BR112016026980B1

BR112016026980B1 - Método para sintetizar uma molécula de rna de uma dada sequência

Info

Publication number: BR112016026980B1
Application number: BR112016026980-2A
Authority: BR
Inventors: Aniela WOCHNER; Tilmann Roos; Thomas Ketterer
Original assignee: Curevac Real Estate Gmbh
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2022-05-03
Also published as: CA2945629C; BR112016026980A2; CA2945629A1; EP3155129A1; RU2738753C2; CN106661621A; SG11201608605QA; JP6748579B2; WO2015188933A1; RU2017100044A3; RU2017100044A; US10837039B2; KR102459599B1; AU2015273933A1; EP3155129B1; PT3155129T; US20210040526A1; US20170114378A1; PL3155129T3; EP3521456B1

Abstract

MÉTODOS E MEIOS PARA MELHORAR A PRODUÇÃO DE RNA. A presente invenção refere-se a um método para sintetizar uma molécula de RNA de uma sequência dada, compreendendo a etapa de determinar a fração (1) for cada um dos quatro nucleotídeos G, A, C e U na dita molécula de RNA, e a etapa de sintetização da dita molécula de RNA por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, em que a dita mistura de reação otimizada por sequência compreende os quatro trifosfatos de ribonucleosídeo GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de ribonucleosídeo na mistura de reação otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA,um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimerase.Além disso, a presente invenção refere-se a um biorreator (1) para sintetizar moléculas de RNA de uma sequência dada,o biorreator (1) tendo um módulo de reação (2) para realizar reações de transcrição in vitro de RNA em uma mistura de reação otimizada por sequência,um módulo de captura (3) para capturar temporariamente as moléculas de RNA transcritas, e um módulo de controle (4) para controlar o avanço dos componentes da (...).

Description

[001] A presente invenção refere-se inter alia a um método para sintetizar uma molécula de RNA de uma sequência dada, assim como a reatores para realizar o dito método.

[002] Moléculas de ácido ribonucleico (RNA) terapêuticas representam uma classe emergente de fármacos. Produtos terapêuticos com base em RNA incluem moléculas de mRNA que codificam antígenos para o uso como vacinas (Fotin-Mleczek et al. 2012. J. Gene Med. 14(6):428 - 439). Além disso, é previsto usar moléculas de RNA para terapias de substituição, por exemplo, fornecendo proteínas em falta tais como fatores de crescimento ou enzimas a pacientes (Karikó et al., 2012. Mol. Ther. 20(5):948 - 953; Kormann et al., 2012. Nat. Biotechnol. 29(2):154 - 157). Além disso, o uso terapêutico de moléculas de RNA imunoestimuladoras que não de codificação (WO2009/095226) e outros RNAs que não de codificação tais como microRNAs e RNAs que não de codificação longos é considerado (Esteller, 2011. Nat. Rev. Genet. 12(12):861 - 74).

[003] A expressão da proteína bem sucedida de RNA transfecta- do depende da eficiência de transfecção, estabilidade de RNA e eficiência de tradução. A estrutura de capuz 5’ e a cauda de poli(A) 3’ são características importantes para a tradução eficiente de mRNA e síntese de proteína em células eucarióticas. mRNAs recentemente sintetizados são modificados com uma estrutura de capuz quando o transcrito atinge um comprimento de 20 a 30 nucleotídeos. Primeiro, o nu- cleotídeo de terminal 5’ pppN é convertido a 5’ GpppN por uma enzima de encapuzamento bifuncional contendo tanto atividades de 5’-trifos- fatase quanto de guanililtransferase de RNA. Depois a parte de GpppN é metilada por uma enzima secundária com atividade de (guanina-7)- metiltransferase para formar a estrutura de capuz tipo 0 de m7GpppN monometilada. O capuz tipo 0 é depois convertido a uma estrutura tipo 1 de m7GpppN no núcleo por 2’-O-metilação (Tcherepanova et al., 2008. BMC Mol. Biol. 9:90).

[004] Moléculas de RNA curto podem ser sintetizadas por métodos químicos ao passo que RNAs longos são tipicamente produzidos por reações de transcrição in vitro contendo um padrão de DNA adequado com um promotor derivado de bacteriófago, uma RNA polime- rase, por exemplo RNA polimerase de bacteriófago SP6, T3 ou T7 e trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs). Principalmente, estruturas de capuz 5’ podem ser introduzidas por dois protocolos em RNA transcrito in vitro.

[005] No primeiro protocolo, o encapuzamento ocorre concorrentemente com a iniciação da transcrição (encapuzamento cotranscri- cional). Neste método, um análogo de capuz de dinucleotídeo tal como m7G(5’)ppp(5’)G (m7G) deve ser adicionado à mistura de reação. O padrão de DNA é usualmente designado em um tal modo que o primeiro nucleotídeo transcrito é uma guanosina. O análogo de capuz diretamente compete com GTP pela incorporação como nucleotídeo inicial (nucleotídeo de partida), e é incorporado tão facilmente quanto qualquer outro nucleotídeo (WO2006/004648). Para favorecer a incor-poração do análogo de capuz, um excesso molar do análogo de capuz sobre GTP é tipicamente usado (por exemplo, em uma razão de 4:1) e a concentração de GTP é reduzida comparado aos outros trifosfatos de ribonucleosídeo ATP, CTP e UTP. Sob estas condições GTP usualmente torna-se o fator limitante para a síntese de moléculas de RNA. Consequentemente, uma proporção alta dos outros NTPs (usualmente entre 40 a 70 %) não é usada para a síntese de RNA mas desperdiçada. Com este método, o rendimento de RNA é tipicamente limitado a cerca de 1 mg/ml (WO2006/004648).

[006] No segundo protocolo, o encapuzamento é feito em uma reação enzimática separada depois da transcrição in vitro (encapuza- mento pós-transcricional ou enzimático). A Enzima de Encapuzamento do Vírus Vaccinia (VCE) possui todas as três atividades enzimáticas necessárias para sintetizar uma estrutura de capuz m7G (RNA 5’- trifosfatase, guanililtransferase, e guanina-7-metiltransferase). Usando GTP como substrato a reação de VCE produz capuzes de RNA na orientação correta. Além disso, um capuz tipo 1 pode ser criado adicionando-se uma enzima de Vaccinia secundária, 2’ O metiltransferase, à reação de encapuzamento (Tcherepanova et al., 2008. BMC Mol. Biol. 9:90).

[007] Foi relatado que o RNA transcrito in vitro por polimerases de fago pode conter contaminantes múltiplos, incluindo moléculas de RNA de filamento duplo geradas pela extensão 3’ autocomplementar e moléculas de RNA curto produzidas por eventos de iniciação de transcrição abortivos.

[008] Moléculas de RNA sintetizadas por T7 RNA polimerase durante a transcrição run-off de padrões de DNA linearizados podem ser mais longas do que o RNA codificado (Triana-Alonso et al., 1995, JBC; 270(11): 6298 - 6307). Depois de deixar o padrão de DNA, a RNA po- limerase pode ligar um transcrito ao sítio do padrão e a extremidade 3’ do transcrito ao sítio de produto e estende-o, se a extremidade 3’ não for parte de uma estrutura secundária estável (extensão 3’ autocom- plementar). Este efeito parece ser especialmente sensível à concentração de UTP e uma redução exclusivamente da concentração de UTP leva à transcrição exata. Entretanto, reduzir a concentração de UTP também pode afetar o rendimento de RNA. Especialmente se o RNA contém uma cauda de poli(A), como é comum em RNAs tais como mRNAs, um excesso de UTP não incorporado na reação de transcrição pode resultar ema incorporação dependente de padrão de RNA de nucleotídeos de uridina opostos da sequência de poli-A, resultando em moléculas de RNA de filamento duplo que podem ativar a resposta imune inata e diminuir a síntese de proteína (Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res.; 39(21): e142).

[009] Além da molécula de RNA de tamanho natural desejada, reações de transcrição in vitro também podem produzir oligorribonu- cleotídeos menores que são o resultado de eventos de iniciação de transcrição abortivos (Milligan, et al., 1987. Nucleic Acid Res. 15(21): 8783 - 8798). Estes transcritos abortivos (prematuros) são moléculas de RNA curto prematuramente liberadas do complexo ternário que consiste em RNA polimerase, padrão de DNA, e cadeia de RNA nascente. Tipicamente, a maioria dos transcritos abortivos são dois a oito nucleotídeos em comprimento e são formados devido à ciclagem abortiva durante a iniciação. Interessantemente, um aumento na transcrição abortiva foi observado quando concentrações de NTP são mais baixas do que aproximadamente 2 mM (Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174 - 184). Transcritos abortivos são indesejáveis porque sua síntese consume NTPs valiosos e reduz o rendimento de produto de tamanho natural.

[0010] Para o desenvolvimento bem sucedido de produtos terapêuticos de RNA a produção de moléculas de RNA como ingredientes farmacêuticos ativos deve ser eficiente em termos de rendimento, qualidade, segurança e custos, especialmente quando RNA é produzido em uma grande escala e moléculas de RNA de tamanho natural ou encapuzadas de tamanho natural são necessárias. Vários métodos foram descritos para aumentar a produção de moléculas de RNA por transcrição in vitro. O uso de concentrações de NTP altas é esperado aumentar o rendimento de moléculas de RNA. Alternativamente, para a síntese eficiente de moléculas de RNA encapuzadas o ajuste da razão do análogo de capuz para GTP foi sugerido.

[0011] Concentrações de nucleotídeo padrão para reações de transcrição in vitro tipicamente variam de 1,5 a 16 mM (Milligan, et al., 1987. Nucleic Acid Res. 15(21): 8783 - 8798; Sampson & Uhlenbeck, 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(4):1033 - 7; Cunningham & Ofengand 1990. Biotechniques 9(6):713 - 4; Weitzmann et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18(12):3515 - 20; Gurevich et al., 1991. Anal. Bio- chem. 195(2):207 - 13). Concentrações de NTP até 40 mM foram relatadas como sendo possíveis se concentrações de Mg++ são ajustadas consequentemente, resultando em rendimento de RNA aumentado (US5256555).

[0012] Vários kits de transcrição de alto rendimento estão comercialmente disponíveis, por exemplo, kit de síntese de RNA de alto rendimento T7 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), kit de transcrição de alto rendimento T7 TranscriptAidTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), kit de transcrição de alto rendimento MEGAscript® (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ou kit gerador de mensagem alto T7 AmpliCap-MaxTM (Epicentre, Madison, WI, USA). Para todos os kits, concentrações operacionais de NTP total altas de 30 a 40 mM são sugeridas para reações de transcrição padrão. Para a síntese de mRNAs encapuzados, concentrações de GTP variam entre 1,5 mM e 2 mM de GTP.

[0013] Embora concentrações de nucleotídeo geralmente altas sejam recomendadas de modo a maximizar o rendimento de RNA de reações de transcrição in vitro, o uso de concentrações de NTP altas também pode ter desvantagens. Por exemplo, com concentrações de NTP iniciais altas e concentrações de Mg++ suficientemente altas (por exemplo, Mg(OAc)2) rendimentos de RNA altos podem ser obtidos. Entretanto, nestas concentrações altas uma fração mais alta de NTPs pode ser incorporada em transcritos abortivos curtos (Kern et al., 1997. Biotechnol. Prog. 13, 747 - 756).

[0014] Para produzir mRNA encapuzado cotranscricionalmente na presença de análogo de capuz, razões econômicas requerem concentrações operacionais de NTP mais baixas, visto que análogo de capuz tem que ser usado em excesso sobre GTP e é um fator de custo principal. Razões de análogo de capuz para GTP mais altas levarão a uma proporção mais alta de RNA encapuzado mas por razões de rendimento e econômicas, uma razão de 4:1 é usualmente sugerida (New England Biolabs, Capped RNA synthesis (E2040), https://www.neb.com/ proto- cols/1/01/01/ capped-rna-synthesis-e2040).

[0015] Por exemplo, para a transcrição de RNAs encapuzados, as instruções do fabricante para o kit de síntese de RNA de alto rendimento T7 sugerem usar 2 mM de GTP com um excesso de 4:1 de análogo de capuz sobre GTP. Rendimentos por 20 μl de reação são indicados como 40 a 50 μg de RNA, correspondendo a 2 a 2,5 mg/ml, com aproximadamente 80 % de transcritos de RNA encapuzado (New England Biolabs, Capped RNA synthesis (E2040), https://www.neb.com/ protocols/1/01/ 01/capped-rna-synthesis-e2040).

[0016] Para compensar quanto ao rendimento limitado que resulta das concentrações de GTP baixas, rendimentos de RNA encapuzado foram aumentados suplementando-se a reação com o nucleotídeo de competição (GTP, ou ATP no caso do capuz A ser usado) em um tal modo que uma razão entre 1:1 e 1:50 de GTP para análogo de capuz é mantida. Com este método a quantidade de RNA encapuzado produzido por reação pode ser duplicada (WO2006/004648).

[0017] Reações de transcrição in vitro são tipicamente realizadas como reações em batelada em que todos os componentes são combinados e depois incubados para permitir a síntese de moléculas de RNA até que a reação termine. Além disso, reações descontínuas alimentadas foram desenvolvidas para aumentar a eficiência da reação de transcrição in vitro (Kern et al., 1997. Biotechnol. Prog. 13, 747 - 756; Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174 - 184). Em um sistema descontínuo alimentado todos os componentes são combinados, mas depois quantidades adicionais de alguns dos reagentes são adicionadas com o passar do tempo (por exemplo, NTPs e magnésio) para manter as condições de reação constantes. A estratégia descontínua alimentada produziu uma melhoria de 100 % em RNA por unidade de RNA polimerase ou padrão de DNA para um padrão de DNA de 38 pares de base muito curto. Este método foi apenas usado para a síntese de moléculas de RNA não encapuzadas com um trifosfato no término 5’.

[0018] O uso de um biorreator (reator de transcrição) para a síntese de moléculas de RNA por transcrição in vitro foi relatado (WO1995/08626). O biorreator é configurado tal que reagentes são liberados por intermédio de uma linha de alimentação ao núcleo do reator e produtos de RNA são removidos passando-se através de uma membrana de ultrafiltração (tendo um corte de peso molecular nominal, por exemplo, 100.000 daltons) à corrente de saída.

[0019] Em resumo, o rendimento de moléculas de RNA encapuza- das a partir de reações de transcrição in vitro principalmente depende de dois fatores, a concentração de NTP total disponível para incorporação na molécula de RNA e a razão de análogo de capuz:GTP. Para o encapuzamento cotranscricional, concentrações de GTP são usualmente reduzidas comparado aos outros NTPs. Este fato limita o possível rendimento de transcrição, especialmente para padrões com teor de GC alto.

[0020] Devido ao acima, existe uma necessidade contínua por meios melhorados e econômicos e métodos de produção de RNA, especialmente para a produção de moléculas de RNA de tamanho natural encapuzadas que podem ser traduzidas em proteínas.

Sumário da Invenção

[0021] A presente invenção refere-se inter alia a um método para sintetizar uma molécula de RNA de uma dada sequência, compreendendo as etapas seguintes: a) determinar a fração (1) para cada um dos quatro nucleo- tídeos G, A, C e U na dita molécula de RNA, e b) sintetizar a dita molécula de RNA por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, em que a dita mistura de reação otimizada por sequência compreende os quatro ri- bonucleotídeos GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro ribonucleotídeos na mistura de reação otimizada por sequência corresponde à fração (1) do respectivo nucleotídeo na dita molécula de RNA, um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA poli- merase.

[0022] A presente invenção também refere-se a um biorreator para sintetizar moléculas de RNA de uma sequência dada, o biorreator tendo um módulo de reação para realizar reações de transcrição de RNA in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, um módulo de captura para capturar temporariamente as moléculas de RNA transcritas, e um módulo de controle para controlar o avanço de componentes da mistura de reação otimizada por sequência no módulo de reação, em que o módulo de reação compreende uma membrana de filtração para separar os nucleotídeos da mistura de reação otimizada por sequência, e o controle do avanço de componentes da mistura de reação otimizada por sequência pelo módulo de controle é fundamentado em uma concentração medida de nucleotídeos separados.

Definições

[0023] Para clareza e legibilidade as definições seguintes são fornecidas. Qualquer característica técnica mencionada para estas definições pode ser lida em cada e toda modalidade da invenção. Definições e explanações adicionais podem ser especificamente fornecidas no contexto destas modalidades como debatido e explicado mais abaixo.

[0024] Estrutura de capuz 5’: Um capuz 5’ é tipicamente um nucle- otídeo modificado, particularmente um nucleotídeo de guanina, adicionado à extremidade 5’ de uma molécula de RNA. Preferivelmente, o capuz 5’ é adicionado usando uma ligação de 5’-5’-trifosfato. Um capuz 5’ pode ser metilado, por exemplo, m7GpppN, em que N é o nu- cleotídeo de terminal 5’ do ácido nucleico que carrega o capuz 5’, tipicamente a extremidade 5’ de um RNA. O capuz 5’ que ocorre naturalmente é m7GpppN.

[0025] Outros exemplos de estruturas de capuz 5’ incluem gliceri- la, resíduo abásico de desóxi invertido (porção), nucleotídeo de 4’,5’ metileno, nucleotídeo de 1-(beta-D-eritrofuranosila), nucleotídeo de 4’- tio, nucleotídeo carbocíclico, nucleotídeo de 1,5-anidroexitol, L-nucleo- tídeos, alfa-nucleotídeo, nucleotídeo de base modificada, nucleotídeo de treo-pentofuranosila, nucleotídeo de 3’,4’-seco acíclico, nucleotídeo de 3,4-diidroxibutila acíclico, nucleotídeo de 3,5 diidroxipentila acíclico, porção de nucleotídeo 3’-3’-invertido, porção abásica 3’-3’-invertida, porção de nucleotídeo 3’-2’-invertido, porção abásica 3’-2’-invertida, fosfato de 1,4-butanodiol, 3’-fosforamidato, hexilfosfato, fosfato de aminoexila, 3’-fosfato, 3’fosforotioato, fosforoditioato, ou porção de me- tilfosfonato de ligação em ponte ou que não de ligação em ponte.

[0026] Estruturas de capuz 5’ particularmente preferidas são CAP1 (metilação da ribose do nucleotídeo adjacente de m7G), CAP2 (metila- ção da ribose do 2o nucleotídeo a jusante do m7G), CAP3 (metilação da ribose do 3o nucleotídeo a jusante do m7G), CAP4 (metilação da ribose do 4o nucleotídeo a jusante do m7G).

[0027] Uma estrutura de capuz 5’ pode ser formada por um análogo de capuz.

[0028] Análogo de capuz: Um análogo de capuz refere-se a um dinucleotídeo não extensível que tem funcionalidade de capuz que significa que ele facilita a tradução ou localização, e/ou impede a degradação da molécula de RNA quando incorporada na extremidade 5’ da molécula de RNA. Não extensível significa que o análogo de capuz será incorporado apenas no término 5’ porque ele não tem um 5’ trifos- fato e, portanto, não pode ser estendido na direção 3’ por uma RNA polimerase dependente de padrão.

