CN116113430A - 冠状病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于适用于治疗或预防冠状病毒感染，较佳冠状病毒SARS‑CoV‑2感染或与此类感染相关的病症，较佳COVID‑19的核酸。本发明亦关于组成物、多肽及疫苗。组成物及疫苗较佳包含所述核酸序列中的至少一者，较佳为与脂质纳米粒子(LNP)缔合的核酸序列。本发明亦关于核酸、组成物、多肽、组合、疫苗及套组的第一及第二医疗用途，及治疗或预防冠状病毒感染，较佳冠状病毒感染的方法。

Description

冠状病毒疫苗
概述
本发明尤其是关于适用于治疗或预防冠状病毒感染，较佳冠状病毒SARS-CoV-2感染或与此类感染相关的病症，较佳COVID-19的核酸。本发明亦关于组成物、多肽及疫苗。组成物及疫苗较佳包含所述核酸序列中的至少一者，较佳与聚合载体、聚阳离子蛋白或肽或脂质纳米粒子(LNP)缔合的核酸序列。本发明亦关于核酸、组成物、多肽、疫苗及套组的第一及第二医疗用途，及治疗或预防冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2感染的方法。
冠状病毒为冠状病毒科家族的具套膜、阳性单股RNA病毒。
其代表性在不同脊椎动物(诸如哺乳动物、鸟类及鱼类)中引起各种疾病。
冠状病毒为基因高度可变的，且个别病毒物种亦可以借由克服物种屏障感染若干宿主物种。此类转移已引起人类感染SARS-相关冠状病毒(SARS-CoV)及中东呼吸症候群冠状病毒(MERS-CoV)。2019/2020年开始的冠状病毒流行归因于先前未知的冠状病毒，其初步命名为nCoV-2019；后来将该病毒正式命名为SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2引起的病毒感染的典型症状，亦称为COVID-19疾病(冠状病毒疾病2019)，包括发烧、咳嗽、呼吸短促、肺炎及胃肠症状(例如腹泻)。严重疾病会导致需要在加护病室中进行机械通风及支持的呼吸衰竭。在2020年1月30日，世界卫生组织(WHO)宣布了彼新型冠状病毒爆发的全球健康紧急情况。世界卫生组织在3月11日宣布COVID-19为大流行性疾病，指出全世界超过110个国家及地区总共有超过118,000个冠状病毒疾病的病例且存在进一步全球扩散的持续风险。截至2020年3月底，有超过800,000例SARS-CoV-2感染的确诊病例，其在世界上几乎每个国家间扩散，其中有超过40,000例COVID-19相关的死亡。
目前，无疫苗或专一性治疗可用于SARS-CoV-2感染及/或COVID-19疾病。
诊断患有SARS-CoV-2感染的患者仅接受基于个体症状及临床状况的支持性治疗。归因于严重的全球大流行性疾病的较大风险，迫切需要对SARS-CoV-2感染的安全且有效的治疗或预防。特定言之，需要疫苗来保护其中已观测到高死亡率的老年人群。
基于核酸的疫苗接种(包括DNA或RNA)代表一种用于针对新兴病毒的新颖疫苗的有前景的技术。核酸可以经基因工程改造且向人类个体投予。经转染的细胞直接产生编码的抗原(例如由DNA或RNA，尤其mRNA提供)，其产生保护性免疫反应。
已阐明病毒专一性记忆T细胞在针对SARS-CoV感染的广泛及长期保护中的关键作用(参见例如Channappanavar、Rudragouda等人「Virus-specific memory CD8T cellsprovide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndromecoronavirus infection.」Journal of virology 88.19(2014):11034-11044)。病毒专一性CD8 T细胞例如为病原体清除及在病毒攻击之后介导保护所需。因此，有效SARS-CoV-2疫苗不仅应诱导强功能性体液免疫反应，而且诱导SARS-CoV-2专一性CD8+T细胞及CD4+T细胞反应。
因此，本发明的目标为提供用于冠状病毒感染，特定言的SARS-CoV-2感染的基于核酸的疫苗。本发明的另一目标为提供一种有效冠状病毒疫苗，其可以在无冷链情况下储存及运输且其能够实现快速及可扩展的冠状病毒疫苗生产。
如权利要求及本说明书中进一步定义，此等目标尤其借由提供核酸(例如RNA或DNA)来解决，该核酸包含至少一个编码至少一种衍生自冠状病毒SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白的编码序列。
此外，将需要此类核酸，或例如包含该核酸的组成物/疫苗具有以下有利特征中的至少一些：
·核酸在注射/疫苗接种(例如肌肉)部位的转译；
·以极低剂量及给药方案极有效诱导针对经编码的SARS-CoV-2蛋白的抗原专一性免疫反应；
·对婴儿及/或新生儿或老年人，尤其老年人进行疫苗接种的适用性；
·肌内投予组成物/疫苗的适用性；
·诱导针对冠状病毒(在例如SARS-CoV-2中)的专一性及功能性体液免疫反应；
·诱导针对冠状病毒(在例如SARS-CoV-2中)的广泛功能性细胞T细胞反应；
·诱导针对冠状病毒(在例如SARS-CoV-2中)的专一性B细胞记忆；
·诱导可以有效中和病毒(例如SARS-CoV-2)的功能性抗体；
·诱导可以有效中和SARS-CoV-2的新兴变异体的功能性抗体；
·借由诱导黏膜IgA抗体来引发黏膜IgA免疫，
·诱导均衡的B细胞及T细胞反应；
·针对冠状病毒感染，例如针对SARS-CoV-2或其新兴变异体诱导保护性免疫；
·针对冠状病毒(在例如SARS-CoV-2中)的免疫保护的快速起效；
·针对冠状病毒(在例如SARS-CoV-2中)所诱导的免疫反应的寿命；
·由于疫苗接种或免疫病理学作用，SARS-CoV-2感染未增强；
·无借由基于核酸的SARS-CoV-2疫苗引起的抗体依赖性增强(ADE)；
·在施加疫苗后未过度诱导全身细胞介素或趋化介素反应，其可能在疫苗接种时引起不期望的高反应原性；
·疫苗的良好耐受性、无副作用、非毒性；
·基于核酸的疫苗的有利稳定性特征；
·冠状病毒疫苗生产的快速、可调适性、简单性及可扩展性；
·有利的疫苗接种方案，其仅需要一次或两次疫苗接种以获得足够保护。
·有利的疫苗接种方案，其仅需要低剂量的组成物/疫苗以获得足够保护。
定义
为清楚及可读性起见，提供以下定义。针对此等定义所提及的任何技术特征可在本发明的每一及每个具体实例上读取。可在此等具体实例的上下文中具体提供额外定义及解释。
数值上下文中的百分比应理解为相对于各别物品的总数目。在其他情况下，且除非上下文另外规定，否则百分比应理解为重量百分比(wt.-％)。
约：当决定子或值无需相同(亦即100％相同)时，使用术语「约」。因此，「约」意谓决定子或值可发散0.1％至20％，较佳0.1％至10％；特定言之，0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。熟习此项技术者将知晓，例如，某些参数或决定子可基于如何判定参数的方式而略微变化。举例而言，若在本文中定义某一决定子或值具有例如「约1000个核苷酸」的长度，则长度可发散0.1％至20％，较佳0.1％至10％；特定言之，0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。因此，熟习此项技术者应知道，在彼具体实施例中，长度可发散1至200个核苷酸，较佳1至200个核苷酸；特定言之，5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个核苷酸。
适应性免疫反应：如本文所使用的术语「适应性免疫反应」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指免疫系统(适应性免疫系统)的抗原专一性反应。抗原专一性允许产生针对专一性病原体或受病原体感染的细胞调整的反应。建立此等经调整的反应的能力通常借由「记忆单元」(B细胞)维持在体内。在本发明的情形下，抗原由编码至少一种衍生自冠状病毒，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)的抗原肽或蛋白的核酸(例如RNA或DNA)提供。
抗原：如本文所使用的术语「抗原」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指可由免疫系统，较佳由适应性免疫系统辨识且能够例如借由形成抗体及/或抗原专一性T细胞作为适应性免疫反应的一部分来触发抗原专一性免疫反应的物质。典型地，抗原可为或可包含肽或蛋白，其可由MHC呈递至T细胞。衍生自例如冠状病毒的棘蛋白(S)，较佳衍生自包含至少一个表位的SARS-CoV-2(nCoV-2019)的肽或蛋白的片段、变异体及衍生物亦在本发明的情形下理解为抗原。在本发明的情形下，抗原可为如本文所指定的所提供核酸的转译产物。
抗原肽或蛋白：术语「抗原肽或蛋白」或「免疫原性肽或蛋白」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指衍生自刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫反应的(抗原或免疫原性)蛋白的肽、蛋白。因此，抗原/免疫原性肽或蛋白包含衍生自(例如冠状病毒的棘蛋白(S)，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019))的蛋白的至少一个表位(如本文所定义)或抗原(如本文所定义)。
阳离子：除非自特定情形清楚不同含义，否则术语「阳离子」意谓各个结构永久或非永久地，但响应于某些条件(诸如pH值)而带正电荷。因此，术语「阳离子」涵盖「永久阳离子」及「可阳离子化」两者。
可阳离子化：如本文所使用的术语「可阳离子化」意谓化合物或基团或原子在较低pH下带正电且在其环境的较高pH下不带电。此外，在无法确定pH值的无水环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电，而在氢离子的低浓度或活性下不带电。视可阳离子化或可聚阳离子化的化合物的个别特性，特定言之各个可阳离子化基团或原子的pKa而定，pH或氢离子浓度下其带电或不带电。在经稀释的水性环境中，带正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分数可使用熟习此项技术者熟知的所谓的亨德森-哈塞尔巴尔赫方程(Henderson-Hasselbalch equation)来估测。例如，在一些具体实例中，若化合物或部分为可阳离子化的，则较佳的是，其在约1至9，较佳4至9、5至8或甚至6至8的pH值下，更佳在低于9、或低于8、或低于7的pH值下，最佳在生理pH值下，例如约7.3至7.4，例如在生理条件下，尤其在活体内细胞的生理盐条件下带正电。在其他具体实例中，较佳的是，可阳离子化的化合物或部分在生理pH值下主要为中性，例如约7.0-7.4，但在较低pH值下变得带正电。在一些具体实例中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的较佳范围为约5至约7。
编码序列/编码区：如本文所使用的术语「编码序列」或「编码区」及对应缩写「cds」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指可转译成肽或蛋白的若干核苷酸三重态的序列。在本发明的情形下，编码序列可为DNA序列，较佳RNA序列，其由可以被三个分开的多个核苷酸组成，所述核苷酸以起始密码子开始且较佳以终止密码子终止。
衍生自：贯穿本说明书，在核酸的上下文中所使用的术语「衍生自」，即对于「衍生自」(另一)核酸的核酸，意谓衍生自(另一)核酸的核酸与衍生其的核酸共享例如至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。熟习此项技术者意识到典型地计算相同类型的核酸，亦即DNA序列或RNA序列的序列一致性。因此，应理解，若DNA是「衍生自」RNA，或若RNA是「衍生自」DNA，则在第一步中，将RNA序列转化为对应DNA序列(特定言的，借由在整个序列中用胸苷(T)替换尿嘧啶(U))，或反之亦然，将DNA序列转化为对应RNA序列(特定言之，借由在整个序列中用U替换T)。其后，测定DNA序列的序列一致性或RNA序列的序列一致性。较佳地，「衍生自」核酸的核酸亦指核酸，其与衍生其的核酸相比经修饰，例如为了提高RNA稳定性，甚至进一步及/或延长及/或增加蛋白产生。在氨基酸序列(例如抗原肽或蛋白)的情形下，术语「衍生自」意谓衍生自(另一)氨基酸序列的氨基酸序列与衍生其的氨基酸序列共享例如至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
表位：如本文所使用的术语「表位」(此项技术中亦称为「抗原决定子」)将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指T细胞表位及B细胞表位。T细胞表位或抗原肽或蛋白的部分且可包含较佳长度为约6至约20或甚至更多个氨基酸的片段，例如如由I类MHC分子处理及呈现的片段，其较佳长度为约8至约10个氨基酸，例如8、9或10个(或甚至11或12个氨基酸)，或如由II类MHC分子处理及呈现的片段，较佳长度为约13至约20或甚至更多个氨基酸。此等片段典型地以由肽片段及MHC分子组成的复合物的形式由T细胞辨识，亦即片段典型地不以其天然形式辨识。B细胞表位典型地为位于(天然)蛋白或肽抗原的外表面上的片段，较佳具有5至15个氨基酸，更佳具有5至12个氨基酸，甚至更佳具有6至9个氨基酸，其可借由抗体辨识，亦即呈其天然形式。蛋白或肽的此类表位可另外选自本文所提及的此等蛋白或肽的变异体中的任一者。在此情形下，表位可以为构形或非连续表位，其由如本文所定义的蛋白或肽的片段组成，所述片段在如本文所定义的蛋白或肽的氨基酸序列中不连续，但在三维结构或由单一多肽链组成的连续或线性表位中结合在一起。
片段：贯穿本说明书，在核酸序列(例如RNA或DNA)或氨基酸序列的上下文中所使用的术语「片段」典型地可为例如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段典型地由与全长序列内的对应延伸段一致的序列组成。在本发明的情形下，序列的较佳片段由实体的连续延伸段组成，诸如对应于与衍生该片段的分子中实体的连续延伸段的核苷酸或氨基酸，其表示至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的衍生该片段(例如冠状病毒的棘蛋白(S)，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019))的总(亦即全长)分子。贯穿本说明书，在蛋白或肽的上下文中所使用的术语「片段」可典型地包含如本文所定义的蛋白或肽的序列，就其氨基酸序列而言，其与原始蛋白的氨基酸序列相比为N末端及/或C末端截断的(truncated)。该截断因此可在氨基酸水准上或对应地在核酸水准上出现。相对于如本文所定义的此类片段的序列一致性因此较佳可指如本文所定义的整个蛋白或肽，或指此类蛋白或肽的整个(编码)核酸分子。蛋白或肽的片段可包含彼等蛋白或肽的至少一个表位。
异源：贯穿本说明书，在核酸序列或氨基酸序列的情形下所使用的术语「异源」或「异源序列」是指序列(例如RNA、DNA、氨基酸)必须理解为衍生自另一基因、另一对偶基因或例如另一物种或病毒的序列。若两个序列不衍生自相同基因或不衍生自相同对偶基因，则其典型地理解为「异源」。亦即，尽管异源序列可衍生自自然界中相同生物体或病毒，但其不存在于相同核酸或蛋白中。
体液性免疫反应：术语「体液性免疫」或「体液性免疫反应」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指B细胞介导的抗体产生及视需要指伴随抗体产生的辅助过程。体液性免疫反应的特性典型地可为例如Th2活化及细胞介素产生、生发中心形成及同型转换、亲和力成熟及记忆细胞产生。体液性免疫典型地亦可指抗体的效应功能，其包括病原体及毒素中和、经典补体活化及吞噬作用及病原体消除的调理素促进。
(序列的)一致性：贯穿本说明书，在核酸序列或氨基酸序列的情形下所使用的术语「一致性」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指两个序列一致的百分比。为了测定两种序列(例如如本文所定义的核酸序列或氨基酸(aa)序列，较佳由如本文所定义的核酸序列编码的aa序列，或aa序列本身)一致的百分比，可以将序列比对以便随后与彼此相比较。因此，可将例如第一序列的位置与第二序列的对应位置相比较。若第一序列中的位置由与第二序列中的位置处相同的残基占据，则两个序列在此位置处一致。若并非如此，则序列在此位置处不同。若与第一序列相比插入出现于第二序列中，则空隙可以插入至第一序列中以允许进一步比对。若与第一序列相比缺失出现于第二序列中，则空隙可以插入至第二序列中以允许进一步比对。两个序列一致的百分比则为一致位置的数目除以仅占据于一种序列中的包括彼等位置的位置的总数目的函数。两个序列一致的百分比可以使用演算法，例如整合于BLAST程式中的演算法来确定。
免疫原、免疫原性：术语「免疫原」或「免疫原性」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指能够刺激/诱导免疫反应的化合物。较佳地，免疫原为肽、多肽或蛋白。本发明意义上的免疫原为所提供核酸的转译产物，其包含编码至少一种衍生自如本文所定义的SARS-CoV-2(nCoV-2019)的棘蛋白(S)的抗原肽、蛋白的至少一种编码序列。典型地，免疫原引发适应性免疫反应。
免疫反应：术语「免疫反应」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指适应性免疫系统对特定抗原的专一性反应(所谓的专一性或适应性免疫反应)或先天性免疫系统的非专一性反应(所谓的非专一性或先天性免疫反应)或其组合。
免疫系统：术语「免疫系统」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指可保护生物体免于感染的生物体系统。若病原体成功穿过生物体的物理障壁且进入此生物体，则先天性免疫系统提供即刻但非专一性反应。若病原体避开此先天性反应，则脊椎动物具有第二层保护，适应性免疫系统。此处，免疫系统调适其在感染期间的反应以改良其对病原体的辨识。此改良的反应随后在病原体已消除之后以免疫记忆形式保留，且使适应性免疫系统每当遭遇此病原体时建立更快且更强的攻击。根据此，免疫系统包含先天性及适应性免疫系统。此等两个部分中的每一者典型地含有所谓的体液及细胞组分。
先天性免疫系统：术语「先天性免疫系统」(亦称为非专一性(non-specific或unspecific)免疫系统)将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指典型地包含以非专一性方式使宿主受其他生物体感染的细胞及机制的系统。此意谓，先天性系统的细胞以通用方式辨识及响应病原体，但不同于适应性免疫系统，其不赋予宿主以持久或保护性免疫。先天性免疫系统可借由样式辨识受体(例如Toll样受体、NOD样受体或RIG-I样受体等)的配体活化。
类脂质化合物：类脂质化合物(亦简称为类脂质)为类脂质化合物(lipid-likecompound)，亦即，具有类脂质物理特性的两亲媒性化合物。在本发明的情形下，术语脂质视为涵盖类脂质化合物。
永久阳离子：如本文所使用的术语「永久阳离子」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且意谓例如相应化合物或基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电。典型地，正电荷由第四氮原子的存在产生。当化合物携带多个此类正电荷时，其可称为永久聚阳离子。
稳定RNA：术语「稳定RNA」是指经修饰使得与不具有此类修饰的RNA相比，其例如借由环境因素或酶消化(诸如借由胞外或核酸内切酶降解)更稳定地崩解或降解的RNA。较佳地，在本发明的情形下，稳定RNA在细胞，诸如原核或真核细胞中，较佳在哺乳动物细胞，诸如人类细胞中稳定。稳定效应亦可施加于细胞外部，例如以缓冲溶液等，例如用于储存包含稳定RNA的组成物。
T细胞反应：如本文所使用的术语「细胞免疫」或「细胞免疫反应」或「细胞T细胞反应」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指巨噬细胞、自然杀手细胞(NK)、抗原专一性细胞毒性T-淋巴细胞的活化及各种细胞介素响应抗原的释放。更一般而言，细胞免疫不基于抗体，而是基于免疫系统的细胞的活化。典型地，细胞免疫反应的特征可为例如活化能够在细胞(例如专一性免疫细胞，如树突状细胞或其他细胞)中诱导细胞凋亡的抗原专一性细胞毒性T-淋巴细胞，在其表面上展现外来抗原的表位。
(序列的)变异体：贯穿本说明书，在核酸序列的情形下所使用的术语「变异体」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指衍生自另一核酸序列的核酸序列的变异体。举例而言，与衍生变异体的核酸序列相比，核酸序列的变异体可展现一或多个核苷酸缺失、插入、添加及/或取代。核酸序列的变异体可与衍生变异体的核酸序列至少50％、60％、70％、80％、90％或95％一致。变异体为功能变异体，意义在于变异体保留衍生其的序列的功能的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多。核酸序列的「变异体」相对于该核酸序列的延伸段的至少10、20、30、50、75或100个核苷酸可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％核苷酸一致性。
贯穿本说明书，在蛋白或肽的情形下所使用的术语「变异体」例如意欲指具有与一或多个突变/取代中的原始序列不同的氨基酸序列，诸如一或多个经取代、插入及/或缺失的氨基酸的蛋白或肽变异体。较佳地，此等片段及/或变异体具有相同或相当的专一性抗原特性(免疫原性变异体、抗原变异体)。插入及取代尤其在不导致对三维结构的修饰或不影响结合区的彼等序列位置是可能的。借由插入或缺失对三维结构的修饰可以容易例如使用圆二色性(circular dichroism，CD)光谱测定。蛋白或肽的「变异体」相对于该蛋白或肽的延伸段的至少10、20、30、50、75或100个氨基酸可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸一致性。较佳地，蛋白的变异体包含蛋白的功能变异体，此意谓在本发明的情形下，变异体发挥与衍生其的蛋白基本上相同或至少40％、50％、60％、70％、80％、90％的免疫原性。
【发明内容】
本发明是基于发明人出人意料地发现由核酸(例如RNA)的编码序列提供的至少一种衍生自冠状病毒SARS-CoV-2(先前称为nCoV-2019)的肽或蛋白可以有效表现于人类细胞中(实施例2a、2b及2c)。甚至更出人意料且无法预期的是，投予包含该核酸(例如该RNA)的组成物诱导针对冠状病毒，特定言之针对冠状病毒SARS-CoV-2的抗原专一性免疫反应(参见实施例部分)。
甚至更加无法预期的是，本发明人展示本发明的编码RNA诱导高水准的功能性抗体，由高病毒中和效价(VNT)及T细胞反应(疫苗诱导双阳性CD4+及CD8+T细胞(参见例如实施例7及实施例10)，且甚至保护仓鼠及NHP免于SARS-CoV-2攻击感染(参见实施例9及实施例15)，因此表明本发明的编码RNA或组成物/疫苗适用作疫苗，例如用作人类个体中的疫苗。
彼等发现为提供基于核酸的冠状病毒疫苗的基础。
在第一态样中，本发明提供用于冠状病毒疫苗，较佳冠状病毒SARS-CoV-2疫苗的核酸，其中该核酸包含至少一个编码序列，该至少一个编码序列编码SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种的抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的。
在第二态样中，本发明提供一种包含第一态样的至少一种核酸的组成物，较佳免疫原性组成物。适当地，组成物可包含至少一种核酸，例如至少一种编码RNA，其与一或多种脂质复合、囊封于一或多种脂质中或与一或多种脂质缔合，从而形成脂质纳米粒子。
在第三态样中，本发明提供用于冠状病毒疫苗的抗原多肽，较佳用于SARS-CoV-2组成物或疫苗。
在第四态样中，本发明提供冠状病毒疫苗，较佳SARS-CoV-2疫苗，其中该疫苗包含至少一种第一态样的核酸或第二态样的组成物或至少一种第三态样的多肽。
在第五态样中，本发明提供一种套组或部件套组(kit of parts)，其包含至少一种第一态样的核酸，及/或至少一种第二态样的组成物，及/或至少一种第三态样的多肽，及/或至少一种第四态样的疫苗。
在第六态样中，本发明提供一种包含至少两种独立组分的组合，其中至少两种独立组分是选自第一态样的两种核酸，及/或至少两种第二态样的组成物，及/或至少两种第三态样的多肽，及/或至少两种第四态样的疫苗。
本发明的其他态样是关于一种治疗或预防个体中的冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2感染的方法，及核酸、组成物及疫苗的第一及第二医疗用途。亦提供制造核酸、组成物或疫苗的方法。
详细描述
本申请案与电子格式的序列表一并提交，该序列表是本申请案的说明书(WIPO标准ST.25)的一部分。序列表中所含资讯以全文引用的方式并入本文中。在本文中提及「SEQID NO」的情况下，参考具有相应识别号的序列表中的对应核酸序列或氨基酸(aa)序列。对于许多序列而言，序列表亦提供额外详细资讯，例如关于某些结构特征、序列优化、GenBank(NCBI)或GISAID(epi)识别号，或关于其编码能力的额外详细资讯。特定言之，此类资讯在WIPO标准ST.25序列表中以数字识别号<223>提供。因此，以该数字识别号<223>提供的资讯全文明确地包括于本文中且必须理解为本发明的说明书的组成部分。
用于冠状病毒疫苗的核酸：
在第一态样中，本发明是关于适用于冠状病毒疫苗的核酸。
必须注意，在本发明的第一态样的上下文中所描述的具体特征及具体实例，即本发明的核酸，同样适用于第二态样(本发明的组成物)、第三态样(本发明的多肽)、第四态样(本发明的疫苗)、第五态样(本发明的套组或部件套组)或其他态样(包括医疗用途及治疗方法)。
冠状病毒可以归类为α冠状病毒属、β冠状病毒属、δ冠状病毒属、γ冠状病毒属及类别不明的冠状病毒属。冠状病毒为基因高度可变的，且个别病毒物种亦可以借由克服物种屏障感染若干宿主物种。人类冠状病毒包括SARS-相关冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸症候群冠状病毒(MERS-CoV)及冠状病毒SARS-CoV-2(先前命名为nCoV-2019)。因此，核酸可适合于针对冠状病毒的疫苗，较佳针对作为人类病原体的冠状病毒，最佳针对新出现的冠状病毒SARS-CoV-2(nCoV-2019)。
一般熟习此项技术者将辨识及理解术语「核酸」或「核酸分子」。如本文所使用的术语「核酸」或「核酸分子」较佳指DNA(分子)或RNA(分子)。其较佳与术语多核苷酸同义地使用。较佳地，核酸或核酸分子为包含或由核苷酸单体组成的聚合物，所述单体借由糖/磷酸酯主链的磷酸二酯键彼此共价连接。术语「核酸分子」亦涵盖经修饰的核酸分子，诸如如本文所定义的经碱基修饰、经糖修饰或经主链修饰的DNA或RNA分子。
第一态样的核酸，例如DNA或RNA，可形成基于核酸的组成物或疫苗的基础。一般而言，基于蛋白的疫苗或减毒活病毒疫苗由于其高生产成本而在发展中国家中的使用是次佳的。此外，基于蛋白的疫苗或减毒活病毒疫苗需要较长研发时间且不适合于大流行性病毒爆发的快速反应，诸如在2019/2020年爆发的冠状病毒SARS-CoV-2。相比之下，根据本发明的基于核酸的疫苗允许极快速及成本有效的生产。因此，相比于已知疫苗，基于本发明核酸的疫苗可以显著较便宜且较快地生产，其特定言之对于在发展中国家使用是特别有利的。相比于基于蛋白或基于肽的疫苗，基于本发明核酸的疫苗的另一优点可为其温度稳定性。然而，基于多肽的疫苗亦在本发明的范畴内(参见例如第三态样)。
术语「核酸序列」、「DNA序列」、「RNA序列」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如是指一连串其核苷酸的特定及个别次序。
在第一态样的较佳具体实例中，核酸包含至少一个编码来自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的编码序列。
术语「来自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白」必须理解为(i)来自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原，其意谓该抗原肽或蛋白(或其片段)的氨基酸序列与SARS-CoV-2冠状病毒蛋白(或其片段)一致，或(ii)衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原，其意谓该抗原肽或蛋白(或其片段)的氨基酸序列与对应SARS-CoV-2冠状病毒蛋白(或其片段)不一致。
因此，在第一态样的较佳具体实例中，核酸包含至少一个编码为或衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的编码序列。
术语「为或衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒的抗原肽或蛋白」必须理解为(i)「来自SARS-CoV-2冠状病毒的」抗原，其意谓该抗原肽或蛋白(或其片段)的氨基酸序列与SARS-CoV-2冠状病毒蛋白(或其片段)的序列一致，或(ii)「衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的」抗原，其意谓该抗原肽或蛋白(或其片段)的氨基酸序列与对应SARS-CoV-2冠状病毒蛋白(或其片段)的序列不一致。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个编码序列，该至少一个编码序列编码为或衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体，其中该核酸包含至少一个异源非转译区(UTR)。
术语「非转译区」或「UTR」或「UTR元件」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指典型地位于编码序列5'或3'处的核酸分子的一部分。未将UTR转译成蛋白。UTR可为核酸的一部分，例如DNA或RNA。UTR可包含用于控制基因表现的元件，亦称为调节元件。所述调节元件可例如为核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
如本文所使用，术语「人类冠状病毒2019」、「nCoV-2019冠状病毒」、「nCoV-2019」、「HCoV-19」、「SARS2」、「COVID-19病毒」、「hCoV-19」、「SARS-CoV-2」或「冠状病毒SARS-CoV-2」贯穿本发明可互换使用，关于2019/2020年出现的新型大流行性冠状病毒，引起COVID-19疾病。根据WHO(2020年2月)，将病毒官方命名为「SARS-CoV-2」，且将相关疾病官方命名为「COVID-19」。
病毒SARS-CoV-2属于冠状病毒，特定言之属于正冠状病毒(Orthocoronaviruses)，更特定言之属于β冠状病毒属。例示性SARS-CoV-2冠状病毒为包括(但不限于)以下清单A及B中所提供的彼等分离株。
清单A：例示性SARS-CoV-2冠状病毒分离株(EPI/GISAID)：
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例示性SARS-CoV-2冠状病毒亦可以借由如以下清单B所提供的GenBank寄存编号提供的遗传资讯来定义或辨识。
清单B：不同SARS-CoV-2分离株的GenBank寄存编号：
NC_045512、LC528232、LC528233、LC529905、MN908947、MN938384、MN938385、MN938386、MN938387、MN938388、MN938389、MN938390、MN970003、MN970004、MN975262、MN975263、MN975264、MN975265、MN975266、MN975267、MN975268、MN985325、MN988668、MN988669、MN994467、MN994468、MN996527、MN996528、MN996529、MN996530、MN996531、MN997409、MT007544、MT012098、MT019529、MT019530、MT019531、MT019532、MT019533、MT020880、MT020881、MT027062、MT027063、MT027064、MT039873、MT039887、MT039888、MT039890、MT044257、MT044258、MT049951、MT050493、MT066156、MT066175、MT066176、MT072688、MT093571、MT093631、MT106052、MT106053、MT106054、MT118835、MT121215、MT123290、MT123291、MT123292、MT123293、MT126808、MT135041、MT135042、MT135043、MT135044、MT152824、MT159705、MT159706、MT159707、MT159708、MT159709、MT159710、MT159711、MT159712、MT159713、MT159714、MT159715、MT159716、MT159717、MT159718、MT159719、MT159720、MT159721、MT159722、MT163716、MT163717、MT163718、MT163719、MT163720、MT163721、MT184907、MT184908、MT184909、MT184910、MT184911、MT184912、MT184913、MT188339、MT188340、MT188341、MT192759、MT192765、MT192772或MT192773。
SARS-CoV-2冠状病毒已归因于NCBI分类学(NCBI:txid或taxID)：2697049。
术语「nCoV-2019冠状病毒的抗原肽或蛋白」或「SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白」是关于任何肽或蛋白，其是(来自)或衍生自如上文所定义的SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，而且关于其片段、变异体或衍生物，较佳关于其免疫原性片段或免疫原性变异体。
术语「免疫原性片段」或「免疫原性变异体」必须理解为能够在个体中产生免疫反应的对应SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒抗原的任何片段/变异体。较佳地，肌内或皮内投予第一态样的核酸引起个体中经编码SARS-CoV-2抗原(肽或蛋白)的表现。
如本文所使用的术语「表现」是指SARS-CoV-2冠状病毒肽或蛋白的产生，其中该SARS-CoV-2冠状病毒肽或蛋白是由第一态样的核酸的编码序列提供。举例而言，RNA的「表现」是指经由将RNA转译成多肽，例如转译成为或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的肽或蛋白来产生蛋白(例如在将该RNA投予至细胞或个体之后)。DNA的「表现」是指经由将DNA转录成RNA且随后转译成多肽，例如转译成为或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的肽或蛋白来产生蛋白(例如在将该DNA投予至细胞或个体之后)。术语「表现」及术语「产生」在本文中可互换使用。此外，术语「表现」较佳是关于在将核酸投予至细胞或生物体之后产生某一肽或蛋白。在具体实例中，核酸适用于疫苗，较佳冠状病毒疫苗。在较佳具体实例中，核酸适用于SARS-CoV-2冠状病毒疫苗。
在本发明的情形下，可使用为或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的任何蛋白且其可适合地由编码序列或第一态样的核酸编码。此外在本发明的范畴内，至少一种抗原肽或蛋白可包含或由经合成工程改造或人工冠状病毒肽或蛋白组成。术语「经合成工程改造」冠状病毒肽或蛋白或术语「人工冠状病毒肽或蛋白」与自然界中不存在的蛋白有关。因此，相比于天然冠状病毒肽或蛋白，「人工冠状病毒肽或蛋白」或「经合成工程改造冠状病毒肽或蛋白」可例如在至少一个氨基酸方面不同，及/或可包含额外异源肽或蛋白元件，及/或可为N末端或C末端延伸或截断。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个编码SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的编码序列，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含至少一种肽或蛋白，该至少一种肽或蛋白为或衍生自结构蛋白、辅助蛋白(accessoryprotein)或复制酶蛋白或此等蛋白中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个编码至少一种SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白的编码序列，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含至少一种肽或蛋白，该至少一种肽或蛋白为或衍生自结构蛋白，其中该结构蛋白是选自棘蛋白(S)、套膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核酸蛋白壳体蛋白(N)或此等蛋白中的任一者的免疫原性片段或变异体。
在尤其较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白(S)或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
棘蛋白是以三聚体形式存在于病毒表面上的典型I型病毒融合蛋白，其中各单体由头部(S1)及茎(S2)组成。个别前驱体S多肽形成均三聚体且在高基氏体(Golgiapparatus)内经历糖基化以及加工以移除信号肽，且借由细胞蛋白酶裂解以产生单独的S1及S2多肽链，其在均三聚体内保持与S1/S2原聚体缔合且因此为异二聚体的三聚体。刺突糖蛋白的S1域包括：受体结合域(RBD)，其与血管收缩素转化酶2受体接合(最可能)且介导病毒融合至宿主细胞中；N末端域，其可与靶细胞初步接触；及2个亚域，其皆对中和抗体敏感。S2域由参与与宿主核内体膜融合的六个螺旋束融合核心组成且亦为用于中和的标靶。S2次单位进一步包含两个七肽重复序列(HR1及HR2)及融合糖蛋白的典型中央螺旋、跨膜域及胞浆尾域。
由本发明的核酸提供的适合抗原肽或蛋白序列揭示于表1，1至41列，A及B栏中。此外，关于所述适合抗原肽或蛋白序列的其他资讯提供在ST25序列表的<223>识别号下。
在下文中，详细描述由本发明的核酸提供的较佳抗原肽或蛋白序列。
在较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的1至41列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
必须注意，除非另外说明，否则当提及棘蛋白(S)中的氨基酸(aa)残基及其位置时，本文所使用的任何编号是关于根据SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒分离株EPI_ISL_402128(βCoV_武汉_WIV05_2019_EPI_ISL_402128)的对应棘蛋白(S)中的相应氨基酸残基的位置。贯穿本发明，例示性指示SARS-CoV-2冠状病毒分离株EPI_ISL_402128(SEQ ID NO:1)的棘蛋白(S)的相应氨基酸位置。熟习此项技术者当然能够将例示SARS-CoV-2EPI_ISL_402128(SEQ ID NO:1)的本说明书中所提供的教示应用于其他SARS-CoV-2冠状病毒分离株中的其他抗原肽或蛋白，例如应用于以下分离株(包括但不限于)：EPI_ISL_404227、EPI_ISL_403963、EPI_ISL_403962、EPI_ISL_403931、EPI_ISL_403930、EPI_ISL_403929、EPI_ISL_402130、EPI_ISL_402129、EPI_ISL_402128、EPI_ISL_402126、EPI_ISL_402125、EPI_ISL_402124、EPI_ISL_402123、EPI_ISL_402120、EPI_ISL_402119(其他SARS-CoV-2分离株提供于清单A及/或清单B及或表25中)。
使用SEQ ID NO:1作为参考蛋白进行蛋白标注。SARS-CoV-2冠状病毒参考蛋白的全长棘蛋白(S)具有1273个氨基酸残基，且包含以下元件：
-分泌信号肽：氨基酸位置aa 1至aa 15(参见SEQ ID NO:28)
-棘蛋白片段S1：氨基酸位置aa 1至aa 681(参见SEQ ID NO:27)
-受体结合域(RBD)：氨基酸位置aa 319至aa 541(参见SEQ ID NO:13243)
-关键中和域(CND)：氨基酸位置aa 329至aa 529(参见SEQ ID NO:13310)
-棘蛋白片段S2：氨基酸位置aa 682至aa 1273(参见SEQ ID NO:30)
-跨膜域(TM)氨基酸位置aa 1212至aa 1273(参见SEQ ID NO:49)
-跨膜域(TMflex)氨基酸位置aa 1148至aa 1273(参见SEQ ID NO:13176)
必须注意，衍生自不同SARS-CoV-2分离株(例示性SARS-CoV-2分离株提供于清单A及清单B中)的棘蛋白之间天然存在氨基酸水准变化。在本发明的情形下，所述氨基酸变化可以应用于衍生自如本文所描述的棘蛋白的各抗原肽或蛋白。
因此，本文所提供且在本发明的情形下涵盖为适合抗原的各棘蛋白可具有一或多种以下氨基酸变化(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)：
·D614G或G614D
·H49Y或Y49H
·V367F或F367V
·P1263L或L1263P
·V483A或A483V
·S939F或F939S
·S943P或P943S
·L5F或F5L
·L8V或V8L
·S940F或F940S
·C1254F或F1254C
·Q239K或K239Q
·M153T或T153M
·V1040F或F1040V
·A845S或S845A
·Y145H或H145Y
·A831V或V831A
·M1229I或I1229M
·H69或H69del/aa缺失
·V70或H70del/aa缺失
·H69_V70或H69del及H70del/aa缺失
·A222V或V222A
·Y453F或F453Y
·S477N或N477S
·I692V或V692I
·R403K或K403R
·K417N或N417K
·N437S或S437N
·N439K或K439N
·V445A或A445V
·V445I或I445V
·V445F或F445V
·G446V或V446G
·G446S或S446G
·G446A或A446G
·L455F或F455L
·F456L或L456F
·K458N或N458K
·A475V或V475A
·G476S或S476G
·G476A或A476G
·S477I或I477S
·S477R或R477S
·S477G或G477S
·S477T或T477S
·T478I或I478T
·T478K或K478T
·T478R或R478T
·T478A或A478T
·E484Q或Q484E
·E484K或K484E
·E484A或A484E
·E484D或D484E
·G485R或R485G
·G485S或S485G
·F486L或L486F
·N487I或I487N
·Y489H或H489Y
·F490S或S490F
·F490L或L490F
·Q493L或L493Q
·Q493K或K493Q
·S494P或P494S
·S494L或L494S
·P499L或L499P
·T500I或I500T
·N501Y或Y501N
·N501T或T501N
·N501S或S501N
·V503F或F503V
·V503I或I503V
·G504D或D504G
·Y505W或W505Y
·Q506K或K506Q
·Q506H或H506Q
·Y144或Y144del/aa缺失
·A570D或D570A
·P681H或H681P
·T716I或I716T
·S982A或A982S
·D1118H或H1118D
·L18F或F18L
·D80A或A80D
·D215G或G215D
·L242或L242del/aa缺失
·A243或A243del/aa缺失
·L244或L244del/aa缺失
·L242_A243_L244或L242del及A243del及L244del/aa缺失
·R246I或I246R
·A701V或V701A
·T20N或N20T
·P26S或S26P
·D138Y或Y138D
·R190S或S190R
·H655Y或Y655H
·T1027I或I1027T
·S13I或I13S
·W152C或C152W
·L452R或R452L
·R346T或T346R
·P384L或L384P
·L452M或M452L
·F456A或A456F
·F456K或K456F
·F456V或V456F
·E484P或P484E
·K417T或T417K
·G447V或V447G
·L452Q或Q452L
·A475S或S475A
·F486I或I486F
·F490Y或Y490F
·Q493R或R493Q
·S494A或A494S
·P499H或H499P
·P499S或S499P
·G502V或V502G
·T748K或K748T
·A522S或S522A
·V1176F或F1176V
下列氨基酸变化(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)尤其较佳：
·H69del、V70del、Y144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H
·L18F、D80A、D215G、L242del、A243del、L244del、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V
·K417N、E484K、N501Y及D614G
·E484K及D614G
·L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I
·S13I、W152C、L452R及D614G
·delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I
·E484K、E484P或E484Q
·G446V
·G485R
在一些具体实例中，棘蛋白(S)的片段可由本发明的核酸编码，其中该片段可为N末端截断的，缺乏全长SARS-CoV-2冠状病毒参考蛋白(SEQ ID NO:1)的N末端氨基酸1至至多100，及/或其中该片段可为C末端截断的，缺乏全长SARS-CoV-2冠状病毒参考蛋白(SEQID NO:1)的C末端氨基酸(aa)531至至多aa 1273。该「棘蛋白(S)的片段」可另外包含氨基酸取代(如下文所描述)且可另外包含至少一种异源肽或蛋白元件(如下文所描述)。在较佳具体实例中，棘蛋白(S)的片段可经C末端截断，从而缺乏C末端跨膜域(亦即，缺乏aa 1212至aa 1273或缺乏aa 1148至aa 1273)。
在其他具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白(S)组成，其中衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的棘蛋白(S)缺乏跨膜域(TM)(氨基酸位置aa 1212至aa1273)。在具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白(S)组成，其中衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的棘蛋白(S)缺乏跨膜域(TMflex)的延伸部分(氨基酸位置aa 1148至aa 1273)。不希望受理论束缚，如本文所定义的缺乏跨膜域(TM或TMflex)的棘蛋白(S)可适用于冠状病毒疫苗，因而蛋白将可溶且不锚定于细胞膜中。可溶蛋白可因此在投予个体后以较高浓度产生(亦即转译)，产生改良的免疫反应。
不希望受理论束缚，RBD(aa 319至aa 541)及CND(aa 29至aa 529)域对于免疫原性可为关键的。两个区域均位于棘蛋白的S1片段处。因此，在本发明的情形下，可能适合的是抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白的S1片段或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。适当地，该S1片段可包含至少如上文所定义的RBD及/或CND域。
在较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由受体结合域(RBD；aa 319至aa 541)组成，其中RBD包含或由棘蛋白片段或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
在另外较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由截断受体结合域(truncRBD；aa 334至aa 528)组成，其中RBD包含或由棘蛋白片段或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
该「棘蛋白(S)的片段」(RBD；aa 319至aa 541或truncRBD，aa 334至aa528)可另外包含氨基酸取代(如下文所描述)且可另外包含至少一种异源肽或蛋白元件(如下文所描述)。
在尤其较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白(S)组成，其中棘蛋白(S)包含或由棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
因此，在较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白(包含或由棘蛋白片段S1组成)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27、29、31-48、58-111、274-1345、1480-1546、1614-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的1至6、9、11-41列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含棘蛋白片段S1，且缺乏至少70％、80％、90％，较佳100％的棘蛋白片段S2(aa 682至aa 1273)。所述具体实例可为有益的，因为S1片段包含中和表位，而无包含S1及S2的全长蛋白的潜在问题。
因此，在较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白(基本上由棘蛋白片段S1组成)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27、1279-1345、29、1480-1546、13243-13309、22733-22736、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的6及9列)，且在相应序列SEQID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
不希望受理论束缚，可能适合的是抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白片段S1及棘蛋白片段S2(至少片段)组成，因为可促进形成免疫原性棘蛋白。
因此，在尤其较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由棘蛋白(S)组成，其中棘蛋白(S)包含或由棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体及棘蛋白片段S2或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
在较佳具体实例中，包含或由棘蛋白片段S1及棘蛋白片段S2组成的至少一种所编码的抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1-26、31-48、58-111、274-1278、1614-11663、13377-13510、13521-14177、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的1至5、11-35、38列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，所编码的至少一种抗原肽或蛋白包含或由全长棘蛋白或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
术语「全长棘蛋白」必须理解为棘蛋白，其较佳衍生自SARS-CoV-2冠状病毒，其具有与基本上全部棘蛋白对应的氨基酸序列。因此，「全长棘蛋白」可包含aa 1至aa 1273(参考蛋白：SEQ ID NO:1)。因此，全长棘蛋白可典型地包含分泌信号肽、棘蛋白片段S1、棘蛋白片段S2、受体结合域(RBD)及关键中和域CND，及跨膜域。特别地，术语「全长棘蛋白」亦涵盖包含某些氨基酸取代(例如用于允许S蛋白的融合前稳定化)或天然发生的氨基酸缺失的变异体。
因此，在较佳具体实例中，至少一种所编码的抗原肽或蛋白为全长S蛋白，其包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，此等序列与SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的1列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸提供的棘蛋白(S)经设计或调适以使呈融合前构形的抗原稳定。融合前构形在高效冠状病毒疫苗的情形下尤其有利，因为在该融合前蛋白构形中可仅获得中和抗体的若干潜在表位。此外，其余呈融合前构形的蛋白旨在避免免疫病理学作用，例如增强的疾病及/或抗体依赖性增强(ADE)。
在较佳具体实例中，向个体投予编码融合前稳定化棘蛋白的核酸(或组成物或疫苗)引发棘蛋白中和抗体且不引发疾病-增强抗体。特定言之，向个体投予编码融合前稳定化棘蛋白的核酸(或组成物或疫苗)不会诱导免疫病理学作用，例如增强的疾病及/或抗体依赖性增强(ADE)。
因此，在较佳具体实例中，本发明的核酸包含至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白的编码序列，该至少一种抗原肽或蛋白为或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒，其中至少一种抗原肽或蛋白为或衍生自棘蛋白(S)，其中棘蛋白(S)为融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。适合地，该融合前稳定化棘蛋白包含至少一个融合前稳定性突变。
如本文所使用的术语「融合前构形」是指冠状病毒S蛋白的胞外域在分泌系统中加工成成熟冠状病毒S蛋白，且在导致冠状病毒S转变为融合后构形的融合事件触发之前采用的结构构形。
相比于天然冠状病毒S序列，如本文所描述的「融合前稳定化棘蛋白(S_stab)」包含一或多个氨基酸取代、缺失或插入，相比于由对应天然冠状病毒S序列形成的冠状病毒S胞外域三聚体，所述氨基酸取代、缺失或插入提供融合前构形的增加的保持。融合前构形借由一或多个氨基酸取代、缺失或插入的「稳定」可以为例如高能稳定(例如相对于融合后开放构形降低融合前构形的能量)及/或动力学稳定(例如降低自融合前构形转变为融合后构形的速率)。此外，相比于对应天然冠状病毒S序列，呈融合前构形的冠状病毒S胞外域三聚体的稳定可以包括对变性的抗性的增加。
因此，在较佳具体实例中，棘蛋白包括使呈融合前构形的S蛋白稳定的一或多个氨基酸取代，例如使呈融合前构形的S蛋白(包括N末端区)的膜远端部分稳定的取代。
SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白的稳定可借由用使呈融合前构形的棘蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)稳定的氨基酸取代位置K986及/或V987处的至少一个氨基酸获得。
在尤其较佳具体实例中，融合前稳定性突变包含位置K986处的氨基酸取代，其中氨基酸K986经选自A、I、L、M、F、V、G或P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的一个取代，较佳其中氨基酸K986经P取代。在其他较佳具体实例中，融合前稳定性突变包含位置K986处的氨基酸取代，其中氨基酸V987经选自A、I、L、M、F、V、G或P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的一个取代，较佳其中氨基酸V987经P取代。
适当地，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白的稳定可借由用使呈融合前构形的棘蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)稳定的氨基酸取代位置K986及V987处的两个连续氨基酸获得。
在较佳具体实例中，融合前稳定性突变包含位置K986及V987的氨基酸取代，其中氨基酸K986及/或V987经选自A、I、L、M、F、V、G或P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的一个取代。
较佳地，融合前构形的稳定是借由在棘蛋白中残基K986及V987(根据参考SEQ IDNO:1的氨基酸位置)处引入两个连续脯氨酸取代来获得。
因此，在较佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含至少一个融合前稳定性突变，其中至少一个融合前稳定性突变包含以下氨基酸取代：K986P及V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
因此，上文所提供的任何NCBI蛋白寄存编号或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946或其片段或变异体的任何蛋白可以由熟习此项技术者选择以引入此类氨基酸变化，较佳氨基酸取代：K986P及V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在较佳具体实例中，至少一个融合前稳定性突变包含使融合前状态进一步稳定的空腔填充突变，其中该突变/氨基酸取代是选自包含以下的清单：T887WN；A1020W；T887WN及A1020W；或P1069F(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
术语「空腔填充突变」或「空腔填充氨基酸取代」是指填充蛋白(诸如冠状病毒S蛋白胞外域)的蛋白核心内的空腔的氨基酸取代。空腔基本上为折叠蛋白内的空隙，其中不存在氨基酸或氨基酸侧链。在若干具体实例中，引入空腔填充氨基酸取代以填充存在于冠状病毒S胞外域核心的融合前构形中的空腔，该冠状病毒S胞外域核心在转变为融合后构形之后塌缩(例如，具有降低的体积)。
在一些具体实例中，以下氨基酸取代F817P、A892P、A899P及A942P中的至少一者可与(K986P及V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合。
在较佳具体实例中，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一者：
·F817P；K986P及V987P
·A892P；K986P及V987P
·A899P；K986P及V987P
·A942P；K986P及V987P
在较佳具体实例中，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)：
·F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及V987P(S_stab_PP_hex)
因此，以上所提供的任何NCBI蛋白寄存编号或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946或其片段或变异体的任何蛋白可以由熟习此项技术者选择以引入此类氨基酸变化，适当地为选自F817P、A892P、A899P、A942P的氨基酸取代；或选自(F817P；K986P及V987P)；(A892P；K986P及V987P)；(A899P；K986P及V987P)；(A942P；K986P及V987P)；(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及V987P)(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的氨基酸取代。
在尤其较佳具体实例中，以下氨基酸取代中的至少一者：T887W；A1020W；T887W及A1020W；或P1069F可与(K986P及V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合。
在其他较佳具体实例中，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一者：
·T887W；K986P及V987P
·A1020W；K986P及V987P
·T887W及A1020W；K986P及V987P
·P1069F；K986P及V987P
因此，以上所提供的任何NCBI蛋白寄存编号或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946或其片段或变异体的任何蛋白可以由熟习此项技术者选择以引入此类氨基酸变化，适当地为选自T887W；A1020W；T887W及A1020W的氨基酸取代；或P1069F；或选自(T887W；K986P及V987P)；(A1020W；K986P及V987P)；(T887W及A1020W；K986P及V987P)；(P1069F；K986P及V987P)(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的氨基酸取代。
在较佳具体实例中，至少一个融合前稳定性突变包含使融合前状态进一步稳定的突变质子化位点，其中该突变/氨基酸取代是选自H1048Q及H1064N；H1083N及H1101N；或H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在一些具体实例中，以下氨基酸取代H1048Q及H1064N；H1083N及H1101N；或H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N中的至少一者可与(K986P及V987P)取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)组合。
在尤其较佳具体实例中，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一者：
·H1048Q及H1064N；K986P及V987P
·H1083N及H1101N；K986P及V987P
·H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N；K986P及V987P
因此，以上所提供的任何NCBI蛋白寄存编号或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946或其片段或变异体的任何蛋白可以由熟习此项技术者选择以引入此类氨基酸变化，适当地为选自H1048Q及H1064N；H1083N及H1101N；或H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N的氨基酸取代；或选自(H1048Q及H1064N；K986P及V987P)；(H1083N及H1101N；K986P及V987P)；(H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N；K986P及V987P)的氨基酸取代；(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在较佳具体实例中，至少一个融合前稳定性突变包含人工分子内双硫键。可以引入此类人工分子内双硫键以进一步稳定呈融合前构形的S蛋白(包括N末端区)的膜远端部分；亦即，在专一性结合至一或多种融合前专一性抗体的构形中，及/或呈现存在于融合前构形上但不存在于S蛋白的融合后构形中的适合抗原位点。
在较佳具体实例中，至少一个融合前稳定性突变产生人工分子内双硫键，其中至少一个人工分子内双硫键是借由选自包含I712C、I714C、P715C、T874C、G889C、A890C、I909C、N914C、Q965C、F970C、A972C、R995C、G999C、S1003C、L1034C、V1040C、Y1047C、S1055C、P1069C、T1077C或Y1110C、S1123C(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的清单的以下氨基酸取代中的至少两者产生。
在较佳具体实例中，至少一个融合前稳定性突变产生人工分子内双硫键，其中至少一个人工分子内双硫键是借由以下氨基酸取代中的至少一者产生：I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C，或N914C及S1123C(根据参考SEQ IDNO:1的氨基酸位置)。
在其他具体实例中，至少一个融合前稳定性突变包含2、3、4、5、6、7或8个不同人工分子内双硫键，其中各自可选自以下氨基酸取代：I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C，或N914C及S1123C(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在另外具体实例中，以下氨基酸取代中的至少一个，较佳2、3、4、5个或更多个：I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C，或N914C及S1123C可与(K986P及V987P)取代组合。举例而言，融合前稳定化的S蛋白可包含两个不同人工分子内双硫键，例如I712C及T1077C；P715C及P1069C；且额外包含K986P及V987P取代等(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
在较佳具体实例中，SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白包含以下氨基酸取代(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)中的至少一者：
·I712C及T1077C；K986P及V987P
·I714C及Y1110C；K986P及V987P
·P715C及P1069C；K986P及V987P
·G889C及L1034C；K986P及V987P
·I909C及Y1047C；K986P及V987P
·Q965C及S1003C；K986P及V987P
·F970C及G999C；K986P及V987P
·A972C及R995C；K986P及V987P
·A890C及V1040C；K986P及V987P
·T874C及S1055C；K986P及V987P
·N914C及S1123C；K986P及V987P
因此，以上所提供的任何NCBI蛋白寄存编号或选自SEQ ID NO:1-9、274-340、22737、22739、22741、22743、22745、22747、22749、22751、22753、22755、22757、22929-22946或其片段或变异体的任何蛋白可以由熟习此项技术者选择以引入此类氨基酸变化，适当地为选自I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C，或N914C及S1123C的氨基酸取代；或选自(I712C；T1077C；K986P；V987P)或(I714C；Y1110C；K986P；V987P)或(P715C；P1069C；K986P；V987P)或(G889C；L1034C；K986P；V987P)或(I909C；Y1047C；K986P；V987P)或(Q965C；S1003C；K986P；V987P)或(F970C；G999C；K986P；V987P)或(A972C；R995C；K986P；V987P)或(A890C及V1040C；K986P及V987P)或(T874C及S1055C；K986P及V987P)或(N914C及S1123C；K986P及V987P)(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)的氨基酸取代。
必须强调，在本发明的情形下，任何SARS-CoV-2冠状病毒棘蛋白可如上文所描述突变(针对参考蛋白SEQ ID NO:1举例说明)以使呈融合前构形的棘蛋白稳定。
因此，在较佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、40-48、85-111、341-1278、1681-2618、2686-3623、3691-4628、4696-5633、5701-6638、6706-7643、7711-8648、8716-9653、9721-10658、10726-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的2至5、12-15、17-20、22-25、27-30、32-35、38列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见栏A及B的列2及5)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在更佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-18、341-407、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的2列)，且在相应序列SEQID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在另一更佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22960、22961、22963中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在甚至更佳具体实例中，融合前稳定化棘蛋白(S_stab)包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10或341中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
根据各种较佳具体实例，本发明的核酸编码至少一种来自如本文所定义的SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白，及另外至少一种异源肽或蛋白元件。
适当地，至少一种异源肽或蛋白元件可促进或改良本发明的编码抗原肽或蛋白的分泌(例如经由分泌讯息序列)，促进或改良本发明的编码抗原肽或蛋白在质膜中的锚定(例如经由跨膜元件)，促进或改良抗原复合物的形成(例如经由多聚合域或抗原簇聚元件)，或促进或改良病毒样粒子形成(VLP形成序列)。此外，第一态样的核酸可另外编码肽连接子元件、自裂解肽、免疫佐剂序列或树突状细胞靶向序列。
适合的多聚合域可选自根据WO2017/081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的跨膜元件可选自根据WO2017/081082的SEQID NO:1228-1343的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的VLP形成序列可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的肽连接子可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ IDNO:1509-1565的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的自裂解肽可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1434-1508的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的免疫佐剂序列可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ IDNO:1360-1421的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的树突状细胞(DC)靶向序列可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1344-1359的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。适合的分泌信号肽可选自根据公布的PCT专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1-1115及SEQ ID NO:1728的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。
在较佳具体实例中，至少一种编码序列另外编码选自以下者的一或多种异源肽或蛋白元件：信号肽、连接肽、辅助表位(helper epitope)、抗原簇聚元件(antigenclustering element)、三聚或多聚合元件、跨膜元件或VLP形成序列。
在较佳具体实例中，本发明的核酸编码至少一种衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原蛋白，额外编码至少一种异源三聚元件、抗原簇聚元件或VLP形成序列。
抗原簇聚元件或多聚合元件
