CN111094574A - 使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的双链多联体dna的体内rna或蛋白质表达 - Google Patents
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Abstract
提供了用于体内RNA或蛋白质表达的方法。该方法包括将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质。双链多联体DNA包括多个串联重复序列，其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列。双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。还提供了包含外源的双链多联体DNA的真核细胞，所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列。
Description
发明领域
本公开内容总体上涉及RNA或蛋白质表达系统，其涉及双链多联体DNA的体内转录和/或翻译。本公开内容特别涉及使用包括硫代磷酸酯化的核苷酸的双链多联体DNA的体内RNA或蛋白质表达。
发明背景
各种基于蛋白质和RNA的应用的增加已增加了对于RNA和蛋白质的大规模生产的需求。这些应用中的大多数，尤其是治疗应用，需要蛋白质/RNA满足在纯度、效力、功效和安全性方面的严格质量标准。经常采用重组蛋白生产来满足所需的大规模蛋白生产的期望。非常需要更高的生产效率和更低的成本，以使这些蛋白质/RNA产物在商业上可行。
传统上，对于在哺乳动物细胞中的蛋白质的体内生产，使用质粒DNA的细胞转染已用作主要工具。由相应的DNA序列产生期望的蛋白质或RNA涉及大量真核细胞的使用，并且一般以大体积规模例如100L执行。对于体内蛋白质生产，可以生成稳定的细胞系，并且扩增至足够的数量，以生成所需的蛋白质产率。进一步地，在其中表达的蛋白质对宿主细胞是致死性的情况下，可以使用瞬时生产系统。使用无细胞的体外RNA或蛋白质表达系统，还可以在更短的时期内表达显著更高数量的RNA或蛋白质。然而，体外转录-翻译系统经常需要较大量的DNA模板。
一般地，质粒DNA在体内和体外转录-翻译系统中用作模板DNA。然而，用于较大规模的瞬时/稳定转染或无细胞表达的足够质粒的制造经常是昂贵且麻烦的。例如，传统的质粒生成方法需要劳动密集型的克隆和质粒纯化。进一步地，大规模质粒制备的传统方法存在被无关细菌组分和/或纯化试剂污染的风险，其可能影响下游RNA表达和后续蛋白质生产。
合适的改造的DNA序列，尤其是仅含有启动子和目的基因，并且缺乏对于在细菌中的维持必需的任何不期望的DNA序列（例如，复制起点或抗生素抗性基因）的DNA序列（其可以用于在真核细胞中的转染，用于后续RNA和/或蛋白质生产）的快速、成本有效生产是高度期望的。等温DNA扩增技术，例如滚环扩增（RCA），可以用于从环状核酸模板开始生成如此大量的高质量DNA，伴随较少的劳力、时间和费用。例如，RCA使得能够快速产生合适的改造的DNA序列，例如仅含有启动子和目的基因的DNA序列。
尽管使用真核细胞系和RCA产物DNA的少数RNA和蛋白质表达系统是目前可获得的，然而，这些系统具有所需蛋白质的表达率相当低的缺点，导致重组蛋白质的低产率和高成本。存在关于适当的体内RNA和/或蛋白质表达系统的需要，所述表达系统提供在商业上可行的RNA和/或蛋白质的生产中的显著改善。
发明概述
在一些实施方案中，提供了用于体内RNA或蛋白质表达的方法。该方法包括将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质。双链多联体DNA包含多个串联重复序列，其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列。双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
在一些实施方案中，提供了包含外源的双链多联体DNA的真核细胞，所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列。多个串联重复序列各自包含硫代磷酸酯化的核苷酸，其中硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
附图简述
当参考附图阅读下述详述时，本发明的这些及其它特点、方面和优点将变得更好理解。
图1是琼脂糖凝胶电泳的图像，其示出了与超螺旋质粒DNA和缺乏硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA相比，包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA的体外稳定性。
图2示出了在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA、缺乏硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA转染HEK293细胞后，绿色荧光蛋白（GFP）的体内表达。信号针对在第2天时确定的相对荧光单位进行标准化。
图3示出了在转染后第2天和第9天时，在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA转染HEK293细胞后，红色荧光蛋白（RFP）的体内表达，并且指示了与超螺旋质粒DNA相比，包含硫代磷酸酯化的核苷酸（RCA-硫代C、RCA-硫代T或RCA-硫代全部）的RCA产物DNA的体内稳定性。
图4示出了与超螺旋质粒DNA相比，在用包含硫代磷酸酯化的核苷酸（RCA硫代A或RCA硫代G）的RCA产物DNA转染HEK293细胞后，红色荧光蛋白（RFP）的体内表达。
发明详述
下述详述是示例性的，并且不预期限制本发明或本发明的用途。在说明书各处，特定术语的例示应该被视为非限制性的实例。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考。如本文在说明书和权利要求书各处所使用的，近似语言可以应用于修饰任何定量表示，其在不导致它与之有关的基本功能的变化的情况下可以允许变化。相应地，由术语如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分数量、性质例如分子量、反应条件等等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。相应地，除非指示相反，否则在下述说明书和所附权利要求书中所阐述的数字参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明获得的所需特性而变。必要时，已提供了范围，并且这些范围包括其间的所有子范围。为了更清楚和简明地描述且指出本发明的主题，对于在下述描述和所附权利要求中使用的特定术语提供了下述定义。
如本文使用的，术语“硫代磷酸酯化的核苷酸”指具有改变的磷酸酯主链的核苷酸，其中糖部分通过硫代磷酸酯键连接。在寡核苷酸序列的磷酸酯主链中，硫代磷酸酯键含有硫原子作为非桥连氧原子的替代物。这种修饰致使核苷酸间连键抵抗核酸酶降解。