[0029] Análogos de capuz incluem, mas não são limitados a, uma estrutura química selecionada do grupo que consiste em m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de capuz não metilados (por exemplo, GpppG); análogo de capuz dimetilado (por exemplo, m2,7GpppG), análogo de capuz trimetilado (por exemplo, m2,2,7GpppG), análogos de capuz simétricos dimetilados (por exemplo, m7Gpppm7G), ou análogos de capuz anti reversos (por exemplo, ARCA; m7,2’OmeGpppG, m7,2’dGpppG, m7,3’OmeGpppG, m7,3’dGpppG e seus derivados de tetrafosfato) (Stepinski et al., 2001. RNA 7(10):1486 - 95). Exemplos de análogos de capuz são mostrados na tabela 1. Tabela 1: Análogos de capuz (D1 e D2 denotam diastereoisômeros em contraparte)

[0030] Outros análogos de capuz foram descritos previamente (US7074596, WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, e WO2013/059475). A síntese de análogos de capuz de dinucleotídeo substituído por N7-(4-clorofenoxietila) foi descrita recentemente (Kore et al., 2013. Bioorg. Med. Chem. 21(15):4570 - 4).

[0031] Análogos de capuz particularmente preferidos são G[5’]ppp [5’]G, m7G[5’]ppp[5’]G, m32,2,7G[5’]ppp[5’]G, m27,3’-OG[5’]ppp[5’]G (3’- ARCA), m27,2’-OGpppG (2’-ARCA), m27,2’-OGppspG D1 (β-S-ARCA D1) e m27,2’-OGppspG D2 (β-S-ARCA D2).

[0032] Ácido nucleico: O termo ácido nucleico significa qualquer molécula de DNA ou RNA e é usado sinônimo com polinucleotídeo. Além disso, modificações ou derivados do ácido nucleico como definido aqui são explicitamente incluídos no termo geral "ácido nucleico". Por exemplo, ácido nucleico de peptídeo (PNA) também está incluído no termo "ácido nucleico".

[0033] RNA monocistrônico: Um RNA monocistrônico pode ser tipicamente um RNA, preferivelmente um mRNA, que compreende apenas uma estrutura de leitura aberta. Uma estrutura de leitura aberta neste contexto é uma sequência de vários tripletos de nucleotídeo (có- dons) que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína.

[0034] RNA bi-/multicistrônico: RNA, preferivelmente mRNA, que tipicamente pode ter duas estruturas de leitura aberta (ORF) (bicistrô- nico) ou mais (multicistrônico). Uma estrutura de leitura aberta neste contexto é uma sequência de vários tripletos de nucleotídeo (códons) que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína.

[0035] RNA imunoestimulador: Um RNA imunoestimulador (isR- NA) no contexto da invenção pode ser tipicamente um RNA que é capaz de induzir uma resposta imune inata. Um isRNA usualmente não tem uma estrutura de leitura aberta e assim não fornece um antígeno de peptídeo mas evoca uma resposta imune inata, por exemplo, ligando-se a receptores de padrões moleculares associados a patógeno (PAMP) (por exemplo, receptor semelhante a Toll (TLR) ou outros sensores de RNA intracelular (por exemplo, RIG-I, MDA-5 ou PKR).

[0036] Análogos de nucleotídeo: Análogos de nucleotídeo são nu- cleotídeos estruturalmente similares (análogos) a nucleotídeos que ocorrem naturalmente que incluem modificações na estrutura de fosfato, modificações de açúcar, ou modificações da nucleobase.

[0037] Síntese de ácido nucleico: Moléculas de ácido nucleico usadas de acordo com a invenção como definido aqui podem ser preparadas usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo métodos sintéticos tais como por exemplo, síntese de fase sólida, propagação in vivo (por exemplo, propagação in vivo de vírus), assim como métodos in vitro, tais como reações de transcrição in vitro.

[0038] De acordo com a invenção a molécula de RNA é preparada por transcrição in vitro de uma molécula de DNA correspondente. Este padrão de DNA preferivelmente compreende um promotor adequado, por exemplo, um promotor T7 ou SP6, para transcrição in vitro, que é seguido pela sequência de nucleotídeo desejada que codifica a molécula de RNA a ser preparada e um sinal de terminação para a transcrição in vitro. A molécula de DNA, que forma o padrão de o pelo menos um RNA de interesse, pode ser preparada por proliferação fermentati- va e isolamento subsequente como parte de um plasmídeo que pode ser replicado em bactérias. Plasmídeos que podem ser mencionados como adequados para a presente invenção são por exemplo, os plas- mídeos pUC18, pUC19, pBR322, pT7Ts (Número de acesso no Gen Bank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), série pGEM®, por exemplo, pGEM®-1 (Número de acesso no GenBank X65300; da Promega) e pSP64 (Número de acesso no GenBank X65327); conforme também Mezei e Storts, Purification of PCR Products, em: Griffin e Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

[0039] RNA: RNA é a abreviação usual para ácido ribonucleico. Ele é uma molécula de ácido nucleico, isto é um polímero que consiste em nucleotídeos. Estes nucleotídeos são usualmente monômeros de monofosfato de adenosina, monofosfato de uridina, monofosfato de guanosina e monofosfato de citidina que são conectados um ao outro ao longo de uma assim chamada estrutura. A estrutura é formada por ligações de fosfodiéster entre o açúcar, isto é ribose, de um primeiro e uma porção de fosfato de um segundo, monômero adjacente. A sucessão específica dos monômeros é chamada a sequência de RNA.

[0040] RNA mensageiro (mRNA): Em células eucarióticas, a transcrição é tipicamente realizada dentro do núcleo ou das mitocôndrias. In vivo, a transcrição do DNA usualmente resulta no assim chamado RNA prematuro que tem que ser processado no assim chamado RNA mensageiro, usualmente abreviado como mRNA. O processamento do RNA prematuro, por exemplo, em organismos eucarióticos, compreende uma variedade de modificações pós-transcricionais diferentes tais como montagem de genes, encapuzamento 5’, poliadenilação, exportação do núcleo ou das mitocôndrias e semelhantes. A soma destes processos também é chamada maturação de mRNA. O RNA mensageiro maduro usualmente fornece a sequência de nucleotídeo que pode ser traduzida em uma sequência de aminoácido de um peptídeo ou proteína particular. Tipicamente, um mRNA maduro compreende um capuz 5’, um 5’UTR, uma estrutura de leitura aberta, um 3’UTR e uma sequência de poli(A). No contexto da presente invenção, um mRNA também pode ser uma molécula artificial, isto é, uma molécula que não ocorre na natureza. Isto significa que o mRNA no contexto da presente invenção pode, por exemplo, compreender uma combinação de um 5’UTR, estrutura de leitura aberta, 3’UTR e sequência de poli(A), que não ocorre nesta combinação na natureza.

[0041] RNA autorreplicante (Replicons): RNA autorreplicante são vetores de liberação com base em alfavírus que foram desenvolvidos a partir de vírus da Floresta de Semliki (SFV), vírus Sindbis (SIN), e vírus da encefalite equina venezuelana (VEE). Alfavírus são vírus de RNA de filamento único em que genes heterólogos de interesse podem substituir os genes estruturais de alfavírus. Fornecendo-se os genes estruturais em trans, o RNA de replicon é empacotado em partículas de replicon (RP) que podem ser usadas para propósitos de terapia genética ou vacinação genética (ver por exemplo Vander Veen et al., 2012. Alphavirus replicon vaccines. Animal Health Research Reviews, p. 1 - 9). Depois da entrada na célula hospedeira, o RNA viral genômi- co inicialmente serve como um mRNA para a tradução das proteínas não estruturais virais (nsPs) necessárias para a iniciação da amplificação do RNA viral. A replicação do RNA ocorre por intermédio de síntese de um intermediário de filamento negativo de tamanho natural que é usado como o padrão para a síntese de RNAs de comprimento de genoma adicionais e para a transcrição de um RNA subgenômico de filamento positivo a partir de um promotor interno. Tal RNA depois pode ser considerado como RNA autorreplicante, visto que as proteínas não estruturais responsáveis pela replicação (e transcrição dos genes heterólogos) ainda estão presentes em tal replicon. Tais vetores de alfavírus são referidos como "replicons".

[0042] Sequência de uma molécula de ácido nucleico: A sequência de uma molécula de ácido nucleico é tipicamente entendida como sendo a ordem particular e individual, isto é a sucessão de seus nu- cleotídeos.

[0043] Estrutura de leitura aberta: Uma estrutura de leitura aberta (ORF) no contexto da invenção pode ser tipicamente uma sequência de vários tripletos de nucleotídeo que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína. Uma estrutura de leitura aberta preferivelmente contém um códon de início, isto é uma combinação de três subsequente nucleotídeos que codificam usualmente o aminoácido metioni- na (ATG ou AUG), em sua extremidade 5’ e uma região subsequente que usualmente exibe um comprimento que é um múltiplo de 3 nucleo- tídeos. Uma ORF é preferivelmente terminada por um códon de parada (por exemplo, TAA, TAG, TGA). Tipicamente, este é o único códon de parada da estrutura de leitura aberta. Assim, uma estrutura de leitura aberta no contexto da presente invenção é preferivelmente uma sequência de nucleotídeo, que consiste em vários nucleotídeos que podem ser divididos por três, que inicia com um códon de início (por exemplo, ATG ou AUG) e que preferivelmente termina com um códon de parada (por exemplo, TAA, TGA, ou TAG ou UAA, UAG, UGA, respectivamente). A estrutura de leitura aberta pode ser isolada ou ela pode ser incorporada em uma sequência de ácido nucleico mais longa, por exemplo em um vetor ou um mRNA. Uma estrutura de leitura aberta também pode ser denominada "região de codificação de proteína" ou "região de codificação".

[0044] Mistura de reação otimizada por sequência: Uma mistura de reação para o uso em uma reação de transcrição in vitro de uma molécula de RNA de uma sequência dada compreendendo os quatro trifosfatos de nucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de nucleosídeo (NTPs) na mistura de reação otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA, um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimerase. Se um ribonucleotídeo não estiver presente na dita molécula de RNA, o trifosfato de nucleosídeo correspondente também não está presente na mistura de reação otimizada por sequência.

[0045] Mistura de trifosfato de nucleosídeo (NTP) otimizada por sequência: Uma mistura de trifosfatos de nucleosídeo (NTPs) para o uso em uma reação de transcrição in vitro de uma molécula de RNA de uma sequência dada compreendendo os quatro trifosfatos de nu- cleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de nucleosídeo (NTPs) na mistura de trifosfa- to de nucleosídeo (NTP) otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA. Se um ri- bonucleotídeo não estiver presente na molécula de RNA, o trifosfato de nucleosídeo correspondente também não está presente na mistura de trifosfato de nucleosídeo (NTP) otimizada por sequência.

[0046] Trifosfato de nucleosídeo modificado: O termo "trifosfato de nucleosídeo modificado" como usado aqui refere-se a modificações químicas compreendendo modificações de estrutura assim como modificações de açúcar ou modificações de base. Estes trifosfatos de nu- cleosídeo modificados também são denominados aqui como análogos (nucleotídeo).

[0047] Neste contexto, os trifosfatos de nucleosídeo modificados como definido aqui são análogos de nucleotídeo/modificações, por exemplo, modificações de estrutura, modificações de açúcar ou modificações de base. Uma modificação de estrutura em relação à presente invenção é uma modificação, em que fosfatos da estrutura dos nu- cleotídeos são quimicamente modificados. Uma modificação de açúcar em relação à presente invenção é uma modificação química do açúcar dos nucleotídeos. Além disso, uma modificação de base em relação à presente invenção é uma modificação química da porção de base dos nucleotídeos. Neste contexto, análogos de nucleotídeo ou modifica- ções são preferivelmente selecionados a partir de análogos de nucleo- tídeo que são aplicáveis para transcrição e/ou tradução.

Modificações de açúcar

[0048] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados, que podem ser usados no contexto da presente invenção, podem ser modificados na porção de açúcar. Por exemplo, o grupo 2’ hidroxila (OH) pode ser modificado ou substituído com vários substituintes de "óxi" ou "desóxi" diferentes. Exemplos de modificações de grupo "óxi" -2’ hidroxila incluem, mas não são limitados a, alcóxi ou arilóxi (-OR, por exemplo, R = H, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar); polietile- noglicóis (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) em que o 2’ hidroxila é conectado, por exemplo, por uma ponte de metileno, ao 4’ carbono do mesmo açúcar tipo ribose; e gru-pos amino (-O-amino, em que o grupo amino, por exemplo, NRR, pode ser alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, he- teroarilamino, ou dieteroaril amino, etileno diamina, poliamino) ou ami- noalcóxi.

[0049] Modificações de "desóxi" incluem hidrogênio, amino (por exemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, dieteroaril amino, ou aminoácido); ou o grupo amino pode ser ligado ao açúcar através de um ligador, em que o liga- dor compreende um ou mais dos átomos C, N, e O.

[0050] O grupo açúcar também pode conter um ou mais carbonos que possuem a configuração estereoquímica oposta daquela do carbono correspondente em ribose. Assim, um nucleotídeo modificado pode incluir nucleotídeos contendo, por exemplo, arabinose como o açúcar.

Modificações de estrutura

[0051] A estrutura de fosfato pode ser ainda modificada nos nu- cleosídeos e nucleotídeos modificados. Os grupos fosfato da estrutura podem ser modificados substituindo-se um ou mais dos átomos de oxigênio com um substituinte diferente. Além disso, os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir a substituição total de uma porção de fosfato não modificado com um fosfato modificado como descrito aqui. Exemplos de grupos fosfato modificado incluem, mas não são limitados a, fosforotioato, fosforosselenatos, borano fosfatos, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforoamidatos, alquil ou aril fosfonatos e fosfotriésteres. Fosforoditioatos têm ambos os oxigênios que não de ligação substituídos por enxofre. O ligador de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação com nitrogênio (fosforoamidatos ligados em ponte), enxofre (fosforotioatos ligados em ponte) e carbono (metileno-fosfonatos liga-dos em ponte).

Modificações de base

[0052] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados, que podem ser usados na presente invenção, podem ser modificados ainda na porção de nucleobase. Exemplos de nucleobases encontradas em RNA incluem, mas não são limitados a, adenina, guanina, citosina e uracila. Por exemplo, os nucleosídeos e nucleotídeos descritos aqui podem ser quimicamente modificados na face de sulco principal. Em algumas modalidades , as modificações químicas de sulco principal podem incluir um grupo amino, um grupo tiol, um grupo alquila, ou um grupo halo.

[0053] Em modalidades particularmente preferidas da presente invenção, os análogos de nucleotídeo/modificações são selecionados a partir de modificações de base, que são preferivelmente selecionadas a partir de 2-amino-6-cloropurina-ribosídeo-5’-trifosfato, 2-Ami- nopurina-ribosídeo-5’-trifosfato; 2-aminoadenosina-5’-trifosfato, 2’-Ami- no-2’-desoxicitidina-trifosfato, 2-tiocitidina-5’-trifosfato, 2-tiouridina-5’- trifosfato, 2’-Fluorotimidina-5’-trifosfato, 2’-O-Metil inosina-5’-trifosfato 4-tiouridina-5’-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5’-trifosfato, 5-aminoaliluri- dina-5’-trifosfato, 5-bromocitidina-5’-trifosfato, 5-bromouridina-5’-trifos- fato, 5-Bromo-2’-desoxicitidina-5’-trifosfato, 5-Bromo-2’-desoxiuridina- 5’-trifosfato, 5-iodocitidina-5’-trifosfato, 5-Iodo-2’-desoxicitidina-5’-trifos- fato, 5-iodouridina-5’-trifosfato, 5-Iodo-2’-desoxiuridina-5’-trifosfato, 5-me- tilcitidina-5’-trifosfato, 5-metiluridina-5’-trifosfato, 5-Propinil-2’-desoxi- citidina-5’-trifosfato, 5-Propinil-2’-desoxiuridina-5’-trifosfato, 6-azaciti- dina-5’-trifosfato, 6-azauridina-5’-trifosfato, 6-cloropurina-ribosídeo-5’- trifosfato, 7-desazaadenosina-5’-trifosfato, 7-desazaguanosina-5’-trifos- fato, 8-azaadenosina-5’-trifosfato, 8-azidoadenosina-5’-trifosfato, benzi- midazol-ribosídeo-5’-trifosfato, N1-metiladenosina-5’-trifosfato, N1-metil- guanosina-5’-trifosfato, N6-metiladenosina-5’-trifosfato, O6-metilguano- sina-5’-trifosfato, pseudouridina-5’-trifosfato, ou puromicina-5’-trifos- fato, xantosina-5’-trifosfato. Preferência particular é dada a nucleotí- deos para modificações de base selecionadas do grupo de nucleotí- deos de base modificados que consistem em 5-metilcitidina-5’-trifos- fato, 7-desazaguanosina-5’-trifosfato, 5-bromocitidina-5’-trifosfato, e pseudouridina-5’-trifosfato.

[0054] Em algumas modalidades, nucleosídeos modificados incluem piridin-4-ona ribonucleosídeo, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2- tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3- metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5-pro- pinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurino- metil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio- uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudou- ridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2- tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, diidrouridina, diidropseudouridina, 2-tio-diidrouridina, 2-tio-diidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metóxi- 4-tio-uridina, 4-metóxi-pseudouridina, e 4-metóxi-2-tio-pseudouridina.

[0055] Em algumas modalidades, nucleosídeos modificados inclu- em 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseu- doisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2- tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisoci- tidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-desaza-pseu- doisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2- tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metóxi-citidina, 2-metóxi-5-metil- citidina, 4-metóxi-pseudoisocitidina, e 4-metóxi-1-metil-pseudoisoci- tidina.

[0056] Em outras modalidades, nucleosídeos modificados incluem 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-aza -adenina, 7-desaza-2-aminopurina, 7-desaza-8-aza-2-aminopurina, 7- desaza-2,6-diaminopurina, 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-meti- ladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis- hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil) ade- nosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7- metiladenina, 2-metiltio-adenina, e 2-metóxi-adenina.

[0057] Em outras modalidades, nucleosídeos modificados incluem inosina, 1-metil-inosina, wyosina, wybutosina, 7-desaza-guanosina, 7- desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza-guanosina, 6-tio-7-desaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-gua- nosina, 7-metilinosina, 6-metóxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2-metil- guanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo- guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, e N2,N2- dimetil-6-tio-guanosina.

[0058] Em algumas modalidades, o nucleotídeo pode ser modificado na face de sulco principal e pode incluir substituir hidrogênio em C-5 de uracila com um grupo metila ou um grupo halo.

[0059] Em modalidades específicas, um nucleosídeo modificado é 5’-O-(l-Tiofosfato)-Adenosina, 5’-O-(1-Tiofosfato)-Citidina, 5’-O-(1-Tio- fosfato)-Guanosina, 5’-O-(1-Tiofosfato)-Uridina ou 5’-O-(l-Tiofosfato)- Pseudouridina.