在较佳具体实例中，抗原簇聚元件可选自铁蛋白元件或二氧四氢喋啶(lumazine)合酶元件、B型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或囊封素(encapsulin)。较佳呈其融合前构形表现稳定成簇的棘蛋白可增加针对SARS-CoV-2之中和活性的量值及宽度。
二氧四氢喋啶合酶(二氧四氢喋啶,LS,LumSynth)为具有粒子形成特性的酶，其存在于广泛多种生物体中且参与核黄素生物合成。
在尤其较佳具体实例中，使用二氧四氢喋啶合酶促进抗原成簇且可因此促进或增强本发明的经编码的冠状病毒抗原的免疫反应。
在尤其较佳具体实例中，抗原簇聚元件(多聚合元件)为或衍生自二氧四氢喋啶合酶，其中该抗原成簇域的氨基酸序列较佳与氨基酸序列SEQ ID NO:112中的任一者或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
铁蛋白是主要功能为胞内铁储存的蛋白。几乎所有活有机体都产生铁蛋白，其由24个次单位组成，各自由四个α-螺旋束组成，其自组装成具有八面体对称性的四级结构。其自组装成纳米粒子的特性非常适合载运及曝露抗原。
在尤其较佳具体实例中，铁蛋白用于促进抗原成簇且可因此促进所编码的冠状病毒抗原，较佳棘蛋白的免疫反应。
在尤其较佳具体实例中，抗原簇聚元件(多聚合元件)为或衍生自铁蛋白，其中该抗原成簇域的氨基酸序列较佳与氨基酸序列SEQ ID NO:113中的任一者或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在一些具体实例中，抗原成簇域为B型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成球形粒子。添加B型肝炎病毒(HBsAg)序列的表面抗原片段可尤其有效地增强针对冠状病毒的基于核酸的疫苗的免疫反应。
在尤其较佳具体实例中，HBsAg用于促进抗原成簇且因此可促进所编码的冠状病毒抗原，较佳如本文所定义的棘蛋白的免疫反应。
在一些具体实例中，抗原成簇元件为囊封元件。添加囊封序列可在增强针对冠状病毒的基于核酸的疫苗的免疫反应方面尤其有效。在尤其较佳具体实例中，囊封用于促进抗原成簇且因此可促进所编码的冠状病毒抗原，较佳如本文所定义的棘蛋白的免疫反应。
囊封为自嗜热海栖热孢菌(thermophile Thermotoga maritima)分离的蛋白且可用作允许抗原自组装以形成抗原(纳米)粒子的元件。囊封由60份相同的31kDa单体组装，所述单体具有内部及外部直径分别为20及24nm的薄及二十面体T＝1对称笼结构。
在核酸的编码序列另外编码异源抗原成簇元件的一些具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含抗原成簇元件及衍生自SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白的融合蛋白。适合地，该抗原肽或蛋白，较佳棘蛋白，缺乏C末端跨膜域(TM)(缺乏aa 1212至aa 1273)或缺乏C末端跨膜域(TMflex)的一部分，例如缺乏aa 1148至aa 1273。
因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以移除位置aa 1212至aa 1273处的内源跨膜域(TM)，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。此外，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以移除位置aa 1148至aa 1273处的内源跨膜域(TMflex)，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。缺乏C末端跨膜域(TM或TMflex)的适合的棘蛋白可选自SEQ ID NO:31-39、1614-3623、13377-13510。
在核酸的编码序列另外编码如上文所定义的异源抗原成簇元件的其他具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含抗原成簇元件及衍生自SARS-CoV-2棘蛋白片段S1(缺乏S2及/或TM及/或TMflex)的抗原肽或蛋白的融合蛋白。此外，其可适合使用连接子元件自抗原肽或蛋白分离异源抗原成簇元件(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接子)。
在较佳具体实例中，至少一种包含异源抗原成簇元件的抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:58-75、85-102、3624-5633、7644-9653、13588-13721、13856-13989、22733、22735、22736中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的16及25列)，且在相应序列SEQ IDNO的ST25序列表的<223>识别号下。
其他适合的多聚合元件可选自根据WO2017/081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。WO2017/081082的SEQ ID NO:1116-1167以引用的方式并入本文中。
三聚元件
在较佳具体实例中，三聚元件可选自折叠子(Foldon)元件。在较佳具体实例中，折叠子元件为纤维蛋白折叠子元件。表现稳定三聚棘蛋白，较佳呈其融合前构形，可增加针对SARS-CoV-2的中和活性的量值及宽度。
在尤其较佳具体实例中，纤维蛋白折叠子元件用于促进抗原三聚且可因此促进所编码的冠状病毒抗原，较佳棘蛋白的免疫反应。较佳地，折叠子元件为或衍生自噬菌体，较佳衍生自噬菌体T4，最佳衍生自噬菌体T4的纤维蛋白。
在尤其较佳具体实例中，三聚元件为或衍生自折叠子，其中该三聚元件的氨基酸序列较佳与氨基酸序列SEQ ID NO:114中的任一者、此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在核酸的编码序列额外编码异源三聚元件的其他具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含三聚元件及衍生自SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白的融合蛋白。适合地，该抗原肽或蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2的棘蛋白，该SARS-CoV-2缺乏C末端跨膜域(TM)(缺乏aa 1212至aa 1273)或缺乏C末端跨膜域(TMflex)的一部分，例如缺乏aa 1148至aa 1273。
因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22947-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以在位置aa 1212至aa 1273处缺乏内源跨膜元件，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白。此外，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22947-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以移除位置aa 1148至aa 1273处的内源跨膜域(TMflex)，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。缺乏C末端跨膜域(TM或TMflex)的适合的棘蛋白可选自SEQ ID NO:31-39、1614-3623、13377-13510。
在核酸的编码序列额外编码如上文所定义的异源三聚元件的其他具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含三聚元件及衍生自SARS-CoV-2棘蛋白片段S1(缺乏S2及/或TM及/或TMflex)的抗原肽或蛋白的融合蛋白。此外，其可适合使用连接子元件自抗原肽或蛋白分离异源抗原成簇元件(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接子)。
在较佳具体实例中，至少一种包含异源三聚元件的抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:76-84、103-111、5634-6638、9654-10658、13722-13788、13990-14056、22734中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的26、30及41列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
其他适合的三聚元件可选自根据WO2017/081082的SEQ ID NO:1116-1167的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。WO2017/081082的SEQ ID NO:1116-1167以引用的方式并入本文中。
VLP形成元件
在较佳具体实例中，VLP形成序列可经选择且融合至如本文所定义的冠状病毒抗原。表现呈VLP形式的稳定成簇的棘蛋白可增加针对SARS-CoV-2的中和活性的量值及宽度。VLP在结构上模拟感染性病毒且其可以诱导强效细胞及体液免疫反应。
适合的VLP形成序列可选自衍生自B型肝炎病毒核心抗原、HIV-1Gag蛋白或土拔鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)的元件。
在尤其较佳具体实例中，至少一个VLP形成序列为土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。WhcAg元件用于促进VLP形成且可因此促进所编码的冠状病毒抗原，较佳棘蛋白的免疫反应。
在尤其较佳具体实例中，VLP形成序列为或衍生自折叠子，其中所述VLP形成序列的氨基酸序列较佳与氨基酸序列SEQ ID NO:13171中的任一者、此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在核酸的编码序列额外编码异源VLP形成序列的其他具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含VLP形成序列及衍生自SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白的融合蛋白。适合地，该抗原肽或蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2的棘蛋白，该SARS-CoV-2缺乏C末端跨膜域(TM)(缺乏aa 1212至aa 1273)或缺乏C末端跨膜域(TMflex)的一部分，例如缺乏aa 1148至aa 1273。
因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以在位置aa 1212至aa 1273处缺乏内源跨膜元件，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白。此外，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以移除位置aa 1148至aa 1273处的内源跨膜域(TMflex)，且因此在本发明的情形下可用作「C末端截断的」蛋白(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。缺乏C末端跨膜域(TM或TMflex)的适合的棘蛋白可选自SEQ ID NO:31-39、1614-3623、13377-13510。
在核酸的编码序列额外编码如上文所定义的异源VLP形成序列的其他具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含VLP形成序列及衍生自SARS-CoV-2棘蛋白片段S1(缺乏S2及/或TM及/或TMflex)的抗原肽或蛋白的融合蛋白。此外，其可适合使用连接子元件自抗原肽或蛋白分离异源抗原成簇元件(例如根据SEQ ID NO:115、13148、13152的连接子)。
在较佳具体实例中，至少一种包含异源VLP形成序列的抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6639-7643、10659-11663、13789-13855、14057-14123中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1中(参见A及B栏的31及35列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在彼情形下的其他适合的VLP形成序列可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1168-1227的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。WO2017/081082的SEQ ID NO:1168-1227以引用的方式并入本文中。
异源分泌信号肽
在一些具体实例中，抗原肽或蛋白包含异源信号肽。异源信号肽可用于改良所编码的冠状病毒抗原的分泌。
适合的分泌信号肽可选自根据公布的PCT专利申请案WO2017/081082的SEQ IDNO:1-1115及SEQ ID NO:1728的氨基酸序列，或此等序列的片段或变异体的清单。WO2017/081082的1-1115及SEQ ID NO:1728特此以引用的方式并入。在核酸的编码序列额外编码异源分泌信号肽的具体实例中，尤其较佳且适合于产生包含异源分泌信号肽及衍生自SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白的融合蛋白。适合地，该抗原肽或蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2的棘蛋白缺乏N末端内源分泌信号肽(缺乏aa 1至aa 15)。因此，与SEQ ID NO:1-26、274-1278、13521-13587、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者一致或至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的任何氨基酸序列可以经修饰以在位置aa 1至aa 15处缺乏内源分泌信号肽，且因此在本发明的情形下可用作「N末端截断的」蛋白。
在以下清单1中，进一步详细地说明如上文所定义的适合的SARS-CoV-2冠状病毒抗原肽及蛋白(例如命名法、蛋白元件等)。
清单1：本发明的例示性适合蛋白设计：
·包含aa 1至aa 1273的全长棘蛋白(S)；
ο参见例如SEQ ID NO:1、274。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代(S_stab_PP)的稳定的S蛋白；
ο参见例如SEQ ID NO:10、341。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代(S_stab_PP)的稳定的S蛋白；
ο参见例如SEQ ID NO:22961。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代(S_stab_PP)的稳定的S蛋白；
ο参见例如SEQ ID NO:22960。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、A942P脯氨酸取代的稳定的S蛋白；S_stab_PP_hex
ο参见例如SEQ ID NO:22732。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代及空腔填充突变(T887W、A1020W)的稳定的S蛋白；S_stab_PP_cav
ο参见例如SEQ ID NO:408。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代及空腔填充突变(P1069F)的稳定的S蛋白；S_stab_PP_cav
ο参见例如SEQ ID NO:475。
·包含aa1-aa1273及K986P、V987P取代及空腔填充突变(H1048Q、H1064N、H1083N、H1101N)的稳定的S蛋白；S_stab_PP_prot
ο参见例如SEQ ID NO:542。
·包含aa1-aa1273及人工双硫键(S_stab_disul)I712C、T1077C的稳定的S蛋白；
ο参见例如SEQ ID NO:19、609。
·无包含aal-aa1211的跨膜域的S(S_woTM)；
ο参见例如SEQ ID NO:31、1614。
·无包含aa1-aa1147的跨膜域flex的S(S_woTMflex)；
ο参见例如SEQ ID NO:2619。
·包含K986P、V987P取代的S_woTM(S_stab_PP_woTM)
ο参见例如SEQ ID NO:40、1681。
·包含K986P、V987P取代的S_woTMflex(S_stab_PP_woTMflex)
ο参见例如SEQ ID NO:2686。
·包含aa 1至aa 681的棘蛋白片段S1(S1)；
ο参见例如SEQ ID NO:27、1279。
·包含二氧四氢喋啶合酶的S_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:58、3624。
·包含二氧四氢喋啶合酶的S_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:7644。
·包含二氧四氢喋啶合酶的S_stab_PP_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:85、3691。
·包含二氧四氢喋啶合酶的S_stab_PP_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:7711。
·包含铁蛋白元件的S_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:67、4629。
·包含铁蛋白元件的S_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:8649。
·包含铁蛋白元件的S_stab_PP_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:94、4696。
·包含铁蛋白元件的S_stab_PP_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:8716。
·包含折叠子元件的S_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:76、5634。
·包含折叠子元件的S_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:9654。
·包含折叠子元件的S_stab_PP_woTM；
ο参见例如SEQ ID NO:103、5701。
·包含折叠子元件的S_stab_PP_woTMflex；
ο参见例如SEQ ID NO:9721。
·包含VLP序列的S_woTM(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:6639。
·包含VLP序列的S_woTMflex(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO 10659。
·包含VLP序列的S_stab_PP_woTM(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:6706。
·包含VLP序列的S_stab_PP_woTMflex(WhcAg)；
ο参见例如SEQ ID NO:10726。
·包含折叠子元件的truncRBD：
ο参见例如SEQ ID NO:22734。
·包含二氧四氢喋啶合酶的truncRBD(C末端)
ο参见例如SEQ ID NO:22735。
·包含二氧四氢喋啶合酶的truncRBD(N末端)
ο参见例如SEQ ID NO:22736
·包含铁蛋白元件的truncRBD：
ο参见例如SEQ ID NO:22733。
清单1中所提供的氨基酸位置是根据参考SEQ ID NO:1。
在第一态样的尤其较佳具体实例中，至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10、21、22、25、27、274、341、408、475、542、743、810、1011、1145、1212、1279、8716、10726、22732-22758、22929-22942、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
衍生自如上文所定义的SARS-CoV-2冠状病毒的较佳抗原肽或蛋白提供于表1中(1至41列)。其中，各1至41列对应于适合的SARS-CoV-2冠状病毒构筑体。表1的A栏提供适合的抗原构筑体的简短描述。表1的B栏提供相应抗原构筑体的蛋白(氨基酸)SEQ ID NO。表1的C栏提供对应野生型核酸编码序列的SEQ ID NO。表1的D栏提供对应G/C最佳化核酸编码序列(opt1,gc)的SEQ ID NO。表1的E栏提供对应人类密码子使用调适核酸编码序列(opt 3,人类)的SEQ ID NO。表1的F栏提供对应G/C含量修饰的核酸编码序列的SEQ ID NO(opt10,gcmod)(关于「编码序列」的详细描述，参见段落「适合的编码序列」)。
特别地，本发明的描述明确地包括在本申请案的ST25序列表的<223>识别号下所提供的资讯。包含表1的编码序列的较佳核酸构筑体，例如包含表1的编码序列的mRNA序列提供于表3a及表3b中。
表1：较佳冠状病毒构筑体(氨基酸序列及核酸编码序列)：
Figure GDA0003858923850000581
Figure GDA0003858923850000591
Figure GDA0003858923850000601
Figure GDA0003858923850000611
适合的编码序列：
根据较佳具体实例，本发明的核酸包含至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白的编码序列，该至少一种抗原肽或蛋白衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，较佳如上文所定义，或其片段及变异体。在彼情形下，编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白或其片段及变异体的任何编码序列均可理解为适合的编码序列且可因此包含于本发明的核酸中。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸可包含或由至少一个编码至少一种来自如本文所定义的SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白的编码序列组成，较佳编码SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或其片段或变异体。应理解，在核酸层面上，与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码氨基酸序列的任何序列(DNA或RNA序列)可经选择且可因此理解为本发明的适合的编码序列。关于所述氨基酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见A及B栏的1至41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸包含编码序列，该编码序列包含至少一种核酸序列，该至少一种核酸序列与根据SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的序列或此等序列中的任一者的片段或片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见C-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
或者，第一态样的核酸包含编码序列，该编码序列包含至少一种核酸序列，该至少一种核酸序列与根据SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中相应序列中的所有尿嘧啶(U)经胸苷(T)或此等序列中的任一者的片段或片段或变异体取代。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见C-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸包含编码序列，该编码序列包含至少一种核酸序列，该至少一种核酸序列与根据SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184的序列或此等序列中的任一者的片段或片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见C-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
或者，第一态样的核酸包含编码序列，该编码序列包含至少一种核酸序列，该至少一种核酸序列与根据SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184的序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中相应序列中的所有尿嘧啶(U)经胸苷(T)或此等序列中的任一者的片段或片段或变异体取代。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见C-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸为人工核酸，例如人工DNA或人工RNA。
如本文所使用的术语「人工核酸」意欲指天然不存在的核酸。换言之，人工核酸可理解为非天然核酸分子。此类核酸分子可归因于其个别序列(例如G/C含量修饰的编码序列、UTR)及/或归因于其他修饰，例如核苷酸的结构修饰而为非天然的。典型地，人工核酸可借由基因工程改造设计及/或产生以对应于所需人工核苷酸序列。在此情形下，人工核酸为可能非天然存在的序列，亦即与野生型序列/天然存在的序列至少一个核苷酸不同的序列。术语「人工核酸」不限于意谓「一个单分子」，而应理解为包含基本上一致的核酸分子的集合。因此，其可关于多个基本上一致的核酸分子。如本文所使用的术语「人工核酸」可关于人工DNA或较佳关于人工RNA。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸，较佳DNA或RNA是经修饰及/或稳定的核酸，较佳经修饰及/或稳定的人工核酸。
根据较佳具体实例，本发明的核酸可因此提供为「稳定的人工核酸」或「稳定的编码核酸」，亦即核酸展示对展示改良的活体内降解的抗性的核酸及/或展示改良的活体内稳定性的核酸，及/或展示改良的活体内可转译性的核酸。在下文中，描述在此情形下适合于使核酸「稳定」的特定适合的修饰/调适。较佳地，本发明的核酸可提供为「稳定的RNA」、「稳定的编码RNA」、「稳定的DNA」或「稳定的编码DNA」。
此类稳定可借由提供如本文中所指定的「干燥核酸」(例如干燥DNA或RNA)及/或「经纯化的核酸」(例如经纯化的DNA或RNA)实现。或者或除此之外，此类稳定可以例如借由本发明的核酸的经修饰的磷酸酯主链实现。与本发明相关的主链修饰为核酸中所含有的核苷酸的主链的磷酸酯经化学修饰的修饰。就此而论较佳可使用的核苷酸含有例如硫代磷酸酯修饰的磷酸酯主链，较佳磷酸酯主链中所含有的磷酸酯氧中的至少一者经硫原子置换。稳定的核酸，较佳稳定的RNA可进一步包括例如：非离子磷酸酯类似物，诸如烷基及芳基膦酸酯，其中带电膦酸酯氧经烷基或芳基置换；或磷酸二酯及烷基磷酸三酯，其中带电氧残基以烷基化形式存在。此类主链修饰典型地包括(但不欲限于)来自由以下者组成的群的修饰：甲基磷酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯(例如胞苷-5'-O-(1-硫代磷酸酯))。
在下文中，描述能够使本发明的核酸「稳定」的适合的修饰。
在较佳具体实例中，核酸，例如RNA或DNA包含至少一个密码子经修饰的编码序列。
在较佳具体实例中，核酸的至少一种编码序列为密码子经修饰的编码序列，其中相比于借由对应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列，借由该至少一个密码子经修饰的编码序列编码的氨基酸序列较佳未经修饰。
术语「密码子经修饰的编码序列」是关于与对应野生型或参考编码序列相比在至少一个密码子(编码一个氨基酸的核苷酸的三重态)方面不同的编码序列。适当地，在本发明的情形下的密码子经修饰的编码序列可展示改良的活体内降解抗性及/或改良的活体内稳定性及/或改良的活体内可转译性。在最广泛意义上，密码子修饰利用基因密码的简并性，其中多个密码子可编码相同氨基酸且可互换使用(cf.表2)以使如上文所概述的活体内应用的编码序列最佳化/修饰。
术语「参考编码序列」是关于编码序列，其为待修饰及/或最佳化的原始序列。
在较佳具体实例中，核酸的至少一种编码序列为密码子经修饰的编码序列，其中该密码子经修饰的编码序列是选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用调适编码序列、G/C含量修饰的编码序列及G/C最佳化编码序列，或其任何组合。
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，包含密码子经修饰的编码序列的核酸具有在12至18小时或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时之间的稳定性且能够由哺乳动物宿主细胞(例如肌肉细胞)表现。
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，将包含密码子经修饰的编码序列的核酸转译成蛋白，其中蛋白的量至少相当于借由转染至哺乳动物宿主细胞中的天然存在或野生型或参考编码序列获得的蛋白的量，或多于该量较佳至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少100％，或至少200％或更多。
在较佳具体实例中，本发明的核酸可经修饰，其中相比于对应野生型或参考编码序列(在本文中称为「C最大化编码序列」)的C含量，至少一种编码序列的C含量可增加，较佳最大化。相比于由相应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列，由核酸的C最大化编码序列编码的氨基酸序列较佳未经修饰。C最大化核酸序列的产生可适当地使用根据WO2015/062738的修饰方法进行。在此背景下，WO2015/062738的揭示内容以引用的方式包括于此。
在较佳具体实例中，核酸可经修饰，其中相比于对应野生型或参考编码序列的G/C含量，至少一种编码序列的G/C含量可最佳化(在本文中称为「G/C含量最佳化编码序列」)。在彼情形下，「最佳化」是指其中G/C含量较佳地增加至基本上最高可能G/C含量的编码序列。相比于由相应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列，由核酸的G/C含量最佳化编码序列编码的氨基酸序列较佳未经修饰。G/C含量最佳化核酸序列(RNA或DNA)的产生可使用根据WO2002/098443的方法进行。在此情形下，WO2002/098443的揭示内容在本发明中包括于其完整范畴中。在整个说明书中，包括序列表的<223>识别号，G/C最佳化编码序列是由缩写「opt1」或「gc」指示。
在较佳具体实例中，核酸可经修饰，其中至少一种编码序列中的密码子可适于人类密码子使用(在本文中称为「人类密码子使用调适编码序列」)。编码相同氨基酸的密码子在人类中以不同频率出现。因此，核酸的编码序列较佳经修饰以使得编码相同氨基酸的密码子的频率对应于根据人类密码子使用的彼密码子的天然存在的频率。举例而言，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列较佳以密码子「GCC」以0.40的频率使用、密码子「GCT」以0.28的频率使用、密码子「GCA」以0.22的频率使用且密码子「GCG」以0.10的频率等使用的方式调适(参见表2)。因此，此类程序(如针对Ala所例示)应用于由核酸的编码序列编码的各氨基酸以获得适于人类密码子使用的序列。在整个说明书中，包括序列表的<223>识别号，人类密码子使用调适编码序列由缩写「opt3」或「人类」指示。
表2：具有指定用于各氨基酸的频率的人类密码子使用表
Figure GDA0003858923850000671
Figure GDA0003858923850000681
*：最常见的人类密码子
在具体实例中，本发明的核酸可经修饰，其中相比于对应野生型或参考编码序列(在本文中称为「G/C含量修饰的编码序列」)的G/C含量相比，至少一种编码序列的G/C含量可经修饰。在此情形下，术语「G/C最佳化」或「G/C含量修饰」是关于核酸，其相比于对应野生型或参考编码序列，包含经修饰，较佳数目增加的鸟苷及/或胞嘧啶核苷酸。此类数目增加可借由含有腺苷或胸苷核苷酸的密码子经含有鸟苷或胞嘧啶核苷酸的密码子取代来产生。有利地，G/C含量增加的核酸序列比A/U增加的序列更稳定或展示更好表现。相比于由相应野生型或参考序列编码的氨基酸序列，由核酸的G/C含量修饰的编码序列编码的氨基酸序列较佳未经修饰。较佳地，相比于对应野生型或参考核酸序列的编码序列的G/C含量，核酸的编码序列的G/C含量增加至少10％、20％、30％，较佳至少40％(本文中称为「opt 10」或「gc mod」)。
在具体实例中，核酸可经修饰，其中密码子适应指数(CAI)可增加或较佳在至少一种编码序列(本文中称为「CAI最大化编码序列」)中最大化。较佳的是，例如人类中相对稀有的野生型或参考核酸序列的所有密码子均交换为在例如人类中常见的相应密码子，其中常见密码子编码与相对稀有密码子相同的氨基酸。适当地，最常见密码子用于所编码蛋白的各氨基酸(参见表2，最常见人类密码子标记有星号)。适当地，核酸包含至少一种编码序列，其中至少一种编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最佳地，至少一种编码序列的密码子适应指数(CAI)为1(CAI＝1)。举例而言，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列可以一定方式调适以使得最常见的人类密码子「GCC」始终用于该氨基酸。因此，此类程序(如针对Ala所例示)可应用于由核酸的编码序列编码的各氨基酸以获得CAI最大化编码序列。
在尤其较佳具体实例中，核酸的至少一种编码序列为密码子经修饰的编码序列，其中该密码子经修饰的编码序列选自G/C最佳化编码序列、人类密码子使用调适编码序列或G/C修饰的编码序列。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由密码子修饰的核酸序列组成，该密码子修饰的核酸序列与选自由以下者组成的群的密码子修饰的核酸序列：SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、14142-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于此等适合的核酸序列编码中的每一者的额外资讯亦可来源于序列表，特定言之来源于其中在识别号<223>下所提供的详情。第一态样的适合的编码序列提供于表1中。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见D-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
或者，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由密码子修饰的核酸序列组成，该密码子修饰的核酸序列与根据SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、14142-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937的序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中相应序列中的所有尿嘧啶(U)经胸苷(T)或此等序列中的任一者的片段或片段或变异体取代。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见D-F栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由G/C最佳化编码序列组成，该G/C最佳化编码序列与选自由以下者组成的群的密码子修饰的核酸序列：SEQ ID NO:136-138、140、141、148、149、152、155、156、159、162、163、166、169、170、173、11731-11813、11815、11817-11966、12271-12472、12743-12944、13514、13515、14124-14132、14142-14150、14160-14168、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23040、23077-23148、23189-23260、23297-23368、23409-23480、23517-23588、23629-23700、23737-23808、23849-23920、23957-24028、24069-24140、24177-24248、24289-24360、24397-24468、24509-24580、24617-24688、24729-24800、24837-24908、24949-25020、25057-25128、25169-25240、25277-25348、25389-25460、25497-25568、25609-25680、25717-25788、25829-25900、25937-26008、26049-26120、26157-26228、26269-26340、26377-26448、26489-26560、26597-26668、26709-26780、26817-26888、26925-26937或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于此等适合的核酸序列编码中的每一者的额外资讯亦可来源于序列表，特定言之来源于其中在识别号<223>下所提供的详情。第一态样的适合的编码序列提供于表1中。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见D栏的1至7、9、11-41列)、表3a及3b，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由人类密码子使用调适编码序列组成：该人类密码子使用调适编码序列与选自由以下者组成的群的密码子修饰的核酸序列：SEQ ID NO:142、143、145、150、153、157、160、164、167、171、174、11967-12033、12473-12539、12945-13011或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于此等适合的核酸序列编码中的每一者的额外资讯亦可来源于序列表，特定言之来源于其中在识别号<223>下所提供的详情。第一态样的适合的编码序列提供于表1中。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见E栏的1至7、9、11-41列)、表3a，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由G/C修饰的编码序列组成，该G/C修饰的编码序列与选自由以下者组成的群的密码子修饰的核酸序列：SEQ ID NO:146、147、151、154、158、161、165、168、172、175、12034-12050、12052、12054-12203、12540-12675、13012-13147、13519、13520、14133-14141、14151-14159、14169-14177、23041-23076、23149-23184、23261-23296、23369-23404、23481-23516、23589-23624、23701-23736、23809-23844、23921-23956、24029-24064、24141-24176、24249-24284、24361-24396、24469-24504、24581-24616、24689-24724、24801-24836、24909-24944、25021-25056、25129-25164、25241-25276、25349-25384、25461-25496、25569-25604、25681-25716、25789-25824、25901-25936、26009-26044、26121-26156、26229-26264、26341-26376、26449-26484、26561-26596、26669-26704、26781-26816、26889-26924或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于此等适合的核酸序列编码中的每一者的额外资讯亦可来源于序列表，特定言之来源于其中在识别号<223>下所提供的详情。第一态样的适合的编码序列提供于表1中。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见F栏的1至7、9、11-41列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在甚至更佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由G/C修饰的编码序列组成：该G/C修饰的编码序列与选自由以下者组成的群的密码子修饰的核酸序列：SEQ ID NO:136-138、142、143、146、147、11731、11798-11801、11804、11805、11808、11810-11812、11923、11953、12035、12049、22759-22785、22965-22982、23077-23094、23149或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于此等适合的核酸序列编码中的每一者的额外资讯亦可来源于序列表，特定言之来源于其中在识别号<223>下所提供的详情。第一态样的适合的编码序列提供于表1中。关于所述核酸序列的其他资讯亦提供于表1(参见F栏的1至7、9、11-41列)，且在相应序列SEQ ID NO的ST25序列表的<223>识别号下。
在尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由编码SARS-CoV-2抗原的G/C修饰的编码序列组成，该编码序列与根据SEQ ID NO:137的密码子修饰的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他尤其较佳具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由编码SARS-CoV-2抗原的G/C修饰的编码序列组成，该G/C修饰的编码序列与根据SEQ ID NO:23090、23091、23093、23094的密码子修饰的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，第一态样的核酸包含至少一种编码序列，该编码序列包含或由编码SARS-CoV-2抗原的编码序列组成，该编码序列与根据SEQ ID NO:23113、23167的密码子修饰的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
UTR：
在较佳具体实例中，本发明的核酸包含蛋白编码区(「编码序列」或「cds」)及5'-UTR及/或3'-UTR。特别地，UTR可具有测定核酸的调节序列元件，例如RNA转换、稳定性及定位。此外，UTR可具有增强转译的序列元件。在核酸序列(包括DNA及RNA)的医疗应用中，将核酸转译成至少一种肽或蛋白对治疗功效至关重要。3'-UTR及/或5'-UTR的某些组合可增强编码本发明的肽或蛋白的可操作地连接的编码序列的表现。具有所述UTR组合的核酸分子有利地实现抗原肽或蛋白在投予至个体之后，较佳在肌内投予之后的快速及短暂表现。因此，包含如本文所提供的3'-UTR及/或5'-UTR的某些组合的核酸特别适于作为疫苗投予，特定言之适于投予个体的肌肉、真皮或表皮中。
适合地，本发明的核酸包含至少一个异源5'-UTR及/或至少一个异源3'-UTR。该异源5'-UTR或3'-UTR可来源于天然存在的基因或可经合成方式工程改造。在较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含至少一个如本文所定义的可操作地连接至至少一个(异源)3'-UTR及/或至少一个(异源)5'-UTR的编码序列。
在较佳具体实例中，核酸(例如RNA或DNA)包含至少一个异源3'-UTR。
术语「3'-未转译区或」或「3'-UTR」或「3'-UTR元件」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指位于编码序列的3'(亦即下游)且不转译成蛋白的核酸分子的一部分。3'-UTR可为位于编码序列与(视需要存在的)末端多(A)序列之间的核酸(例如DNA或RNA)的一部分。3'-UTR可包含用于控制基因表现的元件，亦称为调节元件。所述调节元件可例如为核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
较佳地，核酸包含3'-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期(亦即提供稳定RNA)的RNA有关的基因。
在一些具体实例中，3'-UTR包含以下中的一或多者：多腺苷酸化讯息，影响细胞中的位置的核酸稳定性的蛋白的结合位点，或miRNA的一或多个miRNA或结合位点。
微小RNA(或miRNA)为19-25个核苷酸长的非编码RNA，其结合至核酸分子的3'-UTR且借由降低核酸分子稳定性或借由抑制转译来下调基因表现。例如，已知微小RNA调节RNA，且从而调节蛋白表现，例如在肝(miR-122)、心脏(miR-ld,miR-149)、内皮细胞(miR-17-92,miR-126)、脂肪组织(let-7,miR-30c)、肾(miR-192、miR-194、miR-204)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)，及肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)中。RNA可包含一或多个微小RNA靶标序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可例如对应于任何已知微小RNA，诸如US2005/0261218及US2005/0059005中所教示的彼等微小RNA。
因此，可将如上文所定义的miRNA或miRNA的结合位点自3'-UTR移除或引入3'-UTR中以便调适核酸(例如RNA)的表现至所需细胞类型或组织(例如肌肉细胞)。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个异源3'-UTR，其中至少一个异源3'-UTR包含衍生自基因的3'-UTR的核酸序列，该基因选自PSMB3、ALB7、α-球蛋白(称为「muag」)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1及RPS9，或选自同源物、此等基因中的任一者的片段或变异体，较佳根据核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:253-268、22902-22905、22892-22895或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在彼情形下的尤其较佳核酸序列可以衍生自公布的PCT申请案WO2019/077001A1，特定言之WO2019/077001A1的权利要求9。WO2019/077001A1的权利要求9的对应的3'-UTR序列特此以引用的方式并入(例如，WO2019/077001A1的SEQ ID NO:23-34，或其片段或变异体)。
在尤其较佳具体实例中，核酸包含衍生自α-球蛋白基因的3'-UTR。衍生自α-球蛋白基因(「muag」)的该3'-UTR可包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:267、268、22896-22901、22906-22911或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸包含衍生自RPS9基因的3'-UTR。衍生自RPS9基因的该3'-UTR可包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:263或264、22894、22895、22904、22905或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，核酸包含衍生自PSMB3基因的3'-UTR。衍生自PSMB3基因的该3'-UTR可包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:253或254、22892、22893、22902、22903或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸包含3'-UTR，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:22876-22891或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸可包含如WO2016/107877中所描述的3'-UTR，WO2016/107877的揭示内容与特此以引用的方式并入的3'-UTR序列相关。适合的3'-UTR为WO2016/107877的SEQ ID NO:1-24及SEQ ID NO:49-318或此等序列的片段或变异体。在其他具体实例中，核酸包含如WO2017/036580中所描述的3'-UTR，WO2017/036580的揭示内容与特此以引用的方式并入的3'-UTR序列相关。适合的3'-UTR为WO2017/036580的SEQ ID NO:152-204，或此等序列的片段或变异体。在其他具体实例中，核酸包含如WO2016/022914中所描述的3'-UTR，WO2016/022914的揭示内容与特此以引用的方式并入的3'-UTR序列相关。尤其较佳的3'-UTR为根据WO2016/022914的SEQ ID NO:20-36或此等序列的片段或变异体的核酸序列。
在较佳具体实例中，核酸(例如RNA或DNA)包含至少一个异源5'-UTR。
术语「5'-非转译区」或「5'-UTR」或「5'-UTR元件」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指位于编码序列的5'(亦即「上游」)且不转译成蛋白的核酸分子的一部分。5'-UTR可为位于编码序列的5'的核酸的一部分。典型地，5'-UTR以转录起始位点开始且在编码序列的起始密码子之前终止。5'-UTR可包含用于控制基因表现的元件，亦称为调节元件。此类调节元件可例如为核糖体结合位点、miRNA结合位点等。5'-UTR可经转录后修饰，例如借由5'-帽结构(例如，如下文所定义的mRNA)的酶促或转录后添加。
较佳地，核酸包含5'-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期(亦即提供稳定RNA)的RNA有关的基因。
在一些具体实例中，5'-UTR包含细胞中影响RNA稳定性或RNA位置的蛋白的结合位点中的一或多者，或miRNA的一或多个miRNA或结合位点(如上文所定义)。
因此，可将如上文所定义的miRNA或miRNA的结合位点自5'-UTR移除或引入5'-UTR中以便调适核酸的表现至所需细胞类型或组织(例如肌肉细胞)。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个异源5'-UTR，其中至少一个异源5'-UTR包含衍生自基因的5'-UTR的核酸序列，该基因选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B及UBQLN2，或选自同源物、根据核酸序列的此等基因中的任一者的片段或变异体，所述核酸序列与SEQ ID NO:231-252、22870-22875或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在彼情形下的尤其较佳核酸序列可以选自公布的PCT申请案WO2019/077001A1，特定言之WO2019/077001A1的权利要求9。WO2019/077001A1的权利要求9的对应的5'-UTR序列特此以引用的方式并入(例如，WO2019/077001A1的SEQ ID NO:1-20，或其片段或变异体)。
在较佳具体实例中，核酸包含衍生自RPL31基因的5'-UTR，其中衍生自RPL31基因的该5'-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:243、244、22872、22873或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸包含衍生自SLC7A3基因的5'-UTR，其中衍生自SLC7A3基因的该5'-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:245、246、22874、22875或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在尤其较佳具体实例中，核酸包含衍生自HSD17B4基因的5'-UTR，其中衍生自HSD17B4基因的该5'-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:231、232、22870、22871或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸包含5'-UTR，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:22848-22869或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸包含如WO2013/143700中所描述的5'-UTR，WO2013/143700的揭示内容与特此以引用的方式并入的5'-UTR序列相关。尤其较佳5'-UTR为衍生自WO2013/143700的SEQ ID NO:1-1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421及SEQ ID NO:1422或此等序列的片段或变异体的核酸序列。在其他具体实例中，核酸包含如WO2016/107877中所描述的5'-UTR，WO2016/107877的揭示内容与特此以引用的方式并入的5'-UTR序列相关。尤其较佳5'-UTR为根据WO2016/107877的SEQ ID NO:25-30及SEQ ID NO:319-382或此等序列的片段或变异体的核酸序列。在其他具体实例中，核酸包含如WO2017/036580中所描述的5'-UTR，WO2017/036580的揭示内容与特此以引用的方式并入的5'-UTR序列相关。尤其较佳的5'-UTR为根据WO2017/036580的SEQ ID NO:1-151或此等序列的片段或变异体的核酸序列。在其他具体实例中，核酸包含如WO2016/022914中所描述的5'-UTR，WO2016/022914的揭示内容与特此以引用的方式并入的5'-UTR序列相关。尤其较佳的5'-UTR为根据WO2016/022914的SEQ ID NO:3-19或此等序列的片段或变异体的核酸序列。
适当地，在较佳具体实例中，核酸包含至少一个如本文所指定的编码序列，该编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其可操作地连接至选自以下5'UTR/3'UTR组合的3'-UTR及/或5'-UTR(「亦称为UTR设计」)：
a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(NDUFA4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-球蛋白基因)。
在尤其较佳具体实例中，核酸包含至少一个如本文所指定的编码序列，该编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中该编码序列可操作地连接至HSD17B4 5'-UTR及PSMB3 3'-UTR(HSD17B4/PSMB3(UTR设计a-1))。
本发明人已展示，此具体实例特别有益于诱导针对SARS-CoV-2的免疫反应。在此情形下，可展示一次疫苗接种已足以产生病毒中和抗体效价。
在其他较佳具体实例中，核酸包含至少一个如本文所指定的编码序列，该编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中该编码序列可操作地连接至SLC7A3 5'-UTR及PSMB3 3'-UTR(SLC7A3/PSMB3(UTR设计a-3))。
在其他较佳具体实例中，核酸包含至少一个如本文所指定的编码序列，该编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中该编码序列可操作地连接至RPL31 5'-UTR及RPS9 3'-UTR(RPL31/RPS9(UTR设计e-2))。
在核酸的尤其较佳具体实例中包含至少一个如本文所指定的编码序列，该编码序列编码至少一种如本文所定义的抗原蛋白，较佳衍生自SARS-CoV-2(nCoV-2019)冠状病毒，其中该编码序列可操作地连接至α-球蛋白(「muag」)3'-UTR(-/muag)(UTR设计i-3))。
在一些具体实例中，核酸(例如DNA或RNA)可为单顺反子、双顺反子及多顺反子。
术语「单顺反子」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指包含仅一种编码序列的核酸。如本文所使用的术语「双顺反子」或「多顺反子」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指可包含两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)编码序列的核酸。
在较佳具体实例中，第一态样的核酸为单顺反子。
在其他具体实例中，核酸为单顺反子且该核酸的编码序列编码衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的至少两种不同抗原肽或蛋白。因此，该编码序列可编码至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个及更多个衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白，与或不与氨基酸连接子序列连接，其中该连接子序列可以包含刚性连接子、可挠性连接子、可裂解连接子或其组合。此类构筑体在本文中称为「多抗原构筑体」。
在其他具体实例中，核酸可为双顺反子或多顺反子且包含至少两种编码序列，其中该至少两种编码序列编码衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的两种或两种以上不同抗原肽或蛋白。因此，双顺反子或多顺反子核酸中的编码序列适合地编码如本文所定义的不同抗原蛋白或肽或其免疫原性片段或免疫原性变异体。较佳地，该双顺反子或多顺反子构筑体中的编码序列可借由至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列隔开。因此，术语「编码两种或两种以上抗原肽或蛋白」可意谓(但不限于此)双顺反子或多顺反子核酸编码例如不同SARS-CoV-2冠状病毒分离株的至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种(较佳不同)抗原肽或蛋白。或者，双顺反子或多顺反子核酸可编码例如至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种(较佳不同)衍生自相同SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白。在彼情形下，适合的IRES序列可选自根据专利申请案WO2017/081082的SEQ ID NO:1566-1662的核酸序列或此等序列的片段或变异体的清单。在此情形下，与IRES序列有关的WO2017/081082的揭示内容特此以引用的方式并入。
应理解，在本发明的情形下，编码序列的某些组合可由单顺反子、双顺反子及多顺反子DNA及/或RNA构筑体及/或多抗原构筑体的任何组合产生以获得编码如本文所定义的多抗原肽或蛋白的核酸组。
在较佳具体实例中，核酸的核糖体结合位点的环境中的A/U(A/T)含量相比于其相应野生型或参考核酸的核糖体结合位点的环境中的A/U(A/T)含量可增加。此修饰(围绕核糖体结合位点的增加的A/U(A/T)含量)增加核糖体结合至核酸(例如结合至RNA)的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合又具有高效转译核酸的效应。
因此，在尤其较佳具体实例中，核酸包含核糖体结合位点，亦称为「kozak序列」，其与序列SEQ ID NO:180、181、22845-22847中的任一者或其片段或变异体一致或至少80％、85％、90％、95％一致。
在较佳具体实例中，本发明的核酸包含至少一个多(N)序列，例如至少一个多(A)序列、至少一个多(U)序列、至少一个多(C)序列或其组合。
在较佳具体实例中，本发明的核酸，较佳RNA包含至少一个多(A)序列。
如本文所使用的术语「多(A)序列」、「多(A)尾」或「3'-多(A)尾」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲为典型地位于至多约1000个腺苷核苷酸的线性RNA(或在圆形RNA中)的3'-末端的腺苷核苷酸的序列。较佳地，该多(A)序列为基本上均聚的，例如100个腺苷核苷酸的多(A)序列基本上具有100个核苷酸的长度。在其他具体实例中，多(A)序列可间杂有至少一个不同于腺苷核苷酸的核苷酸，例如100个腺苷核苷酸的多(A)序列可具有超过100个核苷酸的长度(包含100个腺苷核苷酸且另外该至少一种核苷酸或不同于腺苷核苷酸的一段核苷酸)。必须理解，如本文所定义的「多(A)序列」典型地是关于RNA，然而在本发明的情形下，该术语同样是关于DNA分子(例如「多(T)序列」)中的对应序列。
多(A)序列可包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸或约40至约150个腺苷核苷酸。适当地，多(A)序列的长度可为至少约或甚至超过约10、50、64、75、100、200、300、400或500个腺苷核苷酸。
在较佳具体实例中，核酸包含至少一个包含约30至约200个腺苷核苷酸的多(A)序列。在尤其较佳具体实例中，多(A)序列包含约64个腺苷核苷酸(A64)。在其他尤其较佳具体实例中，多(A)序列包含约100个腺苷核苷酸(A100)。在其他具体实例中，多(A)序列包含约150个腺苷核苷酸。
在其他具体实例中，核酸包含至少一个包含约100个腺苷核苷酸的多(A)序列，其中多(A)序列间杂有非腺苷核苷酸，较佳间杂有10个非腺苷核苷酸(A30-N10-A70)。
如本文所定义的多(A)序列可直接位于核酸的3'末端，较佳直接位于RNA的3'末端。
在较佳具体实例中，3'-末端核苷酸(亦即多核苷酸链中最后3'-末端核苷酸)为至少一个多(A)序列的3'-末端A核苷酸。术语「直接位于3'末端」必须理解为准确地位于3'末端处，换言之，核酸的3'末端由终止于A核苷酸的多(A)序列组成。
本发明人已展示，此具体实例特别有益于诱导针对SARS-CoV-2的免疫反应。在此情形下，可展示一次疫苗接种已足以产生病毒中和抗体效价。
在尤其较佳具体实例中，核酸序列，较佳RNA包含至少70个腺苷核苷酸的多(A)序列，其中3'-末端核苷酸为腺苷核苷酸。
在此情形下，已展示终止于腺苷核苷酸降低RNA疫苗对IFNα的诱导。此是尤其重要的，因为IFNα的诱导被认为是在经疫苗接种的个体中诱导发烧的主要因素，其当然必须避免。
在核酸为RNA的具体实例中，核酸的多(A)序列较佳在RNA试管内转录期间获自DNA模板。在其他具体实例中，多(A)序列是借由化学合成的常见方法试管内获得，无需自DNA模板转录。在其他具体实例中，多(A)序列是使用市售多腺苷酸化套组及此项技术中已知的对应方案，或替代地借由使用固定化多(A)聚合酶，例如使用WO2016/174271中所描述的方法及手段由RNA(在RNA试管内转录之后)的酶多腺苷酸化而产生。
核酸可包含借由酶多腺苷酸化获得的多(A)序列，其中大部分核酸分子包含约100(+/-20)至约500(+/-50)，较佳约250(+/-20)个腺苷核苷酸。
在其他具体实例中，核酸可包含衍生自模板DNA的多(A)序列且可另外包含至少一个借由酶多腺苷酸化产生的额外多(A)序列，例如WO2016/091391中所描述。
在其他具体实例中，核酸包含至少一个多腺苷酸化讯息。
在其他具体实例中，核酸可包含至少一个多(C)序列。
如本文中所使用的术语「多(C)序列」意欲为至多约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸的序列。在较佳具体实例中，多(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在尤其较佳具体实例中，多(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
在较佳具体实例中，本发明的核酸包含至少一种组蛋白茎-环(hSL)。
术语「组蛋白茎-环」(例如序列表中缩写为「hSL」)意欲指形成主要存在于组蛋白mRNA中的茎-环二级结构的核酸序列。
组蛋白茎-环序列/结构可适当地选自如WO2012/019780中所揭示的组蛋白茎-环序列，本发明是关于特此以引用的方式并入的组蛋白茎-环序列/组蛋白茎-环结构。可在本发明内使用的组蛋白茎-环序列较佳可衍生自WO2012/019780的式(I)或(II)。根据其他较佳具体实例，核酸可包含至少一种来源于专利申请案WO2012/019780的特定式(Ia)或(IIa)中的至少一者的组蛋白茎-环序列。
在较佳具体实例中，本发明的核酸包含至少一种组蛋白茎-环，其中该组蛋白茎-环(hSL)包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:178或179或其片段或变异体一致或至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，第一态样的RNA不包含如本文所定义的组蛋白茎-环。
在一些具体实例中，尤其在关于RNA的具体实例中，核酸包含3'-末端序列元件。该3'-末端序列元件包含多(A)序列且视需要包含组蛋白-茎-环序列。因此，本发明的核酸包含至少一个3'-末端序列元件，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:182-230、22912、22913或其片段或变异体一致或至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，尤其在关于RNA的具体实例中，核酸包含3'-末端序列元件。该3'-末端序列元件包含多(A)序列且视需要包含组蛋白-茎-环序列。因此，本发明的核酸包含至少一个3'-末端序列元件，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:182、187、189、192、199、207或其片段或变异体一致或至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在各种具体实例中，特定言之在关于RNA的具体实例中，核酸可包含根据SEQ IDNO:176或177、22840-22844或其片段或变异体的5'-末端序列元件。此类5'-末端序列元件包含例如T7 RNA聚合酶的结合位点。此外，该5'-末端起始序列的第一核苷酸可较佳包含2'O甲基化，例如2'O甲基化鸟苷或2'O甲基化腺苷。
较佳地，第一态样的核酸，例如RNA或DNA，典型地包含约50至约20000个核苷酸，或约500至约10000个核苷酸，或约1000至约10000个核苷酸，或较佳约1000至约5000个核苷酸，或甚至更佳约2000至约5000个核苷酸。
在一些具体实例中，核酸为DNA或RNA。
在各种具体实例中，DNA为质体DNA或线性编码DNA构筑体，其中DNA包含或由如本文所定义的核酸元件组成(例如包括编码序列、UTR、多(A/T)、多腺苷酸化讯息、启动子)。
在较佳具体实例中，核酸为DNA表现载体。此类DNA表现载体可选自由以下者组成的群：细菌质体、腺病毒、痘病毒、副痘病毒(羊口疮病毒)、牛痘病毒、鸟痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒(AAV)、α病毒、慢病毒、λ噬菌体、淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒及李斯特菌属(Listeria sp)、沙门氏菌属(Salmonella sp)。
适当地，DNA亦可包含可操作地连接至SARS-CoV-2抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以为来自猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV极早期启动子、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子。启动子亦可以为来自人类基因，诸如人类肌动蛋白、人类肌凝蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白的启动子。启动子亦可以为天然或合成的组织专一性启动子，诸如肌肉或皮肤专一性启动子。此类启动子的实施例描述于美国专利申请公开案第US20040175727号中。在较佳具体实例中，载体可以为pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表现编码冠状病毒抗原的DNA且能够使细胞将序列转译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表现载体。
可产生其他适合的质体DNA以允许在细胞系中，例如在昆虫细胞系中，例如使用如WO2009150222A2中所描述及如PCT权利要求1至33中所定义的载体有效产生经编码的SARS-CoV-2抗原，本发明是关于WO2009150222A2的权利要求1至33，其以引用的方式并入本文中。
在其他具体实例中，第一态样的核酸是基于腺病毒的载体。此类基于腺病毒的载体可包含至少一个编码至少一种如本文所定义的SARS-CoV-2抗原肽或蛋白的编码序列。
在本发明的情形下，可使用任何适合的基于腺病毒的载体，诸如WO2005/071093或WO2006/048215中所描述的彼等物。适当地，所使用的基于腺病毒的载体为猴腺病毒，从而避免在疫苗接种之后借由预先存在的针对诸如AdHu5的常见人类实体的抗体抑制免疫反应。适合的猴腺病毒载体包括AdCh63(专利号WO/2005/071093)或AdCh68(Cohen等人J.GenVirol 2002 83:151)，但亦可使用其他。适当地，腺病毒载体将缺失E1区，使得其在人类细胞中复制不足。腺病毒的其他区(诸如E3及E4)亦可缺失。
在额外具体实例中，第一态样的核酸为基于羊口疮病毒的载体。此类基于腺病毒的载体可包含至少一个编码至少一种如本文所定义的SARS-CoV-2抗原肽或蛋白的编码序列。
在本发明的尤其较佳具体实例中，本发明的核酸为RNA。
较佳地，RNA典型地包含约50至约20000个核苷酸、或约500至约10000个核苷酸、或约1000至约10000个核苷酸、或较佳约1000至约5000个核苷酸、或甚至更佳约2000至约5000个核苷酸。
根据较佳具体实例，核酸为RNA，较佳编码RNA。
在较佳具体实例中，编码RNA可选自mRNA、(编码)自我复制RNA、(编码)环形RNA、(编码)病毒RNA或(编码)复制子RNA。
在其他具体实例中，编码RNA为环形RNA。如本文所使用，「环形RNA」或「circRNA」必须理解为编码至少一种如本文所定义的抗原肽或蛋白的环形多核苷酸构筑体。较佳地，此类circRNA为单股RNA分子。在较佳具体实例中，该circRNA包含至少一个编码至少一种来自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的编码序列。
在其他具体实例中，编码RNA为复制子RNA。术语「复制子RNA」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲为最佳化的自我复制RNA。此类构筑体可包括衍生自例如α病毒(例如SFV、SIN、VEE或RRV)的复制酶元件及用目标核酸取代结构病毒蛋白(亦即编码SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白的编码序列)。或者，可在独立编码RNA构筑体或编码DNA构筑体上提供复制酶。复制酶的下游可为控制复制子RNA的复制的亚基因组启动子。
在尤其较佳具体实例中，至少一种核酸不是复制子RNA或自我复制RNA。
在尤其较佳具体实例中，本发明的核酸为mRNA。
较佳地，mRNA不包含复制酶元件(例如编码复制酶的核酸)。
术语「RNA」及「mRNA」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲为核糖核酸分子，亦即由核苷酸组成的聚合物。此等核苷酸通常为腺苷单磷酸、尿苷单磷酸、鸟苷单磷酸及胞苷单磷酸单体，其沿着所谓的主链彼此连接。主链借由第一单体的糖(亦即核糖)与第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定序列称为RNA序列。mRNA(信使RNA)提供可转译成特定肽或蛋白的氨基酸序列的核苷酸编码序列。