如本文使用的，术语“双链多联体DNA”指含有串联连接的相同DNA序列的多个拷贝的双链DNA分子。
如本文使用的，术语“滚环扩增（RCA）产物DNA”指核酸扩增产物，其中环状核酸模板（例如，单链/双链DNA环）经由滚环扩增反应机制进行扩增。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增产物DNA可以由显示出线性扩增动力学的线性RCA（LRCA）（例如，使用单个特异性引物的RCA）生成，或者由显示出指数扩增动力学的指数RCA（ERCA）生成。滚环扩增产物DNA也可以通过使用多重引物（多重引发的滚环扩增或MPRCA）生成，其中滚环扩增产物DNA是超分支的多联体。在双重引发的RCA中，一个引物可以如在线性RCA中一样与环状核酸模板互补，而另一个可以与RCA产物DNA的串联重复单元核酸序列互补。RCA产物DNA可以通过RCA在体外在等温条件下使用合适的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶生成。
如本文使用的，术语“表达序列”指具有RNA和/或蛋白质表达能力的DNA序列。在其中寻求蛋白质表达的实施方案中，表达序列是有表达能力的单元，其包括与一个或多个开放读码框（ORF）可操作地连接的至少一个启动子。一个或多个ORF可以编码一种或多种相同或不同的蛋白质。在一些情况下，表达序列可以包括与多于一个ORF可操作地连接的一个启动子。例如，表达序列可以包括与两个不同ORF功能性连接的启动子，一个ORF编码抗体的重链，且另一个编码抗体的轻链。表达序列可以进一步包括序列如不依赖于帽的翻译元件（CITE），用于帮助有效的蛋白质表达。在其中寻求RNA表达的实施方案中，表达序列是有RNA表达能力的单元，其包括至少一个启动子和转录终止序列。
一个或多个实施方案涉及通过使用双链多联体DNA的体内表达（体内转录和翻译）系统，用于在真核细胞中生成所需RNA或蛋白质的方法。双链多联体DNA包括多个串联重复序列，并且多个串联重复序列各自包含表达序列。双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸。双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
体内蛋白质表达一般涵盖DNA的转录以生成mRNA，以及mRNA的同时翻译以在细胞中表达蛋白质。在一些实施方案中，通过双链多联体DNA的体内转录来生成RNA。在一些实施方案中，通过双链多联体DNA的体内转录和翻译来表达蛋白质。在一些实施方案中，双链多联体DNA是RCA产物DNA。RCA产物DNA可以进一步包含另外的核苷酸类似物、修饰的核苷酸或其组合。另外的核苷酸类似物可以具有改变的磷酸酯主链、糖部分、核碱基或其组合。例如，另外的核苷酸类似物可以是锁核酸（LNA）核苷酸或肽核酸（PNA）。如本文使用的，术语“修饰的核苷酸”指其中另外的部分附着至核苷酸的核苷酸（例如，生物素化的核苷酸）。这些体内转录和/或翻译反应提供了更高的RNA和/或蛋白质表达。含有硫代磷酸酯化的核苷酸的双链多联体DNA提供了增强的核酸酶抗性特性。
在一些实施方案中，多个（例如，两个或更多个）分开的双链多联体DNA可以用于体内蛋白质表达，其中所述分开的双链多联体DNA各自包括编码不同蛋白质的表达序列。例如，可以采用两个RCA产物DNA，其中第一RCA产物DNA包括编码第一蛋白质的第一表达序列，并且第二RCA产物DNA包括编码第二蛋白质的第二表达序列，其中所述第一蛋白质不同于所述第二蛋白质。
在一些实施方案中，双链多联体DNA的串联重复序列的至少一个序列包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸。在一些实施方案中，双链多联体DNA的每个串联重复序列包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸。通过在RCA反应中使用硫代磷酸酯化的dNTP，例如α-S-dATP和α-S-dTTP，将硫代磷酸酯化的核苷酸掺入RCA产物DNA内。术语“硫代磷酸酯化的”核苷酸在下文中可互换地用作“硫醇化的”核苷酸。术语“总核苷酸”指特定核酸序列中的硫醇化的核苷酸和非硫醇化的核苷酸的总数目。可以通过在DNA扩增反应中使用一种或多种硫醇化的dNTP来掺入硫醇化的核苷酸，所述DNA扩增反应用于产生双链多联体DNA。例如，在DNA扩增反应中，至少一部分的dATP可以被硫醇化的dATP取代。在一些其它实施方案中，可以在DNA扩增反应中使用硫醇化的dATP、dGTP、dCTP和/或dTTP的组合，所述DNA扩增反应用于双链多联体DNA的生成。将硫醇化的dNTP如α-S-dATP加入非硫醇化的dNTP混合物（例如dATP、dGTP、dTTP和dCTP的混合物）的库中。通过将加入含有硫醇化的和非硫醇化的dNTP混合物的反应混合物中的硫醇化的核苷酸的浓度除以总核苷酸（硫醇化和非硫醇化）的浓度，来计算硫醇化的dNTP与总dNTP（包括硫醇化的和非硫醇化的dNTP）的比率。
在一些实施方案中，双链多联体DNA是通过滚环扩增生成的RCA产物DNA。RCA产物DNA可以是线性或分支的多联体。在一些实施方案中，每个串联重复序列包含硫代磷酸酯化的核苷酸。与不包含任何硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA或超螺旋质粒DNA相比，包括硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA显示出针对限制性消化的稳定性增加（参见例如图1，实施例2，其明确地证实了硫醇化的RCA产物DNA对核酸外切酶活性是抗性的）。与不包含任何硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA（图1的泳道4-6）或超螺旋质粒DNA（图1的泳道1-3）相比，硫醇化的RCA产物DNA（图1的泳道7-9）显示更高的稳定性。如指出的，“硫醇化的RCA产物DNA”指包含至少一个硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA。进一步地，“非硫醇化的RCA产物DNA”指不包含任何硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA。
在一些实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在1：1600（即0.001）至125：1600（即0.078）的范围内。在一些其它实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在50：1600（或0.031）至125：1600（或0.078）的范围内。在某些实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在75：1600（或0.047）至125：1600（或0.078）的范围内。在一个或多个实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为125：1600（或0.078）。在一些实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为1：40（即0.025）。在某些实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为1：16（即0.062）。在一个可替代的实施方案中，双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为1：1。在此类实施方案中，双链多联体DNA包括相等数目的硫醇化的和非硫醇化的核苷酸。在一些实施方案中，双链多联体DNA例如RCA产物DNA的所有核苷酸都是硫代磷酸酯化的。换言之，双链多联体DNA含有100%的硫代磷酸酯化的核苷酸。
