KR102459599B1 - Rna생산을 증진하는 방법 및 수단 - Google Patents

Rna생산을 증진하는 방법 및 수단 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 방법과 관련된 발명으로, 상기 RNA 분자에서 네 종류의 G, A, C 및 U 각각의 비율(1)을 결정하는 단계, 및 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로(in vitro) 전사에 의해 상기 RNA 분자를 합성하는 단계를 포함하며, 상기 서열-최적화된 한응 혼합물은 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하며, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에서 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 각각의 비율(2)은 상기RNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드, 버퍼, DNA 주형, 및 RNA 중합효소의 비율(1)에 상응한다. 또한, 본 발명은 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 바이오리액터(1)와 관련된 발명으로, 상기 바이오리액터(1)는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 RNA 전사 반으을 수행하기 위한 반응 모듈(2), 전사된 RNA 분자를 일시적으로 잡기 위한 캡처 모듈(3), 및 서열-최적화된 반응 혼합물 구성요소의 반응 모듈(2)로의 인피드를 제어하기 위한 제어 모듈(4)을 포함하며, 상기 반응 모듈(2)은 뉴클레오타이드를 반응 혼합물로부터 분리하기 위한 여과막(21)을 포함하며, 제어 모듈(4)에 의한 서열-최적화된 반응 혼합물 구성요소의 인피트의 제어는 분리된 뉴크레오타이드의 측정된 농도를 기반으로 한다.

Description

RNA생산을 증진하는 방법 및 수단{Methods and Means for enhancing RNA production}
본 발명은 특히 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 방법 및 그 방법을 수행하기 위한 리액터와 관련된 발명이다.
치료적 리보핵산 (RNA) 분자는 최근 유행하는 약물의 계열을 나타낸다. RNA-기반 치료법들은 백신으로 사용하기 위해 항원을 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다 (Fotin-Mleczek et al. 2012. J. Gene Med. 14(6):428-439). 추가적으로, 환자에게 성장인자나 효소와 같은 부족한 단백질을 제공하는 것과 같은 대상 요법을 위해 RNA 분자를 이용하는 일이 예상되고 있다 (Kariko et al., 2012. Mol. Ther. 20(5):948-953; Kormann et al., 2012. Nat. Biotechnol. 29(2):154-157). 게다가, 논코딩 면역성 자극 RNA 분자와 마이크로RNAs와 같은 다른 논코딩 RNAs 및 긴 논코딩 RNAs의 치료상 이용이 고려되고 있다 (Esteller, 2011. Nat. Rev. Genet. 12(12):861-74).
감염된 RNA로부터 성공적인 단백질 발현은 감염 효율(transfection efficiency), RNA 안정성 및 번역 효율(translation efficiency)에 의존한다. 5' 캡 구조와 3' 폴리(A)꼬리는 진핵세포에서 단백질 합성과 mRNA의 효율적 번역을 위해 중요한 역할을 한다. 새롭게 합성된 mRNAs는 전사가 20 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이에 도달하면 캡 구조로 변형된다. 처음으로, 5'말단 뉴클레오타이드pppN은 RNA 5'-트리포스파테이즈와 구아닐릴트랜스퍼레이즈 활동을 모두 포함한 이-작용기(bi-functional) 캐핑(capping) 효소에 의해 5'GpppN으로 전환된다. 그 다음에는 GpppN 부분이 (구아닌-7)-메틸트랜스퍼레이즈 활동을 하는 두번째 효소에 의해 메틸화되어 모노메틸화된 m7GpppN type 0캡 구조가 된다. Type 0 캡은 그 다음 2'-O-메틸화에 의해 핵 내에서 m7GpppN type 1 구조로 전환된다 (Tcherepanova et al., 2008. BMC Mol. Biol. 9:90).
짧은 RNA 분자는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있는 반면, 긴 RNAs는 인비트로(in vitro) 전사 반응에 의해 생산되며, 이 반응에는 예를 들면 박테리오파지 SP6, T3 또는 T7 RNA 중합효소 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)와 같은 박테리오파지-유도 프로모터와 함께 적합한 DNA 주형, RNA 중합효소를 포함한다. 주로, 5'캡 구조는 인비트로 전사된 RNA 내로 두 가지 프로토콜에 의해 도입될 수 있다.
첫 번째 프로토콜에서, 캐핑(capping)은 전사의 개시와 동시에 일어난다 (공동-전사 캐핑(co-transcriptional capping)). 이 접근에서는, m7G(5')ppp(5')G (m7G) 같은 다이뉴클레오티드 캡 아날로그가 반응 혼합물에 첨가된다. DNA 주형은 일반적으로 첫 번째 전사되는 뉴클레오타이드가 구아노신인 방식으로 설계된다. 캡 아날로그는 바로 처음의 뉴클레오타이드 (개시 뉴클레오타이드)로 포함(incorporation)되기 위해 GTP와 경쟁하며, 그리고 어떤 다른 뉴클레오타이드만큼 쉽게 포함(incorporated)된다 (WO2006/004648). 캡 아날로그의 포함을 우호적으로 하기 위해, GTP에 대한 캡 아날로그의 몰의 과량이 통상적으로 이용되며 (예를 들면, 4:1 비율로) GTP농도는 다른 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 ATP, CTP 및 UTP와 비교하여 감소된다. 이러한 상태에서 GTP는 일반적으로 RNA 분자의 합성을 위한 제한 요소가 된다. 결과적으로, 다른 NTPs의 높은 비율(일반적으로 40내지70%)이 RNA 합성을 위해 사용되지 않고 버려진다. 이 접근으로, RNA 수율은 통상적으로 약 1 mg/ml으로 제한된다 (WO2006/004648).
두 번째 프로토콜에서, 캐핑은 인비트로 전사 후에 독립적인 촉매 반응에서 이루어진다(전사-후(post-transcriptional) 또는 효소에 의한(enzymatic) 캐핑). Vaccinia Virus Capping Enzyme (VCE)은 m7G 캡 구조를 합성하는데 필요한 세가지 효소 활동을 모두 가지고 있다 (RNA 5'-트리포스파테이즈, 구아닐릴트랜스퍼레이즈, 및 구아닌-7-메틸트랜스퍼레이즈). 기질로 GTP를 이용하면 VCE 반응은 정방향에서 RNA 캡을 생산한다. 추가로, type 1 캡은 두번째 Vaccinia 효소, 2' O 메틸트랜스퍼레이즈를 캐핑 반응에 추가함으로써 만들어질 수 있다 (Tcherepanova et al., 2008. BMC Mol. Biol. 9:90).
파지(phage) 중합효소에 의해 인비트로 전사된 RNA는 자가-보완적인 3' 확장에 의해 생성된 이중가닥 RNA 분자 및 실패한 전사 개시에 의해 생성된 짧은 RNA 분자를 포함한 다양한 오염물을 포함할 수 있다고 보고된다.
선형화된 DNA 주형의 2차(run-off) 전사를 하는 동안 T7 중합효소에 의해 합성된 RNA 분자는 암호화된 RNA보다 길 수 있다 (Triana-Alonso et al., 1995, JBC; 270(11): 6298-6307). DNA 주형을 떠난 후에, 3'-말단이 안정적인 이차 구조의 부분이 아니라면, RNA 중합효소는 전사한 것을 주형 부분에 및 전사한 것의 3'-말단을 생산 부분에 결합시키고 이것을 확장할 수 있다(자가-보완적 3' 확장). 이 효과는 특히 UTP 농도에 민감한 것으로 보이며, UTP 농도의 배타적 감소는 정확한 전사를 유도한다. 그러나, UTP 농도를 낮추는 것은 RNA 수율에도 영향을 미칠 수 있다. 특히 RNA가 mRNA와 같이 RNAs에 일반적인 것처럼 폴리(A) 꼬리를 포함하고 있다면, 과량의 전사과정에 포함되지 않은 UTP가 폴리-A-서열의 반대편의 포함되지 않은 우리딘 뉴클레오타이드에 의존적인 RNA-주형을 초래하여, 선천적 면역 반응을 활성화하고 단백질 합성을 줄일 수 있는 이중가닥 RNA분자를 만들게 된다 (Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res.; 39(21): e142).
의도된 완전한-길이의 RNA 분자에 추가적으로, 인비트로 전사 반응은 또한 실패한 전사 개시 사건의 결과인 더 작은 올리고리보뉴클레오타이드를 생산할 수 있다 (Milligan, et al., 1987. Nucleic Acid Res. 15(21): 8783-8798). 이러한 실패한 (정상보다 이른(premature)) 전사체는 RNA 중합효소, DNA 주형, 및 초기의 RNA 사슬로 이루어진 3원 복합체로부터 조기에 방출된 짧은 RNA 분자이다. 전형적으로, 대부분의 파괴적으로 전사된 것은 2 내지 8개 길이의 뉴클레오타이드이며 개시과정 동안 파괴적 순환(abortive cycling) 때문에 생성된다. 흥미롭게도, 실패한 전사의 증가는 NTP 농도가 대략 2 mM 보다 낮을 때 관찰된다 (Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174-184). 실패한 전사는 그들의 합성이 가치 있는 NTPs를 소비하고 완전한-길이의 생산물의 생산을 감소시키기 때문에 요구되지 않는다.
RNA 치료법의 성공적인 발전을 위해서, 특히 RNA가 대규모이며 완전한-길이로 생산되는 경우 또는 완전한-길이의 캡된 RNA 분자가 요구되는 경우, 활성 약학 조성물로서 RNA분자의 생산은 수율, 품질, 안정성 및 비용의 측면에서 효율적이어야 한다. 인비트로 전사에 의해 RNA 분자의 생산을 증가시키기 위한 몇 가지 접근법이 설명되어있다. 고농도 NTP의 이용은 RNA 분자의 생산을 증가시킬 것으로 기대된다. 대안으로는, 캡된 RNA 분자의 효율적인 합성을 위해, GTP 대 캡 아날로그의 비율의 조정이 제안된다.
인비트로 전사 반응을 위한 표준 뉴클레오타이드 농도는 전형적으로 1.5 내지 16 mM의 범위이다 (Milligan, et al., 1987. Nucleic Acid Res. 15(21): 8783-8798; Sampson & Uhlenbeck, 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(4):1033-7; Cunningham & Ofengand 1990. Biotechniques 9(6):713-4; Weitzmann et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18(12):3515-20; Gurevich et al., 1991. Anal. Biochem. 195(2):207-13). Mg++ 농도가 그에 따라 조정된다면 40 mM까지의 NTP 농도는 가능하다고 보고되며, 이 경우 증가된 RNA수율을 보인다 (US5256555).
T7 High Yield RNA synthesis kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), TranscriptAidTM T7 High Yield Transcription kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), MEGAscript® High Yield Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 또는 AmpliCap-MaxTM T7 High Message Maker kit 와 같은 몇몇의 고 수율 전사 키트는 상업적으로 이용 가능하다(Epicentre, Madison, WI, USA). 모든 키트들에서는, 표준 전사 반응을 위해 30 내지 40mM의 많은 수의 NTP 작업 농도가 요구된다. 캡된 mRNAs의 합성을 위해서, GTP 농도는 1.5 mM와2mM GTP사이에 범위한다.
일반적으로 인비트로 전사 반응의 RNA 수율을 최대화시키기 위해 높은 뉴클레오타이드의 농도가 요구됨에도 불구하고, 높은 NTP 농도의 이용은 또한 단점을 갖는다. 예를 들면, 높은 초기 NTP 농도 및 충분히 높은 Mg++ 농도 (e.g. Mg(OAc)2)와 함께 높은 RNA 수율은 얻어질 수 있다. 하지만, 이런 고농도에서 NTPs의 높은 비율은 짧은 실패한 전사체에 포함될 것이다 (Kern et al., 1997. Biotechnol. Prog. 13,747-756).
캡 아날로그 존재 하에서 공동-전사적으로(co-transcriptionally) 캡 된 mRNA를 생산하기 위해, 경제적인 이유로 낮은 NTP 작업 농도가 요구되는데, 캡 아날로그가 GTP에 대해 과량 이용되어야 하고 이것이 주 비용 요소이기 때문이다. 높은 캡 아날로그 대 GTP 비율이 캡 된 RNA의 높은 비를 유도하나 수율과 경제적 이유를 위해, 4:1 비율이 일반적으로 제안된다 (New England Biolabs, 캡된 RNA synthesis (E2040), https://www.neb.com/protocols/1/01/01/capped-rna-synthesis-e2040).
예를 들면, 캡 된 RNA의 전사를 위해 T7 High Yield RNA synthesis kit의 제조사 지시는 GTP에 대해 캡 아날로그의 4:1 과량으로 2 mM GTP를 이용할 것을 제안한다. 20 μl 반응 당 수율은 2-2.5 mg/ml와 상응하고, 대략 80% 캡 된 RNA 전사체와 함께 40-50 μg RNA로 나타나진다(New England Biolabs, 캡된 RNA 합성 (E2040), https://www.neb.com/protocols/1/01/01/캡된-rna-synthesis-e2040).
낮은 GTP농도로 인해 야기되는 제한된 수율을 보상하기 위해, GTP대 캡 아날로그 비율이 1:1 에서 1:50 사이로 유지되는 방식으로 반응에 경쟁 뉴클레오타이드 (GTP, 또는 A-cap이 이용되는 경우ATP)를 보완함으로써 캡 된 RNA의 수율을 증가시킨다. 이러한 접근으로, 반응당 생산되는 캡 된 RNA의 양은 배가 될 수 있다 (WO2006/004648).
인비트로 전사 반응은 통상적으로 모든 구성요소가 갖춰진 다음 반응이 종결될 때까지 RNA 분자의 합성을 하도록 배양되는 방식의 배치 반응(batch reaction)으로 수행된다. 추가적으로, 인비트로 전사 반응의 효율을 증가시키기 위해 공급형-배치 (fed-batch) 반응이 개발되었다 (Kern et al., 1997. Biotechnol. Prog. 13, 747-756; Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174-184). 공급형-배치 계에서는 모든 구성요소가 갖춰지지만 일정한 반응 환경을 유지하기 위해 몇몇 시약 (e.g. NTPs and magnesium)의 추가적 양이 시간이 지남에 따라 첨가된다. 공급형-배치 전략은 매우 짧은 38개 염기 쌍 DNA주형을 위한 DNA주형 또는 RNA 중합효소의 단위당 RNA에 있어 100% 개선된 수율을 보인다. 이 방법은 오로지 5' 말단에서 트리포스페이트가 있는 논 캡 RNA 분자의 합성에만 이용된다.
인비트로 전사에 의한 RNA 분자의 합성을 위한 바이오리액터 (전사 반응기)의 이용이 보고된다 (WO1995/08626). 바이오리액터는 반응물이 피드(feed) 라인을 거쳐 반응기 중심으로 전달되고 RNA 생성물이 (일반적으로 100,000 daltons 정도의 분자량 분리능을 가진) 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 통과함으로써 제거되는 것으로 설정된다.
요약하면, 인비트로 전사 반응으로부터 캡 된 RNA 분자의 수율은 주로 두가지 인자에 의존하는데, RNA 분자에 포함되기 위해 이용하는 전체 NTP 농도와 캡 아날로그 : GTP 비율이 그것이다. 공동-전사캐핑(co-transcriptional capping)을 위해 GTP농도는 일반적으로 다른 NTPs와 비교하여 감소한다. 이러한 사실이 특히 많은 GC- 내용이 있는 주형에 있어서는 가능한 전사 수율을 제한한다.
위의 관점에서, RNA 생산, 특히 단백질로 번역될 수 있는 완전한-길이의 캡된 RNA 분자의 생산을 위해 개선되고 경제적인 수단과 방법을 위한 계속적인 필요가 있다.
긴 RNA의 합성은 인비트로 전사에 의하는데, 이 경우 과다 낭비되는 시약 및 의도치 않은 생성물의 합성, 즉 3'자가 보완적인 전사 또는 실패한 전사로 인한 생성물로 인한 단백질 발현의 저하 또는 선천적 면역 자극 활성의 문제를 가져온다.
본 발명은 이러한 문제를 줄이기 위한 RNA 합성의 방법 및 수단과 관련된 발명이다.
발명의 요약
본 발명의 바탕을 이루는 목적은 청구된 특허 대상들에 의해 해결된다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하며, 특히 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 방법과 관련된 발명이다:
a) 상기 RNA 분자에서 네 종류의 뉴클레오타이드 G, A, C 및 U 각각의 비율(1)을 결정하는 단계, 및
b) 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 전사에 의해 상기 RNA 분자를 합성하는 단계, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물은 네 종류의 리보뉴클레오타이드 GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하며, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에서 네 종류의 리보뉴클레오타이드 각각의 비율(2)은 상기 RNA 분자의 각각의 뉴클레오타이드, 버퍼, DNA 주형, 및 RNA 중합효소의 비율(1)에 상응한다.
본 발명은 또한 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 바이오리액터와 관련된 발명으로, 바이오리액터는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 RNA 전사 반응을 수행하기 위한 반응 모듈, 전사된 RNA 분자를 일시적으로 잡기 위한 캡처 모듈, 서열-최적화된 반응 혼합물의 구성요소를 반응 모듈로 송입(infeed)하는 것을 제어하기 위한 제어 모듈을 포함하며, 상기 반응 모듈은 서열-최적화된 반응 혼합물로부터 뉴클레오타이드를 분리하기 위한 여과막을 포함하며, 제어 모듈에 의한 서열-최적화된 반응 혼합물 구성요소 송입의 제어는 분리된 뉴클레오타이드의 측정된 농도에 기초한다.
정의
명확성 및 가독성을 위해 하기 정의가 제공된다. 이런 정의에 대하여 개시된 어느 기술적 특징은 본 발명의 각각 및 모든 실시예에서 이해될 수 있다. 추가적인 정의 및 설명은 하기에 논의되고 설명된 이들 실시예의 맥락에서 구체적으로 제공될 수 있다.
5'-캡 구조: 5' 캡은 전형적으로 변형된 뉴클레오타이드, 특히 구아닌 뉴클레오타이드로, RNA 분자의 5' 말단에 추가된다. 바람직하게는, 5' 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 이용하여 추가된다. 5' 캡은 메틸화되어, 예를 들어 m7GpppN이 될 수 있고, 상기 N은 5' 캡, 전형적으로 RNA 의 5'-말단을 갖고 있는 핵산의 말단 5' 뉴클레오타이드이다. 자연적으로 발생하는 5' 캡은 m7GpppN이다.
5' 캡 구조에 관한 추가의 예들로서는 글리세릴, 역전 데옥시 무 염기 잔기(부), 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드, 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, 알파-뉴클레오타이드, 변형 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜ㅌ푸라노실 뉴클레오타이드, 비환형 3',4'-세코 뉴크레오타이드, 비환형 3,4-다이하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 비환형 3,5 다이하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'-3'-역전 뉴클레오타이드 부, 3'-2'-역전 무 염기 부, 3'-2'-역전 뉴클레오타이드 부, 3'-2'-역전 무 염기 부, 1,4-부탄다이올포스페이트, 3'-포스포라미데이트, 헬실포스페이트, 아미노헥실포스페이트, 3'-포스페이트, 3'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교형 또는 비-가교형 메틸포스포네이트 부를 포함한다.
특히 선호되는 5'캡 구조는 CAP1 (m7G의 인접한 뉴클레오타이드의 리보스의 메틸화), CAP2 (m7G의 2nd 뉴클레오타이드 다운스트림(downstream)의 리보스의 메틸화), CAP3 (m7G의 3rd 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보스의 메틸화), CAP4 (m7G의 4th 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보스의 메틸화)이며, 5' 캡 구조는 캡 아날로그에 의해 형성될 수 있다.
캡 아날로그: 캡 아날로그는 캡 기능을 갖는 비-확장성 다이-뉴클레오타이드를 언급하는 것으로, 캡 기능이란 번역 또는 위치화(localization)를 촉진하며, 및/또는 RNA 분자의 5' 말단에 포함될 때 RNA 분자의 손상을 막는 것을 의미한다. 비-확장성이란 캡 아날로그가 오로지 5' 말단에만 포함될 것을 의미하는데, 그 이유는 이것이 5' 트리포스페이트를 갖고 있지 않고 따라서 주형-의존적인 RNA 중합효소에 의하여 3' 방향으로 확장할 수 없기 때문이다.
캡 아날로그는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 메틸화되지 않은 캡 아날로그 (e.g., GpppG); 이중메틸화된 캡 아날로그 (e.g., m2,7GpppG), 삼중메틸화된 캡 아날로그 (e.g., m2,2,7GpppG), 이중메틸화된 대칭 캡 아날로그 (e.g., m7Gpppm7G), 또는 반 역전 캡 아날로그 (e.g., ARCA; m7,2'OmeGpppG, m7,2'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG 및 테트라포스페이트 유도체)로 이루어진 군에서 선택된 화학 구조를 포함하며, 여기에 제한된 것은 아니다 (Stepinski et al., 2001. RNA 7(10):1486-95). 캡 아날로그의 예가 표 1에 보여진다.
표 1. 캡 아날로그 (D1 및 D2 는 상대 부분입체이성질체를 나타낸다)
Figure 112016122619642-pct00001
더 많은 캡 아날로그는 이미 설명되었다 (US7074596, WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, and WO2013/059475). N7-(4-클로로펜옥시에틸) 치환된 다이뉴클레오타이드 캡 아날로그의 합성은 최근 설명되었다 (Kore et al., 2013. Bioorg. Med. Chem. 21(15):4570-4).
특히 선호되는 캡 아날로그는 G[5']ppp[5']G, m7G[5']ppp[5']G, m3 2,2,7G[5']ppp[5']G, m2 7,3'-OG[5']ppp[5']G (3'-ARCA), m2 7,2'-OGpppG (2'-ARCA), m2 7,2'-OGppspG D1 (β-S-ARCA D1) 및 m2 7,2'-OGppspG D2 (β-S-ARCA D2)이다.
핵산: 핵산이란 용어는 어떤 DNA- 또는 RNA- 분자를 의미하며 폴리뉴클레오타이드와 동의어로 사용된다. 게다가, 여기서 정의되는 핵산의 변형물 또는 유도체는 일반적인 용어 “핵산”에 명확하게 포함된다. 예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA) 또한 “핵산”이란 용어에 포함된다.