在本发明的情形下，编码RNA，较佳mRNA可提供至少一个编码来自SARS-CoV-2的抗原蛋白的编码序列，该抗原蛋白在投予之后(例如在向个体(例如人类个体)投予之后)转译成(功能性)抗原。
因此，编码RNA、较佳mRNA适合于疫苗，较佳SARS-CoV-2疫苗。
适当地，编码RNA可借由添加5'-帽结构修饰，其较佳使编码RNA稳定及/或增强经编码的抗原的表现及/或减少先天性免疫系统的刺激(在向个体投予之后)。5'-帽结构在核酸为RNA，特定言之线性编码RNA(例如线性mRNA或线性编码复制子RNA)的具体实例中尤其重要。
因此，在较佳具体实例中，RNA，特定言之编码RNA包含5'-帽结构，较佳帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构。
如本文所使用的术语「5'-帽结构」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指安置于RNA(例如mRNA)的5'-端的5'经修饰的核苷酸(特定言之鸟嘌呤核苷酸)。较佳地，5'-帽结构经由5'-5'三磷酸酯键连接至RNA。
可在本发明的情形下适合的5'-帽结构为帽0(第一核碱基的甲基化，例如m7GpppN)、帽1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化)、帽2(m7GpppN下游的第2核苷酸的核糖的额外甲基化)、帽3(m7GpppN下游的第3核苷酸的核糖的额外甲基化)、帽4(m7GpppN下游的第4核苷酸的核糖的额外甲基化)、ARCA(抗反向帽类似物)、经修饰的ARCA(例如经硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-去氮-鸟苷、8-侧氧基-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷及2-叠氮基-鸟苷。
可在化学RNA合成中或使用帽类似物在RNA试管内转录(共转录加帽)中形成5'-帽(帽0或帽1)结构。
如本文所使用的术语「帽类似物」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指具有封端官能基的非可聚合二核苷酸或三核苷酸，其中其促进转译或定位，及/或当在核酸分子的5'-端并入时阻止核酸分子，特定言之RNA分子的降解。非可聚合意谓帽类似物将仅并入5'-末端，因为其不具有5'三磷酸酯且因此无法借由模板依赖性聚合酶，特定言之借由模板依赖性RNA聚合酶在3'-方向上延伸。帽类似物的实施例包括(但不限于)选自由以下者组成的群的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽类似物(例如GpppG)；二甲基化帽类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物((例如m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸盐衍生物)。先前已描述其他帽类似物(WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347及WO2013/059475)。在彼情形下的其他适合的帽类似物描述于WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/053297、WO2017/066782、WO2018/075827及WO2017/066797中，其中参考帽类似物的揭示内容特此以引用的方式并入。
在一些具体实例中，使用如WO2017/053297、WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018/075827及WO2017/066797中所揭示的三核苷酸帽类似物产生经修饰的帽1结构。特定言之，可来源于WO2017/053297的权利要求1至5中所揭示的结构的任何帽结构可适合地用于共转录产生经修饰的帽1结构。此外，可来源于WO2018/075827的权利要求1或权利要求21中所定义的结构的任何帽结构可适合地用于共转录产生经修改的帽1结构。
在较佳具体实例中，(编码)RNA，特定言的mRNA包含帽1结构。
在较佳具体实例中，5'-帽结构可适合地在如本文中所定义的RNA试管内转录反应中使用如本文所定义的三核苷酸帽类似物来共转录地添加。
在较佳具体实例中，本发明的编码RNA的帽1结构使用共转录加帽，使用三核苷酸帽类似物m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG形成。在彼情形下，较佳的帽1类似物为m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG。
在其他较佳具体实例中，本发明的RNA的帽1结构使用共转录加帽，使用三核苷酸帽类似物3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG形成。
在其他具体实例中，本发明的RNA的帽0结构使用共转录加帽，使用帽类似物3'OMe-m7G(5')ppp(5')G形成。
在其他具体实例中，使用加帽酶(例如牛痘病毒加帽酶及/或帽依赖性2'-O甲基转移酶)经由酶加帽形成5'-帽结构，以产生帽0或帽1或帽2结构。可使用WO2016/193226中所揭示的方法及手段，使用固定加帽酶及/或帽依赖性2'-O甲基转移酶添加5'-帽结构(帽0或帽1)。
在较佳具体实例中，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的RNA(物种)包含如使用加帽检定测定的帽1结构。在较佳具体实例中，小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的RNA(物种)不包含如使用加帽检定测定的帽1结构。在其他较佳具体实例中，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的RNA(物种)包含如使用加帽检定测定的帽0结构。在较佳具体实例中，小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的RNA(物种)不包含如使用加帽检定测定的帽0结构。
术语「RNA物种」不限于意谓「一个单分子」，而是应理解为包含基本上一致的RNA分子的集合。因此，其可关于多个基本上一致(编码)RNA分子。
为了测定帽0或帽1结构的存在/不存在，可以使用如例如描述于公布的PCT申请案WO2015/101416，特定言之如描述于公布的PCT申请案WO2015/101416的权利要求27至46中的加帽检定。可用于测定RNA的帽0或帽1结构的存在/不存在的其他加帽检定描述于PCT/EP2018/08667或公布的PCT申请案WO2014/152673及WO2014/152659中。
在较佳具体实例中，RNA包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)帽结构。在此类具体实例中，编码RNA包含5'-末端m7G帽，及在彼情况下，m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，2'O甲基化腺苷。较佳地，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的RNA(物种)包含如使用加帽检定测定的此类帽1结构。
在其他较佳具体实例中，RNA包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)帽结构。在此类具体实例中，编码RNA包含5'-末端m7G帽，及在彼情况下，相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，2'O甲基化鸟苷。较佳地，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的编码RNA(物种)包含如使用加帽检定测定的帽1结构。
因此，该RNA或mRNA序列的第一核苷酸，亦即m7G(5')ppp结构下游的核苷酸，可为2'O甲基化鸟苷或2'O甲基化腺苷。
根据一些具体实例，RNA为经修饰的RNA，其中修饰是指包含主链修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。
经修饰的RNA可包含核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在本发明的情形下的主链修饰为修饰，其中RNA的核苷酸的主链的磷酸酯经化学修饰。在本发明的情形下的糖修饰为RNA的核苷酸的糖的化学修饰。此外，在本发明的情形下的碱基修饰为RNA的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在此情形下，核苷酸类似物或修饰较佳选自适用于转录及/或转译的核苷酸类似物。
在尤其较佳具体实例中，可并入如本文所描述的经修饰的RNA中的核苷酸类似物/修饰较佳选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5-三磷酸、2-氨基嘌呤-核苷-5-三磷酸；2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-去氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5'-三磷酸、2-硫代尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸、4-硫代尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧胞嘧啶核苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-去氮腺苷-5'-三磷酸、7-去氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸或嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄苷-5'-三磷酸。尤其较佳用于碱基修饰的核苷酸，所述碱基修饰选自由以下者组成的碱基修饰的核苷酸的群：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-去氮鸟苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸及假尿苷-5'-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂胞苷、伪异胞苷(pseudoisocytidine)、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-伪异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-伪异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-伪异胞苷、4-硫代-1-甲基-伪异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、泽布拉恩(zebularine)、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-伪异胞苷及4-甲氧基-1-甲基-伪异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀俄丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮-鸟苷、6-硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷及N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷、5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-吡啶、8-氧代-鸟苷、7-去氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-去氮-腺苷。
在一些具体实例中，至少一个经修饰的核苷酸是选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。
在一些具体实例中，如本文所定义的编码序列中100％尿嘧啶具有化学修饰，较佳化学修饰位于尿嘧啶的5-位置中。
在本发明的情形下，尤其较佳为假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶及5-甲氧基尿苷。
然而，在一些具体实例中，具体实例的多核苷酸分子不包括任何N1-甲基假尿苷(m1Ψ)取代的位置。在其他态样中，具体实例的多核苷酸分子不包括任何假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶及5-甲氧基尿苷取代的位置。在其他态样中，具体实例的多核苷酸分子包含仅由G、C、A及U核苷酸组成的编码序列。
将经修饰的核苷酸(诸如假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶及/或5-甲氧基尿苷并入RNA的编码序列中，可有利作为非所需先天性免疫反应(在投予编码RNA或疫苗时)可经调节或减少(必要时)。
在一些具体实例中，RNA包含至少一个编码如本文所定义的SARS-CoV-2抗原蛋白的编码序列，其中该编码序列包含至少一个选自假尿苷(ψ)及N1-甲基假尿苷(m1ψ)的经修饰的核苷酸，较佳其中所有尿嘧啶核苷酸经假尿苷(ψ)核苷酸及/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在较佳具体实例中，RNA不包含N1-甲基假尿苷(m1Ψ)取代的位置。在其他具体实例中，RNA不包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶及5-甲氧基尿苷取代的位置。
在较佳具体实例中，RNA包含仅由G、C、A及U核苷酸组成的编码序列，且因此不包含经修饰的核苷酸(除帽类似物外)。
适合于冠状病毒疫苗的核酸，较佳mRNA构筑体：
在各种具体实例中，核酸，较佳mRNA包含，较佳在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)5'-帽结构，较佳如本文所指定；
B)5'-末端起始元件，较佳如本文所指定；
C)视需要，5'-UTR，较佳如本文所指定；
D)核糖体结合位点，较佳如本文所指定；
E)至少一种编码序列，较佳如本文所指定；
F)3'-UTR，较佳如本文所指定；
G)视需要，多(A)序列，较佳如本文所指定；
H)视需要，多(C)序列，较佳如本文所指定；
I)视需要，组蛋白茎-环，较佳如本文所指定；
J)视需要，3'-末端序列元件，较佳如本文所指定。
在较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含较佳在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)选自m7G(5')、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)的5'-帽结构；
B)选自SEQ ID NO:176或177或其片段或变异体的5'-末端起始元件；
C)视需要，衍生自HSD17B4基因的5'-UTR；
D)选自SEQ ID NO:180、181、22845-22847或其片段或变异体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的至少一种编码序列；
F)衍生自PSMB3基因或α-球蛋白基因(「muag」)的3'-UTR；
G)视需要，包含约30至约500个腺苷的多(A)序列；
H)视需要，包含约10至约100个胞嘧啶的多(C)序列；
I)视需要，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
J)视需要，选自SEQ ID NO:182-230的3'-末端序列元件。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
C)衍生自如本文所定义的muag基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:267或268、22896-22901、22906-22911；
D)包含约64个A核苷酸的多(A)序列。
E)包含约10至约100个胞嘧啶的多(C)序列；
F)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
在较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)衍生自如本文所定义的HSD17B4基因的5'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:231或232；
C)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
D)衍生自如本文所定义的PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:253或254；
E)包含约64个A核苷酸的多(A)序列。
F)视需要包含约10至约100个胞嘧啶的多(C)序列；
G)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
H)视需要，3'-末端序列元件SEQ ID NO:182-230。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)衍生自如本文所定义的HSD17B4基因的5'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:231或232；
C)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
D)衍生自如本文所定义的PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:253或254；
E)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列，较佳表示3'末端。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)衍生自如本文所定义的HSD17B4基因的5'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:231或232；
C)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
D)衍生自如本文所定义的PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:253或254；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列，较佳表示3'末端。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)衍生自如本文所定义的SLC7A3基因的5'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:245或246；
C)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
D)衍生自如本文所定义的PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:253或254；
E)视需要，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列，较佳表示3'末端。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA包含在5'-至3'-方向上的以下元件：
A)如本文所定义的帽1结构；
B)衍生自如本文所定义的RPL31基因的5'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:243或243；
C)选自SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184或其片段或变异体的编码序列；
D)衍生自如本文所定义的RPS9基因的3'-UTR的3'-UTR，较佳根据SEQ ID NO:263或264；
E)视需要，选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列，较佳表示3'末端。
本发明的较佳核酸序列，较佳mRNA序列提供于表3a中。其中各列表示本发明的特定适合的SARS-CoV-2(nCoV-2019)构筑体(与表1相比)，其中SARS-CoV-2构筑体的描述在表3a的A栏中指明且相应SARS-CoV-2构筑体的氨基酸序列的SEQ ID NO提供于B栏中。编码相应SARS-CoV-2构筑体的编码序列的对应SEQ ID NO提供于表1中。其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下。
对应核酸，较佳编码RNA序列，尤其包含较佳编码序列的mRNA序列提供于C及D栏中，其中C栏提供具有如本文所定义的UTR组合「HSD17B4/PSMB3」的核酸序列，其中D栏提供具有如本文所定义的「α-球蛋白」3'UTR的核酸序列。
表3a：适合于冠状病毒疫苗的核酸，较佳mRNA构筑体
Figure GDA0003858923850000981
Figure GDA0003858923850000991
Figure GDA0003858923850001001
Figure GDA0003858923850001011
本发明的更佳核酸序列，较佳mRNA序列提供于表3b中。其中，各栏表示本发明的特定适合的SARS-CoV-2(nCoV-2019)构筑体(与表1及表3a相比)，其中B栏表示「全长棘蛋白；S」，表1及表3a的1列及C栏「稳定棘蛋白；S_stab_PP」，与表1及表3a的2列相比。
相应SARS-CoV-2构筑体的氨基酸序列的SEQ ID NO提供于1列中。编码相应SARS-CoV-2构筑体的编码序列的对应SEQ ID NO提供于表1中。其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下。
对应核酸，较佳编码RNA序列，尤其包含较佳编码序列的mRNA序列提供于2-16列中，其中各列提供具有UTR组合及适合的3'末端的核酸序列。
表3b：适合于冠状病毒疫苗的核酸，较佳mRNA构筑体
Figure GDA0003858923850001012
Figure GDA0003858923850001021
在较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937组成的群的核酸序列或此等序列中的任一者的片段或变异体。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a(尤其参见C及D栏)及表3b(尤其参见2-16列)中。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:162-175、12676-13147、14160-14177、22786-22839、23189-23404或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a(尤其参见D栏)、表3b(2列)中。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:148-161、12204-12675、14142-14159、22786-22812、23409-23624、24729-24944或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a(尤其参见C栏)及表3b(参见3、7列)中。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:149-154、156-161、163-168、170-175、12338、12352、12541、12555、12810、12824、13013、13027、22786、22792、22794、22796、22798、22800、22802、22804、22806、22808、22810、22812、22813、22819、22821、22823、22825、22827、22829、22831、22833、22835、22837、22839、23517-23624、23297-23404、24837-24944或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a(参见C及D栏、2及6列)及表3b(参见C栏)中。
在甚至更佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:149、156、12338、150、157、151、158、12541、163、170、12810、164、171、165、172、13013、12342-12351、12545-12554、12814-12823、13017-13026、14133或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a及表3b中。
在甚至更佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列选自由以下者组成的群：SEQ ID NO:149、150、151、163、164、165或此等序列中的任一者的片段或变异体。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3(参见C及D栏，2列)中。
在尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQID NO:163的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他尤其较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO:24837的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQID NO:23311、23531、24851的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQID NO:23310、23530、24850的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQID NO:23313、23533、24853、23314、23534、24854的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ IDNO:26633的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ IDNO:26907的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中所述RNA序列包含如本文所定义的帽1结构。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a及表3b中。
在其他具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中所述RNA序列中的至少一个，较佳所有尿嘧啶核苷酸经假尿苷(ψ)核苷酸及/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a及表3b中。
在其他具体实例中，核酸，较佳RNA包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中所述RNA序列包含如本文所定义的帽1结构，且，其中所述RNA序列中的至少一个，较佳所有尿嘧啶核苷酸经假尿苷(ψ)核苷酸及/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。关于相应核酸序列的其他资讯提供于序列表中的相应SEQ ID NO的<223>识别号下，及表3a及表3b中。
如本说明书通篇所概述，关于适合的氨基酸序列或核酸序列(编码序列、DNA序列、RNA序列)的额外资讯亦可来源于序列表，特定言的来源于其中在识别号<223>下所提供的细节，如下文中所解释。
在特定具体实例中，本发明的核酸为RNA，其中RNA可使用此项技术中已知的任何方法制备，包括化学合成，诸如固相RNA合成，以及试管内方法，诸如RNA试管内转录反应。因此，在较佳具体实例中，RNA借由RNA试管内转录获得。
因此，在较佳具体实例中，本发明的核酸较佳为试管内转录RNA。
术语「RNA试管内转录」或「试管内转录」是关于其中RNA在无细胞系统中(试管内)合成的过程。RNA可借由适当DNA模板的DNA依赖性试管内转录而获得，该DNA模板根据本发明为线性化质体DNA模板或PCR-扩增的DNA模板。用于控制RNA试管内转录的启动子可以为用于任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的特定实施例为T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶。在本发明的较佳具体实例中，将DNA模板用适合的限制酶线性化，随后使其经历RNA试管内转录。
用于RNA试管内转录的试剂典型地包括：具有启动子序列的DNA模板(线性化质体DNA或PCR产物)，该启动子序列对其相应RNA聚合酶(诸如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6或Syn5))具有高结合亲和力；用于四个碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤及尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTP)；视需要，如本文所定义的帽类似物；视需要，如本文所定义的其他经修饰的核苷酸；能够结合至DNA模板内的启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3、SP6或Syn5RNA聚合酶)；视需要，核糖核酸酶(RNase)抑制剂，以去活化任何潜在污染的核糖核酸酶；视需要，降解焦磷酸盐的焦磷酸酶，其可抑制RNA试管内转录；MgCl2，其提供Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；维持适合的pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其亦可以含有抗氧化剂(例如DTT)，及/或多胺(诸如处于最佳浓度的亚精胺)，例如WO2017/109161中所揭示的包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲液系统。
在较佳具体实例中，本发明的RNA的帽1结构使用共转录加帽，使用三核苷酸帽类似物m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG形成。可适当地用于制造本发明的编码RNA的较佳帽1类似物为m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG。
在尤其较佳具体实例中，本发明的RNA的帽1结构使用共转录加帽，使用三核苷酸帽类似物3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG形成。
在其他具体实例中，本发明的RNA的帽O结构使用共转录加帽，使用帽类似物3'OMe-m7G(5')ppp(5')G形成。
在额外具体实例中，用于RNA试管内转录的核苷酸混合物可另外包含如本文所定义的经修饰的核苷酸。在彼情形下，较佳经修饰的核苷酸可选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶及5-甲氧基尿苷。在特定具体实例中，核苷酸混合物中的尿嘧啶核苷酸经假尿苷(ψ)及/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)置换(部分或完全)以获得经修饰的RNA。
在较佳具体实例中，用于RNA试管内转录的核苷酸混合物不包含如本文所定义的经修饰的核苷酸。在较佳具体实例中，用于RNA试管内转录的核苷酸混合物仅包含G、C、A及U核苷酸，及视需要如本文所定义的帽类似物。
在较佳具体实例中，用于RNA试管内转录反应的核苷酸混合物(亦即混合物中各核苷酸的分数)可针对给定RNA序列进行最佳化，较佳如WO2015/188933所描述。
在此情形下，已在序列最佳化的核苷酸混合物及视需要选用的帽类似物存在下进行试管内转录，较佳其中序列最佳化的核苷酸混合物不包含经化学修饰的核苷酸。
在此情形下，序列最佳化的核苷三磷酸(NTP)混合物为核苷三磷酸(NTP)的混合物，其用于给定序列的RNA分子的试管内转录反应，该RNA分子包含四个核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP及UTP，其中序列最佳化的核苷三磷酸(NTP)混合物中的四个核苷三磷酸(NTP)中的每一者的分数对应于该RNA分子中的相应核苷酸的分数。若核糖核苷酸不存在于RNA分子中，则对应的核苷三磷酸亦不存在于序列最佳化的核苷三磷酸(NTP)混合物中。
在其中必须产生如本文定义的多于一种不同RNA的具体实例中，例如在其中必须产生2、3、4、5、6、7、8、9、10或甚至更多种不同RNA的具体实例中(参见第二态样)，可适当地使用如WO2017/109134中所描述的程序。
在基于核酸的疫苗生产的情形下，可能需要提供GMP级核酸，例如GMP级RNA或DNA。GMP级RNA或DNA可使用由监管机构批准的制造方法产生。因此，在尤其较佳具体实例中，RNA生产是在现行药品优良制造规范(GMP)下进行，较佳根据WO2016/180430，对DNA及RNA水准实施各种品质控制步骤。在较佳具体实例中，本发明的RNA为GMP级RNA，尤其GMP级mRNA。因此，用于疫苗的RNA较佳为GMP级RNA。
所获得的RNA产物较佳使用
Figure GDA0003858923850001091
(CureVac,Tübingen,Germany；根据WO2008/077592的RP-HPLC)及/或切向流过滤(如WO2016/193206中所描述)及/或低聚d(T)纯化(参见WO2016/180430)来纯化。
较佳地，根据本发明的RNA使用RP-HPLC，较佳使用具有巨孔苯乙烯/二乙烯苯管柱(例如粒度30μm、孔径
Figure GDA0003858923850001092
)的反相高压液相层析(RP-HPLC)纯化，且另外使用具有纤维素基膜的过滤盒，该纤维素基膜的分子量截止值为约100kDa。
在此情形下，尤其较佳的是经纯化的RNA已借由RP-HPLC及/或TFF纯化，由此产生约5％、10％或20％以下的双股RNA副产物，如在尚未经RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA中。
或者，已借由RP-HPLC及/或TFF纯化的经纯化的RNA包含约5％、10％或20％以下的双股RNA副产物作为已用低聚dT纯化、沉淀、过滤及/或阴离子交换层析纯化的RNA。
在其他较佳具体实例中，核酸，较佳RNA经冻干(例如根据WO2016/165831或WO2011/069586)以产生如本文所定义的温度稳定干燥核酸(粉末)(例如RNA或DNA)。本发明的核酸，特定言之RNA亦可使用喷雾干燥或喷雾-冷冻干燥(例如根据WO2016/184575或WO2016/184576)干燥，得到如本文所定义的温度稳定RNA(粉末)。因此，在制造及纯化核酸，特定言的RNA的情形下，WO2017/109161、WO2015/188933、WO2016/180430、WO2008/077592、WO2016/193206、WO2016/165831、WO2011/069586、WO2016/184575及WO2016/184576的揭示内容特此以引用的方式并入。
因此，在较佳具体实例中，核酸为干燥核酸，尤其干燥RNA。
如本文所使用的术语「干燥RNA」必须理解为如上文所定义已冻干，或喷雾干燥、或喷雾-冷冻干燥的RNA以获得温度稳定干燥RNA(粉末)。
在较佳具体实例中，本发明的核酸为经纯化的核酸，特定言之，经纯化的RNA。
如本文所使用的术语「经纯化的核酸」必须理解为在某些纯化步骤之后具有比起始物质更高的纯度的核酸。基本上不存在于经纯化的核酸中的典型杂质包含肽或蛋白、亚精胺、BSA、中止核酸序列、核酸片段、游离核苷酸、细菌杂质或来源于纯化程序的杂质。因此，就此而言，需要「核酸纯度」尽可能接近100％。亦需要全长核酸的量尽可能接近100％的核酸纯度。因此，如本文所使用的「经纯化的核酸」具有超过75％、80％、85％、极特定言之90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％且最有利地99％或更高的纯度。纯度可例如借由分析型HPLC测定，其中上文所提供的百分比对应于目标核酸的峰面积与表示副产物的所有峰总面积之间的比。或者，纯度可例如借由分析型琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳测定。
在较佳具体实例中，本发明的核酸为经纯化的RNA。
如本文所使用的术语「经纯化的RNA」或「经纯化的mRNA」必须理解为在某些纯化步骤(例如HPLC、TFF、低聚d(T)纯化、沉淀步骤)之后具有比起始物质(例如试管内转录的RNA)更高的纯度的RNA。基本上不存在于经纯化的RNA中的典型杂质包含肽或蛋白(例如衍生自DNA依赖性RNA试管内转录的酶，例如RNA聚合酶、核糖核酸酶、焦磷酸酶、限制性核酸内切酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、中止RNA序列、RNA片段(短双股RNA片段、中止序列等)、游离核苷酸(经修饰的核苷酸、习知NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲液组分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可衍生自例如发酵程序的其他潜在杂质包含细菌杂质(生物负荷、细菌DNA)或衍生自纯化程序的杂质(有机溶剂等)。因此，就此而言，希望「RNA纯度」尽可能接近100％。亦需要全长RNA转录物的量尽可能接近100％的RNA纯度。因此，如本文所使用的「经纯化的RNA」具有超过75％、80％、85％、极特定言的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％且最有利地99％或更高的纯度。纯度可例如借由分析型HPLC测定，其中上文所提供的百分比对应于目标RNA的峰面积与表示副产物的所有峰总面积之间的比。或者，纯度可例如借由分析型琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳测定。
在其中核酸为RNA的尤其较佳具体实例中，RNA已借由RP-HPLC及/或TFF纯化以移除双股RNA、未加帽RNA及/或RNA片段。
在例如RNA试管内转录期间形成作为副产物的双股RNA可以引起先天性免疫反应的诱导，特定言之IFNα为在经疫苗接种的个体中诱导发烧的主要因素，其当然为非吾人所乐见的副作用。用于dsRNA的免疫墨点法(例如，经由点渍墨法、血清学专一性电子显微法(SSEM)或ELISA)的当前技术用于侦测及测定来自核酸混合物的dsRNA物种。
适当地，本发明的RNA已借由如本文所描述的RP-HPLC及/或TFF纯化以减少dsRNA的量。
在较佳具体实例中，本发明的RNA包含比尚未用RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
在较佳具体实例中，本发明的RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA包含作为已用低聚dT纯化、沉淀、过滤及/或AEX纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
必须理解如本文所定义的「干燥RNA」及如本文所定义的「经纯化的RNA」或如本文所定义的「GMP级RNA」可具有优异的稳定性特征(试管内、活体内)及经改良的效率(例如，mRNA活体内的较佳可转译性)，且因此尤其适合于医疗目的，例如疫苗。
在如本文所定义的共转录加帽之后，且在如本文所定义的纯化之后，所获得的RNA的加帽度可使用如公布的PCT申请案WO2015/101416中所描述的加帽检定测定，特定言之，如可以使用公布的PCT申请案WO2015/101416的权利要求27至46中所描述。或者，可使用PCT/EP2018/08667中所描述的加帽检定。
在具体实例中，用于进行RNA试管内转录的自动化装置可用于产生及纯化本发明的核酸。此类装置亦可用于产生组成物或疫苗(参见态样2及3)。较佳地，可适当地使用如WO2020002598中所描述的装置，特定言之，如WO2020002598(及图1-18)的权利要求1至59及/或68至76中所描述的装置。
本文所描述的方法较佳可应用于产生RNA组成物或疫苗的方法，如下文进一步详细描述。
组成物、医药组成物：
第二态样是关于一种组成物，其包含至少一种第一态样的核酸。
特别地，与第二态样的组成物相关的具体实例同样可阅悉且理解为第四态样的疫苗的适合的具体实例。此外，与第四态样的疫苗相关的具体实例可同样在第二态样的组成物(包含第一态样的核酸)的适合的具体实例上阅悉且理解为适合的具体实例。此外，在第一态样(本发明的核酸)的情形下所描述的特征及具体实例必须阅悉且必须理解为第二态样的组成物的适合的具体实例。
在较佳具体实例中，组成物包含至少一种根据第一态样的核酸，该核酸编码为或衍生自SARS-CoV-2(先前为nCoV-2019)冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体。
在较佳具体实例中，组成物包含至少一个编码为或衍生自根据第一态样的SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体的核酸，其中该组成物较佳肌内或皮内投予。
较佳地，该组成物的肌内或皮内投予引起个体中所编码的SARS-CoV-2抗原构筑体的表现。在其中核酸为RNA的具体实例中，投予该组成物在个体中引起RNA的转译及所编码的SARS-CoV-2抗原产生。在其中核酸为DNA(例如质体DNA、腺病毒DNA)的具体实例中，投予该组成物使得DNA转录成RNA且随后在个体中使得RNA转译成所编码的SARS-CoV-2冠状病毒抗原。
较佳地，第二态样的组成物适合于疫苗，特定言之适合于冠状病毒疫苗，较佳SARS-CoV-2(nCoV-2019)疫苗。
在本发明的情形下，「组成物」是指任何类型的组成物，其中指定成分(例如编码至少一种抗原肽或蛋白的核酸，该抗原肽或蛋白为或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒，例如RNA或DNA，例如与聚合载体或LNP缔结)可视需要连同任何其他成分，通常与至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂一起并入。组成物可为干燥组成物，诸如粉末或颗粒，或固体单元(诸如冻干形式)。或者，组成物可呈液体形式，且各成分可独立地并入溶解或分散(例如悬浮或乳化)形式中。
在第二态样的较佳具体实例中，组成物包含至少一种第一态样的核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在第二态样的具体实例中，组成物包含至少一种第一态样的核酸，较佳质体DNA、腺病毒DNA，及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在第二态样的较佳具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在第二态样的尤其较佳具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
最佳地，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO.163的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
最佳地，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO.149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他尤其较佳具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO.24837、23311、23531、23310、23530、23313、23533的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与SEQ ID NO.26633、26907的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在第二态样的尤其较佳具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:149-151、163-165、24837、23311、23531、24851、23310、23530、23313、23533及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
如本文所使用的术语「医药学上可接受的载剂」或「医药学上可接受的赋形剂」较佳包括用于投予的组成物的液体或非液体基础。若组成物以液体形式提供，则载剂可为水，例如无热原质水；等渗(isotonic)生理盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲的溶液。可使用水或较佳缓冲液，更佳水性缓冲液，其含有钠盐，较佳至少50mM钠盐、钙盐，较佳至少0.01mM钙盐及视需要钾盐，较佳至少3mM钾盐。根据较佳具体实例，钠盐、钙盐及视需要钾盐可以其卤化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)形式，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式存在。钠盐的实施例包括NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，视需要选用的钾盐的实施例包括KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，且钙盐的实施例包括CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。
此外，前述阳离子的有机阴离子可在缓冲液中。因此，在具体实例中，核酸组成物可包含医药学上可接受的载剂或赋形剂，其使用一或多种医药学上可接受的载剂或赋形剂以例如增加稳定性、增加细胞转染、允许持续或延迟、增加活体内所编码的冠状病毒蛋白的转译及/或改变活体内所编码的冠状病毒蛋白的释放轮廓。除传统赋形剂(诸如任何及所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒剂)之外，本发明的分散液或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠或乳化剂、防腐剂、赋形剂可以包括(但不限于)类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、脂复合体(lipoplex)、核壳纳米粒子、肽、蛋白、经多核苷酸转染的细胞、玻尿酸酶、纳米粒子模拟物及其组合。在具体实例中，亦可使用一或多种适用于向个体投予的相容固体或液体填充剂或稀释剂或囊封化合物。如本文所使用的术语「相容的」意谓组成物的成分能够与组成物的至少一种核酸及视需要多种核酸混合，其方式为使得在典型使用条件(例如肌内或皮内投予)下不发生相互作用，其将实质上降低组成物的生物活性或医药学有效性。医药学上可接受的载剂或赋形剂必须具有足够高的纯度及足够低的毒性以使其适合于向待治疗的个体投予。可用作医药学上可接受的载剂或赋形剂的化合物可为糖，诸如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖及蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；动物脂；固态滑动剂，诸如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油及来自可可的油；多元醇，诸如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；褐藻酸。
组成物的至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂可较佳选择为适合于肌内或皮内递送/投予该组成物。因此，组成物较佳为医药组成物，适合地为用于肌内投予的组成物。
组成物，较佳医药组成物的投予所涵盖的个体包括(但不限于)人类及/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅及/或火鸡。
本发明的医药组成物可适当地为无菌及/或不含热原质。
本发明的多价组成物：
在具体实例中，如本文所定义的组成物(例如多价组成物)可包含多种或至少多于一种核酸物种，例如如本发明的第一态样的情形下所定义的RNA物种。较佳地，如本文所定义的组成物可包含各自在第一态样的情形下所定义的2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同核酸。
在具体实例中，组成物(例如多价组成物)可包含如在第一态样的情形下所定义的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同核酸物种，各自编码衍生自相同冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白或其片段或变异体。特定言之，所述(基因上)相同的冠状病毒表现(基本上)相同的蛋白或肽库，其中所有蛋白或肽具有(基本上)相同的氨基酸序列。特定言之，该(基因上)相同的冠状病毒表现基本上相同的蛋白、肽或聚合蛋白，其中此等蛋白、肽或聚合蛋白较佳在其氨基酸序列方面不同。
在具体实例中，组成物(例如多价组成物)包含如在第一态样的情形下所定义的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或甚至更多种不同的核酸物种，各自编码至少一种衍生自基因上不同的冠状病毒(例如不同冠状病毒分离株)或其片段或变异体的肽或蛋白。如整个本说明书中所使用的术语「不同的」或「不同的冠状病毒」必须理解为至少两种相应冠状病毒(例如不同冠状病毒分离株)之间的差异，其中该差异体现于相应不同冠状病毒的基因体上。特定言之，所述(基因上)不同的冠状病毒可表现至少一种不同的蛋白、肽或聚合蛋白，其中至少一种不同的蛋白、肽或聚合蛋白在至少一种氨基酸上不同。
在较佳具体实例中，多价组成物的多种或至少多于一种核酸序列各自编码不同的棘蛋白，较佳融合前稳定化棘蛋白。
在此情形下，尤其较佳的是，不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白是衍生自不同的SARS-CoV-2病毒变异体/分离株，其中尤其较佳的是棘蛋白是衍生自B.1.1.7、B.1.351、P.1或CAL.20C。
在此情形下，更佳的是，不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白在棘蛋白中具有氨基酸变化，其包含：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V；
(iv)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I；及/或
(v)S13I、W152C、L452R及D614G。
在具体实例中，组成物(例如多价组成物)包含2、3、4或5个核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，其中该核酸物种包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中2、3、4或5个核酸物种中的每一者编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同抗原肽或蛋白。
因此，在具体实例中，组成物(例如多价组成物)包含两种核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，其中核酸物种包含或由核酸序列组成，该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937组成的群的核酸序列及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂，其中两种核酸物种中的每一者编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同抗原肽或蛋白。
在具体实例中，组成物(例如多价组成物)包含三种核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，其中核酸包含或由核酸序列组成，该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937组成的群的核酸序列及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂，其中2、3、4或5个核酸物种中的每一者编码SARS-CoV-2冠状病毒的不同抗原肽或蛋白。
在下文中，提供多价组成物的尤其较佳具体实例。
较佳地，多价组成物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸物种各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白(如第一态样中所定义)。较佳地，融合前构形的稳定是借由在棘蛋白中残基K986及V987(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)处引入两个连续脯氨酸取代来获得。因此，在较佳具体实例中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个融合前稳定化棘蛋白(S_stab)各包含至少一个融合前稳定性突变，其中至少一个融合前稳定性突变包含以下氨基酸取代：K986P及V987P(根据参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置)。
因此，多价组成物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸物种各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种稳定棘蛋白是选自氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，多价组成物包含一种核酸物种，该核酸物种包含编码序列，该编码序列编码与SEQ ID NO:10中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中多价组成物另外包含至少2、3、4种选自以下者的其他RNA物种：
i)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22961中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
ii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22960中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
ⅲ)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22963中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
iv)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22941中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
v)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22964中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
在较佳具体实例中，多价组成物包含至少两种核酸物种，该核酸物种包含编码序列，该编码序列编码与SEQ ID NO:10、22961；22960、22963、22941、22964中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。
较佳地，多价组成物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸物种包含核酸编码序列，其各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种核酸编码序列是选自核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184中的任一者或此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，多价组成物包含一种核酸物种，该核酸物种包含编码序列，该编码序列与SEQ ID NO:137中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中多价组成物另外包含至少2、3、4种选自以下者的其他RNA物种：
i)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23091中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23090中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23093中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iv)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:22999中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
v)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23094中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
较佳地，多价组成物的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同的核酸物种包含各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白的核酸编码序列，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种核酸编码序列是选自RNA序列，所述RNA序列与SEQ ID NO:149-151、163-165、12338、12541、12810-12813、12901、12931、13013、22792、22794、22796、22798、22802、22804、22806、22810、22813、22819、22821、22823、22825、22827、22829、22831、22833、22835、22837、22839、23297-23314、23369、23517-23520、23523-23525、23527、23529、23530、23589、23737、23957、24397、24837、25057、25277、25717、26925-26937中的任一者或此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，多价组成物包含一种RNA物种，该RNA物种包含或由RNA序列组成，该RNA序列与SEQ ID NO:163中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中多价组成物另外包含至少2、3、4个选自以下者的其他RNA物种：
i)一种RNA物种，该RNA物种包含或由RNA序列组成，该RNA序列与SEQ ID NO:23311中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ii)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23310中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ⅲ)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23313中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iv)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23219中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
v)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23314中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中，较佳地，mRNA物种中的每一者包含帽1结构，且视需要，mRNA物种中的每一者不包含经修饰的核苷酸。
在较佳具体实例中，多价组成物包含一种RNA物种，该RNA物种包含或由RNA序列组成，该RNA序列与SEQ ID NO:149或24837中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，其中多价组成物另外包含至少2、3、4个选自以下者的其他RNA物种：
i)一种RNA物种，该RNA物种包含或由RNA序列组成，该RNA序列与SEQ ID NO:23531或24851中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ii)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23530或24850中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ⅲ)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23533或24853中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iv)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23439或24759中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
v)一种包含编码序列的RNA物种，该编码序列与SEQ ID NO:23534或24854中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中，较佳地，mRNA物种中的每一者包含帽1结构，且视需要，mRNA物种中的每一者不包含经修饰的核苷酸。
在其他较佳具体实例中，多价组成物包含至少两种RNA物种，所述RNA物种与SEQID NO:149或24837、23531或24851、23530或24850、23533或24853、23439或24759或23534或24854中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在具体实例中，可分别调配多价组成物的核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种(如下文所指定的调配物)。在较佳具体实例中，多价组成物的核酸(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种可分别共调配(如下文所指定的调配物)。
复合：
在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与其他化合物复合或缔合以获得经调配的组成物。在彼情形下的调配物可具有转染剂的功能。在彼情形下的调配物亦可具有保护核酸免于降解的功能。
在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA及视需要至少一种其他核酸与一或多种阳离子或聚阳离子化合物，较佳阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或缔合或至少部分复合或部分缔合。
如本文所使用的术语「阳离子或聚阳离子化合物」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指带电分子，其在约1至9的pH值范围内、在约3至8的pH值范围内、在约4至8的pH值范围内、在约5至8的pH值范围内、更佳在约6至8的pH值范围内、甚至更佳在约7至8的pH值范围内、最佳在生理pH(例如约7.2至约7.5范围内)下带正电。因此，阳离子组分，例如阳离子肽、阳离子蛋白、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质，可为在生理条件下带正电的任何带正电化合物或聚合物。「阳离子或聚阳离子肽或蛋白」可含有至少一个带正电氨基酸或超过一个带正电氨基酸，例如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，「聚阳离子」组分亦在给定条件下展现超过一种正电荷的范畴内。
在此情形下尤其较佳的阳离子或聚阳离子化合物可选自其片段的阳离子或聚阳离子肽或蛋白的以下清单：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺或其他阳离子肽或蛋白，诸如聚-l-离胺酸(PLL)、聚-精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)、包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat衍生肽、穿膜肽、VP22衍生或类似肽、HSV VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白转导域(PTD)、PpT620、富脯氨酸的肽、富精氨酸的肽、富离胺酸的肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素肽、触角足突变衍生肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁传递蛋白、运输蛋白、蟾蜍素-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT衍生肽、SAP或组蛋白。更佳地，核酸(例如DNA或RNA)(例如编码RNA，较佳mRNA)与一或多种聚阳离子，较佳与鱼精蛋白或寡非他命，最佳与鱼精蛋白复合。
在较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与鱼精蛋白复合。
可以用作转染剂或复合剂的更佳阳离子或聚阳离子化合物可包括阳离子多糖，例如聚葡萄氨糖、凝聚胺等；阳离子脂质，例如DOTMA、DMRIE、di-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、寡非他命；或阳离子或聚阳离子聚合物，例如经修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺等，经修饰的聚乙烯，诸如PVP等，经修饰的丙烯酸盐，诸如pDMAEMA等，经修饰的酰氨基胺，诸如pAMAM等，经修饰的聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端修饰的1,4-丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物，诸如聚丙胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，诸如PEI、聚(丙烯亚胺)等，聚烯丙胺、基于糖主链的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物、基于聚葡萄糖的聚合物等，基于硅烷主链的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等，由一或多个阳离子嵌段(例如选自如上文所提及的阳离子聚合物)及由一或多个亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物；等。
在此情形下，尤其较佳的是，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与阳离子或聚阳离子化合物及/或聚合物载剂，较佳阳离子蛋白或肽复合或至少部分复合。在此情形下，WO2010/037539及WO2012/113513的揭示内容特此以引用的方式并入。部分意谓仅一部分核酸与阳离子化合物复合且其余核酸呈未复合形式(「游离」)。
在具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与一或多种阳离子或聚阳离子化合物，较佳鱼精蛋白及至少一种游离(非复合)核酸复合。
在此情形下，尤其较佳的是，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与鱼精蛋白复合或至少部分复合。较佳地，核酸，尤其鱼精蛋白复合的RNA的RNA与游离RNA的摩尔比可选自约0.001:1至约1:0.001的摩尔比，包括约1:1的摩尔比。适合地，借由将鱼精蛋白-海藻糖溶液以2:1的RNA:鱼精蛋白重量比(w/w)添加到RNA样品中来使复合的RNA与鱼精蛋白复合。
可用于复合的更佳阳离子或聚阳离子蛋白或肽可以衍生自专利申请案WO2009/030481或WO2011/026641的式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，与其相关的WO2009/030481或WO2011/026641的揭示内容特此以引用的方式并入。
在较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与至少一种较佳选自SEQ ID NO:269至273的阳离子或聚阳离子蛋白或肽或其任何组合复合或至少部分复合。
根据各种具体实例，本发明的组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种如在第一态样的情形下所定义的RNA及聚合载体。
如本文所使用的术语「聚合载体」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指有助于另一化合物(例如负荷核酸)的输送及/或复合的化合物。聚合载体典型地为由聚合物形成的载剂。聚合载体可借由共价或非共价相互作用与其负荷(例如DNA或RNA)缔合。聚合物可基于不同次单位，诸如共聚物。
在彼情形下的适合的聚合载体可包括，例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(polylactide-polyglycolide copolymer)、聚己内酯、聚葡萄糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原蛋白、聚葡萄胺糖、环糊精、鱼精蛋白、聚乙二醇化鱼精蛋白、聚乙二醇化PLL及聚乙烯亚胺(PEI)、二硫代双(丙酸丁二酰亚胺酯)(DSP)、二甲基-3,3'-二硫代二丙亚胺酸酯(DTBP)、聚(乙烯亚胺)双氨基甲酸酯(PEIC)、聚(L-离胺酸)、组氨酸修饰的PLL、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯亚胺)(PPI)、聚(酰氨基胺)(PAMAM)、聚(酰氨基乙烯亚胺)(SS-PAEI)、三亚乙基四胺(TETA)、聚(β-氨基酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(PHP)、聚(烯丙胺)、聚(α-[4-氨基丁基]-L-羟基乙酸)(PAGA)、聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物)、聚(磷腈)(PPZ)、聚(磷酸酯)(PPE)、聚(氨基磷酸酯)(PPA)、聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)(pHPMA)、聚(2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯)(pDMAEMA)、聚(2-胺乙基磷酸丙脂)(PPE_EA)、半乳糖基化聚葡萄胺糖、N-十二烷基化聚葡萄胺糖、组蛋白、胶原蛋白及聚葡萄糖-精胺。在一个具体实例中，聚合物可为惰性聚合物，诸如(但不限于)PEG。在一个具体实例中，聚合物可为阳离子聚合物，诸如(但不限于)PEI、PLL、TETA、聚(烯丙胺)、聚(N-乙烯基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物)、pHPMA及pDMAEMA。在一个具体实例中，聚合物可为可生物降解的PEI，诸如(但不限于)DSP、DTBP及PEIC。在一个具体实例中，聚合物可为可生物降解的，诸如(但不限于)组氨酸修饰的PLL、SS-PAEI、聚(β-氨基酯)、PHP、PAGA、PLGA、PPZ、PPE、PPA及PPE-EA。
适合的聚合物载剂可为由二硫化物交联的阳离子化合物形成的聚合载体。二硫化物交联的阳离子化合物可彼此相同或不同。聚合载体亦可以含有其他组分。根据本发明使用的聚合载体可包含阳离子肽、蛋白或聚合物及视需要选用的如本文所定义的其他组分的混合物，其借由二硫化物(经由-SH基团)交联。
