涉及一种体外制备RNA的方法，包括以下步骤：
(a)提供如本文所述的双链线性DNA作为模板DNA；
(b)提供(i)核苷三磷酸和(ii)DNA依赖性RNA聚合酶；
(c)在合适的条件下温育在步骤(a)中提供的DNA和在步骤(b)中提供的(i)和(ii)以制备RNA。
在第四方面的优选实施方案中，在上述(a)提及的双链线性DNA在其3'末端偶联到如本文所指定的支持物(直接偶联到支持物或经由偶联到DNA的标签与支持物关联)，以固定线性DNA。这允许在发生RNA体外转录之后从反应混合物中分离DNA(如在第五方面中进一步指定的)。优选地，与在步骤(a)中提供的线性DNA(作为模板DNA)偶联的支持物是磁性微珠。
在合适的条件下在体外制备RNA的方法(即在无细胞环境中)是本领域已知的(参见例如Geall et al.(2013)Semin.Immunol.25(2):152-159,Brunelle et al.(2013)Methods Enzymol.530:101-14)。如何将这种方法置于实践中的示例可以在实施例1、4和5中找到。
在一个具体实施方案中，步骤(b)中的DNA依赖性RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，优选T3、T7、sync5或SP6 DNA依赖性RNA聚合酶。
在另一具体实施方案中，在步骤(b)中另外提供独立选自下述中的一种：帽类似物、核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶和MgCl2。
帽类似物的实例是m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化的帽类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化的帽类似物(例如，m2,2,7GpppG)、二甲基化的对称的帽类似物(例如，m7Gpppm7G)、或抗逆转的帽类似物(例如，ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG和它们的四磷酸衍生物)(Stepinski et al.,2001.RNA 7(10):1486-95)。先前已经描述了另外的帽类似物(US 7,074,596、WO 2008/016473、WO 2008/157688、WO 2009/149253、WO 2011/015347和WO2013/059475)。最近已经描述了N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的合成(Kore etal.,2013.Bioorg.Med.Chem.21(15):4570-4)。
在优选实施方案中，所述帽类似物是m7G(5')ppp(5')G(m7G)。
在一个具体的实施方案中，在步骤(c)中在适于体外制备RNA的缓冲液中温育所述DNA。
用于体外制备RNA的普通缓冲液包括三(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇)和HEPES(2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)。缓冲物质还可以进一步包括用于调节pH的酸或碱，例如在Tris的情况下为柠檬酸或HCl，在HEPES的情况下为KOH。缓冲液的pH值通常调节到pH值为6～8.5。一些常用的转录缓冲液包括HEPES/KOH，pH 7.5和Tris/HCl，pH 7.5。
在另一个具体实施方案中，在步骤(a)中提供的模板DNA被再次用于至少一个另外的RNA体外制备循环。这在图3中举例示出。
通过添加EDTA，可以停止体外RNA制备。
第五方面：生物反应器
在第五方面，本发明涉及一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包括：
(a)包含本文所述的线性双链DNA的反应容器(13)；
(b)包含核糖核苷三磷酸和DNA依赖性RNA聚合酶的容器(14)，其中所述容器连接到所述反应容器；和
(c)用于收集所述RNA产物的产物容器(15)，其中所述产物容器也连接到所述反应容器。
该生物反应器可以被热调节以精确地维持特定温度，通常在4至40℃之间。
所述容器(14)可以另外包含独立选自下述中的至少一种：帽类似物、核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶、MgCl2、适于RNA体外转录的缓冲液、氧化剂和多胺。
帽类似物和缓冲液的实例与上文在本发明的方面3所列的相同。
抗氧化剂的实例是DTT(二硫苏糖醇)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、NAC(N-乙酰半胱氨酸)、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸和胱氨酸。
聚胺的实例是精胺和亚精胺。
容器(14)中存在的组分可以在一定时间内以一定量释放到反应容器(13)中。一旦容器(14)的组分已经被释放到反应容器(13)中，RNA体外转录开始。在RNA体外转录终止(例如通过将EDTA添加到反应容器(13)中)之后，RNA可以被释放到用于收集RNA产物的产物容器(15)中。
在一个具体实施方案中，反应容器(13)包括包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含由所述编码链编码的编码序列元件，其中所述非编码链在其3'末端与生物素偶联，所述生物素进而与链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
在另一具体实施方案中，磁体从外部围绕反应容器(13)。在优选实施方案中，所述磁体是电磁体。
在另一具体实施方案中，所述磁体能够在两种状态之间振荡，以产生能够在反应容器(13)中的混合物内诱导流动的振荡磁场，从而混合所述反应混合物。
在另一具体实施方案中，所述磁体能够吸引在其非编码链的3'末端与生物素偶联的线性双链DNA，所述生物素进而与链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。通过磁体的吸引可以被严格控制，以将DNA模板与RNA产物分离。在另一个实施方案中，在产物容器(15)中收集所述RNA产物。
在另一个具体实施方案中，反应容器(13)所包含的线性DNA的支持物或标签与所述反应容器连接。所述支持物或标签可以与反应容器(13)共价或非共价连接。在一个实施方案中，支持物或标签与反应容器(13)共价连接，以将线性DNA永久固定在反应容器(13)内。
在另一具体实施方案中，所述反应容器(13)包括至少一个用于测量和/或调节pH、盐浓度、镁浓度、磷酸浓度、温度、压力、流速、RNA浓度和/或核糖核苷酸三磷酸浓度的装置。
在另一个具体实施方案中，所述生物反应器包括在所述反应容器(13)和所述产物容器(15)之间的过滤膜，优选地是用于将所述RNA产物与所述反应混合物分离的超滤膜。在优选的实施方案中，所述过滤膜或超滤膜具有在10～100kDa、10～75kDa、10～50kDa、10～25kDa或10～15kDa的范围的截留分子量。在另一个优选实施方案中，所述过滤膜或超滤膜选自由再生纤维素、改性纤维素、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇和聚芳醚砜组成的组。
在另一具体实施方案中，所述产物容器(15)包含用于捕获所制备的RNA以将RNA产物与其它可溶性低分子量组分分离的树脂。
该生物反应器可以间歇(batch)操作，使得在RNA体外转录反应开始时所有试剂都存在，并且不添加新的反应物且不取出产物，直到转录反应已经停止或被停止。或者，该生物反应器可以半间歇(semi-batch)模式操作，其指的是一系列重复的转录反应，其中在每个转录循环之后去除产物，并且为下一转录反应添加新的反应物。该生物反应器还可以连续模式操作，其中不断地供应反应物并且不断地取出产物。
可在图4中找到用于体外转录的生物反应器的实例。
生物反应器通常用于体外合成RNA并且是本领域技术人员已知的(参见例如WO95/08626)。
第六方面：试剂盒
在第六方面，本发明涉及提供必要部件并使人能够实施本发明的方面2中所述的方法的试剂盒。根据本发明的要进行修饰的初始DNA必须由使用该试剂盒的人提供。
在方面6A中，本发明涉及一种试剂盒，包括：
(a)经修饰的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述经修饰的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)活化的支持物或标签；
(d)以高度特异的方式与所述支持物或标签相关联的所述支持物或标签的对应物。
在方面6B中，本发明涉及一种试剂盒，包括：
(a)连接了标签的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述连接了标签的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)以高度特异的方式与所述标签相关联的所述标签的对应物。
以下实施方案涉及如方面6A和6B中所述的试剂盒。
在一个具体的实施方案中，所述标签是生物素，并且所述对应物是亲和素或链霉亲和素。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，包括：
(a)经修饰的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述经修饰的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)活化的生物素；
(d)链霉亲和素偶联的磁性微珠；
(e)任选地，用于点击化学的缓冲液。
在更优选的实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷酸是经修饰的dATP。特别地，所述经修饰的dATP选自炔dATP、叠氮化物dATP、氮杂二苯并环辛炔dATP、反式-环辛烯dATP和乙烯基dATP。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，包括：
(a)生物素连接的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述连接了标签的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)链霉亲和素偶联的磁性微珠。
在更优选的实施方案中，所述生物素连接的脱氧核苷酸是生物素连接的dATP。
附图说明
下面所示的附图仅仅是说明性的，并且将以进一步的方式描述本发明。这些附图不应被解释为将本发明限制于此。
图1：使用定向或未定向偶联的RNA体外转录
图1A示出了支持物(1)的非定向偶联阻止RNAP从DNA模板(2)的失控，这导致失败的短RNA序列(3)和异构RNA产物。
图1B示出了空出RNA体外转录终止位置(4)的支持物(1)的定向偶联，将允许RNAP的失控，并且将导致均匀的全长RNA转录物(3)。
图2：根据本发明制备线性双链DNA的方法的示例性说明
图2示出了本发明的方面2A中描述的方法的实施例。使用平端限制性内切酶(6)线性化环状质粒DNA(5)。然后，使用DNA聚合酶(7)将经修饰的腺嘌呤脱氧核苷酸(A*)加入线性化DNA的每条链的3'末端。在下一步骤中，在前一步骤中获得的DNA在预定的酶切位点(8)被酶切。最后，被酶切的DNA通过经修饰的腺嘌呤脱氧核苷酸(A*)在最后的步骤(9)中偶联到支持物或标签(1)，同时留下自由端作RNA体外转录终止(4)。
图3：使用经由其非编码链的3'末端与磁性微珠相关联的线性双链DNA进行的RNA体外合成
图3a示出了经由其非编码链的3'末端与磁性微珠(1)相关联的线性双链DNA，其用作失控RNA体外转录的模板。失控RNA体外转录获得RNA转录物(3)。
图3B示出了在RNA合成之后，与磁性微珠相关联的线性双链模板DNA可以由电磁体(10)捕获，并且RNA产物可以与捕获的DNA(11)分离。所捕获的DNA可被再次用于进一步的失控RNA体外转录循环(12)。