[0060] Em outras modalidades específicas os nucleotídeos modificados incluem modificações de nucleosídeo selecionadas a partir de 6-aza-citidina, 2-tio-citidina, α-tio-citidina, Pseudo-iso-citidina, 5-ami- noallil-uridina, 5-iodo-uridina, N1-metil-pseudouridina, 5,6-diidrouridina, α-tio-uridina, 4-tio-uridina, 6-aza-uridina, 5-hidróxi-uridina, desóxi-timi- dina, 5-metil-uridina, Pirrolo-citidina, inosina, α-tio-guanosina, 6-metil- guanosina, 5-metil-citidina, 8-oxo-guanosina, 7-desaza-guanosina, N1- metil-adenosina, 2-amino-6-Cloro-purina, N6-metil-2-amino-purina, Pseudo-iso-citidina, 6-Cloro-purina, N6-metil-adenosina, α-tio-adenosi- na, 8-azido-adenosina, 7-desaza-adenosina.

[0061] Outros nucleotídeos modificados foram descritos previamente (WO2013052523).

[0062] Rendimento: Rendimento, também referido como um rendimento de reação,é a quantidade de produto obtido em uma reação química ou enzimática. O rendimento absoluto pode ser dado como o peso em gramas ou em moles (rendimento molar). O rendimento relativo, rendimento parcial, ou rendimento percentual, que serve para medir a efetividade de um procedimento sintético, são calculados dividindo-se a quantidade do produto obtido pelo rendimento teórico (a unidade de medida para ambos deve ser a mesma). rendimento relativo = (rendimento real)/(rendimento teórico)

[0063] Rendimento real: O rendimento real refere-se à quantidade do produto obtido em uma reação química.

[0064] Rendimento teórico: O rendimento teórico é a quantidade máxima de produto que pode ser produzida em uma reação química ou enzimática perfeitamente eficiente. Na realidade, a maioria das reações não são perfeitamente eficientes - o rendimento real da reação é usualmente menor do que o rendimento teórico. O rendimento teórico é calculado com base na quantidade molar do reagente limitante, tomando em consideração a estequiometria da reação. Para o cálculo é usualmente considerado que existe apenas uma reação envolvida.

[0065] Rendimento de RNA: O rendimento de RNA é a quantidade de produto de RNA obtido em uma reação de transcrição in vitro. O rendimento de RNA pode ser expressado como a concentração de RNA (g/ml ou mol/l). A multiplicação da concentração de RNA com o volume de reação fornece a quantidade absoluta de RNA (em gramas ou moles).

[0066] Rendimento de RNA real: O rendimento de RNA real é a quantidade experimentalmente determinada de produto de RNA em uma reação de transcrição in vitro em um ponto no tempo definido, por exemplo, o rendimento depois da conclusão da reação. Por exemplo, a concentração de RNA pode ser determinada por intermédio de medição de absorvância em 260 nm usando um espectrofotômetro (Kolitz et al., 2013. Methods Enzymol. 530:331 - 6). Uma unidade de absor- vância em 260 nm corresponde a 40 ng/μl de RNA (1 A260 = 40 ng/μl RNA).

[0067] Rendimento de RNA teórico: O rendimento de RNA teórico é o rendimento de RNA máximo possível com base nos NTPs disponíveis na reação de transcrição in vitro. Em uma reação de transcrição padrão com concentrações iguais dos quatro NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP) tipicamente o nucleotídeo que corresponde ao nucleotídeo mais frequente na sequência de RNA torna-se o fator limitante. Em uma reação de transcrição otimizada por sequência usando uma mistura de NTP otimizada por sequência para a sequência de RNA de interesse nenhum dos nucleotídeos individuais torna-se o fator limitante.

[0068] Para calcular o rendimento de RNA teórico para uma reação de transcrição, a quantidade de cada NTP (em mol) presente no início da reação de transcrição é dividida pelo número do nucleotídeo respectivo presente na sequência da molécula de RNA resultando no número possível de moléculas de RNA que podem ser sintetizadas (em mol). Multiplicando-se pela massa molecular dos rendimentos de RNA o rendimento de RNA teórico em unidades de massa (grama). Em uma reação de transcrição padrão usando concentrações iguais de cada NTP tipicamente o NTP que corresponde ao nucleotídeo mais frequente na sequência de RNA torna-se o fator limitante. Ao contrário, em uma reação de transcrição otimizada por sequência nenhum NTP tornar-se-á o fator limitante porque todos os tipos de NTPs estão presentes na mesma razão como os nucleotídeos correspondentes na sequência da molécula de RNA.

[0069] Rendimento de RNA relativo: O rendimento de RNA relativo, rendimento parcial de RNA, ou rendimento percentual de RNA, que serve para medir a eficiência de uma reação de transcrição in vitro, são calculados dividindo-se a quantidade do produto de RNA obtido (rendimento de RNA real) pelo rendimento de RNA teórico (a unidade de medida para ambos deve ser a mesma): rendimento de RNA relativo = (rendimento de RNA real)/(rendimento de RNA teórico)

[0070] Para expressar a eficiência de uma reação de transcrição in vitro, o rendimento percentual de RNA pode ser calculado: % de rendimento de RNA = (rendimento de RNA real)/(rendimento de RNA teórico) xioo

Descrição Detalhada da Invenção

[0071] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para sintetizar uma molécula de RNA de uma sequência dada, compreendendo as etapas seguintes: a) determinar a fração (1) para cada um dos quatro nucleo- tídeos G, A, C e U na dita molécula de RNA, e b) sintetizar a dita molécula de RNA por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, em que a dita mistura de reação otimizada por sequência compreende os quatro tri- fosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) na mistura de reação corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA, um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimerase.

[0072] No contexto da presente invenção e como mostrado no exemplo 1 e Figuras 5 e 6, foi descoberto que o uso de uma mistura de reação otimizada por sequência contendo os quatro trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP para a produção de uma molécula de RNA com uma sequência dada por transcrição in vitro resulta em rendimento de produto de RNA mais alto e menos NTPs não incorporados e portanto desperdiçados comparado a uma mistura de reação não otimizada com concentrações iniciais equimolares de todos os quatro NTPs. Este aspecto é especialmente valioso quando difícil para sintetizar e portanto nucleotídeos modificados caros são usados. Na mistura de NTP otimizada por sequência GTP, ATP, CTP e UTP são representados em uma fração que corresponde à fração dos ditos nucleotídeos G, A, C e U ocorrendo na dita sequência de RNA. Em reações de transcrição in vitro otimizadas por sequência, é considerado que os quatro NTPs são consumidos na mesma medida e a transcrição continua até que os NTPs sejam consumidos, assim desperdiçando menos material.

[0073] Além disso, é esperado, que a possibilidade mencionada acima da síntese de moléculas de RNA que são mais longas do que o RNA codificado, por exemplo devido à extensão 3’ autocomplementar (Triana-Alonso et al., 1995, JBC; 270(11): 6298 - 6307), é evitada quando do uso de misturas de NTP otimizadas por sequência porque nenhum UTP em excesso permanece no final da reação. Especialmente se RNA contém uma cauda de poli(A), como é comum em RNAs tais como mRNAs, um excesso de UTP não incorporado na reação de transcrição pode resultar em incorporação dependente de padrão de RNA de nucleotídeos de uridina opostos da sequência de poliA, resultando em moléculas de RNA de filamento duplo que podem ativar a resposta imune inata e diminuir a síntese de proteína (Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res.; 39(21): e142).

[0074] Como será explicado em detalhe abaixo, métodos para a produção de moléculas de RNA usando transcrição in vitro são conhecidos na técnica. Também é conhecido usar análogos de nucleotídeo para melhorar por exemplo a estabilidade da molécula de RNA. A presente invenção diz respeito à concentração dos trifosfatos de ribonu- cleosídeo (NTPs) na mistura de reação da reação de transcrição in vitro.

[0075] Consequentemente, em uma primeira etapa do método da presente invenção, a fração (1) de cada um dos quatro nucleotídeos G, A, C e U na dita molécula de RNA é determinada. Isto pode ser realizado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por contagem simples do número de nucleotídeos ou usando-se métodos informatizados.

[0076] A fração (1) de cada um dos nucleotídeos depois pode ser expressada por qualquer termo adequado, incluindo número, porcentagem, fração em mol ou porcentagem molar. A fração em mol ou fração molar (xi) é definida como a quantidade de um constituinte (expressado em moles), ni, dividida pela quantidade total de todos os constituintes em uma mistura, ntot. A soma de todas as frações em mol é igual a 1. O mesmo conceito expressado com um denominador de 100 é a porcentagem em mol ou porcentagem molar (% em mol).

[0077] Com base na determinação da fração de cada um dos nu- cleotídeos na dita molécula de RNA, em uma outra etapa do método da presente invenção, a dita molécula de RNA é sintetizada por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, em que a dita mistura de reação otimizada por sequência compreende os quatro trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP ou análogos destes, e em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfa- tos de ribonucleosídeo (NTPs) na mistura de reação otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA.

[0078] Em uma modalidade preferida, a etapa b) do método da invenção compreende as etapas de b1) preparar uma mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência compreendendo os quatro trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) na mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA, e b2) sintetizar a dita molécula de RNA por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência compreendendo a mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência da etapa (b1), um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimera- se.

[0079] Consequentemente, nesta modalidade preferida, uma mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência é preparada com base na determinação da fração (1), que é depois adicionada à mistura de reação. Todas as definições indicadas acima com respeito à mistura de reação otimizada por sequência, e especialmente aquelas feitas com respeito à questão "fração (1) corresponde à fração (2)" também aplicam-se à mistura de trifosfato de ribonucleo- sídeo (NTP) otimizada por sequência.

[0080] Neste contexto, a pessoa habilitada na técnica entenderá que se a dita molécula de RNA não contém todos os nucleotídeos G, A, C, e U, respectivamente, o mesmo também aplicar-se-á à mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência e à mistura de reação otimizada por sequência.

[0081] De acordo com a invenção, "fração (1) corresponde à fração (2)" significa que a fração dos trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência foi adaptada à fração dos nucleotí- deos na molécula de RNA. A pessoa habilitada entenderá que não há necessidade de que a fração (2) exatamente espelhe-se à fração (1), mas que é necessário que a fração individual (2) de cada trifosfato de ribonucleosídeo na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência reflita a fração (1) do nu- cleotídeo correspondente na dita molécula de RNA.

[0082] Para avaliar em mais detalhe a relação entre fração (1) e fração (2), o seguinte pode ser considerado para a definição do termo "fração (1) corresponde à fração (2)": a) Com respeito à fração do trifosfato de ribonucleosídeo na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência que corresponde ao primeiro nucleotídeo da molécula de RNA a ser sintetizada, é, de acordo com uma modalidade da presente invenção, possível que a fração (2) esteja na faixa da fração (1), por exemplo, que a fração (1) e a fração (2) difiram em não mais do que 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 7 %, 5 % ou em um valor entre 0,1 % e 5 %. b) Com respeito aos outros trifosfatos de ribonucleosídeo presentes na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência que não correspondem ao primeiro nucleotídeo da dita molécula de RNA, a fração (2) está preferivelmente na faixa de fração (1), por exemplo, a fração (1) e a fração (2) diferem em não mais do que 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 7 %, 5 % ou em um valor entre 0,1 % e 5 %.

[0083] Em uma modalidade preferida da invenção, um nucleotídeo de partida é adicionado à mistura de NTP otimizada por sequência ou à mistura de reação otimizada por sequência antes do início da transcrição in vitro. Um nucleotídeo de partida é um nucleotídeo que corresponde ao primeiro nucleotídeo da dita molécula de RNA (posição +1). O nucleotídeo de partida pode ser especialmente adicionado para aumentar a taxa de iniciação da RNA polimerase. Os ditos nucleotí- deos de partida também são conhecidos na técnica e incluem um mo- nofosfato de nucleosídeo, um difosfato de nucleosídeo, um trifosfato de nucleosídeo. O nucleotídeo de partida pode ser um mononucleotí- deo, um dinucleotídeo ou um trinucleotídeo. No caso de que o primeiro nucleotídeo da dita molécula de RNA é um G, o nucleotídeo de partida é preferivelmente GTP ou GMP.

[0084] Em uma modalidade preferida da invenção, o dito nucleotí- deo de partida é um dinucleotídeo. Em uma modalidade ainda mais preferida o nucleotídeo de partida é um análogo de capuz.

[0085] Em uma modalidade preferida, o análogo de capuz é selecionado do grupo que consiste em G[5’]ppp[5’]G, m7G[5’]ppp[5’] G, m32,2,7G[5’]ppp[5’]G, m27,3’-OG[5’]ppp[5’]G (3’-ARCA), m27,2’-OGpppG (2’- ARCA), m27,2’-OGppspG D1 (β-S-ARCA D1) e m27,2’-OGppspG D2 (β-S- ARCA D2).

[0086] De acordo com uma modalidade preferida, adicional, entretanto, na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência, o nucleotídeo de partida correspondendo ao primeiro nucleotídeo da dita molécula de RNA é adicionado em excesso comparado à fração deste nucleotídeo na dita molécula de RNA que é encontrada na primeira posição da dita molécula de RNA.

[0087] Preferivelmente o nucleotídeo de partida é adicionado com uma concentração inicial na faixa de cerca de 1 a 20 mM, 1 a 17,5 mM, 1 a 15 mM, 1 a 12,5 mM, 1 a 10 mM, 1 a 7,5 mM, 1 a 5 mM ou 1 a 2,5 mM. Ainda mais preferido o nucleotídeo de partida é adicionado com uma concentração inicial de cerca de 5 a 20 mM ou 7,5 a 17,5 mM.

[0088] Em uma modalidade exemplar, preferida do acima, o primeiro nucleotídeo da molécula de RNA é G, o nucleotídeo de partida é um análogo de capuz de G e o trifosfato de ribonucleosídeo correspondente é GTP. Nesta forma de realização, o análogo de capuz está presente na mistura de reação em um excesso, em comparação a GTP. Preferivelmente o análogo de capuz é adicionado com uma concentração inicial na faixa de cerca de 1 a 20 mM, 1 a 17,5 mM, 1 a 15 mM, 1 a 12,5 mM, 1 a 10 mM, 1 a 7,5 mM, 1 a 5 mM ou 1 a 2,5 mM. Ainda mais preferido o análogo de capuz é adicionado com uma con-centração inicial de cerca de 5 a 20 mM, 7,5 a 20 mM, 10 a 20 mM ou 12,5 a 20 mM.

[0089] Métodos para transcrição in vitro são conhecidos na técnica (Geall et al., 2013. Semin. Immunol. 25(2): 152-159; Brunelle et al., 2013. Methods Enzymol. 530:101 - 14). Reagentes usados no dito método tipicamente incluem: 1) um padrão de DNA linearizado com uma sequência promotora que tem uma afinidade de ligação alta pela sua RNA polimera- se respectiva tais como RNA polimerases codificadas por bacteriófago, 2) trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) para as quatro bases (adenina, citosina, guanina e uracila); 3) um análogo de capuz como definido acima (por exemplo, m7G(5’)ppp(5’)G (m7G)); 4) uma RNA polimerase dependente de DNA (por exemplo, T7, T3 ou SP6 RNA polimerase); 5) um inibidor de ribonuclease (RNase) para inativar qualquer RNase contaminante; 6) uma pirofosfatase para degradar pirofosfato, que pode inibir a transcrição; 7) MgCl2, que fornece Mg2+ como um cofator para a polime- rase; 8) um tampão para manter um valor de pH adequado, que também pode conter antioxidantes e poliaminas tais como espermidina em concentrações ideais.

[0090] De acordo com uma modalidade preferida, a mistura de reação otimizada por sequência usada para o método inventivo para sintetizar uma molécula de RNA de uma sequência dada compreende um tampão selecionado do grupo que consiste em ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico (HEPES) e tris(hidroximetil) aminometano (Tris). Preferivelmente o tampão é usado em uma concentração a partir de 10 a 100 mM, 10 a 75 mM, 10 a 50 mM, 10 a 40 mM, 10 a 30 mM ou 10 a 20 mM. O valor de pH do tampão pode ser ajustado com, por exemplo, NaOH, KOH ou HCl. Preferivelmente o tampão tem um valor de pH a partir de 6 a 8,5, a partir de 6,5 a 8,0, a partir de 7,0 a 7,5, ainda mais preferido 7,5. O mais preferido é um tampão selecionado do grupo que consiste em 80 mM de HEPES/KOH, pH 7,5 e 40 mM de Tris/HCl, pH 7,5.

[0091] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a RNA polimerase compreendida na mistura de reação otimizada por sequência é selecionada do grupo que consiste em T3, T7 e SP6 RNA polimerase. Preferivelmente, a concentração da RNA polimerase é a partir de cerca de 1 a 100 nM, 1 a 90 nM, 1 a 80 nM, 1 a 70 nM, 1 a 60 nM, 1 a 50 nM, 1 a 40 nM, 1 a 30 nM, 1 a 20 nM, ou cerca de 1 a 10 nM. Ainda mais preferido, a concentração da RNA polimerase é a partir de cerca de 10 a 50 nM, 20 a 50 nM, ou 30 a 50 nM. O mais preferido é uma concentração de RNA polimerase de cerca de 40 nM. Neste contexto uma concentração de 500 a 10000 U/ml da RNA polimerase é preferido. Mais preferida é uma concentração de 1000 a 7500 U/ml e o mais preferido é uma concentração de 2500 a 5000 Unidades/ml da RNA polimerase. A pessoa habilitada na técnica entenderá que a escolha da concentração de RNA polimerase é influenciada pela concentração do padrão de DNA.

[0092] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a concentração do padrão de DNA compreendido na mistura de reação otimizada por sequência é em uma faixa a partir de cerca de 1 a 50 nM, 1 a 40 nM, 1 a 30 nM, 1 a 20 nM, ou cerca de 1 a 10 nM. Ainda mais preferido a concentração do padrão de DNA é a partir de cerca de 10 a 30 nM. O mais preferido a concentração do padrão de DNA é cerca de 20 nM. Neste contexto é particularmente preferido ter uma concentração do padrão de DNA de cerca de 1 a 200 μg/ml e mais preferivelmente de cerca de 10 a 100 μg/ml, e o mais preferivelmente de cerca de 20 a 50 μg/ml (por exemplo, 25 ou 50 μg/ml).

[0093] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de reação otimizada por sequência compreende pirofosfatase. Preferivelmente, a concentração da pirofosfatase é a partir de cerca de 1 a 20 unidades/ml, 1 a 15 unidades/ml, 1 a 10 unidades/ml, 1 a 5 uni- dades/ml, ou 1 a 2,5 unidades/ml. Ainda mais preferido a concentração da pirofosfatase é cerca de 1 unidade/ml ou é cerca de 5 unidades/ml.