在此情形下，根据专利申请案WO2012/013326的式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}(Cys)y及式Cys、{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys2的聚合载体是较佳的，与其相关的WO2012/013326的揭示内容特此以引用的方式并入。
在具体实例中，用于复合至少一种核酸(例如DNA或RNA)的聚合载体，较佳至少一种RNA可衍生自根据专利申请案WO2011/026641的式(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的聚合载体分子，与其相关的WO2011/026641的揭示内容特此以引用的方式并入。
在具体实例中，聚合载体化合物借由肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO:269)或CysArg12(SEQ ID NO:270)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO:271)形成，或包含或由其组成。在尤其较佳具体实例中，聚合载体化合物由(R12C)-(R12C)二聚体、(WR12C)-(WR12C)二聚体或(CR12)-(CR12C)-(CR12)三聚体组成，其中二聚体(例如(WR12C))或三聚体(例如(CR12))中的个别肽元件经由-SH基团连接。
在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与聚乙二醇/肽聚合物复合或缔合，该聚乙二醇/肽聚合物包含HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO:272作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO:272作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO:273作为肽单体)及/或包含HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:273)的聚乙二醇/肽聚合物。
在其他具体实例中，组成物包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，其中至少一种核酸，较佳至少一种RNA与聚合载体及视需要与至少一种脂质组分复合或缔合，如WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1及WO2017/212009A1中所描述。在此情形下，WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1及WO2017/212009A1的揭示内容特此以引用的方式并入。
在尤其较佳具体实例中，(第一及/或第二组分的)聚合载体为肽聚合物，较佳如上文所定义的聚乙二醇/肽聚合物及脂质组分，较佳类脂质组分。
类脂质(lipidoid)(或类脂质(lipidoit))为类脂化合物，亦即具有类脂物理特性的两亲化合物。类脂质较佳为化合物，其包含两个或两个以上阳离子氮原子及至少两个亲脂性尾。相比于许多习知阳离子脂质，脂质可不含可水解键联基团，特定言之包含可水解酯、酰胺或氨基甲酸酯基的键联基团。类脂质的阳离子氮原子可为阳离子化或永久阳离子的，或两种类型的阳离子氮可存在于化合物中。在本发明的情形下，术语脂质视为涵盖类脂质。
在本发明的一些具体实例中，脂质可包含PEG部分。
在较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与聚合载体，较佳与如上文所定义的聚乙二醇/肽聚合物及类脂类组分复合或缔合。
适当地，类脂质为阳离子的，此意谓其可阳离子化或永久阳离子。在一个具体实例中，类脂质为可阳离子化的，亦即其包含一或多个可阳离子化氮原子，但无永久阳离子氮原子。在另一具体实例中，类脂质的阳离子氮原子中的至少一者为永久阳离子的。视需要，类脂质包含两个永久阳离子氮原子、三个永久阳离子氮原子或甚至四个或四个以上永久阳离子氮原子。
在较佳具体实例中，类脂质组分可为选自公布的PCT专利申请案WO2017/212009A1的第50-54页的表格中所提供的类脂质的任何一者、该表格中所提供的特定类脂质，及与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
在较佳具体实例中，类脂质组分可为选自3-C12-OH、3-C12-OH-cat、3-C12-酰胺、3-C12-酰胺一甲基、3-C12-酰胺二甲基、RevPEG(10)-3-C12-OH、RevPEG(10)-DLin-pA苯甲酸、3C12酰胺-TMA cat.,3C12酰胺-DMA、3C12酰胺-NH2、3C12酰胺-OH、3C12酯-OH、3C12酯-胺、3C12酯-DMA、2C12Amid-DMA、3C12-lin-amid-DMA、2C12-精子-amid-DMA或3C12-精子-amid-DMA(参见公布的PCT专利申请案WO2017/212009A1(第50-54页)的表格)。尤其较佳的是3-C12-OH或3-C12-OH-cat。
在较佳具体实例中，包含如上文所指定的类脂质的聚乙二醇/肽聚合物(例如3-C12-OH或3-C12-OH-cat)用于复合至少一种核酸以形成N/P比率为约0.1至约20、或约0.2至约15、或约2至约15、或约2至约12的复合物，其中N/P比率定义为阳离子肽或聚合物的碱基的氮原子与核酸的磷酸基团的摩尔比率。在彼情形下，公布的PCT专利申请案WO2017/212009A1的揭示内容，特定言的WO2017/212009A1的权利要求1至10，且与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
其他适合的类脂质可衍生自公布的PCT专利申请案WO2010/053572。特定言之，可衍生自公布的PCT专利申请案WO2010/053572的权利要求1至297的类脂质可用于本发明的情形下，例如并入如本文所描述的肽聚合物中，或例如并入脂质纳米粒子中(如下文所描述)。因此，公布的PCT专利申请案WO2010/053572的权利要求1至297及与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
LNP中的囊封/复合：
在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA及视需要至少一种其他核酸与一或多种脂质(例如阳离子脂质及/或中性脂质)复合、囊封、部分囊封或缔合，从而形成基于脂质的载体，诸如脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体。
脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体-并入的核酸(例如DNA或RNA)可完全或部分位于脂质层/膜内或与脂质层/膜的外部表面缔合的脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体的内部空间中。核酸并入脂质体/LNP中在本文中亦称为「囊封」，其中核酸，例如RNA完全含在脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体的内部空间内。将核酸并入脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体中的目的为保护核酸，较佳RNA免于可含有使核酸及/或引起核酸快速分泌的系统或受体降解的酶或化学物质或条件的环境。此外，将核酸，较佳RNA并入脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体中可促进核酸的吸收，且因此可增强核酸的治疗功效，例如编码抗原SARS-CoV-2(nCoV-2019)蛋白的RNA。因此，将核酸，例如RNA或DNA并入脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体中可尤其适合于冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗)，例如适合于肌内及/或皮内投予。
在此情形下，术语「复合的」或「缔合的」是指核酸与一或多种脂质在无共价结合的情况下基本上稳定地组合成更大的复合物或组合体。
术语「脂质纳米粒子」(亦称为「LNP」)并非受限于任何特定形态，且包括在将阳离子脂质及视需要一或多种其他脂质组合时产生的任何形态，例如在水性环境中及/或在核酸(例如RNA)存在下的任何形态。举例而言，脂质体、脂质复合物、脂复合体及其类似物在脂质纳米粒子(LNP)的范畴内。
脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体可以具有不同尺寸，诸如(但不限于)多层囊泡(MLV)，其直径可为数百纳米且可含有一系列由窄水性隔室分隔开的同心双层、小单细胞囊泡(SUV)，其直径可小于50nm，及直径可在50nm与500nm之间的大单层囊泡(LUV)。
本发明的LNP适合地表征为具有一或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水空间的微观囊泡。LNP的双层膜典型地由两亲媒性分子形成，诸如合成或天然来源的脂质，其包含空间分隔的亲水性及疏水性域。脂质体的双层膜亦可借由双染聚合物及界面活性剂(例如聚合物囊泡、非离子表面活性剂囊泡等)形成。在本发明的情形下，LNP典型地用以将至少一种核酸，较佳至少一种RNA输送至靶组织。
因此，在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)。较佳地，该LNP尤其适用于肌内及/或皮内投予。LNP典型地包含阳离子脂质及选自以下者的一或多种赋形剂：中性脂质、带电脂质、类固醇及共轭聚合物的脂质(例如聚乙二醇化脂质)。核酸(例如RNA、DNA)可囊封于LNP的脂质部分或经LNP的一些或整个脂质部分包封的水溶液空间中。核酸(例如RNA、DNA)或其一部分亦可与LNP缔合及复合。LNP可包含能够形成粒子以连接核酸或将一或多种核酸囊封于其中的任何脂质。较佳地，包含核酸的LNP包含一或多种阳离子脂质及一或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质及聚乙二醇化脂质。
较佳地，LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种聚合物共轭脂质，较佳为PEG脂质；
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％聚合物共轭脂质。
LNP的阳离子脂质可为阳离子化的，亦即当pH下降低于脂质的可电离基团的pK时其变为质子化的，但在较高pH值下逐渐地为更中性的。在低于pK的pH值下，脂质随后能够与带负电核酸缔合。在某些具体实例中，阳离子脂质包含在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。
此类脂质包括(但不限于)DSDMA、N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(亦称为N-((2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵及1,2-二油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基-N，N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻醇氧基-N,N-二甲氨基丙烷(γ-DLenDMA)、98N12-5、1,2-二亚油醇氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啡啉基(3morpholinopropane)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油醇-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油醇硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(基于咪唑)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2,2-二亚油醇-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)HGT4003、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)(N-methylpiperazino)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油醇氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油酰氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油醇侧氧基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧丙烷(DLin-EG-DM A)、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物，(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二恶英(dioxol)-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(MC3)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二恶英-5-胺))、1,1'-(2-(4-((2-双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪(piperazin)-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4,7,13-三(3-侧氧基-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N 16-二十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、
Figure GDA0003858923850001351
(包含来自GIBCO/BRL，Grand Island,N.Y.的DOTMA及1,2-二油酰基-sn-3磷酰乙醇胺(DOPE)的可商购的阳离子脂质体)；
Figure GDA0003858923850001352
(包含来自GIBCO/BRL的N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)及(DOPE)的可商购的阳离子脂质体)；及
Figure GDA0003858923850001353
(包含来自Promega Corp.,Madison,Wis.的乙醇中的双十八烷基酰氨基甘胺酰羧基精胺(DOGS)的可商购的阳离子脂质)或前述中的任一者的任何组合。其他适用于本发明的组成物及方法的阳离子脂质包括国际专利公开案WO2010/053572(及特定言之，第[00225]段所描述的CI 2-200)及WO2012/170930中所描述的阳离子脂质，两者均以引用的方式并入本文中，HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见US20150140070A1)。
在具体实例中，阳离子脂质可为氨基脂质。
代表性氨基脂质包括(但不限于)：1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3(N-吗啡啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基侧氧基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)及2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊烷(DLin-KC2-DMA)；二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在具体实例中，阳离子脂质可为氨基醇类脂质。
可用于本发明中的氨基醇类脂质可借由美国专利第8,450,298号中所描述的方法制备，该专利以全文引用的方式并入本文中。适合的(可电离)脂质亦可以为表1、2及3中所揭示且如WO2017/075531A1的权利要求1-24中所定义的化合物，其以引用的方式并入本文中。
在另一具体实例中，适合的脂质亦可以为如WO2015/074085A1中所揭示的化合物(亦即ATX-001至ATX-032或如权利要求1-26中所指定的化合物)，美国申请第61/905,724号及第15/614,499号或美国专利第9,593,077号及第9,567,296号以全文引用的方式并入本文中。
在其他具体实例中，适合的阳离子脂质亦可以为如WO2017/117530A1中所揭示的化合物(亦即脂质13、14、15、16、17、18、19、20或如权利要求中所指定的化合物)，其以全文引用的方式并入本文中。
在较佳具体实例中，可电离或阳离子脂质亦可选自WO2018/078053A1中所揭示的脂质(亦即，衍生自WO2018/078053A1的式I、II及III的脂质，或如WO2018/078053A1的权利要求1至12中所指定的脂质)，WO2018/078053A1的揭示内容以全文引用的方式并入本文中。在彼情形下，在WO2018/078053A1的表7中所揭示的脂质(例如衍生自式I-1至I-41的脂质)及在WO2018/078053A1的表8中所揭示的脂质(例如衍生自式II-1至II-36的脂质)可适当地用于本发明的情形下。因此，WO2018/078053A1的式I-1至式I-41及式II-1至式II-36及与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
在较佳具体实例中，阳离子脂质可衍生自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的式III。因此，WO2018/078053A1的式III及与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
在尤其较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳组成物的至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成LNP，其中LNP的阳离子脂质是选自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的表9的结构III-1至III-36。因此，WO2018/078053A1的III-1至III-36及与其相关的特定揭示内容特此以引用的方式并入。
在第二态样的尤其较佳具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成LNP，其中LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
Figure GDA0003858923850001371
如本文所适当使用的式III-3的脂质具有化学术语((4-羟基丁基)氮二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)，亦称为ALC-0315。
在某些具体实例中，如本文所定义的阳离子脂质，更佳阳离子脂质化合物III-3，以相对于LNP的总脂质含量约30至约95摩尔％的量存在于LNP中。若将多于一种阳离子脂质并入LNP内，则此等百分比应用于经合并的阳离子脂质。
在具体实例中，阳离子脂质以约30至约70摩尔％的量存在于LNP中。在一个具体实例中，阳离子脂质以约40至约60摩尔％，诸如分别为约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔％的量存在于LNP中。在具体实例中，阳离子脂质以约47至约48摩尔％，诸如分别约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、50.0摩尔％的量存在于LNP中，其中47.7摩尔％尤其较佳。
在一些具体实例中，阳离子脂质以存在于LNP中的总脂质的约20mol％至约70或75mol％或约45至约65mol％或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或约70mol％的比存在。在其他具体实例中，LNP包含以摩尔计约25％至约75％的阳离子脂质，例如以摩尔计约20至约70％、约35至约65％、约45至约65％、约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％(基于脂质纳米粒子中的脂质的100％总摩尔)。在一些具体实例中，阳离子脂质与核酸的比(例如编码RNA或DNA)为约3至约15，诸如约5至约13或约7至约11。
其他适合的(阳离子或可电离)脂质揭示于WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354，美国专利第7,893,302号、7,404,969号、8,283,333号、8,466,122号及8,569,256号及美国专利公开案第US2010/0036115号、US2012/0202871号、US2013/0064894号、US2013/0129785号、US2013/0150625号、US2013/0178541号、US2013/0225836号、US2014/0039032号及WO2017/112865号。在彼情形下，特定与适合于LNP中的(阳离子)脂质相关的WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO 2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354，美国专利第7,893,302号、7,404,969号、8,283,333号、8,466,122号及8,569,256号及美国专利公开案第US2010/0036115号、US2012/0202871号、US2013/0064894号、US2013/0129785号、US2013/0150625号、US2013/0178541号、US2013/0225836号及US2014/0039032号及WO2017/112865号的揭示内容特此以引用的方式并入。
在具体实例中，如本文中所定义的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化基团，使得脂质在处于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电且在第二pH下，较佳处于或高于生理pH下为中性的。当然，应理解随pH变化而添加或去除质子为均衡过程，且参考带电或中性脂质是指主导性物种的性质且不要求所有脂质必须以带电或中性形式存在。具有多于一个可质子化或可去质子化基团或为两性离子的脂质不经排除且可同样地适用于本发明的情形下。在一些具体实例中，可质子化脂质具有在约4至约11范围内的可质子化基团的pKa，例如约5至约7的pKa。
LNP可以包含两种或两种以上(不同)如本文所定义的阳离子脂质。阳离子脂质可经选择以提供不同有利特性。举例而言，在特性，诸如胺pKa、化学稳定性、循环中的半衰期、组织的半衰期、组织的净积累或毒性方面不同的阳离子脂质可用于LNP中。特定言之，阳离子脂质可经选择以使得经混合的LNP的特性比个别脂质的单一LNP的特性更合乎需要。
持久阳离子脂质或类脂质的量可考虑核酸负荷的量来选择。在一个具体实例中，此等量经选择以便导致纳米粒子或组成物的N/P比率在约0.1至约20范围内。在此背景下，将N/P比率定义为脂质或类脂质的含有碱性氮基团的氮原子(「N」)与用作负荷的核酸的磷酸盐基团(「P」)的摩尔比率。N/P比率可基于例如1ug RNA典型地含有约3nmol磷酸盐残基来计算，其限制条件为RNA展现碱基的统计分布。脂质或类脂质的「N」值可基于其分子量以及持久阳离子及(若存在)可阳离子化基团的相对含量来计算。
LNP活体内特征及行为可借由将亲水性聚合物涂层(例如聚乙二醇(PEG))添加至LNP表面以赋予立体稳定化来修饰。此外，LNP可以借由将配位体(例如抗体、肽及碳水化合物)连接至其表面或至经连接PEG链的末端(例如经由聚乙二醇化脂质或聚乙二醇化胆固醇)而用于专一性靶向。
在一些具体实例中，LNP包含聚合物共轭脂质。术语「聚合物共轭脂质」是指包含脂质部分及聚合物部分二者的分子。聚合物共轭脂质的实施例为聚乙二醇化脂质。术语「聚乙二醇化脂质」是指包含脂质部分及聚乙二醇部分二者的分子。聚乙二醇化脂质为此项技术中已知且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-s-DMG)及其类似者。
如本文所定义的聚合物共轭脂质，例如PEG脂质可充当聚集减少脂质。
在某些具体实例中，LNP包含稳定脂质，其为聚乙二醇脂质(聚乙二醇化脂质)。适合的聚乙二醇脂质包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的脑酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-C20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。代表性聚乙二醇脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA及PEG-s-DMG。在一个具体实例中，聚乙二醇脂质为N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)胺甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一较佳具体实例中，聚乙二醇脂质为PEG-2000-DMG。在一个具体实例中，聚乙二醇脂质为PEG-c-DOMG。在其他具体实例中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化吲哚酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2',3'-二(十四烷氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯)(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化脑酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3二(十四烷氧基)丙基)胺甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺甲酸酯。
在较佳具体实例中，聚乙二醇化脂质较佳衍生自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的式(IV)。因此，衍生自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的式(IV)的聚乙二醇化脂质及与其相关的各别揭示内容特此以引用的方式并入。
在尤其较佳具体实例中，组成物的至少一种核酸(例如RNA或DNA)与一或多种脂质复合，从而形成LNP，其中LNP包含聚乙二醇化脂质，其中PEG脂质较佳衍生自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的式(IVa)。因此，衍生自公布的PCT专利申请案WO2018/078053A1的式(IVa)的聚乙二醇化脂质及与其相关的各别揭示内容特此以引用的方式并入。
在尤其较佳具体实例中，至少一种核酸，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP包含聚乙二醇化脂质/PEG脂质。较佳地，该PEG脂质具有式(IVa)：
Figure GDA0003858923850001411
其中n具有30至60范围内的平均值，诸如约30±2、32±2、34±2、36±2、38±2、40±2、42±2、44±2、46±2、48±2、50±2、52±2、54±2、56±2、58±2或60±2。在最佳具体实例中，n为约49。在其他较佳态样中，该PEG脂质具有式(IVa)，其中n为经选择以使得PEG脂质的平均分子量为约2000g/mol至约3000g/mol或约2300g/mol至约2700g/mol，甚至更佳为约2500g/mol的整数。
如本文所适当使用的式IVa的脂质具有化学术语2[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺，亦称为ALC-0159。
适用于该情形下的PEG脂质的其他实施例提供于US2015/0376115A1及WO2015/199952中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些具体实例中，LNP包括小于按LNP中的脂质的总摩尔计约3、2或1摩尔％的PEG或PEG修饰的脂质。在其他具体实例中，LNP包含按摩尔计约0.1％至约20％的PEG修饰的脂质，例如按摩尔计(按LNP中的脂质的100％总摩尔计)约0.5至约10％、约0.5至约5％、约10％、约5％、约3.5％、约3％、约2,5％、约2％、约1.5％、约1％、约0.5％或约0.3％。在较佳具体实例中，LNP包含按摩尔计约1.0％至约2.0％的PEG修饰的脂质，例如约1.2至约1.9％、约1.2至约1.8％、约1.3至约1.8％、约1.4至约1.8％、约1.5至约1.8％、约1.6至约1.8％，尤其是约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％，最佳为1.7％(按LNP中的脂质的100％总摩尔计)。在多个具体实例中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比范围为约100:1至约25:1。
在较佳具体实例中，LNP包含一或多种额外脂质，其在粒子形成期间或在制造过程期间稳定粒子形成(例如中性脂质及/或一或多种类固醇或类固醇类似物)。
在第二态样的较佳具体实例中，至少一种核酸，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP包含一或多种中性脂质及/或一或多种类固醇或类固醇类似物。
适合的稳定脂质包括中性脂质及阴离子脂质。术语「中性脂质」是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的许多脂质物种中的任一者。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、脑酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂及脑苷脂。
在第二态样的具体实例中，LNP包含一或多种中性脂质，其中中性脂质是选自包含以下的群：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰丙三醇(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)及二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰磷基脂酰乙醇胺(SOPE)及1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)或其混合物。
在一些具体实例中，LNP包含选自以下者的中性脂质：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM。在各种具体实例中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比范围为约2:1至约8:1。
在较佳具体实例中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。阳离子脂质与DSPC的摩尔比可在约2:1至约8:1的范围内。
在较佳具体实例中，类固醇为胆固醇。阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可在约2:1至约1:1的范围内。在一些具体实例中，胆固醇可经聚乙二醇化。
固醇可以为脂质粒子的约10mol％至约60摩尔％或约25mol％至约40mol％。在一个具体实例中，固醇为脂质粒子中存在的总脂质的约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或约60mol％。在另一具体实例中，LNP包括按摩尔计约5％至约50％的固醇，例如按摩尔计(基于脂质纳米粒子中的脂质的100％总摩尔)约15％至约45％、约20％至约40％、约48％、约40％、约38.5％、约35％、约34.4％、约31.5％或约31％。
较佳地，脂质纳米粒子(LNP)包含：(a)至少一种核酸，较佳第一态样的至少一种RNA、(b)阳离子脂质、(c)聚集还原剂(诸如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)、(d)视需要选用的非阳离子脂质(诸如中性脂质)及(e)视需要选用的固醇。
在一些具体实例中，阳离子脂质(如上文所定义)、非阳离子脂质(如上文所定义)、胆固醇(如上文所定义)及/或PEG修饰的脂质(如上文所定义)可以各种相对摩尔比组合。举例而言，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与聚乙二醇化脂质的比可在约30-60:20-35:20-30:1-15之间，或分别在约40:30:25、50:25:20:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比下，或在约50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5或40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比下。
在一些具体实例中，LNP包含式(III)的脂质、至少一种核酸，较佳至少一种如本文所定义的RNA、中性脂质、类固醇及聚乙二醇化脂质。在较佳具体实例中，式(III)的脂质为脂质化合物III-3(ALC-0315)，中性脂质为DSPC，类固醇为胆固醇，且聚乙二醇化脂质为式(IVa)化合物(ALC-0159)。
在第二态样的较佳具体实例中，LNP基本上由以下者组成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；及(iv)PEG脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，呈约20-60％阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％固醇:0.5-15％PEG脂质的摩尔比。
在尤其较佳具体实例中，至少一种核酸，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP包含：
(i)至少一种如本文所定义的阳离子脂质，较佳式(III)的脂质，更佳脂质III-3(ALC-0315)；
(ii)至少一种如本文所定义的中性脂质，较佳1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种如本文所定义的类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种如本文所定义的PEG脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，较佳为或衍生自式(IVa)的聚乙二醇化脂质(ALC-0159)。
在尤其较佳具体实例中，至少一种核酸、较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP以约20％-60％阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％固醇；0.5-15％PEG脂质的摩尔比包含(i)至(iv)。
在一个较佳具体实例中，脂质纳米粒子包含：具有式(III)的阳离子脂质及/或具有式(IV)的PEG脂质；视需要选用的中性脂质，较佳1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；及视需要选用的类固醇，较佳胆固醇，其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比视需要在约2:1至8:1范围内，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比视需要在约2:1至1:1范围内。
在尤佳较佳具体实例中，第二态样的包含至少一种核酸(较佳至少一种RNA)的组成物包含脂质纳米粒子(LNP)，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7的摩尔比(亦即阳离子脂质(较佳脂质III-3(ALC-0315)的比例(mol％))、DSPC、胆固醇及PEG脂质(较佳式(IVa)的PEG脂质，其中n＝49，甚至更佳式(IVa)的PEG脂质，其中n＝45(ALC-0159))；溶解于乙醇)。
最佳地，第二态样的组成物包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQ ID NO:163的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，该核酸序列调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45(ALC-0159))。在此较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在另一最佳具体实例中，第二态样的组成物包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQID NO:149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，该核酸序列调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或n＝45(ALC-0159))。在此较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在另一最佳具体实例中，第二态样的组成物包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQID NO:24837的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，该核酸序列调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45)(ALC-0159)。在此较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在其他较佳具体实例中，第二态样的组成物包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQID NO:23311、23531或24851的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，该核酸序列调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45)(ALC-0159)。在此较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在其他较佳具体实例中，第二态样的组成物包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQID NO:23310、23530、23313或23533的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，该核酸序列调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45)(ALC-0159)。在此较佳具体实例中，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在具体实例中，当组成物为如上文所定义的多价组成物时，可分别调配多价组成物的核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，较佳分别调配于脂质体或LNP中。适当地，多价组成物的RNA物种分别调配于摩尔比为大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7的LNP中(mol％)阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45)。用于多价组成物的核酸物种较佳如上文所定义选择(参见「本发明的多价组成物」章节)。
在其中组成物为如上文所定义的多价组成物的具体实例中，可将多价组成物的核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种共调配，较佳共调配于脂质体或LNP中。适当地，多价组成物的RNA物种共调配于摩尔比为大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7的LNP中(mol％)阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45)。
用于多价组成物的核酸物种较佳如上文所定义选择(参见「本发明的多价组成物」章节)。
脂质纳米粒子中的核酸的总量可变化且视例如核酸与总脂质w/w比而定义。在本发明的一个具体实例中，核酸，特定言的RNA与总脂质的比小于0.06w/w，较佳在0.03w/w与0.04w/w之间。
在一些具体实例中，脂质纳米粒子(LNP)仅由三种脂质组分组成，亦即咪唑胆固醇酯(ICE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。
在一个具体实例中，组成物的脂质纳米粒子包含阳离子脂质、类固醇；中性脂质；及聚合物共轭脂质，较佳聚乙二醇化脂质。较佳地，聚合物共轭脂质较佳为聚乙二醇化脂质或PEG脂质。在特定具体实例中，根据下式，脂质纳米粒子包含类似于阳离子脂质
Figure GDA0003858923850001471
SS-EC的阳离子脂质(先前名称：SS-33/4PE-15；NOF公司,Tokyo,Japan)。
Figure GDA0003858923850001472
如下文进一步描述，彼等脂质纳米粒子称为「GN01」。
此外，在特定具体实例中，GN01脂质纳米粒子包含类似于结构1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)的中性脂质：
Figure GDA0003858923850001481
此外，在特定具体实例中，GN01脂质纳米粒子包含聚合物共轭脂质，较佳聚乙二醇化脂质，其为具有以下结构的1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)：
Figure GDA0003858923850001482
如此项技术中所使用，将「DMG-PEG 2000」视为约97:3比率的1,2-DMG PEG2000与1,3-DMG PEG2000的混合物。
因此，根据较佳具体实例中的一者的GN01脂质纳米粒子(GN01-LNP)包含SS-EC阳离子脂质、中性脂质DPhyPE、胆固醇及聚合物共轭脂质(聚乙二醇化脂质)1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
在较佳具体实例中，GN01 LNP包含：
(a)阳离子脂质SS-EC(先前名称：SS-33/4PE-15；NOF公司,Tokyo,Japan)量为45-65mol％；
(b)胆固醇的量为25-45mol％；
(c)DPhyPE的量为8-12mol％；及
(d)PEG-DMG 2000的量为1-3mol％；
各量相对于GN01脂质纳米粒子的所有脂质赋形剂的总摩尔量计。
在另一较佳具体实例中，如本文所描述的GN01脂质纳米粒子包含59mol％阳离子脂质、10mol％中性脂质、29.3mol％类固醇及1.7mol％聚合物共轭脂质，较佳聚乙二醇化脂质。在最佳具体实例中，如本文所描述的GN01脂质纳米粒子包含59mol％阳离子脂质SS-EC、10mol％DPhyPE、29.3mol％胆固醇及1.7mol％DMG-PEG 2000。
阳离子脂质相对于GN01脂质纳米粒子中的核酸的量亦可表现为重量比(缩写为f.e.「m/m」)。举例而言，GN01脂质纳米粒子包含至少一种核酸，较佳至少一种RNA的量以便达成在约20至约60，或约10至约50范围内的脂质与RNA重量比。在其他具体实例中，阳离子脂质与核酸或RNA之比为约3至约15，诸如约5至约13、约4至约8或约7至约11。在本发明的极佳具体实例中，总脂质/RNA质量比为约40或40，亦即约40或40倍质量过量以确保RNA囊封。另一较佳RNA/脂质比在约1与约10、约2与约5、约2与约4之间，或较佳约3。
此外，可考虑诸如RNA化合物的核酸负荷的量选择阳离子脂质的量。在一个具体实例中，N/P比率可以在约1至约50范围内。在另一具体实例中，范围为约1至约20、约1至约10、约1至约5。在一个较佳具体实例中，选择此等量以便产生N/P比率在约10至约20范围内的GN01脂质纳米粒子或组成物。在其他极佳具体实例中，N/P为14(亦即14倍摩尔过量的正电荷以确保核酸囊封)。
在较佳具体实例中，GN01脂质纳米粒子包含59mol％阳离子脂质
Figure GDA0003858923850001491
SS-ECC(前者名称：如自实施例章节显而易见的SS-33/4PE-15；NOF公司,Tokyo,Japan)、29.3mol％胆固醇作为类固醇、10mol％DPhyPE作为中性脂质/磷脂及1.7mol％DMG-PEG2000作为聚合物共轭脂质。与使用DPhyPE有关的另一本发明优势为由于其庞大的尾而具有高融合性能力，由此其能够在高水准下与核内体脂质融合。对于「GN01」，N/P(脂质与核酸，例如RNA摩尔比率)较佳为14，且总脂质/RNA质量比较佳为40(m/m)。
在其他具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP包含：
I 至少一种阳离子脂质；
Ii 至少一种中性脂质；
Iii至少一种类固醇或类固醇类似物；及
Iiii至少一种如本文所定义的PEG脂质，
其中阳离子脂质为DLin-KC2-DMA(50mol％)或DLin-MC3-DMA(50mol％)，中性脂质为DSPC(10mol％)，PEG脂质为PEG-DOMG(1.5mol％)且结构性脂质为胆固醇(38.5mol％)。
在其他具体实例中，至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种RNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中LNP包含处于mol％50/38.5/10/1.5的SS15/胆固醇/DOPE(或DOPC)/DSG-5000。
在其他具体实例中，本发明的核酸可调配于脂质体中，例如调配于如WO2019/222424、WO2019/226925、WO2019/232095、WO2019/232097或WO2019/232208中所描述的脂质体中，与脂质体或基于脂质的载体分子相关的WO2019/222424、WO2019/226925、WO2019/232095、WO2019/232097或WO2019/232208的揭示内容特此以引用的方式并入。
在各种具体实例中，适合地囊封本发明的至少一种核酸的LNP具有约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm的平均直径且实质上是无毒的。如本文所使用，平均直径可由如借由作为此项技术中通常已知的动态光散射所测定的z平均值表示。
纳米粒子的多分散性指数(PDI)典型地在0.1至0.5范围内。在特定具体实例中，PDI低于0.2。典型地，PDI借由动态光散射来测定。
在本发明的另一较佳具体实例中，脂质纳米粒子的流体动力直径分别在约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm、或约60nm至约120nm范围内。
在本发明的另一较佳具体实例中，脂质纳米粒子的流体动力直径分别在约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm、或约60nm至约120nm范围内。
在其中在组成物中包含超过一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个)本发明的核酸物种的具体实例中，所述超过一种或所述多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个)本发明的核酸物种可在一或多种脂质内复合，从而形成包含超过一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个)不同的核酸物种的LNP。
根据较佳具体实例，较佳地囊封或包含RNA的基于脂质的载体借由至少一个纯化步骤，较佳借由TFF的至少一个步骤及/或澄清的至少一个步骤及/或至少一个过滤步骤来纯化。此纯化尤其引起组成物中乙醇的量减少，该乙醇的量已用于脂质调配物。
在此情形下，尤其较佳的是，组成物在纯化之后包含小于约500ppM乙醇，较佳小于约50ppM乙醇，更佳小于约5ppM乙醇。
在具体实例中，本文所描述的LNP可经冻干以改良调配物及/或核酸，较佳RNA的储存稳定性。在具体实例中，本文所描述的LNP可经喷雾干燥以改良调配物及/或核酸的储存稳定性。用于冻干及或喷雾干燥的冻干保护剂可选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、聚葡萄糖及菊糖。较佳冻干保护剂为蔗糖，视需要包含其他冻干保护剂。其他较佳冻干保护剂为海藻糖，视需要包含其他冻干保护剂。
因此，组成物，例如包含LNP的组成物(例如根据WO2016/165831或WO2011/069586)，得到如本文所定义的温度稳定干燥核酸(粉末)组成物(例如RNA或DNA)。组成物，例如包含LNP的组成物亦可使用喷雾干燥或冷冻干燥(例如根据WO2016/184575或WO2016/184576)干燥，得到如本文所定义的温度稳定组成物(粉末)。
因此，在较佳具体实例中，组成物为干燥组成物。
如本文所使用的术语「干燥组成物」应理解为如上文所定义已冻干或喷雾干燥或冷冻干燥以获得例如包含LNP复合的RNA(如上文所定义)的温度稳定干燥组成物(粉末)的组成物。
根据其他具体实例，第二态样的组成物可包含至少一种佐剂。
适当地，较佳添加佐剂以增强组成物的免疫刺激特性。
如本文所使用的术语「佐剂」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指可修饰(例如增强)其他药剂的功效或适合于支持组成物投予及递送的药理学及/或免疫药剂。术语「佐剂」是指广泛范围的物质。典型地，此等物质能够增加抗原的免疫原性。举例而言，佐剂可由先天性免疫系统辨识且例如可引发先天性免疫反应(亦即非专一性免疫反应)。「佐剂」典型地不诱发适应性免疫反应。在本发明的情形下，佐剂可增强由核酸提供的抗原肽或蛋白的功效。在彼情形下，至少一种佐剂可选自熟习此项技术者已知且适合于本发明情况(亦即支持个体(例如人类个体)中的免疫反应的诱导)的任何佐剂。
因此，第二态样的组成物可包含至少一种佐剂，其中该至少一种佐剂可适合地选自WO2016/203025中所提供的任何佐剂。WO2016/203025的权利要求2至17中任一项所揭示的佐剂，较佳WO2016/203025的权利要求17中所揭示的佐剂是尤其适合的，与其相关的特定内容特此以引用的方式并入。佐剂可适当地使用且包含于第二态样的组成物或第四态样的疫苗中，例如减少针对所编码蛋白的足够免疫反应所需的核酸量及/或改良组成物/用于治疗的疫苗/老年人的疫苗接种。在冠状病毒组成物或疫苗的情形下(尤其针对包含第三态样的多肽的组成物)的适合的佐剂可为Toll样受体9(TLR9)促效剂佐剂、CpG 1018TM。
第二态样的组成物可包含(除本文所指定的组分)至少一个其他组分，该组分可选自由以下者组成的群：其他抗原(例如以肽或蛋白的形式，较佳衍生自冠状病毒)或其他抗原编码核酸(较佳编码肽或蛋白，较佳衍生自冠状病毒)；其他免疫治疗剂；一或多种辅助物质(细胞介素，诸如单核球激素、淋巴介质、介白素或趋化因子)；或任何其他化合物，其由于其与人类Toll样受体的结合亲和力(作为配位体)而已知为免疫刺激的；及/或佐剂核酸，较佳免疫刺激性RNA(isRNA)(例如CpG-RNA等)。
在具体实例中，囊封RNA的包含基于脂质的载体的组成物在储存为液体之后稳定，例如在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定至少2周。
在一些态样中，如本文所使用，「稳定」是指包含囊封RNA的基于脂质的载体的液体组成物，其中各种生理化学参数的量测值在储存之后的限定范围内。在一个具体实例中，分析包含囊封RNA的基于脂质的载体的液体组成物以根据各种参数评估稳定性。适合的稳定性参数包括(但不限于)RNA完整性、Z平均粒度、多分散性指数(PDI)、液体组成物中游离RNA的量、RNA的囊封效率(以与基于脂质的载体的百分比并入的RNA的比例)、囊封RNA、pH、重量渗透浓度或浊度的基于脂质的载体的形状及形态。此外，「稳定」是指包含囊封RNA的基于脂质的载体的液体组成物，其中各种功能性参数的量测值在储存之后的限定范围内。在一个具体实例中，分析包含囊封RNA的基于脂质的载体的液体组成物以评估液体组成物的效力，包括例如所编码的肽或蛋白的表现、专一性抗体效价的诱导、中和抗体效价的诱导、T细胞的诱导、液体组成物的反应原性，包括例如先天性免疫反应的诱导等。
在较佳具体实例中，术语「稳定性」是指RNA完整性。
在各种具体实例中，具体实例的组成物定义为温度稳定的液体医药组成物且包含囊封RNA的某一浓度的基于脂质的载体，其可为达成液体组成物的温度稳定性的适合的特征。不希望受到理论束缚，某种浓度的RNA在以液体形式储存时对组成物的温度稳定性可具有有利影响。
在具体实例中，组成物中RNA的浓度在约10μg/ml至约10mg/ml范围内。在具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约100μg/ml至约5mg/ml范围内。在具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约100μg/ml至约2mg/ml范围内。在具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约100μg/ml至约1mg/ml范围内。在具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约1mg/ml范围内。在具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约100μg/ml至约500μg/ml范围内。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约500μg/ml范围内。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约600μg/ml范围内。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约700μg/ml范围内。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约800μg/ml范围内。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度在约200μg/ml至约900μg/ml范围内。
在具体实例中，组成物中的RNA浓度为例如约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1mg/ml。在较佳具体实例中，液体组成物中RNA的浓度为至少100μg/ml，较佳至少200μg/ml，更佳至少500μg/ml。
在各种具体实例中，医药组成物的RNA具有某一RNA完整性，其可为达成液体组成物的温度稳定性的适合特征。
术语「RNA完整性」通常描述完整RNA序列是否存在于液体组成物中。低RNA完整性尤其可归因于RNA降解、RNA裂解、RNA的不正确或不完全化学合成、不正确碱基配对、经修饰的核苷酸的整合或已经整合的核苷酸的修饰、缺乏加帽或不完全加帽、缺乏多腺苷酸化或不完全多腺苷酸化、或不完全RNA试管内转录。RNA为可容易降解的脆弱分子，其可例如由温度、核糖核酸酶、pH或其他因子(例如亲核攻击、水解等)所引起，其可降低RNA完整性且因此降低RNA的功能性。
熟习此项技术者可以自多种不同层析或电泳方法中选择以测定RNA完整性。层析及电泳方法为此项技术中熟知的。在使用层析法(例如RP-HPLC)的情况下，RNA的完整性的分析可基于测定对应层析图中的全长RNA的峰面积(或「峰值下的面积」)。峰面积可借由评估侦测器系统的讯息的任何适合的软体测定。测定峰面积的过程亦称为整合。表示全长RNA的峰面积典型地相对于相应样品中的总RNA的峰面积设定。RNA完整性可以％RNA完整性表现。
在本发明的态样的情况下，RNA完整性可使用分析型(RP)HPLC测定。典型地，包含囊封RNA的基于脂质的载体的液体组成物的测试样品可用清洁剂(例如约2％Triton X100)处理以解离基于脂质的载体且释放囊封的RNA。所释放的RNA可基本上根据制造商的说明书使用适合的结合化合物，例如Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)捕获。制备RNA样品之后，可进行分析型(RP)HPLC以测定RNA的完整性。典型地，为了测定RNA完整性，RNA样品可使用例如注射用水(WFI)稀释至0.1g/l的浓度。约10μl经稀释的RNA样品可注射至HPLC管柱(例如单体聚(苯乙烯-二乙烯苯)基质)中。可使用标准条件进行分析型(RP)HPLC，举例而言：梯度1:缓冲液A(0.1M TEAA(pH 7.0))；缓冲液B(含有25％乙腈的0.1MTEAA(pH 7.0))。以30％缓冲液B开始，梯度在2min内延伸至32％缓冲液B，随后在15分钟内以1ml/min的流动速率延伸至55％缓冲液B。HPLC层析图典型地在260nm的波长下记录。所获得的层析图可使用软体评估且相对峰面积可以百分比(％)测定，如此项技术中通常已知。相对峰面积指示具有100％RNA完整性的RNA的量。由于注射至HPLC中的RNA的量典型地为已知的，因此相对峰面积的分析提供关于RNA完整性的资讯。因此，若例如100ng RNA已全部注射，且100ng测定为相对峰面积，则RNA完整性将为100％。若例如相对峰面积将对应于80ng，则RNA完整性将为80％。因此，在本发明的情形下的RNA完整性使用分析型HPLC，较佳分析型RP-HPLC测定。
在某些具体实例中，具体实例的药物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。举例而言，在至少约5℃下以液体形式储存约两周、三周、一个月、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年之后，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA保持完整。在一些态样中，具体实例的温度稳定的液体药物在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少约两周包含至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％的完整RNA。在其他态样中，在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少1个月，具体实例的温度稳定的液体药物包含至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％的完整RNA。在某些态样中，在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年，具体实例的温度稳定的液体药物包含至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％的完整RNA。在一些特定态样中，在约5℃的温度下以液体形式储存约两周之后，具体实例的温度稳定的液体药物包含至少约80％的完整RNA。
在某些具体实例中，组成物的RNA的RNA完整性在约40％至约100％范围内。在具体实例中，RNA的RNA完整性在约50％至约100％范围内。在具体实例中，RNA的RNA完整性在约60％至约100％范围内。在具体实例中，RNA的RNA完整性在约70％至约100％范围内。在具体实例中，RNA完整性为例如约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。RNA适合地使用分析型HPLC，较佳分析型RP-HPLC测定。
在较佳具体实例中，组成物的RNA的RNA完整性为至少约50％，较佳至少约60％，更佳至少约70％，最佳至少约80％或约90％。RNA适合地使用分析型HPLC，较佳分析型RP-HPLC测定。
在各种具体实例中，医药组成物的核酸(例如RNA)不超过某一比例的游离RNA，其可为达成液体组成物的温度稳定性的适合特征。不希望受理论所束缚，液体组成物中的游离RNA随着囊封于基于脂质的载体中的RNA而更易降解。
在某些态样中，具体实例的组成物包含RNA。在此情形下，术语「游离RNA」或「非复合的RNA」或「未经囊封的RNA」包含未囊封于如本文所定义的基于脂质的载体中的RNA分子。在调配液体组成物期间(例如在将RNA囊封成基于脂质的载体期间)，游离RNA可表示污染或杂质。大部分未囊封或游离RNA亦可为用于使组成物的基于脂质的载体不稳定(例如在储存组成物时)的指示符。举例而言，在液体组成物中可侦测的游离RNA可在储存期间增加，其可用作测定组成物的温度稳定性的特征。
熟习此项技术者可以自用于测定液体组成物中游离RNA的游离核酸的量及/或比例的多种不同方法选择。液体组成物中的游离RNA可借由层析法(例如AEX、SEC)或借由使用结合组成物中的游离RNA的探针(例如染料)来测定。在本发明的情形下，游离RNA或未经囊封的RNA的量可使用基于染料的分析测定。可用于测定游离RNA的量及/或比例的适合的染料包含
Figure GDA0003858923850001571
Figure GDA0003858923850001572
染料、
Figure GDA0003858923850001573
染料、
Figure GDA0003858923850001574
RNA染料、
Figure GDA0003858923850001575
RNA染料、Quant-iTTMRNA染料、
Figure GDA0003858923850001576
染料、
Figure GDA0003858923850001577
染料。此类染料适合于区分游离RNA与囊封的RNA。可使用由限定量的游离RNA或囊封的RNA组成的参考标准物且如供应商的说明书所建议与相应试剂(例如
Figure GDA0003858923850001578
试剂(激发500nm/排放525nm))混合。典型地，根据制造商的说明书使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂来定量液体组成物的游离RNA。在本发明的情形下的游离RNA的比例典型地使用RiboGreen分析来测定。
在具体实例中，组成物包含游离核酸，诸如约30％至约0％范围内的游离RNA。在具体实例中，液体组成物包含约20％游离RNA(及约80％囊封的RNA)、约15％游离RNA(及约85％囊封的RNA)、约10％游离RNA(及约90％囊封的RNA)或约5％游离RNA(及约95％囊封的RNA)。在较佳具体实例中，液体组成物包含小于约20％游离RNA，较佳小于约15％游离RNA，更佳小于约10％游离RNA，最佳小于约5％游离RNA。
在包含RNA核酸的态样中，术语「囊封的RNA」包含囊封于如本文所定义的基于脂质的载体中的RNA分子。在本发明的情形下的囊封的RNA的比例典型地使用RiboGreen分析来测定。
因此，在具体实例中，液体组成物中约70％至约100％的RNA囊封于基于脂质的载体中。在具体实例中，液体组成物包含约80％囊封的RNA(及约20％游离RNA)、约85％囊封的RNA(及约15％游离RNA)、约90％囊封的RNA(及约10％游离RNA)或约95％囊封的RNA(及约5％游离RNA)。
在较佳具体实例中，液体组成物中所包含的80％核酸(例如RNA)经囊封，较佳85％包含于组成物中的RNA经囊封，更佳90％包含于组成物中的RNA经囊封，最佳95％包含于组成物中的RNA经囊封。
在各种具体实例中，医药组成物(特定言之组成物的RNA)不超过一定量的二价阳离子，其可为达成液体组成物的温度稳定性的适合特征。二价阳离子，例如二价金属离子(例如Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Pb2+)可在以液体形式储存期间引起囊封于基于脂质的载体中的RNA的水解。
在一些态样中，组成物的RNA典型地可借由(线性)DNA模板的RNA试管内转录(IVT)产生。常见RNA试管内转录缓冲液包含大量MgCl2(例如5mM、15mM或更多)，其为RNA聚合酶的辅助因子。因此，所获得的试管内转录的RNA可包含Mg2+离子作为污染。在RNA试管内转录之后，DNA模板典型地借助于DNA酶移除。用于DNA酶消化的常见缓冲液包含大量CaCl2(例如1mM、5mM或更多)，其为DNA酶的辅助因子。因此，所获得的试管内转录的RNA可包含Mg2+作为污染。
典型地，可采用各种RNA纯化步骤(例如RP-HPLC、切向流过滤)来移除各种污染，包括二价金属离子。适当地，用于囊封于本发明的基于脂质的载体中的RNA已经纯化以移除二价金属离子。
在具体实例中，具体实例的组成物包含小于约100nM二价阳离子/g RNA，较佳小于约50nM二价阳离子/g RNA，更佳小于约10nM二价阳离子/g RNA。在具体实例中，二价阳离子是选自Mg2+及/或Ca2+。在具体实例中，液体组成物包含小于约100nM Mg2+/g RNA。在具体实例中，液体组成物包含小于约100nM Ca2/g RNA。典型地，与感应耦合式电浆质谱分析(IC-ICP-MS)耦合的离子层析(IC)可用于测定二价阳离子。
在具体实例中，囊封组成物中的RNA的基于脂质的载体包含小于约100nM二价阳离子/g RNA，较佳小于约50nM二价阳离子/g RNA，更佳小于约10nM二价阳离子/g RNA。在具体实例中，二价阳离子是选自Mg2+及/或Ca2+。在具体实例中，囊封RNA的基于脂质的载体包含小于约100nM Mg2+/g RNA。在具体实例中，囊封RNA的基于脂质的载体包含小于约100nMCa2/g RNA。典型地，与感应耦合式电浆质谱分析(IC-ICP-MS)耦合的离子层析(IC)可用于测定Mg2+及/或Ca2+。
在具体实例中，组成物的RNA包含Na+作为相对离子。在具体实例中，RNA包含量在约10μg/g RNA至约1mg Na+/g RNA范围内的Na+。在具体实例中，RNA包含Na+作为相对离子，其呈至少约100μg Na+/g RNA，较佳至少约200μg Na+/g RNA的量。典型地，与感应耦合式电浆质谱分析(IC-ICP-MS)耦合的离子层析(IC)可用于测定Na+。
在具体实例中，组成物包含至少一种RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂。此类拮抗剂较佳可共调配于如本文所定义的基于脂质的载体中。
至少一种RNA感应样式辨识受体的适合的拮抗剂揭示于PCT专利申请案PCT/EP2020/072516中，全部揭示内容特此以引用的方式并入。特定言之，并入与如PCT/EP2020/072516的权利要求1至94中的任一者中所定义的至少一种RNA感应样式辨识受体的适合的拮抗剂相关的本发明。
在较佳具体实例中，组成物包含至少一种选自以下者的至少一种RNA感应样式辨识受体的拮抗剂：Toll样受体，较佳TLR7及/或TLR8。
在具体实例中，至少一种RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂是选自核苷酸、核苷酸类似物、核酸、肽、蛋白、小分子、脂质或此等中的任一者的片段、变异体或衍生物。
在较佳具体实例中，至少一种RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂为单股寡核苷酸，较佳单股RNA寡核苷酸。
在具体实例中，至少一种RNA感应样式辨识受体的拮抗剂为单股寡核苷酸，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:PCT/EP2020/072516的85-212，或此等序列中的任一者的片段一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，至少一种RNA感应样式辨识受体的拮抗剂为单股寡核苷酸，其包含或由核酸序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群的核酸序列：SEQ ID NO:PCT/EP2020/072516的85-87、149-212，或此等序列中的任一者的片段一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在本发明的情形下，至少一种RNA感应样式辨识受体的尤其较佳拮抗剂为5'-GAGCGmG CCA-3'(PCT/EP2020/072516的SEQ ID NO:85)或其片段。
在具体实例中，至少一种如本文所定义的RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂与至少一种核酸，较佳编码如本文所定义的SRAS-CoV-2抗原肽或蛋白的RNA的摩尔比适当地在约1:1至约100:1范围内，或在约20:1至约80:1范围内。
在具体实例中，其中至少一种如本文所定义的RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂与至少一种核酸，较佳编码如本文所定义的SRAS-CoV-2抗原肽或蛋白的RNA的重量比适当地在约1:1至约1:30范围内，或在约1:2至约1:10范围内。
冠状病毒疫苗的多肽
在第三态样中，本发明提供一种适合于冠状病毒疫苗，特定言之适合于SARS-CoV-2(先前为nCoV-2019)冠状病毒疫苗的抗原多肽。在较佳具体实例中，多肽衍生自第一态样的核酸所编码的任何蛋白或其片段。较佳多肽设计揭示于清单1中。
在较佳具体实例中，第三态样的抗原多肽的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
第三态样的多肽亦可包含于(医药)组成物中，该组成物包括医药学上可接受的载剂或如本文所定义的佐剂，特定言之如第二态样的情形下所定义。因此，本发明亦关于一种包含该抗原多肽的(医药)组成物。
第三态样的多肽亦可包含于疫苗中，包括医药学上可接受的载剂或如本文所定义的佐剂，特定言之如第四态样的情形下所定义。因此，本发明亦关于包含该抗原多肽的疫苗(参见第四态样)。可与如本文所定义的多肽组合使用的适合的佐剂为基于皂素的佐剂(类固醇或三萜糖苷)，例如基质-M佐剂。
疫苗：
在第四态样中，本发明提供针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2(先前为nCoV-2019)冠状病毒而引起COVID-19疾病的疫苗。
在第四态样的较佳具体实例中，疫苗包含至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种第一态样的RNA或第二态样的组成物。
在其他具体实例中，疫苗包含至少一种如第三态样中所定义的多肽。
在其他具体实例中，疫苗包含至少一种如第一态样中所定义的质体DNA或腺病毒DNA。
特别地，与第二态样的组成物相关的具体实例同样可阅悉且理解为第四态样的疫苗的适合的具体实例。此外，与第四态样的疫苗相关的具体实例同样可阅悉且理解为第二态样的组成物的适合的具体实例。此外，在第一态样(本发明的核酸)的情形下所描述的特征及具体实例必须经阅悉且必须理解为第四态样的组成物的适合的具体实例。
术语「疫苗」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲为提供至少一个表位或抗原，较佳免疫原的预防性或治疗性物质。在本发明的情形下，抗原或抗原功能适当地由第一态样的本发明核酸(该核酸包含编码衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的抗原肽或蛋白的编码序列)或第二态样的组成物(包含第一态样的至少一种核酸)提供。在其他具体实例中，抗原或抗原功能由第三态样的本发明多肽提供。
在较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物引发适应性免疫反应，较佳针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2冠状病毒的适应性免疫反应。
在尤其较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物引发可以有效中和病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的功能性抗体。
在其他较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物借由诱导黏膜IgA抗体引发黏膜IgA免疫。
在尤其较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物引发可以有效中和病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的功能性抗体。
在其他尤其较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物诱导广泛的针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2冠状病毒的功能性细胞T细胞反应。
在其他尤其较佳具体实例中，疫苗或第二态样的组成物诱导针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2冠状病毒的充分平衡的B细胞及T细胞反应。
根据较佳具体实例，如本文所定义的疫苗可进一步包含医药学上可接受的载剂及视需要至少一种如在第二态样的情形下所指定的佐剂。
彼情形中的适合的佐剂可选自WO2016/203025的权利要求17中所揭示的佐剂。