图4：用于RNA体外转录的生物反应器
图4示出了用于RNA体外转录的生物反应器，其包括：反应容器(13)，其被磁体(10)包围并且包含根据本发明的线性双链DNA；容器(14)，其包含核糖核苷三磷酸和DNA依赖性RNA聚合酶，并且连接到所述反应容器(13)；和产物容器(15)，其连接到所述反应容器以收集RNA产物。
图5：线性化质粒DNA与琼脂糖Sepharose的偶联
图5显示了在偶联反应期间的不同时间点(30、60、120和240分钟)的可溶性DNA的量(ng/μl)。A＝偶联到6MB Sepharose的XbaI-消化的质粒DNA；B＝偶联到4B Sepharose的XbaI-消化的质粒DNA；C＝偶联到6MB Sepharose的PvuII-消化的质粒DNA；D＝偶联到4BSepharose的PvuII-消化的质粒DNA，也参见实施例1。
图6：琼脂糖sepharose-偶联的线性DNA的酶切消化和RNA体外转录
图6A示出琼脂糖Agarose凝胶，显示：泳道1＝DNA分子量标准；泳道2＝未消化的环状质粒DNA；3＝用EcoRI处理的游离pDNA；4，5＝XbaI-线性化的6MB Sepharose偶联的DNA；6，7＝XbaI-线性化的4B sepharose偶联的DNA；8,9＝PvuII线性化的6MB sepharose偶联的DNA；10，11＝PvuII-线性化的4B Sepharose偶联的DNA。
图6B示出了在RNA体外测定中产生的RNA的量(mg/μl)，分别使用XbaI-线性化的6MB sepharose偶联的DNA模板(1，2)；XbaI-线性化的4B sepharose偶联的DNA模板(3，4)；PvuII-线性化的6MB sepharose偶联的DNA模板(5，6)；PvuII-线性化的4B sepharose偶联的DNA模板(7，8)；和游离模板DNA(阳性对照)(9)。
图7：与链霉亲和素关联的DNA的酶消化
图7示出了未关联的或与链霉亲和素关联的DNA的消化物。为了测试关联有效性，使用NsbI消化上清(SN)中的未关联的DNA，得到1289bp和2586bp的两个片段。为了测试酶的可及性，使用NsbI消化链霉亲和素关联的DNA，得到一种2586bp的可溶性DNA片段。1：分子量标准；2：与链霉亲和素关联之前的SN，3：与链霉亲和素关联之后的SN；4：从微珠消化与链霉亲和素关联的DNA之后的SN。在实施例3中提供实验的详细描述。
图8：使用与链霉亲和素关联的DNA的RNA体外转录
图8示出了用与链霉亲和素关联的DNA模板进行的RNA体外转录。进行TBTA(A)-或THPTA(B)-催化的环加成，并且在RNA体外转录之前，与链霉亲和素包被的磁性微珠关联之前，用70％EtOH(洗液I)或70％EtOH/10mM EDTA和70％EtOH(洗液II)洗涤生物素偶联的DNA模板。1：分子量标准；2：dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液I，关联；3：乙炔基-dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液I，w/o关联；4：乙炔基-dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液I，关联；5：乙炔基-dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液II，关联；6：dATP-腺苷酸化，THPTA-催化的环加成，洗液I，关联；7：乙炔基-dATP-腺苷酸化，THPTA-催化的环加成，洗液I，w/o关联；8：乙炔基-dATP-腺苷酸化，THPTA-催化的环加成，洗液I，关联；9：乙炔基-dATP-腺苷酸化，THPTA-催化的环加成，洗液II，关联；10：乙炔基-dATP-腺苷酸化，没有环加成。在实施例4中提供了实验的详细描述。
图9：使用不同洗涤程序的体外转录
图9示出了用与链霉亲和素关联的DNA模板进行的RNA体外转录。进行TBTA-或THPTA-催化的环加成，并且在RNA体外转录之前，与链霉亲和素包被的磁性微珠关联之前，用70％EtOH(洗液I)或70％EtOH/10mM EDTA和70％EtOH(洗液II)洗涤生物素偶联的DNA模板。为了提高偶联后的DNA质量以至RNA体外转录条件，生物素偶联的DNA进一步用洗涤缓冲液洗涤六次，用l×TE(洗液III)洗涤三次。1：分子量标准；2：dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液I，关联；3：乙炔基-dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液II，关联；4：乙炔基-dATP-腺苷酸化，TBTA催化的环加成，洗液II，关联，洗液III；5：THPTA-催化的环加成，洗液I，关联；6：THPTA-催化的环加成，洗液I，关联，洗液III；7：THPTA-催化的环加成，洗液II，关联；8：THPTA-催化的环加成，洗液II，关联，洗液III。在实施例5中提供了实验的详细描述。
图10：在非编码链的3'末端偶联的DNA、在编码链的3'末端偶联的DNA、或在两者3'末端均偶联的DNA的RNA体外转录
图10示出琼脂糖agarose凝胶，具有以下泳道：M＝RNA分子量标准；泳道1＝使用在其编码链的3'末端偶联的模板DNA获得的RNA；泳道2＝使用在其非编码链3'末端偶联的模板DNA(模板链)获得的RNA；泳道3＝使用在两者3'末端均偶联的模板DNA获得的RNA。在实施例7中提供实验的进一步细节。
图11：根据本发明的线性双链DNA的示意性示例图
图11示出了在非编码链的3'末端偶联到支持物(或标签，参见下文)的线性双链DNA的示例性方案，其也指示RNA聚合酶启动子序列元件和编码序列元件。与支持物的偶联可以可选地经由偶联到非编码链的3'末端的标签，其中所述标签与所述支持物相互作用。编号如下：(16)线性双链DNA；(17)编码链(非模板链)；(18)非编码链(模板链)；(19)在编码链的5'至3'方向上由编码链编码的编码序列元件(在此示例性地以ATG-相应示出，在非编码链的3'至5'的方向上在非编码链上有TAC)；(20)RNA聚合酶启动子序列元件；(21)非编码链在其3'末端的偶联；(1)支持物或标签。
具体实施方案
定义
为了清楚和可读性起见，提供以下定义。可以在本发明的每个实施方案中读到针对这些定义所提及的任何技术特征。在这些实施方案的上下文中可以具体提供附加的定义和解释。
如在说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一”和“一个”也包括相应的复数。
在本发明的上下文中，术语“大约”表示本领域技术人员将理解仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确性的区间。该术语通常表示与所指示的数值±10％和优选±5％的偏差。
需要理解的是，术语“包括”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果下文中一组被定义为包括至少一定数量的实施方案，则这也意味着包括优选仅由这些实施方案组成的组。
术语“抗氧化剂”是指抑制其它分子氧化的分子。
本文所用的术语“生物反应器”是指在指定条件下在其中进行RNA体外转录反应的容器。
术语“缓冲液”表示用于在添加另一种酸或碱之后将溶液的酸度(pH)维持在所选值附近的弱酸或弱碱。因此，缓冲物质的功能是向溶液中加入酸或碱时防止pH的快速变化。
术语“帽类似物”是指具有帽功能性的不可延伸的二核苷酸，这意味着当结合在RNA的5'末端时，其便于翻译或定位和/或防止RNA的降解。不可延伸的意思是帽类似物将仅在5'末端结合，因为它不具有5'三磷酸，因此不能通过依赖模板的RNA聚合酶在3'方向上延伸。优选地，加入帽类似物的初始浓度的范围约为1～20mM，1～17.5mM，1～15mM，1～12.5mM，1～10mM，1～7.5mM，1～5mM或1～2.5mM。
术语“编码链”(在本文中也称为“非模板链”)表示双链DNA的DNA链，其DNA序列对应于从DNA转录的RNA转录物的序列(除了胸腺嘧啶被尿嘧啶代替)。转录的方向为从编码链的5'至3'，其中“非编码链”用作转录反应中的模板。换句话说，转录的方向不是朝向，而是相反地，远离与非编码链的3'末端偶联的支持物或标签。
本文所用的术语“非编码链”(在本文中也可以称为"模板链")表示双链DNA的DNA链，其DNA序列与从DNA转录的RNA转录物的序列互补(除了胸腺嘧啶代替尿嘧啶)。当用作转录过程中的反应中的模板时，RNA聚合酶从非编码链的3'向5'前进，得到5'至3'与编码链对应的RNA(除了胸腺嘧啶被尿嘧啶代替)。
本文所用的术语“编码序列元件”定义了包含编码和非编码链的双链DNA的一部分。所述编码序列元件在编码链的5'至3'的方向上由编码链编码。这意味着编码序列元件的转录过程将得到与编码链的序列相对应的RNA转录物(除了胸腺嘧啶被尿嘧啶代替)。对于该过程，非编码链作为模板。
“RNA聚合酶启动子序列元件”是包含用于RNA聚合酶的启动子的双链DNA的一部分。RNA聚合酶启动子序列元件位于编码序列元件的上游。换句话说，所述RNA聚合酶启动子序列元件位于所述编码序列元件的5'，其中所述编码序列元件的取向为所述编码链的5'至3'。因此，换句话说，当从编码链的取向(在转录方向上进行，即从编码序列元件的5'末端到编码序列元件的3'末端)描述时，RNA聚合酶启动子序列元件位于编码链上的编码序列元件的5'或5'末端的上游(即，编码序列元件的开始)。
当沿着从5'至3'的转录方向时，线性双链DNA上的元件的取向通常是公知的：RNA聚合酶启动子序列元件是第一元件，随后下游或3'是编码序列元件。这将确保RNA聚合酶结合到编码序列元件的上游或5'的启动子，然后将其从其5'末端转录到3'末端。因此，RNA聚合酶通过与启动子的结合而被引导到转录的起始/开始区。
一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件上游的RNA聚合酶启动子序列元件，也可被称为包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件的5'末端的上游(或5')的RNA聚合酶启动子序列元件。或者，一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件上游的RNA聚合酶启动子序列元件，也可被称为包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)编码所述编码序列元件的编码链的起始(或5'末端)的上游(或5')的RNA聚合酶启动子序列元件。
“酶切位点元件”是包含限制性内切酶的酶切位点的双链DNA的一部分。酶切位点通常是短的，优选为回文结构的核苷酸序列，例如具有4～8个核苷酸。例如，EcoRI和PvuII消化产生“平端”，而XbaI消化产生“粘端”。
如本文所用，术语“对应物”表示以高度特异的方式与支持物或标签结合的对象或分子。亲和素或链霉亲和素是例如生物素的对应物，其以高度特异的方式结合生物素。
如本文所用，动词“偶联”和该动词的任何形式表示经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签之间的共价键。
术语“DNA”是脱氧核糖核酸的通常缩写。它是核酸分子，即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧腺苷单磷酸、脱氧胸苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸和脱氧胞苷单磷酸单体或其类似物，它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成，并通过特征骨架结构聚合。所述骨架结构通常由第一单体的核苷酸(即脱氧核糖)的糖部分和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的具体顺序，即与糖/磷酸骨架连接的碱基的顺序，称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对。虽然双链DNA在双链中存在的两条单链的5'至3'方向上包括两条相对的链，但仍然是指双链DNA的5'末端和3'末端，即，如果DNA包含将转录的方向引入到双链DNA中的编码序列元件(并且因此也是翻译的方向)。本发明的方面2D例如包括以下两个步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，