단일 시스트론형 RNA: 단일 시스트론형 RNA는 전형적으로 RNA이며, 바람직하게는 오직 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 mRNA이다. 이와 같은 내용에 있어서 오픈 리딩 프레임은 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 개의 뉴클레오타이드 트리플렛 (코돈들)의 서열이다.
이중-/다중 시스트론형 RNA: 2 시스트론형 또는 다중 시스트론형 RNA는 통상 오픈 리딩 프레임(ORF)을 2개 가질수 있거나 (2 시스트론형) 그 이상 가질 수 있는 (다중 시스트론형) RNA, 바람직하게는 mRNA이다. 이와 같은 내용에 있어서 오픈 리딩 프레임은 펩티드 또는 단백질로 번역되는 여러 개의 뉴클레오타이드 트리플렛 (코돈들)의 서열이다.
면역자극 RNA: 본 발명의 내용에 있어서 면역자극 RNA (isRNA)는 통상적으로 타고난 면역반응을 유도할 수 있는 RNA이다. 면역자극RNA는 일반적으로 오픈 리딩 프레임을 가지고 있지 않고, 따라서 펩티드-항원을 제공하지 않으나, 예를 들면 병원균-연관 분자 패턴(PAMP) 수용체 (예를 들면, 톨-유사 수용기 (TLR) 또는 기타 세포 내 RNA 센서 (e.g. RIG-I, MDA-5 또는 PKR)가 있다)에 결합함으로써 같은 타고난 면역 반응을 유도한다.
뉴클레오타이드 아날로그: 뉴클레오타이드 아날로그는 포스페이트 백본 변형, 당 변형, 또는 핵염기의 변형을 포함하는 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 구조적으로 유사한 뉴클레오타이드 (아날로그)이다.
핵산 합성: 여기서 정의된 본 발명에 따라 이용되는 핵산 분자는 예를 들면 고체상 합성, 인비보(in vivo) 전파 (예를 들면, 바이러스의 인비보 전파)와 같은 합성법뿐만 아니라 인비트로(in vitro) 전사 반응과 같은 인비트로 방법과 같은 합성법을 포함하는 인공으로 알려진 어떠한 방법을 이용하여 제조될 것이다.
본 발명에 따르면 RNA 분자는 상응하는 DNA 분자의 인비트로 전사에 의해 제조된다. 바람직하게는, 이 DNA 주형은 예를 들어 T7 또는 SP6 프로모터 같은 적합한 프로모터를 포함하며, 준비되어야 하는 RNA 분자를 위한 의도된 뉴클레오타이드 서열 코딩과 인비트로 전사를 위한 종결 신호가 뒤따른다. 적어도 하나의 관심 있는 RNA의 주형을 형성하는 DNA 분자는 박테리아 내에서 복제될 수 있는 플라스미드의 부분으로서 발효성 증식 및 일련의 고립과정에 의해 제조된다. 본 발명에 적합한 언급된 플라스미드는 예를 들면, 플라스미드 pUC18, pUC19, pBR322, pT7Ts (GenBank accession number U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360), pGEM® series, pGEM®-1 (GenBank accession number X65300; from Promega) 및 pSP64 (GenBank accession number X65327)이며; 참고로 또한 Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001이다.
RNA: RNA는 리보핵산의 일반적은 줄임말이다. 이것은 핵산 분자이며, 즉 뉴클레오타이드를 이루는 고분자이다. 이러한 뉴클레오타이드는 일반적으로 소위 백본을 따라 서로 연결될 수 있는 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 시티딘-모노포스페이트 단량체이다. 백본은 첫 번째 근접한 단량체의 당 즉, 리보스 및 두 번째 근접한 단량체의 포스페이트 부 사이에 포스포다이에스터 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정한 이어짐은 RNA-서열이라고 불린다.
메신저 RNA (mRNA): 진핵세포에서, 전사는 통상적으로 핵 또는 미토콘드리아 내부에서 이루어진다. 인비보에서 일반적으로 DNA의 전사는 소위 미성숙 RNA를 초래하는데, 미성숙 RNA는 통상적으로 mRNA로 축약되는 메신저 RNA내부에서 가공되어야 한다. 예를 들면, 진핵 개체에서 미성숙RNA의 가공은 스플라이싱, 5'-캐핑, 폴리아데닐화, 핵 또는 미토콘드리아로부터 방출 및 기타 다양한 다른 전사 후 변형을 포함한다. 이러한 일련의 가공을 또한 mRNA의 성숙이라 부른다. 성숙 메신저 RNA는 통상적으로 특정한 펩티드 또는 단백질의 아미노 산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 통상적으로, 성숙 mRNA 는 5' 캡, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임, 3' UTR 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 본 발명의 내용에 있어서, mRNA는 또한 인공적 분자, 즉 자연 발생적이지 않은 분자이다. 예를 들어, 이것은 본 발명에 있어서 mRNA가 자연에서 발생하지 않는 조합인 5' UTR, 오픈 리딩 프레임, 3' UTR 및 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다는 것이다.
자기-증식 RNA ( 리플리콘 ): 자기-증식 RNA는 Semliki Forest virus (SFV), Sindbis (SIN) virus, 및 Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus로부터 발생된 알파바이러스에 기초한 운반 벡터이다. 알파바이러스는 대상 비상동 유전자가 알파바이러스의 구조 유전자를 대체하는 단일 가닥의 RNA바이러스이다. 구조 유전자를 인트랜스(in trans)로 제공함으로써, 리플리콘 RNA는 유전자 치료 목적 또는 유전적 백신을 위해 이용될 리플리콘 입자 (RP)로 팩킹된다 (예를 위해서는 Vander Veen et al., 2012. Alphavirus replicon vaccines. Animal Health Research Reviews, p. 1-9를 볼 것). 숙주 세포로 들어간 후에, 게놈 바이러스성 RNA는 처음으로 바이러스성 RNA 증폭의 개시를 위해 요구되는 바이러스성 비구조적 단백질 (nsPs) 의 번역을 위해 mRNA의 역할을 한다. RNA복제는 추가적인 게놈-길이의 RNAs의 합성 및 내부 프로모터로부터 양성-가닥의 서브게노믹 RNA의 전사를 위해 주형으로 이용되는 완전한-길이의 음성-가닥 중간체의 합성을 거쳐 일어난다. 복제 (및 비상동 유전자의 전사) 에 책임이 있는 비-구조적 단백질이 여전히 그러한 리플리콘에 존재하기 때문에, 이러한 RNA는 자기-증식 RNA로 간주된다. 이러한 알파바이러스 벡터는 "리플리콘"이라 언급된다.
핵산 분자의 서열: 핵산 분자의 서열은 통상적으로 특정하고 개별적인 순서, 즉 일련의 이 뉴클레오타이드로 이해된다.
오픈 리딩 프레임: 본 발명에 있어 오픈 리딩 프레임 (ORF)는 통상적으로 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오타이드 트리플렛의 서열일 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 개시 코돈, 즉 이의 5'-말단에 아미노산 메티오닌(ATG 또는 AUG)을 일반적으로 코딩하는 세 개의 뉴클레오타이드의 조합 및 일반적으로 3 뉴클레오타이드의 배수인 길이를 보이는 후속 영역을 포함한다. ORF는 바람직하게는 종료 코돈 (예를 들어 TAA, TAG, TGA)에 의해 종결된다. 통상적으로 이는 오픈 리딩 프레임의 유일한 종료 코돈이다. 따라서, 본 발명의 내용에 있어서 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 개시 코돈(예를 들어 ATG 또는 AUG)으로 시작하고 바람직하게는 종료 코돈 (예를 들어, TAA, TGA, 또는 TAG 또는 UAA, UAG, UGA 각각)으로 종료되는, 세 개로 나누어질 수 있는 많은 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이다. 오픈 리딩 프레임은 분리되거나 보다 긴 핵산 서열, 예를 들어 벡터 또는 mRNA에 병합될 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 또한 "단백질 코딩 영역" 또는 "코딩 영역"으로 불릴 수 있다.
서열-최적화된 반응 혼합물: 서열-최적화된 반응 혼합물은 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 주어진 서열의 RNA분자의 인비트로 전사 반응에서 사용되기 위한 반응 혼합물이며, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에서 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 각각의 비율(2)는 상기 RNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드, 버퍼, DNA 주형, 및 RNA 중합효소의 비율(1)에 상응한다. 리보뉴클레오타이드가 상기 RNA 분자에 나타나지 않는다면, 상응하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또한 서열-최적화된 반응 혼합물에 나타나지 않는다.
서열-최적화된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물: NTP 혼합물은 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 주어진 서열의 RNA 분자의 인비트로 전사 반응에서 사용되기 위한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 혼합물이며, 상기 서열-최적화된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에서 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 각각의 비율(2)는 상기 RNA 분자에서 각각의 뉴크레오타이드의 비율(1)에 상응한다. 리보뉴클레오타이드가 RNA 분자에 나타나지 않는다면, 상응하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또한 서열-최적화된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에 나타나지 않는다.
변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 : 여기서 사용되는 "변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트" 용어는 당 변형 또는 염기 변형뿐만 아니라 백본 변형을 포함하는 화학적 변형을 언급한다. 이러한 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 또한 (뉴클레오타이드) 아날로그 같이 여기서 정의된다.
이 문맥에 있어서, 여기서 정의된 것과 같이 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 뉴클레오타이드 아날로그/변형, 예를 들어 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형이다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 뉴클레오타이드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 뉴클레오타이드의 당의 화학적 변형이다. 게다가, 본 발명과 관련된 염기 변형은 뉴클레오타이드의 염기 부의 화학적 변형이다. 이 문맥에 있어서 뉴클레오타이드 아날로그 또는 변형은 바람직하게는 전사 및/또는 번역을 위해 적용 가능한 뉴클레오타이드 아날로그로부터 선택될 수 있다.
당 변형
본 발명의 내용에 있어서 사용되는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 부(moiety)에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 2' 하이드록시기 (OH)는 수많은 다른 "옥시" 또는 "디옥시" 치환기로 대체되거나 변형될 수 있다. "옥시"-2' 하이드록시기 변형의 예는, 여기에 제한된 것은 아니지만, 알콕시 또는 아릴옥시 (-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 고리알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)NCH2CH2OR; 예를 들어 메틸렌 브릿지에 의해 2' 하이드록시기가 동일 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠긴" 핵산 (LNA); 및 아미노 그룹 (-O-아미노, 상기 아미노기는, 예를 들어 NRR은 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민, 폴리아미노) 또는 아미노알콕시를 포함한다.
"데옥시" 변형은 수소, 아미노 (예를 들면, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로싸이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 다이헤테로아릴 아미노, 또는 아미노 산)를 포함하며; 또는 아미노 그룹은 링커(linker)를 통해 당에 연결될 수 있으며, 상기 링커는 하나 또는 이상의 C, N, 및 O 원자를 포함한다.
당 그룹은 또한 리보스에서 상응하는 탄소의 입체화학 형태(configuration)와 반대되는 입체화학 형태를 가지는 하나 또는 그 이상의 탄소를 가질 수 있다. 따라서, 변형된 뉴클레오타이드는 당으로 예를들면, 아라비노스(arabinose)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
백본 변형
포스페이트 백본은 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드에서 더 변형될 수 있다. 백본의 포스페이트 그룹은 하나 또는 그 이상의 산소원자를 다른 치환기로 치환함으로써 변형될 수 있다. 게다가, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 여기에서 설명되는 것과 같이 변형되지 않은 포스페이트 부를 변형된 포스페이트로의 완전한 치환을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 그룹의 예는, 여기에 한정된 것은 아니지만, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로젠 포스페이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스터를 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 둘다 황으로 치환된 논-링킹 산소를 갖는다. 포스페이트 링커는 또한 링킹 산소를 질소 (가교된 포스포로아미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌-포스포네이트)로 치환함으로써 변형될 수 있다.
염기 변형
본 발명에서 이용될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 부에서 더 변형될 수 있다. RNA에서 발견되는 핵염기의 예는, 여기에 한정된 것은 아니지만, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우리실이 있다. 예를 들어, 여기서 설명되는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 주 홈(mafor groove) 면에서 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시예에서, 주 홈의 화학적 변형은 아미노기, 티올(thiol)기, 알킬기, 또는 할로기를 포함할 수 있다.
특히 본 발명의 바람직한 실시는, 뉴클레오타이드 아날로그/변형은 염기 변형으로부터 선택되며, 상기 염기 변형은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-디옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸 이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알킬시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알킬우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도-2'디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아자이도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 잔토신-5'-트리포스페이트로부터 선택된다. 특히 선호되는 것은 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 염기-변형된 뉴클레오타이드의 군에서 선택된 염기 변형을 위한 뉴클레오타이드로 주어진다.
다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-단일 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드로티우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카보시메틸-우리딘, 1-카보시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오- 1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸- 1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘, 다이하이드로??우리딘, 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다.
다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 슈도아이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드로시메틸시티딘, 1-메틸-슈도아이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도아이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도아이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도아이소시티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도아이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도아이소시티딘을 포함한다.
다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-아이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드로시아이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-다이메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸-이노신, 오신,와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-다이메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-다이메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.
다른 실시예에서, 뉴클레오타이드는 주 홈(major groove) 면에서 변형될 수 있고 우라실의 C-5위치의 수소는 메틸기 또는 할로기로 치환되는 것을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘이다.
특정한 실시예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, α-티오-시티딘, 슈도-아이소-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-아이오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-다이하이드로우리딘, α-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드로시-우리딘, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, 슈도-아이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, α-티오-아데노신, 8-아자이도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로부터 선택된 뉴클레오사이드 변형을 포함한다.
더 변형된 뉴클레오타이드는 앞서 설명되어왔다 (WO2013052523).
수율: 수율이란, 또한 반응 수율로 언급되는데, 화학 또는 촉매 반응에서 얻어지는 생성물의 양을 말한다. 절대 수율은 그램 또는 몰 (몰 수율)로 나타낸 질량으로 주어질 수 있다. 상대 수율, 분율 수율, 또는 퍼센트 수율은 합성 과정의 효율성을 측정하기 위함으로, 얻어진 생성물의 양을 이론적 수율로 나눔으로써 계산된다(두 측정의 단위는 반드시 동일해야 함).
상대 수율 = (실제 수율)/(이론에 의한 수율)
실제 수율: 실제 수율이란, 화학 반응에서 얻어진 생성물의 양을 나타낸다.
이론 수율: 이론 수율이란 완벽히 효율적인 화학 또는 촉매 반응에서 생성될 수 있는 생산물의 최대량이다. 현실에서, 대부분의 반응들은 완벽하게 효율적이지 않으므로 - 반응의 실제 수율은 항상 이론 수율보다 적다. 이론 수율은 제한 반응물의 몰랄 양에 기반하여 반응의 화학양론을 고려하여 계산된다. 계산을 위해 통상적으로 단 하나의 반응만이 포함되어있다고 가정한다.
RNA 수율: RNA 수율은 인비트로 전사 반응에서 얻어지는 RNA 생성물의 양이다. RNA 수율은 RNA 농도 (g/ml 또는 mol/l)로 표현될 수 있다. RNA 농도와 반응 부피의 곱은 RNA 의 절대량을 (grams 또는 moles 로) 주어준다.
실제 RNA 수율: 실제 RNA 수율은 제한된 시간, 예를 들어 반응의 완성 후 수율과 같이 제한된 시점에서 인비트로 전사 반응에서 RNA 생성물의 실험적으로 결정된 양이다. 예를 들면, RNA 농도는 분광 광도계를 이용하여 260nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정될 수 있다(Kolitz et al., 2013. Methods Enzymol. 530:331-6). 260nm에서의 1 흡광 단위는 RNA 의 40 ng/μl에 상응한다 (1 A260 = 40 ng/μl RNA).
이론적 RNA 수율: 이론적 RNA 수율은 인비트로 전사 반응에서 이용가능한 NTPs에 기반하여 최대 가능한 RNA 수율이다. 네 종류 NTPs (ATP,GTP,CTP,UTP)의 동일 농도로 하는 표준 전사 반응에서는 전형적으로 RNA 서열에서 가장 빈번한 뉴클레오타이드가 제한 요인이 된다. 대상인 RNA 서열을 위해 서열-최적화된 NTP 혼합물을 이용하는 서열-최적화된 전사 반응에서는 각각의 뉴클레오타이드 중 그 어느 것도 제한 요인이 되지 않는다.
전사 반응에 있어 이론적 RNA 수율을 계산하기 위해, 전사반응의 시적 시점에 존재하는 각각의 NTP 의 (mol단위의) 양은 합성될 수 있는 RNA 분자의 가능한 (mol단위의) 수에 결과하는 RNA 분자의 서열에 나타나는 각각의 뉴클레오타이드의 수로 나누어진다. RNA 분자량을 곱함으로써 이론적 RNA 수율을 질량 단위 (gram)로 나타낸다. 각각 NTP의 동일 농도를 이용하는 표준 전사 반응에서 통상적으로 RNA서열에 가장 빈번한 뉴클레오타이드에 상응하는 NTP는 제한 요인이 된다. 대조적으로, 서열-최적화된 전사 반응에서는 어떤 NTP도 제한 요인이 되지 않는 이유는 모든 종류의 NTPs가 RNA 분자의 서열에서 상응하는 뉴클레오타이드와 같은 비율로 존재하기 때문이다.
상대적RNA 수율: 상대적 RNA 수율, 비율 RNA 수율, 또는 퍼센트 RNA 수율은 인비트로 전사 반응의 효율성을 측정하기 위함으로, 얻어진 RNA 생성물의 양 (실제 RNA 수율)을 이론적 RNA 수율로 나눔으로써 계산된다 (두 측정의 단위는 반드시 동일해야 한다).
상대적 RNA 수율 = (실제 RNA 수율)/(이론적 RNA수율)
인비트로 전사 반응의 효율성을 표현하기 위해, 퍼센트 RNA 수율은 계산될 수 있다:
% RNA 수율 = (실제 RNA 수율)/(이론적 RNA 수율) x 100
본 발명의 상세한 설명
첫 번째 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하며 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 방법과 관련된 발명이다:
a) 상기 RNA 분자에서 네 종류 뉴클레오타이드 G, A, C 및 U 각각의 비율 (1)을 결정하는 단계, 및
b) 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 전사에 의해 상기 RNA 분자를 합성하는 단계, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물은 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하며, 반응 혼합물에서 상기 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 각각의 비율 (2)는 상기 RNA 분자, 버퍼, DNA 주형, 및 RNA 중합효소에서 각각의 뉴클레오타이드의 비율 (1)에 상응함.
본 발명의 내용에 있어서 실시예1과 도5 및 6에서 보여지는 것과 같이, 인비트로 전사에 의해 주어진 서열의 RNA 분자의 생산을 위해 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 서열-최적화된 반응 혼합물의 사용은 모든 네 종류의 NTPs가 동일한 초기 농도를 갖는 최적화되지 않은-반응 혼합물과 비교하여 높은 RNA수율 및 포함되지 않는 것이 적어지고 따라서 덜 낭비되는 NTPs에 결과한다. 이러한 측면은 합성하기 어렵고 따라서 비싼 변형된 뉴클레오타이드가 이용되는 경우 특히 가치가 있다. 서열-최적화된 NTP 혼합물에서 GTP, ATP, CTP 및 UTP는 상기 RNA 서열에서 보이는 상기 뉴클레오타이드 G,A,C, 및 U의 비율에 상응하는 비율로 대표된다. 서열-최적화된 인비트로 전사 반응에서, 네 종류의 NTPs는 동일한 정도로 소비되고 전사는 NTPs가 모두 소진될 때까지 계속되어 따라서 적은 물질을 낭비하게 될 것으로 예상된다.
게다가, 예를 들어 자가-보완적인 3' 확장으로 인한(Triana-Alonso et al., 1995, JBC; 270(11): 6298-6307), 암호화된 RNA 보다 더 긴 RNA 분자의 합성에 대한 앞서 언급된 가능성은 반응의 말미에 과량의 UTP가 남지 않기 때문에 서열-최적화된 NTP 혼합물을 이용할 때에 회피될 수 있음이 예상된다. 특히 RNA가 mRNAs같은 RNAs에서 일반적인 폴리 (A) 꼬리를 포함하는 경우, 전사 반응에서 과량의 포함되지 않은 UTP는 폴리-A-서열의 반대에 있는 우리딘 뉴클레오타이드의 RNA-주형 의존적인 포함(incorporation)을 초래할 수 있으며, 이는 선천적 면역 반응을 활성화하고 단백질 합성을 감소시킬 수 있는 이중-가닥의 RNA 분자를 초래한다(Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res.; 39(21): e142).
아래에서 상세히 설명될 바와 같이, 인비트로 전사를 이용한 RNA 분자의 생산을 위한 방법은 이미 알려진 기술이다. 예를 들어 RNA 분자의 안정성을 증가시키기 위한 뉴클레오타이드 아날로그를 이용하는 것 또한 알려져 있다. 본 발명은 인비트로 전사 반응의 반응 혼합물에서 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 농도에 관한 것이다.
결과적으로, 본 발명의 방법에 있어 첫 번째 단계에서, 상기 RNA 분자에서 네 종류 뉴클레오타이드 G,A,C, 및 U 각각의 비율(1)은 결정된다. 이것은 이미 알려진 기술에 의하여, 예를 들어 간단하게 뉴클레오타이드의 수를 세는 것 또는 컴퓨터에-기초한 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다.
뉴클레오타이드 각각의 비율(1)은 그 다음 수, 퍼센트, 몰 분율 또는 몰랄 퍼센트를 포함하는 어떠한 적합한 용어로써 표현될 수 있다. 몰랄 분율 (xi) 은 (몰로 표현된) 모든 구성성분의 양, ni, 을 혼합물에서 모든 구성성분의 총 량, ntot로 나눈 것으로 정의된다. 모든 몰 분율의 합은 1이다. 분모를 100으로 표현한 동일한 개념이 몰 퍼센트 또는 몰랄 퍼센트 (mol%)이다.
본 발명의 방법에 있어 그 다음 단계에서, 상기 RNA 분자에서 뉴클레오타이드 각각의 비율의 결정에 기초하여, 상기 RNA 분자는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 전사에 의해 합성되고, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물은 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP 또는 그 유사체를 포함하며, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에서 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 각각의 비율(2)는 상기 RNA분자에서 각각의 뉴클레오타이드의 비율(1)에 상응한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어 단계 b)는 하기의 단계를 포함한다.
b1) 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물을 제조하는 단계, 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에서 상기 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 각각의 비율 (2)은 상기 RNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드 비율 (1)에 상응함, 및
b2) 단계(b1)의 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물, 버퍼, DNA 주형, 및 RNA 중합효소를 포함하는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 전사에 의해 상기 RNA 분자를 합성하는 단계.