在一个较佳具体实例中，疫苗为单价疫苗。
术语「单价疫苗」、「单价组成物」、「单价疫苗」或「单价组成物」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指包含仅一种来自病原体的抗原或抗原构筑体的组成物或疫苗。因此，该疫苗或组成物仅包含一种编码单一生物体的单一抗原或抗原构筑体的核酸物种。术语「单价疫苗」包括针对单价的免疫接种。在本发明的情形下，单价SARS-CoV-2冠状病毒疫苗或组成物将包含至少一种编码一种衍生自一种专一性SARS-CoV-2冠状病毒的单一抗原肽或蛋白的核酸。
在具体实例中，疫苗为多价疫苗，其包含多种或至少多于一种在第一态样的情形下所定义的核酸物种。与如第二态样的情形下所揭示的多价组成物相关的具体实例同样可阅悉且理解为多价疫苗的适合的具体实例。
术语「多价疫苗」、「多价组成物」、「多价疫苗」或「多价组成物」将由一般熟习此项技术者辨识及理解，且例如意欲指包含来自超过一种病毒的抗原(例如不同SARS-CoV-2冠状病毒分离株)或包含相同SARS-RSCoV-2冠状病毒的不同抗原或抗原构筑体或其任何组合的组成物或疫苗。所述术语描述该疫苗或组成物具有超过一个效价。在本发明的情形下，多价SARS-CoV-2冠状病毒疫苗将包含编码抗原肽或蛋白的核酸序列，所述抗原肽或蛋白衍生自若干不同SARS-CoV-2冠状病毒(例如不同SARS-CoV-2冠状病毒分离株)或包含编码来自相同SARS-CoV-2冠状病毒的不同抗原或抗原构筑体的核酸序列，或其组合。
在较佳具体实例中，多价或多价疫苗包含至少一种如第二态样中所定义的多价组成物。尤其较佳为如「本发明的多价组成物」章节中所定义的多价组成物。
在具体实例中，疫苗包含至少一种如第二态样中所定义的至少一种RNA感应样式辨识受体的拮抗剂。
冠状病毒疫苗典型地包含安全且有效量的核酸(例如DNA或RNA)，较佳第一态样的RNA或第二态样的组成物(或第三态样的多肽)。如本文所使用，「安全且有效量」意谓足以显著诱导与冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒感染相关的疾病或病症发生阳性修饰的核酸或组成物的量。同时，「安全且有效量」是足够小的量以避免严重副作用。关于本发明的核酸、组成物或疫苗，表现「安全且有效量」较佳意谓核酸、组成物或疫苗的量，其适合于以不达成过度或破坏免疫反应(例如先天性免疫反应)的方式刺激针对冠状病毒的适应性免疫系统。
如上文所定义的「安全且有效量」的核酸、组成物或疫苗将与待治疗的特定病况以及待治疗的患者的年龄及身体状况、病况的严重度、治疗持续时间、伴随疗法的本质、所使用的特定医药学上可接受的载剂及熟习此项技术者的知识及经历内的相似因素有关而变化。此外，「安全且有效量」的核酸、组成物或疫苗可取决于应用/递送途径(皮内、肌内、鼻内)、应用装置(喷柱注射、针注射、微针贴片、电穿孔装置)及/或复合/调配(鱼精蛋白复合或LNP囊封、DNA或RNA)。此外，「安全且有效量」的核酸、组成物或疫苗可视经治疗的个体(婴儿、妊娠期妇女、免疫功能不全人类个体等)的身体状况而定。
根据本发明，冠状病毒疫苗可以用于人类医学目的以及用于兽医学目的(哺乳动物、脊椎动物或禽类物种)。
如本文所使用的医药学上可接受的载剂较佳包括本发明冠状病毒疫苗的液体或非液体基。若本发明疫苗以液体形式提供，则载剂可为水，典型地无热原质水；等渗生理盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲的溶液。较佳地，林格(氏)乳酸溶液用作根据如WO2006/122828中所描述的本发明的疫苗或组成物的液体基，本发明是关于特此以引用的方式并入的适合的缓冲的溶液。用作用于疫苗或组成物，特定言之用于包含LNP的组成物/疫苗的液体基的其他较佳溶液包含蔗糖及/或海藻糖。
如本文所定义的医药学上可接受的载剂的选择原则上借由投予根据本发明的医药组成物或疫苗的方式确定。冠状病毒疫苗较佳局部投予。局部投予途径一般包括例如局部投予途径，但亦皮内、经皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内、关节内及舌下注射。更佳地，根据本发明的组成物或疫苗可借由皮内、皮下或肌内途径，较佳借由注射投予，注射可为无针及/或针注射。在本发明的情形下，较佳为肌内注射。组成物/疫苗因此较佳调配成液体或固体形式。待投予的根据本发明的疫苗或组成物的适合的量可以借由常规实验，例如借由使用动物模型测定。此类模型包括(但不意味着任何限制)兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗及非人类灵长类动物模型。较佳用于注射的单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。此类溶液的pH应调节至约7.4。
如本文所定义的本发明冠状病毒疫苗或组成物可包含一或多种如上文所定义的辅助物质或佐剂以便进一步增加免疫原性。较佳从而达成本发明组成物/疫苗中所含的核酸及可视需要与如上文所描述的本发明疫苗或组成物共调配(或分开调配)的辅助物质的协同作用。此类免疫原性增加剂或化合物可分开提供(不与本发明疫苗或组成物共调配)且单独投与。
冠状病毒疫苗较佳以冻干或喷雾干燥形式提供(如在第二态样的情形下所描述)。此类冻干或喷雾干燥疫苗典型地包含海藻糖及/或蔗糖且在向个体投予之前在适合的液体缓冲液中再造。在一些态样中，具体实例的冻干疫苗包含与LNP复合的具体实例的mRNA。在一些态样中，冻干组成物具有小于约10％的含水量。举例而言，冻干组成物可以具有约0.1％至10％、0.1％至7.5％或0.5％至7.5％的含水量，较佳冻干组成物具有约0.5％至约5.0％的水含量。
在较佳具体实例中，向个体投予治疗有效量的核酸、组成物、多肽、疫苗诱导个体中的针对SARS-CoV-2冠状病毒的中和抗体效价。
在一些具体实例中，中和抗体效价为至少100个中和单位/毫升(NU/mL)、至少500NU/mL或至少1000NU/mL。
在一些具体实例中，可侦测含量的冠状病毒抗原在投予核酸、组成物、多肽或疫苗后约1至约72小时产生于个体中。
在一些具体实例中，在投予核酸、组成物、多肽或疫苗后约1天至约72天在个体的血清中产生至少100NU/ml、至少500NU/ml或至少1000NU/ml的中和抗体效价(针对冠状病毒)。
在一些具体实例中，中和抗体效价足以使冠状病毒感染相对于未经疫苗接种的对照个体的中和抗体效价或相对于经活减毒病毒疫苗、不活化病毒疫苗或蛋白次单位病毒疫苗接种的个体的中和抗体效价降低至少50％。
在一些具体实例中，中和抗体效价及/或T细胞免疫反应足以相对于未经疫苗接种的对照个体的中和抗体效价降低无症状病毒感染的速率。
在一些具体实例中，中和抗体效价及/或T细胞免疫反应足以预防个体中的病毒潜伏。
在一些具体实例中，中和抗体效价足以阻断病毒与个体的上皮细胞融合。
在一些具体实例中，在单次1μg-100μg剂量的核酸、组成物、多肽或疫苗之后20天内或在第二次1μg-100μg剂量的核酸、组成物、多肽或疫苗之后40天内诱导中和抗体效价。
在较佳具体实例中，向个体投予治疗有效量的核酸、组成物、多肽或疫苗在个体中诱导针对冠状病毒的T细胞免疫反应。在较佳具体实例中，T细胞免疫反应包含CD4+T细胞免疫反应及/或CD8+T细胞免疫反应。
套组或部件套组、应用、医疗用途、治疗方法：
在第五态样中，本发明提供适合于治疗或预防冠状病毒感染的套组或部件套组。较佳地，该套组或部件套组适合于治疗或预防冠状病毒，较佳SARS-CoV-2(先前为nCoV-2019)冠状病毒感染。
特别地，与第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽及第四态样的疫苗或相关的具体实例可同样经阅悉且理解为本发明的第五态样的套组或部件套组的适合的具体实例。
在较佳具体实例中，套组或部件套组包含至少一种核酸(例如RNA或DNA)，较佳至少一种第一态样的RNA、至少一种第二态样的组成物及/或至少一种第三态样的多肽及/或至少一种第四态样的疫苗。
在具体实例中，套组或部件套组包含至少一个如第一态样中所定义的DNA，例如至少一个质体DNA及/或至少一个腺病毒DNA。
在具体实例中，套组或部件套组包含至少一种如第三态样中所定义的多肽。
另外，套组或部件套组可包含用于溶解的液体媒剂及/或提供关于组分的投予及剂量的资讯的技术说明书。
套组可进一步包含如第二态样的组成物的情形下所描述的额外组分及/或第四态样的疫苗。
该套组的技术说明书可含有关于投予及剂量及患者群的资讯。此类套组，较佳部件套组可例如应用于本文中所提及的应用或用途中的任一者，较佳第一态样的核酸的用途、第二态样的组成物、第三态样的多肽或第四态样的疫苗，以用于治疗或预防由冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒或与其相关的病症引起的感染或疾病。
较佳地，核酸、组成物、多肽或疫苗是提供于套组的单独部分中，其中核酸、组成物、多肽或疫苗较佳经冻干。
套组可另外含有作为溶解核酸、组成物、多肽或疫苗的一部分媒剂(例如缓冲溶液)。
在较佳具体实例中，如本文所定义的套组或部件套组包含林格(氏)乳酸溶液。
在较佳具体实例中，如本文所定义的套组或部件套组包含用于投予组成物/疫苗的多剂容器。
以上套组中的任一者可用于如本文所定义的治疗或预防。更佳地，以上套组中的任一者可用作疫苗，较佳针对由冠状病毒引起的，较佳由SARS-CoV-2冠状病毒引起的感染的疫苗。
在较佳具体实例中，套组或部件套组包含以下组分：
a)至少一个容器或小瓶，其包含如本文所定义的组成物或SARS-CoV-2疫苗，其中该组成物或SARS-CoV-2疫苗具有核酸浓度，较佳在约100μg/ml至约1mg/ml范围内，较佳在约100μg/ml至约500μg/ml范围内，例如约270μg/ml的RNA浓度。
b)至少一个包含无菌稀释缓冲液的稀释容器或小瓶，适合地包含NaCl的缓冲液，视需要包含防腐剂；
c)至少一个用于将该组成物或疫苗自储存容器转移至稀释容器的构件；及
d)至少一个用于向个体投予最终经稀释的组成物或疫苗的注射器，较佳经组态用于向人类个体肌内投予，其中最终经稀释的组成物或疫苗具有核酸浓度，较佳在约10μg/ml至约100μg/ml范围内，较佳在约10μg/ml至约50μg/ml范围内，例如约24μg/ml的RNA浓度。
在具体实例中，套组或部件套组包含超过一种基于mRNA的SARS-CoV-2组成物/疫苗，较佳
-至少一种如本文所定义的疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中疫苗包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQ ID NO.163、149或24837的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，较佳调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45(ALC-0159))。较佳地，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
-至少一种如本文所定义的其他疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中组成物/疫苗包含至少一种核酸，较佳RNA，其与SEQ ID NO:23311、23531、24851、23310、23530、24850、23313、23533、24853、23314、23534或24854的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，较佳调配于脂质纳米粒子(LNP)中，其具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3(ALC-0315)、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质(其中n＝49或其中n＝45(ALC-0159))。较佳地，核酸，较佳mRNA未经化学修饰。
在具体实例中，套组或部件套组包含两种不同的SARS-CoV-2疫苗，用于初打疫苗接种及加打疫苗接种：
-至少一种如本文所定义的初打疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中疫苗为如本文所定义的基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗；及
-至少一种如本文所定义的加打疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中组成物/疫苗为如本文所定义的基于腺病毒的SARS-CoV-2疫苗。
在具体实例中，套组或部件套组包含两种不同的SARS-CoV-2疫苗，用于初打疫苗接种及加打疫苗接种：
-至少一种如本文所定义的加打疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中疫苗为如本文所定义的基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗；及
至少一种如本文所定义的初打疫苗，其提供于第一小瓶或容器中，其中组成物/疫苗为如本文所定义的基于腺病毒的SARS-CoV-2疫苗。
组合：
第六态样是关于至少两种如第一态样中所定义的核酸序列、至少两种如第二态样的情形中所定义的组成物、至少两种如第三态样中所定义的多肽、至少两种如第四态样的情形中所定义的疫苗或至少两种如第五态样中所定义的套组的组合。
在本发明的情形下，术语「组合(combination)」较佳意谓至少两种组分的组合出现，较佳至少两种如第一态样中所定义的核酸序列、至少两种如第二态样的情形中所定义的组成物、至少两种如第三态样中所定义的多肽、至少两种如第四态样的情形中所定义的疫苗或至少两种如第五态样中所定义的套组。此类组合的组分可以单独实体形式出现。因此，组合的组分的投予可在相同投予部位或在不同投予部位处同时或及时交错进行。
值得注意地，与第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽及第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组相关的具体实例可同样经读取且理解为第六态样的组合的组分的适合具体实例。
在具体实例中，组合可包含多种或至少多于一种核酸物种，例如如在本发明的第一态样的情形中所定义的RNA物种，其中该核酸物种是以个别组分形式提供。
较佳地，如本文所定义的组合可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同核酸，例如如在本发明的第一态样的情形中所定义的RNA物种；如在本发明的第二态样的情形中所定义的2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同组成物；如在本发明的第三态样的情形中所定义的2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同多肽；如在本发明的第三态样的情形中所定义的2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同疫苗，其中该核酸物种、组成物、多肽、疫苗是以个别组分形式提供。
在具体实例中，组合包含2、3、4、5种包含于个别组分中的核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，其中该核酸物种包含核酸序列或由核酸序列组成，其中该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937组成的群的核酸序列及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂，其中该2、3、4、5种核酸物种中的每一者编码不同抗原肽或SARS-CoV-2冠状病毒的蛋白。
因此，在具体实例中，组合包含两种包含于个别组分中的核酸物种(例如DNA或RNA)，较佳RNA物种，其中该核酸物种包含核酸序列或由核酸序列组成，其中该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937148组成的群的核酸序列及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂，其中该两种核酸物种中的每一者编码不同抗原肽或SARS-CoV-2冠状病毒的蛋白。
在具体实例中，组合包含三种包含于个别组分中的核酸物种(例如DNA或RNA))，较佳RNA物种，其中该核酸物种包含核酸序列或由核酸序列组成，其中该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937组成的群的核酸序列及视需要至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂，其中该2、3、4、5种核酸物种中的每一者编码不同抗原肽或SARS-CoV-2冠状病毒的蛋白。
在下文中，提供一种组合的尤其较佳具体实例，其中该组合的各组分是以单独实体形式提供。
较佳地，组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同核酸物种、组成物、疫苗各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白(如第一态样中所定义)。较佳地，融合前构形的稳定化是借由在棘蛋白中残基K986及V987(氨基酸位置根据参考SEQ ID NO:1)处引入两个连续脯氨酸取代来获得。因此，在较佳具体实例中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种融合前稳定化棘蛋白(S_stab)各包含至少一个融合前稳定性突变，其中至少一个融合前稳定性突变包含以下氨基酸取代：K986P及V987P(氨基酸位置根据参考SEQ ID NO:1)。
因此，组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同核酸物种、组成物、疫苗各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种稳定棘蛋白是选自以下中的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-2296410中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，组合包含一种核酸物种、组成物、包含编码与SEQ ID NO:10中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的编码序列的疫苗，其中多价组成物另外包含至少2、3、4种选自以下者的RNA物种：
i)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22961中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
ii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22960中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
iii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22963中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
iv)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22941中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；及/或
v)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列编码与SEQ ID NO:22964中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。
较佳地，组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同核酸物种、组成物、疫苗包含各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白的核酸编码序列，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种核酸编码序列是选自以下中的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:136-138、140-143、145-175、11731-11813、11815、11817-12050、12052、12054-12203、13514、13515、13519、13520、14124-14141、22759、22764-22785、22969-23184中的任一者或此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在较佳具体实例中，组合包含一种核酸物种、组成物、包含与SEQ ID NO:137中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列的疫苗，其中多价组成物另外包含至少2、3、4种选自以下者的其他RNA物种：
i)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23091中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
ii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23090中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iii)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23093中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
iv)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:22999中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；及/或
v)一种包含编码序列的核酸物种，该编码序列与SEQ ID NO:23094中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
较佳地，组合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种不同核酸物种、组成物、疫苗包含各自编码不同的融合前稳定化棘蛋白的核酸编码序列，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或甚至更多种核酸编码序列是选自以下中的RNA序列，所述的RNA序列与SEQ ID NO:149-151、163-165、12338、12541、12810-12813、12901、12931、13013、22792、22794、22796、22798、22802、22804、22806、22810、22813、22819、22821、22823、22825、22827、22829、22831、22833、22835、22837、22839、23297-23314、23369、23517-23520、23523-23525、23527、23529、23530、23589、23737、23957、24397、24837、25057、25277、25717、26925-26937149中的任一者或此等中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的。
在较佳具体实例中，组合包含一种RNA物种、组成物、包含与SEQ ID NO:163中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的RNA序列或由其组成的疫苗，其中该组合另外包含至少2、3、4种选自以下者的其他RNA物种：
i)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23311中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的RNA序列或由其组成；及/或
ii)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23310中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
iii)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23313中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
iv)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23219中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
v)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23314中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；
其中，较佳地mRNA物种中的每一者包含Cap1结构，且视需要，mRNA物种中的每一者不包含经修饰的核苷酸。
在较佳具体实例中，组合包含一种RNA物种、组成物、包含与SEQ ID NO:149或24837中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的RNA序列或由其组成的疫苗，其中该组合另外包含至少2、3、4种选自以下者的其他RNA物种：
i)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23531或24851中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的RNA序列或由其组成；及/或
ii)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23530或24850中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
iii)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23533或24853B中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
iv)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23439或24759中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；及/或
v)一种RNA物种，该RNA物种包含与SEQ ID NO:23534或24854中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的编码序列；
其中，较佳地mRNA物种中的每一者包含Cap1结构，且视需要，mRNA物种中的每一者不包含经修饰的核苷酸。
在一特定具体实例中，组合的第一组分包含病毒载体疫苗/组成物，诸如基于腺病毒载体的疫苗，例如ADZ1222或Ad26.COV-2.S，且第二组分包含基于核酸的疫苗/组成物，较佳如本文所定义的基于mRNA的疫苗。
第一及第二/其他医疗用途：
另一态样是关于所提供的核酸、组成物、多肽、疫苗、套组或组合的第一医疗用途。
值得注意地，与第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽及第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或组合相关的具体实例可同样经读取且理解为本发明的医疗用途的适合具体实例。
因此，本发明提供至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳如第一态样中所定义的用作医药品的RNA、如第二态样中所定义的用作医药品的组成物、如第三态样中所定义的用作医药品的多肽、如第四态样中所定义的用作医药品的疫苗及如第五态样中所定义的用作医药品的套组或部件套组及组合。
本发明此外提供核酸、组成物、多肽、疫苗或套组或组合的若干应用及用途。
特定言之，核酸(较佳RNA)、组成物、多肽、疫苗或套组或组合可用于人类医疗目的且亦用于兽医学医疗目的，较佳用于人类医疗目的。
特定言之，核酸(较佳RNA)、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组适用作人类医疗目的的医药品，其中该核酸(较佳RNA)、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组可适用于幼龄婴儿、新生儿、免疫功能不全的接受者以及孕期及哺乳期女性及老年人群。特定言之，核酸(较佳RNA)组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组适用作人类医疗目的的医药品，其中该核酸(较佳RNA)、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组尤其适用于老年人个体。
该核酸(较佳RNA)、组成物、多肽、疫苗或套组或组合适用作人类医疗目的的医药品，其中该RNA、组成物、疫苗或套组或部件套组可尤其适用于肌内注射或皮内注射。
在另一态样中，本发明是关于所提供的核酸、组成物、多肽、疫苗或套组或组合的第二医疗用途。
因此，本发明提供至少一种核酸，较佳如第一态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的RNA；如第二态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的组成物；如第三态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的多肽；如第四态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的疫苗；如在第五态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的套组或部件套组；如在第六态样中所定义的用于治疗或防治冠状病毒(较佳SARS-CoV-2冠状病毒)感染或与此类感染相关的病症或疾病(诸如COVID-19)的组合。
在具体实例中，核酸，较佳第一态样的RNA、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合用于治疗或防治冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒。
特定言之，核酸，较佳第一态样的RNA、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合可用于防治性(暴露前防治或暴露后防治)及/或治疗性治疗由冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒引起的感染的方法中。
特定言之，核酸，较佳第一态样的RNA、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合可用于防治性(暴露前防治或暴露后防治)及/或治疗性治疗由SARS-CoV-2冠状病毒感染引起的COVID-19疾病的方法中。
核酸、组成物、多肽或疫苗或组合较佳可局部投予。特定言之，组成物或多肽或疫苗或组合可借由皮内、皮下、鼻内或肌内途径投予。在具体实例中，本发明核酸、组成物、多肽、疫苗可借由习知带针注射或无针喷射注射投予。在彼情形下较佳为肌内注射。
在使用质体DNA且包含于组成物或疫苗或组合中的具体实例中，组成物/疫苗/组合可借由电穿孔使用电穿孔装置，例如用于皮内或肌内递送的电穿孔装置投予。适当地，可使用如US7245963B2中所描述的装置，特定言之，如US7245963B2的权利要求1至68项所定义的装置。
在使用腺病毒DNA且包含于组成物或疫苗或组合中的具体实例中，组成物/疫苗/组合可借由鼻内投予来投予。
在具体实例中，包含于如本文所定义的组成物或疫苗或组合中的核酸以约100ng至约500ug的量、约1ug至约200ug的量、约1ug至约100ug的量、约5ug至约100ug的量、较佳约10ug至约50ug的量、确切地说以约1ug、2ug、3ug、4ug、5ug、8ug、9ug、10ug、11ug、12ug、13ug、14ug、15ug、16ug、20ug、25ug、30ug、35ug、40ug、45ug、50ug、55ug、60ug、65ug、70ug、75ug、80ug、85ug、90ug、95ug或100ug的量提供。
在一些具体实例中，包含核酸的疫苗或包含核酸的组成物以有效量调配以在个体中产生抗原专一性免疫反应。在一些具体实例中，核酸的有效量为1ug至200ug、1ug至100ug或5ug至100ug的总剂量。
在基于脂质的载体(例如LNP)提供核酸中的具体实例中，包含于一剂中的如本文所定义的PEG脂质的量低于约50μg PEG脂质，较佳低于约45μg PEG脂质，更佳低于约40μgPEG脂质。
在一剂中具有低量PEG脂质可降低不良影响(例如过敏)的风险。
在尤其较佳具体实例中，包含于一剂中的PEG脂质的量在约3.5μg PEG脂质至约35μg PEG脂质范围内。
在基于脂质的载体(例如LNP)提供核酸中的具体实例中，包含于一剂中的如本文所定义的阳离子脂质的量低于约400μg阳离子脂质，较佳低于约350μg阳离子脂质，更佳低于约300μg阳离子脂质。
在一剂中具有低量阳离子脂质可降低不良影响的风险(例如较少)。
在尤其较佳具体实例中，包含于一剂中的阳离子脂质的量在约30μg PEG脂质至约300μg PEG脂质范围内。
在一个具体实例中，用于治疗或防治个体的针对冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的免疫方案包含一种单剂的组成物或疫苗。
在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的1ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的2ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的3ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的4ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的5ug剂量。在一次疫苗接种中中向个体投予6ug。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的7ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的8ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的9ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的10ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的11ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的12ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的13ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的14ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的16ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的20ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的25ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的30ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的40ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的50ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的100ug剂量。在一些具体实例中，有效量为在一次疫苗接种中向个体投予的200ug剂量。在彼情形中的「剂量」是关于有效量的如本文所定义的核酸，较佳mRNA。
在较佳具体实例中，用于治疗或防治冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的免疫方案包含一系列单一剂或剂量的组成物或疫苗。如本文所用，单一剂量分别是指初始/第一剂、第二剂或任何其他剂，其较佳投予以便「加强」免疫反应。
在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的1ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的2ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的3ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的4ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的5ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的6ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的7ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的8ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的9ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的10ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的11ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的12ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的13ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的14ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的16ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的20ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的25ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的30ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的40ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的50ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的100ug剂量。在一些具体实例中，有效量为向个体投予总计两次的200ug剂量。在彼情形中的「剂量」是关于有效量的如本文所定义的核酸，较佳mRNA。
在较佳具体实例中，疫苗/组成物/组合使个体针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2冠状病毒感染(在如本文所定义投予之后)免疫至少1年，较佳至少2年。在较佳具体实例中，疫苗/组成物/组合使个体针对冠状病毒，较佳针对SARS-CoV-2冠状病毒感染免疫超过2年，更佳超过3年，甚至更佳超过4年，甚至更佳超过5至10年。
治疗方法及用途、诊断方法及用途：
在另一态样中，本发明是关于一种治疗或预防病症的方法。
值得注意地，与第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽及第四态样的疫苗、第五态样的套组或部件套组、第六态样的组合或医疗用途相关的具体实例可同样经读取且理解为如本文所提供的治疗方法的适合具体实例。此外，与如本文所提供的治疗方法相关的特定特征及具体实例亦可适用于本发明的医疗用途。
预防(抑制)或治疗疾病，尤其冠状病毒感染是关于例如在具有诸如冠状病毒感染的疾病的风险的个体中抑制疾病或病况的全面发展。「治疗」是指改善疾病或病理性病症的病征或症状在其开始发展之后的治疗性干预。关于疾病或病理性病症的术语「改善」是指治疗的任何可观测的有益效果。抑制疾病可包括预防或降低疾病的风险，诸如预防或降低病毒感染的风险。可例如借由易感个体的临床症状的发作延迟、疾病的一些或所有临床症状的严重程度降低、疾病的进展较慢、病毒负荷减少、个体的整体健康或幸福改善或借由特定疾病所特有的其他参数证明有益效果。「防治性」治疗为出于降低出现病变的风险的目的，向未展示疾病的病征或仅展示早期病征的个体投予的治疗。
在较佳具体实例中，本发明是关于一种治疗或预防病症的方法，其中该方法包含向有需要的个体施用或投予至少一种第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合。
在较佳具体实例中，病症为冠状病毒感染或与此类感染相关的病症，特定言之SARS-CoV-2冠状病毒感染或与此类感染相关的病症，例如COVID-19。
在较佳具体实例中，本发明是关于一种治疗或预防如上文所定义的病症的方法，其中该方法包含向有需要的个体施用或投予至少一种第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合，其中有需要的个体较佳为哺乳动物个体。
在某些具体实例中，借由向有需要的个体施用或投予至少一种第一态样的核酸、第二态样的组成物、第三态样的多肽、第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组或第六态样的组合治疗或预防疾病的方法进一步定义为一种减少个体中的疾病负荷的方法。例如，该方法较佳降低COVID-19疾病的一或多种症状的严重程度及/或持续时间。在一些态样中，方法降低个体将需要住院、住进加护病室、用补充氧气治疗及/或用呼吸器治疗的机率。在其他态样中，方法降低个体将发生发烧、呼吸困难；嗅觉丧失及/或味觉丧失的机率。在较佳态样中，该方法降低个体将发展成重度或中度COVID-19疾病的机率。在某些态样中，具体实例的方法在向个体投予具体实例的组成物之后约2周及1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或2年之间预防个体中的重度或中度COVID-19疾病。在较佳态样中，具体实例的方法预防症状性COVID-19疾病。在某些态样中，具体实例的方法在向个体投予具体实例的组成物之后约2周及1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或2年之间预防个体中的SARS CoV-2核酸的可侦测水平。在其他态样中，具体实例的方法定义为一种用于在个体中提供针对冠状病毒感染(例如SARS CoV-2感染)的保护性免疫的方法。在又其他态样中，具体实例的方法预防至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中的中度及重度COVID-19疾病。在又其他态样中，具体实例的方法在投予第二或后续免疫性组成物(例如加打投予)之后约2周至约1年预防至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中的中度及重度COVID-19疾病。在又其他态样中，具体实例的方法在投予第二或后续组成物之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年之间预防至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中的中度或重度COVID-19疾病。
在另一态样中，具体实例的方法包含(i)获得具体实例的组成物(例如疫苗组成物)，其中该组成物为冻干的；(ii)使冻干组成物溶解于医药学上可接受的液体载剂中以产生液体组成物；及(iii)向个体投予有效量的液体组成物。在一些态样中，冻干组成物包含少于约10％含水量。例如，冻干组成物较佳可包含约0.1％至约10％、0.5％至7.5％或0.5％至5.0％水。
在其他态样中，具体实例的方法包含向个体投予包含与SEQ ID NO:163至少约95％相同的mRNA(例如与LNP复合)的疫苗组成物。
在其他态样中，具体实例的方法包含向个体投予包含与SEQ ID NO:149、24837、23311、23531、23310、23530、23313或23533至少约95％相同的mRNA(例如与LNP复合)的疫苗组成物。在一些态样中，此类方法提供足够的免疫反应以保护个体免于重度COVID-19疾病至少约6个月。例如，在一些态样中，保护个体免于重度COVID-19疾病约6个月至约1年、1.5年、2年、2.5年、3年、4年或5年。因此，在一些态样中，具体实例的方法提供单剂疫苗组成物，其向个体提供长期(例如超过6个月)保护免于重度疾病。
如本文所用，重度COVID-19疾病定义为个体经历以下中的一或多者：
·静止时的临床病征指示重度全身性疾病(呼吸速率≥30次呼吸/分钟，心率≥125次/分钟，在海平面的室内空气下SpO2≤93％，或PaO2/FiO2<300mmHg(根据海拔高度调节))；
·呼吸衰竭(定义为需要高流量氧气、非侵入性通风、机械通风或ECMO}
·休克迹象(SBP<90mmHg，DBP<60mmHg，或需要血管加压剂)
·严重肾脏、肝脏或神经系统功能障碍
·进入ICU
·死亡
如本文所用，中度COVID-19疾病定义为个体经历以下中的一或多者：
·呼吸短促或呼吸困难
·呼吸速率≥20次呼吸/分钟
·在海平面的室内空气下异常但仍>93％的SpO2(根据海拔高度调节)
·下呼吸道疾病的临床或放射照相迹象
·深层静脉栓塞(DVT)的放射性迹象
如本文所用，轻度COVID-19疾病定义为个体经历以下中的所有：
·症状性AND
·无呼吸短促或呼吸困难AND
·无低血氧症(根据海拔高度调节)AND
·不符合中度或重度COVID-19疾病的病例定义
在尤其较佳具体实例中，有需要的个体为哺乳动物个体，较佳为人类个体，例如新生儿、怀孕个体、免疫功能不全个体及/或老年个体。在一些具体实例中，个体的年龄在6个月与100岁、6个月与80岁、1岁与80岁、1岁与70岁、2岁与80岁或2岁与60岁之间。在其他具体实例中，个体为年龄不超过3岁、不超过2岁、不超过1.5岁、不超过1年(12个月)、不超过9个月、6个月或3个月的新生儿或婴儿。在一些其他具体实例中，个体为年龄为至少50、60、65或70岁的老年个体。在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体为61岁或更大。在又其他态样中，个体为18岁至60岁。
在某些具体实例中，根据具体实例的用于治疗的个体为怀孕个体，诸如怀孕人类。在一些态样中，个体已怀孕超过约一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月或八个月。
在尤其较佳具体实例中，人类个体为老年人个体。
在某些态样中，根据具体实例的用于治疗的个体具有美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。在一些态样中，个体具有至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。在某些态样中，个体具有美洲原住民遗传性，诸如至少约10％、25％或50％美洲原住民遗传性。在其他态样中，个体为具有美洲原住民遗传性的老年个体，例如至少55、60、65或70岁的个体。
在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体患有疾病或为免疫功能不全的。在一些态样中，个体患有肝病、肾病糖尿病、高血压、心脏病或肺病。在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体为具有过敏性反应病史的个体，此类个体具有食物过敏。在一些态样中，个体对疫苗具有前述过敏反应诸如过敏性反应。在又其他态样中，根据所述方法的用于治疗的个体是具有可侦测的抗PEG抗体，诸如血清中可侦测的抗PEG IgE的个体。
在其他态样中，根据所述具体实例的用于治疗的个体具有至少一种选自以下者的共发病：
(i)慢性肾病：肾脏功能将由最近3-6个月内的血清肌酐量测确定，使用慢性肾病流行病合作研究(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI)方程式转化成估计的肾小球滤过率(eGFR)，其中肾功能受损定义为eGFR<60mL/min/1.73m2。
-轻度慢性肾病定义为eGFR在60 89mL/min/1.73m2之间。
-中度慢性肾病定义为eGFR在31至59mL/min/1.73m2之间，具有稳定疗法且良好维持至少6个月(修改自慢性肾病临床实践指南：美国肾脏病杂志(Clinical PracticeClinical Guidelines for Chronic Kidney Disease:Am J Kidney Dis),2002)。
(ii)COPD(包括肺气肿及慢性支气管炎)。
-伴有或不伴有咳嗽或痰产生的轻度COPD定义为1秒/用力肺活量(FEV1/FVC)中的用力呼气量<0.7且预测FEV1≥80％。
-伴有或不伴有咳嗽或痰产生的中度COPD定义为FEV1/FVC<0.7且FEV1≥50％，但<80％用稳定治疗(用于COPD严重程度的GOLD标准)预测。
(iii)体重指数(BMI)>32kg/m2的肥胖-亦包括任何极度病态肥胖。
(iv)慢性心脏血管病况(心脏衰竭、冠状动脉疾病、心肌病、动脉性高血压)，包括以下：
-在无功能性或结构性心脏病症的情况下，I类心脏衰竭具有未来发展为心脏衰竭的潜在高风险。
-II类心脏衰竭：患有心脏疾病导致身体活动轻微限制的个体。休息时舒适。
-日常身体活动导致疲劳、心悸、呼吸困难或心绞痛。
-III类心脏衰竭，具有明显的身体活动限制，但休息时舒适，但低于一般活动会导致症状。
-在任何阶段无症状的结构性心脏病症。
-轻度左心室收缩或舒张功能障碍，通常不会产生许多临床病征。
-根据纽约心脏协会(NYHA)，中度左心室衰竭伴劳力性呼吸困难或正位呼吸或阵发性夜间呼吸困难，随药物稳定(II-III级)。
-2级及以上代谢等效临限值(MET)的冠状动脉疾病直至中度，随药物稳定。(MET定义为在休息时的耗氧量，且等于3.5ml O2/公斤体重×分钟；4级为正常，可爬楼梯或爬山且可参与其他剧烈活动；1级可照顾他/她自身，但可能无法维持自身体力且适应运动时受到约束)。
-具有药物的2-3MET的非感染性及代谢源的心肌病。
-1期高血压或2期高血压，随药物稳定且控制。
(v)如借由登记之前12个月内采集的血液样品所记录，具有稳定病毒血症(<50个复本/毫升)及CD4计数>350/毫升的慢性HIV感染。(允许病毒负荷＜50个复本/毫升且短暂变化为50-350个复本/毫升。)
(vi)第2型糖尿病，其随药物控制[血红素A1c(HbA1c]<58mmol/mol(7.45％]或不受控制，其中近期HbA1c>58mmol/mol(7.45％)；[(以％为单位的HbA1c-2.15)×10.929＝以mmol/mol为单位的HbA1c]；在不受控的DM中，HbA1c应在<10％的变化范围内，且不应在前3个月内具有任何糖尿病酮酸中毒病史或重度症状性低血糖发作。
(vii)至少一年前在稳定条件下经历肾移植且用药物治疗至少6个月的个体，其归类为低排斥风险。
在又其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体在过去6个月中尚未用免疫抑制剂药物治疗超过14天。在一些态样中，根据具体实例的用于治疗的个体在投予之前至少28天尚未接受活疫苗及/或在投予之前至少14天尚未接受不活化疫苗。在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体尚未：
-患有病毒学证实的COVID-19疾病；
-对于女性：在投予具体实例的组成物之前一个月内经历怀孕或泌乳；
-在投予具体实例的组成物之前28天内用研究性或非注册产品(例如疫苗或药物)进行治疗；
-在投予具体实例的组成物之前28天内(对于活疫苗)或14天内(对于不活化疫苗)接受经授权的疫苗；
-先前或并行地用任何研究性SARS-CoV-2疫苗或另一种冠状病毒(SARS-CoV，MERS-CoV)疫苗治疗；
-在投予具体实例的组成物之前6个月内，用免疫抑制剂或其他免疫改性药物(例如皮质类固醇、生物制剂及氨甲喋呤)治疗>14天。
-患有基于病史及体检的任何医学诊断或疑似免疫抑制或免疫缺乏病况，其包括已知的人类免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)感染；当前诊断或治疗的癌症，其包括白血病、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin disease)、多发性骨髓瘤或全身性恶性病；慢性肾衰竭或肾病症候群；及接受器官或骨髓移植。
-患有血管性水肿(遗传或特发性)病史或任何过敏性反应或pIMD病史。
-对CVnCoV疫苗的任何组分过敏的病史。
-在投予具体实例的组成物之前3个月内已投予免疫球蛋白或任何血液产品；
-经历显著急性或慢性医疗或精神疾病；及/或
-经历重度及/或不受控制的心血管疾病、胃肠道疾病、肝病、肾病、呼吸道疾病、内分泌病症及神经及精神疾病。
在某些态样中，根据具体实例的方法用于治疗的个体不具有任何潜在的免疫介导的疾病(pIMD)。在其他态样中，具体实例的治疗方法不诱导经治疗个体中的任何pIMD。如本文所用，pIMD定义为乳糜泻；克罗恩氏病(Crohn's disease)；溃疡性结肠炎；溃疡性直肠炎；自体免疫胆管炎；自体免疫肝炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；艾迪森氏病(Addison's disease)；自体免疫甲状腺炎(包括桥本氏甲状腺炎(Hashimotothyroiditis)；第I型糖尿病；格雷弗氏或巴塞多氏病(Grave's or Basedow's disease)；抗合成酶症候群；皮肌炎；青少年慢性关节炎((包括斯蒂尔氏病(Still's disease)))；混合性结缔组织病症；多发性肌痛风湿病；多发性肌炎；牛皮癣性关节病；复发性多发性软骨炎；类风湿性关节炎；硬皮病(例如包括弥漫性全身型及CREST症候群)；脊椎关节炎(例如包括僵直性脊椎炎、反应性关节炎(莱特尔氏症候群(Reiter's Syndrome))及未分化型脊椎关节炎；全身性红斑狼疮；全身性硬化症；急性弥漫性脑脊髓炎(包括位点专一性变异体(例如非传染性脑炎、脑脊髓炎、脊髓炎、脊髓脊神经根性脊髓炎))；脑神经病症(例如包括麻痹/轻瘫(例如伯耳氏瘫(Bell's palsy))；格林-巴利症候群(Guillain-Barrésyndrome)(例如包括米勒费雪症候群(Miller Fisher syndrome)及其他变异体)；免疫介导性周围神经病变、帕森吉特纳症候群(Parsonage Turner syndrome)及丛神经病变(例如包括慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病、多灶性运动神经病及与单株伽玛球蛋白症相关的多发性神经病)；多发性硬化症；发作性睡病；视神经炎；横贯性脊髓炎；斑秃；自体免疫大疱性皮肤病，其包括天疱疮、类天疱疮及疱疹样皮炎；皮肤型红斑狼疮；结节性红斑；硬斑病；扁平苔癣；牛皮癣；斯威特氏症候群(Sweet's syndrome)；白斑病；大型血管脉炎(例如包括：巨细胞动脉炎诸如高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)及颞动脉炎)；中型及/或小型血管炎(例如包括：结节性多动脉炎、川崎氏病(Kawasaki's disease)、显微多血管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、查格-施特劳斯症候群(Churg-Strauss syndrome，过敏性肉芽肿性血管炎)、伯格氏病(Buerger's disease，血栓闭塞性脉管炎)、坏死性血管炎及抗嗜中性白血球细胞质抗体(ANCA)阳性血管炎(非特定型)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、白塞氏症候群(Behcet's syndrome)、白血球破裂性血管炎)；抗磷脂质症候群；自体免疫溶血性贫血；自体免疫肾丝球肾炎(包括IgA肾病、急进性肾丝球肾炎、膜性肾丝球肾炎、膜增生性及系膜增生性肾丝球肾炎)；自体免疫心肌炎/心肌病；自体免疫性血小板减少症；古巴士德氏症候群(Goodpasture syndrome)；特发性肺纤维化；恶性贫血；雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)；类肉瘤病；休格伦氏症候群(
Figure GDA0003858923850001901
syndrome)；史蒂芬斯-强森症候群(Stevens-Johnson syndrome)；葡萄膜炎)。
在某些态样中，具体实例的疫苗接种方法不导致个体经历任何特别受关注的不良事件(AESI)。如本文所用，AESI定义为以上列出的pIMD；重度过敏；血管炎；免疫后增强的疾病；儿童多系统发炎性症候群；急性呼吸窘迫症候群；COVID-19疾病；急性心脏损伤；微血管病；心力衰竭及心因性休克；压力型心肌病变；冠状动脉疾病；心律不整；心肌炎；心包炎；血小板减少症；深层静脉栓塞；肺栓塞；脑血管中风；肢体缺血症；血友病；急性肾损伤；肝损伤；全身性痉挛；格林-巴利症候群；急性弥漫性脑脊髓炎；嗅觉丧失症；味觉丧失症；脑膜脑炎；冻疮类病灶；单器官皮肤血管炎；多形性红斑；免疫后严重局部/全身性AR。
特定言之，此类治疗方法可包含以下步骤：
a)提供至少一种核酸(例如DNA或RNA)，较佳至少一种第一态样的RNA、至少一种第二态样的组成物、至少一种第三态样的多肽、至少一种第四态样的疫苗或第五态样的套组或部件套组；
b)以第一剂向个体施用或投予该核酸、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组
c)视需要以第二剂或另一剂，较佳在第一剂量之后至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月向个体施用或投予该核酸、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组。
如本文所用，第一剂量分别是指初始/第一剂、第二剂或任何其他剂，其较佳投予以便「加强」免疫反应。在某些态样中，向个体投予疫苗/组成物一次、两次、三次、四次或更多次。在一些态样中，至少第一次及第二次向个体投予疫苗/组成物(例如初打与加打)。在一些态样中，在第一次投予之后，传送投予是至少10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天。在一些态样中，第一次投予与第二次投予之间的时间是在约7天与约56天；约14天与约56天；约21天与约56天；或约28天及约56天之间。在其他态样中，向个体投予疫苗/组成物三次或更多次。在某些态样中，在每次投予疫苗/组成物之间存在至少10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天。
在一些态样中，根据具体实例的用于治疗的个体先前经SARS CoV-2感染或先前经至少第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。在一些态样中，个体经一、两、三或更多剂的第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。在一些态样中，用于治疗个体的具体实例的组成物为与先前用于治疗个体的组成物不同类型的疫苗组成物。在一些态样中，个体先前经mRNA疫苗，诸如BNT162或mRNA-1273治疗。在其他态样中，个体先前经蛋白次单位疫苗，诸如基于棘蛋白的疫苗，例如NVX-CoV2373或COVAX治疗。在某些较佳态样中，蛋白次单位疫苗组成物包含佐剂。在其他态样中，个体先前经病毒载体疫苗，诸如基于腺病毒载体的疫苗，例如ADZ1222或Ad26.COV-2.S治疗。在其他态样中，个体先前经SARS CoV-2的不活化病毒疫苗，诸如CoronaVac、BBIBP-CorV或BBV152治疗。在其他态样中，先前经疫苗组成物治疗的个体具有可侦测的SARS CoV-2结合抗体，诸如SARS CoV-2S蛋白结合抗体或SARS CoV-2N蛋白结合抗体。在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体在至少约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年前经第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。在其他态样中，根据具体实例的用于治疗的个体在约3个月与2年之间或在约6个月与2年之间经第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。在一些态样中，在至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中，经具体实例的另一疫苗组成物治疗的个体经保护免于中度及重度COVID-19疾病。例如，在投予另一组成物之后约2周至约1年，可在至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中保护经治疗的个体免于中度及重度COVID-19疾病。在又其他态样中，在该投予之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，投予具体实例的另一疫苗组成物预防至少80％、85％、90％或95％经治疗的个体中的中度及重度COVID-19疾病。此类组合疫苗接种策略的实施例显示如下：
剂1mRNA疫苗-T1-剂2mRNA疫苗-T2-剂3mRNA疫苗
剂1mRNA疫苗-T1-剂2mRNA疫苗-T2-剂3蛋白次单位疫苗
剂1mRNA疫苗-T1-剂2mRNA疫苗-T2-剂3病毒载体疫苗
剂1mRNA疫苗-T1-剂2mRNA疫苗-T2-剂3不活化病毒疫苗
剂1蛋白次单位疫苗-T1-剂2蛋白次单位疫苗-T2-剂3mRNA疫苗
剂1不活化病毒疫苗-T1-剂2不活化病毒疫苗-T2-剂3mRNA疫苗
剂1病毒载体疫苗-T1-剂2病毒载体疫苗-T2-剂3mRNA疫苗
剂1病毒载体疫苗-T2-剂2mRNA疫苗
剂1蛋白次单位疫苗-T2-剂2mRNA疫苗
剂1不活化病毒疫苗-T2-剂2mRNA疫苗
剂1mRNA疫苗-T2-剂2mRNA疫苗
在实施例中，以上时间段1(T1)典型地为2至6周，较佳3至4周。时间段2(T2)在一些情况下为约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或三年。
在一些态样中，具体实例的方法包含向个体投予多剂的疫苗组成物。在另一态样中，提供一种降低SARS CoV-2加打疫苗组成物的反应原性的方法。在一些态样中，在初始疫苗接种之后，向呈现高水平的反应原性的个体投予不同于初始疫苗组成物的加打疫苗。例如，在一些态样中，初始疫苗为BNT162或mRNA-1273且加打疫苗为具体实例的mRNA疫苗组成物。在一些态样中，基于与先前投予的疫苗组成物相比具有较低浓度的PEG或PEG-共轭物选择用于具有高反应原性的个体的加打疫苗组成物。在一些态样中，基于与先前投予的疫苗组成物相比具有较低浓度的mRNA或LNP选择用于具有高反应原性的个体的加打疫苗组成物。
在某些态样中，根据具体实例的用于治疗的个体投予作为加打疫苗的疫苗组成物且先前已经一或多次冠状病毒疫苗组成物的投予治疗。在某些态样中，经加打疫苗治疗的个体先前经包括棘蛋白抗原或编码棘蛋白抗原的核酸分子的疫苗组成物治疗。在一些态样中，选择经加打疫苗治疗的个体先前投予疫苗组成物，该疫苗组成物包含或编码具有与加打疫苗的棘蛋白不同的氨基酸序列的棘蛋白。在某些态样中，先前投予的疫苗组成物包含或编码棘蛋白(例如SARS CoV-2棘蛋白)，该棘蛋白相对于加打疫苗组成物具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在某些态样中，加打疫苗组成物包含编码相对于先前投予的疫苗组成物具有约1至50个；约3至30个；约5至30个或约10至25个氨基酸差异的棘蛋白的RNA。在又其他态样中，加打疫苗组成物包含编码2、3、4或更多种具有不同氨基酸序列的独特棘蛋白的RNA。
在其他态样中，具体实例的方法包含向个体投予2种或更多种加打疫苗组成物，其中各加打疫苗组成物包含编码具有不同氨基酸序列的独特棘蛋白的RNA。在一些态样中，此类独特加打疫苗组成物基本上同步或小于约10分钟、20分钟、30分钟、1小时或2小时相隔投予。在一些态样中，独特加打疫苗组成物投予至同一位点，诸如向个体的同一臂肌内注射。在其他态样中，独特加打疫苗组成物投予不同位点，诸如向不同臂或向一或两个臂及一或多个腿部肌内注射。
在某些态样中，具体实例的方法另外定义为刺激个体中的抗体或CD8+T细胞反应的方法。在一些态样中，该方法定义为刺激个体中的中和抗体反应的方法。在其他态样中，该方法定义为刺激个体的保护性免疫反应的方法。在又其他态样中，该方法定义为在个体中刺激TH2导向免疫反应的方法。
在其他态样中，投予具体实例的疫苗/组成物/组合刺激抗体反应，该抗体反应针对个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约10至约500个冠状病毒棘蛋白结合抗体。例如，投予可刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约200个棘蛋白结合抗体。在其他态样中，投予刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约10至约300；约20至约300；约20至约200；约30至约100个或约30至约80个冠状病毒棘蛋白结合抗体。在又其他态样中，投予具体实例的组成物刺激个体中的抗体反应，该抗体反应包括棘蛋白结合抗体与冠状病毒中和抗体的比率为在恢复期患者平均血清(来自已自冠状病毒感染中康复的个体)中发现的棘蛋白结合抗体与冠状病毒中和抗体的比率的20％、15％、10％或5％。
在其他态样中，投予具体实例的疫苗/组成物/组合刺激抗体反应，该抗体反应针对个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约1至约500个冠状病毒棘蛋白受体结合域(RBD)结合抗体。在其他态样中，投予刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约50个棘蛋白RBD结合抗体。在其他态样中，投予刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约1至约200；约2至约100；约3至约200；约5至约100；约5至约50或约5至约20个棘蛋白RBD结合抗体。在又其他态样中，投予具体实例的组成物刺激个体中的抗体反应，该抗体反应包括棘蛋白RBD结合抗体与冠状病毒中和抗体的比率为在恢复期患者平均血清(来自已自冠状病毒感染中康复的个体)中发现的棘蛋白RBD结合抗体与冠状病毒中和抗体的比率的20％、15％、10％或5％。
在其他态样中，投予具体实例的疫苗/组成物/组合基本上不诱导个体中的IL-4、IL-13、TNF及/或IL-1β增加。在其他态样中，投予具体实例的疫苗/组成物基本上不诱导个体中血清的IL-4、IL-13、TNF及/或IL-1β增加。在一些态样中，投予具体实例的疫苗/组成物基本上不诱导个体中的注射部位(例如肌内注射部位)处的IL-4、IL-13、TNF及/或IL-1β增加。
在其他态样中，具体实例的方法包含向患有疾病的人类个体投予具体实例的疫苗/组成物。在某些态样中，个体患有心血管疾病、肾病、肺病或自体免疫疾病。在一些态样中，向正接受抗凝血疗法的个体投予具体实例的疫苗/组成物。
在其他态样中，向人类个体投予具体实例的疫苗/组成物/组合导致不超过20％、15％、10％、7.5％或5％的个体经历3级局部不良事件(参见下表A)。例如，在一些态样中，在组成物的第一或第二剂之后，不超过10％的个体经历3级局部不良事件。在较佳态样中，向人类个体投予具体实例的组成物导致不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、7.5％或5％的个体经历2级更高的局部不良事件。例如，在一些态样中，在组成物的第一或第二剂之后，不超过30％的个体经历2级或更高的局部不良事件。在一些态样中，向人类个体投予具体实例的组成物导致不超过10％的个体在注射位点处经历3级疼痛、发红、肿胀及/或瘙痒。
在其他态样中，向人类个体投予具体实例的疫苗/组成物/组合导致不超过30％、25％、20％、15％、10％或5％的个体经历3级全身性不良事件(参见下表B)。例如，在一些态样中，在组成物的第一剂之后，不超过25％的个体经历3级全身性不良事件。在一些态样中，在组成物的第二剂之后，不超过40％的个体经历3级全身性不良事件。在一些态样中，向人类个体投予具体实例的组成物导致不超过30％、25％、20％、15％、10％或5％的个体经历3级发烧、头痛、疲劳、发冷、肌痛、关节痛、恶心及/或腹泻。
表A：征集到的局部不良事件的强度分级*
Figure GDA0003858923850001951
Figure GDA0003858923850001961
表B：征集到的全身性不良事件的强度分级*
Figure GDA0003858923850001962
*FDA毒性分级量表(美国卫生及公共服务部。美国食品药物管理局(FDA)。行业指南。参加预防性疫苗临床试验的健康成人及青少年志愿者的毒性分级量表。2007年于万维网fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Vaccines/ucm091977.pdf；访问日期：2019年3月，以引用的方式并入本文中)；IV＝静脉内。
根据另一态样，本发明亦提供一种用于表现至少一种多肽的方法，该至少一种多肽包含至少一种源自冠状病毒的肽或蛋白或其片段或变异体，其中该方法较佳包含以下步骤：
a)提供至少一种第一态样的核酸或至少一种第二态样的组成物；及
b)将该核酸或组成物施用或投予至表现系统(细胞)、组织、生物体。用于表现多肽(由本发明的核酸提供)的合适细胞可为果蝇S2昆虫细胞系。
用于表现的方法可应用于实验室、用于研究、用于诊断、用于商业生产肽或蛋白及/或用于治疗目的。该方法可进一步在治疗特定疾病的情形下进行，尤其在治疗传染性疾病，尤其为冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒感染及疾病COVID-19中进行。
同样，根据另一态样，本发明亦提供核酸、组成物、多肽、疫苗或套组或部件套组的用途，其较佳用于诊断或治疗目的，例如用于表现编码的冠状病毒抗原肽或蛋白。
在特定具体实例中，向组织或生物体施用或投予该核酸、多肽、组成物、疫苗、组合之后可随后进行例如获得所诱导的冠状病毒抗体(例如SARS-CoV-2冠状病毒专一性(单株)抗体)的步骤或获得所产生的SARS-CoV-2冠状病毒蛋白构筑体(S蛋白)的步骤。
该用途可应用于(诊断)实验室、用于研究、用于诊断、用于商业生产肽、蛋白或SARS-CoV-2冠状病毒抗体及/或用于治疗目的。该用途可在试管内、活体内或活体外进行。该用途可进一步在治疗特定疾病的情形下进行，尤其在治疗冠状病毒感染(例如COVID-19)或相关病症中进行。
根据另一态样，本发明亦提供一种制造组成物或疫苗的方法，其包含以下步骤：
a)使用DNA模板在帽类似物存在下进行RNA试管内转录步骤以获得加帽mRNA，较佳具有如表3a及3b中所提供的核酸序列；
b)使用RP-HPLC及/或TFF及/或寡聚(dT)纯化及/或AEX纯化步骤a)的所获得的加帽RNA，较佳使用RP-HPLC；
c)提供包含步骤b)的经纯化加帽RNA的第一液体组成物；
d)提供包含至少一种如本文所定义的阳离子脂质、如本文所定义的中性脂质、如本文所定义的类固醇或类固醇类似物及如本文所定义的PEG脂质的第二液体组成物；
e)将该第一液体组成物及该第二液体组成物引入至少一个混合构件中，以允许形成包含加帽RNA的LNP；
f)纯化所获得的包含加帽RNA的LNP；
g)视需要冻干包含加帽RNA的该经纯化的LNP。
较佳地，步骤e)的混合构件为T形连接器或微流混合装置。较佳地，纯化步骤f)包含至少一种选自沉淀步骤、透析步骤、过滤步骤、TFF步骤的步骤。视需要，可在步骤a)或b)之后进行多腺苷酸化步骤。视需要，可实施其他纯化步骤以例如移除残余DNA、缓冲液、小型RNA副产物等。视需要，在无帽类似物存在下进行RNA试管内转录，且在RNA试管内转录之后进行酶加帽步骤。视需要，RNA试管内转录是在至少一种如本文所定义的经修饰的核苷酸存在下进行。
在具体实例中，步骤a、较佳步骤a-c、更佳上文所概述的所有步骤(a-g)在用于RNA试管内转录的自动化装置中进行。此类装置亦可用于产生组成物或疫苗(参见态样2及3)。较佳地，可适当地使用如WO2020/002598中所描述的装置，特定言之，如WO2020/002598(及图1-18)的权利要求1至59及/或68至76中所描述的装置。
较佳具体实例/项目的清单
在下文中，提供本发明的尤其较佳具体实例(项目1-275)。
项目清单：
项目1.一种核酸，其包含至少一个编码序列，该至少一个编码序列编码来自或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白，或其免疫原性片段或免疫原性变异体，其中该核酸包含至少一个异源非转译区(UTR)。
项目2.如项目1的核酸，其中该核酸适用于疫苗。
项目3.如项目1或2的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由至少一种肽或蛋白组成，该至少一种肽或蛋白为或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体。