与超螺旋质粒DNA和非硫醇化的RCA产物DNA相比，使用硫醇化的RCA产物DNA显示了GFP（图2）和RFP（图3-4）的增强产率。采用硫醇化的RCA产物DNA（例如1：1600、125：1600）的蛋白质产率高于非硫醇化的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA的蛋白质产率，其在实施例3和4中详细描述，并且在图2-4中进行描绘。在这些实例中，当与非硫醇化的RCA产物DNA（由相同质粒DNA生成）和超螺旋质粒DNA相比，表达由编码GFP的质粒pAcGFP1-Hyg-C1 DNA或编码RFP的质粒pCMV6-AC-mKate DNA生成的硫醇化的RCA产物DNA时，关于GFP和RFP的体内蛋白质表达是增强的（图2-4）。进一步地，与超螺旋质粒DNA相比，RCA产物DNA显示更高的体内稳定性，如图2-4中所示。例如，图2示出了通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达，在转染到HEK293细胞内之后，与超螺旋质粒DNA和非硫醇化的RCA产物DNA相比，硫醇化的RCA产物DNA的体内稳定性增加。图2显示了与超螺旋质粒DNA相比，在体内蛋白质表达期间，硫醇化的和非硫醇化的RCA产物DNA保持完整更长的持续时间（例如20天）。然而，即使转染到HEK293细胞20天后，硫醇化的RCA DNA仍显示最大的稳定性和活性。图3-4示出了通过红色荧光蛋白（RFP）的表达，在转染到HEK293细胞内之后，与超螺旋质粒DNA相比，硫醇化的RCA产物DNA的体内稳定性增加。图2-4还指出了随着RCA产物DNA中硫代磷酸酯化的核苷酸的量增加，稳定性增加和蛋白质表达更高。例如，与1：1600相比，具有125：1600的硫醇化的RCA产物DNA显示更高的稳定性和增强的蛋白质表达。
在一些实施方案中，用于体内蛋白质表达的双链RCA产物DNA包含硫醇化的核苷酸。通过滚环扩增产生具有硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA。在这些实施方案中，RCA反应补充有在dNTP混合物内的硫醇化的dNTP，例如α-S-dATP或α-S-dTTP，用于在扩增时将硫醇化的碱基随机掺入RCA产物DNA内。当与非硫醇化的RCA产物相比时，当包含硫醇化的核苷酸的RCA产物用于体内转录和翻译时，蛋白质表达得到改善。在一些实施方案中，双链多联体DNA，例如RCA产物DNA，可以是内部硫醇化的（具有α-S-dNTP）。在此类实施方案中，为了生成内部硫醇化的双链多联体DNA，RCA反应补充有硫代磷酸酯化的核苷酸。将硫代磷酸酯化的核苷酸掺入dNTP混合物内，用于在扩增过程中将硫醇化的碱基随机掺入RCA产物DNA内。在一些其它实施方案中，可以通过采用硫醇化的引物序列用于RCA反应，来生成（例如，硫醇化，具有α-S-dNTP）双链多联体DNA，例如包含硫代磷酸酯化的核苷酸的RCA产物DNA。
用于体内RNA或蛋白质表达的RCA产物DNA可以是加工的DNA或未加工的DNA。RCA产物DNA的“加工”可以包括目的RCA产物DNA的限制性消化、化学变性、热变性、自切割或酶促切割的动作。RCA产物DNA的“加工”还可以包括目的RCA产物DNA的纯化。RCA产物的“加工”还可以包括物理或酶促降低RCA产物的长度。这种“加工”可以包括但不限于实例例如剪切，超声处理，使用限制性消化、转座酶、原核端粒酶、cas9/CRISPR的处理，或可以用于降低RCA产物的长度的任何其它酶促反应，所述RCA产物含有一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸。在一些实施方案中，RCA产物DNA可以用作用于体内蛋白质表达的DNA模板而无需任何纯化。在一些实施方案中，可以加工双链多联体DNA，以形成线性或环状DNA模板用于转染。在转染到真核细胞内之前，可以将线性多联体DNA插入质粒载体内。在此类实施方案中，线性多联体DNA可以经受限制性消化，以产生片段化的DNA，随后使用重组技术将片段化的DNA插入质粒载体内。另外，可以用重组酶或原核端粒酶或其它酶处理线性多联体DNA，以生成环化的片段化的DNA。在一些实施方案中，将RCA产物DNA转染或引入真核细胞内，而无需任何进一步加工。在此类实施方案中，在将RCA产物用作用于体内蛋白质表达的DNA模板之前，它不经受任何种类的限制性消化或自切割以形成较小的片段。在一些其它实施方案中，在采用DNA模板用于引入真核细胞内用于体内蛋白表达之前，RCA产物不经受任何化学变性或热变性以使RCA产物DNA变性。然而，在一些实施方案中，在进行至转染之前，可以从反应介质中分离（例如，通过沉淀）RCA产物DNA，以去除盐或任何其它污染物，例如引物或更小的片段化的DNA。
RCA产物DNA经常通过滚环扩增反应生成，所述滚环扩增反应采用试剂例如引物、核酸聚合酶和游离核苷酸（dNTP）。核酸聚合酶可以是校对核酸聚合酶，包括但不限于Phi29DNA聚合酶。在一些实施方案中，RCA中使用的试剂可以例如通过紫外线辐射进行预处理，或者通过在核酸酶及其辅因子的存在下温育试剂进行去污染。在扩增反应过程中，DNA模板在dNTP（例如dATP、dGTP、dCTP或dTTP）、修饰的dNTP（例如硫醇化的dNTP，例如α-S-dGTP、α-S-dCTP、α-S-dATP和α-S-dTTP）或其组合的存在下通过聚合酶进行复制。可以使用商购可得的RCA扩增试剂盒，例如illustra™ TempliPhiTM Amplification Kit（GE Healthcare LifeSciences）来执行RCA。
RCA反应可以使用随机引物混合物或特异性引物执行。也可以使用包含一种或多种核苷酸类似物的引物序列。例如，核苷酸类似物可以包括硫代磷酸酯化的核苷酸、肌苷、锁核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸、拉链核酸（ZNA）聚阳离子修饰的核苷酸、或其组合。在一个或多个实施方案中，随机引物混合物具有核酸酶抗性引物（例如，在适当的位置处包含硫代磷酸酯基团的引物序列）、随机六聚体或六聚体引物。
在一些实施方案中，通过使用RCA反应生成RCA产物DNA，所述RCA反应具有在约10μM至约10 mM范围内的dNTP最终浓度。在RCA反应的一个或多个实施方案中，dNTP浓度小于10 mM。在这些实施方案中，dNTP的浓度保持低于10 mM，以避免由RCA产物的水凝胶形成，并且保持在低于或等于反应缓冲液中存在的二价阳离子（例如，镁）的量的浓度下。在高浓度dNTP的存在下的扩增后，可能发生水凝胶形成，其可能进一步使下游操作（例如RCA产物的移液和加工）复杂化。当在RCA反应中使用50 mM或更高的dNTP浓度时，可以观察到水凝胶形成。