이 바람직한 실시에 있어, 결과적으로 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물은 반응 혼합물에 다음으로 추가되는 비율 (1)의 결정에 기초하여 제조된다. 서열-최적화된 반응 혼합물의 측면으로 위에서 나타낸 모든 정의 및 특히 “비율 (1)은 비율 (2)에 상응함”이라는 측면에서 만들어진 것들은 또한 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에 적용된다.
이 내용에 있어, 통상의 기술자는 상기 RNA 분자가 모든 뉴클레오타이드 G, A, C, 및 U 각각을 포함하지 않는 경우, 같은 경우가 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에 또한 적용되고 서열-최적화된 반응 혼합물에 적용될 것이라는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따르면, “비율 (1)은 비율 (2)에 상응한다”는 것은 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 비율이 RNA 분자에서 뉴클레오타이드의 비율에 맞춰진 것을 의미한다. 통상의 기술자는 비율 (2)가 정확히 비율 (1)을 보여줄 필요는 없지만, 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 각각의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 개별적인 비율 (2)이 상기 RNA 분자에서 상응하는 뉴클레오타이드의 비율 (1)을 반영해야 함이 요구되는 것을 이해할 것이다.
비율(1)과 비율(2)사이의 더 구체적인 관례에 접근해보면, “비율(1)이 비율(2)에 상응한다”는 용어의 정의를 위해 하기의 사항이 고려될 것이다.
a) 본 발명의 한 가지 실시예에 따르면, 합성되어야 하는 RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 상응하는 서열-최적화된 반응 혼합물 또는 서열-최적화된 NTP 혼합물에서 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 비율에 대한 측면에서 비율(2)이 비율(1)의 범위에 있는 것, 예를 들어 비율 (1) 및 비율 (2)의 차이가 25%, 20%, 15%, 10%, 7%, 5% 이하 또는 0.1% 와 5% 사이의 값인 것이 가능하다.
b) 상기 RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 상응하지 않는 서열-최적화된 반응 혼합물 또는 서열-최적화된 NTP 혼합물에서 다른 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트에 대한 측면에서, 비율 (2)은 바람직하게는 비율 (1)의 범위에 있는 것, 예를 들어 비율 (1)과 비율 (2)의 차이가 25%, 20%, 15%, 10%, 7%, 5% 또는 0.1% 와 5% 사이의 값이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 개시 뉴클레오타이드는 인비트로 전사의 개시 전에 서열-최적화된 NTP혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에 첨가된다. 개시 뉴클레오타이드는 상기 RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 상응하는 뉴클레오타이드이다 (+1 위치). 개시 뉴클레오타이드는 특히 RNA 중합효소의 개시 비율을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 상기 개시 뉴클레오타이드는 또한 이미 알려진 기술이며 뉴클레오사이드 모노포스페이트, 뉴클레오사이드 다이포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함한다. 개시 뉴클레오타이드는 모노뉴클레오타이드, 다이뉴클레오타이드 또는 트리뉴클레오타이드가 될 수 있다. 상기 RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드가 G인 경우에 있어, 개시 뉴클레오타이드는 바람직하게 GTP 또는 GMP이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 개시 뉴클레오타이드는 다이뉴클레오타이드이다. 훨씬 더 바람직한 실시예로는 개시 뉴클레오타이드는 캡 아날로그이다.
바람직한 실시예로, 캡 아날로그는 G[5']ppp[5']G, m7G[5']ppp[5']G, m3 2,2,7G[5']ppp[5']G, m2 7,3'-OG[5']ppp[5']G (3'-ARCA), m2 7,2'-OGpppG (2'-ARCA), m2 7,2'-OGppspG D1 (β-S-ARCA D1) 및 m2 7,2'-OGppspG D2 (β-S-ARCA D2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
그러나 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서, 상기 RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 상응하는 개시 뉴클레오타이드는 상기 RNA 분자의 첫 번째 위치에서 발견되는 상기 RNA 분자에 있는 그 뉴클레오타이드의 비율과 비교하여 과량 첨가된다.
바람직하게 개시 뉴클레오타이드는 초기 농도가 대략 1 내지 20 mM, 1 내지 17.5 mM, 1 내지 15 mM, 1 내지 12.5 mM, 1 내지 10 mM, 1 내지 7.5 mM, 1 내지 5 mM 또는 1 내지 2.5 mM의 범위에서 첨가된다. 심지어 더 바람직한 개시 뉴클레오타이드는 약 5 내지 20 mM 또는 7.5 내지 17.5 mM의 초기 농도로 첨가된다.
상기의 바람직한 실시예에서, RNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드는 G이며, 개시 뉴클레오타이드는 G의 캡 아날로그이고 상응하는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 GTP이다. 이 실시예에서, 캡 아날로그는 GTP와 비교하여 과량으로 반응 혼합물에 존재한다. 바람직하게는 캡 아날로그는 초기 농도가 약 1 내지 20 mM, 1 내지 17.5 mM, 1 내지 15 mM, 1 내지 12.5 mM, 1 내지 10 mM, 1 내지 7.5 mM, 1 내지 5 mM 또는 1 내지 2.5 mM의 범위에서 첨가된다. 훨씬 더 바람직한 캡 아날로그는 초기 농도 약 5 내지 20 mM, 7.5 내지 20 mM, 10 내지 20 mM 또는 12.5 내지 20 mM로 첨가된다.
인비트로 전사에 대한 방법은 이미 알려진 기술이다(Geall et al., 2013. Semin. Immunol. 25(2): 152-159; Brunelle et al., 2013. Methods Enzymol. 530:101-14). 상기 방법에서 이용되는 시약은 통상적으로 다음을 포함한다:
1) 박테리오파지-암호화된 RNA 중합효소와 같이 각각의 RNA 중합효소에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 프로모터 서열을 가진 선형화된 DNA 주형,
2) 네 종류 염기 (아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)을 위한 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs);
3) 위에서 정의된 캡 아날로그 (예를 들어, m7G(5')ppp(5')G (m7G));
4) DNA-의존적인 RNA 중합효소 (예를 들어, T7, T3 또는 SP6 RNA 중합효소);
5) 오염원인 리보뉴클리에이즈를 비활성화하기 위한 리보뉴클리에이즈(RNase) 억제제;
6) 전사를 억제할 수도 있는 파이로포스페이트를 손상시키기 위한 파이로포스파테이즈;
7) 중합효소를 위한 보인자(co-factor)로서 Mg2+를 공급하는 MgCl2;
8) 적합한 pH 값을 유지하기 위한 버퍼, 상기 버퍼는 또한 항산화제 및 스페르미딘과 같은 최적의 농도의 폴리아민을 포함할 수 있음.
바람직한 실시예에 따르면, 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 본 발명의 방법을 위해 이용되는 서열-최적화된 반응 혼합물은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰 산 (HEPES) 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인(Tris)로 이루어진 군에서 선택된 버퍼를 포함한다. 바람직하게는 버퍼는 10 내지 100 mM, 10 내지 75 mM, 10 내지 50 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 20 mM의 농도로 이용된다. 버퍼의 pH 값은 예를 들어, NaOH, KOH 또는 HCl로 조절될 수 있다. 바람직하게 버퍼는 6 내지 8.5, 6.5 내지 8.0, 7.0 내지 7.5의 pH값을 가질 수 있으며, 훨씬 더 바람직하게는 7.5의 값을 갖는다. 가장 바람직한 것은 80 mM의 HEPES/KOH, pH 7.5 및 40 mM Tris/HCl, pH 7.5로 이루어진 군에서 선택된 버퍼이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물에 포함된 RNA 중합효소는 T3, T7 및 SP6 RNA 중합효소로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, RNA 중합효소의 농도는 약 1 내지 100 nM, 1 내지 90 nM, 1 내지 80 nM, 1 내지 70 nM, 1 내지 60 nM, 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 1 내지 20 nM, 또는 약 1 내지 10 nM이다. 더 바람직하게는, RNA 분자의 농도는 약 10 내지 50 nM, 20 내지 50 nM, 30 내지 50 nM이다. 가장 바람직한 것은 약 40 nM RNA 중합효소 농도이다. 이 내용에 있어서 RNA 중합효소의 500 내지 10000 U/ml의 농도가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 1000 내지 7500 U/ml의 농도이며, 가장 선호되는 것은 RNA 중합효소의 2500 내지 5000 Units/ml의 농도이다. 통상의 기술자는 RNA 중합효소 농도의 선택이 DNA 주형의 농도에 의해 영향 받는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물에 포함된 DNA 주형의 농도는 약 1 내지 50 nM, 1 내지 40 nM, 1 내지 30 nM, 1 내지 20 nM, 또는 약 1 내지 10 nM이다. 훨씬 더 바람직한 DNA 주형의 농도는 약 10 내지 30 nM이다. 가장 선호되는 DNA 주형의 농도는 약 20 nM이다. 이 내용에 있어서 약 1 내지 200 μg/ml의 DNA 주형의 농도를 갖는 것이 특히 바람직하고 더 바람직하게는 약 10 내지 100 μg/ml이며, 가장 바람직한 것은 약 20 내지 50 μg/ml (예를 들면, 25또는50 μg/ml )이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물은 파이로포스파테이즈를 포함한다. 바람직하게는 파이로포스파테이즈의 농도는 약 1 내지 20 units/ml, 1 내지 15 units/ml, 1 내지 10 units/ml, 1 내지 5 units/ml, 또는 1 내지 2.5 units/ml이다. 훨씬 더 바람직한 파이로포스파테이즈의 농도는 약 1 units/ml 또는 약 5 units/ml이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물은 Mg++이온을 포함한다. 바람직하게는, Mg++이온은 MgCl2 또는 Mg(OAc)2의 형태로 제공된다. 바람직하게는, 초기의 자유 Mg++농도는 약 1 내지 100 mM, 1 내지 75 mM, 1 내지 50 mM, 1 내지 25 mM, 또는 1 내지 10 mM이다. 훨씬 더 바람직한 초기 자유 Mg++농도는 약 10 내지 30 mM 또는 약 15 내지 25 mM이다. 가장 선호되는 초기 자유 Mg++농도는 약 24 mM이다. 통상의 기술자는 Mg++농도의 선택이 초기 총 NTP 농도에 의해 영향 받는 을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물은 RNA 중합효소를 활성 상태로 유지하기 위해 환원제를 포함한다. 바람직하게는, 환원제는 다이티오트레이톨 (DTT), 다이티오에리트리톨 (DTE), 트리스(2-카복시에틸)포스파인 (TCEP) 및 β-멀캡토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 환원제의 농도는 약 1 내지 50 mM, 1 내지 40 mM, 1 내지 30 mM, 또는 1 내지 20 mM, 또는 1 내지 10 mM이다. 훨씬 더 바람직한 환원제의 농도는 10 내지 50 mM 또는 20 내지 40 mM이다. 가장 바람직한 것은 40 mM의 DTT를 포함하는 서열-최적화된 반응 혼합물이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물은 폴리아민을 포함한다. 바람직하게는, 폴리아민은 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는 폴리아민의 농도는 약 1 내지 25 mM, 1 내지 20 mM, 1 내지 15 mM, 1 내지 10 mM, 1 내지 5 mM, 또는 약 1 내지 2.5 mM이다. 훨씬 더 바람직한 폴리아민의 농도는 약 2 mM이다. 가장 바람직한 것은 2 mM의 스페르미딘을 포함하는 서열-최적화된 반응 혼합물이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 반응 혼합물은 리보뉴클리에이즈 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 리보뉴클리에이즈 억제제의 농도는 약 1 내지 500 units/ml, 1 내지 400 units/ml, 1 내지 300 units/ml, 1 내지 200 units/ml, 또는 1 내지 100 units/ml이다. 훨씬 더 바람직한 리보뉴클리에이즈 억제제의 농도는 약 200 units/ml이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 초기의 전체 NTP 농도는 20 mM미만, 15 mM미만, 10 mM미만, 7.5 mM미만, 5.0 mM미만, 또는 2.5 mM미만이다.
본 발명에 따르면, 초기의 총 뉴클레오타이드 농도라는 용어는 서열-최적화된 반응 혼합물의 다양한 구성요소가 인비트로 전사 반응을 수행하기 위한 최종 부피로 조작되었을 때, 처음부터 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에 존재하는 NTPs의 총 농도, 예를 들어 ATP, GTP, CTP 및/또는 UTP 농도의 총 합이다. 자연적으로, 반응이 진행함에 따라서 뉴클레오타이드는 RNA 분자로 포함될 것이고 결과적으로 전체 뉴클레오타이드의 농도는 점진적으로 초기의 값으로부터 감소될 것이다.
본 발명의 중요한 측면은 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물이 낮은 초기의 총 뉴클레오타이드 농도 (예를 들면 2mM)에서도 RNA 합성의 증가된 효율을 이끌어낸다는 것이다. 대조적으로, 증가된 RNA 수율을 위해 12 mM에서40 mM의 순서로 총 뉴클레오타이드의 높은 농도가 필요하다는 것은 이미 제시되어 왔다 (US6586218).
게다가, 짧은 실패한 RNA 분자의 합성은 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 낮은 초기의 총 뉴클레오타이드 농도 (예를 들면 2.5mM)가 이용될 때 감소될 것이 예상된다. 대조적으로, 실패한 전사의 증가는 표준 동량의 NTP 혼합물의 NTP 농도가 대략 2mM이하로 낮아지는 경우 관찰되었다(Kern et al., 1999. Biotechnol. Prog. 15, 174-184).
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 NTPs가 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에 첨가되는 형태와 관련된다. 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP 또는 그 유사체들은 카운터이온으로서 1가 또는 2가의 양이온과 함께 제공될 수 있다. 바람직하게는 1가 양이온은 Li+, Na+, K+, NH4+ 또는 트리스(하이드록시메틸)-아미노메테인 (트리스)로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 1가 양이온은 Mg++, Ba++ 및 Mn++으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 가장 선호되는 실시예에 따르면, NTP 카운터이온은 트리스(하이드록시메틸)-아미노메테인 (트리스)이다.
박테리오파지 RNA 중합효소는 염 억제에 민감한 것으로 알려진다. RNA 수율에 있어 높은 NaCl 농도의 부정적인 영향은 알려져있다 (e.g. Kern & Davis, 1997. Biotechnol. Prog., 13, 747-756; US 6,586,218 B2). 특히 NTP 피딩(feeding) 전략을 추구할 때 결과로서, Na-NTPs의 높은 농도는 따라서 감소된 RNA 수율을 초래한다. 이러한 제한은 트리스-뉴클레오타이드를 이용함으로써 회피될 수 있는데, 이는 RNA 중합효소 활성이 높은 Na 농도에 비교하여 높은 트리스 농도에 의해서는 덜 영향 받기 때문이다. 실시예 5 및 도 12에서 보여지는 것 같이, RNA 수율은 트리스와 비교할 때 Na의 추가에 더 민감하다.
리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 GTP,ATP,CTP 및 UTP 각각 대신에 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (아날로그)가 또한 인비트로 전사 반응에서, 예를 들면 RNA의 안정성을 강화하기 위해, 사용될 수 있음은 이 기술분야에서 알려져 있다. 실시예 3 및 도 8에서 보여지는 것 같이, 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 UTP의 부분 또는 전체는 슈도-UTP로 대체될 수 있다.
결과적으로, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물에서 적어도 하나의 리보뉴크레오사이드 트리포스페이트의 부분 또는 전체는 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트에의해 대체될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 1-메틸슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트 및 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 군에서 선택된다.
통상의 기술자는 서열-최적화된 NTP 혼합물 또는 서열-최적화된 반응 혼합물의 개개의 구성요소의 농도를 정확히 맞추는 것은 오로지 인비트로 전사의 개시 전에 가능하다는 것을 이해할 것이다. 결과적으로, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 앞서 정의된 것과 같이 수와 비율은 전사의 개시 전에 서열-최적화된 반응 혼합물 또는 서열-최적화된 NTP 혼합물에 존재하는 초기의 상태를 반영한다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시예에 따르면, 인비트로전사의 과정에서 서열-최적화된 반응 혼합물은 여기서 정의된 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물로 보충된다.
본 발명의 내용에 있어서, RNA 수율은 인비트로 전사 반응에 서열-최적화된 NTP 혼합물의 추가적인 양을 공급(feeding)함으로써 더 증가될 수 있다(NTP 피드(feed)). 실시예 1 및 도 6에서 보여지는 것과 같이, 추가적인 서열-최적화된 NTP 혼합물을 추가하는 것은 상당히 RNA 수율을 증가시킨다.
신선한 서열-최적화된 NTP 혼합물은 캡 아날로그 대 상응하는 뉴클레오타이드,예를 들면 GTP,의 의도된 비율 (예를 들면, 4:1)이 유지되는 방식으로 추가된다. 바람직하게는, 신선한 서열-최적화된 NTP 혼합물은 서열-최적화된 반응 혼합물에 있는 모든 뉴클레오타이드가 소진되는 인비트로 전사 반응의 말미에서 추가된다. 잔존하는 캡 아날로그 대 신선하게 추가된 상응하는 뉴클레오타이드 예를 들면 GTP의 비율 (예를 들면, 4:1)은 RNA 분자 당 단 하나의 캡 아날로그만이 포함될 수 있기 때문에 캡 아날로그의 100%에 가까운 수가 전사 반응의 말미에 남아있게 되므로 거의 유지된다. 이 전략은 동일한 캐핑 효율, 증가된 수율( >4.5-폴드(fold), RNA 서열에 의존함.) 및 극적으로 감소된 비용의 결과를 낳는다. 추가적으로, 증가된 NTP 내용물은 표준 NTP 농도에서 (표준 및 서열-최적화된 반응 모두에서) 공통적으로 보이는 전사과정 동안의 RNA 분자의 침전을 막는다.
NTPs의 서열-의존적은 포함은 또한 인비트로 전사 반응의 진전에 대한 관찰을 허가한다. 실시예 6 및 도 13에서 보여지듯이, 인비트로 전사 반응의 진전은 인비트로 전사 반응으로부터 포함되지 않은 뉴클레오타이드를 분리하고 260nm에서 흡광도를 측정합으로써 관찰될 수 있다. 그 이유는 모든 네 종류의 NTPs의 총 농도에서의 감소는 바로 합성된 RNA 의 양에 상응하기 때문이다. 이러한 접근은 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 동일 비율로 있는 표준 NTP 혼합물이 사용되는 경우에는 단도직입적으로는 가능하지 않다. 예를 들면 저 분자량 분리(cut-off)를 하는 막을 통한 여과에 의해, NTPs가 개입을 피하기 위해 RNA 및 DNA로부터 분리되는 경우에 260nm에서 흡광도의 감소는 제조된 RNA 분자로 바로 번역될 수 있다.
핵산 및 뉴클레오타이드의 정량화를 위한 방법은 이미 알려진 기술이다. 핵산 정량화를 위한 분광학적 방법은 전통적인 흡광도 측정 (Kolitz et al., 2013. Methods Enzymol. 530:331-6) 및 에티디움 브로마이드와 같은 형광 염료와 적합한 들뜬 파장 (예를 들면 302 또는 546 nm)으로 형광 광도계를 이용하는 더 민감한 형광 기술을 포함한다 (Gallagher, 2011. Current Protocols in Molecular Biology. 93:A.3D.1-A.3D.14). 결과적으로, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 인비트로 전사에 의한 상기 RNA 분자의 합성은 포함되지 않은 NTPs의 분리 및 정량화가 뒤따른다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 RNA 분자는 논-코딩 및 코딩 RNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
논-코딩 RNA (ncRNA) 분자는 펩티드 또는 단백질로 번역되지 않는 기능적 RNA 분자이다. 논-코딩 RNA 분자는 snoRNAs, microRNAs, siRNAs, snRNAs, exRNAs, 및 piRNAs 및 Xist와 HOTAIR과 같은 예를 포함하는 긴 ncRNA와 더불어 운반 RNA (tRNA) 및 리보솜 RNA (rRNA)와 같이 풍부하고 기능적으로 중요한 RNAs를 포함한다(Esteller, 2011. Nat. Rev. Genet. 12(12):861-74). 게다가 논-코딩 RNA 분자는 면역자극 RNA (isRNA)를 포함한다.
바람직하게는, 면역자극 RNA 는 선형 단일-가닥의 RNA 이다. 훨씬 더 바람직하게는, 면역자극 RNA는 긴 선형 단일-가닥의 논-코딩 RNA 이다. 이 내용에 있어서 isRNA가 5'-말단에서 트리포스페이트를 수반하는 것이 특히 바람직하다.
면역자극 RNA (isRNA)는 면역자극성으로 알려진 어떠한 RNA를 포함할 수 있으며, 여기에는 이것에 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 인간(human family)의 TLR1 내지TLR10 또는 쥐과(murine family)의 TLR1 내지 TLR13, 더 바람직하게는 인간의 TLR1 내지 TLR10, 훨씬 더 바람직하게는 TLR7 및 TLR8으로부터 선택된 TLRs의 리간드, (RIG-I, MDA-5 또는 PKR과 같은) RNA를 위한 세포 내 수용체에 대한 리간드 (Meylan and Tschopp, 2006. Mol. Cell 22, 561-569)를 나타내는 및/또는 인코딩하는 RNA 서열, 또는 기타 면역자극성 RNA 서열을 포함한다. 게다가, 면역자극성 RNA 분자는 선천적 면역 반응을 끌어내는 능력이 있는 기타 RNA를 포함할 수 있다. 여기에 한정되는 것은 아님, 이러한 면역자극성 RNA는 리보솜RNA (rRNA), 전달RNA (tRNA), 메신저RNA (mRNA), 및 바이러스성RNA (vRNA)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 면역자극성 RNA는 논-코딩 RNA이다. 이러한 면역자극성 RNA는 길이 1000내지 5000, 500내지 5000, 5내지 5000, 또는 5내지 1000, 5내지 500, 5내지 250, 5내지 100, 5내지 50 또는 5내지 30개 뉴클레타이드를 포함할 수 있다.