其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够将所述经修饰的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA。
考虑到上述情况，这两个步骤可以可选地被称为如下：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'(或对于双链DNA而言的上游)的平端和所述编码元件3'(或对双链DNA而言的下游)的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够将所述经修饰的脱氧核苷酸在平端(其在本例中仅存在于编码序列元件的上游，但是当然包括编码链的5'末端和非编码链的3'末端)而不是在粘端(其在本例中仅存在于编码序列元件的下游)添加到单链的3'末端(即，到以平端存在的非编码单链的3'末端——酶能够将所述经修饰的脱氧核苷酸仅添加到单链的3'末端，而不是平端的5'末端)的酶，以提供在非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA。
术语“DNA质粒”是指环状核酸分子，优选是人工核酸分子。这样的质粒DNA构建体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转运载体等。优选地，本发明的含义内的质粒DNA除了本文所述的元件外还包括多克隆位点，任选地包括选择标记，例如抗生素抗性因子，适合于载体复制的序列，例如复制起点，和适合于转录起始的序列，例如启动子。典型的质粒骨架例如是pUC19和pBR322。
术语“DNA聚合酶”是指能够将至少一种脱氧核苷酸转运和/或掺入到DNA链中的任何酶。术语DNA聚合酶包括能够将至少一种经修饰的脱氧核苷酸或连接了标签的脱氧核苷酸转运和/或掺入到DNA链中的DNA聚合酶。本文所用的术语“工程化DNA聚合酶”是指具有例如经修饰的和/或改进的能力的基因工程化的DNA聚合酶。
术语“dNTP”是脱氧核苷三磷酸的缩写。本文所用的脱氧核苷三磷酸包含与脱氧核糖结合的含氮碱基，其又结合到三个磷酸基团。
术语“线性DNA”是指包括不相互连接的自由5'末端和自由3'末端的DNA。本发明上下文中的线性DNA可以通过环状DNA(例如质粒DNA)的酶切消化或dbDNA的酶切消化来获得。特别优选使用产生至少一个平端的酶进行所述酶切消化。
术语“磁体”是指产生磁场的材料或物体。“电磁体”是由电流产生磁场的一种类型的磁体。当电流接通时存在磁场，并且当电流断开时不存在磁场。
本文所用的“经修饰的脱氧核苷酸”应理解为非天然存在的脱氧核苷酸，其具有化学反应性基团，其能够与另一化学反应性基团(例如，与支持物或标签的另一化学反应性基团)特异性反应。
术语“焦磷酸酶”是指水解二磷酸酯键的酸酐水解酶。在RNA体外转录反应中，其用于水解在将核苷三磷酸掺入到新生RNA链上时释放的二磷酸酯内的键，从而提高转录反应中RNA的产率。优选地，焦磷酸酶的浓度为1～20单位/ml，1～15单位/ml，1～10单位/ml，1～5单位/ml，或1～2.5单位/ml。
术语“核糖核酸酶抑制剂”是指抑制降解RNA的核糖核酸酶的作用的抑制剂。优选地，核糖核酸酶抑制剂的浓度为约1～500单位/ml，1～400单位/ml，1～300单位/ml，1～200单位/ml或1～100单位/ml。
术语“核糖核苷三磷酸”缩写为NTP，是指鸟苷三磷酸(GTP)、腺嘌呤三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)和三磷酸尿苷(UTP)。
术语“RNA”是核糖核酸的通常缩写。它是核酸分子，即由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷单磷酸、尿苷单磷酸、鸟苷单磷酸和胞苷单磷酸单体或其类似物，它们沿着所谓的骨架彼此连接。骨架由第一单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的具体顺序，即与糖/磷酸骨架连接的碱基的顺序，称为RNA序列。术语“RNA”可以指分子或选自由如下组成的组的分子类型：长链RNA、编码RNA、非编码RNA、单链RNA(ssRNA))、双链RNA(dsRNA)、线性RNA(linRNA)、环状RNA(circRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义RNA(asRNA)、CRISPR/Cas9导引RNA、核糖开关、免疫刺激RNA(isRNA)、核酶、适体、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、病毒RNA(vRNA)、逆转录病毒RNA或复制子RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)和Piwi-相互作用RNA(piRNA)。
本文所用的术语“RNA体外制备循环”是指从转录起始到其终止(例如RNA聚合酶的失控)的一整个RNA转录反应。
术语“RNA体外转录”涉及从无细胞系统(体外)中的DNA模板合成RNA的方法。DNA，优选线性DNA(例如线性化质粒DNA、线性化dbDNA)用作生成RNA转录物的模板。用于RNA体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是对应于待体外转录的相应RNA的cDNA，并将其引入用于RNA体外转录的适当载体，例如进入质粒DNA来获得。在本发明中，转录的方向远离下面的线性双链DNA模板的支持物或标签，其偶联到非编码链的3'末端，参见图11。
术语“RNA聚合酶”是指催化DNA模板转录成RNA的任何酶。“DNA依赖性RNA聚合酶”可以仅催化从DNA模板转录RNA。优选地，DNA依赖性RNA聚合酶的浓度为约1000～75000U/ml，优选2500～5000U/ml。典型的DNA依赖性RNA聚合酶是T7、SP6、T3和Syn5RNA聚合酶。
本文所用的术语“支持物”表示包括凝胶的固相实体。本文所用的“活化的支持物”是指具有化学反应性基团的支持物，该基团能够与另一化学反应性基团(例如，经修饰的脱氧核苷酸的另一化学反应性基团)特异性反应。
如本文所用，术语“标签”表示能够与对应物结合或与之相关联的部分。本文所用的“活化的标签”是指具有化学反应性基团的标签，该基团能够与另一个化学反应性基团(例如，经修饰的脱氧核苷酸的另一个化学反应性基团)特异性反应。如本文所用，“连接了标签的脱氧核苷酸”指的是脱氧核苷酸，其与如上所述的标签共价结合。
本文所用的术语“UTR”是“非翻译区”的通常缩写。UTR通常是mRNA的一部分，并且可以位于mRNA的开放阅读框的5'和3'。例如可以通过添加5'帽来后转录修饰5'UTR。5'-UTR可以包括用于控制基因表达的元件，其也称为调节元件。3'UTR可以包括在模板中未被编码的元件，RNA从其被转录，但是在成熟期间转录之后被添加，例如，聚(N/A)序列。
如本文所用，术语“DoggyboneTM”(dbDNA)表示最小、闭合-线性的DNA载体，该载体由Touchlight Genetics Ltd通过酶法开发。线性DNA被快速制备，无质粒且通过酶法合成，该酶法产生仅含有所编码的感兴趣序列、启动子、聚A尾和端粒末端的载体盒。
发明详述
为了获得适合在基于RNA的治疗中使用的高质量RNA，重要的是从最终RNA产物中高效且可靠地去除DNA模板，以确保基于RNA的治疗剂的功效和安全性。
从RNA体外转录反应中的DNA模板去除可以例如通过酶DNA消化和RNA的纯化来实现。然而，该过程是相当复杂的，DNA模板被破坏并且承受纯化的RNA中残留DNA片段的风险。因此，这种方法不适用于大规模的RNA制备。使用在其编码链的5'末端偶联到单个支持物或标签的DNA模板用于分离的方法的缺点在于，它们是基于容易出错的PCR程序并且是序列依赖性的，这也不适合大规模RNA制备。
本发明基于以下发现，线性双链DNA可以在线性DNA的生成之后以特异的方式偶联到支持物或标签以用于分离。
其它化学偶联技术，如偶联到CnBr活化的琼脂糖或通过EDC/磺基-NHS偶联到NH2微珠，会导致支持物跨DNA的非定向偶联，与其不同，本发明的方法允许支持物或标签的定向偶联，即在线性双链DNA的非编码链的3'末端。支持物或标签的特异性偶联例如可以通过在线性双链DNA的非编码链的3'末端的经修饰的脱氧核苷酸，使用高度特异性和有效的“点击”化学反应(例如，CuAAC、SPAAC或四嗪-烯连接)来实现。
根据本发明的单个支持物或标签的定向偶联使得线性双链DNA可由酶反应(例如，酶切消化或RNA体外转录)进行，而非定向偶联防止酶的可及性。关于RNA体外转录，非定向的偶联进一步可能阻止RNA聚合酶的高效失控，从而导致不均匀的RNA产物池。
此外，根据本发明的定向偶联不包括序列特异性步骤，例如使用序列特异性引物和易于出错的步骤，例如PCR。
因此，本发明提供了偶联到支持物或标签的高质量线性双链DNA，其可以用作酶反应，特别是RNA体外转录的模板，并且可以容易且高效地回收和再循环(参见图4)。
本发明还提供了用于制备所述高质量线性双链DNA的方法。
本发明人认识到，本发明的偶联策略的基本原理不仅可用于大规模RNA制备，而是广泛适用于涉及线性双链DNA的多种酶反应(例如DNA扩增反应)及应用(DNA检测，如在DNA芯片上)。
本发明的优选实施方案
在下文中，描述了本发明的进一步的优选实施方案。
1.一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件上游的RNA聚合酶启动子序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
2.根据实施方案1的线性双链DNA，其中所述标签是生物素，优选与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
3.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA与识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(d)将步骤(c)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
4.根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸的酶是DNA聚合酶，优选为水生栖热菌DNA聚合酶。
5.根据实施方案3或4所述的方法，其中所述支持物选自由磁性微珠、纳米颗粒、琼脂糖Agarose、玻璃、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组，并且其中所述标签选自由生物素和PEG组成的组。
6.根据实施方案3-5中任一项所述的方法，其中，在所述偶联步骤中使用的所述支持物或所述标签是活化的支持物或活化的标签。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是炔脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dNTP，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dATP，并且其中所述活化的标签是叠氮活化的生物素。
10.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA和识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到标签。
11.根据实施方案10的方法，其中所述连接了标签的脱氧核苷酸选自由生物素-脱氧核苷酸和PEG-脱氧核苷酸组成的组，优选生物素-脱氧核苷酸。