项目4.如项目3的核酸，其中该结构蛋白为或衍生自棘蛋白(S)、套膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核酸蛋白壳体蛋白(N)或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体。
项目5.如项目1至4中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白为或衍生自棘蛋白(S)或其免疫原性片段或免疫原性变异体。
项目6.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或序列中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目7.如项目4至6中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)包含或由棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
项目8.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27、29、31-48、58-111、274-1345、1480-1546、1614-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目9.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27、1279-1345、29、1480-1546、13243-13309、22733-22736、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目10.如项目4至9中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)包含或由以下者组成：棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体，及棘蛋白片段S2或其免疫原性片段或免疫原性变异体。
项目11.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-26、31-48、58-111、274-1278、1614-11663、13377-13510、13521-14177、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目12.如项目4至11中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
项目13.如项目12的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含以下氨基酸取代：K986P及V987P。
项目14.如项目12或13的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含空腔填充突变。
项目15.如项目14的核酸，其中该至少一个空腔填充突变是选自包含T887W；A1020W；T887W及A1020W；或P1069F的清单。
项目16.如项目12至15中任一项的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含突变的质子化位点。
项目17.如项目16的核酸，其中该至少一个突变的质子化位点是选自包含H1048Q及H1064N；H1083N及H1101N；或H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N的清单。
项目18.如项目12至17中任一项的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变产生至少一个人工分子内双硫键。
项目19.如项目18的核酸，其中该至少一个人工分子内双硫键是借由以下氨基酸取代产生：I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C或N914C及S1123C。
项目20.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、40-48、85-111、341-1278、1681-2618、2686-3623、3691-4628、4696-5633、5701-6638、6706-7643、7711-8648、8716-9653、9721-10658、10726-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或序列中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目21.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或序列中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目22.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列额外编码选自以下者的一或多种异源肽或蛋白元件：信号肽、连接子、辅助表位、抗原簇聚元件、三聚元件、跨膜元件及/或VLP形成序列。
项目23.如项目22的核酸，其中该至少一种异源肽或蛋白元件为异源抗原簇聚元件、异源三聚元件及/或VLP形成序列。
项目24.如项目22或23的核酸，其中该至少一种异源抗原簇聚元件是选自铁蛋白元件、二氧四氢喋啶合酶元件、B型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或囊封素。
项目25.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:58-75、85-102、3624-5633、7644-9653、13588-13721、13856-13989、22733、22735、22736中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目26.如项目22或23的核酸，其中该至少一种异源三聚元件为折叠子元件，较佳纤维蛋白折叠子(folden)元件。
项目27.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:76-84、103-111、5634-6638、9654-10658、13722-13788、13990-14056、22734、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目28.如项目22或23的核酸，其中该至少一个VLP形成序列为土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。
项目29.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6639-7643、10659-11663、13789-13855、14057-14123中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目30.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、10、21、22、25、27、274、341、408、475、542、743、810、1011、1145、1212、1279、8716、10726、22732-22758、22929-22942、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目31.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10、22960、22961或22963中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目32.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由至少一种核酸序列组成，该至少一种核酸序列与SEQ ID NO:116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目33.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白是包含融合前稳定性K986P及V987P突变的S蛋白，其包含或由氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ IDNO:10或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致。
项目34.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列为密码子经修饰的编码序列，其中与借由对应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，借由至少一个密码子经修饰的编码序列编码的该氨基酸序列较佳未经修饰。
项目35.如项目34的核酸，其中该至少一个密码子经修饰的编码序列是选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用调适编码序列、G/C含量修饰的编码序列及G/C最佳化编码序列，或其任何组合。
项目36.如项目34或35的核酸，其中该至少一个密码子经修饰的编码序列为G/C最佳化编码序列、人类密码子使用调适编码序列或G/C含量修饰的编码序列。
项目37.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由G/C最佳化编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO:136-138、140、141、148、149、152、155、156、159、162、163、166、169、170、173、11731-11813、11815、11817-11966、12271-12472、12743-12944、13514、13515、14124-14132、14142-14150、14160-14168、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23040、23077-23148、23189-23260、23297-23368、23409-23480、23517-23588、23629-23700、23737-23808、23849-23920、23957-24028、2406924140、24177-24248、24289-24360、24397-24468、24509-24580、24617-24688、24729-24800、24837-24908、24949-25020、25057-25128、25169-25240、25277-25348、25389-25460、25497-25568、25609-25680、25717-25788、25829-25900、25937-26008、26049-26120、26157-26228、26269-26340、26377-26448、26489-26560、26597-26668、26709-26780、26817-26888、26925-26937中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目38.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由人类密码子使用调适编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO:142、143、145、150、153、157、160、164、167、171、174、11967-12033、12473-12539、12945-13011中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目39.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由G/C含量修饰的编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO:146、147、151、154、158、161、165、168、172、175、12034-12050、12052、12054-12203、12540-12675、13012-13147、13519、13520、14133-14141、14151-14159、14169-14177、23041-23076、23149-23184、23261-23296、23369-23404、23481-23516、23589-23624、23701-23736、23809-23844、23921-23956、24029-24064、24141-24176、24249-24284、24361-24396、24469-24504、24581-24616、24689-24724、24801-24836、24909-24944、25021-25056、25129-25164、25241-25276、25349-25384、25461-25496、25569-25604、25681-25716、25789-25824、25901-25936、26009-26044、26121-26156、26229-26264、26341-26376、26449-26484、26561-26596、26669-26704、26781-26816、26889-26924中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目40.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列的G/C含量为至少约50％、55％或60％，较佳约63.9％。
项目41.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列编码包含融合前稳定性K986P及V987P突变的S蛋白，其中该编码序列包含或由G/C最佳化编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO:137、23090、23091、23093、23094或其片段或变异体一致。
项目42.如前述项目中任一项的核酸，其中该至少一个异源非转译区是选自至少一个异源5'-UTR及/或至少一个异源3'-UTR。
项目43.如项目42的核酸，其中该至少一个异源3'-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列衍生自选自以下者的基因的3'-UTR：PSMB3、ALB7、α-球蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1及RPS9，或此等基因中的任一者的同源物、片段或变异体。
项目44.如项目42的核酸，其中该至少一个异源5'-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列衍生自选自以下者的基因的5'-UTR：HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B及UBQLN2，或此等基因中的任一者的同源物、片段或变异体。
项目45.如项目42的核酸，其中该至少一个异源5'-UTR及该至少一个异源3'UTR是选自UTR设计a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、e-2(RPL31/RPS9)及i-3(-/muag)，其中UTR设计a-1(HSD17B4/PSMB3)及i-3(-/muag)是尤其较佳的。
项目46.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含至少一个多(A)序列，较佳包含30至200个腺苷核苷酸及/或至少一个多(C)序列，较佳包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
项目47.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含至少一个组蛋白茎-环。
项目48.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为DNA或RNA。
项目49.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为编码RNA。
项目50.如项目49的核酸，其中该编码RNA为mRNA、自我复制RNA、环状RNA或复制子RNA。
项目51.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸，较佳该编码RNA为mRNA。
项目52.如项目51的核酸，其中该mRNA不是复制子RNA或自我复制RNA。
项目53.如项目51的核酸，其中该mRNA包含至少一个包含30至200个腺苷核苷酸的多(A)序列，且3'末端核苷酸为腺苷。
项目54.如项目48至51中任一项的核酸，其中该RNA，较佳该编码RNA包含5'-帽结构，较佳m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构，较佳5'-帽1结构。
项目55.如项目48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5'-至3'-方向包含下列元件：
A)5'-帽1结构；
B)根据SEQ ID NO.137的编码序列或其片段或变异体；
C)较佳根据SEQ ID NO:267或268的衍生自α-球蛋白基因的3'-UTR的3'-UTR；
D)包含约64个A核苷酸的多(A)序列；
E)包含约30个C核苷酸的多(C)序列；
F)根据SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环。
项目56.如项目48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5'-至3'-方向包含下列元件：
A)5'-帽1结构；
B)较佳根据SEQ ID NO:231或232的衍生自HSD17B4基因的5'-UTR的5'-UTR；
C)根据SEQ ID NO.137的编码序列或其片段或变异体；
D)较佳根据SEQ ID NO:253或254的衍生自PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR；
E)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列。
项目57.如项目56的核酸，其中该3'末端核苷酸为腺苷。
项目58.如项目48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5'-至3'-方向包含下列元件：
A)5'-帽1结构；
B)根据SEQ ID NO.23090或23091的编码序列或其片段或变异体；
C)较佳根据SEQ ID NO:267或268的衍生自α-球蛋白基因的3'-UTR的3'-UTR；
D)包含约64个A核苷酸的多(A)序列；
E)包含约30个C核苷酸的多(C)序列；
F)根据SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环。
项目59.如项目48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5'-至3'-方向包含下列元件：
A)5'-帽1结构；
B)较佳根据SEQ ID NO:231或232的衍生自HSD17B4基因的5'-UTR的5'-UTR；
C)根据SEQ ID NO.23090或23091的编码序列或其片段或变异体；
D)较佳根据SEQ ID NO:253或254的衍生自PSMB3基因的3'-UTR的3'-UTR；
E)选自SEQ ID NO:178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列。
项目60.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937148组成的群的核酸序列或此等序列中的任一者的片段或变异体。
项目61.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO:149、156、12338、150、157、151、158、12541、163、170、12810、164、171、165、172、13013、12342-12351、12545-12554、12814-12823、13017-13026、14133组成的群的核酸序列或此等序列中的任一者的片段或变异体，较佳选自SEQ ID NO:149、150、151、163、164、165或此等序列中的任一者的片段或变异体。
项目62.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自SEQ ID NO:163的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目63.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自SEQ ID NO:149的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目64.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自SEQ ID NO:24837的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目65.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自由以下者组成的群组：SEQ ID NO:23311、23531、24851或其片段或变异体的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目66.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自由SEQ ID NO:23310、23530、24850组成的群的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目67.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列，较佳RNA序列组成，该核酸序列与选自由SEQ ID NO:23313、23533、24853、23314、23534、24854组成的群的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目68.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为不包含1-甲基假尿苷取代的RNA。
项目69.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为不包含经化学修饰的核苷酸的RNA。
项目70.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为试管内转录RNA，其中RNA试管内转录已在序列最佳化核苷酸混合物及帽类似物存在下进行，较佳其中该序列最佳化核苷酸混合物不包含经化学修饰的核苷酸。
项目71.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，较佳为已借由RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA。
项目72.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，其已借由RP-HPLC及/或TFF纯化且包含比尚未用RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
项目73.如前述项目中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，其已借由RP-HPLC及/或TFF纯化且包含比已用Oligo dT纯化、沉淀、过滤及/或阴离子交换层析纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
项目74.一种组成物，其包含至少一种如项目1至73中任一项的核酸，其中该组成物视需要包含至少一种医药学上可接受的载剂。
项目75.如项目74的组成物，其中该组成物包含根据SEQ ID NO:149、163、24837、23311、23531、23310、23530、23313或23533的mRNA或此等序列中的任一者的片段或变异体。
项目76.如项目74的组成物，其中该组成物为包含该多种或至少多于一种如项目1至73中任一项的核酸的多价组成物。
项目77.如项目76的组成物，其中该多价组成物的该多种或至少多于一种核酸序列各自编码不同的棘蛋白，较佳融合前稳定化棘蛋白。
项目78.如项目77的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白是衍生自不同SARS-CoV-2病毒变异体/分离株。
项目79.如项目78的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白是至少衍生自B.1.1.7、B.1.351、P.1或CAL.20C。
项目80.如项目78的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白在S蛋白中具有氨基酸变化，所述氨基酸变化包含：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V；
(iv)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I；及/或
(v)S13I、W152C、L452R及D614G。
项目81.如项目76至78中任一项的组成物，其中该多价组成物包含至少两种核酸物种，所述核酸物种包含编码氨基酸序列的编码序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:10、22961；22960、22963、22941、22964中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目82.如项目76至78中任一项的组成物，其中该多价组成物包含至少两种RNA物种，所述RNA物种与SEQ ID NO:149或24837、23531或24851、23530或24850、23533或24853、23439或24759或23534或24854中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目83.如项目74至80中任一项的组成物，其中该组成物包含具有70％或更高的RNA完整性的mRNA。
项目84.如项目74至83中任一项的组成物，其中该组成物包含具有70％或更高的加帽度的mRNA，较佳其中至少70％、80％或90％的所述mRNA物种包含帽1结构。
项目85.如项目74至84中任一项的组成物，其中该至少一种核酸与一或多种阳离子或聚阳离子化合物，较佳阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或缔合或至少部分复合或部分缔合。
项目86.如项目85的组成物，其中该至少一种核酸是与一或多种脂质或基于脂质的载体复合或缔合，从而形成脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体及/或纳米脂质体，较佳囊封该至少一种核酸。
项目87.如项目85或86的组成物，其中该至少一种核酸与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子。
项目88.如项目86或87的组成物，其中该LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
Figure GDA0003858923850002131
项目89.如项目86至88中任一项的组成物，其中该LNP包含式(IVa)的PEG脂质：
Figure GDA0003858923850002132
其中n具有范围为30至60的平均值，较佳其中n具有约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54的平均值，最佳其中n具有49或45的平均值。
项目90.如项目86至88中任一项的组成物，其中该LNP包含式(IVa)的PEG脂质：
Figure GDA0003858923850002133
其中n为经选择以使得该PEG脂质的平均分子量为约2500g/mol的整数。
项目91.如项目86至90中任一项的组成物，其中该LNP包含一或多种中性脂质及/或一或多种类固醇或类固醇类似物。
项目92.如项目91的组成物，其中该中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，较佳其中该阳离子脂质与DSPC的摩尔比在约2:1至约8:1范围内。
项目93.如项目91的组成物，其中该类固醇为胆固醇，较佳其中该阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约2:1至约1:1范围内。
项目94.如项目86至93中任一项的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质，较佳式(III)的脂质，更佳脂质III-3；
(ii)至少一种中性脂质，较佳1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种聚合物共轭脂质，较佳衍生自式(IVa，其中n＝49)的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目95.如项目86至93中任一项的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质，较佳式(III)的脂质，更佳脂质III-3；
(ii)至少一种中性脂质，较佳1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种聚合物共轭脂质，较佳衍生自式(IVa，其中n＝45)的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目96.如项目94或95的组成物，其中(i)至(iv)的摩尔比为约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7。
项目97.如项目87至96中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且该组成物包含小于约20％游离(未经复合或未经囊封)RNA，较佳小于约15％游离RNA，更佳小于约10％游离RNA。
项目98.如项目87至97中任一项的组成物，其中脂质与核酸的wt/wt比为约10:1至约60:1，较佳约20:1至约30:1，例如约25:1。
项目99.如项目87至98中任一项的组成物，其中所述囊封核酸的LNP的n/p比率是在约1至约10范围内，较佳在约5至约7范围内，更佳为约6。
项目100.如项目87至99中任一项的组成物，其中该组成物的多分散性指数(PDI)值为小于约0.4，较佳小于约0.3，更佳小于约0.2，最佳小于约0.1。
项目101.如项目86至100中任一项的组成物，其中所述LNP的Z平均尺寸在约60nm至约120nm范围内，较佳小于约120nm，更佳小于约100nm，最佳小于约80nm。
项目102.如项目86至101中任一项的组成物，其中所述LNP包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％具有超过约500nm的粒度的LNP。
项目103.如项目86至102中任一项的组成物，其中该LNP包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％具有小于约20nm的粒度的LNP。
项目104.如项目86至103中任一项的组成物，其中至少约80％、85％、90％、95％基于脂质的载体具有球形形态，较佳包含实心核心或部分实心核心。
项目105.如项目86至104中任一项的组成物，其中该组成物的浊度在约150FNU至约0.0FNU范围内，较佳为约50FNU或以下，更佳为约25FNU或以下。
项目106.如项目74至105中任一项的组成物，其进一步包含浓度为约50至约300mM的糖，较佳浓度为约150mM的蔗糖。
项目107.如项目74至106中任一项的组成物，其进一步包含浓度为约10mM至约200mM的盐，较佳浓度为约75mM的NaCl。
项目108.如项目74至107中任一项的组成物，其进一步包含浓度为1mM至约100mM的缓冲剂，较佳浓度为约10mM的Na3PO4。
项目109.如项目74至108中任一项的组成物，其中该组成物的pH在约pH 7.0至约pH 8.0范围内，较佳约pH 7.4。
项目110.如项目86至109中任一项的组成物，其包含囊封编码SARS-CoV-2S蛋白的RNA的脂质纳米粒子，该蛋白包含融合前稳定性K986P及V987P突变
其中该LNP包含
(i)式III-3的阳离子脂质；
(ii)1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)胆固醇；及
(iv)式IVa的PEG脂质(n＝49))，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4％阳离子脂质、10％DSPC、40.9胆固醇、1.7％PEG脂质；
其中该RNA与SEQ ID NO.163或149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中该RNA未经化学修饰；
其中该RNA包含5'-帽1结构；
其中该RNA的完整性为至少约70％；
其中所述囊封RNA的LNP的n/p比率为约6；
其中所述囊封RNA的LNP的Z平均尺寸为约60nm至约120nm；
其中该组成物包含小于约20％的游离(未经复合；未经囊封)RNA；
视需要，其中该组成物进一步包含浓度为约150mM的蔗糖、浓度为约75mM的NaCl、浓度为约10mM的Na3PO4；
视需要，其中该组成物的pH为约pH 7.4。
项目111.如项目86至109中任一项的组成物，其包含囊封编码SARS-CoV-2S蛋白的RNA的脂质纳米粒子，该蛋白包含融合前稳定性K986P及V987P突变
其中该LNP包含
(i)式III-3的阳离子脂质；
(ii)1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)胆固醇；及
(iv)式IVa的PEG脂质(n＝45))，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4％阳离子脂质、10％DSPC、40.9胆固醇、1.7％PEG脂质；
其中该RNA与SEQ ID NO.163或149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中该RNA未经化学修饰；
其中该RNA包含5'-帽1结构；
其中该RNA的完整性为至少约70％；
其中所述囊封RNA的LNP的n/p比率为约6；
其中所述囊封RNA的LNP的Z平均尺寸为约60nm至约120nm；
其中该组成物包含小于约20％的游离(非复合)RNA；
视需要，其中该组成物进一步包含浓度为约150mM的蔗糖、浓度为约75mM的NaCl、浓度为约10mM的Na3PO4；
视需要，其中该组成物的pH为约pH 7.4。
项目112.如项目86至110中任一项的组成物，其包含未经化学修饰的RNA，该未经化学修饰的RNA与在脂质纳米粒子(LNP)中调配的SEQ ID NO.163的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，所述LNP具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质。
项目113.如项目86至110中任一项的组成物，其包含未经化学修饰的RNA，该未经化学修饰的RNA与在脂质纳米粒子(LNP)中调配的SEQ ID NO.149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，所述LNP具有大约50:10:38.5:1.5，较佳47.5:10:40.8:1.7或更佳47.4:10:40.9:1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质。
项目114.如项目74至112中任一项的组成物，其中该组成物包含编码SARS-CoV-2棘蛋白(S)的mRNA，该棘蛋白(S)为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
项目115.如项目114的组成物，其中该mRNA编码与SEQ ID NO:163至少95％一致的SARS-CoV-2棘蛋白或编码与SEQ ID NO:163一致的冠状病毒棘蛋白。
项目116.如项目114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；及
(iv)至少一种PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目117.如项目114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目118.如项目114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5:10:40.8:1.7。
项目119.如项目114的组成物，其中该LNP包含：
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4:10:40.9:1.7。
项目120.如项目107至118中任一项的组成物，其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目121.如项目120的组成物，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5:10:40.8:1.7，且
其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目122.如项目120的组成物，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含：
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4:10:40.9:1.7，且
其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目123.如项目74至99或110至122中任一项的组成物，其中该组成物为冻干组成物。
项目124.如项目123的组成物，其中该冻干组成物的含水量为小于约10％。
项目125.如项目124的组成物，其中该冻干组成物的含水量在约0.5％与5％之间。
项目126.如项目86至122中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定至少约两周。
项目127.如项目126的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定至少1个月。
项目128.如项目126的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。
项目129.如项目126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少约两周，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
项目130.如项目129的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少1个月，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
项目131.如项目126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
项目132.如项目126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存约两周之后，至少80％的RNA为完整的。
项目133.如项目86至132中任一项的组成物，其中该组成物包含聚集减少脂质。
项目134.如项目86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA的浓度在约10μg/ml至约10mg/ml范围内，较佳在约100μg/ml至约1mg/ml范围内。
项目135.如项目86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA的浓度为至少100μg/ml，更佳至少200μg/ml，最佳至少500μg/ml。
项目136.如项目86至135中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA具有至少约50％，较佳至少约60％，更佳至少约70％，最佳至少约80％的RNA完整性。
项目137.如项目86至136中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物包含小于约20％游离RNA，较佳小于约15％游离RNA，更佳小于约10％游离RNA。
项目138.如项目86至137中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物包含每g RNA小于约100nM二价阳离子，较佳每g RNA小于约50nM二价阳离子，更佳每g RNA小于约10nM二价阳离子。
项目139.如项目138的组成物，其中所述二价阳离子是选自Mg2+及/或Ca2+。
项目140.如项目86至139中任一项的组成物，其中脂质的浓度在约250μg/ml至约250mg/ml范围内，较佳在约2.5mg/ml至约25mg/ml范围内。
项目141.如项目86至140中任一项的组成物，其中脂质的浓度为至少约2.5mg/ml，较佳至少5mg/ml，更佳至少12.5mg/ml。
项目142.如项目133至142中任一项的组成物，其中聚集减少脂质的浓度在约17.5μg/ml至约17.5mg/ml范围内，较佳在约175μg/ml至约1.75mg/ml范围内。
项目143.如项目133至142中任一项的组成物，其中聚集减少脂质的浓度为至少约175μg/ml，较佳至少约350μg/ml，更佳至少875μg/ml。
项目144.如项目86至143中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中脂质与RNA的wt/wt比为约10:1至约60:1，较佳约20:1至约30:1，更佳约25:1。
项目145.如项目86至144中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中基于脂质的载体与RNA的N/P比率在约1至约10范围内，较佳在约5至约7范围内，更佳为约6。
项目146.如项目86至143中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中所述囊封RNA的基于脂质的载体包含摩尔比率为约0.5％-15％，较佳摩尔比率为约1.0％至约2.5％，更佳摩尔比率为约1.7％的聚集减少脂质。
项目147.如项目133至143中任一项的组成物，其中该聚集减少脂质为聚合物共轭脂质，例如PEG共轭脂质。
项目148.如项目86至147中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA及囊封RNA的基于脂质的载体已借由至少一个纯化步骤，较佳借由至少一个TFF步骤及/或至少一个澄清步骤及/或至少一个过滤步骤纯化。
项目149.如项目86至148中任一项的组成物，其中该组成物包含小于约500ppM乙醇，较佳小于约50ppM乙醇，更佳小于约5ppM乙醇。
项目150.如权利要求86至154中任一项的组成物，其中该组成物的容积渗透浓度(osmolarity)为约250mOsmol/kg至约450mOsmol/kg，较佳为约335mOsmol/kg。
项目151.如项目86至150中任一项的组成物，其中该组成物在约25℃下以液体形式储存之后稳定至少1周，较佳至少2周，更佳至少3周，最佳至少4周。
项目152.如项目86至151中任一项的组成物，其中该组成物在约40℃下以液体形式储存之后稳定至少1天，较佳至少2天，更佳至少3天，最佳至少4天。
项目153.如项目86至152中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该RNA的完整性降低小于约30％，较佳小于约20％，更佳小于约10％。
项目154.如项目86至153中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，游离RNA的量增加不超过10％，较佳不超过5％。
项目155.如项目86至154中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中在以液体形式储存时，所述囊封RNA的基于脂质的载体的PDI值增加不超过约0.2的值，较佳不超过约0.1的值。
项目156.如项目86至155中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中在以液体形式储存时，所述囊封RNA的基于脂质的载体的Z平均尺寸增加不超过20％，较佳不超过10％。
项目157.如项目86至156中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该组成物的浊度增加不超过20％，较佳不超过10％。
项目158.如项目86至157中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，pH及/或重量渗透浓度(osmolality)增加或减少不超过20％，较佳不超过10％。
项目159.如项目86至158中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该组成物的效力降低小于约30％，较佳小于约20％，更佳小于约10％。
项目160.如项目86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA为经纯化的RNA，较佳RP-HPLC纯化的RNA及/或切向流过滤(TFF)纯化的RNA。
项目161.如项目74至160中任一项的组成物，其另外包含至少一种RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂，较佳TLR7受体及/或TLR8受体的至少一种拮抗剂。
项目162.如项目161的组成物，其中该TLR7受体及/或TLR8受体的至少一种拮抗剂为单股寡核苷酸，较佳p5'-GAG CGmG CCA-3'。
项目163.一种用于疫苗的多肽，其包含至少一种为或衍生自冠状病毒SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变异体，较佳其中该抗原肽或蛋白的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO:1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938,26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
项目164.一种疫苗，其包含如项目1至73中任一项的核酸及/或如项目74至162中任一项的组成物及/或如项目163的多肽。
项目165.如项目164的疫苗，其中该疫苗引发适应性免疫反应，较佳针对冠状病毒，较佳针对冠状病毒SARS-CoV-2的保护性适应性免疫反应。
项目166.如项目164或165的疫苗，其中该疫苗为多价疫苗，其包含多种或至少多于一种如项目1至73中任一项所定义的核酸或多种或多于一种如项目74至162中任一项所定义的组成物。
项目167.一种套组或部件套组，其包含如项目1至73中任一项的核酸，及/或如项目74至162中任一项的组成物，及/或如项目163的多肽，及/或如项目164至166的疫苗，视需要包含用于溶解的液体媒剂，且视需要包含提供关于所述组分的投予及剂量的资讯的技术说明书。
项目168.如项目1至73中任一项的核酸、如项目74至162中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗、如项目167的套组或部件套组，其用作医药品。
项目169.如项目1至73中任一项的核酸、如项目74至162中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗、如项目167的套组或部件套组，其用于治疗或预防冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒感染或与此类感染相关的病症，较佳COVID-19。
项目170.一种治疗或预防病症的方法，其中该方法包含向有需要的个体施用或投予如项目1至73中任一项的核酸、如项目74至162中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗及/或如项目167的套组或部件套组。
项目171.如项目170的治疗或预防病症的方法，其中该病症为冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒或与此类感染相关的病症，较佳COVID-19。
项目172.如项目170或171的治疗或预防病症的方法，其中该有需要的个体为哺乳动物个体，较佳人类个体。
项目173.如项目170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体为老年人类个体，较佳年龄为至少50、60、65或70岁。
项目174.如项目173的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体的年龄为61岁或更大。
项目175.如项目170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体的年龄为18至60岁。
项目176.如项目170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该个体怀孕。
项目177.如项目170至175中任一项的方法，其中不超过25％的个体在第一剂的该组成物之后经历3级全身不良事件，或其中不超过30％的个体在第一剂的该组成物之后经历2级或更高局部不良事件。
项目178.如项目170至175中任一项的方法，其中不超过40％的个体在第二剂的该组成物之后经历3级全身不良事件。
项目179.如项目170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体为新生儿或婴儿，较佳年龄不超过3岁、不超过2岁、不超过1.5岁、不超过1岁(12个月)、不超过9个月、6个月或3个月，或年龄在6个月与2岁之间。
项目180.如项目170的方法，其进一步定义为减轻该个体中的疾病负荷的方法。
项目181.如项目180的方法，其中该方法减轻COVID-19疾病的一或多种症状的严重程度。
项目182.如项目181的方法，其中该方法降低该个体将需要入院、进入加护病室、用补充氧气治疗及/或用呼吸器治疗的机率。
项目183.如项目181的方法，其中该方法降低该个体将发展成重度或中度COVID-19疾病的机率。
项目184.如项目181的方法，其中该方法预防该个体中的重度COVID-19疾病至少约6个月。
项目185.如项目184的方法，其中该方法在该个体曝露于与SEQ ID NO:1相比在S蛋白中具有至少第一氨基酸变化的SARS CoV-2变异体时，预防该个体中的重度COVID-19疾病。
项目186.如项目185的方法，其中该SARS CoV-2变异体在S蛋白中具有氨基酸变化，所述变化包含：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V；
(iv)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I；及/或
(v)S13I、W152C、L452R及D614G。
项目187.如项目181的方法，其中该方法降低该个体将产生发烧、呼吸困难；嗅觉丧失及/或味觉丧失的机率。
项目188.如项目181的方法，其中该方法降低该个体将产生发烧、呼吸困难；嗅觉丧失及/或味觉丧失的机率。
项目189.如项目170的方法，其中该个体患有疾病或为免疫功能不全的。
项目190.如项目189的方法，其中该个体患有肝病、肾病、糖尿病、高血压、心脏病、肺病、癌症或为HIV阳性。
项目191.如项目170的方法，其中该个体在过去6个月内尚未用免疫抑制剂药物治疗超过14天。
项目192.如项目170的方法，其中该个体在该投予之前至少28天尚未接受活疫苗及/或在该投予之前至少14天尚未接受不活化疫苗。
项目193.一种刺激个体中的免疫反应的方法，其中该方法包含向该个体投予至少第一组成物，该第一组成物包含如项目1至73中任一项的核酸，较佳mRNA、如项目74至162中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗，及/或如项目167的套组或部件套组。
项目194.如项目193的方法，其中该个体先前感染了SARS CoV-2。
项目195.如项目193的方法，其中该个体先前用至少第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。
项目196.如项目195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为mRNA疫苗。
项目197.如项目196的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为BNT162或mRNA-1273。
项目198.如项目195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为蛋白次单位疫苗。
项目199.如项目198的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为NVX-CoV2373或COVAX。
项目200.如项目195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为腺病毒载体疫苗。
项目201.如项目200的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为ADZ1222或Ad26.COV-2.S。
项目202.如项目193至201中任一项的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2结合抗体。
项目203.如项目202的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2S蛋白结合抗体。
项目204.如项目202的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2N蛋白结合抗体。
项目205.如项目195至201中任一项的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物是在至少约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年前向该患者投予。
项目206.如项目195至201中任一项的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物是在约3个月至2年前或在约6个月至2年前向该患者投予。
项目207.如项目193至206中任一项的方法，其中该方法预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目208.如项目207的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约1年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目209.如项目207的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目210.如项目193至209中任一项的方法，其中该方法在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARS CoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
项目211.如项目210的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约1年，在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARS CoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
项目212.如项目211的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARS CoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
项目213.如项目193至212中任一项的方法，其进一步包含向该个体投予至少第二组成物，该第二组成物包含如项目1至61中任一项的核酸，较佳mRNA、如项目74至128中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗，及/或如项目167的套组或部件套组。
项目214.如项目213的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后至少约7天投予。
项目215.如项目214的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后至少约10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天投予。
项目216.如项目213的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后约7天与约56天之间投予。
项目217.如项目216的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后约14天与约56天；约21天与约56天；或约28天与约56天之间投予。
项目218.如项目193至212中任一项的方法，其进一步包含向该个体投予至少第三组成物，该第三组成物包含如项目1至61中任一项的核酸、如项目74至162中任一项的组成物、如项目163的多肽、如项目164至166的疫苗，及/或如项目167的套组或部件套组。
项目219.如项目213至218中任一项的方法，其中该方法预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目220.如项目219的方法，其中该方法在投予该第二或后续组成物之后约2周至约1年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目221.如项目219的方法，其中该方法在投予该第二或后续组成物之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
项目222.如项目193至221中任一项的方法，其进一步定义为刺激该个体中的抗体、CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应的方法。
项目223.如项目193至221中任一项的方法，其进一步定义为刺激该个体中的中和抗体反应的方法。
项目224.如项目193至221中任一项的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对该个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约10至约500个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
项目225.如项目224的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约200个棘蛋白结合抗体。
项目226.如项目224的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约10至约300；约20至约300；约20至约200；或约30至约100个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
项目227.如项目226的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约30至约80个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
项目228.如项目223的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对该个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约1至约500个冠状病毒棘蛋白受体结合域(RBD)结合抗体。
项目229.如项目228的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约50个棘蛋白RBD结合抗体。
项目230.如项目228的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约1至约200；约2至约100；约3至约200；约5至约100或约5至约50个棘蛋白RBD结合抗体。
项目231.如项目230的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约5至约20个冠状病毒棘蛋白RBD结合抗体。
项目232.如项目222的方法，其中该个体先前已感染SARS-CoV-2。
项目233.如项目222的方法，其进一步定义为刺激该个体中的保护性免疫反应的方法。
项目234.如项目193至233中任一项的方法，其中该个体为人类个体。
项目235.如项目234的方法，其中该个体的年龄在6个月与100岁、6个月与80岁、1岁与80岁、1岁与70岁、2岁与80岁或2岁与60岁之间。
项目236.如项目234的方法，其中该个体为新生儿或婴儿，其年龄不超过3岁、不超过2岁、不超过1.5岁、不超过1岁(12个月)、不超过9个月、6个月或3个月，或在6个月与2岁之间。
项目237.如项目234的方法，其中该个体为老年个体，其年龄为至少50、60、65或70岁。
项目238.如项目237的方法，其中该个体为老年个体，其年龄为至少60岁。
项目239.如项目234至238中任一项的方法，其中该个体具有美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。
项目240.如项目238的方法，其中该个体具有至少约10％、25％或50％美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。
项目241.如项目238的方法，其中该个体具有美洲原住民遗传性。
项目242.如项目238的方法，其中该个体具有至少约10％、25％或50％美洲原住民遗传性。
项目243.如项目193至242中任一项的方法，其中该方法基本上不诱导该个体中的Th2细胞介素，较佳IL-4、IL-13、TNF及/或IL-1β的增加。
项目244.如项目193至242中任一项的方法，其进一步定义为在该个体中诱导Th1导向免疫反应的方法。
项目245.如项目193至244中任一项的方法，其中该个体正在接受抗凝疗法。
项目246.如项目193至245中任一项的方法，其中该组成物借由肌内注射投予。
项目247.如项目193至246中任一项的方法，其中该组成物包含编码冠状病毒棘蛋白(S)的mRNA，该冠状病毒棘蛋白为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
项目248.如项目247的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO:163至少95％一致的冠状病毒棘蛋白。
项目249.如项目248的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO:163一致的冠状病毒棘蛋白。
项目250.如项目247的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO:149至少95％一致的冠状病毒棘蛋白。
项目251.如项目248的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO:149一致的冠状病毒棘蛋白。
项目252.如项目250或251的方法，其中单剂的该组成物提供足够的免疫反应以保护该个体免于重度COVID-19疾病至少约6个月。
项目253.如项目252的方法，其中单剂的该组成物提供足够的免疫反应以保护该个体免于重度COVID-19疾病约6个月至约1年、1.5年、2年、2.5年、3年、4年或5年。
项目254.如项目247至249中任一项的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成LNP。
项目255.如项目254的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；及
(iv)至少一种PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目256.如项目255的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
项目257.如项目256的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5:10:40.8:1.7。
项目258.如项目256的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4:10:40.9:1.7。
项目259.如项目254至258中任一项的方法，其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目260.如项目249的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5:10:40.8:1.7，且
其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目261.如项目249的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4:10:40.9:1.7，且
其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
项目262.如项目247至261中任一项的方法，其中向该个体投予包含约2μg与约50μg之间的mRNA的组成物。
项目263.如项目262的方法，其中向该个体投予约10μg与约50μg之间的mRNA的组成物。
项目264.如项目263的方法，其中向该个体投予约10μg与约30μg之间的mRNA的组成物。
项目265.如项目264的方法，其中向该个体投予包含约12μg mRNA的组成物。
项目266.如项目264至265中任一项的方法，其中该投予在100％投予该组成物的个体中提供血清转化。
项目267.如项目193至266中任一项的方法，其中该人类个体的年龄为61岁或更大。
项目268.如项目193至266中任一项的方法，其中该人类个体的年龄为18至60岁。
项目269.如项目193至268中任一项的方法，其中该人类个体已经历先前疫苗过敏。
项目270.如项目193至269中任一项的方法，其中该个体具有可侦测的抗PEG抗体。
项目271.如项目193至270中任一项的方法，其包含：
(i)获得如项目74至162中任一项的组成物，其中该组成物是冻干的；
(ii)使该冻干组成物溶解于医药学上可接受的液体载体中以产生液体组成物；及
(iii)向该个体投予有效量的该液体组成物。
项目272.一种使如项目74至162中任一项的组成物稳定的方法，其包含冻干该组成物以产生稳定化组成物。
项目273.如项目272的方法，其中该稳定化组成物的含水量小于约10％。
项目274.如项目273的方法，其中该稳定化组成物的含水量在约0.5％与5.0％之间。
项目275.一种稳定化的冻干组成物，其借由如项目272至274中任一项的方法产生。
清单及表的简要说明
清单A：例示性SARS-CoV-2冠状病毒分离株
清单B：不同SARS-CoV-2分离株的Genbank寄存编号
清单1：本发明的例示性适合蛋白设计
表A：征集到的局部不良事件的强度分级
表B：征集到的全身性不良事件的强度分级
表1：较佳冠状病毒构筑体(氨基酸序列及核酸编码序列)
表2：具有指定用于各氨基酸的频率的人类密码子使用表
表3a：适用于冠状病毒疫苗的核酸、较佳mRNA构筑体
表3b：适用于冠状病毒疫苗的核酸、较佳mRNA构筑体
表4：编码不同SARS-CoV-2S抗原设计的RNA构筑体(用于实施例中)
表A：实施例的基于脂质的载体组成物
表5：实施例2a中所用的mRNA构筑体的概述
表6：实施例2b中所用的mRNA构筑体的概述
表7：实施例2c中所用的mRNA构筑体的概述
表8：疫苗接种方案(实施例3)
表9：疫苗接种方案(实施例4)
表10：疫苗接种方案(实施例5)
表11：疫苗接种方案(实施例6)
表12：疫苗接种方案(实施例7)
表13：疫苗接种方案(实施例8)
表14：疫苗接种方案(实施例9)
表15：图12F中所指示的组织病理学分析的清单：
表16：疫苗接种方案(实施例11)
表17：疫苗接种方案(实施例12)
表18：用于各指标(endpoint)分析的主要及支援群体
表19：具有56个及个111病例的期间分析及185个病例的最终分析的两阶段分批逐次设计
表20：疫苗接种方案(实施例14)
表21：疫苗接种方案(实施例15)
表22：疫苗接种方案(实施例16)
表23：疫苗接种方案(实施例17)
表24：疫苗接种方案(实施例18)
表25：新兴SARS-CoV-2分离株/变异体的清单(实施例19)
【图式简单说明】
[图1]显示编码不同SARS-CoV2 S蛋白设计的mRNA构筑体使用试管内转译系统引起可侦测蛋白表现。实施例2a及表5中提供其他细节。
[图2]显示编码不同SARS-CoV2 S蛋白设计的mRNA构筑体使用FACS分析表现于哺乳动物细胞的细胞表面上。实施例2b及表6中提供其他细节。
[图3]显示编码不同SARS-CoV2 S蛋白的mRNA构筑体使用西方墨点分析表现于哺乳动物细胞中。实施例2c及表7中提供其他细节。
[图4]显示经编码全长稳定S蛋白的mRNA疫苗疫苗接种的组的显著IgG1及IgG2a反应。图4显示mRNA疫苗及重组SARS-CoV-S蛋白的可比IgG1反应，以及与重组SARS-CoV-S蛋白相比mRNA疫苗的较高IgG2a效价。借由ELISA使用重组SARS-CoV-2S蛋白作为涂布试剂评估IgG1及IgG2a抗体效价。实验如实施例5中所描述执行。表10中提供其他构筑体细节。
[图5]显示经编码全长稳定S蛋白及全长野生型S蛋白的mRNA疫苗疫苗接种的组的显著IgG1及IgG2a反应。图5A显示两种全长S蛋白设计的可比IgG1反应，且图5B显示两种全长S蛋白设计的可比IgG2a效价。图5C显示两种全长S蛋白设计在第42天的较高及可比病毒中和效价。实验如实施例6中所描述执行。表11中提供其他构筑体细节。
[图6]显示使用细胞内细胞介素染色分析，经LNP调配的编码全长稳定的S蛋白及全长S蛋白的mRNA诱导小鼠中的细胞免疫反应(CD8+及/或CD4+T细胞反应)。A至C组为经LNP调配的编码不同全长S蛋白设计的mRNA；D组为阴性对照组。疫苗接种方案参见表11。实施例6中提供其他细节。
[图7]显示经LNP调配的编码全长S蛋白(S_stab)的mRNA(A组)疫苗接种后的先天性免疫反应。虚线指示侦测的下限。实验如实施例7中所描述执行。表12中提供其他构筑体细节。
[图8A]显示经编码全长稳定S蛋白的mRNA疫苗疫苗接种的组的显著IgG1及IgG2a反应。图8A显示在第一次疫苗接种之后的高IgG1反应及高IgG2a反应。A至D组：一种经LNP调配的编码全长S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗接种；I组：有佐剂的重组棘蛋白及J组：阴性对照组。实验如实施例7中所描述执行。表12中提供其他构筑体细节。
[图8B]显示所有经编码全长稳定S蛋白(s_stab)的mRNA疫苗疫苗接种的组的显著IgG1及IgG2a反应。图8B(A)显示在第28天(在第一次疫苗接种之后)及在第35天(在第二次疫苗接种之后)的IgG1反应且图8B(B)显示在第28天(在第一次疫苗接种之后)及在第35天(在第二次疫苗接种之后)的IgG2a反应。A至H组：具有不同疫苗接种间隔的经LNP调配的全长S蛋白mRNA；I组：有佐剂的重组棘蛋白及J组：阴性对照组。实验如实施例7中所描述执行。表12中提供其他构筑体细节。
[图9]显示所有经编码全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗疫苗接种的组的病毒中和效价(VNT)的显著诱导。图9A显示在第28天(在第一次疫苗接种之后)及第35天及第49天(图9B)(在第二次疫苗接种之后)的VNT。A至H组：具有不同疫苗接种间隔的经LNP调配的全长S蛋白mRNA；I组：有佐剂的重组棘蛋白及J组：阴性对照组。实验如实施例7中所描述执行。表12中提供其他构筑体细节。
[图10]显示使用细胞内细胞介素染色分析，经LNP调配的编码全长稳定的S蛋白的mRNA(S_stab)在初打与加打疫苗接种之间具有不同时间间隔的第二次疫苗接种之后诱导小鼠中细胞免疫反应(CD8+及/或CD4+T细胞反应)。A至H组：具有不同疫苗接种间隔的经LNP调配的全长S蛋白mRNA；I组：有佐剂的重组棘蛋白及J组：阴性对照组。实验如实施例7中所描述执行。表12中提供其他构筑体细节。