특히 더 바람직한 실시예에 따르면, 이러한 면역자극성 RNA분자는 식 (I)의 RNA로 이루어지거나 또는 포함한다:
(N u G l X m G n N v ) a , (식 (I))
상기:
G 는 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실) 또는 구아노신 (구아닌) 또는 우리딘 (우라실)의 유사체이며, 바람직하게는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이다.
X 는 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실), 아데노신 (아데닌), 티미딘 (티민), 시티딘 (시토신), 또는 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 유사체이며, 바람직하게는 우리딘 (우라실) 또는 그 유사체이다.
N 은 길이 약 4 내지 50, 바람직하게는 4 내지 40, 더 바람직하게는 약 4 내지 30 또는 4 내지 20 개 핵산을 가지는 핵산 서열이며, 각 N은 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실), 아데노신 (아데닌), 티미딘 (티민), 시티딘 (시토신) 또는 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 유사체로부터 독립적으로 선택된다.
a 는 1 내지 20의 정수이며, 바람직하게는 1 내지 15, 더 바람직하게는 1 내지 10의 정수이다.
l 은 1 내지 40의 정수이며,
상기 l =1인 경우, G 는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이며,
l>1인 경우, 적어도 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 50%는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이며;
m은 정수이고 적어도3이다;
상기 m = 3인 경우, X는 우리딘 (우라실) 또는 그 유사체이며, 및
m > 3인 경우, 적어도 3개의 연속적인 우리딘 (우라실) 또는 우리딘 (우라실)의 유사체가 발생하며;
n은 1 내지 40의 정수이다,
상기 n = 1인 경우, G는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이며,
n >1인 경우, 적어도 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 50%는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이다;
u, v 는 1 내지 50의 정수로 각각 독립적이며,
바람직하게는 u = 0인 경우, v
Figure 112016122619642-pct00002
1, 또는
v = 0인 경우, u
Figure 112016122619642-pct00003
1 이다;
상기 식(I)의 핵산 분자는 길이가 적어도 50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 적어도 150개 뉴클레오타이드, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 200개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 적어도 250개 뉴클레오타이드이다.
가장 바람직한 실시예에 따르면, 화학식(I)에 따른 RNA 분자는 예를 들어 하기의 서열로부터 선택될 수 있다:
GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG (R2025; SEQ ID NO: 4)
코딩 RNA는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 기능성 RNA 분자이다. 바람직하게는 코딩 RNA 분자는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 위해 코딩하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
이 내용에 있어서, 코딩 RNA 분자는 하나 (모노시스트론), 두 개 (바이시스트론) 또는 그 이상 (멀티시스트론)의 오픈리딩 프레임 (ORF)를 포함할 수 있다. 코딩 RNA 분자는 메신저 RNA 분자 (mRNA), 바이러스성 RNA 분자 또는 자기-증식 RNA 분자 (리플리콘) 일 수 있다. 바람직하게는 RNA 분자는 mRNA이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 RNA 분자는 100개 뉴클레오타이드보다 길다. RNA가 100 내지 15.000개 뉴클레오타이드, 100 내지 12.500개 뉴클레오타이드, 100 내지 10.000개 뉴클레오타이드, 100 내지 7.500개 뉴클레오타이드, 100 내지 5.000개 뉴클레오타이드, 100 내지 2.500개 뉴클레오타이드, 100 내지 1.500개 뉴클레오타이드, 또는 100 내지 1.000개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 것은 동등하게 바람직한 경우이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 주어진 서열의 RNA 분자의 합성은 대규모로 수행된다.
본 발명에 따르면, "대규모"라는 용어는 mg 수량, 바람직하게는 적어도 1g에 맞는 상기 RNA 분자의 반응 수율을 말한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 인비트로 전사 반응은 전사리액터 또는 RNA의 대규모 합성에서는 RNA 리액터로도 일컬어지는 바이오리액터에서 수행된다. 따라서, 바이오리액터는 본 발명의 위에서 설명된 방법을 수행하기 위해 적응될 수 있다.
본 발명에 따르면, 주어진 서열의 RNA분자를 합성하기 위한 이러한 바이오리액터는, 바람직하게는 대규모로, 모듈식으로 설계된 인비트로 전사 반응 시스템으로, 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 RNA 전사 반응을 수행하기 위한 반응 모듈, 전사된 RNA 분자를 일시적으로 잡기 위한 캡처 모듈, 서열-최적화된 반응 혼합물의 구성요소를 반응 모듈로의 인피드(infeed)를 제어하기 위한 제어 모듈을 포함한다. 여기서, 반응 모듈은 반응 혼합물로부터 뉴클레오타이드를 분리하기 위한 여과막을 포함하며, 제어 모듈에 의한 서열-최적화된 반응 혼합물 구성요소의 인피드에 대한 제어는 분리된 뉴클레오타이드의 측정된 농도에 기반한다.
여기서 사용되는 바이오리액터 또는 전사 리액터라는 용어는 챔버 또는 시험관 또는 칼럼을 말하며 상기 인비트로 전사 반응은 특정한 환경 하에서 수행된다. 바이오리액터는 특정 온도, 일반적으로 4 내지 40 °C를 정확하게 유지하기 위해 열적으로 조절될 것이다. 바이오리액터는 인플로우 또는 피드 라인 및 배출구도 같이 설계될 것이다. 바이오리액터는 다양한 속도의 스터링을 제공하는 스터드-셀(stirred-cell)일 것이다.
본 발명에 따르면, 바이오리액터는 반응 혼합물로부터 뉴클레오타이드를 분리하기 위해, 특히 서열-최적화된 반응 혼합물로부터 뉴클레오타이드 및 다른 저분자량 구성요소를 분리하기 위해 여과 막을 포함한다. 이러한 플로우 시스템에서 여과막, 예를 들면 한외여과막, 의 도입은 예를 들면, 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 고분자량 구성요소를 뉴클레오타이드와 같은 저분자량 구성요소로부터 분리하기 위해 이용된다. 뉴클레오타이드 (NTPs) 와 같이 더 작은 분자는 여과막을 통과해 반응 모듈의 분리된 더 작은 부분, 즉 여과 부분으로 갈 수 있는 반면 여과막은 고정된 DNA 주형, RNA 중합효소 및 합성된 RNA 분자를 선택적으로 반응 모듈의 리액터 중심에서 보존하기 위해 이용된다. 뉴클레오타이드 농도는 그 다음, 예를 들어 저분자량 구성요소를 포함하는 분리된 유체에서 분광학적 분석에 의해 측정될 수 있다. 그렇지 않으면, 뉴클레오타이드 농도는 온라인 HPLC 시스템에 의해 측정될 수 있다. 이 반응 시스템에서 서열-최적화된 NTP 혼합물의 적용은 인비트로 전사 반응 동안 인비트로 전사 반응의 진전을 관찰하기 위해 뉴클레오타이드 농도의 실시간 측정을 허락한다.
적합한 여과막은 통상의 기술자에 자명한 다양한 물질로 이루어질 수 있다 (van de Merbel, 1999. J. Chromatogr. A 856(1-2):55-82). 예를 들어, 막은 재생 또는 변형된 셀룰로스 또는 합성 재료로 이루어질 수 있다. 후자에는 폴리설폰 (PSU), 폴리아크릴로-나이트릴 (PAN), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리아릴에터-설폰, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아미드 의 혼합물(폴리아믹스.RTM)을 포함한다. 예를 들어, 폴리설폰은 폴리에터설폰 [폴리(옥시-1,4-페닐설포닐-1,4-페닐), PES로 생략]을 포함한다. 몇 가지 실시예에서, 폴리에터설폰은 실시에 따른 이용을 위해 반투과막으로 활용될 수 있다. 몇몇의 경우에 PES 막은 PSU 막과 비교하여 증가된 친수성 (및/또는 수분과 함께 막의 개선된 습윤성)을 포함한다. 몇 가지 경우에 PES 막의 습윤성은 예를 들면, 수용성 고분자 폴리비닐피롤리돈의 포함에 의해 더 증가될 수 있다.
여과막을 통과해 분자의 유입에 영향을 미치는 주요한 파라미터는 구멍 크기 또는 쿠멍 -크기 분포다. 여과막은 통상적으로 분자량 분리 (MWCO) 값, 즉 특정한 크기 제한에 의해 특징지어지는데, 이는 가장 작은 구성요소가 90% 이상 보존되기 위한 가장 작은 화합물의 분자량으로 정의된다. 각각의 적용에 있어, 적절한 MWCO 값은 고분자량 화합물이 충분히 보존되지만 동시에 분석물질의 빠른 수송이 보장될 수 있도록 선택될 필요가 있다. 본 발명의 바이오리액터의 여과막은 10내지 100kDa, 10내지 75 kDa, 10 내지 50 kDa, 10 내지25 kDa 또는 10 내지 15 kDa의 범위에서 MWCO를 갖을 것이다. 훨씬 더 바람직하게는, 여과막은 약 10 내지 50 kDa의 범위에서 MWCO를 갖는다. 바람직하게는, 여과막은 셀룰로스, 변형 셀룰로스, 폴리설폰 (PSU), 폴리아크릴로나이트릴 (PAN), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리비닐 알코올 (PVA) 및 폴리에릴에터설폰 (PAES)로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터는 RNA 전사 반응을 위한 기초로서 고체 지지체에 고정된 DNA 주형을 포함한다. DNA 주형의 고정화는 주형의 반복된 사용을 허락하고 잔류 DNA 에 의한 RNA 생성물의 오염을 줄인다. 추가적으로, 고정화는 최종 RNA 생성물로부터 DNA 주형의 제거를 위해 DNAse의 사용을 불필요하게 한다. DNA 주형은 바람직하게는 반응 모듈의 반응 중심에서 고체 지지체에 고정되며, 화학적으로 합성된 DNA 분자, 고립된 DNA 제한 조각, 플라스미드 또는, 예를 들면 중합 연쇄 반응 (PCR) 에 의한 증폭으로 인한, 증폭된 DNA 분자를 대표할 수 있다. DNA 주형은 단일-가닥의 RNA 코딩 영역의 위에 이중-가닥의 프로모터 영역을 포함하는 이중-가닥의 듀플렉스 또는 유닛일 수 있다. DNA 주형은 DNA 가닥의 내부 뉴클레오타이드, 3' 말단, 또는 5'말단의 고체 지지체에 고정을 위한 리간드와 함께 변형될 수 있다.
본 발명에 따르면, "고체 지지체"라는 용어는 표면에 DNA 분자를 고정시킬 수 있는 모든 분해되지 않는 지지체와 관련된다. 고체 지지체는 아가로스, 세파로스, 폴리스티렌, 라텍스, 셀룰로스, 및 페로- 또는 페리마그네틱 입자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 적절한 고체 지지체를 선택하고 상기 고체 지지체에 DNA 분자를 커플링하는 방법 및 전략은 이미 알려진 기술이다 (예를 들면. Arndt-Jovin et al. 1975. Eur. J. Biochem. 54(2):411-8; Kerrigan et al., 2001. Current Protocols in Molecular Biology. 24:12.10.1-12.10.18; WO1995/08626 참조). 고체 지지체에 DNA 주형의 고정은 공유결합 또는 비-공유결합을 통할 수 있다. 바람직하게는, DNA 주형의 고체 지지체는 비-공유 결합을 통해 일어난다. 예를 들어, DNA 주형의 고체 지지체에 고정은 비공유적 바이오틴-스트렙타아비딘 상호작용을 통해 일어날 수 있다. DNA 주형의 논-코딩 가닥은 스트렙타아비딘 단백질을 포함하는 고체 지지체 매질(matrix)에 DNA 가닥을 고정하는 기능을 하는 5'-말단 바이오틴기와 함께 변형 될 수 있다. DNA 주형의 상보적인 RNA-코딩 가닥은 고정되지 않은채로 남아있을 수 있다. 다른 유형의 비공유 결합, 예를 들면, 폴리(A)-폴리(T), 및 폴리(G)-폴리(G) 상호작용을 통해 고체 지지체에 DNA 주형을 고정하는 것 또한 가능하다. 동등히 바람직하게, DNA 주형의 고정화는 공유 결합, 예를 들면, 에스터 결합 또는 그 유도체를 통해 일어날 수 있다. 통상적으로, 커플링 전에, DNA 분자와 커플링 반응을 가능하게 하기 위해 고체 지지체는 NHS, 카르보디이미드 등과 같은 활성기를 포함할 수 있다. DNA 분자는 (예를 들면, 아미노-, 설프하이드릴-, 카복실-, 하이드록실-, 알데하이드-, 및 케톤기와 같은 작용기를 사용하여) 직접 커플링에 의해 고체 지지체에 연결될 수 있다. 고체 지지체 물질에대한 결합은 지지체로부터 DNA 주형의 공간적 분리를 최적화하기 위한 스페이서(spacer)를 포함할 수 있다. 스페이서는 DNA 주형의 5'말단에 추가적인 뉴클레오타이드의 삽입에 의해 공급될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터의 캡처 모듈은 전사된 RNA 분자를 잡고 서열-최적화된 전사 반응 혼합물의 다른 용해성 구성요소로부터 전사된 RNA 분자를 분리하기 위한 수지/고체상을 포함한다. 바람직하게는, 캡처 모듈은 캡처된 전사된 RNA 분자를, 예를 들면 워싱 과정 또는 기타 과정에 의해 정제시키기 위한 수단을 포함한다. 더 바람직하게는, 캡처 모듈은 캡처된 전사된 RNA 분자를 바람직하게는 일루션 버퍼에 의해, 일루팅(eluting)하기 위한 수단을 포함한다.
더 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터는 전사된 RNA 분자를 잡은 후에, 잔류 여과된 서열-최적화된 반응 혼합물, 즉 전사된 RNA 분자와 더불어 서열-최적화된 전사 반응 혼합물의 기타 용해성 구성요소를 캡처 모듈에서부터 반응 모듈로 돌려보내기 위한 환류 모듈을 더 포함하며, 상기 잔류 여과된 서열-최적화된 반응 혼합물을 돌려보내는 수단은 펌프이다. 여기서, 환류 모듈은 바람직하게는 피아로포스파테이즈와 같은 효소, 또는 포스페이트와 같은 망가진 구성요소를 잡기 위한 수지를 포함한다.
바람직한 예에서, 바이오리액터는 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함한다. 본 발명의 내용에 있어서, '이온-선택적 전극'이란 용어는 용액에 용해된 특정한 이온의 활성을 전기적 에너지로 전환하는 변환기 (예를 들면 센서)와 관련되며, 상기 전기적 에너지는 예를 들면, 전압기 또는 pH 측정기를 이용하여 측정될 수 있다. 특히, 여기서 사용되는 '이온-선택적 전극-이란 용어는 선택적 투과도를 갖는 막을 포함하거나 또는 이루어진 시스템을 포함하며, 상기 막은 통상적으로 두 전해질을 분리한다. 여기서 사용되는 이온-선택적 전극은 바람직하게는 선택적 투과도 및 기준 전극을 갖는 막을 포함하는 감지부를 통상적으로 포함한다. 막은 통상적으로 이온-선택적 막이며, 다른 유형의 이온에 대한 다른 투과도에 의해 특징화된다. 바람직하게는, 바이오리액터의 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 유리 막, 고체 상 막, 액체 기반 막, 및 화합물 막으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 실시예에서, 여기서 설명되는 바이오리액터는 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함하며, 상기 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 다른 유형의 이온에 대한 다른 투과도를 갖는, 막, 바람직하게는 여기서 정의된 막, 더 바람직하게는 전기화학적 막을 포함 또는 이루어지며, 상기 막은 바람직하게는 여기서 정의된 막, 더 바람직하게는 전기화학적인 막으로 바람직하게는 두 전극을 구분한다. 한 실시예로, 막은 물과 섞이지 않는 용매에서 전해질 용액 또는 고체 전해질의 층을 포함 또는 이루어진다. 막은 바람직하게는 한 방향 또는 두 방향으로 전해질 용액과 닿아 있다. 바람직한 실시예로, 이온-선택적 전극은 내부의 기준 전극을 포함한다. 이러한 내부 기준 전극은 다른 실시예, 예를 들면 금속 접촉 또는 절연체 또는 반도체 층에 의해 대체될 수 있다.
이온-선택적 전극은 다른 매체에서 이온 활성 또는 이온 농도의, 고도의 예민하고, 빠르고, 정확하며 파괴적이지 않은 측정을 가능하게 한다. 이온 활성 또는 이온 농도의 직접적인 측정 외에도, 특히 전위차 적정에서 아주 정확한 지시전극으로서 또는 작용물질의 정량의 통제를 위한 요인으로서 농도변화의 계속적인 모니터링을 위해 적량선(calibration curve)을 이용함으로써 전극은 기능을 할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 바이오리액터는 바이오리액터의 적어도 하나의 컴파트먼트에서 하나 또는 그 이상 유형의 이온의 농도를 측정하기 위한 적어도 하나의 이온-선택적 전극을, 바람직하게는 여기서 설명된 것과 같은 전극을 포함한다. 예를 들면, 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 바이오리액터의 반응 모듈, 제어 모듈, 또는 환류 모듈에서 하나 또는 그 이상 유형의 이온의 농도를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 반응 모듈에서 하나 또는 그 이상의 유형의 이온의 농도를 측정하기 위해, 더 바람직하게는 반응 코어 또는 여과 부분에서 이용된다. 게다가, 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 바이오리액터의 센서 유닛에, 바람직하게는 여기서 정의된 것 처럼 포함될 수 있다. 이온-선택적 전극은 바이오리액터 자체에, 바이오리액터 위에 또는 바이오리액터 바깥에 (예를 들면, 측관에 의해 바이오리액터에 연결되어) 위치될 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, '바이오리액터는 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함한다'는 문구는 따라서 적어도 하나의 이온-선택적 전극이 바이오리액터의 부분인 상황, 또는 적어도 하나의 이온-선택적 전극이 바이오리액터의 관점으로 별도의 물리적 개체이나 바이오리액터와 연결되어 사용되는 상황을 언급하는 것일 것이다.
몇 개의 실시예에 따르면, 바이오리액터는 바람직하게는 여기에 설명된 것과 같이, 바이오리액터의 적어도 하나의 부분에 포함된 액체에서 하나 또는 그 이상의 유형의 이온의 농도를 측정하기 위해 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함하며, 상기 이온은 바람직하게는 H+, Na+, K+, Mg2 +, Ca2 +, Cl- 및 PO4 3-로 이루어진 군에서 선택된다.
몇 개의 실시예에 따르면, 바이오리액터는 바람직하게는 여기에 설명된 것과 같이, 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함하고 이는 전위차계, 바람직하게는 멀티-채널 전위차계 (예를 들면, a CITSens Ion Potentiometer 6-channel, high-resolution; C-CIT Sensors AG, Switzerland)에 연결된다.
바람직한 실시예에서는, 바이오리액터는 적어도 하나의 이온- 선택적 전극을 포함하며, 상기 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 바람직하게는 튜브 전극, 더 바람직하게는 Mg2 + 선택적 튜브 전극, Na+ 선택적 튜브 전극, Cl- 선택적 튜브 전극, PO4 3- 선택적 튜브 전극, pH-선택적 튜브 전극 및 Ca2 + 선택적 튜브 전극으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 전위차계에 연결되어 이용된다.
훨씬 더 바람직하게는, 바이오리액터는 적어도 하나의 이온-선택적인 전극을 포함하며, 상기 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 바람직하게는 CITSens Ion Mg2 + 선택적인 미니-튜브 전극, CITSens Ion Na+ 선택적 미니-튜브 전극, CITSens Ion Cl- 선택적 미니-튜브 전극, CITSens Ion PO4 3- 선택적 미니-튜브 전극, CITSens Ion pH-선택적 미니-튜브 전극 및 CITSens Ion Ca2 + 선택적 미니-튜브 전극 (모두 C-CITSens Sensors AG, Switzerland로부터)으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 전위차계와, 더 바람직하게는 CITSens Ion Potentiometer 6-channel, high-resolution (C-CIT Sensors AG, Switzerland)와 같은 멀티-채널 전위차계와 연결된다.
이온-선택적 전극은 실용적인 사용에 있어 많은 장점이 있다. 예를 들면, 그들은 테스트한 용액에 영향을 미치지 않는다, 따라서 파괴적이지 않은 측정을 가능하게 한다. 게다가, 적정 센서 뿐만 아니라 직접적인 측정에 있어 유독적이고 적합하며 비용 효율적이다. 바이오리액터 (예를 들면, 전사 리액터)에서 이온-선택적 전극의 사용에 대한 주요 장점은 샘플 수집이 없고 파괴적이지 않은 방식으로 측정이 가능하다는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터, 또는 더 정확히 바이오리액터의 제어 모듈은 서열-최적화된 반응 혼합물에서 pH-값, 전도성 및 뉴클레오타이드 농도와 같은 중요한 반응 지표의 분석을 위한 센서 유닛을 포함한다. 바람직하게는, 바이오리액터의 센서 유닛은 인비트로 전사 반응 동안 뉴클레오타이드 농도의 실시간 측정을 위해, UV 260/280 nm를 위한 UV 플로우 셀과 같은 센서를 포함한다. 바람직하게는, 센서 유닛의 센서는 광도계 분석에 의하여 진행 지표로서 뉴클레오타이드 농도를 측정한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터는 제어 모듈을 포함한다. 제어 모듈에 의한 데이터 수집 및 분석은 서열-최적화된 NTP 혼합물의 구성요소 또는 서열-최적화된 반응 혼합물, 예를 들면 버퍼 구성요소, RNA 중합효소 또는 뉴클레오타이드의 반복된 피드를 위한 통합된 펌프계 (작동기)의 제어를 가능하게 한다. 엄격한 제어 및 조절은 높은 생산 수율에 결과하는 최적의 정상-상태 환경 하에서 인비트로 전사 반응을 수행하는 것을 가능하게 한다. 바람직하게는 제어 모듈은 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물의 서열-최적화된 반응 혼합물로의 추가를 조절하며, 바람직하게는 상기 바이오리액터는 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물의 서열-최적화된 반응 혼합물로의 첨가를 위한 작동기를 포함한다. 게다가, 작동기는 또한 버퍼 구성요소, 또는 Mg++과 같은 서열-최적화된 반응 혼합물의 다른 반응 구성요소를 인비트로 전사 반응 혼합물에 추가한다. 본 발명의 더 바람직한 실시예에 따르면, 바이오리액터는 세미-배치 모드 또는 연속적인 모드로 작동한다. 여기서 사용되는 세미-배치라는 용어는 인비트로 전사 반응이 반복적인 일련의 전사 반응으로 수행되는 것을 말한다. 예를 들면, 반응은 유한한 시간 동안 생성물이 제거되고, 새로운 반응물이 추가되고, 완벽한 반응이 반복되며 진행되는 것이 가능하다. 여기에서 사용되는 계속적-흐름이라는 용어는 삽입 피드 라인을 통해 계속적으로 추가된 보충적인 반응물과 출구 부분을 통해 끊임없이 제거된 생성물과 함께 바이오리액터 중심에서 계속적으로 수행되는 반응을 말한다. 계속적-흐름 리액터는 통제된 장치의 흐름 속도를 통해 시약 운반 및 생성물 제거를 제어하며, 이는 시약 제한과 제한적인 생성물이 있는 반응에 있어 유익하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에 공개된 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 RNA 분자에 관련된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법 발명에 의해 얻어진 RNA는 선행기술의 방법에 의해 얻어진 RNA, 특히 표준적인 동일량의 NTP 혼합물을 이용하는 방법처럼 NTP 혼합물이 전사 서열에 대해 최적화가 되지 않은 인비트로 전사 방법에 의해 얻어진 RNA와 비교하여 감소된 면역자극 활성의 특징이 있다.