12.根据实施方案10或11所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶和末端转移酶组成的组。
13.一种体外制备RNA的方法，包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案1-2中任一项所述的双链线性DNA作为模板DNA；
(b)提供(i)核糖核苷三磷酸和(ii)DNA依赖性RNA聚合酶；
(c)在合适的条件下温育在步骤(a)中提供的DNA和在步骤(b)中提供的(i)和(ii)以制备RNA。
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，优选T3、T7或SP6 DNA依赖性RNA聚合酶。
15.根据实施方案13或14所述的方法，其中在步骤(a)中提供的DNA被再次用于至少一个另外的RNA体外制备循环。
在下文中指示本发明的更进一步的优选实施方案
1.一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含由所述编码链编码的编码序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
2.根据实施方案1所述的线性双链DNA，其中所述非编码链通过三唑在其3'末端偶联到支持物或标签。
3.根据实施方案1或2所述的线性双链DNA，其中所述标签是生物素。
4.根据实施方案3所述的线性双链DNA，其中所述生物素与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的线性双链DNA，其中所述编码序列元件侧翼为5'UTR和/或3'UTR元件。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的线性双链DNA，其中所述DNA包含在编码序列元件的5'的RNA聚合酶启动子序列元件。
7.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA与识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(d)将步骤(c)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
8.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过在每条链的3'末端的经修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签；
(d)温育在步骤(c)中获得的DNA与识别所述酶切元件的限制性内切酶，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
9.实施方案7或8所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸选自由炔脱氧核苷酸、叠氮化物脱氧核苷酸、氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸、反式-环辛烯脱氧核苷酸和乙烯基脱氧核苷酸组成的组。
10.根据实施方案7-9中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸的酶是DNA聚合酶。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、酿酒酵母DP1 DNA聚合酶、哺乳动物DNAβ聚合酶、工程化DNA聚合酶、DNA聚合酶I大(Klenow)片段和末端转移酶组成的组。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述DNA聚合酶是水生栖热菌DNA聚合酶，并且其中在步骤(a)中提供的线性化DNA包括在所述编码序列元件的5'末端的平端。
13.根据实施方案7-12中任一项所述的方法，其中所述支持物选自由磁性微珠、纳米颗粒、琼脂糖Agarose、玻璃、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组，并且其中所述标签选自由生物素和PEG组成的组。
14.根据实施方案7-13中任一项所述的方法，其中在所述偶联步骤中使用的所述支持物或所述标签是活化的支持物或活化的标签。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述活化的支持物或标签选自由炔活化的支持物或标签、叠氮化物活化的支持物或标签、氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签、四嗪活化的支持物或标签、以及反式-环辛烯活化的支持物或标签组成的组。
16.根据实施方案14或15所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸通过CuAAC、SPAAC或四嗪-烯连接与所述活化的支持物或标签偶联。
17.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是炔脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
18.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是炔活化的支持物或标签。
19.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
20.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签。
21.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是反式-环辛烯脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。
22.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙烯基脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。
23.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dNTP，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
24.根据实施方案23所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dATP，并且其中所述活化的标签是叠氮化物活化的生物素。
25.根据实施方案23或24所述的方法，其中所述偶联步骤在Cu(I)的存在下进行。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述偶联步骤在Cu(I)-TBTA或Cu(I)-THPTA的存在下进行。
27.根据实施方案25或26所述的方法，其中执行另外的洗涤步骤以在所述偶联步骤之后经由络合到EDTA来去除Cu(I)。
28.根据实施方案7-27中任一项所述的方法，其中所述方法包括在温育所述DNA和限制性内切酶的步骤之后的附加步骤，即将在所述非编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或带有支持物或标签的线性双链DNA与在所述编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或带有支持物或标签的线性双链DNA分离的附加步骤。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述分离通过所述DNA的大小来实现，优选使用AMPure XP微珠。
30.根据实施方案7-29中任一项所述的方法，其中所述酶切位点元件是EcoRI位点，并且其中所述限制性内切酶是EcoRI。
31.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA和识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到标签。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述连接了标签的脱氧核苷酸选自由生物素-脱氧核苷酸和PEG-脱氧核苷酸组成的组。
33.根据实施方案31或32所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶和末端转移酶组成的组。
34.根据实施方案30-33中任一项所述的方法，其中所述方法包括在温育所述DNA和限制性内切酶的步骤之后的附加步骤，即将在所述非编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的所述线性双链DNA与在所述编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA分离的附加步骤。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述分离通过所述DNA的大小来实现，优选使用AMPure XP微珠。
36.根据实施方案31-35中任一项所述的方法，其中所述酶切位点元件是EcoRI位点，并且其中所述限制性内切酶是EcoRI。
37.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够将所述经修饰的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
38.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)将所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够将连接了标签的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在非编码链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA。
39.根据实施方案37或38所述的方法，其中所述能够将经修饰的脱氧核苷酸或连接了标签的脱氧核苷酸在平端添加到单链的3'末端的酶为水生栖热菌DNA聚合酶。
40.根据实施方案1-6中任一项所述的线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途。
41.一种体外制备RNA的方法，包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案1-6中任一项所述的双链线性DNA作为模板DNA；
(b)提供(i)核糖核苷三磷酸和(ii)DNA依赖性RNA聚合酶；
(c)在合适的条件下温育在步骤(a)中提供的DNA和在步骤(b)中提供的(i)和(ii)以制备RNA。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，优选T3、T7或SP6 DNA依赖性RNA聚合酶。
43.根据实施方案41或42所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供帽类似物。
44.根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供核糖核酸酶抑制剂。
45.根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供焦磷酸酶。
46.根据实施方案41-45中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供MgCl2。
47.根据实施方案41-46中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中在适于体外制备RNA的缓冲液中温育所述DNA。
48.根据实施方案41-47中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中提供的DNA被再次用于至少一个另外的RNA体外制备循环。