多个串联重复序列各自中的表达序列可以包含编码序列、非编码序列或其组合。在一些实施方案中，表达序列进一步包含聚A序列、翻译增强子序列、转录终止序列、核糖体结合位点、翻译终止序列、绝缘子序列或其组合。表达序列可以进一步包括前启动子序列、用于蛋白酶切割或核苷酸切割的序列、用于蛋白质纯化的序列或其组合。
在一些实施方案中，表达序列含有编码序列，其中所述编码序列在真核细胞中生成所需蛋白质。编码序列是含有特定目的基因的核酸序列。一般而言，编码序列包含启动子和开放读码框（ORF）。编码序列可以任选地包括不依赖于帽的翻译元件（CITE）。在一些实施方案中，编码序列进一步包含核糖体结合位点。编码序列可以包含位于开放读码框外，但在表达序列内的转录终止子序列。在一个或多个实施方案中，编码序列的开放读码框包含密码子优化的序列、纯化标签序列、蛋白酶切割位点或其组合。在一些实施方案中，表达序列包括编码序列和非编码序列两者。
在一个或多个实施方案中，多个串联重复序列各自包含至少一个表达序列。在一些实施方案中，至少一个表达序列包含至少一个编码序列。在此类实施方案中，至少一个表达序列的至少一个编码序列包含至少一个启动子和至少一个开放读码框。在一些实施方案中，多个串联重复序列各自包含两个或更多个表达序列。包括编码序列的两个或更多个表达序列可以编码相同蛋白质或不同蛋白质。在一些实施方案中，表达序列包括与至少一个开放读码框在功能上连接的至少一个启动子。例如，在一个方面，在表达序列中，一个启动子与一个开放读码框在功能上连接。在另一个方面，在表达序列中，一个启动子与两个不同的开放读码框在功能上连接。在一些实施方案中，表达序列可以包括与两个或更多个开放读码框在功能上连接的两个或更多个启动子。
表达序列可以包括与两个不同的开放读码框(例如第一开放读码框和第二开放读码框)可操作地连接的启动子，所述开放读码框各自编码彼此不同的蛋白质。在这个实例中，单个启动子经由不依赖于帽的翻译元件与两个开放读码框在功能上连接。每个开放读码框包括翻译起始和翻译终止序列。翻译终止或停止序列是表达序列所需的，否则可能合成无限多聚蛋白，其是不期望的。然而，转录终止密码子对于第一开放读码框可以是任选的，导致转录后多顺反子mRNA的生成。在这种情况下，可以这样选择在第一开放读码框和第二开放读码框之间的插入序列，使得在体内蛋白质表达后，即使产生单个多顺反子mRNA，它也可以翻译为两种不同的蛋白质。通过第一开放读码框的翻译的第一蛋白质合成，随后可以为核糖体滑动至第二开放读码框的第二翻译起始序列，以起始来自第二开放读码框的第二蛋白质合成。这可以通过在第一开放读码框和第二开放读码框之间引入“自切割序列”来实现。合适的自切割序列，例如病毒P2A基序，促进从一个单一mRNA产生两种或更多种蛋白质。
在一些实施方案中，表达序列含有非编码序列，其中所述非编码序列生成所需RNA。此类表达序列不包含任何编码序列。非编码序列包含启动子和转录终止序列。非编码序列一般缺乏开放读码框。含有非编码序列的表达序列也称为RNA表达序列。在一些实施方案中，表达序列基本上由非编码序列组成。在一些其它实施方案中，表达序列包括编码序列和非编码序列两者，其中RNA可以由表达序列的非编码序列生成。在此类实施方案中，随后也可以由相同表达序列的编码序列生成所需蛋白质。在一些实施方案中，可以从真核细胞提取所生成的RNA，用于不同的下游应用。在一个实施方案中，提取的RNA随后可以包装到慢病毒系统内，以递送到另一细胞中。非编码序列可包括但不限于关于反义RNA、短干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、微小RNA模拟物、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）或其组合的序列。非编码序列还可以包括CRISPR RNA（tracrRNA、crRNA、sgRNA或gRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）、端粒酶RNA、剪接体RNA、增强子RNA、逆转录转座子、X染色体特异性失活转录物（Xist）、由RNA聚合酶I和RNA聚合酶III编码的RNA或其组合。
如所指出的，编码序列和非编码序列两者均包含启动子。本领域已知的任何合适的启动子，包括例如T7 RNA聚合酶或CMV启动子序列，都可以用于本文所述的方法中。同样地，可以使用本领域已知的任何合适的核糖体结合位点，包括但不限于IRES、聚A束、物种不依赖性翻译前导序列（SITS）、Kozak共有序列和夏因-达尔加诺序列。
开放读码框包括翻译起始和翻译终止序列。在一些实施方案中，开放读码框包含密码子优化的序列用于增强翻译。开放读码框可以包含用于增强核糖体识别的衍生自内部核糖体进入位点（IRES）的氨基末端肽融合序列、用于所需蛋白质纯化的标签序列或其组合。CITE可以包括IRES、翻译增强元件（TEE）或其组合。
所需蛋白质可以通过标签序列进行纯化，其中所述标签序列可以是用于亲和纯化的融合标签、用于蛋白酶切割的标签或其组合。用于亲和纯化的融合标签可以用于所表达的蛋白质的快速纯化和检测。这些标签也称为亲和标签。亲和标签可以包括聚组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶标签（GST）、血凝素（HA）、myc（衍生自c-myc基因产物）、FLAG（由八个氨基酸Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys组成，包括肠激酶切割位点）或其组合。融合标签帮助所需蛋白质的快速纯化或检测，然而，标签可能不被视为重组蛋白质的永久固定物或结构域。因此，对于重组蛋白结构和功能的高度分析研究经常需要去除融合标签。可以通过使用另一种类型的标签，例如蛋白酶切割标签，从蛋白质中去除用于纯化的标签。蛋白酶切割标签可以用于切割特定蛋白质或肽序列内的独特肽键。蛋白酶切割标签可以包括例如PreScissionTM Protease标签（GE Healthcare Life Sciences）或凝血酶蛋白酶标签（GEHealthcare Life Sciences）。
如所指出的，编码序列的开放读码框可以包含密码子优化的序列，其中所述密码子优化的序列通过考虑不同因素，例如密码子偏倚、前后关系密码子优先和/或个别密码子优先而生成。开放读码框的密码子优化序列可以增强RCA产物的翻译速率或质量。密码子优化一般通过增加目的基因的翻译效率来改善来自编码序列的蛋白质表达。基因的功能性也可以通过优化定制设计基因内的密码子使用得到增加。在密码子优化实施方案中，物种中的低频率密码子可以替换为具有高频率的密码子，例如，低频率的密码子UUA可以替换为关于亮氨酸的高频率的密码子CUG。密码子优化可以增加mRNA的稳定性，并且因此改变蛋白质翻译或蛋白质折叠的速率。进一步地，密码子优化可以定制转录和翻译控制，修饰核糖体结合位点或稳定mRNA降解位点。
转录终止序列一般位于DNA模板中的基因的3′末端处。转录终止序列在新近合成的mRNA中提供了信号，以起始从转录复合物中释放mRNA的过程，其也可帮助所需蛋白质产物的有效翻译。绝缘子序列一般增强核糖体结合或翻译起始的效率。可以使用本领域中存在的合适的绝缘子序列的众多实例，包括例如编码聚组氨酸束的序列。在一些实施方案中，可以通过在核糖体结合位点周围插入间隔物序列，或通过在所表达的蛋白质的N末端内优化或插入密码子，来凭经验确定绝缘子序列。