더 나아가, 본 발명은 또한 주어진 서열의 RNA 분자에 대해 최적화된, 상기 RNA 분자의 합성을 위한 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물의 이용에 관련된다. 본 발명의 방법의 측면에서 위에서 만들어진 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물과 관련된 모든 정의 및 구체적 실시예는 또한 본 발명의 상기 이용에 적응된다.
특히, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열-최적화된 NTP 혼합물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 최적화된다:
a) 상기 RNA 분자에서 네 종류 뉴클레오타이드 G, A,C 및 U 각각의 비율(1)을 결정하는 단계, 및
b) 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물을 제조하는 단계, 상기 서열-최적화된 리본클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에서 네 종류 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 각각의 비율(2)은 상기 RNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드의 비율(1)에 상응함.
나아가, 본 발명은 또한 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 GTP, ATP, CTP 및 UTP 를 포함하는 주어진 서열의 RNA분자의 합성을 위한 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물과 관련되며, 상기 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물에서 네 종류 뉴클레오사이드 트리포스페이트 각각의 비율(2)는 상기 RNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드의 비율(1)에 상응한다.
나아가, 본 발명은 또한 위에서 정의된 주어진 서열의 RNA 분자를 위해 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물을 포함하는 키트와 관련된다. 서열-최적화된 NTP혼합물은 네 종류의 NTPs (GTP, ATP, CTP 및 UTP)를 포함하는 하나의 튜브 또는 각각의 NTP를 분리된 튜브로 제공될 수 있다. 본 발명의 방법의 측면에서 위에서 내려진 모든 정의 또는 특정한 실시예는 또한 본 발명의 상기 키트에 적용될 수 있다.
본 발명에 의한 RNA 합성은 서열-최적화된 반응 혼합물의 사용으로 낭비되는 시약을 줄이며, 주어진 서열의 RNA 생성물의 수득률을 높인다. 이는 불필요한 시약에 의한 의도치 않은 생성물을 줄이 수 있게 되고, 표준 전사 반응물을 사용한 합성과 비교하여 단백질 발현 면에서 우수하고, 선천적 면역 반응 활성도를 낮추는 효과가 있게 된다.
하기에서 보이는 도면은 단지 설명용이며, 더 나은 방법으로 본 발명을 설명할 것이다. 이 도면은 이것에 따라 본 발명을 제한하기 위함이 아니다.
도1 : 호모 사피엔스(Homo Sapiens) 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA)을 코딩하는 R1871의 G/C 최적화된 mRNA 서열로, SEQ ID NO: 1 에 상응함.
도2 : Photinus pyralis 루시퍼레이즈 (PpLuc)를 코딩하는 R2988의 G/C 최적화된 mRNA 서열로, SEQ ID NO: 2 에 상응함.
도3 : 호모 사피엔스 Mucin-1 신호 펩티드/표피 성장 인자 수용체/ Mucin-1퓨전 단백질 (EGFR/Mucin-1)을 코딩하는 R1626의 G/C 최적화된 mRNA 서열로, SEQ ID NO: 3 에 상응함
도4: R2025의 논-코딩 면역자극 RNA 서열로, SEQ ID NO:4에 상응함.
도5: HsPSCA (R1871) 및 EGFR/Mucin-1를 인코딩하는 mRNA (R1626)의 시간 경과에 따른 RNA 수율. mRNAs는 예1에서 보여지는 대로 인비트로 전사에 의해 합성됨.
(A) 표준 전사 반응의 RNA 수율은 약 30분 후에 EGFR/Mucin-1를 인코딩하는 5337개 뉴클레오타이드 길이의 RNA (R1626)에 있어 약 1.4 mg/ml 의 RNA와 HsPSCA를 인코딩하는 589개 뉴클레오타이드 길이의 RNA (R1871)에 있어 1.8 mg/ml RNA의 정체기에 도달함.
(B) 서열-최적화된 전사 반응의 RNA 수율은 표준 전사 반응에 비교하여 상당히 더 높음. R1626은 60분 후 및 R1871은 120분 후, 두 RNAs는 약 3.9 mg/ml RNA의 유사한 정체기에 도달함. 세 샘플에 대한 평균 및 표준편차를 나타냄.
도6 : HsPSCA (R1871), Luciferase (PpLuc, R2988) 및 EGFR/Mucin-1 (R1626)을 인코딩하는 mRNA를 위한 표준 및 서열-최적화된 뉴클레오타이드 (CapNTP) 혼합물을 이용함으로써 얻어진 RNA 수율의 비교. 실험은 실시예 1에 설명된 대로 수행됨(반응 시간 5시간).
다른 길이의 세가지 다른 RNA 분자에 대한 RNA 수율은 각 종류의 전사 반응에 있어 거의 동일함. 그러나, 인비트로 전사를 위해 사용되는 뉴클레오타이드 혼합물에 따라 다른 수율이 얻어짐.
표준 전사 (각각의 NTP에 대해 동일한NTP 농도) 수율은 약 1.5 mg/ml RNA이며, 두 배 농축된 Cap-NTP 혼합물(2xCapNTP)의 전사는 약 3.0 mg/ml RNA, 서열-최적화된 (seq-opt) 전사는 약 3.9 mg/ml RNA 및 NTP피드가 있는 서열-최적화된 전사는 약 6.75 mg/ml RNA임. 이들의 평균 및 표준 편차를 나타냄.
도7 : Photinus pyralis Luciferase (PpLuc) mRNA의 표준 및 서열-최적화된 인비트로 전사에 의해 얻어진 캐핑 효율에 대한 분석.
RNAs는 실시예 2에 설명된 대로 헤머헤드 리보자임 HHNUH2d 로 잘라지고, 그 결과 RNA 조각은 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(dPAGE)에 의해 분리됨. Non-캡된 (노 캡) 및 효소처리로 캡 된 (E-cap) RNAs가 대조군으로 작용함.
도8 : Mucin-1 신호 펩티드/표피 성장 인자 수용체/Mucin-1 퓨전 단백질 (EGFR/Mucin-1) mRNA (R1626) 및 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA) mRNA (R1871)을 위한 서열-최적화된 CapNTP 혼합물에서 UTP 및 슈도-UTP를 이용한 RNA 수율의 비교. 실험은 실시예 3에서 설명된 대로 수행됨. 나타난 대로, 혼합물에서 UTP는 0%,10%,또는 100% 슈도-UTP(psU)로 대체됨. 이것들의 평균 및 표준 편차를 나타냄.
도9 : 추가적인 뉴클레오타이드 (동등 혼합물을 위해서 13.45 mM 총 NTP 농도; 13.45 mM 캡 또는GTP (4-배 과량의GTP); 서열-최적화된 NTP 혼합물을 위해서11.2 mM 캡 또는GTP (4-배 과량의 GTP)가 존재하는 표준 (동등) 및 서열-최적화된 (seqopt) 혼합물을 이용하는 논코딩 면역자극성 RNA R2025에 대한 이론적 및 실제 RNA 수율의 비교. 흰 막대: 실제 수율. 검정 막대: 이론적 수율. 실험은 실시예 4에 설명된 대로 수행됨. 이것들의 평균 및 표준 편차를 나타냄.
도10 : 추가적인 뉴클레오타이드 (동등 혼합물을 위해서 13.45 mM 총 NTP 농도; 13.45 mM 캡 또는GTP (4-배 과량의GTP); 서열-최적화된 NTP 혼합물을 위해서13.7 mM 캡 또는GTP (4-배 과량의 GTP)가 존재하는 표준 (동등) 및 서열-최적화된 혼합물을 이용하는 호모 사피엔스 전립선 줄기세포 항원 (HsPSCA) 을 인코딩하는 mRNA (R187)에 대한 이론적 및 실제 RNA 수율의 비교. 흰 막대: 실제 수율. 검정 막대: 이론적 수율. 실험은 실시예 4에 설명된 대로 수행됨.
도11 : 각각의 추가적 염 (NaCl; Tris/HCl, pH7.5)의 존재하에서, Na-NTPs or Tris-NTPs의 서열-최적화된 NTP 혼합물을 이용한 전사 효율. 실험은 실시예 5에서 설명된 대로 수행됨.
도12 : 생성된 RNA 의 양 및 뉴클레오타이드 혼합물의 소진을 측정함으로써 서열-최적화된 전사 반응의 진전에 대한 관찰결과. 실험은 실시예 6에서 설명된 대로 수행됨.
도13 : 캡 농도에 따른 Photinus pyralis 루시퍼레이즈 (PpLuc) 를 인코딩하는 mRNA (R2988)에 대한 RNA 수율. mRNA는 캡 아날로그의 다양한 농도 하에서 PpLuc 서열-최적화된 NTP 혼합물의 4 mM 및 13.45 mM의 총 NTP 농도를 이용한 인비트로 전사에 의해 합성됨. 실험은 실시예 7에서 설명된 대로 수행됨. (A) 실제 RNA [mg/ml]. (B) 상대 RNA 수율[%].
도14 : 캡 농도에 따른 호모 사피엔스 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA) 을 인코딩하는 mRNA (R1871)에 대한 RNA 수율. mRNA는 캡 아날로그의 다양한 농도 하에서 HsPSCA 서열-최적화된 NTP 혼합물의 2 mM, 4 mM 및 13.45 mM의 총 NTP 농도를 이용한 인비트로 전사에 의해 합성됨. 실험은 실시예 7에서 설명된 대로 수행됨. (A) 실제 RNA 수율 [mg/ml]. (B) 상대 RNA 수율[%].
도15 : GTP 개시 뉴클레오타이드 농도에 따른 호모 사피엔스 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA) 을 인코딩하는 mRNA (R1871)에 대한 RNA 수율. mRNA는 GTP 개시 뉴클레오타이드가 20 mM의 농도까지 추가되는 HsPSCA 서열-최적화된 NTP 혼합물의 13.45 mM의 총 NTP 농도를 이용한 인비트로 전사에 의해 합성됨. 실험은 실시예 8에서 설명된 대로 수행됨.(A) 실제 RNA 수율 [mg/ml]. (B) 상대 RNA 수율[%].
도 16: GTP 개시 뉴클레오타이드 농도에 따른 Photinus pyralis 루시퍼레이즈 (PpLuc) 를 인코딩하는 mRNA (R2988)에 대한 RNA 수율. mRNA는 GTP 개시 뉴클레오타이드가 20mM의 농도까지 추가되는 PpLuc 서열-최적화된 NTP 혼합물의 13.45 mM의 총 NTP 농도를 이용한 인비트로 전사에 의해 합성됨. 실험은 실시예 8에서 설명된 대로 수행됨. .(A) 실제 RNA 수율 [mg/ml]. (B) 상대 RNA 수율[%].
도17 : GTP 개시 뉴클레오타이드 농도에 따른 EGFR/Mucin-1를 인코딩하는 mRNA (R1626)에 대한 RNA 수율. mRNA는 GTP 개시 뉴클레오타이드가 20 mM의 농도까지 추가되는 PpLuc 서열-최적화된 NTP 혼합물의 13.45 mM의 총 NTP 농도를 이용한 인비트로 전사에 의해 합성됨. 실험은 실시예 8에서 설명된 대로 수행됨. (A) 실제 RNA 수율 [mg/ml]. (B) 상대 RNA 수율[%].
도18 : 도식적 설명된 바이오리액터로, 전사 반응을 위한 주형으로서 수지-고정된 선형 DNA가 있는 계속적 또는 세미-배치 과정을 위한 모듈을 포함함.
도19 : 표준 동량의 NTP 혼합물과 비교하여 서열-최적화된 NTP 혼합물로 합성된 RNA에 의한 감소된 면역 자극성. 세포 상층액에서 시토카인 및 케모카인 레벨은 실시예 10에 설명된 대로 측정됨.
도20 : 인플루엔자 A H1N1 (Netherlands 2009)로부터 HA를 인코딩하는 G/C 최적화된 mRNA로, SEQ ID NO: 6에 상응함 (실시예 11).
도21 : HA를 인코딩하는 mRNA에 대한 RNA 수율 (실시예 11). 다른 시점(time points)에서 RNA 수율은 표준 NTP 혼합물을 이용한 바이오리액터에서 인비트로 전사에 의해 (TS(1)), 피드가 없는 바이오리엑터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(2)), 피드가 있는 바이오리액터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(3)), 또는 감소된 T7 RNA 중합효소 농도와 감소된 주형 농도로 바이오리액터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(4)) 얻어진 RNA 각각에 대한 것임.
도22 : 유동세포계수분석(flow cytometric analysis)을 이용하여 결정된 HA 단백질의 표면 발현 (실시예 11). 형광 광도 (GMFI)의 기하 평균은 표준 NTP 혼합물을 이용한 바이오리액터에서 인비트로 전사에 의해 (TS(1)), 피드가 없는 바이오리엑터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(2)), 피드가 있는 바이오리액터에서서열-최적화된 전사에 의해 (TS(3)), 또는 감소된 T7 RNA 중합효소 농도와 감소된 주형 농도로 바이오리액터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(4)) 얻어진 RNA로 세포 감염된 세포에 각각 결정됨.
도23 : 표준 NTP 혼합물을 이용한 바이오리액터에서 인비트로 전사에 의해 (TS(1)), 피드가 없는 바이오리액터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(2)), 피드가 있는 바이오리액터에서서열-최적화된 전사에 의해 (TS(3)), 또는 감소된 T7 RNA 중합효소 농도와 감소된 주형 농도로 바이오리액터에서 서열-최적화된 전사에 의해 (TS(4)) 얻어진 RNA 에 의한 각각의 면역 자극성. 세포 상층액에서 시토카인 및 케모카인 레벨은 실시예 11에서 설명된 대로 측정됨.
하기에 보여진 실시예는 단지 설명용이며 더 나은 방법으로 본 발명을 설명하기 위함이다. 이 예들에 따라서 본 발명이 제한되기 위함이 아니다.
mRNA의 제조
1. DNA 및 mRNA 구성의 제조
본 발명의 실시예로, 호모 사피엔스 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA) mRNA (R1871), Photinus pyralis 루시퍼레이즈 (PpLuc) mRNA (R2988) 및 Mucin-1 신호 펩티드/표피 성장 인자 수용체/Mucin-1 퓨전 단백질(EGFR/Mucin-1) (R1626)을 인코딩하는 DNA 서열이 제조되고 그 다음의 인비트로 전사 반응을 위해 사용된다.
첫 번째 제조에 따르면, 인비트로 전사를 위한 벡터는 상기 언급된 단백질을 위해 코딩하는 서열이 뒤따르는 T7 프로모터를 포함하며 제작된다. 제작은 GC -최적화된 서열을 도입하는 야생형 코딩 서열을 변형하고 후에 알파-글로빈-3'-UTR (muag (mutated alpha-globin-3'-UTR)), 64개 아데노신의 연장 (폴리-A-서열), 30개 시토신의 연장 (폴리-C-서열), 및 히스톤 스템 루프로부터 유도된 서열을 안정화함으로써 준비된다.
추가적으로, 인비트로 전사를 위한 벡터는 단백질을 인코드하지 않는, 면역 자극성 RNA (R2025)를 인코딩하는 서열이 뒤따르는 T7 프로모터를 포함하여 제작된다.
RNA 구성 및 그 뉴클레오타이드 구성요소가 각각 표 1 및 표2에 열거된다.
RNAs
Description
Identifier
(R number) 		Sequence SEQ ID No.
HsPSCA
Mrna		 R1871 도 1 1
PpLuc mRNA R2988 도 2 2
EGFR/Mucin-1 mRNA R1626 도 3 3
Non-coding RNA R2025 도 4 4
RNAs의 뉴클레오타이드 구성요소
RNA Length (nt) G C A U
HsPSCA 589 150
(25.5%)		 205
(34.8%)		 154
(26.1%)		 80
(13.6%)
PpLuc 1870 571
(30.5%)		 604
(32.3%)		 428
(22.9%)		 267
(14.3%)
EGFR/
Mucin-1		 5337 1630 (30.5%) 1967 (36.9%) 1086 (20.3%) 654
(12.3%)
Non-coding RNA 547 114
(20.8%)		 111
(20.2%)		 112
(20.5%)		 210
(38.4%)
2. 인비트로 전사
1단락에 따라 제작된 각각의 DNA 플라스미드는 T7 중합효소를 이용하는 인비트로 전사된다. 그 후에 mRNA는 PureMessengerβ 을 이용해 정제된다 (CureVac, Tubingen, Germany; WO2008/077592A1).
표준 전사 반응 부피는 20 μl이며, 예를 들면 캡 분석을 위해, mRNAs의 뒤따르는 HPLC 정제를 위해 1ml 반응이 설정되었다.
선형화된 DNA 플라스미드 주형 (50 μg/ml)이 80 mM HEPES/KOH, pH 7.5, 24 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 40 mM DTT, 5 U/ml 파이로포스파테이즈(Thermo Fisher Scientific), 200 U/ml Ribolock RNase 억제제 (Thermo Fisher Scientific), 5000 U/ml T7 RNA중합효소(Thermo Fisher Scientific)에서 3시간 동안 (또는 지시된 대로) 37°C로 전사되었다. 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs) 가 각각 아래의 섹션 3 내지 7에 따라 추가되었다. 전사 다음, DNA 주형은 DNase1 분해에 의해 제거되었다 (Roche) (100 U/ml, 1 mM CaCl2, 30 minutes at 37°C).
RNAs는 원심분리 (30분, 16.000g, 4°C)가 뒤따르는 3.45-배 반응 부피로 2.86M LiCl에서 16시간 동안 20°C 로 결정화되었다. 펠릿은 5 전사 반응 부피의 75% 에탄올에서 세척되고 (인버트 튜프, 원심분리 5 분, 16000 g, 4°C), 건조 및 2.5 전사 반응 부피의 H2O에 재용해되었다.
RNA 수율은 NanoDrop® 광도계를 이용하여 260 nm에서 흡광도 측정을 통하여 결정되었다. 260nm에서 1 흡광도 단위는 RNA 의 40 ng/μl에 상응한다 (1 A260 = 40 ng/μl RNA).
포함된 (incorporated) 뉴클레오타이드의 수를 결정하기 위해, 생산된 RNA의 총 양은 생산된 분자의 수를 분자량으로 나눔으로써 전환되었다. 서열에 존재하는 각각의 뉴클레오타이드의 수를 곱하면 포함되지 않은 (unincorporated) 뉴클레오타이드가 얻어진다. 전사 반응의 말미에서 잔류 뉴클레오타이드 (%로)를 결정하기 위해, 이 수는 하기에 따라서 필요한 뉴클레오타이드의 수로 나누어졌다:
[식 1]
Figure 112016122619642-pct00004
RNA 수율은 반응 당 생산된 분자의 수로 나타낸다 (nmol). NTP 시작하는 농도 [NTP(시작)]은 mM, 반응 부피는 μl로 나타낸다.
각각의 뉴클레오타이드의 잔존 농도를 계산하기 위해, 반응의 시작 단계에서 이용 가능한 NTPs의 수에 (하기에) 따라서 전사 반응의 말미에 잔존하는 NTPs의 퍼센트가 곱하여졌다.
[식 2]
Figure 112016122619642-pct00005
3. 캡 아날로그의 존재 하에서 표준 인비트로 전사
캡 아날로그를 이용한 5'-캡 RNAs의 생산을 위해, 표준 전사가 5.8 mM m7G(5´)ppp(5´)G 캡 아날로그, 4 mM ATP, 4 mM CTP, 4 mM UTP, 및 1.45 mM GTP (all Thermo Fisher Scientific) (표 3 참고)로 수행되었다. 캡 아날로그 및 GTP는 4:1의 비율로 사용되었다.
표준 인비트로 전사 반응을 위한 뉴클레오이드 농도 (mM)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 5.8 1.45 4 4 4
PpLuc 5.8 1.45 4 4 4
EGFR/
Mucin-1		 5.8 1.45 4 4 4
표준 전사 반응의 끝에 남아있는 뉴클레오타이드의 양 (2.5시간 후, 반응의 시작에서 뉴클레오타이드의 퍼센트로 나타냄)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 99,86 17,35 59,05 69,24 84,02
PpLuc 99,96 16,39 67,94 77,28 85,83
EGFR/
Mucin-1		 99,99 16,37 63,42 79,80 87,84
표준 인비트로 전사 반응의 끝에 남아있는 뉴클레오타이드 농도 (mM) (2.5시간 후)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 5,79 0,25 2,36 2,77 3,36
PpLuc 5,80 0,24 2,72 3,09 3,43
EGFR/
Mucin-1		 5,80 0,24 2,54 3,19 3,51
표준 전사 반응에서 RNA 전사의 통상적인 수율은 약 1.5 mg/ml 반응이다.
4. 캡 아날로그 및 NTPs의 두 배 농도를 사용하는 캡 아날로그의 존재 하에서 인비트로 전사(2xCapNTP).