49.一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包括
(a)包含根据实施方案1-6中任一项所述的线性双链DNA的反应容器(13)；
(b)包含核糖核苷三磷酸和DNA依赖性RNA聚合酶的容器(14)，其中所述容器连接到所述反应容器；和
(c)用于收集所述RNA产物的产物容器(15)，其中所述产物容器也连接到所述反应容器。
50.根据实施方案49所述的生物反应器，其中所述反应容器(13)包含根据实施方案4的与链霉亲和素包被的磁性微珠相关联的线性双链DNA。
51.根据实施方案50的生物反应器，其中磁体从外部围绕反应容器(13)。
52.根据实施方案51所述的生物反应器，其中所述磁体能够振荡以混合包含所述线性双链DNA的反应混合物。
53.根据实施方案51或52所述的生物反应器，其中所述磁体能够吸引所述线性双链DNA，以将所述线性双链DNA与所述RNA产物分离，所述RNA产物可以被收集在所述产物容器(15)中。
54.根据实施方案49所述的生物反应器，其中根据实施方案1-6中任一项所述的线性双链DNA的支持物或标签与所述反应容器(13)连接。
55.根据实施方案49-54中任一项所述的生物反应器，其中所述容器(14)进一步包括独立地选自由以下组成的组中的至少一个：适用于体外转录的缓冲液、帽类似物、经修饰的核糖核苷三磷酸、核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶、MgCl2、抗氧化剂和多胺。
56.根据实施方案49-55中任一项所述的生物反应器，其中所述反应容器(13)包括至少一个用于测量和/或调节pH、盐浓度、镁浓度、磷酸浓度、温度、压力、流速、RNA浓度和/或核糖核苷酸三磷酸浓度的装置。
57.根据实施方案49-56中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器包括在所述反应容器(13)与所述产物容器(15)之间的过滤膜，优选地是用于将所述RNA产物与所述反应混合物分离的超滤膜。
58.根据实施方案57的生物反应器，其中所述过滤膜或超滤膜具有在10～100kDa、10～75kDa、10～50kDa、10～25kDa或10～15kDa的范围的截留分子量。
59.根据实施方案57或58的生物反应器，其中所述过滤膜或超滤膜选自由再生纤维素、改性纤维素、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇和聚芳醚砜组成的组。
60.根据实施方案49-59中任一项所述的生物反应器，其中所述产物容器(15)包含用于捕获所制备的RNA以将所述RNA产物与反应混合物的其它可溶性组分分离的树脂。
61.根据实施方案49-60中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器以间歇、半间歇或连续模式操作。
62.根据实施方案49-61中任一项所述的生物反应器在根据实施方案41-48中任一项的方法中的用途。
63.一种试剂盒，其包含
(a)经修饰的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述经修饰的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)活化的支持物或标签；
(d)以高度特异的方式与所述支持物或标签相关联的所述支持物或标签的对应物。
64.一种试剂盒，其包含
(a)连接了标签的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述连接了标签的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)以高度特异的方式与所述标签相关联的所述标签的对应物。
实施例
以下实施例仅仅是说明性的，并以进一步的方式描述本发明。这些实施例不应被解释为将本发明限制于此。
实施例1：线性化DNA与CnBr活化的琼脂糖的偶联
本实施例的目的是查明线性化的DNA是否可偶联到CnBR活化的琼脂糖sepharose，如果是，则是否所述DNA仍是酶反应可及的。
使用10U XbaI以生成粘性DNA末端或使用10U PvuII以生成DNA平端来线性化1μg质粒DNA(SEQ ID NO：1)。在37℃，在20μl 1×酶切缓冲液中进行酶切反应1小时。随后，通过琼脂糖凝胶电泳在0.8％琼脂糖凝胶上分析反应，以确保完全线性化。根据制造商的说明书使用AMPure XP微珠(Beckman coulter)纯化线性DNA。
根据制造商的说明书进行XbaI-或PvuII-线性化的DNA在CnBr活化的4B或6MB琼脂糖sepharose(GE Healthcare)上的偶联。简而言之，使4B或6MB琼脂糖sepharose悬浮在1mMHCl中，使其溶胀，随后洗涤。为了偶联，将琼脂糖重新悬浮在偶联缓冲液(0.1M NaHCO3 pH8.3，含有0.5M NaCl)和XbaI-或PvuII-线性化的DNA中并在室温温育。为了监测DNA与琼脂糖sepharose的偶联，将偶联反应离心并在0.5、1、2和4小时自上清取级分(fractions)，并对其进行分析游离可溶性DNA的存在(参见图5)。4小时后，将偶联反应体系(reaction)在偶联缓冲液中洗涤4小时。在室温，将琼脂糖sepharose偶联的线性DNA在0.1M Tris-HCl(pH8，1mM EDTA)中封闭2小时，洗涤三次(洗涤循环1：偶联缓冲液；洗涤循环2：0.1M乙酸盐(acetate))，最后储存在2-8℃的1M NaCl缓冲液中。
对在0.5、1、2和4小时离心的上清的分析表明，线性DNA的偶联独立于线性化模式(粘端或平端)和琼脂糖sepharose微珠的类型(4B或6MB)。在30分钟内偶联80％DNA。此外，使用偶联缓冲液和0.1M乙酸盐的严格洗涤不会导致从琼脂糖sepharose微珠释放DNA(数据未示出)。
成功偶联后，将来自30分钟和2小时时间点的约1μg偶联DNA的等分试样用10UEcoRI消化1小时。通过将消化物加热至65℃15分钟来停止反应。将反应体系离心来沉淀琼脂糖sepharose偶联的线性DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳在1％琼脂糖凝胶上分析上清的消化的游离DNA(图6A)。
琼脂糖凝胶没有显示在琼脂糖sepharose偶联的DNA样品的EcoRI消化时预期的DNA片段。EcoRI处理的阳性对照可以在图6A的泳道3中找到。琼脂糖sepharose偶联的DNA不能被限制性内切酶消化的事实表明，由于DNA与琼脂糖sepharose的强且非特异性/非定向的结合，琼脂糖sepharose固定化的DNA不再是可及的。
为了测试其它酶反应是否也受破坏，使用XbaI-或PvuII-线性化的4B-或6MB琼脂糖sepharose偶联的DNA、T7 RNA聚合酶和序列优化的Cap/NTP混合物在37℃进行RNA体外转录2小时。使用40mM EDTA停止反应，并使用AMPure XP微珠进行纯化。
在任何RNA体外转录反应中都不能检测到产物RNA，而对于非偶联线性化的质粒DNA观察到产物RNA(图6B)。除了酶消化获得的阴性结果之外，所述体外转录的阴性结果证实琼脂糖sepharose偶联的线性DNA不再是酶反应可及的。
实施例2：使用EDC/磺基-NHS将线性化的DNA与NH2微珠偶联
本实施例的目的是查明使用EDC磺基-NHS偶联至NH2微珠的线性化DNA是否仍是酶反应可及的。
使用500U PvuII以生成DNA平端来将1mg质粒DNA(SEQ ID NO：1)线性化。在37℃，在5ml 1×酶切缓冲液中进行酶切反应2小时。在37℃使用300U碱性磷酸酶对所得的DNA平端去磷酸化30分钟，以防止再连接。在65℃通过加入0.1％SDS 10分钟来停止磷酸酶反应。然后，将线性化和去磷酸化的DNA用1ml冰冷的丙醇洗涤，并在室温以20,000g离心20分钟。将沉淀物干燥10～30分钟。然后在37℃用AseI再消化DNA 2小时以生成羧酸基团，这对于通过EDC/磺基-NHS与NH2-微珠偶联是强制性的，随后如上文所述用异丙醇洗涤。最后，将PvuII/AseI消化的DNA溶解在2×偶联缓冲液中，并使用Nanodrop2000测定DNA浓度。
将16mg EDC和44mg磺基-NHS溶于100μl wfi(注射用水)，然后与PvuII/AseI-消化的DNA混合作为20×溶液。将1g NH2-微珠用2ml MES偶联缓冲液(0.2M 2-吗啉代乙磺酸，pH6；1M NaCl)在0.2μm Vivaspin-2柱(20.000g，1min)中洗涤3次。为了偶联PvuII/AseI-消化的DNA，将5μl 20×EDC和20×磺基-NHS添加到40μl wfi中的100μgDNA中，至50μl的最终体积，并温育15分钟以活化DNA的5'-磷酸基团。随后加入0.14μl 2-巯基乙醇以灭活过量的EDC。之后，加入100μl NH2-微珠，并在室温温育反应1.5～3小时。最后，通过在室温由10mM羟胺或100mM Tris-HCl，pH 8 30分钟来终止反应。
为了测试NH2偶联的DNA是否是酶反应可及的以及是否可使用限制性内切酶消化，通过EcoRI消化NH2偶联的DNA并通过如实施例1中所述的琼脂糖凝胶电泳进行分析。
琼脂糖凝胶没有显示EcoRI消化NH2偶联的DNA时预期的DNA片段(数据未示出)。NH2偶联的DNA不能被限制性内切酶消化的事实表明，由于DNA与NH2微珠的强且非特异性/非定向的结合，琼脂糖sepharose固定的DNA不再是可及的。
RNA体外转录的尝试同样失败(数据未示出)。除了酶消化获得的阴性结果之外，RNA体外转录的阴性结果证实NH2偶联的线性DNA不再是酶反应可及的。
实施例3：通过Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)将线性化的DNA偶联到叠 氮化物-生物素，并随后与磁性链霉亲和素微珠相关联
本实施例的目的是查明线性化的质粒DNA是否可以通过CuAAC(所谓的“点击”反应)偶联到叠氮化物-生物素，并且是否可以进一步与链霉亲和素微珠相关联，如果是，则所述DNA是否仍然是酶反应可及的。
使用200U PvuII在37℃和600rpm将1mg的质粒DNA(SEQ ID NO：1)线性化2小时以生成DNA平端。使用AMPure XP微珠纯化线性化的DNA，并通过如实施例1中所述的琼脂糖凝胶电泳分析酶切反应体系。
通过在72℃和1000rpm用40μM 7-乙炔基-dATP和1U Taq聚合酶将300μg线性化的DNA腺苷酸化55分钟，生成炔烃部分，该炔烃部分与叠氮化物-生物素反应并使线性化的DNA与链霉亲和素相关联。进行使用dATP的腺苷酸化作为阴性对照，因为该反应不产生炔部分。在双链线性化DNA的每条链的3'末端发生通过水生栖热菌(Taq)聚合酶的腺苷酸化。随后使用AMPure XP微珠纯化腺苷酸化反应。为了获得仅在模板链的3'末端上具有7-乙炔基-dATP的线性双链DNA，使用EcoRI在37℃和100rpm将线性化的腺苷酸化的DNA消化60分钟，并再次使用AMPure XP微珠进行纯化。
使用BaseClick-Kit生物素(baseclick GmbH)，根据制造商的说明书，进行DNA的7-乙炔基-dATP与叠氮-生物素的叠氮基的的Cu(I)-催化的叠氮化物-炔环加成。将15μg腺苷酸化的DNA与10mM叠氮化物-生物素溶液混合。添加Cu-THPTA或Cu-TBTA以催化环加成。
将反应涡旋10秒，然后在45℃在100rpm温育30分钟。随后，使用AMPure XP微珠纯化生物素化的DNA。为了防止铜离子对DNA的损伤，生物素化的DNA用70％EtOH洗涤六次或用70％EtOH洗涤四次并用70％EtOH+10mM EDTA洗涤两次，以络合铜离子。
最后，生物素化的DNA与磁性链霉亲和素微珠相关联。使用B&W缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，2M NaCl)洗涤DynabeadsTM M-280链霉亲和素微珠(Thermo FisherScientific)三次。然后将DynabeadsTM M-280链霉亲和素微珠与4.5μg生物素化的DNA混合并在22℃在1000rpm温育30分钟。然后将微珠离心，放在磁体上，并用l×TE缓冲液洗涤三次。