在一些实施方案中，表达序列包括编码序列、非编码序列或其组合。编码序列包含启动子、开放读码框和任选地不依赖于帽的翻译元件（CITE）。编码序列的不依赖于帽的翻译元件（CITE）可以是内部核糖体进入位点（IRES）、翻译增强元件（TEE）或其组合。编码序列的开放读码框可以进行密码子优化用于增强翻译。开放读码框可以进一步包含用于纯化所需蛋白质的标签序列、衍生自IRES的用于增强核糖体识别的氨基末端肽融合序列、或其组合。表达序列进一步包含聚A序列、转录终止序列、绝缘子序列或其组合。
在一些实施方案中，表达序列是最简单的表达序列，其缺乏在宿主细胞中繁殖质粒所需的任何无关序列。用于表达所需蛋白质的最简单的表达序列至少包括启动子、核糖体结合位点和翻译终止序列。用于表达所需RNA的最简单的表达序列至少包括启动子、核糖体结合位点和翻译终止序列。在一些实施方案中，双链RCA产物DNA基本上由最简单的表达序列的串联重复组成。在此类实施方案中，表达序列可以另外含有序列，所述序列实质上不影响使用RCA产物DNA作为模板的体内蛋白质表达或RNA表达。例如，它可以进一步包括序列例如翻译增强子序列、绝缘子序列或转录终止序列。RCA产物DNA的最简单的表达序列排除任何无关序列，例如抗生素选择基因或在宿主细胞中克隆、选择、筛选和/或复制所需的任何其它附属序列。RCA产物可以是含有最简单的表达序列的串联重复的线性或分支的多联体。RCA产物DNA的最简单的表达序列可以衍生自仅包括最简单的表达序列的DNA小环。
双链多联体DNA可以进一步包含含肌苷的核苷酸、锁核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸或其组合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸，例如含肌苷的核苷酸、锁核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸是用于滚环扩增的引物序列的部分。
双链多联体DNA可以通过任何方法递送至真核细胞，所述方法包括但不限于电穿孔、声致穿孔、穿刺转染、转导、光学转染、磁转染、核转染、流体动力学递送、热休克介导的基因递送、纳米颗粒介导的基因枪递送、磷酸钙介导的递送、阳离子聚合物介导的递送或脂质体介导的递送。
在一些实施方案中，提供了包含外源的双链多联体DNA的真核细胞，所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列。多个串联重复序列各自包含硫代磷酸酯化的核苷酸，其中硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。用于转染到真核细胞内以生成所述细胞的外源的双链多联体DNA可以是未加工的或加工的RCA产物DNA。真核细胞可以是原生动物、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
可以使用各种方法来制备用于与本发明的方法一起使用的DNA小环模板。在一些实施方案中，线性DNA模板可以被环化，以生成DNA小环模板。在一个示例性的实施方案中，线性DNA模板的环化可以通过酶促反应来实现，例如，通过与连接酶例如DNA连接酶一起温育。在一些实施方案中，线性DNA模板的末端与核酸序列杂交，使得末端非常接近。然后与连接酶一起温育可能实现杂交的线性DNA模板的环化，以生成DNA小环。合适的DNA小环模板也可以通过以下生成：使用适当的PCR引物PCR扩增较大的DNA（例如，基因组DNA或来自DNA文库的DNA）的一部分，随后为PCR产物的环化。也可以通过合适的线性寡核苷酸的化学合成，随后为合成的寡核苷酸的环化，来生成DNA小环。在一些实施方案中，合成的线性寡核苷酸可以基本上由最简单的表达序列组成，并且经由DNA连接酶实现环化，以生成DNA小环。
实施例：
除非另有说明，否则实施例中描述的成分从普通化学品供应商商购可得。实施例部分中使用的一些缩写扩展如下：“mg”：毫克；“ng”：纳克；“pg”：皮克；“fg”：飞克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克/毫升；“mM”：毫摩尔的；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔的；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟和“h.”：小时。
材料：HEK293细胞得自ATCC（目录号CRL-1573），DMEM、L-谷氨酰胺和1% Pen/Strep得自Gibco（Thermo Fisher，Waltham，MA，US）。Tris缓冲液pH 8得自Ambion®（MA，US）。10%胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific（MA，USA）。Lipofectamine 2000（目录号11668-027）来自Invitrogen（Thermo Fisher，Waltham，MA，US）。Hind III、ExoI和Exo III酶购自New England Biolabs（Ipswich，MA，USA）。Typhoon可变模式成像仪得自GEHealthcare（Piscataway，NJ，USA）。微量离心管和96孔细胞培养板得自Fisher Scientific（Hampton，NH，US）。dNTP和随机六聚体引物得自GE Healthcare Life Sciences（Piscataway，NJ，USA），并且α-硫代-dNTP的Sp异构体（例如Sp-dTTPαS、Sp-dGTPαS、Sp-dATPαS和Sp-dCTPαS）得自Biolog – Life Science Institute（Bremen，德国）。Phi29 DNA聚合酶（1 mg/ml）来自Enzymatics（Beverly，MA，USA）。寡核苷酸（例如用于RCA的引物）购自Integrated DNA Technologies（IDT Inc，Iowa，USA）。Hanks氏平衡盐溶液（HBSS）、HEPES购自HyClone，GE Healthcare（Utah，US）。
质粒载体pAcGFP1-Hyg-C1和pCMV6-AC-mKate来自Clontech Laboratories（Mountain View，California，US）。质粒载体按原样使用，对载体序列没有任何修饰。关于每个载体的质粒图谱和序列可从各自的供应商获得。