캡 아날로그 및 NTP 농도는 표준 전사 상태와 비교하여 두 배로 되었고, 반응은 11.6 mM m7G(5´)ppp(5´)G 캡 아날로그, 8 mM ATP, 8 mM CTP, 8 mM UTP, 및 2.9 mM GTP (all Thermo Fisher Scientific) (표 3 참고)에서 수행된다. 캡 아날로그와 GTP의 비율은 4:1 이다.
2xCapNTP 인비트로 전사 반응을 위한 뉴클레오타이드 농도 (mM)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 11.6 2.9 8 8 8
PpLuc 11.6 2.9 8 8 8
EGFR/
Mucin-1		 11.6 2.9 8 8 8
2xCapNTP 전사 반응의 끝에서 남아있는 뉴클레오타?事? 양 (2.5시간 후, 반응의 시작에서 뉴클레오타이드의 퍼센트로 나타냄).
RNA CAP G C A U
HsPSCA 99,87 23,45 62,08 71,51 85,20
PpLuc 99,96 17,93 68,53 77,70 86,09
EGFR/
Mucin-1		 99,99 20,15 65,07 80,72 88,39
두 배 농도의 캡 아날로그와 NTPs를 이용하는 전사의 통상적인 수율은 약 3mg/ml 반응이다.
5. 캡 아날로그의 존재 하에서 서열-최적화된 인비트로 전사
서열-최적화된 인비트로 전사 반응을 위해, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 농도는 서열의 뉴클레오타이드 구성요소 (표 2)에 따른 각각 개별적인 서열에 대해 계산되었으며, 표준 전사 반응에서처럼 모든 NTP의 총 농도가 13.45 mM이었다. 캡 아날로그의 농도는 GTP의 계산된 농도보다 4배 높았고, 4:1의캡/GTP 비율이 얻어진다.
서열-최적화된 인비트로 전사를 위한 뉴클레오타이드 농도 (mM)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 13.6 3.4 4.7 3.5 1.8
PpLuc 16.4 4.1 4.3 3.1 1.9
EGFR/
Mucin-1		 16.4 4.1 5.0 2.7 1.7
서열-최적화된 전사의 끝에서 남아있는 뉴클레오타이드의 양 (2.5시간 후, 반응의 시작에서 뉴클레오타이드의 퍼센트로 나타냄)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 99,86 14,83 14,71 14,57 14,83
PpLuc 99,96 14,62 14,72 14,76 14,85
EGFR/
Mucin-1		 99,99 14,60 14,82 14,51 15,04
서열-최적화된 인비트로 전사반응의 끝에서 남아있는 뉴클레오타이드 농도 (mM) (2.5시간 후)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 13,58 0,51 0,69 0,51 0,27
PpLuc 16,39 0,60 0,64 0,45 0,29
EGFR/
Mucin-1		 16,40 0,60 0,74 0,40 0,25
서열-최적화된 캡 아날로그 및 NTPs를 이용한 전사의 통상적인 RNA 수율은 약 3.9mg/ml 반응이다.
6. NTP 피드와 함께 캡 아날로그의 존재하에서 서열-최적화된 인비트로 전사
서열-최적화된 인비트로 전사 반응을 위해 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 농도가 서열의 뉴클레오타이드 구성요소 (표 2)에 따라 각각 개별적인 서열에 대해 측정되었고 모든 NTPs의 총 농도가 표준 전사에서처럼 13.45mM이 되었다. 캡 아날로그의 농도는 GTP의 측정된 농도보다 4배 더 높았고 4:1비율의 캡/GTP가 얻어졌다 (표 7참고).
NTP 피드를 위해, 캡 아날로그 없이 13.45mM NTPs가 2.5시간 후에 반응 혼합물에 (2.69 μl의 부피로) 추가되었다. 이 시점에서 캡 아날로그의 >99% 가 전사 반응에 여전히 존재했고, 4:1 캡/GTP 비율이 유지될 수 있었다.
NTP 피드와 함께 서열-최적화된 전사의 끝에 남아있는 뉴클레오타이드의 양 (5시간 후, 반응의 시작에 뉴클레오타이드의 퍼센트로 나타냄)
RNA CAP G C A U
HsPSCA 99,75 26,3 26,2 26,1 26,3
PpLuc 99,94 26,1 26,2 26,2 26,3
EGFR/
Mucin-1		 99,98 26,1 26,3 26,0 26,5
NTP 피드가 뒤따르는 서열-최적화된 캡 아날로그 및NTPs를 이용한 전사의 통상적인 RNA 수율은 약 6.75 mg/ml 반응이다.
7. 논-캡 RNAs의 표준 인비트로 전사
논-캡, 5' 트리포스페이트 RNAs의 생산을 위헤, 전사는 4mM의 각각ATP, GTP,CTP 및 UTP의 존재하에서 수행되었다 (all Thermo Fisher Scientific). 논-캡 RNAs는 캐핑 분석법에서 대조군으로 사용되었다 (도 7).
8. mRNA의 효소를 이용한 캐핑
효소 캐핑은 제조사의 지시에 따라 ScriptCapTM m7G Capping System (Cellscript, Madison, WI, USA)를 이용하여 수행되었다. 간단하게, 반응당, 논-캡 RNAs의 60 μg이 68.5 μl 의 부피에서 열-분해되었고 (10분, 65°C) 즉시 얼음으로 냉각되었다 (5분). 최종 부피 100 μl까지, 반응 구성요소(1x ScriptCap 캐핑 버퍼, 1 mM GTP, 0.1 mM SAM, 1000 U/ml ScripGuard RNase 억제제, 400 U/ml ScriptCap 캐핑 효고)의 첨가를 하여, 반응은 1시간 동안 37°C에 배양되었다. RNAs는 원심분리 (30 minutes, 16.000 g, 4°C)가 뒤따르는 16시간 동안 -20 °C에서 3.45-배 부피에서 2.86 M LiCl에서 결정화되었다. 펠릿은 0.5 반응 부피 75% 에탄올에서 세척되고 (역으로, 원심분리 5 분, 16000 g, 4°C), 건조 및 H2O에 재용해되었다. 효소적으로 캡 된 RNAs는 캐핑 분석법에서 대조군으로 이용되었다 (도 7).
9. 결과
표준 및 서열-최적화된 인비트로 전사 반응의 RNA 수율은 위 (2 단락)에서 설명된 대로 2시간까지 동안 제한된 시점에서 결정되었다.
도 5A에서 보여질 수 있듯이, 약 30분 후에 표준 전사 반응의 RNA 수율은 EGFR/Mucin-1 을 인코딩하는 5337개 뉴클레오타이드 길이의 RNA (R1626)의 약 1.4 mg/ml 및 HsPSCA 를 인코딩하는 589개 뉴클레오타이드 길이의 RNA (R1871)의 약 1.8 mg/ml 의 정체기에 도달한다.
도 5B에서 보여질 수 있듯이, 서열-최적화된 전사 반응의 RNA 수율은 표준 전사 반응에 비교하여 상당히 더 높다. 60분 (R1626) 및 120 분 (R1626) 후에, 각각, 두 RNA 는 거의 3.9 mg/ml 의 닮은 정체기에 도달한다.
도 6에서 보여질 수 있듯이, 다른 길이의 세 가지 다른 RNA 분자를 위한 RNA 수율은 5시간 후에 전사 반응의 각각의 종류에 대해 거의 같다.
표준 전사 (동량의 NTP 농도)는 약1.5mg/ml RNA를, 두 배 농도의 Cap-NTP 혼합물 (2xCapNTP)은 약 3.0mg/ml RNA를, 서열-최적화된 전사는 3.9mg/ml RNA를 및 NTP 피드가 있는 서열-최적화된 전사는 약 6.75 mg/ml RNA를 생산한다.
따라서, 서열-최적화된 전사 반응은 표준 전사 반응과 비교하여 RNA 수율 면에서 약 세배의 증가를 낳는다. 이 수율은 NTP와 함께 반응을 보충함으로써 약 두 배로 더 증가될 수 있다 (NTP 피드).
CAP 분석법
1. 분석법의 원리
해머헤드 리보자임 HHNUH2d (5'-GCAUGGCUGAUGAGGCCUCGACCGAUAGGUCGAGGCCGAAAAGCUUUCUCCC-3') (SEQ ID NO: 5)는 실시예 1의 인비트로 전사된 RNAs와 함께 배양되며 분해 폴리아크릴아마이드-겔-전기영동 (dPAGE)에 의해 분열 생산물이 분리되었다.
2. 리보자임 분열 반응
반응 당, 10pmol의 HHNUH2d 및 10 pmol의 각각의 기종 4 RNA는 6 μl의 총 부피에서 0.625mM EDTA에서 아닐(anneal)된다 (95°C에서 2 분, 0.1°C/초로 25°C, 10 분까지). 100 mM MgCl2, 125 mM Tris/HCl, pH 7.5 의 4 μl 첨가 후에 (최종 농도 40 mM MgCl2, 50 mM Tris/HCl), 반응은 25°C에서 배양되었다. PAGE를 통한 분석을 위해 1x반응은 30 μl, 95% 포름아마이드, 20 mM EDTA로 중단되었다.
3. 분열 생성물의 겔 분리, 정량화 및 캐핑 정도의 계산
중단된 반응은 열-분해(80°C에서 2분 동안 가열되고, 즉시 5분 간 얼음에 넣음)되었고, 10 cm x 8 cm x 1.0 mm 20% 분해성 폴리아크릴아마이드 겔 (8 M urea (AppliChem), 20% 아크릴아미드:비스아크릴아미드 19:1 (AppliChem), 1x TBE, 1% APS (AppliChem), 0.1% TEMED (AppliChem); 180 V, 2 시간, Mini-PROTEAN® Tetra Cell (BioRad))로 분리되었다. 겔은 TBE에서 1:10,000 SYBR Gold (Invitrogen)에서 10분 동안 염색되었고, 312 nm-UV 트랜스일루미네이터로 (Peqlab) (SYBR Gold에 대한 출력 최대:~300nm, 방출:~537nm) E-BOX VX2 겔 기록계에 기록되었다.
mRNA제조에서 캡 된 부분을 결정하기 위해 각각 13-mer (논 캡 부분에서 유래함) 또는 14-mer (캡 된 부분에서 유래함) 분열 생성물은 Quantity One 1-D Analysis Software (BioRad)을 이용하여 정량되었다.
캡 및 논-캡 RNA의 정도는 각각 하기에 따라 계산되었다:
[식 4]
Figure 112016122619642-pct00006
[식 5]
Figure 112016122619642-pct00007
4. 결과
도 7에서 볼 수 있듯이, 비교할 만한 캐핑 효율은 Photinus pyralis 루시퍼레이즈 (PpLuc) mRNA를 위한 표준 및 서열-최적화된 NTP 혼합물에 대해 성취되었다.
서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물에서 UTP 및 슈도 -UTP를 이용한 RNA 수율의 비교
인비트로 전사 반응은 네 종류 뉴클레오타이드 ATP, GTP, CTP 및 UTP의 하나 또는 그 이상을 뉴클레오타이드 아날로그로 치환함으로써 수행될 수 있다. 그러한 변형된 NTPs의 예로는 슈도우리딘 (psU 또는 Ψ) 트리포스페이트 및 5-메틸시티딘 (5mC) 트리포스페이트이다. 혼합물에서 변형된 뉴클레오타이드의 퍼센트는 이것이 대체하는 자연적 뉴클레오타이드의 0%부터 100%까지 다양할 수 있다.
서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물에서 슈도우리딘 (psU) 트리포스페이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 이용하는 것이 가능한 지 아닌지 테스트하기 위해, UTP는 10%, 및 100% 슈도우리딘 트리포스페이트로 치환될 수 있다. 통제 반응에서, 100% UTP 가 사용되었다.
캡 아날로그의 존재 하에서 서열-최적화된 인비트로 전사
서열-최적화된 인비트로 전사 반응에서 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTPs)의 농도는 서열의 뉴클레오타이드 구성요소 (표2)에 따른 각각 개별적인 서열에 대해 계산되었고, 모든 NTPs의 총 농도는 표준 전사 반응에서처럼 13.45mM이 되었다. 캡 아날로그의 농도는 GTP 의 계산된 농도보다 4배 더 높았고, 4:1 CAP/GTP 비율이 얻어졌다.
결과
도 8에서 볼 수 있듯이, 캡 아날로그가 있는 서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물 (CapNTP 혼합물)에서 UTP 및 슈도-UTP를 이용하는 것은 서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물에서 슈도-UTP 퍼센트에 독립적으로 비교할만한 RNA수율에 결과한다. 이것은 두 가지 다른 Mucin-1 신호 펩티드/ 표피 성장 인자 수용체/Mucin-1 퓨전 단백질 (EGFR/Mucin-1)을 인코딩하는 mRNAs (R1626)와 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA) mRNA 각각을 위해 설명되어졌다.
표준 및 서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물을 이용한 이론적 및 실제 RNA 수율의 비교
전사 반응은 섹션2, 실시예 1에 설명된 대로 구성되었다. NTPs는 동등하게 분배되거나 (등몰) 또는 섹션5, 실시예 1에 설명된 대로 생산된 RNA의 서열에 따라 분배되었다. 몇 반응을 위해 추가적인 뉴클레오타이드 (GTP 또는 캡 아날로그)가 GTP에 대하여 4:1의 비율로 추가되었다.
결과
도 9에서 볼 수 있듯이, R2025에 대한 실제 수율은 표준 NTP혼합물 (동 NTP 혼합물)과 비교하여 서열-최적화된 NTP 혼합물에 대해 증가될 수 있다.
도 10에서 볼 수 있듯이, 호모 사피엔스 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA; R1871)을 인코딩하는 mRNA에 대한 실제 수율은 표준 NTP혼합물 (동 NTP 혼합물)과 비교하여 서열-최적화된 NTP 혼합물에 대해 증가될 수 있다.
RNA 수율에 있어 NTP 카운터이온의 영향
RNA 수율에 있어 NTP 카운터이온의 영향은 호모 사피엔스 Mucin-1 신호 펩티드/표피 성장 인자 수용체/Mucin-1 퓨전 단백질 (EGFR/Mucin-1, R1626)을 인코딩하는 mRNA를 예로 사용하여 조사되었다. 전사 반응은 13.45 mM의 총 NTP 농도 및 서열-최적화된 NTP 비율을 사용하는, 섹션2, 실시예1에서 설명된 대로 구성되었다. NTPs는 Na+ 또는 Tris+ (both Thermo Scientific)를 카운터이온으로 포함하였다. 추가적으로, Na-NTP 반응은 다른 농도의 NaCl로, Tris-NTP 반응은 Tris/HCl로 보충되었다. 반응 시간의 2.5시간 후에, RNAs는 정제되었고, 그들의 농도는 섹션 2, 실시예 1 에서 설명된 대로 결정되었다.
결과
도 11에서 볼 수 있듯이, 서열-최적화된 NTP 혼합물을 이용하는 호모 사피엔스 Mucin-1 신호 펩티드/표피 성장 인자 수용체/ Mucin-1 퓨전 단백질 (EGFR/Mucin-1, R1626) 를 위한 RNA수율은 150 mM Tris-HCl의 농도까지 거의 같게 유지되었다. 대조적으로, RNA 수율은 75 mM 이상의 NaCl농도에서는 감소하기 시작했다.
RNA 수율에 있어 높은 NaCl 농도의 부정적 영향은 설명되어온다 (예를 들면 Kern et al., 1997. Biotechnol. Prog., 13, 747-756; US 6,586,218 B2). Na-NTPs의 높은 농도는, 특히 NTP 피딩 전략을 추구할 때의 결과로서, 따라서 감소된 RNA 수율에 결과할 수 있다. 이 제한은 중합효소 활성은 높은 Tris/HCl 농도에 의해 영향 받지 않기 때문에, Tris-NTPs로 회피되어야 할 것이다.
전사 반응의 진전의 관찰
호모 사피엔스 전립선 줄기 세포 항원 (HsPSCA; R1871)의 대-규모 전사 반응 (350 μl)는 13.45 mM Tris-NTPs의 총 NTP 농도 및 서열-최적화된 NTP 비율을 이용하는 섹션 2, 실시예 1에서 설명된 대로 구성되었다. 캡 아날로그는 GTP에 대하여 4:1 과량으로 존재하였다. 제한된 시간 점(반응 시작 후 15 / 30 / 60 / 90 /120 분)에서, 20 μl 샘플이 취해졌고, RNA가 정제되고 이것의 260 nm에서 흡광도가 섹션 2, 실시예 1에서 설명된 대로 결정되었다. 40 μl의 두 번째 샘플이 같은 시간 점에서 취히졌고 Microcon YM10장치 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany를 통해 여과되었다 (16000*g, 5분, 17°C). 포함되지 않은 캡 아날로그 및 NTPs에 상응하는, 260 nm에서 통과액 (flow-through)의 흡광도는 제조사의 지시에 따라 NanoDrop® Spectrophotometer를 사용하여 결정되었다 (T009-Technical Bulletin NanoDrop 1000 % 8000; Thermo Fisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA).
결과
도 12에서 볼 수 있듯이, 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드 혼합물의 사용은 제한된 시간 점에서 남아있는 총 뉴클레오타이드 농도를 결정함으로써 인비트로 전사 반응의 진전을 측정하는 것을 가능하게 한다. 총 NTP 농도의 감소는 바로 합성된 RNA의 양에 상응한다.
따라서, 전사 반응의 진전은 주어진 시간 점에서 측정된 총 NTP 농도 및 소비된 NTPs의 몰 수를 계산하는 것의 함수로써 정확히 결정될 수 있다. 이 정보에 기초하여, 합성된 RNA의 양을 계산하는 것이 가능하다.
이 과정은 특히, 예를 들면 전사 리액터에서, 전사 반응의 진전을 계속적으로 관찰하는데 유용하다. 표준 NTP 혼합물을 사용할 때는 NTPs의 소진이 합성된 RNA의 양을 용이하게 반영하지 않기 때문에 이것이 불가능하다.
캡 농도의 함수로써 서열- 최적화된 뉴클레오타이드 혼합물의 RNA 수율
전사 반응은 섹션2, 실시예 1에서 설명된 대로 구성되었고, 도 14 및 15에서 나타난 대로, 2 mM, 4 mM, 및 13.45 mM NTPs 의 총 NTP 농도에서 수행되었다. NTPs는 섹션 5, 실시예 1 (PpLuc 및 HsPSCA를 위한 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드 혼합물) 에 설명된 대로 생산된 RNA의 서열에 따라 분배되었다. 반응은 도 14 및 15에 나타난 대로 캡 아날로그 (m7G(5´)ppp(5´)G)의 다양한 농도 (0, 0.25, 2.0, 10, 16 및 20 mM)에서 수행되었다.
결과
도 13A에서 볼 수 있듯이, PpLuc mRNA 를 위한 실제 RNA 수율은 더 높은 캡 아날로그 농도와 함께 증가한다. 실제 RNA 수율은 4 mM과 비교해서 13.45 mM의 총 NTP 농도에서 더 높다. 도 13B는 PpLuc mRNA를 위한 상대 RNA 수율은 대략 16mM의 캡 아날로그 농도까지 증가하는 것을 보여준다. 상대 RNA 수율에서 증가는 높은 NTP 농도 (13.45mM)일 때 보다 낮은 NTP 농도 (4mM) 에서 더 강하다.
도 14A에서 볼 수 있듯이, HsPSCA mRNA를 위한 실제 RNA 수율은 더 높은 캡 아날로그의 농도와 함게 증가한다. 실제 RNA 수율은 4mM 및 2mM과 비교하여 13.45mM의 총 NTP 농도를 위해 더 높다. 도 14B는 HsPSCA Mrna를 위한 상대RNA 수율이 대략 16mM의 캡 아날로그 농도까지 증가하는 것을 보여준다. 상대 RNA 수율의 가장 강한 증가는 시험된 가장 낮은 NTP 농도 (2mM)일 때 관찰된다.
이러한 결과는 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드의 사용이 낮은 초기의 총 뉴클레오타이드 농도 (예를 들면 2mM)에서 조차도 캡 RNA 합성의 증가된 효율성을 이끈다는 것을 설명한다. 대조적으로, 12mM 내지 40mM의 순서로, 증가된 RNA 수율을 위해 총 뉴클레오타이드의 높은 농도가 필요하다는 것은 앞서 제시되어왔다 (US6586218).
PpLuc mRNA (1870 뉴클레오타이드) 및 HsPSCA mRNA (589 뉴클레오타이드)의 비교는 상대 RNA 수율이 정의된 총 NTP 농도에 대한 RNA 길이에 독립적임을 보여준다.
GTP 개시 뉴클레오타이드 농도의 함수로서 서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물에 대한 RNA 수율
전사 반응은 섹션2, 실시예 1에서 설명된 대로 구성되었고, P625, P1040 및 P532를 위한 13.45mM의 서열-최적화된 뉴클레오타이드 혼합물의 총 NTP 농도에서 수행되었다.
NTPs는 섹션 5, 실시예 1 (PpLuc, HsPSCA 및 EGFR/Mucin-1를 위해 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드 혼합물)에서 설명된 대로 생산된 RNA의 서열에 따라 분배되었다. 반응은 도16 내지 18에서 나타난 대로 서열-최적화된 NTP 혼합물에 GTP 개시 뉴클레오타이드의 정의된 농도 (0, 0.25, 2.0, 10, 16 and 20 mM )를 첨가함으로써 수행되었다.
결과
도 15A 및 15B에서 볼 수 있듯이, HsPSCA mRNA를 위한 실제 및 상대 RNA 수율은 대략 10mM의 GTP 개시 뉴클레오타이드 농도까지 증가하고 더 높은 GTP 농도에서 감소한다.
도 16A 및 16B에서 볼 수 있듯이, PpLuc mRNA를 위한 실제 및 상대 RNA 수율은 대략 10mM의 GTP 개시 뉴클레오타이드 농도까지 약간 증가하고 그 다음 더 높은 GTP 농도에서 감소한다.
도 17A 및 17B에서 볼 수 있듯이, EGFR/Mucin- mRNA를 위한 실제 및 상대 RNA 수율은 대략 10mM의 GTP 개시 뉴클레오타이드 농도까지 증가하고 더 높은 GTP 농도에서 감소한다.
이러한 결과는 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드 혼합물 및 개시 뉴클레오타이드 GTP의 추가적인 양의 사용은 대략 10mM의 GTP개시 뉴클레오타이드 농도까지 RNA 합성의 증가된 효율성을 이끈다는 것을 설명한다.