为了评估关联效率，使用NsbI在37℃和850rpm在相应的酶切缓冲液中消化关联之前和之后的上清样品中的未关联的DNA。成功的DNA消化将得到1289bp和2586bp的两个DNA片段。使用琼脂糖凝胶电泳定量分析酶切反应体系(图7，泳道2和3)。
当比较图7的泳道2和3时，可以看出，上清中的DNA量在关联反应之后较少(图7的泳道3)。事实上，70％的生物素化的DNA可以与链霉亲和素磁性微珠相关联。
为了评估酶对链霉亲和素相关联的DNA的可及性，使用NsbI在37℃和850rpm在相应的酶切缓冲液中消化所述DNA 30分钟。此时成功的DNA消化将得到2586bp的一个DNA片段。使用琼脂糖凝胶电泳定量分析酶切反应体系(图7，泳道4)。
图7中的结果，泳道4表明与链霉亲和素关联的DNA仍然是酶反应(即酶切消化)可及的。
实施例4：使用与链霉亲和素相关联的DNA的RNA体外转录
已经表明，与根据实施例3的链霉亲和素磁性微珠相关联的线性化DNA是酶消化可及的，本实施例旨在表明与链霉亲和素关联的DNA适合用作失控RNA体外RNA转录的模板。
在CuAAC期间，使用TBTA或THPTA(两种都是铜稳定配体)来稳定用于环加成的Cu(I)-催化剂。作为成功的环加成的对照，使用dATP而不是乙炔基-dATP(图8，泳道2和6)。为了测试铜离子经由EDTA的络合是否会改善RNA体外转录及RNA质量，在RNA体外转录之前，将与生物素的偶联反应体系用70％EtOH洗涤六次(图8，泳道3、4、7、8)或者用70％EtOH洗涤4次并用70％EtOH+10mM EDTA洗涤两次(图8，泳道5和9)。为了检查对DNA偶联的影响，还使用未偶联的线性化的DNA用作RNA制备的模板(图8，泳道10)。
如实施例1所述进行RNA体外转录，通过添加20mM EDTA，在30分钟后停止转录反应，并通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA制备(图8)。
如图8所示，与链霉亲和素相关联的DNA是用于RNA的体外转录的合适模板。此外，发现使用水溶性催化剂Cu(I)-THPTA(A)比使用Cu(I)-TBTA(B)产生更多的RNA产物(比较图8的通道4、5以及8、9)。此外，可以表明，铜离子与EDTA的络合提供了高质量的RNA产物(比较图8的泳道4和5和8和9)。图8的泳道10示出了没有与生物素偶联作为用于体外转录的RNA的模板的线性DNA的对照。
实施例5：通过经严格洗涤耗尽铜离子而提高的RNA体外转录
本实施例的目的是查明如实施例3中所述的偶联反应之后和RNA体外转录之前的严格洗涤是否提高了RNA质量。为此，经使用Cu(I)-TBTA或Cu(I)-THPTA的CuAAC将叠氮化物-生物素与线性化的DNA偶联，并单独用70％EtOH(洗液I)或70％EtOH/10mM EDTA(洗液II)洗涤。然后将洗涤过的生物素化的DNA与如实施例4中所述的磁性链霉亲和素微珠相关联。将与链霉亲和素微珠相关联的DNA放置在磁体上，去除上清，并用洗涤缓冲液(0.5％吐温-20，500mM NaCl，10mM Tris，pH 8，10mM EDTA)(洗液III)在22℃和850rpm洗涤六次。然后用l×TE缓冲液洗涤3次。
已表明，当使用洗液I乙醇(参见图9的泳道2和5)或洗液II乙醇和EDTA(参见图9的泳道3、7)洗涤并进一步用洗涤缓冲液洗液III(参见图9的泳道4、6和8)洗涤时，从与磁性链霉亲和素微珠相关联的DNA进行的RNA体外转录的效率和质量提高。这种提高很很可能是由于去除了Cu(I)离子而DNA质量更好。
实施例6：线性化的炔化dsDNA与叠氮化物官能化的磁性微珠的偶联
对于所有以下实施例6.1至6.3，使用线性化的炔化dsDNA和用叠氮基团官能化的磁性微珠。根据实施例3获得线性化的炔化dsDNA。
6.1无Cu的环加成：
将lμg炔化dsDNA(重悬于50％DMSO和50％wfi中)与500μg磁性叠氮化物微珠在室温以1000rpm振摇混合过夜。之后，进行若干洗涤步骤以除去未结合的DNA和杂质，并防止金属离子对核酸的破坏(用高盐缓冲液(0.5％吐温-20，500mM NaCl，10mM Tris pH 8，10mMEDTA)洗涤3次，用低盐缓冲液(0.5％吐温-20，10mM Tris pH 8，10mM EDTA)洗涤3次并用l×TE缓冲液洗涤3次)。
6.2 CuBr作为催化剂：
将1μg炔化dsDNA与500μg磁性叠氮化物微珠混合；添加Cu-THPTA或Cu-TBTA络合物(催化剂)以催化环加成。将反应体系涡旋10秒，然后在室温以1000rpm振摇温育过夜。之后，进行若干洗涤步骤以去除未结合的DNA和杂质，并防止核酸被任何金属离子，即铜破坏(用高盐缓冲液(0.5％吐温-20，500mM NaCl，10mM Tris pH 8，10mM EDTA)洗涤3次，用低盐缓冲液(0.5％吐温-20，10mM Tris pH 8，10mM EDTA)洗涤3次并用l×TE缓冲液洗涤3次)。
6.3CuSO4作为催化剂：
将1μg炔化dsDNA与500μg磁性叠氮化物微珠混合；添加CuSO4-THPTA与20～70％DMSO和10～70mM抗坏血酸钠以催化环加成。将反应涡旋10秒，然后在室温以1000rpm振摇温育过夜。之后，进行若干洗涤步骤以去除未结合的DNA和杂质，并防止核酸被任何金属离子，即铜破坏(用高盐缓冲液(0.5％吐温-20，500mM NaCl，10mM Tris pH 8，10mM EDTA)洗涤3次，用低盐缓冲液(0.5％吐温-20，10mM Tris pH 8，10mM EDTA)洗涤3次并用l×TE缓冲液洗涤3次)。
6.4固定化的DNA上的RNA体外转录：
将获得的固定在磁性微珠上的DNA(根据段落6.1、6.2和6.3.)用于RNA体外转录反应。
实施例7：使用在其非编码链3'末端偶联的DNA、在其编码链3'末端偶联的DNA、或 在两者3'末端均偶联的DNA的RNA体外转录
本实施例的目的是比较使用在偶联的支持物的位置方面不同的线性DNA模板的RNA体外转录反应的结果。
7.1将线性化的DNA经Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)偶联到叠氮化物- 生物素，并随后与磁性链霉亲和素微珠相关联：
使用200U NsbI在37℃和600rpm进行2小时以生成DNA平端来线性化1mg质粒DNA(SEQ ID NO：1)。使用AMPure XP微珠纯化线性化的DNA。通过用40μM炔-dATP和1UTaq聚合酶将300μg线性化的DNA在72℃和1000rpm腺苷酸化55分钟，生成炔烃部分，该炔烃部分与叠氮化物-生物素反应并使线性化的DNA与链霉亲和素相关联。随后使用AMPure XP微珠纯化腺苷酸化反应。
设置1：在其编码链的3'偶联的DNA的制备
为了获得仅在非模板链(编码链)的3'末端具有炔-dATP的线性双链DNA，用SspI在37℃和1000rpm消化线性化的腺苷酸化的DNA 60分钟，并使用AMPure XP微珠纯化。DNA的炔-dATP与叠氮化物-生物素的叠氮基团的Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成，以及生物素化的DNA与磁性链霉亲和素微珠(DynabeadsTM M-280)的关联基本如实施例3中所述进行。获得的DNA微珠如实施例5中所述被全面洗涤，并最终用作RNA体外转录的模板(参见7.2)。
设置2：在其非编码链的3'偶联的DNA的制备
为了获得仅在模板链(非编码链)的3'末端具有炔-dATP的线性双链DNA，用AhdI在37℃和1000rpm消化线性化的腺苷酸化的DNA60分钟，并使用AMPure XP微珠进行纯化。DNA的炔-dATP与叠氮化物-生物素的叠氮基团的Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成，以及生物素化的DNA与磁性链霉亲和素微珠(DynabeadsTM M-280)的关联基本如实施例3中所述进行。获得的DNA微珠如实施例5中所述被全面洗涤，并最终用作RNA体外转录的模板(参见7.2)。
设置3：在两者3'末端都偶联的DNA的制备
为了获得在两者3'末端(即在非模板链(编码链)的3'末端以及在模板链(非编码链)的3'末端)都具有炔-dATP的线性双链DNA，使用如上所述的腺苷酸化反应之后纯化的DNA。DNA的炔-dATP与叠氮化物-生物素的叠氮基团的Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成，以及生物素化的DNA与磁性链霉亲和素微珠(DynabeadsTM M-280)的关联基本如实施例3中所述进行。获得的DNA微珠如实施例5中所述被全面洗涤，并最终用作RNA体外转录的模板(参见7.2)。
7.2使用与链霉亲和素相关联的DNA的不同模板的RNA体外转录
基本上如实施例1中描述的那样进行RNA体外转录。使用在其编码链的3'偶联的DNA(设置1)、在其非编码链的3'偶联的DNA(设置2)、或在两者3'末端都偶联的DNA(设置3)作为DNA模板进行三种不同的反应。通过添加48mM EDTA，在30分钟后停止转录反应，通过琼脂糖凝胶电泳评估每份RNA制备(2μl的未纯化的每份RNA产物；参见图10)。
如图10所示，固定在其非编码链3'的DNA(泳道2，图10)在体外转录反应期间比固定在其编码链3'的DNA(泳道1，图10)制备出更多的RNA。值得注意的是，对于使用两者3'末端都被固定的DNA的反应(泳道4，图10)，在琼脂糖凝胶上没有检测到RNA。第一泳道，泳道M对应于RNA分子量标准。
该实施例表明，根据本发明偶联的DNA(即在其非编码链的3'末端)对于随后的RNA体外转录反应是有利的。结果清楚地表明，支持物的位置对于RNA体外转录过程中的RNA收率是至关重要的。虽然不希望受理论的束缚，但结果似乎通过以下事实得以解释：非编码链的3'DNA末端上的支持物/微珠不损害RNA聚合酶(RNAP)的高效失控，而相反，在编码链的3'DNA端上的固定可能损害RNA聚合酶的高效失控，这将最终降低所制备的RNA的收率和/或质量(参见图1)。如实施例1和2中所示，本实施例证实在两末端的偶联导致DNA不再是酶反应可及的。
实施例概述
从前述实施例中显而易见的是，通过CuAAC偶联到标签如生物素(参见实施例3-5和7)并且还进一步通过生物素标签与链霉亲和素相关联的DNA是酶反应可及的，因此例如适用于RNA体外转录反应。当从标签/微珠所偶联的链的角度比较与标签/微珠的偶联时，与在编码链的3'末端的偶联相比，在非编码链的3'末端的偶联提高了所制备的RNA的收率和/或质量(参见实施例7)。根据实施例3-5提供的模板的前述可及性和适用性是令人惊讶的，因为以其他方式(参见实施例1经由CnBr或，实施例2经由EDC/磺基-NHS，或实施例7在两者3'末端上的baseClick)制备的模板对于酶反应是不可及的，因此不能用于例如RNA体外转录反应。
序列表
<110> 库瑞瓦格股份公司
<120> 偶联到单一支持物或标签的线性双链DNA和用于制备所述线性双链DNA的方法
<130> C10283WO2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3907
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA的序列
<400> 1
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 60
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 120
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 180
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 240
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 300