[0094] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de reação otimizada por sequência compreende íons Mg++. Preferivelmente, os íons Mg++ são fornecidos na forma de MgCl2 ou Mg(OAc)2. Preferivelmente, a concentração de Mg++ livre inicial é a partir de cerca de 1 a 100 mM, 1 a 75 mM, 1 a 50 mM, 1 a 25 mM, ou 1 a 10 mM. Ainda mais preferido a concentração de Mg++ livre inicial é a partir de cerca de 10 a 30 mM ou cerca de 15 a 25 mM. O mais preferido é uma concentração de Mg++ livre inicial de cerca de 24 mM. A pessoa habilitada na técnica entenderá que a escolha da concentração de Mg++ é influenciada pela concentração inicial de NTP total.

[0095] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de reação otimizada por sequência compreende um agente redutor para manter a RNA polimerase em seu estado ativo. Preferivelmente, o agente redutor é selecionado do grupo que consiste em ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e β-mercaptoetanol. Preferivelmente a concentração do reagente de redução é a partir de cerca de 1 a 50 mM, 1 a 40 mM, 1 a 30 mM, ou 1 a 20 mM, ou 1 a 10 mM. Ainda mais preferido a concentração do reagente de redução é a partir de 10 a 50 mM ou 20 a 40 mM. O mais preferido é uma mistura de reação otimizada por sequência compre-endendo 40 mM de DTT.

[0096] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de reação otimizada por sequência compreende uma poliami- na. Preferivelmente, a poliamina é selecionada do grupo que consiste em espermina e espermidina. Preferivelmente a concentração da poli- amina é a partir de cerca de 1 a 25 mM, 1 a 20 mM, 1 a 15 mM, 1 a 10 mM, 1 a 5 mM, ou cerca de 1 a 2,5 mM. Ainda mais preferido a concentração da poliamina é cerca de 2 mM. O mais preferido é uma mistura de reação otimizada por sequência compreendendo 2 mM de es- permidina.

[0097] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de reação otimizada por sequência compreende um inibidor de ribonuclease. Preferivelmente, a concentração do inibidor de ribonuclease é a partir de cerca de 1 a 500 unidades/ml, 1 a 400 unida- des/ml, 1 a 300 unidades/ml, 1 a 200 unidades/ml, ou 1 a 100 unida des/ml. Ainda mais preferido a concentração do inibidor de ribonuclease é cerca de 200 unidades/ml.

[0098] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a concentração inicial de NTP total na mistura de NTP otimizada por sequência ou mistura de reação otimizada por sequência é menos do que 20 mM, menos do que 15 mM, menos do que 10 mM, menos do que 7,5 mM, menos do que 5,0 mM ou menos do que 2,5 mM.

[0099] De acordo com a invenção, o termo concentração de nu- cleotídeo total inicial significa a concentração total de NTPs, por exemplo, a soma das concentrações de ATP, GTP, CTP e/ou UTP, presentes inicialmente na mistura de NTP otimizada por sequência ou mistura de reação otimizada por sequência quando os vários componentes da mistura de reação otimizada por sequência foram montados no volume final para realizar a reação de transcrição in vitro. Naturalmente, conforme a reação procede, os nucleotídeos serão incorporados na molécula de RNA e consequentemente a concentração dos nu- cleotídeos totais será progressivamente reduzida a partir de seu valor inicial.

[00100] Um aspecto importante da presente invenção é que o uso de uma mistura de NTP otimizada por sequência ou mistura de reação otimizada por sequência leva a uma eficiência aumentada da síntese de RNA mesmo em concentrações de nucleotídeo totais iniciais baixas (por exemplo, em 2 mM). Ao contrário, foi previamente sugerido que para um rendimento de RNA aumentado concentrações altas de nu- cleotídeos totais, na ordem de 12 mM a 40 mM, são necessárias (US6586218).

[00101] Além disso, espera-se que a síntese de moléculas de RNA abortivas curtas seja diminuída quando concentrações de nucleotídeo totais iniciais baixas (por exemplo, 2,5 mM) em uma mistura de NTP otimizada por sequência ou mistura de reação otimizada por sequên- cia são usadas. Ao contrário, um aumento na transcrição abortiva foi observado quando concentrações de NTP de uma mistura de NTP equimolar padrão foram diminuídas abaixo de aproximadamente 2 mM (Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174 - 184).

[00102] Uma outra modalidade preferida da invenção refere-se à forma em que os NTPs são adicionados à mistura de NTP otimizada por sequência ou mistura de reação otimizada por sequência. Os tri- fosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP ou análogos destes podem ser fornecidos com um cátion monovalente ou bivalente como contraíon. Preferivelmente o cátion monovalente é selecionado do grupo que consiste em Li+, Na+, K+, NH4+ ou tris(hidroximetil)- aminometano (Tris). Preferivelmente, o cátion bivalente é selecionado do grupo que consiste em Mg++, Ba++ e Mn++.

[00103] De acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, o contraíon de NTP é tris(hidroximetil)-aminometano (Tris).

[00104] RNA polimerases de bacteriófago são conhecidas como sendo sensíveis à inibição salina. O impacto negativo de concentrações de NaCl altas sobre rendimentos de RNA foi descrito (por exemplo, Kern & Davis, 1997. Biotechnol. Prog., 13, 747 - 756; US 6.586.218 B2). Concentrações altas de Na-NTPs, especialmente como consequência quando da adoção de uma estratégia de alimentação de NTP, podem portanto resultar em rendimentos de RNA diminuídos. Esta limitação pode ser evitada usando-se Tris-nucleotídeos, porque a atividade de RNA polimerase é menos afetada por concentrações de Tris altas comparado a concentrações de Na altas. Como mostrado no exemplo 5 e Figura 12, o rendimento de RNA é mais sensível à adição de Na comparado a Tris.

[00105] É conhecido na técnica que ao invés dos trifosfatos de ribo- nucleosídeo GTP, ATP, GTP e UTP, respectivamente, trifosfatos de nucleosídeo modificados (análogos) também podem ser usados em reações de transcrição in vitro, por exemplo, para aumentar a estabilidade do RNA. Como mostrado no exemplo 3 e Figura 8, parte ou todo o UTP em uma mistura de NTP otimizada por sequência ou em uma mistura de reação otimizada por sequência podem ser substituídos por pseudo-UTP.

[00106] Consequentemente, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, uma parte ou todo de pelo menos um trifosfato de ribonucleosídeo na mistura de NTP otimizada por sequência ou na mistura de reação otimizada por sequência são substituídos por um trifosfato de nucleosídeo modificado.

[00107] Em uma modalidade preferida da invenção, o dito trifosfato de nucleosídeo modificado é selecionado do grupo que consiste em pseudouridina-5’-trifosfato, 1-metilpseudouridina-5’-trifosfato, 2- tiouridina-5’-trifosfato, 4-tiouridina-5’-trifosfato e 5-metilcitidina-5’-trifos- fato.

[00108] A pessoa habilitada na técnica entenderá que é apenas possível antes do início da transcrição in vitro estabelecer exatamente as concentrações dos componentes individuais da mistura de NTP otimizada por sequência ou da mistura de reação otimizada por sequência. Consequentemente, em uma modalidade preferida da presente invenção, os números e frações como definido acima refletem as condições iniciais presentes na mistura de reação otimizada por sequência ou na mistura de NTP otimizada por sequência antes do início da transcrição.

[00109] De acordo com uma outra modalidade preferida da invenção, no curso da transcrição in vitro a mistura de reação otimizada por sequência é suplementada com a mistura de trifosfato de ribonucleo- sídeo (NTP) otimizada por sequência como definido aqui.

[00110] No contexto da presente invenção, foi descoberto que o rendimento de RNA pode ser aumentado ainda por quantidades adici- onais de alimentação da mistura de NTP otimizada por sequência na reação de transcrição in vitro (alimentação de NTP). Como mostrado no exemplo 1 e Figura 6, adicionar mistura de NTP otimizada por sequência adicional aumenta significantemente o rendimento de RNA.

[00111] A mistura de NTP otimizada por sequência fresca é adicionada em um tal modo que a razão desejada do análogo de capuz para o nucleotídeo correspondente por exemplo, GTP (por exemplo, 4:1) seja mantida. Preferivelmente, a mistura de NTP otimizada por sequência fresca é adicionada no final da reação de transcrição in vitro, quando todos os nucleotídeos na mistura de reação otimizada por sequência são consumidos. A razão do análogo de capuz remanescente para o nucleotídeo correspondente recentemente adicionado por exemplo, GTP (por exemplo, 4:1) pode ser aproximadamente mantida porque próximo a 100 % do análogo de capuz permanece no final da reação de transcrição porque apenas um análogo de capuz pode ser incorporado por molécula de RNA. Esta estratégia resulta na mesma eficiência de encapuzamento, rendimentos aumentados (> 4,5 vezes, dependendo da sequência de RNA) e custos dramaticamente reduzidos. Além disso, o teor de NTP aumentado impede a precipitação de moléculas de RNA durante a transcrição, como é comumente observado para concentrações de NTP padrão (ambas em reações padrão e otimizadas por sequência).

[00112] A incorporação dependente de sequência de NTPs também permite o monitoramento do progresso da reação de transcrição in vitro. Como mostrado no exemplo 6 e Figura 13, o progresso da reação de transcrição in vitro pode ser monitorado separando-se os nucleotí- deos não incorporados a partir da reação de transcrição in vitro e medindo-se a absorvância em 260 nm. A razão é que a diminuição na concentração total de todos os quatro NTPs diretamente correlaciona- se com a quantidade de RNA sintetizado. Este método não seria pos- sível como diretamente se uma mistura de NTP padrão com a mesma razão de trifosfatos de nucleosídeo for usada. Uma diminuição na absorção em 260 nm pode ser diretamente traduzida em moléculas de RNA produzidas se NTPs são separados do RNA e DNA para evitar interferência, por exemplo, por filtração através de uma membrana com um corte de peso molecular baixo.

[00113] Métodos para a quantificação de ácidos nucleicos e nucleo- tídeos são conhecidos na técnica. Métodos espectroscópicos para quantificação de ácido nucleico incluem medições de absorvância tradicionais (Kolitz et al., 2013. Methods Enzymol. 530:331 - 6) e técnicas de fluorescência mais sensíveis usando corantes fluorescentes tais como brometo de etídio e um fluorômetro com um comprimento de onda de excitação adequado (por exemplo, 302 ou 546 nm) (Gallagher, 2011. Current Protocols in Molecular Biology. 93:A,3D,1-A,3D,14). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, a sintetização da dita molécula de RNA por transcrição in vitro é seguida por separação e quantificação dos NTPs não incorporados.

[00114] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a dita molécula de RNA é selecionada do grupo que consiste em moléculas de RNA que não de codificação e de codificação.

[00115] Uma molécula de RNA que não de codificação (ncRNA) é uma molécula de RNA funcional que não é traduzida em um peptídeo ou proteína. Moléculas de RNA que não de codificação incluem RNAs altamente abundantes e funcionalmente importantes tais como RNA de transferência (tRNA) e RNA ribossômico (rRNA), assim como RNAs tais como snoRNAs, microRNAs, siRNAs, snRNAs, exRNAs, e piRNAs e os ncRNAs longos que incluem exemplos tais como Xist e HOTAIR (Esteller, 2011. Nat. Rev. Genet. 12(12):861 - 74). Além disso, moléculas de RNA que não de codificação incluem moléculas de RNA imu- noestimulador (isRNA).

[00116] Preferivelmente, o RNA imunoestimulador pode ser um RNA de filamento único linear. Ainda mais preferido, o RNA imunoes- timulador pode ser um RNA longo que não de codificação de filamento único linear. Neste contexto é particularmente preferido que o isRNA carregue um trifosfato em sua extremidade 5’.

[00117] O RNA imunoestimulador (isRNA) pode compreender qualquer sequência de RNA conhecida como sendo imunoestimuladora, incluindo, sem ser limitado à esta, sequências de RNA que representam e/ou que codificam ligantes de TLRs, preferivelmente selecionados a partir de membros da família humana TLR1 a TLR10 ou membros da família de murino TLR1 a TLR13, mais preferivelmente selecionados a partir de membros da família humana TLR1 a TLR10, ainda mais preferivelmente a partir de TLR7 e TLR8, ligantes para receptores intracelulares para RNA (tais como RIG-I, MDA-5 ou PKR) (Meylan e Tschopp, 2006. Mol. Cell 22, 561 - 569), ou qualquer outra sequência de RNA imunoestimulador. Além disso, moléculas de RNA imu- noestimuladoras podem incluir qualquer outro RNA capaz de evocar uma resposta imune inata. Sem ser limitado a isto, um tal RNA imu- noestimulador pode incluir RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA mensageiro (mRNA), e RNA viral (vRNA). Preferivelmente o RNA imunoestimulador é um RNA que não de codificação. Um tal RNA imunoestimulador pode compreender um comprimento de 1000 a 5000, de 500 a 5000, de 5 a 5000, ou de 5 a 1000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos.

[00118] De acordo com uma outra modalidade particularmente preferida, tais moléculas de RNA imunoestimuladoras consistem em ou compreendem RNA da fórmula (I): (NuGlXmGnNv)a, (fórmula (I)) em que: G é guanosina (guanina), uridina (uracila) ou um análogo de guanosina (guanina) ou uridina (uracila), preferivelmente guanosina (guanina) ou um análogo deste; X é guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (ade- nina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo destes nucle- otídeos (nucleosídeos), preferivelmente uridina (uracila) ou um análogo deste; N é uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de cerca de 4 a 50, preferivelmente de cerca de 4 a 40, mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 ácidos nucleicos, cada N independentemente sendo selecionado a partir de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosi- na) ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos); a é um número inteiro a partir de 1 a 20, preferivelmente a partir de 1 a 15, o mais preferivelmente a partir de 1 a 10; l é um número inteiro a partir de 1 a 40, em que quando l = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo deste, quando l > 1, pelo menos 50 % destes nucleotídeos (nu- cleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo deste; m é um número inteiro e é pelo menos 3; em que quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo deste, e quando m > 3, pelo menos 3 uridinas sucessivas (uracilas) ou análogos de uridina (uracila) ocorrem; n é um número inteiro a partir de 1 a 40, em que quando n = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo deste, quando n > 1, pelo menos 50 % destes nucleotídeos (nu- cleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo deste; u,v podem ser independentemente um do outro um número inteiro a partir de 0 a 50, preferivelmente em que quando u = 0, v > 1, ou quando v = 0, u > 1; em que a molécula de ácido nucleico da fórmula (I) tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nu- cleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotí- deos e o mais preferivelmente de pelo menos 250 nucleotídeos.

[00119] De acordo com uma modalidade mais preferida, a molécula de RNA de acordo com a fórmula (I) pode ser selecionada a partir, por exemplo, da sequência seguinte: GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUAC AACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCU CAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGC UGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUU UUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAU GCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCG AGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCU GAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCAC UGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUU UUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCAC UGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAA GAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGA GAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG (R2025; SEQ ID NO: 4)

[00120] Um RNA de codificação é uma molécula de RNA funcional que pode ser traduzida em um peptídeo ou proteína. Preferivelmente a molécula de RNA de codificação compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica pelo menos um peptídeo ou proteína.

[00121] Neste contexto a molécula de RNA de codificação pode compreender uma estrutura de leitura aberta (ORF) (monocistrônicas), duas estruturas de leitura abertas (ORF) (bicistrônicas) ou mais (multi- cistrônicas). A molécula de RNA de codificação pode ser uma molécula de RNA mensageiro (mRNA), molécula de RNA viral ou molécula de RNA auto-replicante (replicon). Preferivelmente a molécula de RNA é um mRNA.

[00122] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a dita molécula de RNA é mais longa do que 100 nucleotídeos. É igualmente preferido que o RNA tenha um comprimento entre 100 e 15.000 nucleotídeos, 100 e 12.500 nucleotídeos, 100 e 10.000 nucleotídeos, 100 e 7.500 nucleotídeos, 100 e 5.000 nucleotídeos, 100 e 2.500 nu- cleotídeos, 100 e 1.500 nucleotídeos, ou 100 e 1.000 nucleotídeos.

[00123] Em uma modalidade preferida da invenção, a dita sintetização de uma molécula de RNA de uma sequência dada é realizada como uma síntese em grande escala.

[00124] De acordo com a presente invenção, o termo "grande escala" refere-se a um rendimento de reação da dita molécula de RNA na ordem de quantidades em miligrama, preferivelmente de pelo menos um grama.

[00125] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a reação de transcrição in vitro é realizada em um biorreator, também referido como um reator de transcrição ou reator de RNA para a síntese em grande escala de RNA. Portanto, o biorreator pode ser adaptado para realizar o método descrito acima da presente invenção.

[00126] De acordo com a presente invenção, um tal biorreator para sintetizar moléculas de RNA de uma sequência dada, preferivelmente em uma grande escala, é um sistema de reator de transcrição in vitro modularmente projetado, compreendendo um módulo de reação para realizar reações de transcrição de RNA in vitro em uma mistura de re- ação otimizada por sequência, um módulo de captura para capturar temporariamente as moléculas de RNA transcritas, e um módulo de controle para controlar o avanço de componentes da mistura de reação otimizada por sequência no módulo de reação. Aqui, o módulo de reação compreende uma membrana de filtração para separar nucleo- tídeos a partir da mistura de reação, e o controle do avanço dos componentes da mistura de reação otimizada por sequência pelo módulo de controle é fundamentado em uma concentração medida de nucleo- tídeos separados.

[00127] O termo biorreator ou reator de transcrição como usado aqui refere-se a uma câmara ou tubo de teste ou coluna em que uma reação de transcrição in vitro é realizada sob condições específicas. O biorreator pode ser termicamente regulado para manter exatamente uma temperatura específica, usualmente entre 4 e 40°C. O biorreator pode ser configurado com uma linha de afluência ou alimentação e uma porta de saída. O biorreator pode ser uma célula agitada com provisão para taxas variáveis de agitação.

[00128] De acordo com a presente invenção, o biorreator compreende uma membrana de filtração para separar nucleotídeos a partir da mistura de reação, em particular para separar nucleotídeos e outros componentes de peso molecular baixo da mistura de reação otimizada por sequência. A introdução de uma membrana de filtração em um tal sistema de fluxo, por exemplo uma membrana de ultrafiltração, é usada para separação de componentes de peso molecular alto, tais como por exemplo, proteínas e/ou polinucleotídeos, a partir de componentes peso molecular baixo, tais como nucleotídeos. A membrana de filtração serve para reter seletivamente o padrão de DNA imobilizado, a RNA polimerase e as moléculas de RNA sintetizadas no núcleo do reator do módulo de reação ao passo que moléculas menores tais como nucleotídeos (NTPs) podem passar na membrana de filtração em um compartimento menor separado do módulo de reação, isto é o compartimento de filtração. A concentração de nucleotídeo depois pode ser medida, por exemplo, por análise espectroscópica no fluido separado contendo os componentes de peso molecular baixo. Alternativamente, a concentração de nucleotídeo pode ser medida por um sistema de HPLC em linha. A aplicação de uma mistura de NTP otimizada por sequência neste sistema de reator permite que a medição em tempo real da concentração de nucleotídeo durante a reação de transcrição in vitro monitore o progresso da reação de transcrição in vitro.