通过将密码子优化的H1血凝素（HA）基因插入表达盒内生成质粒RW218，所述表达盒使用人巨细胞病毒立即早期启动子。包括另外的序列以改善表达，特别是HBV前S2 5'UTR、CMV外显子½（由通过天然内含子的缺失而剪接在一起的前两个CMV IE外显子组成）、大鼠胰岛素内含子A、HBV env增强子和兔β珠蛋白聚A（rGpA）。HA编码序列（Peter T. Loudon，Eric J. Yager，Debbie T. Lynch，Amithi Narendran，Cristy Stagnar，Anthony M.Franchini，James T. Fuller，Phil A. White，Julia Nyuandi，Clayton A. Wiley，Michael Murphey-Corb和Deborah H. Fuller，"GM-CSF Increases Mucosal andSystemic Immunogenicity of an H1N1 Influenza DNA Vaccine Administered intothe Epidermis of Non-Human Primates"，PLoS One. 2010；5（6）: e11021.）由得自流感序列数据库（Influenza Sequence Database）（Macken，C.，Lu，H.，Goodman，J.，& Boykin，L.，"The value of a database in surveillance and vaccine selection." InOptions for the Control of Influenza IV. A.D.M.E. Osterhaus，N. Cox & A.W.Hampson（编辑）Amsterdam: Elsevier Science，2001，103-106.）的A型流感/NewCaledonia/20/99（H1N1）血凝素蛋白的全长氨基酸序列，使用在人基因中通常发现的密码子使用模式（Kazusa Genome Database，Kazusa DNA Res. Inst.），在GeneArt（Regensburg，德国）处合成。
由1 M Tris，pH 8的贮液（Ambion®，MA，US）制备10 mM Tris，pH 8.0。含有DMEM、10%胎牛血清（FBS）和2 mM L-谷氨酰胺的完全培养基用于培养细胞。对于流式细胞术，使用包含Hanks氏平衡盐溶液（HBSS）与20 mM HEPES pH 8、16.8 mM D-葡萄糖和10% FBS的培养基。用于制备RCA产物DNA的dNTP的Sp-异构体和dNTP混合物为1：1600和125：1600比率。
实施例1：RCA产物DNA的生成
RCA产物DNA通过RCA反应从超螺旋质粒DNA模板（例如，pAcGFP1-Hyg-C1、pCMV-AC-mKate2）生成。质粒RW218用作对照。
质粒DNA的滚环扩增（RCA）
试剂的制备：在添加模板DNA和dNTP之前，预净化RCA试剂，包括水、反应缓冲液、引物和phi29酶，以使脱靶扩增降到最低。通过使引物-核苷酸混合物与核酸外切酶I、核酸外切酶III和单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）的组合一起温育，使含有核酸外切酶抗性引物和核苷酸（dNTP）的引物-核苷酸溶液（引物-核苷酸混合物）去污染。通过任选地在核酸外切酶的存在下与二价阳离子（例如，Mg2+）一起温育，使含有DNA聚合酶的酶混合物去污染。
用于生成RCA产物的引物：使用用于pAcGFP1-Hyg-C1的随机六聚体NNNN*N*N或用于pCMV-AC-mKate2的具有序列W+W+N*N*S的六聚物引物，执行用于生成RCA产物DNA的质粒DNA模板的扩增，其中“N”表示随机核苷酸（即，N可以是A、C、G或T/U中的任一个），“at N”表示2-氨基dA、2-硫代-dT、正常G或正常C中的任一个，字母名称前的加号（+）符号指示由该字母指定的核苷酸是锁核酸（LNA）核苷酸，并且字母前的星号（*）符号指示由该字母指定的核苷酸是硫代磷酸酯化修饰的核苷酸。
dNTP和修饰的dNTP：RCA产物DNA使用传统dNTP的完整集合，或通过使用传统dNTP和α-硫代-dNTP的Sp异构体（例如Sp-dTTPαS、Sp-dGTPαS、Sp-dATPαS和Sp-dCTPαS）的混合物来合成。α-硫代-dNTP的Sp异构体在本文中可互换地用作α-S-dNTP。例如，在一种扩增中使用1：1600比率的Sp-ATPαS与含有Sp-ATPαS和非硫醇化的传统dNTP的总dNTP混合物。对于所有RCA反应，dNTP浓度维持低于1mM（通常为400-800 μM），以避免扩增的RCA产物DNA的水凝胶形成，其可以潜在地使RCA产物DNA的下游可用性复杂化。
质粒DNA模板：含有GFP基因的插入物的pAcGFP1-Hyg-C1质粒用于表达GFP，含有RFP基因的插入物的质粒pCMV-AC-mKate用于表达RFP，并且含有HA基因的插入物的质粒RW218用作阴性对照。将十纳克（10 ng）的质粒DNA加入反应混合物中，用于在0.8 mM随机六聚体的存在下生成RCA产物DNA。
模板DNA的制备：首先通过在EDTA的存在下的碱变性使质粒DNA变性。为了变性，将含有约22 μg重悬浮的质粒DNA模板的体积与等体积的0.4 N氢氧化钠和0.4 M EDTA在管中混合。在室温下温育5分钟后，将3 M乙酸加入管中，以具有0.4 M的最终浓度，随后加入乙醇至总体积的75%的最终浓度。然后使管在干冰-乙醇浴中温育30分钟。通过在室温（30ºC）和大于20,000倍的重力下离心30分钟，来收集沉淀的质粒DNA。在离心后获得的质粒DNA团块用约500 µl冰冷的70%（v/v）乙醇洗涤，并且在室温（30ºC）和大于20,000倍的重力下再次离心15分钟。在再次离心后，将变性的质粒DNA重悬浮在水中，并且通过分光光度法测定浓度。变性的质粒DNA在同一天用于RCA反应，以产生RCA产物DNA。为了产生双链RCA（dsRCA）产物，使用非变性的质粒DNA模板和较小的随机六聚体。
滚环扩增（RCA）：使用去污染的酶混合物和引物-核苷酸混合物执行质粒DNA模板的扩增。例如，使含有200 ng的Phi29 DNA聚合酶的聚合酶溶液与0.1单位的核酸外切酶III一起在5 μL的50 mM HEPES缓冲液（pH=8.0）中温育，所述缓冲液含有15 mM KCl、20 mMMgCl2、0.01% Tween-20和1 mM TCEP。温育在30℃下执行约60分钟、或在4°C下执行12小时。将去污染的Phi29 DNA聚合酶溶液转移到冰浴中，然后用于靶RCA测定中，而无需核酸外切酶III的先前失活。对于滚环扩增，扩增反应混合物包含40 μM引物、400 μM dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各自为400 μM）；~1-30 ng的环状DNA模板（质粒DNA）、20 ng/μL phi29 DNA聚合酶、50 mM HEPES（pH = 8.0）、75 mM KCl、20 mM MgCl2、0.01%（v/v）Tween-20和1 mMTCEP。在温育结束时，通过将反应混合物在65℃下加热10分钟，使反应混合物中的Phi29DNA聚合酶失活。在一些实例中，硫醇化的dATP以相对于总dNTP溶液1：1600的比率（例如0.01mM α-S-dATP）或125：1600的比率补充。
使用pAcGFP1-Hyg-C1质粒、pCMV-AC-mKate2质粒和质粒RW218的RCA反应在两种不同的测试条件下执行：（i）使用随机六聚体引物和dNTP，（ii）使用随机六聚体引物以及与硫醇化的dNTP混合的dNTP。
实施例2：通过确定RCA产物DNA对限制性消化的稳定性，确认硫代磷酸酯化的核苷 酸在滚环扩增时包括在双链多联体DNA中