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 360
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 420
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 480
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 540
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 600
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 660
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 720
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 780
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 840
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 900
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 960
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 1020
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 1080
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 1140
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 1200
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 1260
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 1320
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 1380
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 1440
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 1500
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 1560
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 1620
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 1680
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 1740
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 1800
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 1860
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 1920
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 1980
gtgccacctg acgtctaata cgactcacta tagggagaaa gcttaccatg gaggacgcca 2040
agaacatcaa gaagggcccg gcgcccttct acccgctgga ggacgggacc gccggcgagc 2100
agctccacaa ggccatgaag cggtacgccc tggtgccggg cacgatcgcc ttcaccgacg 2160
cccacatcga ggtcgacatc acctacgcgg agtacttcga gatgagcgtg cgcctggccg 2220
aggccatgaa gcggtacggc ctgaacacca accaccggat cgtggtgtgc tcggagaaca 2280
gcctgcagtt cttcatgccg gtgctgggcg ccctcttcat cggcgtggcc gtcgccccgg 2340
cgaacgacat ctacaacgag cgggagctgc tgaacagcat ggggatcagc cagccgaccg 2400
tggtgttcgt gagcaagaag ggcctgcaga agatcctgaa cgtgcagaag aagctgccca 2460
tcatccagaa gatcatcatc atggacagca agaccgacta ccagggcttc cagtcgatgt 2520
acacgttcgt gaccagccac ctcccgccgg gcttcaacga gtacgacttc gtcccggaga 2580
gcttcgaccg ggacaagacc atcgccctga tcatgaacag cagcggcagc accggcctgc 2640
cgaagggggt ggccctgccg caccggaccg cctgcgtgcg cttctcgcac gcccgggacc 2700
ccatcttcgg caaccagatc atcccggaca ccgccatcct gagcgtggtg ccgttccacc 2760
acggcttcgg catgttcacg accctgggct acctcatctg cggcttccgg gtggtcctga 2820
tgtaccggtt cgaggaggag ctgttcctgc ggagcctgca ggactacaag atccagagcg 2880
cgctgctcgt gccgaccctg ttcagcttct tcgccaagag caccctgatc gacaagtacg 2940
acctgtcgaa cctgcacgag atcgccagcg ggggcgcccc gctgagcaag gaggtgggcg 3000
aggccgtggc caagcggttc cacctcccgg gcatccgcca gggctacggc ctgaccgaga 3060
ccacgagcgc gatcctgatc acccccgagg gggacgacaa gccgggcgcc gtgggcaagg 3120
tggtcccgtt cttcgaggcc aaggtggtgg acctggacac cggcaagacc ctgggcgtga 3180
accagcgggg cgagctgtgc gtgcgggggc cgatgatcat gagcggctac gtgaacaacc 3240
cggaggccac caacgccctc atcgacaagg acggctggct gcacagcggc gacatcgcct 3300
actgggacga ggacgagcac ttcttcatcg tcgaccggct gaagtcgctg atcaagtaca 3360
agggctacca ggtggcgccg gccgagctgg agagcatcct gctccagcac cccaacatct 3420
tcgacgccgg cgtggccggg ctgccggacg acgacgccgg cgagctgccg gccgcggtgg 3480
tggtgctgga gcacggcaag accatgacgg agaaggagat cgtcgactac gtggccagcc 3540
aggtgaccac cgccaagaag ctgcggggcg gcgtggtgtt cgtggacgag gtcccgaagg 3600
gcctgaccgg gaagctcgac gcccggaaga tccgcgagat cctgatcaag gccaagaagg 3660
gcggcaagat cgccgtgtga ggactagtta taagactgac tagcccgatg ggcctcccaa 3720
cgggccctcc tcccctcctt gcaccgagat taataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatg catccccccc cccccccccc 3840
cccccccccc ccccaaaggc tcttttcaga gccaccagaa ttcggatact ctagacatat 3900
gcttaag 3907

Claims (63)

1.一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件上游的RNA聚合酶启动子序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
2.根据权利要求1所述的线性双链DNA，其中所述非编码链通过三唑在其3'末端偶联到支持物或标签。
3.根据权利要求1或2所述的线性双链DNA，其中所述标签为生物素。
4.根据权利要求3所述的线性双链DNA，其中所述生物素与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的线性双链DNA，其中所述编码序列元件侧翼为5'UTR和/或3'UTR元件。
6.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA与识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(d)将步骤(c)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
7.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过在每条链的所述3'末端的所述经修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签；
(d)将步骤(c)中获得的DNA与识别所述酶切元件的限制性内切酶温育，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述经修饰的脱氧核苷酸选自由炔脱氧核苷酸、叠氮化物脱氧核苷酸、氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸、反式-环辛烯脱氧核苷酸和乙烯基脱氧核苷酸组成的组。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸的酶是DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、酿酒酵母DP1DNA聚合酶、哺乳动物DNAβ聚合酶、工程化DNA聚合酶、DNA聚合酶I大(Klenow)片段和末端转移酶组成的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述DNA聚合酶是水生栖热菌DNA聚合酶，并且其中在步骤(a)中提供的线性化DNA包括在所述编码序列元件的5'末端的平端。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述支持物选自由磁性微珠、纳米颗粒、琼脂糖Agarose、玻璃、聚(甲基丙烯酸甲酯)、微芯片、琼脂糖Sepharose、葡聚糖sephadex和二氧化硅组成的组，并且其中所述标签选自由生物素和PEG组成的组。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中在所述偶联步骤中使用的所述支撑物或所述标签是活化的支持物或活化的标签。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述活化的支持物或标签选自由炔活化的支持物或标签、叠氮化物活化的支持物或标签、氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签、四嗪活化的支持物或标签、以及反式-环辛烯活化的支持物或标签组成的组。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸通过CuAAC、SPAAC或四嗪-烯连接与所述活化的支持物或标签偶联。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是炔脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是炔活化的支持物或标签。