[00129] Membranas de filtração adequadas podem consistir em vários materiais conhecidos a uma pessoa habilitada na técnica (van de Merbel, 1999. J. Chromatogr. A 856(1 - 2):55 - 82). Por exemplo, membranas podem consistir em celulose regenerada ou modificada ou de materiais sintéticos. Estes incluem polissulfona (PSU), poliacrilo- nitrila (PAN), polimetilmetacrilato (PMMA), misturas de poliariléter- sulfonas, polivinilpirrolidona e poliamida (Polyamix.RTM.). Por exemplo, as polissulfonas incluem polietersulfona [poli(óxi-1,4-fenilsulfonil- 1,4-fenila), abreviado PES]. Em algumas modalidades exemplares, polietersulfona pode ser utilizada como uma membrana semipermeá- vel para o uso de acordo com a divulgação. Em alguns casos membranas de PES incluem hidrofilicidade aumentada (e/ou a umectabili- dade melhorada da membrana com água) comparado a membranas de PSU. Em algumas modalidades , a umectabilidade de membranas de PES pode, por exemplo, ser aumentada ainda pela inclusão do polímero solúvel em água polivinilpirrolidona.

[00130] Um parâmetro importante que influencia o fluxo de moléculas através da membrana de filtração é o tamanho do poro ou distribuição de tamanho de poro. Uma membrana de filtração é usualmente caracterizada por seu valor de corte de peso molecular (MWCO), isto é uma limitação de tamanho específica, que é definida como a massa molecular do menor composto, que é retido por mais do que 90 %. Para cada aplicação, um valor de MWCO apropriado precisa ser selecionado de modo que compostos de peso molecular alto sejam suficientemente retidos, mas ao mesmo tempo um transporte rápido do analito é garantido. A membrana de filtração do biorreator da presente invenção pode ter um MWCO em uma faixa a partir de 10 a 100 kDa, 10 a 75 kDa, 10 a 50 kDa, 10 a 25 kDA ou 10 a 15 kDa. Ainda mais preferido, a membrana de filtração tem um MWCO em uma faixa de aproximadamente 10 a 50 kDa. Preferivelmente, a membrana de filtração é selecionada do grupo de celulose regenerada, celulose modificada, polissulfona (PSU), poliacrilonitrila (PAN), polimetilmetacrilato (PMMA), álcool polivinílico (PVA) e poliariletersulfona (PAES).

[00131] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o biorreator compreende um padrão de DNA imobilizado em um suporte sólido como base para a reação de transcrição de RNA. A imobilização do padrão de DNA permite o uso repetido do padrão e reduz a contaminação do produto de RNA por DNA residual. Além disso, a imobilização torna o uso de DNAse dispensável para a remoção do padrão de DNA do produto de RNA final. O padrão de DNA, que é preferivelmente imobilizado em um suporte sólido no núcleo de reação do módulo de reação, pode representar uma molécula de DNA quimicamente sintetizada, um fragmento de restrição de DNA isolado, um plasmídeo ou uma molécula de DNA amplificada, por exemplo por um processo de amplificação tal como a reação em cadeia de polimerase (PCR). O padrão de DNA pode ser um duplex de filamento duplo ou uma unidade que compreende uma região promotora de filamento duplo a montante de uma região de codificação de RNA de filamento único. O padrão de DNA pode ser modificado com um ligante para imobilização a um suporte sólido na extremidade 5’, na extremidade 3’, ou em um nucleotídeo interno de um filamento de DNA.

[00132] De acordo com a invenção, o termo "suporte sólido" refere- se a cada suporte não dissolvido que é capaz de imobilizar uma molécula de DNA em sua superfície. O suporte sólido pode ser selecionado do grupo que consiste em agarose, agarose modificada, sefarose, poliestireno, látex, celulose, e partículas ferro- ou ferrimagnéticas. Métodos e estratégias para escolher suportes sólidos apropriados e para ligação de moléculas de DNA aos ditos suportes sólidos são conhecidos na técnica (ver por exemplo, Arndt-Jovin et al. 1975. Eur. J. Bio- chem. 54(2):411 - 8; Kerrigan et al., 2001. Current Protocols in Molecular Biology. 24:12,10,1-12,10,18; WO1995/08626). A imobilização do padrão de DNA no suporte sólido pode ser por intermédio de uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. Preferivelmente, a imobilização do padrão de DNA ocorre através de uma ligação não covalente. Por exemplo, a imobilização de um padrão de DNA a um suporte sólido pode ocorrer através de uma interação de biotina-estreptavidina não covalente. O filamento que não de codificação do padrão de DNA pode ser modificado com um grupo biotina 5’-terminal que funciona para imobilizar o filamento de DNA a uma matriz de suporte sólido compreendendo proteína estreptavidina. O filamento de codificação de RNA complementar do padrão de DNA pode permanecer não imobilizado. Também é possível imobilizar padrões de DNA a suportes sólidos através de outros tipos de ligações não covalentes, por exemplo, interações poli(A)-poli(T), e poli(G)-poli(C). Igualmente preferido, a imobilização do padrão de DNA ocorre através de uma ligação covalente, por exemplo, ligação de éster ou derivado desta. Em geral, antes da ligação, o suporte sólido pode conter grupos ativos tais como NHS, carbodimida etc. para permitir a ligação da reação com a molécula de DNA. A molécula de DNA pode ser ligada ao suporte sólido por ligação direta (por exemplo, usando grupos funcionais tais como grupos amino, sulfidrila, carboxila, hidroxila, aldeído, e cetona). A liga- ção ao material de suporte sólido pode envolver espaçadores para otimizar a separação espacial do padrão de DNA a partir do suporte. O espaçador pode ser fornecido por inserção de nucleotídeos adicionais na extremidade 5’ do padrão de DNA.

[00133] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o módulo de captura do biorreator compreende uma fase de resina/sólida para capturar as moléculas de RNA transcritas e para separar as moléculas de RNA transcritas de outros componentes solúveis da mistura de reação de transcrição otimizada por sequência. Preferivelmente, o módulo de captura compreende meios para purificar as moléculas de RNA transcritas capturadas, por exemplo, por um processo de lavagem ou semelhantes. Ainda preferivelmente, o módulo de captura compreende meios para eluição das moléculas de RNA transcritas capturadas, preferivelmente por meio de um tampão de eluição.

[00134] De acordo com uma outra modalidade preferida, o biorrea- tor compreende ainda um módulo de refluxo para devolver a mistura de reação otimizada por sequência filtrada residual, isto é os outros componentes solúveis da mistura de reação de transcrição otimizada por sequência além das moléculas de RNA transcritas, ao módulo de reação a partir do módulo de captura depois de capturar as moléculas de RNA transcritas, preferivelmente em que o meio para devolver a mistura de reação otimizada por sequência filtrada residual é uma bomba. Aqui, o módulo de refluxo preferivelmente compreende enzimas imobilizadas, tais como pirofosfatase, ou resina para capturar componentes disruptivos, tal como fosfato.

[00135] Em uma modalidade preferida, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon. No contexto da presente invenção, o termo ‘eletrodo seletivo de íon’ refere-se a um transdutor (por exemplo, um sensor) que converte a atividade de um íon específi- co dissolvido em uma solução em um potencial elétrico, em que o potencial elétrico pode ser medido, por exemplo, usando-se um voltímetro ou um medidor de pH. Em particular, o termo ‘eletrodo seletivo de íon’ como usado aqui compreende um sistema, que compreende ou consiste em uma membrana tendo permeabilidade seletiva, em que a membrana tipicamente separa dois eletrólitos. Um eletrodo seletivo de íon como usado aqui tipicamente compreende uma parte de leitura, que preferivelmente compreende uma membrana tendo permeabilidade seletiva e um eletrodo de referência. A membrana é tipicamente uma membrana seletiva de íon, que é caracterizada por permeabilidades diferentes para diferentes tipos de íons. Preferivelmente, o pelo menos um eletrodo seletivo de íon do biorreator compreende uma membrana selecionada do grupo que consiste em uma membrana vítrea, uma membrana em estado sólido, uma membrana com base em líquido, e uma membrana de composto.

[00136] Em modalidades preferidas, o biorreator como descrito aqui compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, em que o pelo menos um eletrodo seletivo de íon compreende ou consiste em um sistema compreendendo uma membrana, preferivelmente uma membrana como descrito aqui, mais preferivelmente uma membrana ele- troquímica, tendo permeabilidades diferentes para diferentes tipos de íons, em que a membrana, preferivelmente uma membrana como descrito aqui, mais preferivelmente uma membrana eletroquímica, preferivelmente separa dois eletrólitos. Em uma forma de realização, a membrana compreende ou consiste em uma camada de um eletrólito sólido ou uma solução de eletrólito em um solvente imiscível com água. A membrana está preferivelmente em contato com uma solução de ele- trólito em um ou ambos os lados. Em uma modalidade preferida, o eletrodo seletivo de íon compreende um eletrodo de referência interno. Tal eletrodo de referência interno pode ser substituído em algumas modalidades, por exemplo por um contato metálico ou por um isolador e uma camada semicondutora.

[00137] Um eletrodo seletivo de íon permite a medição altamente sensível, rápida, exata e não destrutiva de atividades de íon ou concentrações de íon em diferentes meios. Além de medições diretas de atividades de íon ou concentrações de íon elas podem servir, em particular usando-se uma curva de calibração, para o monitoramento contínuo de mudanças de concentração, como elementos para o controle de dosagem de agentes ou como eletrodos indicadores muito exatos em titulações potenciométricas.

[00138] Em modalidades preferidas, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, preferivelmente como descrito aqui, para medir a concentração de um ou mais tipos de íons em pelo menos um compartimento do biorreator. Por exemplo, o pelo menos um eletrodo seletivo de íon pode ser usado para medir a concentração de um ou mais tipos de íons em um módulo de reação, um módulo de controle ou um módulo de refluxo do biorreator. Preferivelmente, o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é usado para medir a concentração de um ou mais tipos de íons no módulo de reação, mais preferivelmente no núcleo de reação ou no compartimento de filtração. Além disso, o pelo menos um eletrodo seletivo de íon pode ser compreendido em uma unidade de sensor do biorreator, preferivelmente como definido aqui. O eletrodo seletivo de íon pode ser localizado no biorreator propriamente dito, no biorreator ou fora do biorreator (por exemplo, conectado ao biorreator por um desvio). No contexto da presente invenção, a frase ‘o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon’ pode assim referir-se a uma situação, onde o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é uma parte do biorreator, ou a uma situação, onde o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é uma entidade física separada com respeito ao biorreator, mas que é usada em rela- ção ao biorreator.

[00139] De acordo com algumas modalidades, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, preferivelmente como descrito aqui, para medir a concentração de um ou mais tipos de íons em um líquido compreendido em pelo menos um compartimento do biorreator, em que o íon é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl- e PO43-.

[00140] De acordo com algumas modalidades, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, preferivelmente como descrito aqui, que é conectado a um potenciômetro, preferivelmente um potenciômetro de canais múltiplos (por exemplo, um CITSens Ion Potentiometer 6-channel, high-resolution; C-CIT Sensors AG, Switzerland).

[00141] Em uma modalidade preferida, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, em que o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é preferivelmente um eletrodo de tubo, mais preferivelmente selecionado do grupo que consiste em um eletrodo de tubo seletivo de Mg2+, um eletrodo de tubo seletivo de Na+, um eletrodo de tubo seletivo de Cl-, um eletrodo de tubo seletivo de PO43-, um eletrodo de tubo seletivo de pH e um eletrodo de tubo seletivo de Ca2+, preferivelmente usado em relação a um potenciômetro. Ainda mais preferivelmente, o biorreator compreende pelo menos um eletrodo se-letivo de íon, em que o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é prefe-rivelmente selecionado do grupo que consiste em um eletrodo de mini- tubo seletivo de Mg2+ CITSens Ion, um eletrodo de minitubo seletivo de Na+ CITSens Ion, um eletrodo de minitubo seletivo de Cl- CITSens Ion, um eletrodo de minitubo seletivo de PO43- CITSens Ion, um eletrodo de minitubo seletivo de pH CITSens Ion e um eletrodo de minitubo seletivo de Ca2+ CITSens Ion (todos da C-CIT Sensors AG, Switzerland), preferivelmente em relação a um potenciômetro, mais preferivelmente com um potenciômetro de canais múltiplos, tal como um Potenciôme- tro de 6 canais, de alta resolução CITSens Ion (C-CIT Sensors AG, Switzerland).

[00142] Eletrodos seletivos de íon têm numerosas vantagens para o uso prático. Por exemplo, eles não afetam a solução testada, permitindo assim medições não destrutivas. Além disso, eletrodos seletivos de íon são móveis, adequados para determinações diretas assim como sensores de titulação, e eficazes de custo. A principal vantagem do uso de um eletrodo seletivo de íon em um biorreator (por exemplo, um reator de transcrição) é a possibilidade de medir in situ sem coleta de amostra e em uma maneira não destrutiva.

[00143] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o biorreator, ou mais precisamente o módulo de controle do biorreator compreende uma unidade de sensor para a análise de parâmetros de processo críticos, tais como valor de pH, condutividade e concentração de nucleotídeo na mistura de reação otimizada por sequência. Preferivelmente, a unidade de sensor do biorreator compreende um sensor, tal como uma célula de fluxo UV para UV 260/280nm, para a medição em tempo real da concentração de nucleotídeo durante a reação de transcrição in vitro. Preferivelmente, o sensor da unidade de sensor mede a concentração de nucleotídeo, como um parâme-tro de processo, por análise fotométrica.

[00144] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o biorreator compreende um módulo de controle. A coleta e análises de dados pelo módulo de controle permitem o controle do sistema de bomba integrada (atuador) para alimentações repetidas de componentes da mistura de NTP otimizada por sequência ou componentes da mistura de reação otimizada por sequência, por exemplo, componentes tampão, RNA polimerase ou nucleotídeos. O controle e regulação rígidos permitem realizar a reação de transcrição in vitro sob uma condição no estado estacionário ideal resultando em produto de alto rendimento. Preferivelmente o módulo de controle controla a adição da mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência à mistura de reação otimizada por sequência, preferivelmente em que o dito biorreator compreende um atuador para adição da mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência à mistura de reação otimizada por sequência. Além disso, o atuador também pode adicionar outros componentes de reação da mistura de reação otimizada por sequência, tal como um componente tampão, ou Mg++, à mistura de reação de transcrição in vitro. De acordo com uma outra modalidade preferida da presente invenção, o bior- reator opera em um modo semicontínuo ou em um modo contínuo. O termo semicontínuo como usado aqui refere-se à operação da reação de transcrição in vitro como uma série repetitiva de reações de transcrição. Por exemplo, a reação é deixada proceder por um tempo finito neste ponto em que o produto é removido, novos reagentes adicionados, e a reação completa repetida. O termo fluxo contínuo como usado aqui refere-se a uma reação que é realizada continuamente em um núcleo de biorreator com reagentes suplementares constantemente adicionados através de uma linha de alimentação de entrada e produtos constantemente removidos através de uma porta de saída. Um reator de fluxo contínuo controla a liberação de reagente e remoção de produto através de taxas de fluxo de dispositivo controladas, o que é vantajoso para reações com limitações de reagente e produtos inibitó-rios.

[00145] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de RNA obtenível pelo método inventivo como divulgado aqui. Preferivelmente, o RNA obtido pelo método inventivo é caracterizado por uma atividade imunoestimuladora reduzida em comparação ao RNA obtido por métodos da técnica anterior, em particular quando comparado ao RNA obtido por um método de transcrição in vitro, em que a mistura de NTP não é otimizada com respeito à sequência de transcrito, tal como um método usando uma mistura de NTP equimolar padrão.

[00146] Em um outro aspecto, a presente invenção também refere- se ao uso de uma mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência otimizada para uma molécula de RNA de uma sequência dada para a síntese da dita molécula de RNA. Todas as definições e modalidades específicas referindo-se à mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência fabricada acima com respeito ao método da invenção também aplicam-se ao dito uso da invenção.

[00147] Especialmente, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, a mistura de NTP otimizada por sequência foi otimizada por um método compreendendo as etapas de: a) determinar a fração (1) de cada um dos quatro nucleotí- deos G, A, C e U na dita molécula de RNA, e b) preparar a mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência compreendendo os quatro trifosfatos de ribo- nucleosídeo (NTPs)GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de ribonucleosídeo na mistura de trifos- fato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA.

[00148] Em um outro aspecto, a presente invenção também refere- se a uma mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência para a síntese de uma molécula de RNA de uma sequência dada compreendendo os quatro trifosfatos de nucleosídeo GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro trifosfatos de nucleosídeo na mistura de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na dita molécula de RNA.

[00149] Em um outro aspecto, a presente invenção também refere- se a um kit compreendendo uma mistura de trifosfato de ribonucleosí- deo (NTP) otimizada por sequência otimizada para uma molécula de RNA de uma sequência dada como definido acima. A mistura de NTP otimizada por sequência pode ser fornecida em um tubo contendo todos os quatro tipos de NTPs (GTP, ATP, CTP e UTP) ou cada NTP em um tubo separado. Todas as definições ou modalidades específicas feitas acima com respeito ao método da invenção também aplicam-se ao dito kit da invenção.

Breve Descrição das Figuras

[00150] As figuras mostradas no seguinte são meramente ilustrativas e devem descrever a presente invenção em um outro modo. Estas figuras não devem ser interpretadas como limitando a presente invenção a isto.

[00151] Figura 1: Sequência de mRNA otimizada por G/C de R1871 que codifica antígeno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA), que corresponde à SEQ ID NO: 1.

[00152] Figura 2: Sequência de mRNA otimizada por G/C de R2988 que codifica luciferase de Photinus pyralis (PpLuc), que corresponde à SEQ ID NO: 2.

[00153] Figura 3: Sequência de mRNA otimizada por G/C de R1626 que codifica peptídeo de sinal de Mucina-1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 (EGFR/Mucina-1) de Homo sapiens, que corresponde à SEQ ID NO: 3.

[00154] Figura 4: Sequência de RNA imunoestimulador que não de codificação de R2025, que corresponde à SEQ ID NO: 4.

[00155] Figura 5: Rendimentos de RNA com o passar do tempo para mRNA que codifica HsPSCA (R1871) e EGFR/Mucina-1 (R1626). mRNAs foram sintetizados por transcrição in vitro como mostrado no exemplo 1. (A) O rendimento de RNA das reações de transcrição padrão atinge depois de cerca de 30 minutos um platô de aprox. 1,4 mg/ml de RNA para o RNA de 5337 nucleotídeos de comprimento que codifica EGFR/Mucina-1 (R1626) e de aprox. 1,8 mg/ml de RNA para o RNA de 589 nucleotídeos de comprimento que codifica HsPSCA (R1871). (B) O rendimento de RNA de reações de transcrição otimizadas por sequência é significantemente mais alto comparado a reações de transcrição padrão. Depois de 60 minutos (R1626) e 120 minutos (R1871) ambos os RNAs atingem um platô similar de aproximadamente 3,9 mg/ml de RNA. Média e desvio padrão de triplicatas são mostrados.