[图11]显示经不同剂量的编码全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗疫苗接种的组在大鼠中的显著抗体反应。图11A显示对于C-F组的高IgG1反应，图11B显示对于D-F组的高IgG2a反应，且图11C显示对于C-E组的高总IgG反应。B至F组：不同剂量的经LNP调配的全长S蛋白mRNA及D组：阴性对照组。图11D显示IgG1抗体反应进一步增加且图11E显示在第42天第二次疫苗接种之后所有组的IgG2a抗体效价进一步增加。图11F及G显示，用调配于LNP中的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中剂量依赖性VNT水平诱导。实验如实施例8中所描述执行。表13中提供其他构筑体细节。
[图12]显示保护仓鼠免于经编码全长稳定S蛋白(S_stab)的不同的本发明mRNA疫苗疫苗接种的SARS-CoV-2攻击。图12A显示疫苗接种E及F组的高总IgG抗体的诱导，且图12B显示一个(第28天)或两个(第42天及第56天)疫苗接种时VNTs的剂量依赖性诱导。图12C-E显示在第56天至第60天(图12C)的咽喉拭子、在第60天(图12D)的鼻甲及在第60天(图12F)的肺组织中的可侦测到的复制胜任型病毒水平。各点表示个别动物，条描绘中值。使用曼-惠特尼检定进行统计分析。图12F显示在无疫苗增强的疾病征象存在下保护经疫苗接种的仓鼠的呼吸道免于攻击感染。在第60天，即攻击感染后四天，在经福尔马林固定石蜡包埋的组织切片上进行组织病理学分析。根据检验参数的严重程度进行组织病理学评估评分。各点表示个别动物，条描绘中值，使用曼-惠特尼检验进行统计分析。实验如实施例9中所描述执行。表14及表15中提供其他细节。
[图13]显示健康人类个体的I期临床试验的结果。在图13A中，在第一剂后及第二剂后不同剂量群组中显示全身性不良事件。在图13B中，在第一剂后及在第二剂后不同剂量群组中显示局部不良事件。在图13C中，显示特定全身性不良事件，诸如疲劳、头痛、肌痛、发冷、关节痛、发烧、恶心及腹泻。在图13D中，显示特定局部不良事件，诸如疼痛、瘙痒、肿胀及发红。在图13E中，显示不同剂量群组的棘蛋白专一性IgG抗体在第1天、第29天、第36天、第43天及第57天的诱导。在图13E的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在图13F中，显示不同剂量群组的RBD专一性IgG抗体在第1天、第36天及第43天的诱导。在图13F的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在图13G中，显示病毒中和抗体的诱导。在图13G的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在图13H中，显示棘蛋白或RBD结合抗体的水平与中和抗体的水平的比率。图13I显示在第一剂(第29天)及第二剂(第36天)之后针对棘蛋白S1的CD4+T细胞的诱导。图13J显示在第一剂(第29天)及第二剂(第36天)之后针对棘蛋白S2的CD4+T细胞的诱导。在图13K中，显示在2μg及4μg的CvnCoV疫苗接种之后，SARS-CoV-2血清反应阳性个体中病毒中和效价及RBD专一性抗体的诱导。
[图14]显示在单次疫苗接种(d21)之后经编码全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNA疫苗接种后的显著IgG1及IgG2a反应且在第二次疫苗接种(d42)之后增加的显著IgG1及IgG2a反应(图14A)。包含编码包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA的疫苗组成物(C组)显示结合抗体的改良且较强的诱导(由IgG1及IgG2a指标效价显示)。VNT的诱导显示于图14B中。与B组相比，C组的小鼠显示在第一次疫苗接种之后d21早期增加的VNT水平。T细胞免疫的诱导显示于图14C中。包含编码包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA的疫苗组成物(C组)出人意料地显示CD8+IFNγ/TNF双阳性T细胞的明显较强的诱导。
[图15]显示经不同剂量的编码全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗疫苗接种的组在大鼠中的显著抗体反应，该全长稳定S蛋白包含经调配于LNP中的3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的替代性非编码区。图15A显示IgG1及IgG2a结合抗体的稳健诱导，且图15B显示以剂量依赖性方式的VNT的诱导。实验如实施例12中所描述执行。表17中提供其他构筑体细节。
[图16]显示经不同剂量的编码全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗疫苗接种的组在大鼠中的显著抗体反应，该全长稳定S蛋白包含经调配于LNP中的不同非编码区。图16A显示IgG1及IgG2a结合抗体的稳固且剂量依赖性的诱导，且图16B为编码全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗以剂量依赖性方式仅以一剂的疫苗接种之后的早期VNT的诱导，该全长稳定S蛋白包含经调配于LNP中的3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的非编码区。图16C显示在第42天两剂疫苗接种之后VNT的诱导。实验如实施例14中所描述执行。表20中提供其他构筑体细节。
[图17]显示CVnCoV(编码调配于LNP中的全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗)诱导非人类灵长类动物中的体液反应。(图17A)研究设定的示意图。恒河猕猴(n＝6；3只雄性，3只雌性/组)在第0天及第28天肌内疫苗接种0.5μg或8μg CVnCoV或保持未经疫苗接种。所有动物在d56经5.0×106PFU的SARS-CoV-2攻击。各组的两只动物分别在d62、d63及d64终止(图17B)三聚棘蛋白或(图17C)RBD专一性结合IgG抗体，如所指示(C)经由在如所指示的不同时间点的聚焦减少中和试验测定的病毒中和抗体，在不同时间点处显示为指标效价。所有值均显示为范围内的中值。虚线分别表示疫苗接种及攻击感染。RBD受体结合域；VNT病毒中和效价。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图18]显示CVnCoV(编码调配于LNP中的全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗)诱导非人类灵长类动物中的细胞反应。用S专一性肽池再刺激来自经0.5μg或8μg CVnCoV疫苗接种的PBMC或来自在不同时间点分离的未经处理动物的PBMC，随后进行IFNγELISpot分析。(图18A)在d56攻击感染之前进行IFNγELISpot。图1表示用覆盖整个S蛋白的单一肽池刺激的结果，图2至4描绘各组中覆盖整个S蛋白的十个个别池的刺激结果。(图18B)IFNγELISpot在d62-d64前终止。图1表示用三个巨池刺激的结果且显示覆盖整个S蛋白的偏移反应，图2至4描绘各组中覆盖整个S蛋白的十个个别池的刺激结果。SFU点形成单位；PP肽池。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图19]显示CVnCoV(编码调配于LNP中的全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗)保护非人类灵长类动物免于攻击感染。针对总病毒RNA的复本，经由RT-qPCR分析(图19A}在攻击后不同时间点采集的鼻拭子、(图19B)在d59上采集且在d62-64终止的活体BAL样品及(图19C)来自d62-64的肺组织均质物。针对次基因体病毒RNA的复本，经由RT-qPCR分析(图19D)在攻击后不同时间点采集的鼻拭子、(图19E)在d59上采集且在d62-64终止的活体BAL样品及(图19F)来自d62-64的肺组织均质物。值描绘为范围内的中值。下部及上部虚线分别表示LLOD及LLOQ。先后使用Kruskall-Wallis ANOVA和邓恩试验(Dunn's test)用以比较组且显示P值。LLOD侦测下限、LLOQ定量下限、RT-qPCR反转录-定量聚合酶链反应。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图20]显示CVnCoV(编码调配于LNP中的全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗)保护非人类灵长类动物免于攻击感染。针对总病毒RNA的复本，经由RT-qPCR分析(图20A)在攻击后不同时间点采集的咽喉拭子，针对次基因体RNA的复本，经由RT-qPCR分析(图20B)在攻击后不同时间点采集的咽喉拭子。针对总病毒RNA的复本，经由RT-qPCR分析衍生自(图20C)扁桃体(图20D)气管(图20E)脾(图20F)十二指肠(G)结肠(H)肝脏(I)肾的均质化组织。(RT-qPCR反转录-定量聚合酶链反应，sg次基因体)。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图21]例示性切片显示组织病理学(H&E)及SARS-CoV-2原位杂合(ISH)。图21A：肺泡间隙中的肺泡坏死及发炎性泌出物(*)及II型肺细胞增生(箭头)。图21B：轻度血管周围围管(箭头)。图21C：肺泡间隙及肺泡隔膜中的发炎性细胞浸润(*)及II型肺细胞增生(箭头)。图21D：在大量细胞中在发炎性病灶内的SARS-CoV-2ISH染色(箭头)。图21E：在单个细胞中在肺泡隔膜内的SARS-CoV-2ISH染色(箭头)。图21F：肺泡内衬及肺泡隔膜内的SARS-CoV-2ISH染色细胞的大量病灶(箭头)(Bar＝100μm。ISH原位杂合)。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图22]显示8μg CVnCoV的疫苗接种(编码调配于LNP中的全长稳定S蛋白(S_stab)的mRNA疫苗)保护肺免受在病毒攻击时的病理性变化。(图22A)热图显示各肺病理学参数的评分及来自如所指示的所有组的各动物的平均评分。严重程度在0至4范围内：0＝无；1＝最小；2＝轻度；3＝中度及4＝显著/重度。(图22B)图式表示各动物的所有肺组织病理学参数的累积评分。(图22C)所有动物的肺组织切片中病毒RNA的存在以肺切片的ISH(RNAScope，原位杂合)阳性染色面积的百分比表示。(图22D)经由CT放射学侦测的肺病理学累积评分。盒及须指示范围内的中值。先后使用Kruskall-Wallis ANOVA和邓恩试验(Dunn's test)用以比较组且显示P值。实验如实施例15中所描述执行。表21中提供其他构筑体细节。
[图23]显示用mRNA疫苗组成物刺激的人类PBMC中的IFNa的诱导(图23A)。在仅一次疫苗接种之后(第21天)及在两次疫苗接种之后(第42天)的VNT的诱导显示于图23B及C中。具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA的所有mRNA疫苗组成物(C-G组，I-M组)显示出VNTs的改良、早期及强诱导。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'端处。
[图24]图24A显示在仅一次疫苗接种之后的VNT的诱导。具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA的mRNA疫苗组成物显示出VNTs的改良、早期及强诱导。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'端处。图24B说明在第42天的稍后时间点在仅一次疫苗接种(A-E组)之后或在两次疫苗接种(F-J组)之后的VNT的诱导。包含R9709的mRNA疫苗组成物(B组)在接受仅一次疫苗接种的组之间诱导最显著的VNT效价。
实施例
在下文中，呈现说明本发明的各种具体实例及态样的特定实施例。然而，本发明的范围不应受本文的特定具体实例限制。给出以下制备及实施例以使得熟习此项技术者能够更清楚地理解及实践本发明。然而，本发明的范围不受仅意欲作为本发明的单一态样的说明的例示性具体实例限制，且功能上等效的方法在本发明的范围内。实际上，根据前文描述、附图及以下实施例，除本文的修改之外，本发明的各种修改对熟习此项技术者而言将变得显而易见。所有所述修改属于随附权利要求的范围内。
实施例1：DNA及RNA构筑体、组成物及疫苗的制备
本发明的实施例提供获得本发明的RNA的方法以及产生本发明的组成物或疫苗的方法。
1.1.DNA及RNA构筑体的制备：
制备编码不同SARS-CoV-2S蛋白设计的DNA序列且将其用于后续RNA试管内转录反应。借由引入用于稳定化及表现最佳化的G/C经最佳化或经修饰编码序列(例如「cdsopt1」)修饰野生型或参考编码DNA序列来制备所述DNA序列。将序列引入pUC衍生DNA载体中以包含稳定3'-UTR序列及5'-UTR序列，其另外包含腺苷区段(例如A64或A100)及视需要存在的组蛋白-茎-环(hSL)结构，及视需要存在的30个胞嘧啶区段(例如C30)(参见表4，关于冠状病毒抗原设计的概述，参见清单1或表1)。
所获得的质体DNA构筑体是使用此项技术中已知的常见方案在细菌中转型及繁殖。最终，萃取质体DNA构筑体，纯化且用于后续RNA试管内转录(参见章节1.2.)。
或者，DNA质体可用作PCR扩增模板(参见章节1.3.)。
1.2.自质体DNA模板进行RNA试管内转录：
根据章节1.1制备的DNA质体在合适的缓冲液下使用限制酶酶线性化且在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)及帽类似物(例如m7GpppG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)或3'OMe-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG。)的存在下使用T7 RNA聚合酶进行DNA依赖性RNA试管内转录。使用RP-HPLC(
Figure GDA0003858923850002451
位于德国图宾根的CureVac公司(CureVac AG，Tübingen，Germany)；WO2008/077592)纯化所获得的RNA构筑体且用于试管内及活体内实验。DNA模板亦可使用PCR产生。此类PCR模板可用于使用如本文所概述的RNA聚合酶进行DNA依赖性RNA试管内转录。
为获得经化学修饰的mRNA，在包含假尿苷N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)而非尿嘧啶的经修饰的核苷酸混合物存在下进行RNA试管内转录。使用RP-HPLC(
Figure GDA0003858923850002452
位于德国图宾根的CureVac公司；WO2008/077592)纯化所获得的m1Ψ经化学修饰的RNA且用于其他实验(参见例如实施例16或17)。
使用酶加帽产生加帽RNA(预示性)：
一些RNA构筑体在不存在帽类似物的情况下试管内转录。接着使用加帽酶，如此项技术中通常已知，以酶方式添加帽结构(帽0或帽1)。简而言之，经试管内转录的RNA使用加帽套组加帽以获得帽0-RNA。帽0-RNA另外使用帽专一性2'-O-甲基转移酶修饰以获得帽1-RNA。帽1-RNA经例如如上文所阐述纯化且用于其他实验。
用于临床开发的RNA是在现行药品优良制造规范下产生，例如根据WO2016/180430，对DNA及RNA水平实施各种品质控制步骤。
实施例的RNA构筑体：
所产生的RNA序列/构筑体与编码的抗原蛋白及其中所指示的各别UTR元件一起提供于表4中。若未另外指明，则已在m7GpppG,m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG存在下使用RNA试管内转录产生表4的RNA序列/构筑体；因此，RNA序列/构筑体包含5'帽1结构。若未另外指明，则已在不存在经化学修饰的核苷酸(例如假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ))的情况下产生表4的RNA序列/构筑体。
1.3.自PCR扩增的DNA模板进行RNA试管内转录(预示性)：
根据段落1.1制备的经纯化的PCR扩增的DNA模板在适合缓冲液条件下在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)及帽类似物(m7GpppG或3'-OMe-m7G(5')ppp(5')G)存在下使用DNA依赖性T7 RNA聚合酶进行试管内转录。或者，在适合的缓冲液条件下在经修饰的核苷酸混合物(ATP、GTP、CTP、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)或假尿苷(Ψ)及帽类似物(m7GpppG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)存在下使用DNA依赖性T7 RNA聚合酶对PCR扩增的DNA进行试管内转录。在不存在帽类似物的情况下一些RNA构筑体经试管内转录，且使用如此项技术中通常已知的加帽酶以酶方式添加帽结构(帽0或帽1)。所获得的RNA经例如如上文所阐述纯化且用于其他实验。使用RP-HPLC(
Figure GDA0003858923850002461
位于德国图宾根的CureVac公司(CureVac AG，Tübingen，Germany)；WO2008/077592)纯化所获得的mRNA且用于试管内及活体内实验。
表4：编码不同SARS-CoV-2S抗原设计的RNA构筑体
Figure GDA0003858923850002462
Figure GDA0003858923850002471
Figure GDA0003858923850002481
Figure GDA0003858923850002491
Figure GDA0003858923850002501
Figure GDA0003858923850002511
Figure GDA0003858923850002521
Figure GDA0003858923850002531
*mRNA R10160及R10161是用3'OME Clean Cap产生。
**mRNA R10157、R10158、R10159、R10162是用N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)产生
1.4.经LNP调配的mRNA组成物的制备：
使用阳离子脂质、结构性脂质、PEG脂质及胆固醇制备LNP。使用微流混合装置将脂质溶液(于乙醇中)与RNA溶液(水性缓冲液)混合。所获得的LNP经由透析在碳水化合物缓冲液中再缓冲，且使用超速离心管将其浓缩至目标浓度。在试管内或活体内实验中使用之前，将经LNP调配的mRNA储存在80℃下。
较佳地，脂质纳米粒子是根据PCT公开案第WO 2015/199952、WO 2017/004143及WO2017/075531号中所描述的通用程序制备及测试，其全部揭示内容以引用的方式并入本文中。经脂质纳米粒子(LNP)调配的mRNA使用可电离氨基脂质(阳离子脂质)、磷脂、胆固醇及聚乙二醇化脂质制备。如下制备LNP。根据式III-3(ALC-0315)的阳离子脂质、DSPC、胆固醇及根据式IVa的PEG脂质(ALC-0159)以约47.5:10:40.8:1.7的摩尔比溶解于乙醇中(参见表A)。包含化合物III-3的脂质纳米粒子(LNP)以0.03-0.04w/w的mRNA(序列参见表4)与总脂质的比率制备。简言之，在pH为4的10至50mM柠檬酸盐缓冲液中将mRNA稀释至0.05至0.2mg/mL。使用注射泵以约1:5至1:3(vol/vol)的比率混合乙醇脂质溶液与mRNA水溶液，其中总流动速率高于15ml/min。随后移除乙醇且用PBS借由透析置换外部缓冲液。最后，脂质纳米粒子经由0.2μm孔隙无菌过滤器过滤。脂质纳米粒子粒径为60-90nm，如借由使用MalvernZetasizer纳米(英国马尔文(Malvern，UK))的准弹性光散射测定。
表A：实施例的基于脂质的载体组成物
Figure GDA0003858923850002541
1.5.鱼精蛋白复合的mRNA组成物的制备(预示性)：
RNA构筑体在用于活体内免疫接种实验之前与鱼精蛋白复合。RNA调配物是由50％游离RNA与50％以2:1的重量比与鱼精蛋白复合的RNA的混合物组成。首先，借由将鱼精蛋白-乳酸林格氏溶液(Ringer's lactate solution)添加至mRNA使mRNA与鱼精蛋白复合。培育10分钟之后，当复合物稳定产生时，添加游离mRNA，且用乳酸林格氏溶液调节最终浓度。
1.6.经设计的mRNA构筑体的表现分析：
使用兔网状红血球裂解物系统以及细胞培养物中，经由试管内转译测试如表4中所示的mRNA构筑体的表现，随后经由如此项技术中通常已知的西方墨点法或FACS分析进行侦测(参见其他细节及例示性结果实施例2)。
实施例2a：编码SARS-CoV-2蛋白(S,S_stab,S1)的mRNA构筑体的表现分析
为了测定mRNA构筑体的试管内蛋白表现，将编码SARS-CoV-2棘蛋白或片段(S,S_stab,S1)的构筑体与根据制造商方案的普洛麦格(Promega)兔网状红血球裂解物系统的组分混合。裂解物含有蛋白合成所需的细胞组分(tRNA、核糖体、氨基酸、起始因子、延长因子及终止因子)。使用来自裂解物系统套组的萤光素酶RNA作为阳性对照组。借由SDS-Page及西方墨点分析(IRDye 800CW链霉亲和素抗体(1:2000))分析转译结果。表5概述所测试的RNA构筑体。
表5：实施例2a中所用的mRNA构筑体的概述
Figure GDA0003858923850002551
结果：
如图1中所示，所用mRNA构筑体引起预期尺寸(S或S_stab：140kDa，S1：75kDa)的可侦测蛋白表现，其为基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗的前提条件。
实施例2b：SARS-CoV-2蛋白(S,S_stab,S1)在HeLa细胞中的表现及借由FACS的分析
为了测定mRNA构筑体的试管内蛋白表现，用编码SARS-CoV-2蛋白的mRNA(S,S_stab,S1)短暂转染HeLa细胞且使用适合的抗棘蛋白抗体染色(在小鼠中培养)，用FITC偶合二级抗体对比染色。在转染前24h，将HeLa细胞以400,000个细胞/孔的密度接种于细胞培养基(RPMI，10％FCS，1％L-麸酰胺酸，1％Pen/Strep)中的6孔板中。使用脂质体2000(Invitrogen)用2μg未经调配的mRNA转染HeLa细胞。根据实施例1制备且在表6中列出的mRNA构筑体在包括阴性对照组(注射用水)的实验中使用。转染后24小时，用适合的抗棘蛋白(针对SARS S的S专一性抗体，针对SARS-CoV-2S的交叉反应性)抗体(在小鼠中培养；1:250)及抗小鼠FITC标记的二级抗体(1:500)染色HeLa细胞且随后借由流式细胞量测术(FACS)在BD FACS Canto II上使用FACS Diva软体分析。使用FlowJo软体包(Tree Star公司)进行萤光FITC讯息的定量分析。
表6：实施例2b中所用的mRNA构筑体的概述
Figure GDA0003858923850002561
结果：
如图2中所示，所用mRNA构筑体引起全长S(S及S_stab)的可侦测细胞表面表现。因为S1片段缺乏跨膜域，所以其表现在细胞表面上不可侦测(图2)。
实施例2c：使用西方墨点法分析SARS-CoV-2蛋白(S,S_stab,S1)的表现分析
对于SARS-CoV-2S表现的分析，使用脂质体作为转染剂来用未经调配的mRNA转染HeLa细胞。HeLa细胞以300,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中。使用脂质体2000(Invitrogen)用2μg未经调配的mRNA转染HeLa细胞。根据实施例1制备且在表7中列出的mRNA构筑体在包括阴性对照组(注射用水)的实验中使用。转染后24小时，借由无胰蛋白酶/EDTA缓冲液脱离HeLa细胞，采集且制备细胞裂解物。使细胞裂解物经受SDS-PAGE，接着进行西方墨点法侦测。西方墨点法分析使用与适合的二级抗体组合使用的抗棘蛋白(SARS S，针对SARS-CoV-2S的交叉反应性)抗体进行。
表7：实施例2c中所用的mRNA构筑体的概述
Figure GDA0003858923850002571
结果：
在可侦测细胞裂解物中所有分析的mRNA的表现(图3)，全长S：预期尺寸140kDa，两条主带大约90kDA及180kDa，可能反映未经处理的S蛋白(S0)及经裂解的S2次单位的糖基化形式，S1：70kDa，可能经糖基化)。
实施例3：用编码SARS-CoV-2蛋白设计抗原的mRNA(S,S_stab)疫苗接种小鼠
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表5中所指示。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表8：疫苗接种方案(实施例3)：
Figure GDA0003858923850002581
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S(细胞外域)蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且使用生物素化同型专一性抗小鼠抗体，接着使用Amplex作为受质的链霉亲和素-HRP(辣根过氧化酶)侦测专一性抗体与SARS-CoV2 S的结合。在疫苗接种后第21天及第42天借由ELISA量测抗体(IgG1、IgG2a)的指标效价。
棘蛋白-专一性免疫反应的侦测：
HeLa细胞使用脂质体经2μg编码棘蛋白的mRNA转染。转染后20h收集细胞，且以1×105/孔接种至96孔板中。将细胞与经疫苗接种小鼠的血清样品(1:50稀释)培育，接着与经FITC-共轭的抗小鼠IgG抗体一起培育。使用DIVA软体在BD FACS Canto II上获取细胞且借由FlowJo分析。
细胞内细胞介素染色：
根据此项技术中已知的标准方案分离来自经疫苗接种小鼠的脾细胞。简言之，经分离的脾经由细胞过滤器研磨且在PBS/1％FBS中洗涤，随后进行红血球裂解。用PBS/1％FBS进行彻底洗涤步骤之后，将脾细胞接种于96孔板中(2×106个细胞/孔)。细胞在2.5μg/ml抗CD28抗体(BD Biosciences)存在下在37℃下在蛋白转运抑制剂存在下用SARS-CoV-2S蛋白专一性肽表位(各肽5μg/ml)的混合物刺激6小时。在刺激之后，细胞经洗涤且根据制造商说明使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)对细胞内细胞介素进行染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1:200)、CD8-APC-H7(1:100)、TNF-PE(1:100)、IFNγ-APC(1:100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1:200)(BD Biosciences)且与1:100稀释的Fcγ嵌段一起培育。染料Aqua Dye用于区分活细胞/死细胞(Invitrogen)。使用Canto II流式细胞仪(Beckton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软体包(Tree Star公司)分析流式细胞测量术数据。
测定病毒中和效价：
收集血清用于测定经由CPE(细胞病变效应)或经由假模式化基于粒子的分析侦测的SARS-CoV-2中和效价(VNT)。
实施例4：用编码SARS-CoV-2抗原S1的mRNA疫苗接种小鼠
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表6中所指示。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表9：疫苗接种方案(实施例4)
Figure GDA0003858923850002601
Figure GDA0003858923850002611
经由ELISA、ICS及VNT诱导专一性免疫反应如先前所描述测定(参见实施例3)。
实施例5：用编码SARS-CoV-2抗原设计(S_stab)的mRNA疫苗接种小鼠
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表10中所指示。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液疫苗接种。所有动物在第0天疫苗接种。在第21天收集血液样品以用于测定抗体效价。
表10：疫苗接种方案(实施例5)：
Figure GDA0003858923850002612
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且使用生物素化同型专一性抗小鼠抗体，接着使用Amplex作为受质的链霉亲和素-HRP(辣根过氧化酶)侦测专一性抗体与SARS-CoV2 S的结合。在一次单次初打疫苗接种后第21天借由ELISA量测抗体(IgG1、IgG2a)的指标效价。
结果：
如图4中所示，在单次疫苗接种(d21)之后用编码全长S稳定蛋白的mRNA的疫苗接种诱导S专一性结合抗体的较高效价。相较于有佐剂的重组S蛋白，mRNA疫苗诱导可比的IgG1效价及较高IgG2a效价。
实施例6：用编码SARS-CoV-2抗原设计的mRNA疫苗接种小鼠
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表11中所指示。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表11：疫苗接种方案(实施例6)：
Figure GDA0003858923850002621
Figure GDA0003858923850002631
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S(细胞外域)蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且使用生物素化同型专一性抗小鼠抗体，接着使用Amplex作为受质的链霉亲和素-HRP(辣根过氧化酶)侦测专一性抗体与SARS-CoV2 S的结合。在初打疫苗接种后第21天及第42天借由ELISA量测抗体(IgG1、IgG2a)的指标效价。
测定病毒中和效价：
收集血清用于测定经由CPE(细胞病变效应)侦测的SARS-CoV-2中和效价(VNT)。一式两份地测试加热去活化血清的连续稀释(56℃，30min)，在37℃下以1:10的起始稀释，接着1:2连续稀释与100TCID50的野生型SARS-CoV-2(病毒株2019-nCov/Italy-INMI1)一起培育1小时。各板含有仅含有细胞及培养基的用于细胞对照组的专用排(8孔)及仅含有细胞及病毒的病毒对照组专用排。在100μl病毒-血清混合物与Vero E6细胞汇合层(ATCC，Cat.1586)一起培育后定量感染性病毒，随后在37℃下培育3天且进行CPE形成的显微法评分。对各操作进行反滴定以便验证工作病毒溶液的TCID50的正确范围。根据由李-明二氏(Reed&Muench)所描述的方法计算VN效价。若未观察到中和(MNt<10)，则报告任意值5。在VisMederi srl(Siena，Italy)进行分析。
细胞内细胞介素染色：
根据此项技术中已知的标准方案分离来自经疫苗接种小鼠的脾细胞。简言之，经分离的脾经由细胞过滤器研磨且在PBS/1％FBS中洗涤，随后进行红血球裂解。用PBS/1％FBS进行彻底洗涤步骤之后，将脾细胞接种于96孔板中(2×106个细胞/孔)。细胞在2.5μg/ml抗CD28抗体(BD Biosciences)存在下在37℃下在蛋白转运抑制剂存在下用SARS-CoV-2S蛋白专一性肽表位(各肽5μg/ml)的混合物刺激6小时。在刺激之后，细胞经洗涤且根据制造商说明使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)对细胞内细胞介素进行染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1:200)、CD8-APC-H7(1:100)、TNF-PE(1:100)、IFNγ-APC(1:100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1:200)(BD Biosciences)且与1:100稀释的Fcγ嵌段一起培育。染料Aqua Dye用于区分活细胞/死细胞(Invitrogen)。使用Canto II流式细胞仪(Beckton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软体包(Tree Star公司)分析流式细胞测量术数据。
结果：
如图5A及B中所示，在单次疫苗接种(d21)之后用编码全长S蛋白及全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNA疫苗接种诱导S专一性结合抗体的较高效价(图5A：IgG1，图5B：IgG2a)。第二次疫苗接种(d42)后效价增加。所有mRNA设计均诱导或多或少可比的抗体效价，而C组的小鼠与其他组相比在d21显示出IgG2a抗体的降低的水平。如图5C中所示，在两次疫苗接种之后用编码全长S蛋白及全长S稳定蛋白的mRNA的疫苗接种诱导强健的病毒中和抗体水平。
如图6中所示，用编码全长S蛋白及全长S稳定蛋白的mRNA的疫苗接种诱导CD4+及CD8+两者IFNγ/TNF双阳性T细胞。
实施例7：SARS-CoV-2疫苗组成物在不同疫苗接种方案下的活体内免疫原性
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表12中所指示。I组用明矾佐剂的SARS-CoV2棘蛋白(S细胞外域)疫苗接种(1.5μg/5.6μl磷酸盐缓冲盐水[PBS]中缓冲的铝胶)。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液(0.9％NaCl)疫苗接种。
动物在第0天、第7天、第14天或第21天接受其第一次疫苗接种。所有动物均在第28天接受第二次疫苗接种。在第28天及第35天分析SARS-CoV 2S结合抗体的存在，在第28天、第35天及第49天分析化合物中和效价(VNT)的存在。在实验的第49天评定疫苗接种之后的T细胞反应的诱导。选择此实验配置以确定专一性免疫反应的发作且确定自第一次至第二次免疫接种第哪些疫苗接种时间间隔在小鼠中产生最高的免疫反应。
表12：疫苗接种方案(实施例7)：
Figure GDA0003858923850002651
Figure GDA0003858923850002661
RNA诱导的先天性免疫反应的特征界定：
在投予调配于LNP中编码S_stab的mRNA(关于A组的例示性显示)、阳性对照组或缓冲液之后，经由眶后放血14h获取血液样品。使用细胞学珠粒阵列(CBA)，使用BD FACSCANTO II评定血清细胞介素(IFN-γ、IL-1βTNF、IL-6、IL-4、IL-5及IL-13)。以1:4稀释血清且根据制造商方案使用BD Bioscience小鼠细胞介素挠曲组以测定血清细胞介素水平。
使用以下挠曲组：小鼠IFN-γ挠曲组RUO(A4)(BD Bioscience,Cat.558296)；小鼠Il-13挠曲组RUO(B8)(BD Bioscience,Cat.558349)；小鼠IL-1β挠曲组RUO(E5)(BDBioscience,Cat.560232)；小鼠Il-4挠曲组RUO(A7)(BD Bioscience,Cat.558298)；小鼠Il-5挠曲组RUO(A6)(BD Bioscience,Cat.558302)；小鼠IL-6挠曲组RUO(B4)(BDBioscience,Cat.558301)；小鼠TNF挠曲组RUO(C8)(BD Bioscience,Cat.558299)。
根据制造商的说明，使用VeriKine-HS小鼠IFN-α血清ELISA套组(pbl,Cat.42115-1)定量。将血清以1:100稀释且测试50μl的稀释液。
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S(细胞外域)蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且使用生物素化同型专一性抗小鼠抗体，接着使用Amplex作为受质的链霉亲和素-HRP(辣根过氧化酶)侦测专一性抗体与SARS-CoV2 S的结合。
测定病毒中和效价：
收集血清以使用野生型SARS-CoV-2病毒测定经由CPE(细胞病变效应)侦测的SARS-CoV-2中和效价(VNT)。对于小鼠血清的病毒中和效价的分析，一式两份地测试加热去活化血清的连续稀释(56℃，30min)，在37℃下以1:10的起始稀释，接着1:2连续稀释与100TCID50的野生型SARS-CoV-2(病毒株2019-nCov/Italy-INMI1)一起培育1小时。各板含有仅含有细胞及培养基的用于细胞对照组的专用排(8孔)及仅含有细胞及病毒的病毒对照组专用排。在100μl病毒-血清混合物与Vero E6细胞汇合层(ATCC，Cat.1586)一起培育后定量感染性病毒，随后在37℃下培育3天且进行CPE形成的显微法评分。对各操作进行反滴定以便验证工作病毒溶液的TCID50的正确范围。根据由李-明二氏(Reed&Muench)所描述的方法计算VN效价。若未观察到中和(MNt<10)，则报告任意值5。在VisMederi srl(Siena，Italy)进行分析。
细胞内细胞介素染色：
分离脾细胞且用SARS-CoV-2棘蛋白专一性肽库刺激24小时。随后，细胞针对分化丛集8(CD8)及CD4 T细胞(表面)染色且针对INF-γ及TNF(细胞内)染色以评估借由疫苗专一性肽专一性活化的多功能性T细胞的诱导。与二甲亚砜(DMSO)一起培育的细胞充当阴性对照组。使用Canto II流式细胞仪(Beckton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软体包(Tree Star公司)分析流式细胞测量术数据。
结果
如图7中所示，细胞介素分析证实调配于LNP(CVnCoV)注射中编码S_stab的mRNA后诱导平衡的免疫反应，其展现对IFNγ或IL4、IL-5及IL-13的无偏差，分别指示TH1及TH2反应。低水平促炎性细胞介素IL-6、IFNα在血清中可侦测，而TNF及IL1β保持不可侦测。
如图8A中所示，在第一次疫苗接种后用编码全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNAR9515的疫苗接种诱导免疫反应的快速起始。疫苗组成物的单一肌内投予足以在注射后七天诱导结合抗体。
如图8B中所示，用编码全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNA的疫苗接种诱导可比抗体效价，而与CDS最佳化无关。结合抗体的水平随疫苗接种与血清取样之间的时间间隔增加(图8A+B)。第二次免疫接种能够在注射后一周(第35天)增加结合抗体的总体效价。第35天观测到结合抗体效价的较高水平，其特征在于第一次免疫接种与第二次免疫接种之间的时间间隔较长。有佐剂的重组棘蛋白疫苗(I组)诱导可比水平的结合IgG1抗体，但IgG2a效价相较于所有mRNA组在统计学上显著较低。
如图9A+B中所示，在第一次疫苗接种后28天(D组及H组)存在低但可侦测水平的VNT。在研究的第35天及第49天分析的所有组在第二次免疫接种之后VNT水平增加。随着结合抗体增加，VNT随时间的推移而增加且第一次及第二次疫苗接种时间间隔较长的组也随的增加。
如图10中所示，在经疫苗接种的动物中观测到多功能CD8+及CD4+T细胞的大大增加。
多功能性T细胞的强诱导以及更重要的功能性抗体的结合表明编码SARS-CoV-2棘蛋白的mRNA疫苗在小鼠中引发强效免疫反应。
疫苗引发平衡Th1/Th2轮廓，其借由诱导可比水平的IgG1及IgG2a抗体以及不提供TH2偏差指示(亦即诱导IL4、IL5及IL13)的细胞介素轮廓指示。
实施例8：用编码SARS-CoV-2抗原的mRNA疫苗接种大鼠
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向大鼠肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表13中所指示。作为阴性对照组，一组大鼠经缓冲液(A组)疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表13：疫苗接种方案(实施例8)：
Figure GDA0003858923850002691
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S(细胞外域)蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且用标记HRP抗体代替用于小鼠ELISA的二级HRP抗体直接侦测专一性抗体与SARS-CoV-2S的结合。大鼠ELISA中缺乏讯息扩增可能为较低效价的原因，因此大鼠与小鼠研究之间的ELISA效价目前无可比性。测定病毒中和抗体效价(VNT)
如先前实施例6中所描述用小鼠血清分析大鼠血清样品的病毒中和抗体效价(VNT)。
结果：
如图11A-C中所示，在第21天使用0.5μg、2μg及10μg的调配于LNP中的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中诱导结合抗体效价的剂量依赖性水平，且在用40μg及80μg进行疫苗接种的组中达到饱和。图11D及E显示第一次疫苗接种之后第42天的结合抗体效价水平。第二次疫苗接种引起抗体效价的进一步增加。
如图11F及G中所示，用调配于LNP中的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中剂量依赖性VNT水平诱导。
实施例9：用SARS-CoV-2的仓鼠的攻击研究
调配于LNP(CVnCoV)中编码S_stab的mRNA的保护功效阐述于叙利亚仓鼠中。此模型代表轻度至中度人类肺病病变且为一种认可及公认模型以调查人类相关免疫原性及发病机制(
Figure GDA0003858923850002701
等人,PMID 32967005)。仓鼠对野生型SARS-CoV-2感染敏感，导致高水平的病毒复制及病毒靶器官的组织病理学变化。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种及攻击：
向叙利亚黄金仓鼠(n＝5/组,11至13周龄)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表14中所指示(参见例如E及F组)。作为阴性对照组，一组仓鼠未经处理且模拟感染(用缓冲液)(A组)，另一组注射NaCl作为缓冲液对照组。作为阳性对照组，C组在第0天用于0.1ml中的102TCID50/剂量的SARS CoV-2分离株BetaCoV/Munich/BavPat1/2020(含有D614G代替物)鼻内感染。作为另一阳性对照组，D组肌内注射于铝胶(Brenntag)中佐剂为2％的5μg重组SARS-CoV-2棘蛋白(S1+S2 ECD，His标签；Sino Biological,Cat.40589-V08B1)。在第28天(初打后)及第42天及第56天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。在第56天，以0.1ml总剂体积用102TCID50/剂的SARS CoV-2鼻内攻击动物。动物在攻击后(p.c.)四天追踪且在实验第60天安乐死。
表14：疫苗接种方案(实施例9)
Figure GDA0003858923850002711
抗体分析
在第28天、第42天及第56天采集血液样品用于经由ELISA测定总IgG抗体。培养板在37℃下涂布1μg/ml SARS-CoV-2棘蛋白S(细胞外域)持续4-5h。培养板在10％牛奶中阻断隔夜，洗涤且在室温下与血清一起培育2h。为了侦测，仓鼠血清与生物素山羊抗仓鼠(叙利亚)IgG抗体(BioLegend,Cat:405601)一起培育，接着与HRP-链霉亲和素(BD,Cat:554066)一起培育。在BioTek SynergyHTX板读取器中，借由激发530/25，发射侦测590/35及45的灵敏度进行特定讯息的侦测。未经由ELISA对感染动物(C组)的IgG抗体效价进行分析。
在56℃下对样品热去活化30min后分析仓鼠血清样品的病毒中和抗体效价(VNT)。在37℃下将一式三份连续两倍稀释液与102TCID50/孔SARS-CoV-2病毒(特征为突变D614G)一起培育一小时，产生样品以1:10开始稀释。将病毒-血清混合物与Vero E6细胞培养物单层一起转移至96孔板，且在37℃下培育五天。接着使用活力标记WST8对培养板进行评分，且根据由李-明二氏(Reed&Muench)所描述的方法计算(100％指标)VN效价。
呼吸道中的病毒负荷
在攻击后分析咽喉拭子、肺及鼻甲组织中可侦测的复制胜任型病毒水平。将一式四份10倍连续稀释液与Vero E6细胞培养物单层一起转移至96孔板，且在37℃下培育一小时。洗涤细胞单层随后在37℃下培育五天。接着使用活力标记WST8对培养板进行评分，且使用斯皮尔曼-卡勃(Spearman-Karber)的方法计算病毒效价(Log10 TCID50/ml或/g)。
在仓鼠攻击后的组织病理学
对攻击后第4天取样的组织进行组织病理学分析。用10％福尔马林固定之后，将切片包埋于石蜡中，且用苏木精及曙红染色组织切片用于组织学检查。组织病理学评估评分如下：肺泡炎严重程度、支气管炎/小支气管炎严重程度：0＝无炎性细胞，1＝少量炎性细胞，2＝中等数目发炎性细胞，3＝大量炎性细胞。肺泡炎延伸为0＝0％，1＝<25％，2＝25-50％，3＝>50％。存在肺泡水肿，存在肺泡出血，存在II型肺细胞增生，0＝否，1＝是。支气管周围/血管周围围管的延伸为0＝无，1＝1-2个细胞厚，2＝3-10个细胞厚，3＝>10个细胞厚。
结果
如图12A中所示，以4周间隔经2μg或10μg的两个CVnCoV剂量疫苗接种的仓鼠在第一次疫苗接种之后产生的剂量依赖性S结合IgG抗体在第二次疫苗接种后增加。用10μgCVnCoV疫苗接种的动物的中值指标效价在一剂之后为1.6×105且在第42天在7.8×105达到峰值。未经由ELISA对感染动物(C组)的IgG抗体效价进行分析。
如图12B中所示，在第一次疫苗接种后28天存在可侦测水平的VNT。在研究的第42天及第56天分析的跨越两个剂量组(E及F组)在第二次免疫接种之后VNT水平增加。用于此分析的病毒表征D614D突变，而CVnCoV编码的S_stab不包括此突变。值得重视地，接受有明矾佐剂的SECD蛋白的对照组产生IgG抗体而不诱导可侦测水平的VNT。
在第56天，在第二次疫苗接种之后四周，用特征为D614G(102TCID50/剂)的SARS-CoV-2攻击所有动物。在缓冲液对照组动物中，自第56天至第60天终止每天采集的来自咽喉细胞的复制胜任型病毒的水平在攻击后两天显示约103TCID50/ml的峰值病毒效价，其在第60天返回至几乎不可侦测的水平。先前经SARS-CoV-2感染的动物在整个实验期间保持阴性。两个CVnCoV疫苗接种组的咽喉拭子中的病毒水平显著降低。用10μg CVnCoV疫苗接种导致病毒峰值显著降低且延迟，在攻击后三天达到101.5TCID50/ml。此组中5只动物中的至少2只在整个试验周期保持阴性(参见图12C)。
鼻甲中的病毒水平较不明显但可侦测到的病毒复制的剂量依赖性减少(图12D)。重要地，经10μg CVnCoV疫苗接种的动物在肺中展现不可侦测的病毒水平，证明CVnCoV保护动物免于下呼吸道中的病毒复制的能力(图12E)。
组织病理学分析显示在SARS-CoV-2感染后缓冲液对照组中肺泡损伤及肺泡、支气管及气管的炎症的发生。与保护肺免于病毒复制一致，CVnCoV在用10μg进行两次疫苗接种后显著减少组织病理学变化。重要地，2μg的剂量(其引起结合抗体的诱导但仅诱导低水平的VNT)不诱导增加的组织病理学评分。肺均质物中的差异基因表现的组比较显示，相比于缓冲液组或模拟感染组，mRNA组中的IL-4或IL-5的诱导无显著变化(图中未示)。因此，本发明人得出结论，即使在发生突发性病毒复制的条件下，CVnCoV亦不会在仓鼠中诱导增强的疾病(例如经由抗体依赖性增强)。呈现的数据表明，用明矾佐剂的蛋白疫苗进行疫苗接种，其不引发可侦测水平的VNT，但会引发高水平的结合抗体，造成在仓鼠的组织病理学评分增加(图12F，表14)。
表15：图12F中所指示的组织病理学分析的清单：
组织病理学分析
1 肺泡炎/肺泡损伤的延伸
2 肺泡炎的严重程度
3 肺泡炎的延伸+严重程度的总和
4 存在肺泡水肿
5 存在肺泡出血
6 存在II型肺细胞增生
7 支气管炎的严重程度
8 小支气管炎的严重程度
9 支气管周围/血管周围围管的程度
10 气管炎的严重程度
11 鼻炎的严重程度
与强健的免疫反应一致，CVnCoV保护仓鼠免于来自特征为S中的D614G突变的SARS-CoV-2病毒攻击，证明CVnCoV保护免受最普遍形式的病毒的能力。此等实验显示，在用10μg的CVnCoV进行两次疫苗接种后，上呼吸道中的复制病毒水平显著减少且动物肺中不存在可侦测的活病毒。
实施例10：SARS-CoV-2mRNA疫苗组成物的临床发展
为了证明mRNA疫苗组成物的安全性及免疫原性，启动临床试验(1、2a期)。在1期临床试验中，对人类志愿者(18-60岁)群组进行至少两次肌内注射(例如第1天及第29天，其中剂量为2μg、4μg、8μg、12μg、16μg或20μg根据本发明(CvnCoV)的调配于LNP(如实施例1.4中所描述)中编码SARS-CoV-2棘蛋白(R9515，SEQ ID No.163)的mRNA)。为了评估本发明的疫苗组成物的安全轮廓，在投予之后监测个体(生命体征、疫苗接种位点及全身性反应原性评估、血液学分析)。免疫接种的免疫原性是借由测定来自疫苗接种个体的血清中针对SARS-CoV-2、病毒中和效价(VNT)及SARS-CoV-2专一性T细胞的抗体来分析。在第1天，在各疫苗接种之后及在长期追踪期间，收集血液样品作为基线。
群组：
2μg 4μg 6μg 8μg 12μg 16μg 20μg 总计
N 血清反应阴性 46 46 46 46 24 12 12 232
N 血清反应阳性 10 10 10 6 4 1 41
总N CVnCoV+安慰剂 56 56 56 52 28 13 12 273
在第8天、第15天、第29天、第36天、第43天、第57天、第120天、第211天及第393天，测定以下各者：
a)如借由ELISA量测个体针对SARS-CoV-2棘蛋白抗体血清转化的比例。
在试验之前或在试验期间在收集可适用样品之前未暴露于SARS-CoV-2的个体中，如借由ELISA针对SARS-CoV-2N-抗原所量测，血清转化定义为抗体针对SARS-CoV-2棘蛋白相对于基线的效价增加。
在基线处对SARS-CoV-2血清呈血清反应阳性的个体中，血清转化定义为抗体针对SARS-CoV-2棘蛋白相对于基线的效价增加2倍。
b)如借由ELISA量测血清中个别SARS-CoV-2蛋白专一性抗体水平。
c)在试验之前或在试验期间在收集可适用样品之前未暴露于SARS-CoV-2的个体中(如借由ELISA针对SARS-CoV-2N-抗原所量测)的血清SARS-CoV-2棘蛋白抗体的几何平均值效价(GMT)如借由ELISA所量测。
d)如借由活性分析量测个体针对SARS-CoV-2中和抗体血清转化的比例。
在试验之前或在试验期间在收集可适用样品之前未暴露于SARS-CoV-2的个体中，如借由ELISA针对SARS-CoV-2N-抗原所量测，血清转化定义为抗体针对SARS-CoV-2中和抗体相对于基线的效价增加。
在基线处对SARS-CoV-2血清呈血清反应阳性的个体中，血清转化定义为抗体针对SARS-CoV-2中和抗体相对于基线的效价增加2倍。
e)血清中个别SARS-CoV-2中和抗体水平。
f)在试验之前或在试验期间在收集可适用样品之前未暴露于SARS-CoV-2的个体中(如借由ELISA针对SARS-CoV-2N-抗原所量测)的血清SARS-CoV-2中和抗体的GMT如借由活性分析所量测。
细胞介导的免疫反应
在第29天、第36天及第211天，在来自所有个体的指定位点处的周边血液单核细胞(PBMC)中，测定以下各者：
a)在抗原刺激之后SARS-CoV-2棘蛋白专一性T细胞反应的频率及功能。
b)细胞内细胞介素染色(ICS)以研究Th1反应及Th2标记的产生
c)具有SARS-CoV-2棘蛋白专一性T细胞反应可侦测到增加的个体的比例。
先天性免疫反应
在第2天、第8天、第29天、第30天及第36天，在所有开放标记标记的个体中，测定以下各者：
a)血清细胞介素浓度包括(但不限于)干扰素(IFN)-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、趋化介素配位体(CCL)2及IFN-γ诱导的蛋白10(IP 10)。
b)基因表现轮廓。
感染评估
a)在整个试验中测定时间点临床上借由反转录(RT)-PCR所量测的患有病毒学证实的SARS-CoV-2感染的个体的数目。
b)测定患有如借由预定义时间点的回溯性血清学所量测的无症状SARS-CoV-2感染的个体数目。
病毒中和：
借由基于细胞病变效应(CPE)的微量中和分析，借由病毒感染剂量25(MN25TCID50/孔)，在VERO E6细胞系上使用野生型病毒株(SARS-CoV-2 2019nCOV ITALY/INMI1}观察50％CPE来测定所诱导抗体的中和活性。以96孔板格式进行分析，以1:2连续稀释来稀释人类血清。微量中和效价为保护至少50％的细胞免于CPE影响的最高样品稀释度的倒数且报导为重复的几何平均值。
ELISA：
使用棘蛋白的额外细胞结构域(ECD)或受体结合结构域(RBD)作为目标抗原用Elisa分析量测抗体效价。用于涂布的抗原重组蛋白表现于真核细胞中。人类血清以连续稀释1:2稀释，效价定义为空白加基质效应的割点上的最高样品稀释的倒数。效价报导为重复的几何平均值。
T细胞反应：
作为此临床试验的探测指标，借由评估在抗原刺激之后SARS-CoV-2棘蛋白专一性CD4+Th1及细胞毒性CD8+T细胞反应的频率及功能来评估细胞介导的免疫反应。此外，测定疫苗接种后SARS-CoV-2棘蛋白-专一性T细胞反应可侦测增加的个体的比例。
借由在SARS-CoV-2棘蛋白专一性CD4+Th1及细胞毒性CD8+T细胞用叠加棘蛋白肽池刺激之后T细胞活化标记及效应细胞介素(CD40L、IFN-γ、IL-2及TNF-α)的基于流式细胞测量术细胞内细胞介素染色(ICS)活体外测定及定量功能性T细胞反应。
结果：
在图13A中，在第一剂后及第二剂后不同剂量群组中显示全身性不良事件。
在图13B中，在第一剂后及第二剂后不同剂量群组中显示局部不良事件。
在图13C中，显示特定全身性不良事件，诸如疲劳、头痛、肌痛、发冷、关节痛、发烧、恶心及腹泻。
在图13D中，显示特定局部不良事件，诸如疼痛、瘙痒、肿胀及发红。
总体而言，CvnCoV疫苗显示良好安全特性及可接受的反应原性。
在图13E中，显示不同剂量群组的棘蛋白专一性IgG抗体在第1天、第29天、第36天、第43天及第57天的诱导。所有经疫苗接种的个体显示良好的棘蛋白专一性抗体的诱导，其中12μg群组显示与血清转化患者(HCS)相同的抗体水平。在图13E的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在大部分情况下，在第43天，超过90％经疫苗接种的个体显示与基线相比棘蛋白专一性抗体增加超过2倍。在所有剂量组中，至少70％经疫苗接种的个体显示与基线相比棘蛋白专一性抗体增加超过4倍。在12μg中，甚至超过90％的个体显示抗体增加超过4倍。
在图13F中，显示不同剂量群组的RBD专一性IgG抗体在第1天、第36天及第43天的诱导。所有经疫苗接种的个体显示良好的RBD专一性抗体的诱导，其中12μg群组显示与血清转化患者(HCS)相同的抗体水平。在图13F的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在大部分情况下，在第43天，超过80％经疫苗接种的个体显示与基线相比RBD专一性抗体增加超过2倍。在8μg及12μg组中，超过80％的个体显示抗体增加超过4倍。
在图13G中，显示病毒中和抗体的诱导。所有剂量组显示良好的病毒中和效价的诱导，其中12μg的最高剂量诱导与血清转化患者(HCS)中所存在相同的中和抗体水平。在图13G的表中，显示经疫苗接种的个体的血清转化百分比。在所有剂量组中，在第43天，超过70％经疫苗接种的个体显示与基线相比病毒中和抗体增加超过2倍。在8μg及12μg剂量组中，至少70％经疫苗接种的个体显示与基线相比病毒中和抗体增加超过4倍。在12μg中，甚至100％的个体显示病毒中和抗体增加超过4倍。
在图13H中，显示棘蛋白或RBD结合抗体的水平与中和抗体的水平的比率。重要地，CVnCoV诱导的比率约与来自恢复期个体相同，此暗示所诱导的抗体水平足以中和SARS-CoV-2。
图13I显示在第一剂(第29天)及第二剂(第36天)之后针对棘蛋白S1的CD4+T细胞的诱导。两个剂量组(4μg及8μg)显示针对棘蛋白S1的CD4+T细胞的良好诱导。
图13J显示在第一剂(第29天)及第二剂(第36天)之后针对棘蛋白S2的CD4+T细胞的诱导。两个剂量组(4μg及8μg)显示与恢复期病患可比的针对棘蛋白S的CD4+T细胞的良好诱导。
在图13K中，显示在2μg(左)及4μg(右)的CvnCoV疫苗接种之后，SARS-CoV-2血清反应阳性个体中病毒中和效价的诱导(上部)。值得注意地，病毒中和抗体可在已表现病毒中和抗体的血清反应阳性患者中的两个剂量组中加强。
在下部显示在2μg(左)及4μg(右)的CvnCoV疫苗接种之后，SARS-CoV-2血清反应阳性个体中RBD专一性抗体的诱导。值得注意地，RBD专一性抗体可在已表现RBD专一性抗体的血清反应阳性患者中的两个剂量组中加强。
实施例11：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA疫苗接种小鼠
本实施例显示具有包含3'端(A64-N5-C30-hSL-N5或hSL-A100)及UTR组合(i-3(-/muag)或a-1(HSD17B4/PSMB3))的替代形式的mRNA的SARS-CoV-2S mRNA疫苗在小鼠中诱导强体液以及细胞免疫反应。包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的编码SARS-CoV-2S_stab的mRNA显示免疫反应的较强诱导，其借由结合及中和抗体的较强诱导以及CD8+T细胞的较强诱导展现。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
以如表16中所指示的剂量，向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，n＝8)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价，在第42天分离脾细胞以用于T细胞分析。
表16：疫苗接种方案(实施例11)：
Figure GDA0003858923850002801
如实施例6中所描述，进行使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价、经由CPE(细胞病变效应)测定病毒中和效价及借由细胞内细胞介素染色(ICS)进行T细胞分析。
结果：
如图14A中所示，在单次疫苗接种(d21)之后用编码全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNA的疫苗接种诱导S专一性结合抗体(IgG1及IgG2a)的较高效价。第二次疫苗接种(d42)后效价增加。包含编码包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA的疫苗组成物(C组)显示结合抗体的改良且较强的诱导(由IgG1及IgG2a指标效价显示)。
两种mRNA设计在第二次疫苗接种后(第42天)诱导或多或少的可比的病毒中和抗体效价，而C组小鼠相较于B组在第一次疫苗接种后已经在d21显示出VNT的较早水平增加(图14B中所示)。
如图14C中所示，在两次疫苗接种之后用编码全长S稳定蛋白的mRNA与两种替代形式的3'端(A64-N5-C30-hSL-N5或hSL-A100)及UTR组合(i-3(-/muag)或a-1(HSD17B4/PSMB3))的疫苗接种诱导稳健水平的抗原专一性CD4+及CD8+IFNγ/TNF双阳性T细胞。包含编码包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA的疫苗组成物(C组)出人意料地显示CD8+IFNγ/TNF双阳性T细胞的显著较强诱导。
实施例12：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA疫苗接种大鼠
本实施例显示具有包含3'端(hSL-A100)及UTR组合(a-1(HSD17B4/PSMB3))的本发明替代形式的mRNA的SARS-CoV-2S mRNA疫苗在大鼠中诱导强体液性细胞免疫反应。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向大鼠肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表17中所指示。作为阴性对照组，一组大鼠经缓冲液(A组))疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表17：疫苗接种方案(实施例12)：
Figure GDA0003858923850002821
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA使用重组SARS-CoV-2S(受体结合域，RBD)蛋白进行涂布。使用各别血清稀释液培育经涂布的培养板，且用标记HRP抗体代替用于小鼠ELISA的二级HRP抗体直接侦测专一性抗体与SARS-CoV-2S的结合。大鼠ELISA中缺乏讯息扩增可能为较低效价的原因，因此大鼠与小鼠研究之间的ELISA效价目前无可比性。
测定病毒中和抗体效价(VNT)
如先前实施例6中所描述用小鼠血清分析大鼠血清样品的病毒中和抗体效价(VNT)。
结果：
如图15A中所示，在第一次疫苗接种之后第21天及在使用0.5μg、2μg及8μg的剂量进行第二次疫苗接种之后第42天，用调配于LNP中包含具有3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的替代性非编码区的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中诱导稳健及剂量依赖性水平的结合抗体效价。第二次疫苗接种引起抗体效价的进一步增加。
如图15B中所示，用调配于LNP中包含具有3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的替代性及本发明非编码区的编码全长S稳定蛋白的mRNA的疫苗接种在大鼠中诱导剂量依赖性及极高水平的VNT。与用包含具有3'端A64-N5-C30-hSL-N5及UTR组合(i-3(-/muag)的非编码区的mRNA引发的免疫反应相比，借由ELISA(结合抗体IgG1及IgG2a(及VNTS所示的体液性免疫反应显著增加(参见比较实施例8图11A-F)。
实施例13：SARS-CoV-2(CVnCoV)疫苗的临床发展
1针对人类疫苗接种的试验方案
2概述
试验设计为18岁及以上成人中的2b/3期关键疗效及安全试验。试验将具有随机、观察者单盲、安慰剂对照设计。个体将在全球多个位点登记且将以1:1比率随机化以接受2剂方案的以12μg mRNA为剂量水平的CVnCoV或安慰剂{标准生理盐水(0.9％NaCl)}作为对照组。
3延伸
在第393天完成试验CV-NCOV-004之后，个体将继续参与延伸为1年的研究。在试验CV-NCOV-004同意时，个体亦将同意参与1年的延伸研究。延伸研究将收集额外数据以评估长期安全性{严重不良事件(SAE)}、抗体对SARS-CoV-2的持久性及COVID-19病例的出现以评估疫苗功效(VE)的持续时间。
4试验目标、指标及评估量
4.1目标
4.1.1主要目标
协同主要功效目标
·证明CVnCoV的2剂方案在SARS CoV 2未经感染的个体中预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效。
·证明CVnCoV的2剂方案在SARS CoV-2未经感染的个体中预防中度至重度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效。
主要安全目标
·评估向18岁及以上的个体投予2剂方案的CVnCoV的安全性。
4.1.2次要目标
关键次要功效目标
·证明CVnCoV的2剂方案在SARS CoV-2未经感染的个体中预防重度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效。
·证明CVnCoV的2剂方案在血清反应阴性个体中预防或减轻SARS-CoV-2的无症状感染的功效，如借由血清转化为病毒的N蛋白所量测。
其他次要功效目标
评估SARS-CoV-2未经感染的个体：
·CVnCoV的2剂方案在≥61岁个体中预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效。
·CVnCoV的2剂方案在具有或不具有症状情况下预防经病毒学证实的SARS-CoV-2感染病例的第一次发作的功效。
·CVnCoV的2剂方案在降低COVID-19疾病负担(BoD)的功效。
·CVnCoV在第一剂之后在预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效。
次要免疫原性目标
·在参与试验2b期的个体子组中，评定1剂及2剂CVnCoV之后的对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的抗体反应。
·在参与试验2b期的个体子组中，评定1剂及2剂CVnCoV之后的SARS-CoV-2病毒中和抗体反应。
次要安全目标
·评估以2剂方案向18岁及以上参与试验2b期的个体中投予后的CVnCoV的反应原性及耐受性。
4.1.3探索性目标
探索性功效目标
研究SARS-CoV-2未经感染的个体：
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体的COVID-19病例的严重程度较轻。
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体减少由COVID-19所致的补充氧合的需要。
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体减少由COVID-19所致的机械通风的需要。
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体减少由COVID-19所致的住院期。
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体由COVID-19所致的死亡降低。
·比如相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体的各种原因的死亡降低。
·研究来自所选位点处多达400名个体的2剂方案的CVCoV的细胞介导的免疫(CMI)反应。
研究SARS-CoV-2未经感染及经感染的个体：
·CVnCoV的2剂方案在所有个体中预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效，无关于基线处的SARS-CoV-2血清学状态。
·CVnCoV在第一剂之后在所有个体中预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一次发作的功效，无关于基线处的SARS-CoV-2血清学状态。
研究在试验期间患有经病毒学证实的COVID-19的第一次发作的个体：
·相比于投予安慰剂的个体，接受2剂方案的CVnCoV的个体出现COVID-19的第二次发作。
4.2指标
4.2.1主要指标
协同主要功效指标
·出现符合主要功效分析的病例定义的任何严重程度的经病毒学证实{反转录聚合酶链反应(RT-PCR)阳性}的COVID-19病例的第一次发作。
·出现符合主要功效分析的病例定义的中度至重度的经病毒学证实(RT-PCR阳性))的COVID-19病例(本文所定义的中度及重度COVID-19疾病)的第一次发作。
主要安全指标
·所有个体中在第二次试验疫苗接种之后6个月内收集的医疗介入的AE的出现、强度及关系。
·所有个体中在第二次试验疫苗接种之后1年内收集的SAE及AESI的出现、强度及关系。
·所有个体中在第二次试验疫苗接种之后1年内致命性SAE的出现。
4.2.2次要指标
关键次要功效指标
·出现符合主要功效分析的病例定义的重度的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例(本文所定义的重度COVID-19疾病)的第一次发作。
·在无症状血清反应阴性个体第二次试验疫苗接种后≥15天内SARS-CoV-2的N蛋白出现血清转化。
血清转化定义为在试验第211天及/或第393天的个体血清中可侦测的SARS-CoV-2N蛋白抗体，个体在第1天(基线)及第43天(亦即在第二次试验疫苗接种之后15天之前的2个测试时间点)测试呈血清反应阴性。
其他次要功效指标
·在≥61岁个体中，出现符合主要功效分析的病例定义的任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性))的COVID-19病例的第一次发作。
·出现伴有或不伴有症状的经病毒学证实(RT-PCR阳性))的SARS-CoV-2感染。
若个体有症状，则症状发作必然在第二次试验疫苗接种之后≥15天出现；若个体无征状，则阳性RT PCR测试结果必然在第二次试验疫苗接种之后≥15天出现。
·基于符合主要功效分析的病例定义的任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例的第一次发作计算BoD评分。
oBoD#1-无疾病(未感染或无症状感染)＝0；轻度或中度疾病＝1；重度疾病＝2。
oBoD#2-无疾病((未感染或无症状感染)＝0；无需住院的疾病＝1；需住院的疾病＝2；死亡＝3。
·出现在第一次试验疫苗接种之后的任何时间内具有症状发作的任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性))的COVID-19病例的第一次发作。
次要免疫原性指标(2b期免疫原性子组)
S蛋白的SARS-CoV-2RBD抗体反应
在第1天、第29天、第43天、第57天、第120天、第211天及第393天：
·针对S蛋白的SARS-CoV-2RBD的血清抗体。
·出现血清转化为S蛋白的SARS-CoV-2RBD。
血清转化定义为在基线处经测试为血清反应阴性的个体的血清中可侦测的S蛋白的SARS-CoV-2RBD抗体。
SARS-CoV-2病毒中和抗体反应
在第1天、第29天、第43天、第57天、第120天、第211天及第393天：
·针对SARS-CoV-2病毒的血清病毒中和抗体，如借由病毒中和抗体分析所量测。
·出现血清转化为SARS-CoV-2病毒，如借由病毒中和抗体分析所量测。
血清转化定义为在基线处经测试为血清反应阴性的个体的血清中可侦测的SARS-CoV-2病毒中和抗体。
次要安全指标
·在各试验疫苗接种之后7天内在2b期个体中各征集到的局部AE的出现、强度及持续时间。
·在各试验疫苗接种之后7天内在2b期个体中各征集到的全身性AE的出现、强度及持续时间。
·在各试验疫苗接种之后28天内在2b期个体中出现的非征集到的(unsolicited)AE的出现、强度及关系。
·在第二次试验疫苗接种之后1年内在所有个体中导致疫苗废止或试验中断的AE的出现。
4.2.3探索性指标
探索性功效指标
·符合主要功效分析的病例定义的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例的第一次发作的严重程度估计。
以下指标将分析为在第二次试验疫苗接种后≥15天(完整VE)及在第一次试验疫苗接种之后的任何时间出现。
在SARS-CoV-2未经感染的个体中：
·出现由COVID-19疾病所致的补充氧合。
·出现由COVID-19疾病所致的机械通风。
·出现由COVID-19疾病所致的住院。
·出现由COVID-19疾病所致的死亡。
·出现由任何原因所致的死亡。
在SARS-CoV-2未经感染的及经感染的个体中：
·在所有个体中，无关于其基线血清状态，出现任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例的第一次发作。
以下指标将在具有符合主要功效分析的病例定义的任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例的第一次发作的个体中分析。
·出现任何严重程度的经病毒学证实(RT-PCR阳性)的COVID-19病例的第二次发作。
探索性免疫原性指标(2b期免疫原性子组)
在第1天、第29天、第43天、第120天**和第211天**时，在来自400名个体的所选择的位点处的周边血液单核细胞(PBMC)：
·在借由细胞内细胞介素染色(ICS)抗原刺激之后S专一性T细胞反应的SARS-CoV-2RBD的频率及功能性以研究Th1反应及Th2标记的表现。
·具有S专一性T细胞反应的SARS-CoV-2RBD可侦测到增加的个体的比例。
**第120天及第211天收集的样品的测试将仅在第29天及/或第43天分类为T细胞反应者的个体中进行。
4.3估计量
Figure GDA0003858923850002891
Figure GDA0003858923850002901
Figure GDA0003858923850002911
Figure GDA0003858923850002921
Figure GDA0003858923850002931
Figure GDA0003858923850002941
5试验设计
5.1总体设计
试验CV-NCOV-004将在2个部分中进行：初始期2b试验，随后转变成大型期3功效试验。2b期及3期两者将作为随机、观察者单盲、安慰剂对照试验来进行。18岁或以上的个体将在全球多个位点登记且将以1:1比率接受2剂方案的以12μg mRNA为剂量水平的CVnCoV或安慰剂{标准生理盐水(0.9％NaCl)}作为对照。试验的2b期及3期部分两者在设计方面一致(例如针对COVID-19病例确定及病例定义)，使得在2b期中发生的COVID-19病例可与3期中的彼等病例合并以用于VE的主要分析。
个体亦将参与试验的2b期及3期部分的1年延伸试验。
2b期设计及目标