18.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
19.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是叠氮化物脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是氮杂二苯并环辛炔活化的支持物或标签。
20.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是反式-环辛烯脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。
21.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙烯基脱氧核苷酸，并且其中所述活化的支持物或标签是四嗪活化的支持物或标签。
22.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dNTP，并且其中所述活化的支持物或标签是叠氮化物活化的支持物或标签。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷酸是乙炔基-dATP，并且其中所述活化的标签是叠氮化物活化的生物素。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述偶联步骤在Cu(I)的存在下进行。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述偶联步骤在Cu(I)-TBTA或Cu(I)-THPTA的存在下进行。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中执行另外的洗涤步骤以在所述偶联步骤之后经由络合到EDTA来去除Cu(I)。
27.根据权利要求6-26中任一项所述的方法，其中所述方法包括在温育所述DNA和限制性内切酶的步骤之后的附加步骤，即将在所述非编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或带有支持物或标签的所述线性双链DNA与在所述编码链的3'末端带有经修饰的脱氧核苷酸或带有支持物或标签的线性双链DNA分离的附加步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述分离通过所述DNA的大小来实现，优选使用AMPure XP微珠。
29.根据权利要求6-28中任一项所述的方法，其中所述酶切位点元件是EcoRI位点，并且其中所述限制性内切酶是EcoRI。
30.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA和识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到标签。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述连接了标签的脱氧核苷酸选自由生物素-脱氧核苷酸和PEG-脱氧核苷酸组成的组。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸的酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶和末端转移酶组成的组。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述方法包括在温育所述DNA和限制性内切酶的步骤之后的附加步骤，即将在所述非编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的所述线性双链DNA与在所述编码链的3'末端带有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA分离的附加步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述分离是通过所述DNA的大小来实现的，优选使用AMPure XP微珠。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述酶切位点元件是EcoRI位点，并且其中所述限制性内切酶是EcoRI。
36.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(c)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(d)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够将所述经修饰的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(e)将步骤(b)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
37.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含由所述编码链编码的编码序列元件的线性双链DNA，其中所述DNA具有所述编码元件5'的平端和所述编码元件3'的粘端；
(b)温育所述DNA与(i)连接了标签的脱氧核苷酸和(ii)能够将连接了标签的脱氧核苷酸在平端而不在粘端添加到单链的3'末端的酶，以提供在所述非编码链的3'末端具有连接了标签的脱氧核苷酸的线性双链DNA。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述能够将经修饰的脱氧核苷酸或连接了标签的脱氧核苷酸在平端添加到单链的3'末端的酶为水生栖热菌DNA聚合酶。
39.根据权利要求1-5中任一项所述的线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途。
40.一种体外制备RNA的方法，包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1-5中任一项所述的双链线性DNA作为模板DNA；
(b)提供(i)核糖核苷三磷酸和(ii)DNA依赖性RNA聚合酶；
(c)在合适的条件下温育在步骤(a)中提供的DNA和在步骤(b)中提供的(i)和(ii)以制备RNA。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶，优选T3、T7或SP6 DNA依赖性RNA聚合酶。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供帽类似物。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供核糖核酸酶抑制剂。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供焦磷酸酶。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中另外提供MgCl2。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中在适于体外制备RNA的缓冲液中温育所述DNA。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中提供的DNA被再次用于至少一个另外的RNA体外制备循环。
48.一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包括
(a)包含根据权利要求1-5中任一项所述的线性双链DNA的反应容器(13)；
(b)包含核糖核苷三磷酸和DNA依赖性RNA聚合酶的容器(14)，其中所述容器连接到所述反应容器；和
(c)用于收集所述RNA产物的产物容器(15)，其中所述产物容器也连接到所述反应容器。
49.根据权利要求48所述的生物反应器，其中所述反应容器(13)包含与根据权利要求4的链霉亲和素包被的磁性微珠相关联的线性双链DNA。
50.根据权利要求49所述的生物反应器，其中磁体从外部围绕所述反应容器(13)。
51.根据权利要求50所述的生物反应器，其中所述磁体能够振荡以混合包含所述线性双链DNA的反应混合物。
52.根据权利要求50或51所述的生物反应器，其中所述磁体能够吸引所述线性双链DNA，以将所述线性双链DNA与所述RNA产物分离，所述RNA产物可以被收集在所述产物容器(15)中。
53.根据权利要求48所述的生物反应器，其中根据权利要求1-5中任一项所述的线性双链DNA的支持物或标签与所述反应容器(13)连接。
54.根据权利要求48-53中任一项所述的生物反应器，其中所述容器(14)进一步包括独立地选自由以下组成的组中的至少一种：适用于体外转录的缓冲液、帽类似物、经修饰的核糖核苷三磷酸、核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶、MgCl2、抗氧化剂和多胺。
55.根据权利要求48-54中任一项所述的生物反应器，其中所述反应容器(13)包括至少一个用于测量和/或调节pH、盐浓度、镁浓度、磷酸浓度、温度、压力、流速、RNA浓度和/或核糖核苷酸三磷酸浓度的装置。
56.根据权利要求48-55中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器包括在所述反应容器(13)和所述产物容器(15)之间的过滤膜，优选地是用于将所述RNA产物与所述反应混合物分离的超滤膜。
57.根据权利要求56所述的生物反应器，其中所述过滤膜或超滤膜具有在10～100kDa、10～75kDa、10～50kDa、10～25kDa或10～15kDa的范围的截留分子量。
58.根据权利要求56或57所述的生物反应器，其中所述过滤膜或超滤膜选自由再生纤维素、改性纤维素、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇和聚芳醚砜组成的组。
59.根据权利要求48-58中任一项所述的生物反应器，其中所述产物容器(15)包含用于捕获所制备的RNA以将所述RNA产物与反应混合物的其它可溶性组分分离的树脂。
60.根据权利要求48-59中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器以间歇、半间歇或连续模式操作。
61.根据权利要求48-60中任一项所述的生物反应器在根据权利要求40-47中任一项的方法中的用途。
62.一种试剂盒，其包含
(a)经修饰的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述经修饰的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)活化的支持物或标签；
(d)以高度特异的方式与所述支持物或标签相关联的所述支持物或标签的对应物。
63.一种试剂盒，其包含
(a)连接了标签的脱氧核苷酸；
(b)能够在DNA平端将所述连接了标签的脱氧核苷酸添加到链的3'末端的水生栖热菌DNA聚合酶；
(c)以高度特异的方式与所述标签相关联的所述标签的对应物。
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