[00156] Figura 6: Comparação de rendimentos de RNA obtidos a partir do uso de misturas de nucleotídeo padrão e otimizadas por sequência (CapNTP) para mRNA que codifica HsPSCA (R1871), Luciferase (PpLuc, R2988) e EGFR/Mucina-1 (R1626). O experimento foi realizado como descrito no exemplo 1 (tempo de reação de 5 horas).

[00157] Os rendimentos de RNA para as três moléculas de RNA diferentes de comprimentos diferentes são aproximadamente os mesmos para cada tipo de reação de transcrição. Entretanto, rendimentos diferentes são obtidos dependendo da mistura de nucleotídeo usada para a transcrição in vitro.

[00158] A transcrição padrão (igual à concentração de NTP para cada NTP) produz cerca de 1,5 mg/ml de RNA, transcrição com uma mistura de Cap-NTP concentrada de duas vezes (2xCapNTP) de cerca de 3,0 mg/ml de RNA, transcrição otimizada por sequência (seq-opt) de cerca de 3,9 mg/ml de RNA e transcrição otimizada por sequência com alimentação de NTP de cerca de 6,75 mg/ml de RNA. Média e desvio padrão de triplicatas são mostrados.

[00159] Figura 7: Análise da eficiência de encapuzamento obtida por transcrição padrão e otimizada por sequência in vitro de mRNA de Luciferase de Photinus pyralis (PpLuc).

[00160] RNAs foram clivados com a ribozima cabeça de martelo HHNUH2d como descrito no exemplo 2 e os fragmentos de RNA resultantes foram separados desnaturando-se eletroforese em gel de polia- crilamida (dPAGE). RNAs não encapuzados (nenhum capuz) e enzi- maticamente encapuzados (capuz E) serviram como controles.

[00161] Eficiências de encapuzamento comparáveis foram obtidas quando do uso de misturas de NTP padrão e otimizadas por sequência para a síntese de mRNAs que codificam Luciferase de Photinus pyralis (PpLuc).

[00162] Figura 8: Comparação de rendimentos de RNA usando UTP e pseudo-UTP em misturas de CapNTP otimizadas por sequência para mRNA (R1626) de peptídeo de sinal de Mucina-1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 (EGFR/Mucina-1) e mRNA (R1871) de antígeno de célula-tronco da próstata (HsPSCA). Os experimentos foram realizados como descrito no exemplo 3. Nas misturas UTP foi substituído com 0 %, 10 %, ou 100 % de pseudo-UTP (psU) como indicado. A média e desvio padrão de triplicatas são mostrados.

[00163] Figura 9: Comparação de rendimentos teóricos e reais de RNA para o imunoestimulador de RNA que não de codificação R2025 usando misturas de NTP padrão (iguais) e otimizadas por sequência (seqopt) na presença de nucleotídeos adicionais (concentração de NTP total de 13,45 mM; 13,45 mM de capuz ou GTP para misturas iguais (4 vezes de excesso de GTP); 11,2 mM de capuz ou GTP para misturas de NTP otimizadas por sequência (4 vezes de excesso de GTP)). Barras brancas: rendimentos reais. Barras pretas: rendimentos teóricos. Os experimentos foram realizados como descrito no exemplo 4. Média e desvio padrão de triplicatas são mostrados.

[00164] Figura 10: Comparação de rendimentos teóricos e reais de RNA para o mRNA que codifica antígeno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA) (R1871) usando razões de NTP padrão (iguais) e otimizadas por sequência na presença de nucleotídeos adicionais (concentração de NTP total de 13,45 mM; 13,45 mM de capuz ou GTP para misturas iguais (4 vezes de excesso de GTP); 13,7 mM de capuz ou GTP para misturas de NTP otimizadas por sequência (4 vezes de excesso de GTP)). Barras brancas: rendimentos reais. Barras pretas: rendimentos teóricos. Os experimentos foram realizados como descrito no exemplo 4.

[00165] Figura 11: Eficiências de transcrição usando misturas de NTP otimizadas por sequência de Na-NTPs ou Tris-NTPs, na presença de sais adicionados respectivos (NaCl; Tris/HCl, pH 7,5). O experimento foi realizado como descrito no exemplo 5.

[00166] Figura 12: Monitoramento do progresso da reação de transcrição otimizada por sequência medindo-se a quantidade de RNA produzido e o consumo de mistura de nucleotídeo. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 6.

[00167] Figura 13: Rendimentos de RNA para mRNA que codifica luciferase de Photinus pyralis (PpLuc) (R2988) dependendo da concentração de capuz. O mRNA foi sintetizado por transcrição in vitro usando concentrações de NTP totais de 4 mM e 13,45 mM da mistura de NTP otimizada por sequência de PpLuc na presença de concentrações variadas de análogo de capuz. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 7. (A) RNA Real [mg/ml]. (B) Rendimento de RNA relativo [%].

[00168] Figura 14: Rendimentos de RNA para mRNA que codifica antígeno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA) (R1871) dependendo da concentração de capuz. O mRNA foi sinteti- zado por transcrição in vitro usando concentrações de NTP totais de 2 mM, 4 mM e 13,45 mM da mistura de NTP otimizada por sequência de HsPSCA na presença de concentrações variadas de análogo de capuz. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 7. (A) Rendimento de RNA real [mg/ml]. (B) Rendimento de RNA relativo [%].

[00169] Figura 15: Rendimentos de RNA para mRNA que codifica antígeno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA) (R1871) dependendo da concentração de nucleotídeo de partida de GTP. O mRNA foi sintetizado por transcrição in vitro usando concentrações de NTP totais de 13,45 mM da mistura de NTP otimizada por sequência de HsPSCA à qual o nucleotídeo de partida de GTP foi adicionado até uma concentração de 20 mM. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 8. (A) Rendimento de RNA real [mg/ml]. (B) Rendimento de RNA relativo [%].

[00170] Figura 16: Rendimentos de RNA para mRNA que codifica luciferase de Photinus pyralis (PpLuc) (R2988) dependendo da concentração de nucleotídeo de partida de GTP. O mRNA foi sintetizado por transcrição in vitro usando concentrações de NTP totais de 13,45 mM da mistura de NTP otimizada por sequência de PpLuc à qual o nucleotídeo de partida de GTP foi adicionado até uma concentração de 20 mM. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 8. (A) Rendimento de RNA real [mg/ml]. (B) Rendimento de RNA relativo [%].

[00171] Figura 17: Rendimentos de RNA para mRNA que codifica EGFR/Mucina-1 (R1626) dependendo da concentração de nucleotídeo de partida de GTP. O mRNA foi sintetizado por transcrição in vitro usando concentrações de NTP totais de 13,45 mM da mistura de NTP otimizada por sequência de EGFR/Mucina-1 à qual o nucleotídeo de partida de GTP foi adicionado até uma concentração de 20 mM. O experimento foi realizado como descrito no exemplo 8. (A) Rendimento de RNA real [mg/ml]. (B) Rendimento de RNA relativo [%].

[00172] Figura 18: Biorreator em uma ilustração esquemática, incluindo módulos para processo contínuo ou semicontínuo, com DNA linear imobilizado por resina como padrão para a reação de transcrição.

[00173] Figura 19: Imunoestimulação reduzida por RNA sintetizado com uma mistura de NTP otimizada por sequência comparada a uma mistura de NTP equimolar padrão. Níveis de citocina e quimiocina em sobrenadantes celulares foram medidos como descrito no exemplo 10.

[00174] Figura 20: Sequência de mRNA otimizada por G/C que codifica HA a partir de Influenza A subtipo H1N1 (Netherlands 2009), que corresponde à SEQ ID NO: 6 (Exemplo 11).

[00175] Figura 21: Rendimentos de RNA com o passar do tempo para mRNA que codifica HA (Exemplo 11). O rendimento de RNA em pontos no tempo diferentes é mostrado para o RNA obtido por transcrição in vitro em um biorreator usando uma mistura de NTP padrão (TS(1)), por transcrição otimizada por sequência em um biorreator sem alimentação (TS(2)), por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com alimentação (TS(3)), ou por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com concentração de RNA polimerase T7 reduzida e concentração de padrão reduzida (TS(4)), respectivamente.

[00176] Figura 22: Expressão superficial da proteína HA como determinado usando-se análise citométrica de fluxo (Exemplo 11). A média geométrica da intensidade de fluorescência (GMFI) foi determinada para células transfectadas com RNA obtido por transcrição in vitro em um biorreator usando uma mistura de NTP padrão (TS(1)), por trans-crição otimizada por sequência em um biorreator sem alimentação (TS(2)), por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com alimentação (TS(3)), ou por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com concentração de RNA polimerase T7 reduzida e concentração de padrão reduzida (TS(4)), respectivamente.

[00177] Figura 23: Imunoestimulação por RNA sintetizado por transcrição in vitro em um biorreator usando uma mistura de NTP padrão (TS(1)), por transcrição otimizada por sequência em um biorrea- tor sem alimentação (TS(2)), por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com alimentação (TS(3)), ou por transcrição otimizada por sequência em um biorreator com concentração de RNA polime- rase T7 reduzida e concentração de padrão reduzida (TS(4)), respectivamente. Níveis de citocina e quimiocina em sobrenadantes celulares foram medidos como descrito no Exemplo 11.

Exemplos

[00178] Os exemplos mostrados no seguinte são meramente ilustrativos e devem descrever a presente invenção em um outro modo. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitando a presente invenção a estes.

Exemplo 1: Preparação do mRNA 1. Preparação de construções de DNA e mRNA

[00179] Para o presente exemplo sequências de DNA que codificam antígeno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPS- CA) mRNA (R1871), mRNA de Luciferase de Photinus pyralis (PpLuc) (R2988) e peptídeo de sinal de Mucina-1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 (EGFR/Mucina-1) (R1626) foram preparadas e usadas para reações de transcrição in vitro subsequentes.

[00180] De acordo com uma primeira preparação, um vetor para transcrição in vitro foi construído contendo um promotor de T7 seguido por uma sequência que codifica as proteínas mencionadas acima. As construções foram preparadas modificando-se a sequência de codificação do tipo selvagem introduzindo-se uma sequência otimizada por GC para estabilização, seguido por uma sequência de estabilização derivada a partir da alfa-globina-3’-UTR (muag (alfa-globina-3’-UTR mutada)), um trecho de 64 adenosinas (sequência de poli-A), um trecho de 30 citosinas (sequência de poli-C), e uma forma de haste e ansa de histona.

[00181] Além disso, um vetor para transcrição in vitro foi construído contendo um promotor de T7 seguido pela sequência que codifica um RNA imunoestimulador (R2025), que não codifica uma proteína.

[00182] As construções de RNA e suas composições de nucleotí- deo são listadas na tabela 1 e Tabela 2, respectivamente. Tabela 1: RNAs

Tabela 2: Composição de nucleotídeo de RNAs

2. Transcrição in vitro

[00183] Os respectivos plasmídeos de DNA preparados de acordo com o parágrafo 1 foram transcritos in vitro usando T7 polimerase. Subsequentemente o mRNA foi purificado usando PureMessenger® (CureVac, Tübingen, Germany; WO2008/077592A1).

[00184] O volume de reação de transcrição padrão foi de 20 μl. Pa- ra a purificação por HPLC subsequente de mRNAs, por exemplo, para análise de capuz, reações de 1 ml foram estabelecidas.

[00185] Padrões de plasmídeo de DNA linearizado (50 μg/ml) foram transcritos a 37°C por três horas (ou como indicado) em 80 mM de HEPES/KOH, pH 7,5, 24 mM de MgCl2, 2 mM de espermidina, 40 mM de DTT, 5 U/ml de pirofosfatase (Thermo Fisher Scientific), 200 U/ml de inibidor de RNase Ribolock (Thermo Fisher Scientific), 5000 U/ml de T7 RNA polimerase (Thermo Fisher Scientific). Trifosfatos de ribo- nucleosídeo (NTPs) foram adicionados de acordo com as seções 3 a 7 abaixo, respectivamente. A seguir da transcrição, o padrão de DNA foi removido por digestão de DNaseI (Roche) (100 U/ml, 1 mM CaCl2, 30 minutos a 37°C).

[00186] RNAs foram precipitados em LiCl 2,86 M em um volume de reação de 3,45 vezes por 16 horas a -20°C, seguido por centrifugação (30 minutos, 16.000 g, 4°C). Pelotas foram lavadas em cinco volumes de reação de transcrição de etanol a 75 % (inverter os tubos, centrifugar por 5 minutos, 16.000 g, 4°C), secas e redissolvidas em 2,5 volumes de H2O de reação de transcrição.

[00187] Rendimentos de RNA foram determinados por intermédio de medição de absorvância em 260 nm usando um Espectrofotômetro NanoDrop®. Uma unidade de absorvância em 260 nm corresponde a 40 ng/μl de RNA (1 A260 = 40 ng/μl de RNA).

[00188] Para determinar o número de nucleotídeos incorporados, a quantidade total de RNA produzido foi convertida ao número de moléculas produzidas dividindo-se pela massa molecular. A multiplicação pelo número do nucleotídeo respectivo presente na sequência produziu os nucleotídeos incorporados. Para determinar os nucleotídeos remanescentes (em %) no final da reação de transcrição, este número foi dividido pelo número de nucleotídeos disponíveis, de acordo com: Equação (1):

[00189] Rendimento de RNA indica o número de moléculas produzidas por reação (nmol). A concentração de partida de NTP [NTP (início)] é indicada em mM, o volume de reação em μl.

[00190] Para calcular a concentração remanescente dos nucleotí- deos respectivos, NTPs disponíveis no começo da reação foram multiplicados pela porcentagem de NTPs remanescentes no final de uma reação de transcrição (ver acima) de acordo com: Equação (2):

3. Transcrição in vitro padrão na presença de análogo de capuz

[00191] Para a produção de RNAs de capuz 5’ usando análogo de capuz, a transcrição padrão foi realizada com 5,8 mM de análogo de capuz m7G(5')ppp(5')G, 4 mM de ATP, 4 mM de CTP, 4 mM de UTP, e 1,45 mM de GTP (todos da Thermo Fisher Scientific) (ver Tabela 3). O análogo de capuz e GTP foram usados em uma razão de 4:1. Tabela 3: Concentrações de nucleotídeo (mM) para reações de transcrição in vitro padrão

Tabela 4: Quantidade de nucleotídeos remanescentes no final das reações de transcrição padrão (depois de 2,5 horas, em porcentagem de nucleotídeos no início da reação)

Tabela 5: Concentrações de nucleotídeo (mM) remanescentes no final de uma reação de transcrição padrão in vitro (depois de 2,5 horas)

[00192] O rendimento típico de transcritos de RNA em uma transcrição padrão é de cerca de 1,5 mg/ml de reação. 4. Transcrição in vitro na presença de análogo de capuz usando con-centrações duplas de análogo de capuz e NTPs (2xCapNTP)

[00193] Concentrações de análogo de capuz e NTP foram duplicadas comparado a condições de transcrição padrão, de modo que reações fossem realizadas em 11,6 mM de análogo de capuz m7G(5')ppp(5')G, 8 mM de ATP, 8 mM de CTP, 8 mM de UTP, e 2,9 mM de GTP (todos da Thermo Fisher Scientific) (ver Tabela 3). O análogo de capuz e GTP foram usados em uma razão de 4:1. Tabela 6: Concentrações de nucleotídeo (mM) para reações de transcrição in vitro de 2xCapNTP

Tabela 7: Quantidade de nucleotídeos remanescentes no final de reações de transcrição de 2xCapNTP (depois de 2,5 horas, em porcentagem de nucleotídeos no início da reação)

[00194] O rendimento típico de uma transcrição usando concentrações duplas de análogo de capuz e NTPs é cerca de 3 mg/ml de reação. 5. Transcrição in vitro otimizada por sequência na presença de análogo de capuz

[00195] Para reações de transcrição in vitro otimizadas por sequência a concentração de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) foi calculada para cada sequência individual de acordo com a composição de nucleotídeo da sequência (Tabela 2) de modo que a concentração total de todos para NTPs foi 13,45 mM como em reações de transcrição padrão. A concentração do análogo de capuz foi quatro vezes mais alta do que a concentração calculada para GTP de modo que uma razão de capuz/GTP de 4:1 fosse obtida. Tabela 8: Concentrações de nucleotídeo (mM) para transcrição in vitro otimizada por sequência

Tabela 9: Quantidade de nucleotídeos remanescentes no final da transcrição otimizada por sequência (depois de 2,5 horas, em porcentagem de nucleotídeos no início da reação)

Tabela 10: Concentrações de nucleotídeo (mM) remanescentes no final de uma reação de transcrição in vitro otimizada por sequência (depois de 2,5 horas)

EGFR/Mucina-1 16,40 0,60 0,74 0,40 0,25

[00196] O rendimento típico de RNA de uma transcrição usando análogo de capuz e NTPs otimizados por sequência é cerca de 3,9 mg/ml de reação.

6. Transcrição in vitro otimizada por sequência na presença de análogo de capuz com alimentação de NTP

[00197] Para reações de transcrição in vitro otimizadas por sequência a concentração de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) foi calculada para cada sequência individual de acordo com a composição de nucleotídeo da sequência (Tabela 2) de modo que a concentração total de todos para NTPs fosse 13,45 mM como em transcrições padrão. A concentração do análogo de capuz foi quatro vezes mais alta do que a concentração calculada para GTP de modo que uma razão de ca- puz/GTP de 4:1 fosse obtida (ver Tabela 7).

[00198] Para a alimentação de NTP, 13,45 mM de NTPs sem análogo de capuz foram adicionados (em um volume de 2,69 μl) à mistura de reação depois de 2,5 horas. Como neste ponto no tempo >99 % de análogo de capuz ainda estava presente na reação de transcrição, a razão de Capuz/GTP a 4:1 pode ser mantida. Tabela 11: Quantidade de nucleotídeos remanescentes no final da transcrição otimizada por sequência com alimentação de NTP (depois de 5 h, em porcentagem de nucleotídeos no início da reação)

[00199] O rendimento típico de RNA de uma transcrição usando análogo de capuz e NTPs otimizados por sequência seguido por alimentação de NTP é em torno de 6,75 mg/ml de reação.

7. Transcrição in vitro padrão de RNAs não encapuzados

[00200] Para a produção de RNAs, 5’ trifosfato não encapuzados, a transcrição foi realizada na presença de 4 mM de cada ATP, GTP, CTP e UTP (todos da Thermo Fisher Scientific). RNAs não encapuza- dos foram usados como controle no ensaio de análise de encapuza- mento (Figura 7).

8. Encapuzamento enzimático de mRNA

[00201] O encapuzamento enzimático foi realizado usando o Sistema de Encapuzamento de m7G ScriptCapTM (Cellscript, Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Em breve, por reação, 60 μg de RNAs não encapuzados foram desnaturados por calor (10 minutos, 65°C) em um volume de 68,5 μl e imediatamente resfriados em gelo (5 minutos). A seguir da adição dos componentes de reação (1x tampão de encapuzamento ScriptCap, 1 mM de GTP, 0,1 mM de SAM, 1000 U/ml de Inibidor de RNase ScripGuard, 400 U/ml de Enzima de encapuzamento ScriptCap) a um volume final de 100 μl, reações foram incubadas por 1 hora a 37°C. RNAs foram precipitados em LiCl 2,86 M em um volume de reação de 3,45 vezes por 16 horas a -20°C, seguido por centrifugação (30 minutos, 16.000 g, 4°C). Pelotas foram lavadas em 0,5 volumes de reação etanol a 75 % (inverter, centrifugar 5 minutos, 16000 g, 4°C), secas e redissolvidas em H2O. RNAs enzimaticamente encapuzados foram usados como controle no ensaio de análise de encapuzamento (Figura 7).