在该实施例中，确定了与未修饰的RCA产物DNA（非硫醇化）和超螺旋质粒DNA相比，修饰的RCA产物DNA（硫醇化）的稳定性。硫代磷酸酯化的核苷酸包括在双链多联体DNA（例如RCA产物DNA）中，一般增加DNA在暴露于限制性酶时的稳定性。与非硫醇化的DNA和质粒DNA相比，硫醇化的DNA（RCA产物）的稳定性增加，也确认了硫代磷酸酯化的核苷酸成功包括在RCA产物DNA中。
DNA通过从大肠杆菌中纯化作为超螺旋质粒DNA的RW218表达质粒进行制备，或通过滚环扩增进行制备，所述滚环扩增使用标准RCA反应、或其中α-硫代磷酸酯化的dATP以与扩增反应中的总dNTP相比1：1600的比率加入的反应。编码血凝素（HA）基因的质粒DNARW218用作阴性对照。通过使用编码HA的质粒DNA作为模板，形成非硫醇化的RCA产物DNA（RCA-RW218）和硫醇化的RCA产物DNA（硫代-RCA-RW218）。为了确定核酸酶抗性特性，在含有50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH8、10 mM MgCl2和80单位HindIII的40 µl反应中，使200ng不同的DNA样品，例如硫醇化的RCA产物DNA、非硫醇化的RCA产物DNA和超螺旋质粒DNA，经受用HindIII的限制性消化。使反应在37℃下温育1小时，然后在80℃下温育15分钟，以使HindIII失活。将10单位的ExoI和ExoIII加入如上所述的HindIII消化的DNA的12 μl等分试样中，然后使反应分别在37℃下温育15和30分钟。使用HindIII消化这三种类型的DNA（硫代-RCA-RW218、RCA-RW218和质粒RW218），以生成线性DNA片段，随后为用ExoI和ExoIII的限制性消化。将Exo I和Exo III加入含有不同DNA样品（例如硫代-RCA-RW218、RCA-RW218和RW218质粒）和HindIII的溶液中，并且使样品在37°C下温育0、30分钟或60分钟。
执行消化产物的样品的琼脂糖凝胶电泳，其中将每个电泳条带的强度与具有已知DNA浓度的标准（DNA标记物，在图1中指示为M）的那些进行比较。消化产物的样品在0分钟（图1，泳道1、4、7）、15分钟（图1，泳道2、5、8）和30分钟（图1，泳道3、6和9）时进行收集，并且经受琼脂糖凝胶电泳（图1）。图1示出了超螺旋质粒DNA（泳道1-3）、或RCA产物DNA（泳道4-6）和硫醇化的RCA产物DNA（泳道7-9）的限制性消化产物。图1显示了硫醇化的RCA DNA（在总共1600个核苷酸中含有大约1个硫醇化的碱基）对于通过经由双链DNA核酸外切酶和单链DNA核酸外切酶的限制性消化的降解是抗性的（参见图1，泳道8和9）。这个数据进一步确定了在RCA反应期间通过添加硫醇化的核苷酸使RCA产物DNA变得硫醇化的事实。
实施例3：硫醇化的RCA产物DNA的体内稳定性和GFP的表达
细胞培养：贴壁细胞系HEK293用于下述实验，以评估来自具有修饰碱基的RCA供体DNA的表达的持久性。在第0天时，将细胞铺平板在细胞培养基处理的96孔板中。关于HEK293细胞系的铺平板密度为30,000个细胞/孔。允许细胞在37℃下在5% CO2培养箱中静置过夜，以诱导细胞附着至96孔板的孔的内表面。在第1天时，将培养的细胞用于细胞转染实验。制备转染混合物，从细胞中吸出培养基，然后将转染混合物加入细胞中。
用Lipofectamine 2000的细胞转染用于表达GFP：在10 mM Tris，pH 8.0中制备RCA产物DNA和pAcGFP1-Hyg-C1表达质粒DNA（100 ng/µl）。将100 ng RCA产物DNA加入无血清培养基（不含青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺）中，至25 µL的最终体积，以形成DNA样品。将0.5 µL Lipofectamine 2000加入分开管中的24.5 µL无血清培养基中，以形成Lipofectamine溶液。将来自每个管的25 µL DNA样品加入25 µL Lipofectamine溶液中，轻轻混合以形成总体积为50 µL的转染混合物，使其在室温下温育20分钟。将30,000个细胞铺平板在每孔100 µL完全培养基中。将整个50 µL转染混合物加入细胞中，随后为在37°C下、在5% CO2环境下温育过夜。第二天，将培养基替换为新鲜的完全培养基。在使用超螺旋质粒DNA（在图2中指定为GFP质粒）、非硫醇化的RCA产物DNA（图2中的GFP RCA）以及具有浓度为1：1600（在图2中指定为GFP RCA-硫代A（1：1600））和125：1600（在图2中指定为GFP RCA-硫代A（125：1600））的硫醇化ATP的RCA产物DNA的转染后第2、5、10和20天时，通过使用荧光显微镜（IN Cell分析仪，GE Healthcare Life Sciences）获取图像。
使用FC500（Beckman Coulter）流式细胞仪分析细胞样品。根据样品中的总细胞计数，将细胞在200-400 µL缓冲液中进行稀释。优化细胞浓度，使得细胞浓度足够高以获得足够的信号，同时浓度也足够低以在流式细胞仪的准确范围内读取。流式细胞仪通过从分析中去除所有非细胞碎片突出显示了被视为细胞的所有事件。进一步地，解析出来自总细胞样品的所有GFP阳性细胞。由总细胞群体计算GFP细胞百分比。GFP阳性细胞的强度可以由总细胞群体以及GFP阳性细胞亚群进行测量。当将含有GFP插入物的质粒DNA和RCA产物DNA（硫醇化的和非硫醇化的两者）转染到细胞内时，定量GFP阳性细胞的百分比，以评估质粒DNA和RCA产物DNA的体内稳定性。图2表示GFP表达的标准化百分比（相对于在第1天时的信号）。GFP表达百分比是在总细胞群体中对于GFP表达呈阳性的细胞百分比。
在用超螺旋质粒DNA、RCA产物DNA或硫醇化的RCA产物DNA转染后，收获HEK293细胞用于流式细胞术分析。在所示天数后剩余的GFP信号的平均相对荧光单位（RFU）针对第1天进行标准化，并且结果在图2中描绘。图2指出了与超螺旋质粒DNA相比，非硫醇化的RCA产物DNA和硫醇化的RCA产物DNA均可以在体内保持完整和活性更长的持续时间。图2还示出了硫醇化的RCA产物DNA的稳定性高于非硫醇化的RCA产物DNA或超螺旋质粒DNA。与总dNTP相比，具有比率125：1600的硫代A的硫醇化的RCA产物DNA显示比具有比率1：1600的硫代A的硫醇化的RCA产物DNA甚至更好的稳定性。
实施例4：硫醇化的RCA产物DNA的体内稳定性和RFP的表达