바이오리액터
도 18은 본 발명은 도식적인 설명으로 본 발명과 관련한 바이오리액터 1의 바람직한 실시예를 보여준다. 도 18로부터, 바이오리액터 1의 모듈 구조가 분명해진다. 여기서, 바이오리액터 1은 여러 바이오리액터 모듈 2,3,4,5로 이루어진다. 반응 모듈 1은 주어진 서열의 RNA 분자 합성을 위한 연속적인 또는 세미-배치 과정을 위한 반응 용기로 이용된다. 반응 모듈 2는 RNA 전사 반응을 위한 주형으로서 사용되는 수지-고정된 DNA를 포함한다. 여기서, DNA의 고정은 주형의 반복적인 사용을 가능하게 하고 어떤 종류의 잔류 DNA 에 의해 목표되는 RNA 생성물의 오염을 줄인다. 추가로, DNA 주형의 고정은 말단 DNA 분해를 위한 효소 DNAse의 이용을 대체한다. 전사 후에, 생산된 RNA 분자는 나누어져(batch by batch) 또는 연속적으로 캡처 모듈 3으로 방출될 수 있다. 그 후에, RNA 분자는 출구선 또는 기타 (보여지지 않음)의 수단에 의해 바이오리액터 1로부터 이후의 RNA 용리 및 정제가 수행될 수 있는 받개 유닛 또는 기타로 나올 수 있다. 세척 용액 및/또는 용리 버퍼는 반응 모듈 2와 캡처 모듈 3 사이에 수송 지역에 연결된 각각의 세척 및 버퍼 탱크 31의 수단에 의해 캡처 모듈 3으로 제공될 수 있다.
반응 모듈 2에서 전사 과정을 관찰하고 제어할 수 있게 하기 위해서, 뉴클레오타이드와 같은 저 분자량 구성요소로부터 단백질 및 폴리뉴클레오타이드와 같은, 고 분자량 구성요소를 분리하기 위한 한외여과막 21이 반응 모듈 2에서 제공된다. 막은 여과된 반응 혼합물을 받는 여과 부분 23으로부터 RNA 전사 반응이 수행되는 반응 코어 22를 분리한다. 결정적인 진행 파라미터로 이용되는, 반응 모듈 2의 여과 부분 23에 있는 여과된 반응 혼합물에서 뉴클레오타이드 농도에 기초하여, 피드 탱크 24로부터 반응 모듈2로의 뉴클레오타이드, 버퍼 구성요소 및/또는 효소의 피드(feed)는 RNA 전사 반응이 높은 전사 수행을 생산하는, 최적의 정상 상태에서 RNA 전사 반응을 수행하는 것을 가능하게 하는 피드 펌프 43의 수단에 의해 제어되고 조절될 수 있다. 측정 수단으로써, 센서 유닛 41이 반응 혼합물에서 반응 파라미터를 측정하기 위해 제공된다. 여기서, 센서 유닛 41은 적어도 저 분자량 구성요소를 포함하는 여과된 용액에서 UV 260/280nm를 위한 UV 플로우 셀 (flow cell)과 같은 광도계 분석을 위한 센서를 포함하며, 상기 여과된 용액은 여과 부분 23에서 추출되고, 재순환 펌프 25에 의해 순환되고 여과 부분 23으로 다시 돌아간 것이다. 순환 라인에서, 센서 유닛 41의 센서는 여과 부분 23 내부에서 여과된 용액의 실시간 관찰을 성취하기 위해 제공된다. 바이오리액터 1에서 서열-최적화된 리보뉴클레오타이드 혼합물의 적용은 반응 모듈 2의 반응 코어 22에서 RNA 전사 반응 동안 여과 부분 23에서 뉴클레오타이드 농도의 실시간 측정을 가능하게 한다. 센서 유닛 41은 제어 모듈 4의 부분으로서, 컨트롤러 42 및 피드 펌프 43의 형태로 액츄애이터를 더 포함한다. 센서 유닛 41 및 피드 펌프 43은 컨트롤러 42로 측정 신호를 제공하고 컨트롤러42로부터 지시 신호를 받기 위해 컨트롤러 42와 연결된다. 게다가, 여과된 용액의 pH-값, 여과된 용액의 전도성과 같은 다른 중요한 진행 파라미터는 더 센서 유닛 41의 더 적합한 센서에 의해 분석될 수 있다. 통상적으로 컴퓨터 기반 시스템 또는 기타의 방법에서 컨트롤러 42에 의한 정보 수집 및 분석은 반응 모듈2로의 뉴클레오타이드, 버퍼 구성요소 및/ 또는 효소의 반복적인 피드를 위한 액츄애이터로서 피드 펌프 43의 통제와 더불어 최적의 정상 상태 반응 환경에서 핵심적인 진행 파라미터를 조정하기 위한 바이오리액터 1의 다른 펌프의 통제를 가능하게 한다.
폐기물을 막기 위해, 바람직한 실시예의 바이오리액터1은 캡처 모듈 3에 연결된 환류 모듈 5를 더 포함하며, 환류 모듈 5는 뉴클레오타이드 및 효소 같은 사용되지 않은 원료를 수집하고 환류 펌프 51의 수단에 의해 반응 모듈 2로 재순환하여 돌려보낸다. 환류 모듈 5는 파이로포스파테이즈와 같은 고정된 효소, 또는 포스파테이트 또는 그 기타와 같은 실패한 구성요소를 잡기 위한 수지를 포함한다.
설명된 발명의 변형이 수반하는 청구항의 범위를 벗어나지 않고 수반하는 청구항의 범위 내에서 이루어질 수 있기 때문에, 본 발명의 위에서 설명된 실시예 및 수반하는 그림은 설명적인 것에 불과하고 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
RNA 분자의 면역자극 활성
이 실시예에서, 서열-최적화된 NTP 혼합물 및 표준 등몰 NTP 혼합물로 합성된 RNA 분자의 면역자극성질이 비교되었다. 면역자극은 mRNA로 세포감염된 세포의 상층액에서 시토카인 및 케모카인 레벨을 측정함으로써 결정되었다.
루시퍼레이즈 mRNA (pPluc)을 위한 표준 및 서열-최적화된 인비트로 전사 반응은 실시예 1에서 설명된 대로 수행되었다.
그 후에, mRNA는 LiCl 침전에 의해 정제되었다.
면역자극법
HeLa 세포는 25 mM HEPES, 2 mM L-글루타민 및 100 IU/ml 페니실린/스트렙토마이신(all Lonza, Basel, Switzerland) 및 10% fetal calf serum (Perbio Science, Bonn, Germany)로 보충된 Gibco® RPMI 1640 배지로 이루어진 2 ml HeLa 세포 배양 배지에서 6-홈 플레이트에서 홈 당 4x105 개 세포의 농도로 뿌려졌다. 다음 날, 세포는 RNA의 2 μg 또는 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, Darmstadt, Germany, catalog no. 11668-027을 이용한 음성대조군으로서 주사용 증류수 (WFI)가 세포 감염되었다. 간단하게, Lipofectamine®시약 및 RNA 는 각각 Opti-MEM® 배지 (Life Technologies)에서 희석되었고, 1:1.5의 RNA: Lipofectamine® 비율로 결합되고 상온에서 20분 동안 배양되었다. 음성대조군은 RNA 대신에 Lipofectamine® 과 혼합된 WFI를 포함했다. 그동안 세포는 25 mM HEPES 및 2 mM L-Glutamine (세럼 프리 및 페니실린/스트렙토마이신 프리 배지)가 보충된 2 ml Gibco® RPMI 1640 배지로 한 번 세척되고 세럼 프리 및 페니실린/ 스트렙토마이신 프리 배지의 2 ml가 세포에 더해졌고, 0.5 ml RNA: Lipofectamine® 세포감염 혼합물이 추가되었다. 37°C 및 5% CO2 에서 4시간 동안 배양 후에, 감염 혼합물을 포함한 배지는 2 ml 의 HeLa 세포 배양 배지로 교체되었다.
24시간 후에, 세포가 없는 상층액이 모아졌고 IL-6, CXCL10 및 CCL5의 농도가 하기의 키트를 이용하여 제조사의 지시(BD Biosciences)에 따라 Cytometric Bead Array (CBA)에 의하여 측정되었다: Human Soluble Protein Master Buffer Kit (catalog no. 558264), Assay Diluent (catalog no. 560104), Human IL-6 Flex Set (catalog no. 558276), Human CXCL10 Flex Set (catalog no. 558280) 및 Human CCL5 Flex Set (catalog no. 558324) (모든 키트는 BD Biosciences로부터). 데이터는 the FCAP Array v3.0 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 분석되었다.
결과
도 19에서 볼 수 있듯이, 분비된 IL-6, CXCL10 및 CCL5의 단계는 표준 등몰 NTP 혼합물로 합성된 동일 RNA와 비교하여 서열-최적화된 NTP 혼합물로 합성된 RNA에서 더 낮았고, 이는 서열-최적화된 NTP 혼합물로부터 RNA의 더 낮은 면역자극활성이 결과한다는 것을 나타낸다.
바이오리액터에서 인비트로 전사
인브트로 전사를 위해 이용된 DNA의 제작 (P1140):
인비트로 전사를 위한 DNA 벡터 (P1140)은 DNA 벡터 (pCV32(KanR)로 하기의 요소가 삽입됨으로써 제작된다.
5' UTR: 32L4 (Top-UTR)
ORF: H1N1(Netherlands2009) (GC-enriched)로부터 온 HA
3' UTR: 알부민7
얻어진DNA벡터의 인비트로 전사는 2083개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 RNA 분자에 결과한다. 각각의 RNA 서열 (SEQ ID NO: 6)은 도 20에 설명된다.
RNA 구성은 하기의 뉴클레오타이드 구성요소에 의해 특징화된다:
G = 540 (25.92 %)
C = 676 (32.45 %)
A = 541 (25.97 %)
U = 326 (15.65 %)
G/C = 58.37 %
DNA 벡터의 선형화:
플라스미드 P1140은 하기의 상태를 이용하여 선형화된다:
0.5 μg 플라스미드 DNA
1.5 μl 10 x 반응 버퍼
1 μl EcoRI
ad 15 μl WFI (주사용 증류수)
반응은 37°C에서 3시간 동안 배양되었다. 그 후 페놀/클로로폼 추출 및 아이소프로판올 침전이 수행되었다.
인비트로 전사:
표준 캡/NTP 혼합물
Figure 112016122619642-pct00008
(캡 없는 최종 NTP 농도는 13.45mM)
NTPs 및 캡의 계산:
표준 전사 반응에서 사용된 것과 같이 13.45mM의 같은 총 NTP 농도가 서열-최적화된 전사에서도 이용된다. GTP의 네 배의 양이 캡 아날로그를 위해 필요하다.
Figure 112016122619642-pct00009
P1140을 위한 서열-최적화된 캡/NTP 혼합물의 제작
Figure 112016122619642-pct00010
5X 전사 버퍼:
400 mM HEPES
120 mM MgCl2
10 mM 스페르미딘
200 mM DTT
25 U/ml 무기 파이로포스파테이즈
네 가지 다른 전사 반응이 바이오리액터에서 시험되었다:
바이오리액터로서, Dasgip사의 DasBox Bioreakor가 사용되었다. 반응은 50rpm으로 저어졌다. 표시된 시간 점에서, 20 μl 각각의 샘플이 제거되었다. RNA 농도는 LiCl 침전 후에 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다.
네 가지 다른 상황이 인비트로 전사를 위해 사용되었다:
1. 표준NTP 혼합물을 이용한 전사
Figure 112016122619642-pct00011
전사 반응은 37°C에서 3시간 동안 배양되었다.
그 후, 6 μl DNAse I (1 mg/ml) 및 0.2 μl CaCl2 용액 (0.1 M) / μg DNA 주형이 전사 반응에 첨가되고 37°C에서 2시간 동안 배양되었다.
2. 서열-최적화된 전사 (피드 없이 1.5시간)
Figure 112016122619642-pct00012
전사 반응은 37°C에서 1.5시간 동안 배양되었다.
그 후, 6 μl DNAse I (1 mg/ml) 및 0.2 μl CaCl2 용액 (0.1 M) / μg DNA 주형이 전사 반응에 첨가되었고 37°C에서 2시간 동안 배양되었다.
3. 피드 있는 서열-최적화된 전사
Figure 112016122619642-pct00013
전사 반응은 37°C에서 1.5시간 동안 배양되었다
12934.6 μl 서열-최적화된 Cap/NTP-혼합물 및 5 x 전사 버퍼가 1.5시간 후에 추가되었다. 전사 반응은 37°C에서 추가적인 1.5시간 동안 배양되었다.
그 후에, 6 μl DNAse I (1 mg/ml) 및 0.2 μl CaCl2 용액 (0.1 M) / μg DNA 주형이 전사 반응에 첨가되었고 37°C에서 2시간 동안 배양되었다.
4. 감소된 T7 RNA 중합효소 농도 및 감소된 주형 농도로 서열-최적화된 전사
Figure 112016122619642-pct00014
결과
서열-최적화된 전사 혼합물에서 전사는 표준 상태 (도 21, TS(1)) 하에서 전사와 비교하여 전사된 RNA 의 더 높은 농도를 초래한다. 뉴클레오타이드 및 전사 버퍼의 추가적인 피드는 전사된 RNA의 양을 더 증가시킨다 (도 21, TS(3)).
수율
Figure 112016122619642-pct00015
발현 및 면역자극성
HeLa 세포는 25 mM HEPES, 2 mM L-글루타민 및 100 IU/ml 페니실린/스트렙토마이신(all Lonza, Basel, Switzerland) 및 10% fetal calf serum (Perbio Science, Bonn, Germany)로 보충된 Gibco® RPMI 1640 배지로 이루어진 2 ml HeLa 세포 배양 배지에서 6-홈 플레이트에서 홈 당 4x105 개 세포의 농도로 뿌려졌다. 다음 날, 세포는 RNA의 2 μg 또는 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies, Darmstadt, Germany, catalog no. 11668-027을 이용한 음성대조군으로서 주사용 증류수 (WFI)가 세포 감염되었다. 간단하게, Lipofectamine®시약 및 RNA 는 각각 Opti-MEM® 배지 (Life Technologies)에서 희석되었고, 1:1.5의 RNA: Lipofectamine® 비율로 결합되고 상온에서 20분 동안 배양되었다. 음성대조군은 Lipofectamine® 과 혼합된 RNA 대신에 WFI를 포함했다. 그동안 세포는 25 mM HEPES 및 2 mM L-Glutamine (세럼 프리 및 페니실린/스트렙토마이신 프리 배지)가 보충된 2 ml Gibco® RPMI 1640 배지로 한 번 세척되고 세럼 프리 및 페니실린/ 스트렙토마이신 프리 배지의 2 ml가 세포에 더해졌고, 0.5 ml RNA: Lipofectamine® 세포감염 혼합물이 추가되었다. 37°C 및 5% CO2 에서 4시간 동안 배양 후에, 감염 혼합물을 포함한 배지는 제거되었고 2 ml 의 HeLa 세포 배양 배지가 추가되었다.
24시간 후에, 상층액과 세포가 수집되었다.
단백질 발현
HA 단백질의 표면 발현은 유동세포계수분석법을 이용하여 결정되었다. 흡착력있는 HeLa세포는 1ml PBS로 한 번 세척되고 트립신-프리 분리 버퍼(40mM 트리스 HCl pH 7,5; 150mM NaCl, 1mM EDTA)를 이용하여 하베스트되었다. 세포는 쥐의 단일클론 항-HA (H1N1) 항체 (Immune Technology, New York, USA)로 배양되었고 그 후 두번째 안티-마우스 FITC-컨쥬게이티드 항체 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)가 뒤따라진다. 세포는 BD FACS Canto로 측정되었고 FlowJo Software Version 10.6를 이용하여 분석되었다. 통계적인 분석은 Graph Pad Prism Software, Version 5.01를 이용하여 수행되었다.
결과:
서열-최적화된 반응 혼합물 (도 22, TS(2), TS(3), TS(4))에서 전사된 RNA는 표준 상태 (도 22, T(1))에서 전사된 RNA 보다 암호화된 HA 단백질의 더 높은 발현을 초리했다.
면역 자극성
IL-6, CXCL10 및 CCL5의 농도는 제조사의 지시 (BD Biosciences) 에 따라 하기의 키트를 이용하여 혈구계산 비드 어레이 (CBA)에 의해 세포-프리 상층액에서 측정되었다.
Figure 112016122619642-pct00016
데이터는 FCAP Array v3.0 software (BD Biosciences)를 이용하여 분석되었다. 통계적 분석은 Graph Pad Prism Software, Version 5.01를 이용하여 수행되었다.
결과:
표준 상태 (도 23, TS1)하에서 전사된 RNA는 서열-최적화된 반응 혼합물 (도23, TS2, TS3, TS4)에서 전사된 RNAs와 비교하여 그리고 헬라세포에서 더 높은 단계의 시토카인, IL-6, CXCL10 및 CCL5을 유도했다.