9. Resultados

[00202] O rendimento de RNA de reações de transcrição in vitro padrão e otimizadas por sequência foi determinado em pontos no tempo definidos por até duas horas como descrito acima (parágrafo 2).

[00203] Como pode ser observado a partir da Figura 5A, depois de cerca de 30 minutos o rendimento de RNA das reações de transcrição padrão atinge um platô de cerca de 1,4 mg/ml para o RNA de 5337 nucleotídeos de comprimento que codifica EGFR/Mucina-1 (R1626) e de cerca de 1,8 mg/ml para o RNA de 589 nucleotídeos de comprimento que codifica HsPSCA (R1871).

[00204] Como pode ser observado a partir da Figura 5B, o rendimento de RNA das reações de transcrição otimizadas por sequência é significantemente mais alto comparado a reações de transcrição padrão. Depois de 60 minutos (R1626) e 120 minutos (R1626), respectivamente, ambos os RNAs atingem um platô similar de aproximadamente 3,9 mg/ml.

[00205] Como pode ser observado a partir da Figura 6, os rendimentos de RNA para as três moléculas de RNA diferentes de comprimento diferente são aproximadamente os mesmos para cada tipo de reação de transcrição depois de cinco horas.

[00206] A transcrição padrão (concentração de NTP igual) produz cerca de 1,5 mg/ml de RNA, transcrição com uma mistura de Cap-NTP concentrada de duas vezes (2xCapNTP) cerca de 3,0 mg/ml de RNA, transcrição otimizada por sequência cerca de 3,9 mg/ml de RNA e transcrição otimizada por sequência com alimentação de NTP cerca de 6,75 mg/ml de RNA.

[00207] Assim, a reação de transcrição otimizada por sequência resulta em um aumento de cerca de três vezes em rendimento de RNA comparada a reações de transcrição padrão. Este rendimento pode ser aumentado ainda em torno de duas vezes suplementando-se a reação com NTP (alimentação de NTP). Exemplo 2: Ensaio de análise de capuz

1. Princípio do ensaio

[00208] A ribozima cabeça de martelo HHNUH2d (5’- GCAUGGCUGAUGAGGCCUCGACCGAUAGGUCGAGGCCGAAAAG CUUUCUCCC-3’) (SEQ ID NO: 5) foi incubada com os transcritos de RNA in vitro do exemplo 1 e produtos de clivagem foram separados desnaturando-se eletroforese em gel de poliacrilamida (dPAGE).

2. Reação de clivagem de ribozima

[00209] Por reação, 10 pmol de HHNUH2d e 10 pmol do RNA de geração 4 respectivo foram recozidos em 0,625 mM de EDTA em um volume total de 6 μl (2 minutos a 95°C, 0,1°C/segundos a 25°C, 10 minutos a 25°C). Depois da adição de 4 μl de MgCh a 100 mM, 125 mM de Tris/HCl, pH 7,5 (concentração final de 40 mM de MgCl2, 50 mM de Tris/HCl), a reação foi incubada a 25°C por uma hora. Para a análise por intermédio de PAGE, a reação de 1x foi interrompida com 30 μl de formamida a 95 %, 20 mM de EDTA.

3. Separação de gel, quantificação de produtos de clivagem e cálculo do grau de encapuzamento

[00210] As reações interrompidas foram desnaturadas por calor (aquecidas até 80°C por 2 minutos, imediatamente colocadas em gelo por 5 minutos) e separadas em um gel de poliacrilamida desnaturante a 20 % de 10 cm x 8 cm x 1,0 mm (ureia 8 M (AppliChem), 20 % de acrilamida:bisacrilamida a 19:1 (AppliChem), 1x TBE, 1 % de APS (AppliChem), 0,1 % de TEMED (AppliChem); 180 V, 2 horas, Mini- PROTEAN® Tetra Cell (BioRad)). Géis foram tingidos por 10 minutos em SYBR Gold a 1:10.000 (Invitrogen) em TBE e documentados em um sistema de documentação de gel VX2 E-BOX com Transiluminador UV de 312 nm (Peqlab) (excitação máxima para SYBR Gold: ~300 nm, emissão: ~537 nm).

[00211] Para determinar a proporção encapuzada nas preparações de mRNA, faixas dos respectivos produtos de clivagem 13-mer (derivado a partir da fração não encapuzada) ou 14-mer (derivado a partir da fração encapuzada) foram quantificados usando o software Quantity One 1-D Analysis (BioRad).

[00212] Os graus de RNA encapuzado e não encapuzado, respectivamente, foram calculados de acordo com: Equação (4):

4. Resultados

[00213] Como pode ser observado na Figura 7, eficiências de en- capuzamento comparáveis foram obtidas para misturas de NTP padrão e otimizadas por sequência para mRNA de Luciferase de Photi- nus pyralis (PpLuc). Exemplo 3: Comparação de rendimentos de RNA usando UTP e pseudo-UTP em misturas de nucleotídeo otimizadas por sequência

[00214] Reações de transcrição in vitro podem ser realizadas substituindo-se um ou mais dos quatro nucleotídeos ATP, GTP, CTP e UTP por análogos de nucleotídeo. Exemplos de tais NTPs modificados são trifosfato de pseudouridina (psU ou Φ) e trifosfato de 5-metilcitidina (5mC). A porcentagem do nucleotídeo modificado na mistura pode ser variada a partir de 0 % a 100 % do nucleotídeo natural que ele substitui.

[00215] Para testar se é possível usar nucleotídeos modificados tais como trifosfato de pseudouridina (psU) em misturas de nucleotídeo otimizadas por sequência, UTP foi substituído por 10 %, e 100 % de trifosfato de pseudouridina. Em uma reação de controle, 100 % de UTP foram usados. Transcrição in vitro otimizada por sequência na presença de análogo de capuz

[00216] Para reações de transcrição in vitro otimizadas por sequência a concentração de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) foi calculada para cada sequência individual de acordo com a composição de nucleotídeo da sequência (Tabela 2) de modo que a concentração total de todos para NTPs foi 13,45 mM como em reações de transcrição padrão. A concentração do análogo de capuz foi quatro vezes mais alta do que a concentração calculada para GTP de modo que uma razão de CAP/GTP de 4:1 foi obtida.

Resultados

[00217] Como pode ser observado a partir da Figura 8, usar UTP e pseudo-UTP em misturas de otimizadas por sequência com análogo de capuz (misturas de CapNTP) resulta em rendimentos de RNA comparáveis independente da porcentagem de pseudo-UTP na mistura de nucleotídeo otimizada por sequência. Isto foi demonstrado para dois mRNAs diferentes que codificam peptídeo de sinal de Mucina- 1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 (EGFR/Mucina-1) (R1626) e antígeno de célula-tronco da próstata (HsPSCA) mRNA (R1871), respectivamente.

Exemplo 4: Comparação dos rendimentos de RNA teóricos e reais usando misturas de nucleotídeo padrão e otimizadas por sequência

[00218] Reações de transcrição foram montadas como descrito no exemplo 1, Seção 2. Os NTPs foram igualmente distribuídos (equimo- lares) ou distribuídos de acordo com a sequência do RNA produzido como descrito no exemplo 1, Seção 5. Para algumas reações, um nu- cleotídeo adicional (GTP ou análogo de capuz) foi adicionado em uma razão de 4:1 sobre GTP.

Resultados

[00219] Como pode ser observado a partir da Figura 9, o rendimento de RNA real para R2025 pode ser aumentado para misturas de NTP otimizadas por sequência comparado a misturas de NTP padrão (mistura de NTP igual).

[00220] Como pode ser observado a partir da Figura 10, o rendimento de RNA real para o mRNA que codifica antígeno de célula- tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA; R1871) pode ser aumentado para misturas de NTP otimizadas por sequência comparado a misturas de NTP padrão (mistura de NTP igual).

Exemplo 5: Influência de contra-íons de NTP sobre rendimentos de RNA

[00221] O impacto de contraíons de NTP sobre o rendimento de RNA foi investigado usando mRNA que codifica peptídeo de sinal de Mucina-1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 de Homo sapiens (EGFR/Mucina-1, R1626) como exemplo. Reações de transcrição foram montadas como descrito no exemplo 1, Seção 2, usando razões de NTP otimizada por sequência e uma concentração de NTP total de 13,45 mM. NTPs continham Na+ ou Tris+ (ambos da Thermo Scientific) como contraíons. Além disso, reações de Na-NTP foram suplementadas com concentrações diferentes de NaCl, reações de Tris-NTP com Tris/HCl. Depois de 2,5 horas de tempo de reação, os RNAs foram purificados e sua concentração foi determinada como descrito no exemplo 1, Seção 2.

Resultados

[00222] Como pode ser observado a partir da Figura 11, o rendimento de RNA para peptídeo de sinal de Mucina-1/receptor de fator de crescimento epidérmico/proteína de fusão de Mucina-1 de Homo sapiens (EGFR/Mucina-1, R1626) usando uma mistura de NTP otimizada por sequência permaneceu aproximadamente o mesmo até uma concentração de 150 mM de Tris-HCl. Ao contrário, o rendimento de RNA começou a declinar em concentrações de NaCl acima de 75 mM.

[00223] O impacto negativo de concentrações de NaCl altas sobre rendimentos de RNA foi descrito (por exemplo, Kern et al., 1997. Bio- technol. Prog., 13, 747 - 756; US 6.586.218 B2). Concentrações altas de Na-NTPs, especialmente como consequência quando da adoção de uma estratégia de alimentação de NTP, podem, portanto, resultar em rendimentos de RNA diminuídos. Esta limitação deve ser evitada com Tris-NTPs, porque a atividade de polimerase não é afetada por concentrações de Tris/HCl altas.

Exemplo 6: Monitoramento do progresso da reação de transcrição

[00224] Reações de transcrição em escala maior (350 μl) de antí- geno de célula-tronco da próstata de Homo sapiens (HsPSCA; R1871) foram montadas como descrito no exemplo 1, Seção 2, usando razões de NTP otimizado por sequência e uma concentração de NTP total de 13,45 mM de Tris-NTPs. Análogo de capuz estava presente em um excesso a 4:1 de GTP. Em pontos no tempo definidos (15/30/60/90/ 120 minutos depois do início da reação), uma amostra de 20 μl foi tomada, o RNA purificado e sua absorvância em 260 nm determinada como descrito no exemplo 1, Seção 2. Uma segunda amostra de 40 μl foi tomada no mesmo ponto no tempo e foi filtrada através de um dis-positivo Microcon YM10 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) (16000*g, 5 minutos, 17°C). A absorvância do fluxo passante em 260 nm, correspondendo a análogo de capuz e NTPs não incorporados, foi determinada usando um Espectrofotômetro NanoDrop® de acordo com as instruções do fabricante (T009-Technical Bulletin NanoDrop 1000 % 8000; Thermo Fisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA). Resultados

[00225] Como pode ser observado a partir da Figura 12, o uso de uma mistura de ribonucleotídeo otimizada por sequência permite medir o progresso da reação de transcrição in vitro determinando-se a concentração de nucleotídeo total remanescente em pontos no tempo definidos. A diminuição na concentração de NTP total diretamente correlaciona-se com a quantidade de RNA sintetizado.

[00226] Assim, o progresso da reação de transcrição pode ser exatamente determinado como uma função da concentração de NTP total medida em um ponto no tempo dado e calculando-se os moles de NTPs consumidos. Com base nesta informação torna-se possível calcular a quantidade de RNA sintetizado.

[00227] Este procedimento é especialmente útil para monitorar continuamente o progresso de uma reação de transcrição, por exemplo em um reator de transcrição. Isto não seria possível quando uma mistura de NTP padrão é usada porque o consumo de NTPs não refletiria tão facilmente a quantidade de RNA sintetizado.

Exemplo 7: Rendimentos de RNA para misturas de nucleotídeo otimizadas por sequência como uma função de concentração de capuz

[00228] Reações de transcrição foram montadas como descrito no exemplo 1, seção 2, e foram realizadas em concentrações de NTP totais de 2 mM, 4 mM, e 13,45 mM de NTPs como indicado nas Figuras 14 e 15. Os NTPs foram distribuídos de acordo com a sequência do RNA produzido como descrito no exemplo 1, seção 5 (mistura de ribo- nucleotídeo otimizada por sequência para PpLuc e HsPSCA). As reações foram realizadas em várias concentrações (0, 0,25, 2,0, 10, 16 e 20 mM) do Análogo de capuz (m7G(5')ppp(5')G) como indicado nas Figuras 14 e 15.

Resultados

[00229] Como pode ser observado a partir da Figura 13A, o rendimento de RNA real para mRNA de PpLuc aumenta com concentrações de análogo de capuz mais altas. O rendimento de RNA real é mais alto para a concentração de NTP total de 13,45 mM comparado a 4 mM. A Figura 13B mostra que o rendimento de RNA relativo para PpLuc mRNA aumenta até uma concentração de análogo de capuz de aproximadamente 16 mM. O aumento no rendimento de RNA relativo é mais forte para a concentração de NTP baixa (4 mM) do que para a concentração de NTP alta (13,45 mM).

[00230] Como pode ser observado a partir da Figura 14A, o rendimento de RNA real para mRNA de HsPSCA aumenta com concentra- ções de análogo de capuz mais altas. O rendimento de RNA real é mais alto para a concentração de NTP total de 13,45 mM comparado a 4 mM e 2 mM. A Figura 14B mostra que o rendimento de RNA relativo para mRNA de HsPSCA aumenta até uma concentração de análogo de capuz de aproximadamente 16 mM. O aumento mais forte do rendimento de RNA relativo é observado para a concentração de NTP mais baixa testada (2 mM).

[00231] Estes resultados demonstram que o uso de uma mistura de ribonucleotídeo otimizada por sequência leva a uma eficiência aumentada de síntese de RNA encapuzado mesmo em concentrações de nucleotídeo totais iniciais baixas (por exemplo, em 2 mM). Ao contrário, foi previamente sugerido que para um rendimento de RNA aumentado concentrações altas de nucleotídeos totais, na ordem de 12 mM a 40 mM, são necessárias (US6586218).

[00232] A comparação de mRNA de PpLuc (1870 nucleotídeos) e mRNA de HsPSCA (589 nucleotídeos) mostra que os rendimentos de RNA relativos são independentes dos comprimentos de RNA para uma concentração de NTP total definida. Exemplo 8: Rendimentos de RNA para misturas de nucleotídeo otimizadas por sequência como uma função da concentração de nucleotí- deo de partida de GTP

[00233] Reações de transcrição foram montadas como descrito no exemplo 1, seção 2, e foram realizadas em uma concentração de NTP total da mistura de nucleotídeo otimizada por sequência de 13,45 mM para P625, P1040 e P532.

[00234] Os NTPs foram distribuídos de acordo com a sequência do RNA produzido como descrito no exemplo 1, seção 5 (mistura de ribo- nucleotídeo otimizada por sequência para PpLuc, HsPSCA e EGFR/ Mucina-1). As reações foram realizadas adicionando-se concentrações definidas (0, 0,25, 2,0, 10, 16 e 20 mM) de nucleotídeo de partida de GTP à mistura de NTP otimizada por sequência como indicado nas Figuras 16 a 18.

Resultados

[00235] Como pode ser observado a partir da Figura 15A e 15B, o rendimento de RNA real e relativo para mRNA de HsPSCA aumenta até uma concentração de nucleotídeo de partida de GTP de aproximadamente 10 mM e declina em concentrações de GTP mais altas.

[00236] Como pode ser observado a partir da Figura 16A e 16B, o rendimento de RNA real e relativo para mRNA de PpLuc levemente aumenta até uma concentração de nucleotídeo de partida de GTP de aproximadamente 10 mM e depois declina em concentrações de GTP mais altas.

[00237] Como pode ser observado a partir da Figura 17A e 17B, o rendimento de RNA real e relativo para mRNA de EGFR/Mucina- aumenta até uma concentração de nucleotídeo de partida de GTP de aproximadamente 10 mM e declina em concentrações de GTP mais altas.

[00238] Estes resultados demonstram que o uso de uma mistura de ribonucleotídeo otimizada por sequência e uma quantidade adicional do nucleotídeo de partida GTP leva a uma eficiência aumentada de síntese de RNA até uma concentração de nucleotídeo de partida de GTP de aproximadamente 10 mM.

Exemplo 9: Biorreator

[00239] A Figura 18 mostra uma modalidade preferida de um bior- reator 1 de acordo com a presente invenção em uma ilustração esquemática. A partir da Figura 18, a estrutura modular do biorreator 1 torna-se evidente. Aqui, o biorreator 1 consiste em vários módulos de biorreator 2, 3, 4, 5. O módulo de reação 1 é um vaso de reação usado para um processo contínuo ou semicontínuo para sintetizar moléculas de RNA de uma sequência dada. O módulo de reação 2 contém DNA imobilizado por resina usado como um padrão para a reação de transcrição de RNA. Aqui, a imobilização do DNA permite um uso repetido do padrão e reduz a contaminação do produto de RNA desejado por qualquer tipo de DNA residual. Além disso, a imobilização do padrão de DNA substitui o uso da enzima DNAse para digestão de DNA terminal. Depois da transcrição, as moléculas de RNA produzidas podem ser liberadas lote a lote ou continuamente no módulo de captura 3. O módulo de captura 3 contém uma fase de resina/sólida para capturar as moléculas de RNA e para separar o RNA a partir de outros componentes solúveis da reação de transcrição. Posteriormente, as moléculas de RNA podem ser dispensadas do biorreator 1 por meio de uma linha de saída ou semelhantes (não mostrado) para uma unidade de recepção ou semelhantes, em que outra eluição e purificação de RNA podem ser realizadas. Um fluido de lavagem e/ou tampão de eluição podem ser fornecidos ao módulo de captura 3 por meio de um respectivo tanque lavagem e tampão 31 conectado à área de transferência entre o módulo de reação 2 e o módulo de captura 3.