用Lipofectamine 2000的细胞转染用于表达RFP：在10 mM Tris，pH 8.0中制备RCA产物DNA和mKate2-RFP表达质粒DNA（100 ng/µl）。将600 ng RCA产物DNA加入无血清培养基（不含青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺）中，至25 µL的最终体积，以形成DNA样品。将2 µLLipofectamine 2000加入分开管中的23 µL无血清培养基中，以形成Lipofectamine溶液。将来自每个管的25 µL DNA样品加入25 µL Lipofectamine溶液中，轻轻混合以形成总体积为50 µL的转染混合物，使其在室温下温育20分钟。在转染前一天的晚上，将100,000个细胞铺平板在24孔板中的每孔500 µL完全培养基中。第二天，将培养基替换为450 uL的无血清培养基（青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺）。将整个50 µL转染混合物加入细胞中，随后为在37°C下、在5% CO2环境下温育过夜。第二天，将培养基替换为新鲜的完全培养基。例如，使用具有硫醇化的CTP的RCA产物DNA（在图3中指定为RFP RCA-硫代C（1：1600）和RFP RCA-硫代C（125：1600））、具有硫醇化的TTP的RCA产物DNA（在图3中指定为RFP RCA-硫代T（1：1600）和RFP RCA-硫代T（125：1600）），在第2天和第9天时，通过使用荧光显微镜（IN Cell分析仪，GEHealthcare Life Sciences）获取图像。对于另一个实例，在转染后使用具有硫醇化的ATP的RCA产物DNA（在图4中指定为RFP RCA-硫代A（1：1600）和RFP RCA-硫代A（125：1600））、具有硫醇化的GTP的RCA产物DNA（在图4中指定为RFP RCA-硫代G（1：1600）和RFP RCA-硫代G（125：1600）），在第2、9、14和21天时，通过使用相同的荧光显微镜获取图像。通过流式细胞术分析样品。
当将含有RFP插入物的质粒DNA以及硫醇化的和非硫醇化的RCA产物DNA两者转染到细胞内时，定量RFP阳性细胞的百分比，以评估质粒DNA和RCA产物DNA的体内稳定性。图3和图4代表了用于RFP表达的细胞的标准化的平均相对荧光单位（RFU），其中RFP的测量的和标准化的平均RFU百分比是RFP的相对荧光单位，其通过总细胞群体内对于RFP表达呈阳性的细胞总数目获得。
如实施例3中所述，使用FC500（Beckman Coulter）流式细胞仪分析细胞样品。在用超螺旋质粒DNA、非硫醇化的RCA产物DNA或硫醇化的RCA产物DNA转染后，收获HEK293细胞用于流式细胞术分析。在指定天数后剩余的RFP信号的平均RFU百分比针对第1天进行标准化，并且结果在图3和4中描绘。
前述实施例示出了本发明的一些特点，并且是从多种多样的所有可能的实施方案中选择的实施方案。本发明可以以其它特定形式实施，而不脱离其精神或基本特征。尽管本文仅示出且描述了本发明的某些特点，但鉴于本公开的益处，本领域的技术人员将能够进行修饰/改变以优化参数。前述实施方案因此在所有方面被视为说明性的，而不是关于本文所述的发明的限制。必要时，已提供了范围，并且这些范围包括其间的所有子范围。
Claims (22)
1.一种用于体内RNA或蛋白质表达的方法，所述方法包括：
将双链多联体DNA引入真核细胞内，以生成所需RNA或蛋白质，
其中所述双链多联体DNA包含多个串联重复序列，并且其中所述多个串联重复序列各自包含表达序列，
其中所述双链多联体DNA包含一个或多个硫代磷酸酯化的核苷酸；和
其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
2.权利要求1的方法，其中所述双链多联体DNA是滚环扩增（RCA）产物DNA。
3.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在1：1600至125：1600的范围内。
4.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在50：1600至125：1600的范围内。
5.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率在75：1600至125：1600的范围内。
6.权利要求1或2的方法，其中所述双链多联体DNA中的硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为125：1600。
7.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述双链多联体DNA是未加工的或加工的RCA产物DNA。
8.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述表达序列包含编码序列、非编码序列或其组合。
9.权利要求8的方法，其中所述编码序列包含启动子、开放读码框和任选地不依赖于帽的翻译元件（CITE）。
10.权利要求9的方法，其中所述不依赖于帽的翻译元件（CITE）包含内部核糖体进入位点（IRES）、翻译增强元件（TEE）或其组合。
11.权利要求9或10的方法，其中所述开放读码框包含密码子优化的序列用于增强翻译。
12.权利要求9、10或11的方法，其中所述开放读码框包含用于所需蛋白质的纯化的标签序列、衍生自IRES的用于增强核糖体识别的氨基末端肽融合序列或其组合。
13.权利要求8-12中的一项或多项的方法，其中所述非编码序列包含启动子和转录终止序列。
14. 权利要求8-13中的一项或多项的方法，其中所述非编码序列包括关于反义RNA、短干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、微小RNA模拟物、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、CRISPR RNA或其组合的序列。
15.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述表达序列是最简单的表达序列，其缺乏在宿主细胞中繁殖质粒所需的任何无关序列。
16.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述表达序列进一步包含聚A序列、转录终止序列、绝缘子序列或其组合。
17.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述双链多联体DNA进一步包含含肌苷的核苷酸、锁核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸或其组合。
18.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中通过电穿孔、声致穿孔、穿刺转染、转导、光学转染、磁转染、核转染、流体动力学递送、热休克介导的基因递送、纳米颗粒介导的基因枪递送、磷酸钙介导的递送、阳离子聚合物介导的递送或脂质体介导的递送，将所述双链多联体DNA递送至真核细胞。
19.上述权利要求中的一项或多项的方法，其中所述双链多联体DNA是使用包含以下的引物产生的RCA产物DNA：含肌苷的核苷酸、锁核酸（LNA）核苷酸、肽核酸（PNA）核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸或其组合。
20.一种真核细胞，其包含：
包含多个串联重复序列的外源的双链多联体DNA；
其中所述多个串联重复序列各自包含硫代磷酸酯化的核苷酸，和
其中硫代磷酸酯化的核苷酸与总核苷酸的比率为至少1：1600。
21.权利要求20的真核细胞，其中所述外源的双链多联体DNA是未加工的或加工的RCA产物DNA。
22.权利要求20或21的真核细胞，其中所述真核细胞包含原生动物、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
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