1...반응리액터 24...피드 탱크
2...반응 모듈 25...재순환 펌프
3...캡처 모듈 31...버 퍼탱크
4...제어 모듈 41...센서 유닛
5...환류 모듈 42...컨트롤러
21...한외여과막 43...피드 펌프
22...반응 코어 51...환류 펌프
23...여과 부분
SEQUENCE LISTING <110> CureVac GmbH <120> Methods for enhancing RNA production <130> CU01P165WO2 / IMP162877 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 589 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G/C optimized mRNA sequence of R1871 coding for Homo sapiens prostate stem cell antigen (HsPSCA) <400> 1 gggagaaagc uuaccaugaa ggccgugcug cucgcgcugc ugauggccgg ccuggcccug 60 cagccgggga ccgcccugcu gugcuacagc ugcaaggccc aggucucgaa cgaggacugc 120 cugcaggugg agaacugcac gcagcugggc gagcagugcu ggaccgcccg gauccgcgcc 180 gugggccugc ucaccgugau cagcaagggc ugcagccuga acugcgugga cgacagccag 240 gacuacuacg ugggcaagaa gaacaucacc ugcugcgaca ccgaccugug caacgccagc 300 ggcgcccacg cccugcagcc cgcggccgcc auccuggccc ugcugcccgc ccugggccug 360 cugcucuggg gccccggcca gcugugacca cuaguuauaa gacugacuag cccgaugggc 420 cucccaacgg gcccuccucc ccuccuugca ccgagauuaa uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaugcau cccccccccc 540 cccccccccc cccccccccc caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 589 <210> 2 <211> 1870 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G/C optimized mRNA sequence of R2988 coding for Photinus pyralis luciferase (PpLuc) <400> 2 gggagaaagc uuaccaugga ggacgccaag aacaucaaga agggcccggc gcccuucuac 60 ccgcuggagg acgggaccgc cggcgagcag cuccacaagg ccaugaagcg guacgcccug 120 gugccgggca cgaucgccuu caccgacgcc cacaucgagg ucgacaucac cuacgcggag 180 uacuucgaga ugagcgugcg ccuggccgag gccaugaagc gguacggccu gaacaccaac 240 caccggaucg uggugugcuc ggagaacagc cugcaguucu ucaugccggu gcugggcgcc 300 cucuucaucg gcguggccgu cgccccggcg aacgacaucu acaacgagcg ggagcugcug 360 aacagcaugg ggaucagcca gccgaccgug guguucguga gcaagaaggg ccugcagaag 420 auccugaacg ugcagaagaa gcugcccauc auccagaaga ucaucaucau ggacagcaag 480 accgacuacc agggcuucca gucgauguac acguucguga ccagccaccu cccgccgggc 540 uucaacgagu acgacuucgu cccggagagc uucgaccggg acaagaccau cgcccugauc 600 augaacagca gcggcagcac cggccugccg aagggggugg cccugccgca ccggaccgcc 660 ugcgugcgcu ucucgcacgc ccgggacccc aucuucggca accagaucau cccggacacc 720 gccauccuga gcguggugcc guuccaccac ggcuucggca uguucacgac ccugggcuac 780 cucaucugcg gcuuccgggu gguccugaug uaccgguucg aggaggagcu guuccugcgg 840 agccugcagg acuacaagau ccagagcgcg cugcucgugc cgacccuguu cagcuucuuc 900 gccaagagca cccugaucga caaguacgac cugucgaacc ugcacgagau cgccagcggg 960 ggcgccccgc ugagcaagga ggugggcgag gccguggcca agcgguucca ccucccgggc 1020 auccgccagg gcuacggccu gaccgagacc acgagcgcga uccugaucac ccccgagggg 1080 gacgacaagc cgggcgccgu gggcaaggug gucccguucu ucgaggccaa ggugguggac 1140 cuggacaccg gcaagacccu gggcgugaac cagcggggcg agcugugcgu gcgggggccg 1200 augaucauga gcggcuacgu gaacaacccg gaggccacca acgcccucau cgacaaggac 1260 ggcuggcugc acagcggcga caucgccuac ugggacgagg acgagcacuu cuucaucguc 1320 gaccggcuga agucgcugau caaguacaag ggcuaccagg uggcgccggc cgagcuggag 1380 agcauccugc uccagcaccc caacaucuuc gacgccggcg uggccgggcu gccggacgac 1440 gacgccggcg agcugccggc cgcgguggug gugcuggagc acggcaagac caugacggag 1500 aaggagaucg ucgacuacgu ggccagccag gugaccaccg ccaagaagcu gcggggcggc 1560 gugguguucg uggacgaggu cccgaagggc cugaccggga agcucgacgc ccggaagauc 1620 cgcgagaucc ugaucaaggc caagaagggc ggcaagaucg ccgugugagg acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc 1860 caccagaauu 1870 <210> 3 <211> 5337 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G/C optimized mRNA sequence of R1626 coding for Homo sapiens Mucin-1 signal peptide/epidermal growth factor receptor/Mucin-1 fusion protein (EGFR/Mucin-1) <400> 3 gggagaaagc uuaccaugac ccccggcacc cagagcccgu ucuuccugcu ccugcugcuc 60 acggugcuga ccgucgugac cgggaugcgg ccgagcggca ccgccggggc ggcccugcuc 120 gcccugcugg ccgcccugug ccccgccucg cgcgcgcugg aggagaagaa ggugugccag 180 ggcacgagca acaagcugac ccagcucggc accuucgagg accacuuccu gagccugcag 240 cggauguuca acaacugcga ggucgugcug ggcaaccugg agaucaccua cgugcagcgg 300 aacuacgacc ugagcuuccu caagaccauc caggaggugg ccggcuacgu gcugaucgcc 360 cugaacaccg uggagcggau cccgcuggag aaccugcaga ucauccgggg caacauguac 420 uacgagaaca gcuacgcccu ggccguccuc agcaacuacg acgccaacaa gacggggcug 480 aaggagcugc cgaugcggaa ccugcaggag auccugcacg gcgcggugcg cuucucgaac 540 aacccggccc ugugcaacgu ggagagcauc caguggcggg acaucgugag cagcgacuuc 600 cucagcaaca ugagcaugga cuuccagaac caccugggcu cgugccagaa gugcgacccg 660 agcugcccga acggcagcug cuggggcgcc ggcgaggaga acugccagaa gcugaccaag 720 aucaucugcg cccagcagug cagcgggcgg ugccggggca agagccccag cgacugcugc 780 cacaaccagu gcgccgccgg cugcaccggc ccgcgggagu cggacugccu ggugugccgg 840 aaguuccgcg acgaggcgac cugcaaggac accugcccgc cgcugaugcu guacaacccg 900 accacguacc agauggacgu gaacccggag ggcaaguaca gcuucggcgc caccugcguc 960 aagaagugcc cccggaacua cguggugacc gaccacggga gcugcgugcg ggccugcggc 1020 gccgacagcu acgagaugga ggaggacggc gugcggaagu gcaagaagug cgagggcccg 1080 ugccggaagg ugugcaacgg caucggcauc ggggaguuca aggacagccu cagcaucaac 1140 gccaccaaca ucaagcacuu caagaacugc accucgauca gcggcgaccu gcacauccug 1200 ccggucgccu uccggggcga cagcuucacc cacacgccgc cgcuggaccc gcaggagcug 1260 gacauccuga agaccgugaa ggagaucacc ggcuuccucc ugauccaggc guggcccgag 1320 aaccgcaccg accugcacgc cuucgagaac cuggagauca uccggggccg gaccaagcag 1380 cacggccagu ucagccuggc cguggugagc cugaacauca ccagccucgg gcugcggucg 1440 cugaaggaga ucagcgacgg cgacgugauc aucagcggca acaagaaccu gugcuacgcc 1500 aacacgauca acuggaagaa gcuguucggc accagcggcc agaagaccaa gaucaucagc 1560 aaccggggcg agaacagcug caaggccacc gggcaggugu gccacgcccu gugcucgccg 1620 gagggcugcu ggggcccgga gccgcgggac ugcgucagcu gccgcaacgu gagccggggc 1680 cgggagugcg uggacaagug caaccuccug gagggcgagc cgcgggaguu cguggagaac 1740 agcgagugca uccagugcca cccggagugc cugccccagg cgaugaacau caccugcacc 1800 ggccgggggc cggacaacug cauccagugc gcccacuaca ucgacggccc gcacugcgug 1860 aagacgugcc cggccggcgu gaugggcgag aacaacaccc uggucuggaa guacgccgac 1920 gccggccacg ugugccaccu gugccacccg aacugcaccu acggcugcac cgggccgggc 1980 cuggagggcu gccccaccaa cggcccgaag aucccgagca ucgccaccgg cauggugggc 2040 gcgcuccugc ugcugcuggu gguggcccug gggaucggcc ucuucaugcg gcgccggcac 2100 aucgugcgga agcggacgcu gcggcggcug cugcaggagc gcgagcuggu cgagccgcug 2160 accccgagcg gcgaggcccc gaaccaggcc cuccugcgga uccugaagga gaccgaguuc 2220 aagaagauca aggugcuggg cucgggcgcc uucggcaccg uguacaaggg gcuguggauc 2280 cccgagggcg agaaggugaa gaucccggug gccaucaagg agcugcggga ggcgaccagc 2340 ccgaaggcca acaaggagau ccucgacgag gccuacguga uggccagcgu cgacaacccg 2400 cacgugugcc ggcugcuggg caucugccug accagcacgg ugcagcugau cacccagcug 2460 augccguucg gcugccuccu ggacuacgug cgggagcaca aggacaacau cggcagccag 2520 uaccugcuga acuggugcgu gcagaucgcc aagggcauga acuaccugga ggaccggcgc 2580 cuggugcacc gggaccucgc cgcgcggaac guccugguga agaccccgca gcacgugaag 2640 aucaccgacu ucgggcuggc caagcugcug ggcgccgagg agaaggagua ccacgccgag 2700 ggcggcaagg ugcccaucaa guggauggcc cuggagagca uccuccaccg gaucuacacc 2760 caccagucgg acguguggag cuacggcgug accgucuggg agcugaugac guucggcagc 2820 aagccguacg acgggauccc ggccagcgag aucagcagca uccuggagaa gggcgagcgg 2880 cugccgcagc cgccgaucug caccaucgac guguacauga ucauggugaa gugcuggaug 2940 aucgacgcgg acucgcggcc caaguuccgc gagcugauca ucgaguucag caagauggcc 3000 cgggacccgc agcgguaccu ggugauccag ggcgacgagc ggaugcaccu cccgagcccg 3060 accgacagca acuucuaccg ggcccugaug gacgaggagg acauggacga cgugguggac 3120 gccgacgagu accugauccc gcagcagggc uucuucagca gcccgucgac cagccggacc 3180 ccgcugcuga gcagccugag cgccaccagc aacaacucga cggucgccug caucgaccgc 3240 aacggccucc agagcugccc caucaaggag gacagcuucc ugcagcggua cagcagcgac 3300 ccgaccggcg cgcugaccga ggacagcauc gacgacaccu uccugccggu gccggaguac 3360 aucaaccagu cggugccgaa gcggcccgcc gggagcgugc agaacccggu guaccacaac 3420 cagccgcuga acccggcccc gagccgggac ccgcacuacc aggaccccca cagcaccgcc 3480 gugggcaacc cggaguaccu gaacaccguc cagccgacgu gcgugaacag caccuucgac 3540 agcccggccc acugggccca gaagggcucg caccagauca gccucgacaa cccggacuac 3600 cagcaggacu ucuucccgaa ggaggcgaag cccaacggca ucuucaaggg cagcaccgcc 3660 gagaacgccg aguaccugcg gguggccccg cagagcagcg aguucaucgg cgccuccggc 3720 cacgccagcu ccacccccgg gggcgagaag gagacgagcg ccacccagcg guccagcgug 3780 cccuccagca ccgagaagaa cgcggucucc augaccagcu ccgugcugag cucccacagc 3840 cccggguccg gcagcuccac gacccagggc caggacguga cccucgcccc ggccaccgag 3900 cccgccagcg gguccgccgc gacguggggc caggacguca ccagcgugcc cgugacccgc 3960 cccgcccugg ggagcaccac gccgcccgcc cacgacguca ccuccgcccc cgacaacaag 4020 cccgcgccgg gcagcaccgc cccccccgcc cacgggguga ccuccgcccc cgacacgcgg 4080 ccggcccccg gcagcaccgc gccccccgcc cacggcguga ccuccgcccc ggacacccgc 4140 ccggcccccg gcagcaccgc cccccccgcc cacgggguga ccuccgcccc ggacacgcgg 4200 cccgcccccg gcagcaccgc cccgcccgcc cacggcguca cguccgcgcc cgacaaccgc 4260 cccgcccugg ggagcaccgc cccgcccgug cacaacguga ccuccgccag cggcuccgcg 4320 agcggguccg ccagcacccu cguccacaac ggcacguccg cccgggccac caccaccccc 4380 gccagcaagu ccacgcccuu cagcaucccg ucccaccaca gcgacacccc caccacccug 4440 gcgucccaca gcacgaagac cgacgccucc agcacccacc acuccagcgu gcccccgcug 4500 accagcucca accacagcac guccccgcag cucagcaccg ggguguccuu cuucuuccug 4560 agcuuccaca ucuccaaccu gcaguucaac agcucccucg aggaccccag caccgacuac 4620 uaccaggagc ugcagcggga caucuccgag auguuccugc agaucuacaa gcagggcggc 4680 uuccucgggc ugagcaacau caaguuccgc cccggcuccg ucguggugca gcugacccuc 4740 gccuuccggg aggggacgau caacguccac gacguggaga cccaguucaa ccaguacaag 4800 accgaggccg ccagccgcua caaccugacc aucuccgacg ugagcgucuc cgacgugccc 4860 uucccguuca gcgcgcaguc cggcgccggc gugcccgggg ccgugugcca gugccggcgc 4920 aagaacuacg ggcagcucga caucuucccc gcccgggaca cguaccaccc gaugagcgag 4980 uacccgaccu accacaccca cggccgcuac guccccccca gcuccaccga ccggagcccc 5040 uacgagaagg uguccgccgg gaacggcggc agcucccuga gcuacaccaa cccggcggug 5100 gccgccgccu ccgccaaccu ggaggaccag guggaccccc ggcugaucga cggcaaguga 5160 ggacuaguua uaagacugac uagcccgaug ggccucccaa cgggcccucc uccccuccuu 5220 gcaccgagau uaauaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaua uucccccccc cccccccccc cccccccccc ccucuag 5337 <210> 4 <211> 547 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-coding immunostimulatory RNA sequence of R2025 <400> 4 gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60 uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120 auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180 uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240 gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300 cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360 gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420 guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540 gcucuag 547 <210> 5 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hammerhead ribozyme HHNUH2d <400> 5 gcauggcuga ugaggccucg accgauaggu cgaggccgaa aagcuuucuc cc 52 <210> 6 <211> 2083 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G/C optimized mRNA sequence encoding HA from Influenza A H1N1 (Netherlands 2009) <400> 6 ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accaugaagg 60 ccauccuggu gguccuccug uacaccuucg ccaccgcgaa cgccgacacg cugugcaucg 120 gcuaccacgc caacaacagc accgacaccg uggacaccgu gcucgagaag aacgucacgg 180 ugacccacuc cgugaaccug cuggaggaca agcacaacgg gaagcucugc aagcugcggg 240 gcgucgcccc gcugcaccuc gggaagugca acaucgccgg cuggauccug gggaacccgg 300 agugcgagag ccuguccacc gcgagcuccu ggagcuacau cguggagacc uccagcuccg 360 acaacggcac gugcuacccc ggcgacuuca ucgacuacga ggagcuccgc gagcagcuga 420 gcuccgugag cuccuucgag cgguucgaga ucuuccccaa gaccagcucc uggcccaacc 480 acgacagcaa caaggggguc accgccgccu gcccgcacgc cggcgcgaag uccuucuaca 540 agaaccugau cuggcucgug aagaagggga acagcuaccc caagcugucc aagagcuaca 600 ucaacgacaa gggcaaggag gugcuggucc ucugggggau ccaccacccc agcaccuccg 660 ccgaccagca gagccuguac cagaacgccg acgccuacgu guucgugggc uccagccgcu 720 acuccaagaa guucaagccc gagaucgcca uccggccgaa gguccgcgac caggagggcc 780 ggaugaacua cuacuggacg cugguggagc ccggggacaa gaucaccuuc gaggcgaccg 840 gcaaccucgu ggucccccgc uacgccuucg ccauggagcg gaacgccggg agcggcauca 900 ucaucuccga cacccccgug cacgacugca acacgaccug ccagaccccg aagggcgcca 960 ucaacaccag ccugcccuuc cagaacaucc accccaucac gaucgggaag ugccccaagu 1020 acgugaaguc caccaagcug cgccucgcga ccggccugcg gaacgucccg agcauccagu 1080 cccgcgggcu guucggcgcc aucgccgggu ucaucgaggg cggcuggacc gggauggugg 1140 acggcuggua cggguaccac caccagaacg agcagggcag cggguacgcc gccgaccuca 1200 aguccacgca gaacgcgauc gacgagauca ccaacaaggu gaacagcguc aucgagaaga 1260 ugaacaccca guucaccgcc gugggcaagg aguucaacca ccuggagaag cggaucgaga 1320 accugaacaa gaaggucgac gacggcuucc ucgacaucug gacguacaac gccgagcugc 1380 uggugcuccu ggagaacgag cgcacccugg acuaccacga cuccaacgug aagaaccucu 1440 acgagaaggu ccggagccag cugaagaaca acgccaagga gaucgggaac ggcugcuucg 1500 aguucuacca caagugcgac aacaccugca uggaguccgu gaagaacggg accuacgacu 1560 accccaagua cagcgaggag gccaagcuga accgcgagga gaucgacggc gugaagcucg 1620 aguccacgcg gaucuaccag auccuggcga ucuacagcac cgucgccagc ucccuggugc 1680 ucguggucag ccugggggcc aucuccuucu ggaugugcag caacggcucc cugcagugcc 1740 gcaucugcau cugaccacua gugcaucaca uuuaaaagca ucucagccua ccaugagaau 1800 aagagaaaga aaaugaagau caauagcuua uucaucucuu uuucuuuuuc guugguguaa 1860 agccaacacc cugucuaaaa aacauaaauu ucuuuaauca uuuugccucu uuucucugug 1920 cuucaauuaa uaaaaaaugg aaagaaccua gaucuaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaau gcaucccccc cccccccccc 2040 cccccccccc cccccaaagg cucuuuucag agccaccaga auu 2083

Claims (52)

  1. 하기 단계를 포함하는 주어진 서열의 캡 된(capped) mRNA 분자를 합성하는 방법:
    a) 상기 캡 된 mRNA 분자의 네 종류의 뉴클레오타이드 G, A, C 및 U 의 각각의 비율(fraction) (1) 을 결정하는 단계, 및
    b) 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로(in vitro) 전사를 통해 상기 캡 된 mRNA 분자를 합성하는 단계, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물은 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하며, 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에서 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 각각의 비율(2)은 상기 캡 된 mRNA 분자, 버퍼(buffer), DNA 주형 및 RNA 중합효소의 비율(1)에 상응하며,
    상기 인비트로 전사의 과정에서 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTPs) GTP, ATP, CTP 및 UTP를 포함하는 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP) 혼합물은 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에 첨가되며, 상기 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP) 혼합물 중 네 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 각각의 비율(2)은 상기 캡 된 mRNA 분자에서 각각의 뉴클레오타이드의 비율(1)에 상응하며,
    여기서:
    상기 인비트로 전사의 시작 전에 캡 아날로그(cap analog)가 서열-최적화된 반응 혼합물에 첨가되어 캡 된 mRNA를 생산하며; 또는
    상기 인비트로 전사 이후 캡핑 효소가 캡 된 mRNA를 생산하는데 사용됨.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 인비트로 전사 시작 전에 개시 뉴클레오타이드가 상기 캡 된 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드와 상응하는 상기 서열-최적화된 반응 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 개시 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 모노포스페이트, 뉴클레오사이드 다이포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 다이-뉴클레오사이드 트리포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 개시 뉴클레오타이드는 캡 아날로그(cap analog)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 개시 뉴클레오타이드는 상기 캡 된 mRNA분자의 첫 번째 위치에서 발견된 상기 캡 된 mRNA 분자에 뉴클레오타이드의 비율과 비교하여 과량으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 캡 된 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드와 상응하지 않는 뉴클레오타이드의 비율(1) 및 비율(2)는 최대 10%로 다른 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 부분 또는 전부는 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트에 의해 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 슈도우리딘-5'-트리포스페이트(pseudouridine-5'-triphosphate), 1-메틸슈도우리딘-5'-트리포스페이트(1-methylpseudouridine-5'-triphosphate), 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트(2-thiouridine-5'-triphosphate), 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트(4-thiouridine-5'-triphosphate) 및 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트(5-methylcytidine-5'-triphosphate)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 캡 된 mRNA분자는 100개 뉴클레오타이드 보다 긴 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 주어진 서열의 캡 된 mRNA 분자를 합성하는 방법은 대규모 합성으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 NTP 짝 이온 (counter ion)은 트리스(하이드록시메틸)-아미노메테인(트리스)(tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris))인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 인비트로 전사를 통해 상기 캡 된 mRNA 분자를 합성하는 방법은 이후 포함되지 않은(unincorporated) NTPs를 분리 및 정량하는 단계가 뒤따르는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인비트로 전사를 통해 상기 캡 된 mRNA 분자를 합성하는 방법은 바이오리액터(1)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 고체 지지체에 고정된 DNA 주형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 서열-최적화된 반응 혼합물로부터 뉴클레오타이드를 분리하기 위한 여과막(21)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 여과막(21)은 재생 셀룰로스, 개량 셀룰로스, 폴리설폰(polysulfone (PSU)), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile (PAN)), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate (PMMA)), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol (PVA)) 및 폴리아릴에터설폰(polyarylethersulfone (PAES))의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 여과막(21)은 10에서 50 kDa의 범위에서 분자량 분리(cut-off)를 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 반응하는 동안 뉴클레오타이드 농도의 실시간 측정을 위한 센서 유닛(41)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 센서 유닛(41)은 광도계 분석 (photometric analysis)에 의하여 뉴클레오타이드 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터는 제1항에서 정의된 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물의 증가를 제어하는 제어 모듈 (4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 제1항에서 정의된 서열-최적화된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (NTP) 혼합물을 첨가하는 작동기(43)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 캡 된 mRNA 분자를 잡고(capture) 전사 반응 혼합물의 다른 구성성분으로부터 캡 된 mRNA 분자를 분리하는 수지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 반-회분식(semi-batch) 모드 또는 연속적인 모드로 작동하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제17항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 적어도 하나의 이온-선택적 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이온-선택적 전극은 바이오리액터(1)의 적어도 하나의 부분(compartment)에 포함된 액체 내의 한 종류 또는 그 이상 종류의 이온의 농도를 측정하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29힝에 있어서, 상기 이온은 H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl- 및 PO4 3-로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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  38. 하기 모듈을 포함하는 주어진 서열의 RNA 분자를 합성하기 위한 바이오리액터(1):
    i) 제1항 (b)에서 정의된 서열-최적화된 반응 혼합물에서 인비트로 전사 반응을 수행하기 위한 반응 모듈(2); 여기서 상기 반응 모듈(2)은 RNA 전사 반응을 위한 기초로서 고체 지지체 상에 고정된 DNA 주형을 포함하고, 상기 반응 모듈(2)은 서열-최적화된 반응 혼합물의 고분자량 성분으로부터 뉴클레오티드를 분리하기 위한 여과막(21)을 포함하고, 상기 여과막(21)은 반응 코어(22)를 여과 구획(23)으로부터 분리하며;
    ii) 전사된 RNA 분자를 일시적으로 포획하기 위한 수지/고체상을 포함하는 캡처 모듈(3), 여기서 캡처 모듈(3)은 포획된 전사된 RNA 분자를 정제하기 위한 수단(31)을 포함하며; 및
    iii) 반응 모듈(2) 내로 서열-최적화된 반응 혼합물의 구성요소의 인피드(infeed)를 제어하도록 구성된 제어 모듈(4), (a)광도계(photometric) 분석용 센서를 포함하는 센서 유닛(41), (b)컨트롤러(42), 및 (c)공급 펌프(43), 여기서 상기 센서(41) 및 공급 펌프(43)는 상기 컨트롤러(42)에 연결되며, 여기서 상기 컨트롤러(42)는 공급 펌프(43)의 제어를 허용하고, 여과 구획(23)에서 측정된 분리된 뉴클레오티드의 농도에 기초하여 서열-최적화된 반응 혼합물의 성분의 인피드를 제어하도록 구성됨.
  39. 제38항에 있어서, 상기 여과막(21)은 고분자량 구성요소를 저분자량 구성요소로부터 분리하기 위한 한외 여과막(ultrafiltration)(21)인 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  40. 제38항에 있어서, 상기 여과막(21)은 10 내지 100kDa, 10 내지 75kDa, 10 내지 50kDa, 10 내지 25kDA, 10 내지 15kDa의 범위에서 분자량 분리(cut-off)하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  41. 제40항에 있어서, 상기 여과막(21)은 10 내지 50kDa의 범위에서 분자량 분리 값을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  42. 제38항에 있어서, 상기 캡처 모듈(3)은 전사된 RNA 분자를 잡고 전사된 RNA 분자를 전사 반응 혼합물의 다른 용해성 구성요소로부터 분리하기 위한 수지를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  43. 제38항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 전사된 RNA 분자를 잡은 후에 나머지 여과된 반응 혼합물을 캡처 모듈(3)으로부터 반응 모듈(2)로 돌려보내도록 구성된 환류 모듈(5)을 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 환류 모듈(5)은 상기 나머지 여과된 반응 혼합물을 돌려보내도록 구성된 펌프(51)를 포함하는 바이오리액터(1).
  44. 제43항에 있어서, 상기 환류 모듈(5)은 와해성 구성요소를 잡기 위한 고정된 효소 또는 수지를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  45. 제38항에 있어서, 상기 센서 유닛 (41)은 전사 반응 파라미터로서, 광도계 분석에 의하여 분리된 뉴클레오타이드의 농도를 측정하도록 조정된(adapted) 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  46. 제45항에 있어서, 상기 센서 유닛 (41)은 여과된 반응 혼합물에서 추가 전사 반응 파라미터를 측정하도록 조정된 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  47. 제46항에 있어서, 상기 추가 전사 반응 파라미터는 pH-값 및/또는 염도인 것을 특징으로 하는 바이오리액터(1).
  48. 제38항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 반-회분식(semi-batch) 모드 또는 연속적인 모드로 작동하는 바이오리액터(1).
  49. 제38항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 제1항의 방법을 수행하도록 구성된 바이오리액터(1).
  50. 제38항에 있어서, 상기 여과막(21)은 재생 셀룰로스, 개량 셀룰로스, 폴리설폰(polysulfone (PSU)), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile (PAN)), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate (PMMA)), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol (PVA)) 및 폴리아릴에터설폰(polyarylethersulfone (PAES))으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오리액터(1).
  51. 제38항에 있어서, 상기 바이오리액터(1)는 여과 구획(23)으로부터 추출된 여과된 유체를 순환시키도록 구성되고, 상기 여과된 유체를 여과 구획(23)으로 돌려 보내도록 구성된 재순환 펌프(25)를 포함하는 바이오리액터(1).
  52. 제51항에 있어서, 순환 라인은 재순환 펌프(25) 및 센서 유닛(41)을 포함하는 바이오리액터(1).
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