[00240] De modo a ser capaz de monitorar e controlar o processo de transcrição no módulo de reação 2, uma membrana de ultrafiltração 21 para separação dos componentes de peso molecular alto, tais como proteínas e polinucleotídeos, a partir de componentes de peso molecular baixo, tais como nucleotídeos, é fornecida no módulo de reação 2. A membrana separa um núcleo de reação 22, em que a reação de transcrição de RNA é realizada, a partir de um compartimento de filtração 23, em que a mistura de reação filtrada é recebida. Com base na concentração de nucleotídeo na mistura de reação filtrada no compartimento de filtração 23 do módulo de reação 2, usado como parâmetro de processo crítico, a alimentação de nucleotídeos, componentes tampão e/ou enzimas no módulo de reação 2 a partir de um tanque de alimentação 24 pode ser controlada e regulada por meio de uma bom ba de alimentação 43, que permite realizar a reação de transcrição de RNA em uma condição no estado estacionário ideal produzindo desempenho transcricional alto. Como um meio de medição, uma unidade de sensor 41 é fornecida para medir os parâmetros de reação na mistura de reação. Aqui, a unidade de sensor 41 pelo menos compreende um sensor para análise fotométrica, tal como uma célula de fluxo UV para UV 260/280nm, no fluido filtrado contendo os componentes de peso molecular baixo, fluido filtrado este que é extraído a partir do compartimento de filtração 23, circulado por uma bomba de recircula- ção 25 e devolvido no compartimento de filtração 23. Na linha de circulação, o sensor da unidade de sensor 41 é fornecido de modo a obter monitoramento em tempo real do fluido filtrado dentro do compartimento de filtração 23. A aplicação de uma mistura de ribonucleotídeo otimizada por sequência no biorreator 1 permite uma medição em tempo real da concentração de nucleotídeo no compartimento de filtração 23 durante a reação de transcrição de RNA no núcleo de reação 22 do módulo de reação 2. A unidade de sensor 41 é parte do módulo de controle 4, que compreende ainda um controlador 42 e um atuador na forma de bomba de alimentação 43. A unidade de sensor 41 e a bomba de alimentação 43 são conectadas ao controlador 42 de modo a fornecer sinais de medição para receber sinais de instrução a partir do controlador 42. Além disso, outros parâmetros de processo críticos, tais como um valor de pH do fluido filtrado, ou uma condutividade do fluido filtrado podem ser analisados por outros sensores adequados da unidade de sensor 41. A coleta e análises de dados pelo controlador 42, usualmente na forma de um sistema informatizado ou semelhantes, permitem o controle da bomba de alimentação 43 como um atua- dor para alimentações repetidas de nucleotídeos, componentes tampão e/ou enzimas no módulo de reação 2, assim como o controle de outras bombas no biorreator 1 de modo a ajustar parâmetros de pro- cesso chaves em condições de reação no estado estacionário ideais.

[00241] De modo a impedir o desgaste, o biorreator 1 da modalidade preferida compreende ainda um módulo de refluxo 5 conectado ao módulo de captura 3, módulo de refluxo 5 este que coleta as matérias- primas não usadas, tais como nucleotídeos e enzimas, e recircula os mesmos de volta no módulo de reação 2 por meio de uma bomba de refluxo 51. O módulo de refluxo 5 contém enzimas imobilizadas, tais como pirofosfatase, ou resina para capturar componentes disruptivos, tais como fosfato ou semelhantes.

[00242] As modalidades descritas acima da presente invenção e os desenhos anexos são meramente intencionados a ser ilustrativos e não devem ser considerados como limitantes, visto que modificações da invenção descrita podem ser feitas dentro do escopo das reivindicações anexas sem divergir do escopo da mesma.

Exemplo 10: Atividade imunoestimuladora de moléculas de RNA

[00243] Neste exemplo as propriedades imunoestimuladoras de moléculas de RNA sintetizadas com uma mistura de NTP otimizada por sequência e uma mistura de NTP equimolar padrão foram comparadas. A imunoestimulação foi determinada medindo-se níveis de cito- cina e quimiocina nos sobrenadantes de células transfectadas com mRNA.

[00244] Reações de transcrição in vitro padrão e otimizadas por sequência para mRNA de Luciferase (pPluc) foram realizadas como descrito no exemplo 1.

[00245] Subsequentemente o mRNA foi purificado por precipitação de LiCl. Ensaio de imunoestimulação

[00246] Células HeLa foram semeadas em uma densidade de 4x105 células por reservatório em uma placa de 6 reservatórios em 2 ml de meio de cultura de célula HeLa que consiste em meio RPMI 1640 Gibco® suplementado com 25 mM de HEPES, 2 mM de L- Glutamina e 100 IU/ml de penicilina/estreptomicina (todos da Lonza, Basel, Switzerland) e 10 % de soro de bezerro fetal (Perbio Science, Bonn, Germany). No dia seguinte as células foram transfectadas com 2 μg de RNA ou água para injeção (WFI) como controle negativo usando Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, Darmstadt, Germany, catálogo no 11668-027). Brevemente, reagente Lipofectamine® e RNA foram todos diluídos em meio Opti-MEM® (Life Technologies), combinados em uma razão de RNA:Lipofectamine® de 1:1,5 e incubados por 20 minutos na temperatura ambiente. O controle negativo continha WFI ao invés de RNA misturado com Lipofectamine®. Nesse meio tempo as células foram lavadas uma vez com 2 ml de meio RPMI 1640 Gibco® suplementado com 25 mM de HEPES e 2 mM de L-Glutamina (meio livre de soro e livre de penicilina/estreptomicina) e 2 ml do meio livre de soro e livre de penicilina/estreptomicina foram adicionados às células seguido pela adição de 0,5 ml de mistura de transfecção de RNA:Lipofectamine®. Depois da incubação por 4 horas a 37°C e 5 % de CO2, o meio contendo a mistura de transfecção foi substituído por 2 ml de meio de cultura de célula HeLa.

[00247] Depois de 24 horas, sobrenadantes livres de célula foram coletados e as concentrações de IL-6, CXCL10 e CCL5 foram medidas por Arranjo de Pérola Citométrico (CBA) de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences) usando os kits seguintes: Human Soluble Protein Master Buffer Kit (catálogo no 558264), Assay Diluent (catálogo no 560104), Human IL-6 Flex Set (catálogo no 558276), Human CXCL10 Flex Set (catálogo no 558280) e Human CCL5 Flex Set (catálogo no 558324) (todos os kits da BD Biosciences). Os dados foram analisados usando o software FCAP Array v3.0 (BD Biosciences).

Resultados

[00248] Como pode ser observado a partir da Figura 19, os níveis de IL-6, CXCL10 e CCL5 secretados foram mais baixos para o RNA sintetizado com a mistura de NTP otimizada por sequência comparado ao mesmo RNA sintetizado com uma mistura de NTP equimolar padrão indicando uma atividade imunoestimuladora mais baixa do RNA que resulta a partir da mistura de NTP otimizada por sequência.

Exemplo 11: Transcrição in vitro em um biorreator Preparação do DNA usado para transcrição in vitro (P1140):

[00249] Um vetor de DNA para transcrição in vitro (P1140) foi preparado por inserção dos elementos seguintes em um vetor de DNA (pCV32(KanR)): 5’ UTR: 32L4 (Top-UTR) ORF: HA a partir de H1N1(Netherlands2009) (enriquecido com GC) 3’ UTR: Albumina7

[00250] A transcrição in vitro do vetor de DNA obtido resulta em uma molécula de RNA tendo um comprimento de 2083 nt. A sequência de RNA respectiva (SEQ ID NO: 6) é ilustrada na Fig. 20.

[00251] A construção de RNA é caracterizada pela composição de nucleotídeo seguinte: G = 540 (25,92 %) C = 676 (32,45 %) A = 541 (25,97 %) U = 326 (15,65 %) G/C = 58,37 % Linearização do vetor de DNA:

[00252] O plasmídeo P1140 foi linearizado usando as condições seguintes: 0,5 μg de DNA plasmídico 1,5 μl de reação tampão 10 x 1 μl de EcoRI adicionar 15 μl de WFI (água para injeção)

[00253] A reação foi incubada por 3 h a 37 °C. Subsequentemente uma extração com fenol/clorofórmio e uma precipitação com isopropanol foram realizadas. Transcrição in vitro: Mistura de Capuz/NTP Padrão

(Concentração de NTP final sem capuz é de 13,45 mM) Cálculo de NTPs e Capuz:

[00254] A mesma concentração de NTP total de 13,45 mM como usado na reação de transcrição padrão é usada para transcrição otimizada por sequência. A quantidade de quatro vezes de GTP é usada para o análogo de capuz.

Preparação da mistura de Capuz/NTP otimizada por sequência para P1140:

5x tampão de transcrição: 400 mM de HEPES 120 mM de MgCl2 10 mM de espermidina 200 mM de DTT 25 U/ml de pirofosfatase inorgânica 4 reações de transcrição diferentes foram testadas em um biorreator:

[00255] Como o biorreator, um Bioreaktor DasBox da Dasgip foi usado. A reação foi agitada em 50 rpm. Nos pontos no tempo indicados, amostras de 20 μl de cada foram removidas. A concentração de RNA foi medida determinando-se a absorção em 260 nm depois da precipitação de LiCl.

[00256] Quatro condições diferentes foram usadas para transcrição in vitro: 1. Transcrição usando uma mistura de NTP padrão

[00257] A reação de transcrição foi incubada por 3 h a 37 °C.

[00258] Subsequentemente, 6 μl de DNAse I (1 mg/ml) e 0,2 μl de solução de CaCl2 (0,1 M)/μg de padrão de DNA foram adicionados à reação de transcrição, e incubados por 2 h a 37°C. 2. Transcrição otimizada por sequência (1,5 h sem alimentação)

[00259] A reação de transcrição foi incubada por 1,5 h a 37 °C.

[00260] Subsequentemente, 6 μl de DNAse I (1 mg/ml) e 0,2 μl de solução de CaCh (0,1 M)/μg de padrão de DNA foram adicionados à reação de transcrição, e incubados por 2 h a 37°C. 3. Transcrição otimizada por sequência com alimentação

[00261] A reação de transcrição foi incubada por 1,5 h a 37 °C.

[00262] 12934,6 μl de mistura de capuz/NTP otimizada por sequên cia e 5 x tampão de transcrição foram adicionados depois de 1,5 h. A reação de transcrição foi incubada por 1,5 h adicionais a 37 °C.

[00263] Subsequentemente, 6 μl de DNAse I (1 mg/ml) e 0,2 μl de solução de CaCl2 (0,1 M)/μg de padrão de DNA foram adicionados à reação de transcrição, e incubados por 2 h a 37°C. 4. Transcrição otimizada por sequência com concentração de RNA po- limerase T7 reduzida e concentração de padrão reduzida

Resultados:

[00264] A transcrição em uma mistura de transcrição otimizada por sequência resulta em concentrações mais altas de RNA transcrito comparado à transcrição sob condições padrão (Fig. 21, TS(1)). Uma alimentação de adição com nucleotídeos e tampão de transcrição aumentou ainda mais a quantidade de RNA transcrito (Fig. 21, TS(3). Rendimento:

Expressão e Imunoestimulação:

[00265] Células HeLa foram semeadas em uma densidade de 4x105 por reservatório em uma placa de 6 reservatórios em 2 ml de meio de cultura de célula HeLa que consiste em meio RPMI 1640 Gib- co® suplementado com 25 mM de HEPES, 2 mM de L-Glutamina e 100 IU/ml de penicilina/estreptomicina (todos da Lonza, Basel, Switzerland) e 10 % de soro de bezerro fetal (Perbio Science, Bonn, Germany). No dia seguinte, as células foram transfectadas com concen trações diferentes de 2 μg de RNA ou água para injeção (WFI) como controle negativo usando Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, Darmstadt, Germany, catálogo no 11668-027). Brevemente, reagente de Lipofectamine e RNA foram todos diluídos em meio Opti-MEM® (Life Technologies), combinados em uma razão de RNA:Lipofectamine de 1:1,5 e incubados por 20 min na temperatura ambiente. O controle negativo continha WFI ao invés de RNA misturado com Lipofectami- ne2000. Nesse meio tempo, as células foram lavadas uma vez com 2 ml de meio RPMI 1640 Gibco® suplementado com 25 mM de HEPES e 2 mM de L-Glutamina (meio livre de soro e penicilina/estreptomi- cina), 2 ml do meio livre de soro e penicilina/estreptomicina foram adicionados às células a seguir da adição de 0,5 ml de mistura de trans- fecção de RNA:Lipofectamine. Durante a incubação por 4 h a 37°C e 5 % de CO2, o meio contendo a mistura de transfecção foi removido e 2 ml do meio de cultura de célula HeLa foram adicionados.

[00266] Depois de 24 horas, os sobrenadantes e células foram coletados.

Expressão da proteína:

[00267] Expressão superficial da proteína HA foi determinada usando análise citométrica de fluxo. Células HeLa aderentes foram lavadas uma vez com 1 ml de PBS e colhidas usando tampão de separação livre de tripsina (40 mM de Tris HCl pH 7,5; 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA). As células foram incubadas com anticorpo anti-HA (H1N1) monoclonal de camundongo (Immune Technology, New York, USA) seguido por um anticorpo conjugado a FITC anti-camundongo secundário (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany). As células foram medidas em um BD FACS Canto e analisadas usando Software FlowJo Versão 10.6. A análise estatística foi realizada usando o Software Graph Pad Prisma, Versão 5.01.

Resultados:

[00268] O RNA transcrito em uma mistura de reação otimizada por sequência (Fig. 22, TS(2), TS(3), TS(4)) resultou em uma expressão mais alta da proteína HA codificada do que o RNA transcrito sob condições padrão (Fig. 22, TS(1)).

Imunoestimulação:

[00269] As concentrações de IL-6, CXCL10 e CCL5 foram medidas em sobrenadantes livres de célula por Arranjo de Pérola Citométrico (CBA) de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences) usando os kits seguintes:

[00270] Os dados foram analisados usando o software FCAP Array v3.0 (BD Biosciences). A análise estatística foi realizada usando o Software Graph Pad Prisma, Versão 5.01.

Resultados:

[00271] O RNA transcrito sob condições padrão (Fig. 23, TS1) induziu níveis mais altos das citocinas IL-6, CXCL10 e CCL5 em células HeLa comparado a RNAs transcritos em uma mistura de reação otimizada por sequência (Fig. 23, TS2, TS3, TS4).

Claims

1. Método para sintetizar uma molécula de RNA de uma dada sequência, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) determinar a fração (1) para cada um dos quatro nucleo- tídeos G, A, C e U na referida molécula de RNA, e (b) sintetizar a referida molécula de RNA por transcrição in vitro em uma mistura de reação otimizada por sequência, em que a referida mistura de reação otimizada por sequência compreende os quatro ribonucleosídeos trifosfatos (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro ribonucleosídeos trifosfatos na mistura de reação otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na referida molécula de RNA, um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimerase.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende as etapas de (b1) preparar uma mistura de ribonucleosídeo trifosfato (NTP) otimizada por sequência compreendendo os quatro ribonucleo- sídeos trifosfatos (NTPs) GTP, ATP, CTP e UTP, em que a fração (2) de cada um dos quatro ribonucleosídeos trifosfatos na mistura de ribo- nucleosídeo trifosfato (NTP) otimizada por sequência corresponde à fração (1) do nucleotídeo respectivo na referida molécula de RNA, e (b2) sintetizar a referida molécula de RNA por transcrição in vitro na mistura de reação otimizada por sequência compreendendo a mistura de NTP da etapa (b1), um tampão, um padrão de DNA, e uma RNA polimerase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que, antes do início da transcrição in vitro, um nucle- otídeo de partida é adicionado à mistura de reação otimizada por sequência que corresponde ao primeiro nucleotídeo da referida molécula de RNA.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido nucleotídeo de partida é um nucleosídeo monofosfato, um nucleosídeo difosfato, um nucleosídeo trifosfato, um dinucleosídeo trifosfato ou um análogo de cap.

5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o referido nucleotídeo de partida é adicionado em excesso comparado à fração deste nucleotídeo na referida molécula de RNA que é encontrada na primeira posição da referida molécula de RNA.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que, para os nucleotídeos que não correspondem ao primeiro nucleotídeo da molécula de RNA, a fração (1) e a fração (2) diferem em no máximo 10%.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma parte ou todo de pelo menos um ribonucleosídeo trifosfato é substituído por um nucleosídeo trifosfa- to modificado, em que o referido nucleosídeo trifosfato modificado é preferivelmente selecionado dentre o grupo que consiste em pseudou- ridina-5’-trifosfato, 1-metilpseudouridina-5’-trifosfato, 2-tiouridina-5’- trifosfato, 4-tiouridina-5’-trifosfato e 5-metilcitidina-5’-trifosfato.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que, no curso da transcrição in vitro, a mistura de reação otimizada por sequência é suplementada com a mistura de ribonucleosídeo trifosfato (NTP) otimizada por sequência como definida na reivindicação 2 (b1).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de RNA é selecionada dentre o grupo que consiste em moléculas de RNA codifi- cantes e não-codificantes, preferivelmente um mRNA.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de RNA é mais longa do que 100 nucleotídeos, e/ou a referida sintetização de uma molécula de RNA de uma dada sequência é realizada como uma síntese em grande escala e/ou em que o contraíon de NTP é tris(hidroximetil)-aminometano (Tris).

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a sintetização da referida molécula de RNA por transcrição in vitro é seguida por separação e quantificação dos NTPs não incorporados.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a sintetização da referida molécula de RNA por transcrição in vitro é realizada em um biorreator (1), em que o referido biorreator (1) preferivelmente compreende um padrão de DNA imobilizado em um suporte sólido.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido biorreator (1) compreende uma membrana de filtração (21) para separar nucleotídeos da mistura de reação otimizada por sequência, em que a referida membrana de filtração (21) é preferivelmente selecionada dentre o grupo de celulose regenerada, celulose modificada, polissulfona (PSU), poliacrilonitrila (PAN), polime- tilmetacrilato (PMMA), álcool polivinílico (PVA) e poliariletersulfona (PAES).

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida membrana de filtração (21) tem um corte de peso molecular em uma faixa de aproximadamente 10 a 50 kDa.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido biorreator (1) compreende uma unidade de sensor (41) para a medição em tempo real da concentração de nucleotídeo durante a reação, em que a refe- rida unidade de sensor (41) preferivelmente mede a concentração de nucleotídeo por análise fotométrica.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido biorreator compreende um módulo de controle (4) que controla a adição da mistura de ribonucleosídeo trifosfato (NTP) otimizada por sequência como definida na reivindicação 2 (b1) e/ou em que o referido biorreator (1) compreende um atuador (43) que adiciona a mistura de ribonucleosí- deo trifosfato (NTP) otimizada por sequência como definida na reivindicação 2 (b1), e/ou em que o dito biorreator (1) compreende uma resina para capturar as moléculas de RNA e para separar as moléculas de RNA dos outros componentes da mistura de reação de transcrição, e/ou em que o referido biorreator (1) opera em um modo semicontínuo ou em um modo contínuo.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido biorreator (1) compreende pelo menos um eletrodo seletivo de íon, em que o pelo menos um eletrodo seletivo de íon é preferivelmente usado para medir a concentração de um ou mais tipos de íons em um líquido compreendido em pelo menos um compartimento do biorreator (1), em que o íon é preferivelmente selecionado dentre o grupo que consiste em H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl- e PO43-.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, antes do início da transcrição in vitro, um análogo de cap é adicionado à mistura de reação otimizada por sequência para produzir o mRNA capeado; ou após a transcrição in vitro, uma enzima de captação é usada para produzir o mRNA.