2b期的目标为在起始期3之前进一步界定CVCoV的安全、反应原性及免疫原性的特征。CVnCoV将以借由来自初始期1及2a试验的安全及免疫原性数据告知的选择用于3期研究的12μg的剂量水平投予。2b期将在2个年龄的成人组中进行：18至60岁及≥61岁，其表示既定3期试验群体的年龄范围。
大约4,000名个体将登记且将以1:1比率随机化以接受2剂方案的以12μg mRNA为剂量水平的CVnCoV或安慰剂，相隔28天投予。在登记的4,000名个体中，大约800至1,000名(20％至25％)将≥61岁。2b期将以观察者单盲方式执行以减少安全评估中的任何潜在偏差。4,000名个体的样品大小是基于产生界定在进入3期之前的CVnCoV的安全、反应原性及免疫原性的稳健且详细数据集的特征。此外，2b期中所产生的数据将为支援CVnCoV的早期条件性核准而提交的主要数据集。
在2b期中，将借由量测以下AE的频率及严重程度来详细评定2剂方案的CVnCoV的安全及反应原性：在各疫苗接种之后7天内的征集到的局部及全身性反应；在各疫苗接种之后28天内的非征集到的AE；在第二次试验疫苗接种之后6个月内的医疗介入的AE；及第二次试验疫苗接种之后1年内的AESI及SAE。将借由量测针对S蛋白的SARS-CoV-2RBD的结合抗体及病毒中和抗体，在个体子组(前600名个体参加2个年龄组中的每一者；免疫原性子组中总共1,200名个体)中的1及2剂之后评价CVnCoV的免疫原性。将在此试验中以及延伸研究中评估抗体持久性。
将收集在2b期个体中出现的COVID-19病例且与3期中出现的彼等者合并，且病例的总数将用于功效的初步分析。另外，DSMB将定期监测VDE讯息的COVID-19病例。
参与2b期的个体亦将在试验期间评估无征状SARS-CoV-2感染，如借由针对SARS-CoV-2的N蛋白的抗体的发展(亦即血清转化)所量测。此等数据将与来自3期的数据合并以确定疫苗接种CVnCoV能否可预防或降低借由SARS-CoV-2的无症状感染比率(关键次要功效目标中的一者)。
将2个目标年龄组的初始个体登记为2b期为可挠的。视来自1期及2a期试验的数据时序而定，可将2个年龄组登记至2b期错开，初始开始为18至60岁的个体，随后为≥61岁的个体。由于年长的年龄组将包含2b期个体总数的20％至25％，预期此错开开始不影响2b期群组的总体登记。
2b期数据的早期安全回顾将借由DSMB进行(参见章节9.3.9.1)。当大约1,000名个体已登记为2b期(25％的个体登记；500名CVnCoV接受者及500名安慰剂接受者)且在第一次试验疫苗接种之后进行至少1周的安全追踪时将进行安全审查。若安全轮廓判定为可接受的且不存在安全性或耐受性问题，则预期个体登记为3期可开始而无需自2b期中断。当大约1,000名2b期的个体已接受其第二次试验疫苗接种且具有至少数周的以下安全追踪时将借由DSMB进行的另一安全审查。此时将亦回顾来自2b期个体的所有可获得的第一剂安全性数据。
3期设计及目标
合并的2b/3期试验的协同主要目标为展现在预防任何严重程度的COVID-19病例或中等或高于严重程度的COVID-19病例的2剂方案的CVnCoV的功效。与2b期类似，3期将作为随机、观察者单盲、安慰剂对照试验来进行。大约32,500名18岁或以上的个体将在3期在全球多个位点登记且将以1:1比率接受2剂方案的以12μg为剂量水平的CVnCoV或安慰剂(参见图2)。与2b期类似，登记目标为年龄≥61岁的个体，约占3期试验群体(6,500至8,125名个体)的20％至25％。试验的合并的的2b期及3期部分的总登记将为36,500名个体。
个体将经历针对COVID-19的主动监督。在所有位点访视及电话呼叫期间，若个体患有具有临床上与COVID-19一致的任何症状的急性疾病，则将提醒个体联络位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，且对具有COVID-19症状提供肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪访问及评估。若怀疑个体患有COVID-19疾病，则他/她将进行SARS-CoV-2感染的测试，其中样品在位点或在家中访视时收集。若个体经确认患有COVID-19，则将追踪所有个体直至其疾病消退。若个体住院，则个体进展必须由研究人员进行追踪且在住院结束时获得出院汇总。关于临床症状及病征、其持续时间及严重程度以及COVID-19发作的治疗及结果的资讯将由试验工作人员记录且记录于电子病例报告表(eCRF)中。在消退时，个体将继续以与尚未呈现有COVID-19的相同的方式追踪试验结束。患有先前疾病的个体中COVID-19的第二次发作将不视为主要功效病例，但将计数用于评估COVID-19在经疫苗接种的个体中复发的探索性目标。
由于在大流行性配置中COVID-19例所致的不确定发病率，试验将基于任何严重程度COVID-19指标作为病例驱动的试验进行，其将包括两个期间分析及借由达成预定数目个病例以用于各分析而触发的最终分析。如上文所描述，在2b期中发生的COVID-19病例将与3期中的彼等病例合并以用于VE的主要分析。因而，参与2b期的个体将对VE的主要分析贡献总样品大小(N＝36,500)。
对于主要功效分析，病例必须满足以下标准(中度及严重COVID-19疾病定义于本文中)：
·必须为病毒学证实的COVID-19病例，其定义为在患有临床上症状性COVID-19的个体中呈阳性SARS CoV 2专一性RT-PCR测试结果(参见章节9.2)。
·症状发作必须在第二次试验疫苗接种之后≥第15天出现。
·个体在登记时(基于排除标准1)必须不具有病毒学证实的COVID19的病史或在第二次试验疫苗接种之后15天之前已产生病毒学证实的COVID-19病例。
·个体必须已在基线及第43天(针对N蛋白为血清反应阴性)展现为SARS-CoV-2未经感染的个体。
主要功效病例必须借由裁定委员会证实。
此试验将利用具有2个期间分析的组连续设计以用于高功效或无效，对任何严重度的经病毒学证实的COVID-19病例的协同主要指标使用O'Brien及Fleming误差损耗函数。在总体双边α为2.5％且在最终分析时具有符合主要功效病例定义的任何严重程度总共185个COVID-19病例下，当考虑VE为60％时，试验将具有90％的总体功效以显示大于30％的VE{基于针对VE的97.5％信赖区间(CI)的下限的30％界限}。一旦已累积符合主要病例定义的56/111个病例(最终病例数目的30％/60％)，则将进行高功效或无效的两个期间分析。此等点是基于2个标准选择：i)56/111病例的稳健性以支持高疗效或无效的决定及ii}若高功效，则此将缩短试验的持续时间且潜在地允许疫苗较早可用。
对于病毒学证实的中度至重度COVID-19病例的协同主要指标，在总共双边α为2.5％且总共60个重度至中度COVID 19个病例符合最终分析时的主要功效病例定义的情况下，当考虑VE为70％时，试验将具有90％的总体功效以显示大于20％的VE{基于针对VE的97.5％信赖区间(CI)的下限的20％界限}。假定COVID-19个病例中的1/3个为中度至重度，则当COVID-19个病例的总数为180时，将获得60个中度至严重病例。将不存在针对此协同主要指标的期间分析。
假设安慰剂个体中COVID-19的发病率为每月0.15％(1.5个病例/1000个/月)；在试验期间，VE为60％；及20％的不可评估比率，其包括基线处的约5％个体呈血清阳性的登记(亦即经感染的个体)，持续3个月对36,500名个体追踪登记(每个疫苗组18,250)将在第一次疫苗接种之后大约9个月累积目标185个任何严重程度的COVID-19病例。
在登记完成或快登记完成时，将借由DSMB执行对病例的发病率的非盲审查。若病例应计率低于预期，则DSMB可推荐增加样品大小。若需要，则可在试验中稍后进行借由DSMB进行的另一非盲审查以进一步调整样品大小。试验事件展示于以下时间线(1年延伸研究论述于下文)中。
在两组中可评估个体具有相同追踪时间的情况下，若185个全部病例中的60个或更少处于CVnCoV组中，则将在最终分析中展现功效(所估计的VE≥52.0％)。当已累积符合主要病例定义的56/111个病例(在试验开始之后大约5/6.5个月)，则将进行高功效或无效的两个期间分析。若两个组中可评估个体的追踪时间相等，若56/111个病例中的7/29个病例或更少病例在CVnCoV组中则将展现早期较高功效(在期间的所估计的VE≥85.7％/64.6％)；相反地，若26/41个病例或更多病例在CVnCoV组中则将达到无效(在期间的所估计的VE≤13.3％/41.4％)。期间分析的评估将借由DSMB进行，且结果将在无盲试验小组或试验委托者的情况下传达。
与2b期类似，参与3期的个体亦将在试验期间评估SARS-CoV-2感染，如借由在血清反应阴性的个体在针对SARS-CoV-2的N蛋白的抗体的发展所量测。
3期的安全目标为产生将展现CVnCoV的安全的大规模安全性数据库。参与试验的2b期及3期部分的所有个体将具有在第二次疫苗接种之后6个月收集的医疗介入的AE；且在第二次疫苗接种之后1年收集的AESI及SAE。
不依赖于在期间分析中的任一者或最终分析中对CVnCoV功效的论证，HERALD试验CV-NCOV-004将继续且保持观察者单盲直至试验结束为止(当最后一个个体在第393天完成最后一次访视时(参见章节5.4))。在此时间段期间，安慰剂对照安全性数据的采集及COVID-19病例的累积将继续。
延伸研究
在第393天完成试验之后，个体将继续参与HERALD试验CV-NCOV-004延伸为1年(12个月)的研究。在延伸研究期间，在位点水平的盲法将维持用于收集用于安全性(SAE)的额外安慰剂对照数据、抗体针对SARS-CoV2的持久性及COVID-19病例的出现以评定功效的持续时间。延伸研究可在CVnCoV的批准后终止，此时可尽快向对照组个体提供对CVnCoV的疫苗接种。延伸研究亦可在局部部署有效疫苗时终止。在终止延伸研究之前，此将用DSMB及研究人员以及相关管控机构论述。
5.2试验设计的科学基本原理
HERALD试验CV-NCOV-004将在2个部分中进行：初始期2b试验，随后转变成大型期3功效试验。试验的2期及3期部分的设计一致，使得在2期中出现的COVID-19病例可与3期中的彼等病例合并以用于VE的主要分析。在2及3期合并COVID-19病例以加快功效结果在大流行性环境中视为保证的。
2b期及3期两者将经随机、观察者单盲、安慰剂对照。试验用CVnCoV疫苗及安慰剂的外观及呈现的差异需要试验以观察者单盲的方式进行，该方式为盲法试验的常用及公认方法。随机、观测者单盲及安慰剂对照设计将降低试验的安全性及功效结果的偏差的风险(亦参见章节7.3)。
因为老年人受SARS CoV 2最大且具有严重疾病及死亡率的高风险，所以研究此群体中的CVnCoV至关重要且因此将包括≥61岁个体。
2b期中的4,000名个体的样品大小是基于产生界定在进入3期之前的CVnCoV的安全、反应原性及免疫原性的稳健且详细数据集的特征。此外，2b期中所产生的数据将为支援CVnCoV的早期条件性核准而提交的主要数据集。
当考虑VE为60％时，合并的2b/3期试验的36,500名个体的总样品大小是基于表明VE高于30％(基于针对VE的97.5％(CI)的下限的30％界限)。在双边α为2.5％且总共为185个COVID-19病例的情况下，试验将具有90％功效以展示超过30％的VE。假设对照组个体中COVID-19的发病率为每月0.15％；且在试验期间20％的不可评估比率，其包括基线处的约5％个体呈血清阳性的登记(亦即经感染的个体)，持续3个月对36,500名个体追踪登记(每个疫苗组18,250)将在第一次疫苗接种之后大约9个月累积目标185个COVID-19病例。
对于功效的协同主要分析，COVID-19病例确定在第二次疫苗接种CVnCoV之后≥15天开始。此时间点允许免疫反应成熟且在第二剂之后达到其完全高度。因而，在此时间点处开始的确定病例表示对CVnCoV相对于COVID 19的完全VE的评估。
3期的安全目标为产生将展现CVnCoV的安全的大规模安全性数据库。参与试验的2b期及3期部分的所有个体将具有在第二次疫苗接种之后6个月收集的医疗介入的AE；且在第二次疫苗接种之后1年收集的AESI及SAE。因此，各个体将参与试验大约13.5个月，以便进行安全性追踪。
具有病毒学证实的COVID-19疾病病史的个体将不包括参与此试验。然而，此试验将不筛选或不包括具有先前SARS-CoV-2感染的病史或实验室证据的参与者，其中许多可能无症状。由于先前感染的预先疫苗接种筛选不大可能实务上发生，因此理解疫苗安全性及具有先前感染SARS-CoV-2病毒的个体中的COVID-19结果为至关重要的。
5.3剂量的调整
试验CV-NCOV-004的12μg mRNA剂量水平的选择是基于试验CV-NCOV-001及CVNCOV-002的安全性、耐受性及免疫原性结果。
5.4试验结束的定义
当他/她已完成所有访视及适用于他/她随机化的组的程序及测试时，认为个体已完成试验。
试验CV-NCOV-004的结束定义为最后一个个体在第393天完成最后一次访视或过早地中断试验时。
预期所有个体在1年延伸研究中继续，其中试验结束定义为最后一个个体在第757天完成最后一次访视时。
5.5安全性的停止/暂停规则
5.5.1个别个体停止规则
在第一试验疫苗接种之后出现以下事件中的任一者的情况下，满足个别个体停止规则：
·视为与试验疫苗相关的过敏性/过敏性反应
·视为与试验疫苗相关的任何SAE
若满足此等法则中的任一者，则个体不可接受第二疫苗剂。将鼓励个体继续参与，直至试验结束安全性为止。
5.5.2试验的暂停
归因于安全讯息而暂停试验(亦即暂时停止登记及疫苗接种)的决定将基于来自DSMB与试验委托者的建议(参见章节9.3.9.1)。在定期安排的DSMB会议审查呈递的累积安全性数据之后或自进行中的AE审查，DSMB可能出于安全问题而推荐暂停试验，所述AE包括但不限于疑似无法预期的严重不良反应(SUSAR)；判定为与试验疫苗有关的所有SAE；关于SAE(例如AESI)；以及所有危及生命的AE及死亡。在试验期间有规律的基础上，此等事件将由DSMB监测。在DSMB特许权中详细描述所选择的AE及用于安全性检查的程序。
为了确保进行中的基础上的个体安全，常规地借由DSMB主席(或被指派者)以规则时间间隔常规监测如上文所描述的AE的盲化清单。对于各审查，主席{或被指派者}将判定任何单一事件或事件组能否构成新安全讯息。若否，则主席将告知研究小组不存在安全问题。相反地，若存在安全性问题，则主席可揭发一或多个AE，且必要时召开特用DSMB会议以供进一步评估事件。
基于AE与试验疫苗的因果关系的有利风险比率及生物合理性的评估，DSMB将向试验委托者提出建议即按计划继续试验，修改试验的进行，或暂停试验以允许AE的进一步评估。若为后者，则试验委托者将与DSMB协商决定暂停研究。
有关DSMB角色和职责的额外论述，请参阅DSMB特许权。
6试验群体
将明确遵循登记的标准。若注意到不符合纳入标准中之一或多者及/或符合排除标准中的一或多者的个体被无意中登记及给药，则试验委托者必须立即接触。
在此试验中，具有病毒学证实的COVID-19疾病病史的个体将自试验排除。然而，此试验将不筛选或排除具有先前SARS-CoV-2感染的病史或实验室证据的个体。另外，在登记时在筛选时将不进行常规RT PCR测试以排除具有SARS CoV2感染的个体。另外，将遵守任何国家特定法规。
6.1所有个体的纳入标准
仅在个体符合所有以下标准时才将个体登记在此试验中：
1.18岁或以上的男性或女性个体。
2.在起始任何试验程序之前提供书面知情同意书。
3.经由最后计划的访视预期符合方案程序及临床追踪的可用性。
4.如下定义无生育潜力的女性：以手术方式绝育(两侧输卵管结扎、双侧卵巢切除术或子宫切除术病史)或绝经后{定义为筛选前(第1天)连续闭经≥12个月，无替代性医学病因}。促卵泡激素(FSH)水平可由研究人员酌情处理量测以证实绝经后状态。
5.能够生育的女性：在第1天及第29天各试验疫苗接种之前在24小时内呈阴性尿液妊娠测试结果{人类绒毛膜促性腺激素(hCG)}。
6.自第一次投予试验疫苗之前2周直至最后一次投予之后3个月，具有生育潜能的女性必须使用高度有效的生育控制方法。以下生育控制方法在一致且正确地使用时被视为高度有效的：
·与抑制排卵相关联的组合(含有雌激素及孕激素)激素避孕(经口、阴道内或经皮)；
·与抑制排卵相关联的仅孕激素激素避孕(经口、注射或植入)；
·子宫内装置(IUD)；
·子宫内激素释放系统(IUS)；
·两侧输卵管闭塞；
·切除输精管的配偶体或不育配偶体；
·禁欲{周期性禁欲(例如行事历、排卵、症状体温避孕法及交配后排卵方法)且戒断是不可接受的}。
6.2排除标准
若个体符合所有以下标准中的一者时，则不将其登记在此试验中：
1.病毒学证实的COVID-19疾病病史。
2.对于女性：怀孕或泌乳。
3.在投予第一次试验疫苗或计划试验期间使用之前28天内使用任何试验用或非注册产品(疫苗或药物)。
4.在投予第一次试验性疫苗之前28天内(对于活疫苗)或14天内(对于不活化疫苗)接受经授权的疫苗。
5.先前投予任何研究性SARS-CoV-2疫苗或另一种冠状病毒(SARS-CoV，MERS-CoV)疫苗或计划在试验期间使用。
6.在试验投予试验疫苗或在试验计划期间使用之前6个月内，经免疫抑制剂或其他免疫改性药物(包括(但不限于)皮质类固醇、生物制剂及氨甲蝶呤)任何治疗总共>14天。对于皮质类固醇使用，此意谓普赖松或等效物，0.5mg/kg/天，持续14天或以上。允许使用吸入、外用或局部注射皮质类固醇(例如用于关节痛/发炎)。
7.基于病史及体检的任何医学诊断或疑似免疫抑制或免疫缺乏病况，其包括已知的人类免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)感染；当前诊断或治疗的癌症，其包括白血病、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、多发性骨髓瘤或全身性恶性病；慢性肾衰竭或肾病症候群；及接受器官或骨髓移植。
8.血管性水肿(遗传或特发性)病史或任何过敏性反应或pIMD病史。
9.对CVnCoV疫苗的任何组分过敏的病史。
10.在投予投予试验疫苗或在试验期间计划接受之前3个月内已投予免疫球蛋白或任何血液产品。
11.患有显著急性或慢性医学或精神疾病的个体，在研究人员观点中该疾病将阻碍个体参与试验(例如可增加试验参与的风险、使得个体无法满足试验的需求或可能干扰个体提出诊断试验评估)。此等疾病包括重度及/或不受控制的心血管疾病、胃肠道疾病、肝病、肾病、呼吸道疾病、内分泌病症及神经及精神疾病。然而，试验中可包括具有受控及稳定情况的彼等者。
12.患有减弱的凝血或任何出血病症的个体，其中肌内注射或抽血为禁忌。
13.借由研究人员判断可预见的不符合试验程序的情况。
6.3疫苗延缓建议
在登记之后，个体可遭遇可保证如下文所描述的试验疫苗投予延缓的临床情形。
·在第1天或第29天预期试验疫苗接种3天内患有临床上显著(≥2级)活性感染或其他急性疾病(如由研究人员评估)或温度≥38.0℃(≥100.4℉)的个体。此包括可代表COVID-19病的症状。
ο试验疫苗接种应延缓至活性感染或其他急性疾病已恢复至≤1级或个体温度已降低至<38.0℃(<100.4℉)。在疾病消退之后，可基于研究人员的判断对个体重新安排用于试验疫苗接种。
ο具有轻微疾病的无发烧个体可由研究人员酌情处理进行疫苗接种。
·在试验疫苗的安排投予之前或之后28天内(对于活疫苗)或14天内(对于不活化疫苗)接受经授权的疫苗。由于此等为推荐的窗口，因此仅在切实可行的情况下才应重新安排试验疫苗接种以符合此等窗口。
6.4未能符合合格性标准
研究人员必须解释签署知情同意书的所有个体。若发现个体不符合条件(亦即，不符合所有纳入标准或符合一或多个排除标准)，则研究人员应在个体源文件中记录此情况。
7试验疫苗
7.1试验疫苗投予
7.1.1试验疫苗的描述
CVnCoV为研究性经LNP调配的
Figure GDA0003858923850003051
SARS-CoV-2疫苗。IMP由活性医药成分、编码Wsmpv-SP的mRNA及4个脂质组分构成：胆固醇、1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、PEG化脂质及阳离子脂质。其以1mg/mL mRNA药物物质的浓缩物形式供应。
安慰剂疫苗将为注射用无菌标准生理盐水(0.9％NaCl)。
7.1.2给药及投予
7.1.2.1 CVnCoV
随机分入CVnCoV的个体将以12μg mRNA的剂量水平接受CVnCoV的2次注射，相隔28天投予。
CVnCoV的投予必须在三角肌区，较佳在非显性臂中借由肌内(IM)注射来进行。CVnCoV严格意欲用于IM注射且不得皮下注射、皮内或静脉内注射。必须遵循如药房手册中所描述的注射说明。
7.1.2.2安慰剂对照组(标准生理盐水)
随机分入试验的对照组的个体将接受2剂盐水安慰剂{注射用标准生理盐水(0.9％NaCl)}，相隔28天投予。
盐水安慰剂的投予必须在三角肌区，较佳在非显性臂中借由IM注射来进行。必须遵循药房手册中所描述的注射说明。
7.1.2.3针对疫苗接种的超敏反应
CVnCoV不应向对疫苗的组分中的任一者具有已知超敏性的个体投予。
由于存在过敏性反应的理论风险，因此试验疫苗必须仅在易于获得用于治疗过敏性反应的紧急设备(静脉注射液、皮质类固醇、H1及H2阻断剂、肾上腺素、心肺复苏设备)时才可投予。在投予试验疫苗后，所有个体必须在接受过此等反应治疗培训的人员的直接监督下至少30分钟。
若在试验疫苗投予后发生过敏或超敏反应，则不应给予其他剂(参见章节5.5.1及8.1)。
7.2准备/处理/储存/课责
参考关于CVnCoV及生理盐水安慰剂的制备、处置、储存及盲法的详细资讯的药房手册。
7.2.1 CVnCoV制备
浓缩CVnCoV必须在所提供的含有防腐剂的无菌生理盐水(0.9％NaCl)稀释剂中稀释，产生用于IM注射的剂溶液。此将借由非盲合格的药师根据由CureVac AG提供的IMP的处理手册来制备。药师在疫苗接种之后将不具有其他试验职能且将维持治疗分配严格的可信度。
7.2.2 CVnCoV产品储存及稳定性
将浓缩CVnCoV运送至在低于-60℃下冷冻的位点。
一旦处于该位点，则浓缩CVnCoV应在低于-60℃下冷冻储存。
7.2.3安慰剂对照组(标准生理盐水)
标准生理盐水安慰剂对照组疫苗应根据产品特征的概述储存。
7.2.4课责
研究人员有责任确保根据适用规定及准则，使用适当形式维持在现场接收、储存及分配的试验供应的当前及精确记录。试验供应必须储存在建议储存条件下，上锁并禁止接近(参考指药房手册)。经授权人员必须在试验位点且根据方案及适用规定及指导原则分配疫苗。
IMP课责及库存日志必须在试验位点保持最新，其中资讯如下：
·自CureVac接收的CVnCoV的日期及数量。
·独特个体识别号。
·向各个体分配试验疫苗的日期及数量。
·准备剂的人员姓名缩写。
·投予疫苗的人员姓名缩写。
此等日志必须易于可供检查且在任何时间对监管检查开放。
7.3随机化及盲法
2b期及3期两者将经随机、观察者单盲、安慰剂对照。研究性CVnCoV疫苗及安慰剂的外观差异需要试验以观察者单盲的方式进行，其为盲法的公认方法。
7.3.1随机化
18岁或以上的个体将登记且将以1:1比率随机化以接受CVnCoV或安慰剂。随机化将按国家及年龄组(18至60岁及≥61岁)居中进行且分级。随机化方案将在PRA合同研究组织(CRO)处由独立统计组生成及维持。个体将在线登记至试验中，且使用交互式网路反应系统(IWRS)随机化。在将人口统计及合格准则输入系统中之后，将对登记至试验的各个体分配其治疗分配。
7.3.2盲法
个体将以观测者单盲的方式随机化且接种CVnCoV或安慰剂(归因于研究性CVnCoV疫苗及安慰剂的外观及呈现的差异)。位点处的药师将不会对向个体投予的试验疫苗的标识盲化。然而，疫苗接种者、研究人员及参与试验(包括安全性追踪及COVID-19病例确定)进行的所有位点人员将对试验疫苗及个体治疗分配盲化。为了维持疫苗接种者的盲法，药师将向注射器预填充有覆盖液体内容物的标签的疫苗接种剂提供试验疫苗的剂，使得其不可见。在CRO及试验委托者处直接涉及试验进行的所有人员亦将盲化。在CRO及试验委托者处将存在某些个体，其职务需要个体在试验期间非盲{例如用于药剂学中的试验疫苗课责的非盲监测；辅助DSMB的非盲独立统计学家；免疫原性数据审查(参见下一段)}。将鉴别此等非盲个体且记录其责任。
因为免疫原性结果将使个体的治疗分配无效，所以进行分析的独立实验室将使结果保持严格的可信度。在试验开始时命名且与试验进行无关的非盲人员将具有在其产生时审查免疫原性数据的质量的职责。此个人将使结果维持严格的可信度。为保持盲化，免疫原性数据将仅在试验非盲之后与临床数据库合并。
由DSMB成员酌情处理，在DSMB会议时回顾的安全性数据是否将为非盲的。若存在任何安全性问题，则DSMB可在任何时间请求个体的非盲或特定数据集。另外，DSMB将借由疫苗组定期监测VDE讯息的COVID-19病例。在期间分析时，DSMB将由疫苗组检查COVID-19病例的病例以获得功效或无效性，且将以盲化方式将结果传达至试验委托者。
在正在进行的试验CV-NCOV-004期间呈递文件以供监管机构批准(例如若在期间分析中证明功效)，将形成完全不依赖于进行试验的小组的非盲呈递小组。呈递小组将包含来自试验委托者及CRO的个人，且其对非盲小组的作用及责任将被清楚地定义。
7.3.3紧急非盲
当试验疫苗的知识对个体的临床管理或福利至关重要时，个体非盲应仅出于个体安全的原因在紧急情况下发生。在此情况下，非盲将基于研究人员的判断，理想地与试验委托者讨论。
一般而言，试验疫苗的标识不应影响任何SAE/AE的临床管理。无论何时可能，研究人员应在解盲之前试图联络试验委托者以论述对紧急非忙的需要。在同意之后，将经由IWRS进行编码破解。
当解盲时，日期、准确时序及原因必须充分记载于源文件中。研究人员不应告知其他盲法试验人员IMP的标识。
若编码已解开且不存在中断医学原因，则个体可继续试验。若个体已接受至少1剂的试验疫苗，则研究人员在与试验委托者协商时将判断个体能否接种第二剂。若个体中断试验，则应尽一切努力以继续个体的安全追踪，直至试验结束为止。
7.4疫苗顺应性
研究人员必须记录个体的eCRF页中投予的所有试验疫苗接种。
7.5误用及过度剂量
误用的定义：试验疫苗刻意地且不适当地使用，不符合方案剂量说明或经授权产品资讯的情况。
过度剂量的定义：根据方案给药说明或经授权的产品资讯投予一定量的每次投予或累积给出的试验疫苗，其高于最大建议剂量。
自当前临床及非临床经历来看，预期无毒性作用。可能的局部反应(疼痛)或全身性AE(发烧、头痛、疲劳、发冷、肌痛、关节痛、恶心/呕吐及腹泻)可用物理措施、扑热息痛或非类固醇消炎药治疗进行对症治疗。
7.6伴随疗法及疫苗
包括投予原因的伴随药品及疫苗必须记录在个体的eCRF中。
7.6.1试验期间准许的药品/疫苗
允许个体使用退热剂及其他止痛药来治疗个体可能患有的任何进行中的病况。退热剂(例如扑热息痛)或其他止痛药可用于治疗与试验疫苗接种相关的任何局部及/或全身性反应。在此试验中亦允许预防性服用扑热息痛用于潜在疫苗接种的相关反应。例如，若个体在第一次试验疫苗接种之后经历不良反应，则可针对用于第二次试验疫苗接种的此等反应预防性地服用扑热息痛。在此情况下，可在试验疫苗接种之后及在就寝时间且接着在第二天期间的上午及就寝时间服用扑热息痛(至多1公克剂量)。或者，可在试验疫苗接种之后每6小时服用500mg剂量的扑热息痛持续至多36小时。扑热息痛的剂量及给药排程应与研究人员论述。
作为用于疫苗接种相关反应或用于预防的治疗剂投予的扑热息痛以及关于试验疫苗接种的投予时序必须记录在eCRF中。
除章节6.2中所描述及下文章节7.6.2中列举的违禁药品及疫苗以外，允许治疗个体使用先前存在的医学病况所需的药物。
7.6.2试验期间禁止的药品/疫苗
·在试验期间禁止使用任何研究性或未注册产品(疫苗或药物)。
·在试验期间内，在试验疫苗投予28天内(对于活疫苗)或14天内(对于不活化疫苗)内不得投予核准的疫苗；
·在试验期间禁止接受任何其他研究性SARS-CoV-2疫苗或其他冠状病毒疫苗。
·在试验期间禁用使用免疫抑制剂或其他免疫改性药物(包括(但不限于)皮质类固醇、生物制剂及氨甲喋呤)的任何治疗。对于皮质类固醇使用，此意谓普赖松或等效物，0.5mg/kg/天，持续14天或以上。允许使用吸入、外用或局部注射皮质类固醇(例如用于关节痛/发炎)。
·在试验期间禁止免疫球蛋白或任何血液产品的投予。
7.7导致中断的疗法
若个体需要在章节6.2中列举为排除标准且无法延缓的疗法，则应考虑中断治疗，以确保在个体病例审查后试验数据的完整性。应尽一切努力继续个体的安全性追踪，直至试验结束。
7.8试验结束之后的治疗
将不提供试验后护理。
8中断/废止标准
试验中的参与为严格自发的。个体有权任何时间及任何原因自试验中退出。如果考虑到个体的最佳利益或由于方案偏差，研究人员有权从进一步的试验疫苗投予及/或试验中使个体退出。
对于由AE所致的中断，应尽一切努力以记录事件的结果。
将鼓励接受至少1剂的试验疫苗的个体继续参与，直至试验结束进行安全评定。
8.1试验疫苗投予的中断
中断进一步投予试验疫苗的主要原因将根据以下类别记录在个体的eCRF中：
·同意个体退出。
若提供，则退出的原因应记录在eCRF中。
注意：应尽一切努力确定退出的基础原因，且在可能的情况下，应记录主要基础原因(亦即由AE所致的退出不应记录于「自主退出」的类别中)。
·AE(包括试验疫苗的已知副作用)。
若中断由可能与试验疫苗或试验程序相关的AE所致，则个体必须根据研究人员的医学判断借由额外检查追踪，直至病状消退或研究人员认为不再需要医疗指示上的进一步观测或检查。
·个体整体医疗状况发生变化，禁止进一步参与。
·怀孕(参见章节9.3.5)
尽管需要充分避孕，但在试验期间怀孕的任何个体将不接受进一步试验疫苗剂。位点应维持与怀孕个体接触且尽可能快地完成「临床试验怀孕表」。另外，个体应追踪直至孩童出生，或自发或自愿终止。当怀孕结果资讯变得可用时，应使用相同形式捕获资讯。个体应报告为为IMP中断且应给出原因(亦即怀孕)。
·试验由试验委托者终止(在此情况下，将进行在第393天试验访视结束时进行的最小安全性追踪)。
·主要方案偏差。
·其他。
应注意：特定原因应记录在eCRF的指定「特定」区域中。
8.2来自试验的退出
若发生以下情形中的任一者，则应自试验退出个体：
·持续参与危及个体健康、安全性或权利。
·个体已经历AE，该AE需要早期终止，因为持续参与对个体健康施加不可接受的风险或个体由于AE不愿意继续。应记录不进行进一步安全性或免疫原性评估的原因。
·个体未返回至位点且多次尝试(最少3次尝试)联络个体失败(未能追踪)。
·个体希望自试验退出。若提供，则退出的原因应记录。
应尽一切努力确定退出的基础原因，且在可能的情况下，应记录主要基础原因(亦即由AE所致的退出不应记录于「自主退出」的类别中)。
过早终止参与且已接受至少一个试验疫苗剂的任何个体将经历与试验访视结束相同的程序，除非此类程序被视为对个体造成不可接受的风险。
将不替换中断或退出的个体。
8.3试验终止
试验委托者保留在任何时间终止试验的权利。试验终止的可能原因包括以下：
·期间分析的结果可能显示高VE或无效性。
·安全性原因：在此或任何其他试验中使用相关疫苗的AE的发病率指示个体的潜在健康风险。
·已知新科学知识使得试验目标不再可实行/有效。
·位点不大可能能够在同意时间范围内募集足够个体。
·位点不对试验管理请求作出反应。
·重复方案偏差。
·不安全及非伦理实践。
·投予决定。
在试验终止决定之后，研究人员必须在由试验委托者设定的时间段内接触所有个体。必须收集所有试验材料且尽可能完成相关资料。
试验亦可出于任何原因或若由DSMB建议，或在由独立伦理委员会或机构审查委员会(IEC/IRB)的位点水平上由管理机构终止。试验委托者可过早地关闭个别位点，原因为诸如方案顺应性不良或个体的募集不令人满意。
8.4未能追踪
应尽一切努力以接触未返回安排试验访视或无法出于安排电话呼叫而接触的个体。应进行最少3次尝试且记录。若个体在相关SAE或AE的消退之前未能追踪，则试验委托者可考虑进一步尝试接触个体以便收集追踪安全性资讯。
9试验评定及程序
试验评定及程序论述于此章节中。
对于无法到位点以进行方案指定的位点访视(例如，由与COVID-19相关的公共健康紧急情况所致)的个体，可使用替代方法(例如电话接触、虚拟访视、评估的替代地点)进行安全评定。
对于在大流行性情形下进行试验的进一步可挠性，将允许家庭访视进行安全性评定及程序，包括收集血液及任何生物样品。若位点访视、电话接触或样品收集无法在方案所定义的窗口内执行，则在此等独特情况下作为公共卫生紧急情况，在此等窗口之外执行此等任务将是可接受的。在大流行性情形下，提供用于位点访视及电话接触的方案所定义的窗口以用于指导，且若未严格遵守，则将不视为偏差。
电子日记(eDiary)将在试验期间用于安全相关资讯的高效收集。然而，在试验期间，一些个体可使用纸质日记取代。
将2个目标年龄组的初始个体登记为2b期为可挠的。视来自1期及2a期试验的数据时序而定，可将2个年龄组登记至2b期错开，初始开始为18至60岁的个体，随后为≥61岁的个体。由于年长的年龄组将包含2b期个体总数的20％至25％，预期此错开开始不影响2b期群组的总体登记。
9.1试验评定的时程及程序
借由对知情同意书进行签名，个体将同意参与试验CV-NCOV-004及其1年延伸研究，总共参与大约2.1年。
试验评定及程序适用于所有个体，独立于其在试验之前具有已知SARS CoV-2阳性血清学或独立于根据回溯性分析的基线下的血清学状态。
参与2b期的个体将被给予经口测量体温的温度计及测定局部注射位点反应的大小的量测卷尺。个体将受到指示如何在eDiary中每天输入征集到的AE，为期7天。
在进行试验及与个体相互作用期间，任何具有COVID-19的早期警告病征的个体应立即被转诊至紧急医疗护理。此等病征包括(但不限于)以下：呼吸困难、胸部中的持久疼痛或压力、新意识模糊、无法清醒或保持清醒，或嘴唇或面部发青。
9.1.1 2b期：免疫原性子组
2b期的免疫原性子组将包括进入2b期的登记至2个年龄组(18-60岁及≥61岁)中的每一者之前600名个体。因此，目标总登记将为大约1,200名个体。
9.1.1.1第1次临床访视：第1天-第一次试验疫苗接种
应注意，确定个体合格性、人口统计资讯及病史的记录的程序可在试验疫苗投予之前21天内进行，亦即扩散超过1天。然而，若所有资讯均为可用的且可进行评定及程序，则可在试验疫苗投予的同一天确定合格性。必须在第1天在试验疫苗投予之前审查所有合格性标准。
疫苗接种前程序
·获得经签名的知情同意书。
-在个体进入试验之前及在进行任何方案导向程序之前，必须获得经签名的知情同意书。
-借由对知情同意书进行签名，个体自愿同意参与HERALD试验CV-NCOV-004及其1年延伸研究，总共大约2年。
·审查纳入/排除标准(参见章节6.1及6.2)及审查列举为排除标准的违禁药品(参见章节6.2)。
·记录人口统计资讯。
·记录病史。
·若在此试验登记之前6个月内服用，则记录伴随药品及疫苗接种，包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。若在试验疫苗投予之前21天内进行确定合格性的完整体检，则应在试验疫苗投予之前的疫苗接种当天进行症状导向的体检。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压；参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试。
·收集对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)；SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)；及对SARS CoV 2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。
·在所选位点收集来自个体的基因体生物标记(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。
·在所选位点收集来自个体的CMI(约32mL血液)的疫苗接种前血液样品。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体的图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压；参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何AE的出现。
·个体的说明：
-指示个体如何量测征集到的AE及如何完成eDiary。个体应记录在疫苗接种当天及疫苗接种后7天出现的征集到的局部及全身性AE，及在疫苗接种当天及之后28天出现的非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
注意：出于若干原因，可能已测试无症状的个体，例如，与已知的SARS-CoV-2感染者密切接触，或者作为他们作为医疗保健提供者例行筛选的一部分。
9.1.1.2电话呼叫：第2天(-0/+0天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及在第一次试验疫苗接种之后1天评估安全性。
·在电话呼叫期间：
-审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
-记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
-若个体报告任何关于局部或全身性反应或其他AE(例如医疗介入的AE、SAE)，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-提醒个体继续在eDiary中记录征集到的及非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.3第2次临床访视：第29天-第二次试验疫苗接种(-3/+7天)
疫苗接种前程序
·审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试。
·收集对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)及SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。在此时间点未对SARS-CoV-2的N蛋白进行抗体测试。
·在所选位点收集来自个体的基因体生物标记(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。
·在所选位点收集来自个体的CMI(约32mL血液)的疫苗接种前血液样品。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体的图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压；参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何AE的出现。
·个体的说明：
-重新指示个体如何量测征集到的AE及如何完成eDiary。个体应记录在疫苗接种当天及疫苗接种后7天出现的征集到的局部及全身性AE，及在疫苗接种当天及之后28天出现的非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状((COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.4电话呼叫：第30天(-0/+0天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及在第二次试验疫苗接种之后1天评估安全性。
评定及程序与在第2天电话呼叫期间所进行的彼等相同。
9.1.1.5第3次临床访视：第43天(-3/+3天)
·审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)；SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)；及对SARS-CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
·在所选位点收集来自个体的基因体生物标记(约6mL血液)的血液样品。
·在所选位点收集来自个体的CMI(约32mL血液)的血液样品。
·个体的说明：
-告知个体在eDiary中征集到的局部及全身性反应的记录是完整的。提醒个体继续记录非征集到的AE(所有AE)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.6第4次临床访视：第57天(-3/+7天)
·审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括非征集到的AE或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)及SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)的免疫原性估计的血液样品。(在此时间点未对SARS CoV 2的N蛋白进行抗体测试)。
·个体的说明：
-告知个体非征集到的AE的报告是完整的。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.7第5次临床访视：第120天(-7/+7天)
·自在第57天的位点访视起，审查及记录任何新报告的AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)及SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)的血液样品。(在此时间点未对SARS CoV 2的N蛋白进行抗体测试)。
·在所选位点收集来自个体的基因体生物标记(约6mL血液)的血液样品。
·在所选位点收集来自个体的CMI(约32mL血液)的血液样品。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.8第6次临床访视：第211天(-7/+7天)
所述评定及程序与在第120天第5次临床访视期间所进行的彼等相同，惟下文除外。
·收集对SARS CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)；SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)；及对SARS-CoV-2的N(核蛋白壳)蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
·在所选位点收集来自个体的基因体生物标记(约6mL血液)的血液样品。
9.1.1.9电话呼叫：第302天(-7/+7天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及自第211天的位点访视后评估安全性。
·在电话呼叫期间：
ο自第211天的位点访视(SAE)起，审查及记录任何新报告的AE。
ο记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
ο若个体借由电话报告任何关于AE，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.1.10试验访视结束：第393天(-0/+21天)
试验访视结束将在最后一次试验疫苗投予的1年后第393天进行。若可能，则此访视应包括在试验期间过早中断疫苗接种的个体。应进行以下评定：
·自第302天的电话连络(SAE)起，审查及记录任何新报告的AE。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体测试(约6mL血液)；SARS-CoV-2病毒中和活性(约6mL血液)；及对SARS-CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
告知个体其已完成试验的主要部分，试验的延伸部分现将开始(参见章节9.1.4)。
9.1.2 2b期：非免疫原性个体
在将个体登记至2b期免疫原性子组(n＝1,200)后，其余2,800名个体，18岁及以上，将被登记为2b期。
9.1.2.1第1次临床访视：第1天-第一次试验疫苗接种
应注意，确定个体合格性、人口统计资讯及病史的记录的程序可在试验疫苗投予之前21天内进行，亦即扩散超过1天。然而，若所有资讯均为可用的且可进行评定及程序，则可在试验疫苗投予的同一天确定合格性。必须在第1天在试验疫苗投予之前审查所有合格性标准。
疫苗接种前程序
·获得经签名的知情同意书。
-在个体进入试验之前及在进行任何方案导向程序之前，必须获得经签名的知情同意书(参见章节12.4)。
-借由对知情同意书进行签名，个体自愿同意参与HERALD试验CV-NCOV-004及其1年延伸研究，总共大约2年。
·审查纳入/排除标准(参见章节6.1及6.2)及审查列举为排除标准的违禁药品(参见章节6.2)。
·记录人口统计资讯。
·记录病史。
·若在此试验登记之前6个月内服用，则记录伴随药品及疫苗接种，包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。若在试验疫苗投予之前21天内进行确定合格性的完整体检，则应在试验疫苗投予之前的疫苗接种当天进行症状导向的体检。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试。
·收集对SARS-CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何AE的出现。
·个体的说明：
-指示个体如何量测征集到的AE及如何完成eDiary。个体应记录在疫苗接种当天及疫苗接种后7天出现的征集到的局部及全身性AE，及在疫苗接种当天及之后28天出现的非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
注意：出于若干原因，可能已测试无症状的个体，例如，与已知的SARS-CoV-2感染者密切接触，或者作为他们作为医疗保健提供者例行筛选的一部分。
9.1.2.2电话呼叫：第2天(-0/+0天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及在第一次试验疫苗接种之后1天评估安全性。
·在电话呼叫期间：
-审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
-记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
-若个体报告任何关于局部或全身性反应或其他AE(例如医疗介入的AE、SAE)，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-提醒个体继续在eDiary中记录征集到的及非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.3第2次临床访视：第29天-第二次试验疫苗接种(-3/+7天)
疫苗接种前程序
·审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何AE的出现。
·个体的说明：
-重新指示个体如何量测征集到的AE及如何完成eDiary。个体应记录在疫苗接种当天及疫苗接种后7天出现的征集到的局部及全身性AE，及在疫苗接种当天及之后28天出现的非征集到的AE(亦即所有其他AE的出现)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.4电话呼叫：第30天(0/+0天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及在第二次试验疫苗接种之后1天评估安全性。
评定及程序与在第2天电话呼叫期间所进行的彼等相同。
9.1.2.5第3次临床访视：第43天(-3/+3天)
·审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括征集到的及非征集到的AE，或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS-CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
·个体的说明：
-告知个体在eDiary中征集到的局部及全身性反应的记录是完整的。提醒个体继续记录非征集到的AE(所有AE)。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.6电话呼叫：第57天(-3/+7)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及自第43天的位点访视后评估安全性。
·在电话呼叫期间：
-审查及记录任何新报告的安全性数据，其包括非征集到的AE或其他AE(医疗介入的AE、SAE)。
-记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
-若个体报告任何关于局部或全身性反应或其他AE(例如医疗介入的AE、SAE)，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-告知个体非征集到的AE的报告是完整的。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.7第4次临床访视：第120天(-7/+7)
·自在第57天的电话呼叫起，审查及记录任何新报告的AE(医疗介入的AE、SAE)。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.8第5次临床访视：第211天(-7/+7)
所述评定及程序与在第120天第4次临床访视期间所进行的彼等相同，惟下文除外。
·收集对SARS CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
9.1.2.9电话呼叫：第302天(-7/+7)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及自第211天的位点访视后评估安全性。
·在电话呼叫期间：
ο自第211天的位点访视(SAE)起，审查及记录任何新报告的AE。
ο记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
ο若个体借由电话报告任何关于AE，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.2.10试验临床访视结束：第393天(-0/+21天)
试验访视结束将在最后一次试验疫苗投予的1年后第393天进行。若可能，则此访视应包括在试验期间过早中断疫苗接种的个体。应进行以下评定：
·自第302天的电话连络(SAE)起，审查及记录任何新报告的AE。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
告知个体其已完成试验的主要部分，试验的延伸部分现将开始(参见章节9.1.4)。
9.1.3 3期个体
大约32,500名个体，18岁及以上，将登记至3期。
9.1.3.1第1次临床访视：第1天-第一次试验疫苗接种
应注意，确定个体合格性、人口统计资讯及病史的记录的程序可在试验疫苗投予之前21天内进行，亦即扩散超过1天。然而，若所有资讯均为可用的且可进行评定及程序，则可在试验疫苗投予的同一天确定合格性。必须在第1天在试验疫苗投予之前审查所有合格性标准。
疫苗接种前程序
·获得经签名的知情同意书。
-在个体进入试验之前及在进行任何方案导向程序之前，必须获得经签名的知情同意书(参见章节12.4)。
-借由对知情同意书进行签名，个体自愿同意参与HERALD试验CV-NCOV-004及其1年延伸研究，总共大约2年。
·审查纳入/排除标准(参见章节6.1及6.2)及审查列举为排除标准的违禁药品(参见章节6.2)。
·记录人口统计资讯。
·记录病史。
·若在此试验登记之前6个月内服用，则记录伴随药品及疫苗接种，包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。若在试验疫苗投予之前21天内进行确定合格性的完整体检，则应在试验疫苗投予之前的疫苗接种当天进行症状导向的体检。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试
·收集对SARS-CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的疫苗接种前血液样品。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何新AE的发生。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
注意：出于若干原因，可能已测试无症状的个体，例如，与已知的SARS-CoV-2感染者密切接触，或者作为他们作为医疗保健提供者例行筛选的一部分。
9.1.3.2第2次临床访视：第29天-第二次试验疫苗接种(-3/+7天)
疫苗接种前程序
·审查及记录任何新收集的安全性数据，其包括医疗介入的AE及SAE。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·对具有生育潜力的女性进行尿液验孕测试。
疫苗接种程序
·延缓或取消疫苗接种的审查标准。关于引起延缓或消除疫苗投予的标准概述，参见章节6.3及8.1。在延缓的情况下，疫苗接种应发生在所允许的时间窗口内。延缓或取消的原因应记录于个体图表中。
·根据个体的分配投予试验疫苗剂。
疫苗接种后程序
·在疫苗接种之后，在位点观察个体至少30分钟以进行安全性监测。在观察周期结束时：
-量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
-在生命体征在正常范围内或恢复到疫苗接种前水平之前，个体不可出院。
-在试验疫苗接种后记录任何新AE的发生。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.3.3第3次临床访视：第43天(-3/+3天)
·审查及记录任何新收集的安全性数据，其包括医疗介入的AE及SAE。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·进行症状导向的体检(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历关于局部或全身性反应的任何事件或其他医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.3.4电话呼叫：第57天(-3/+7天)及第120天(-7/+7天)
此等电话接触的目的为询问个体的总体健康及自最后一次电话连络或位点访视后评估安全性。
·在电话呼叫期间：
-自在位点访视或电话呼叫起，审查及记录任何新报告的AE(医疗AE、SAE)。
-记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
-若个体借由电话报告任何关于AE，则此等AE应基于研究人员的判断借由电话呼叫或借由不定期位点访视来追踪。
·个体的说明：
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯(参见章节9.2.1及章节9.5)。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.1.3.5第4次临床访视：第211天(-7/+7天)
评定及程序与在第43天临床访视期间所进行的彼等相同。
9.1.3.6电话呼叫：第302天(-7/+7天)
此电话接触的目的为询问个体的总体健康及自第211天的最后一次位点访视后评估安全性。
评定及程序与在第57天及第120天电话呼叫期间所进行的彼等相同。
9.1.3.7试验临床访视结束：第393天(-0/+21天)
试验访视结束将在最后一次试验疫苗投予的1年后第393天进行。若可能，则此访视应包括在试验期间过早中断疫苗接种的个体。应进行以下评定：
·自第302天的电话连络(SAE)起，审查及记录任何新报告的AE。
·记录伴随药品及疫苗接种，其包括用于间歇性病况的复发药品。
·执行完整体检，包括高度及重量(参见章节9.3.7)。
·量测生命体征(体温、脉搏、血压，参见章节9.3.7)。
·收集对SARS CoV-2的N蛋白的结合抗体测试(约6mL血液)的血液样品。
告知个体其已完成试验的主要部分，试验的延伸部分现将开始(参见章节9.1.4)。
9.1.4延伸研究(长达1年持续时间)
·所有个体的通用说明：
-告知个体延伸研究将在主要试验的最后一天(第393天)开始。说明试验持续时间计划为1年，但若CVnCoV符合监管部门的批准，且安慰剂组的个体可以疫苗接种CVnCoV，则试验可能提前终止。若局部部署另一有效疫苗，则试验亦可较早终止。
·参与免疫原性子组的2b期个体的说明：
-告知个体将进行以下评定及程序：
ο每3个月(第484天、第575天、第665天及第757天)返回位点采集血液样品，以评估SARS-CoV-2的S蛋白的RBD的结合抗体及SARS-CoV-2病毒中和抗体的长期持久性。
οCOVID-19病例侦测以评估长期功效。
ο收集AEO及SAE以评估长期安全性。
·2b期非免疫原性个体及3期个体的说明。
-告知个体将进行以下评定及程序：
ο每3个月(第484天、第575天、第665天及第757天)电话接触以确保采集AESI及SAE以评估长期安全性。
οCOVID-19病例侦测以评估长期功效。
-提醒个体立即联络位点报告以下情况：
ο比如他/她经历任何关于医疗事件。
ο任何不是体检或疫苗接种的非常规访视的医疗介入的访视，诸如住院访视、急诊室访视或出于任何原因自医疗人员(医疗医生)进行另外的不定期访视。
ο经历严重医疗事件、整体健康状况发生变化或被医生诊断为新医学病况。此等应报告，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
-若个体(他/她)具有暗示COVID-19的任何症状，则要求个体立即接触位点。另外，个体将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。将借由试验人员联络「肯定」回应的彼等者以供追踪资讯。
-若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS-CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID-19疾病)或无症状)，则亦应提醒该个体立即接触位点。
9.2功效评定
9.2.1 COVID-19病例
COVID-19病例的确定将以相同方式在试验的2b期及3期部分中进行。病例侦测将以鉴别报告来自与COVID 19疾病一致的症状标准化清单的至少1个症状的个体开始。基于试验工作人员的电话访问，怀疑患有COVID-19疾病的个体将经历针对SARS-CoV-2感染的测试，其由试验工作人员局部进行的快速抗原测试及指定中央实验室处进行的基于分子的RT-PCR测试组成。测试策略描述于章节9.5中。若个体经证实患有COVID-19，则将追踪个体直至其疾病消退，即使初始呈现为轻度。若个体住院，则个体进展必须由研究人员进行追踪且在住院结束时获得医疗/出院汇总。
9.2.1.1病例侦测
9.2.1.1.1针对COVID-19的常规监督
在所有位点访视及电话呼叫期间，若个体具有以下症状*中的任一者，则将提醒个体接触位点：
ο发烧或发冷；呼吸短促或呼吸困难；味觉或嗅觉的新丧失；咳嗽；疲劳；肌肉或身体疼痛；头痛；咽喉痛；鼻塞或流鼻涕；恶心或呕吐；腹泻
*FDA预防COVID-19的疫苗研发及许可指南(美国卫生及公共服务部。美国食品药物管理局(FDA)。行业指南。预防COVID-19的疫苗研发及许可指南。2020年于万维网fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/development-and-licensure-vaccines-prevent-covid-19；访问日期：2020年10月，以引用的方式并入本文中)。
个体亦将每周最多会收到两次讯息，以对具有COVID-19症状做出肯定或否定的反应。对于两个试验疫苗接种，讯息将在疫苗接种之后4天才开始，以避免混淆在此时间段期间发生的疫苗相关反应(例如发烧、发冷、头痛、疲劳、肌痛)以及潜在COVID-19症状。
将借由试验人员联络位点访视时或借由电话呼叫报告症状或借由讯息对具有症状做出「肯定」回应的彼等者以供追踪手机访问。试验人员将使用脚本式访问(其中他/她已接受过相关培训)以收集关于个体的医学病况的资讯，其将用于确定个体患有COVID-19的机率。若怀疑个体患有COVID-19疾病，则他/她将进行针对SARS-CoV-2感染的测试(参见下一章节)。若怀疑较低，则将进行后续电话呼叫以评估个体的疾病及症状是否已发展且若COVID-19的怀疑已达到足以测试个体的水平。基于临床判断，电话接触可如每天频繁进行。所有症状性个体将提供温度计及血氧饱和浓度监测器以用于家庭使用。试验工作人员将指导个体每天进行至少3至4次其口腔体温及血氧饱和浓度水平，或其每当感觉有症状时便量测。
SARS-CoV-2感染的测试策略呈现于章节9.5中。测试将由2种测试组成：试验工作人员局部进行的快速抗原测试及指定中央实验室处进行的基于分子的RT-PCR测试。视研究人员及其他/她的设施及试验人员而定，将在位点或在家庭访视时收集用于测试的鼻咽拭子样品。试验工作人员对位点或家庭访视的访视将视为「疾病访视」且记录在eCRF中。
若个体借由阳性RT-PCR测试经病毒学证实的患有COVID-19，则将追踪个体直至其疾病消退，即使初始呈现为轻度。若个体住院，则个体进展必须由研究人员进行追踪且在住院结束时必须获得出院汇总。关于临床症状及征象、其持续时间及严重程度以及COVID-19发作的治疗及结果的资讯将由试验工作人员记录且记录在eCRF中。
在消退时，个体将继续以与尚未呈现COVID-19的彼等方式相同的方式跟踪(亦即其将返回至常规病例监督)。患有先前疾病的个体中COVID-19的第二次发作将不视为主要功效病例，但将包括于评估COVID-19在经疫苗接种的个体中第二次发作的探索性目标。
若个体未借由RT-PCR测试经病毒学证实，则其将作为SARS-CoV-2感染(除非以其他方式借由对N蛋白的血清反应阳性测试测定)的未经感染的个体返回至COVID-19疾病的常规监督。
9.2.1.1.2针对COVID-19的非常规监督(超出位点外的阳性测试)
若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID 19疾病)或无症状)，则将提醒该个体立即接触位点。
若个体有症状，则试验工作人员将使用脚本式访问以收集关于个体COVID-19症状及医学病况的资讯。应尽快对个体进行再测试以确认结果。鼻咽拭子样品应递送至试验委托者特指的中心实验室进行RT-PCR测试；RT-PCR测试结果将视为决定COVID-19的经病毒学证实的病例。若个体经证实患有COVID-19，则将追踪个体直至其疾病消退，如上文针对借由常规监督侦测的个体所描述。
若个体未借由RT-PCR测试经病毒学证实，则其将作为SARS-CoV-2感染(除非以其他方式借由对N蛋白的血清反应阳性测试测定)的未经感染的个体返回至COVID-19疾病的常规监督。
9.2.1.2病毒学证实的COVID-19病例的定义
经病毒学证实的COVIDV-19病例定义为患有临床上症状性疾病的个人的阳性SARS-CoV-2专一性RT-PCR测试结果，该临床上症状性疾病由1种或多于1种以下症状组成(基于如上文的相同筛选症状)：
ο发烧或发冷；呼吸短促或呼吸困难；味觉或嗅觉的新丧失；咳嗽；疲劳；肌肉或身体疼痛；头痛；咽喉痛；鼻塞或流鼻涕；恶心或呕吐；腹泻
此定义意欲捕获所有严重程度的经病毒学证实的临床上症状性COVID-19病例。因此，借由严重程度(例如轻度或重度)分类的COVID-19病例将为此等病例的子集。
9.2.1.3协同主要功效分析的COVID-19病例定义
对于主要功效分析，病例必须符合以下标准：
·必须为病毒学证实的COVID-19病例，其定义为在患有临床上症状性COVID-19的个体中呈阳性SARS CoV 2专一性RT-PCR测试结果，如上文在章节9.2.1.2中所定义。
ο对于主要功效分析，COVID-19病例将归类为「任何严重程度」或「中度至重度」严重程度。
·症状发作必须在第二次试验疫苗接种之后≥第15天出现。
·个体在登记时必须不具有病毒学证实的COVID-19疾病病史或在第二次试验疫苗接种之后15天之前已产生病毒学证实的COVID-19的病例(对于更多细节的功效分析集(EAS)参见章节10.2.3)。
·个体必须在基线及第43天为SARS-CoV-2未经感染个体(定义为在基线及第43天收集的血液样品中对N蛋白呈血清反应阴性)。
主要功效病例必须借由裁定委员会证实。
第43天为在第二剂后14天，其使得对CVnCoV的免疫反应成熟且在第二剂后达到其高度。因而，在次日≥15天开始的确定COVID-19病例表示对CVnCoV相对于COVID-19疾病的完全VE的评估。
9.2.1.4 COVID-19病例的裁定
将形成临床医师的独立委员会以裁定COVID-19病例。委员会将对个体的治疗分配盲化。所述病例将由成员关于与试验指标一致的以下问题来裁定。
·该病例是否定义为经病毒学证实的COVIDV-19病例，其患有临床上症状性COVID-19的个人的阳性SARS-CoV-2专一性RT-PCR测试结果，该临床上症状性COVID-19具有1种或多于1种上文章节9.2.1.2中所列的症状。
οRT-PCR检测是否在CureVac指定的中心实验室进行？
·在第二次疫苗接种后，该病例的症状发作时间是否≥15天？还是在第二次试验疫苗接种后15天之前发生的？
·个体在基线及第43天时对SARS-CoV-2为未经感染或为经感染的个体？(定义为对SARS-CoV-2N蛋白呈血清反应阴性或血清反应阳性)。
·个体是否为18至60岁或≥61岁？
·个体是否无症状？若无征状，则第二次疫苗接种之后≥15天或之前的RT-PCR测试为阳性吗？
·基于所提供的临床定义，其为轻度或为重度COVID-19病例？
·个体是否需要补充氧合？个体接受了何种类型的氧气支援？
·个体是否住院？个体进入重症监护病房了吗？
·个体是否死亡？其为由COVID-19所致或由其他原因所致？
9.2.2 SARS-CoV-2感染的无症状病例
在此试验中将不存在对无症状SARS-CoV-2感染的主动监督。若个体(他/她)具有超出位点外进行的阳性SARS CoV-2测试结果(无论其在测试时为有症状(COVID 19疾病)或无症状)，则将提醒该个体立即接触位点。出于若干原因，可能已测试无症状的个体，例如，与已知的SARS-CoV-2感染者密切接触，或者作为他们作为医疗保健提供者例行筛选的一部分。
若个体无症状，则试验工作人员将接触个体以立刻收集关于阳性SARS-CoV-2测试个体所报告的关于待收集的资讯。应尽快对个体进行再测试以确认结果。鼻咽拭子样品应递送至试验委托者特指的中心实验室进行RT-PCR测试；RT-PCR测试结果将视为决定SARS-CoV-2感染的经病毒学证实的病例。
若确认个体患有SARS-CoV-2感染，则试验工作人员将对个体追踪至少2周以便发展出任何COVID-19症状，以确保此为无症状感染。若个体罹患COVID-19，则他/她将被追踪为COVID-19病例。若个体确认无症状，则将由试验工作人员收集资讯且记录在适当eCRF页上。
若个体未借由RT-PCR测试经病毒学证实，则其将作为SARS-CoV-2感染(除非以其他方式借由对N蛋白的血清反应阳性测试测定)的未经感染的个体返回至COVID-19疾病的常规监督。
9.3安全性评定
将如下文所描述评估CVnCoV的2剂方案的安全性、反应原性及耐受性。
9.3.1 2b期个体专一性的安全性评定
·将在各疫苗接种日及之后7天借由使用日记收集征集到的局部AE(注射位点疼痛、发红、肿胀及瘙痒)及全身性AE(发烧、头痛、疲劳、发冷、肌痛、关节痛、恶心/呕吐及腹泻)以每日评定反应原性。另外，将收集安全性的其他指标(例如体温)。
·eDiary亦将用作用于在各疫苗接种日及之后28天收集非征集到的AE的个体的记忆辅助。
9.3.2 2b期及3期所有个体的安全性评定
·医疗介入的AE将在第二次试验疫苗接种之后6个月内收集。
·AESI将在第二次试验疫苗接种之后1年内收集。待监测的AEO包括pIMD、针对SARS-CoV-2疫苗的AESI及可影响对疫苗接种的免疫反应的非严重间发的医学病况。
·SAE将在第二次试验疫苗接种之后1年内收集。
·导致疫苗废止或试验中断的AE将在第二次试验疫苗接种之后1年内收集。
{若个体未接受其第二次试验疫苗接种，则将基于安排在第29天第二次疫苗接种的日期测定AE追踪时间(6个月或1年)}。
·eDiary亦将用作用于收集医疗AE、AESI及SAE的个体的记忆辅助。
9.3.3 1年延伸研究中个体的安全性评定
·AESI及SAE在延伸研究中将收集额外至多1年。
·eDiary亦将用作用于收集AESI及SAE的个体的记忆辅助。
9.3.4不良事件
AE/SAE的定义、用于记录、评估、追踪及报告AE/SAE/怀孕/过度剂量的程序以及AE的强度及因果关系的评估。
值得注意的是COVID-19疾病及其并发症/后遗症与试验的功效指标一致且因此不应记录为AE。此等数据将在相关eCRF页上捕获用于试验中进行的COVID-19疾病的病例，其为试验的预期结果。因此，COVID-19疾病及其并发症/后遗症不会根据SAEs的标准快速程序报告，即使该事件可能符合SAE的标准。
9.3.4.1征集到的不良事件
eDiary将分配至2b期中的所有个体以将在各疫苗接种日及之后7天收集征集到的局部AE(注射位点疼痛、发红、肿胀及瘙痒)及全身性AE(发烧、头痛、疲劳、发冷、肌痛、关节痛、恶心/呕吐及腹泻)。个体将被给予经口测量体温的温度计及测定局部注射位点反应的大小的量测卷尺。个体将受到指示如何在eDiary中每天输入征集到的AE，为期7天。
征集到的AE将按不存在、轻度、中度及重度的强度量表(以上表A及表B)评估。按照定义，认为所有局部征集到的AE均与试验疫苗接种有关。对于征集到的全身性AE，研究人员将评估试验疫苗与各AE的发生之间的关系且评估各AE的强度(表B)。
若关于个体或持续时间延长，则应即刻将征集到的3级AE向研究人员报告。在3级征集到的AE在eDiary报告超过1天的情况下，将对个体进行询问以尽可能精确地确定AE的总持续时间。
9.3.4.2非征集到的不良事件及严重不良事件
2个试验疫苗接种中的每一者的在疫苗接种日及之后28天发生的非征集到的AE将由2b期个体记录。
对于2b期及3期中的所有个体，医疗介入的AE将在第二次试验疫苗接种之后6个月内收集。AESI将在第二次试验疫苗接种之后1年内收集(参见章节9.3.4.3)。SAE将在第二次试验疫苗接种之后1年内收集。在延伸研究中，AESI及SAE将继续收集额外1年。
医疗介入的AE定义为具有医疗介入的访视的AE，其并非体检或疫苗接种的常规访视，诸如住院的访视、急诊室访视或出于任何原因向医疗人员(医疗医生)或自医疗人员(医疗医生)以其他方式不定期访视。
AE(严重及非严重)的出现将借由在每次访问时个体的非导向询问来评定。在访视期间或在访视之间作为eDiary项目自愿或经由观测、体检、实验室测试或整个试验期间的其他评定侦测的AE将记录在eCRF中。应指示个体立即向研究人员或位点人员报告具有严重症状、主观不适或客观变化的任何AE，无关于事件与试验疫苗之间的感知关系。
研究人员将评定试验疫苗与各AE/SAE的发生之间的关系。
亦将在整个试验中收集可能影响对疫苗接种的免疫反应的非严重间发的医学病况。
9.3.4.3特别受关注的不良事件
AESI将在第二次试验疫苗接种之后1年内在HERALD试验CV NCOV 004中收集且在延伸研究中额外收集至多1年。以下事件将在此试验期间视为AESI：
·具有潜在免疫介导的疾病(pIMD)的疑似免疫介导病因学的AE，如上文所定义。
乳糜泻；克罗恩氏病溃疡性结肠炎；溃疡性直肠炎；自体免疫胆管炎；自体免疫肝炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；艾迪森氏病；自体免疫甲状腺炎(包括桥本氏甲状腺炎第I型糖尿病；格雷弗氏或巴塞多氏病；抗合成酶症候群；皮肌炎；青少年慢性关节炎(包含斯蒂尔氏病)；混合性结缔组织病症；多发性肌痛风湿病；多发性肌炎；牛皮癣性关节病；复发性多发性软骨炎；类风湿性关节炎；硬皮病(例如包括弥漫性全身型及CREST症候群)；脊椎关节炎(例如包括僵直性脊椎炎、反应性关节炎(莱特尔氏症候群)及未分化型脊椎关节炎；全身性红斑狼疮；全身性硬化症；急性弥漫性脑脊髓炎(包括位点专一性变异体(例如非传染性脑炎、脑脊髓炎、脊髓炎、脊髓脊神经根性脊髓炎))；脑神经病症(例如包括麻痹/轻瘫(例如伯耳氏瘫)；格林-巴利症候群(例如包括米勒费雪症候群及其他变异体)；免疫介导性周围神经病变、帕森吉特纳症候群及丛神经病变(例如包括慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病、多灶性运动神经病及与单株伽玛球蛋白症相关的多发性神经病)；多发性硬化症；发作性睡病；视神经炎；横贯性脊髓炎；斑秃；自体免疫大疱性皮肤病，其包括天疱疮、类天疱疮及疱疹样皮炎；皮肤型红斑狼疮；结节性红斑；硬斑病；扁平苔癣；牛皮癣；斯威特氏症候群；白斑病；大型血管脉炎(例如包括：巨细胞动脉炎诸如高安氏动脉炎及颞动脉炎)；中型及/或小型血管炎(例如包括：结节性多动脉炎、川崎氏病、显微多血管炎、韦格纳氏肉芽肿病、查格-施特劳斯症候群(过敏性肉芽肿性血管炎)、伯格氏病(血栓闭塞性脉管炎)、坏死性血管炎及抗嗜中性白血球细胞质抗体(ANCA)阳性血管炎(非特定型)、亨-舍二氏紫癜、白塞氏症候群、白血球破裂性血管炎)；抗磷脂质症候群；自体免疫溶血性贫血；自体免疫肾丝球肾炎(包括IgA肾病、急进性肾丝球肾炎、膜性肾丝球肾炎、膜增生性及系膜增生性肾丝球肾炎)；自体免疫心肌炎/心肌病；自体免疫性血小板减少症；古巴士德氏症候群；特发性肺纤维化；恶性贫血；雷诺氏现象；类肉瘤病；休格伦氏症候群；史蒂芬斯-强森症候群；葡萄膜炎)。
·与SARS-CoV-2疫苗发展相关的其他AE或目标疾病包括：
重度过敏；血管炎；免疫后增强的疾病；儿童多系统发炎性症候群；急性呼吸窘迫症候群；COVID-19疾病；急性心脏损伤；微血管病；心力衰竭及心因性休克；压力型心肌病变；冠状动脉疾病；心律不整；心肌炎；心包炎；血小板减少症；深层静脉栓塞；肺栓塞；脑血管中风；肢体缺血症；血友病；急性肾损伤；肝损伤；全身性痉挛；格林-巴利症候群；急性弥漫性脑脊髓炎；嗅觉丧失症；味觉丧失症；脑膜脑炎；冻疮类病灶；单器官皮肤血管炎；多形性红斑；免疫后严重局部/全身性AR。
·亦将在整个试验中收集可能影响对疫苗接种的免疫反应的非严重间发的医学病况。
9.3.5怀孕
怀孕为此试验中入选的排除标准，但个体可能在其参与此试验期间怀孕。
9.3.6安全性实验室评定
用于怀孕测试的尿液样品将获自在试验疫苗接种之前第1天具有生育潜力的女性以确定合格性。亦将在第29天第二次试验疫苗接种之前进行尿液怀孕测试以继续确定合格性。
9.3.7生命体征及体检
在对于2b期及3期的所有试验访视时，以标准化方式记录个体以坐立位置休息5分钟后的生命体征(体温、收缩/舒张血压及脉博)。
在第1天第一次试验访视时及在第393天试验结束访视时，对于HERALD试验CVNCOV-004中的所有个体，将进行完整体检，其包括检查整体外观、眼/耳/鼻/咽喉、头部/颈部/甲状腺、淋巴结区域、心脏血管系统、肺/胸部、腹部及泌尿生殖系统、四肢及神经检查、皮肤检查、体重及身高量测。在所有其他试验访视时，将进行症状导向的体检。
9.3.8医疗及手术史
登记前受试者的所有重要发现和先前存在的条件必须在eCRF的相关病史/当前医学病况筛选上报告。
应在医疗及手术史以及指定在第1天正进行的彼等医学病况上提供资讯。
9.3.9监测委员会
9.3.9.1数据及安全性监测委员会(DSMB)
将召集独立的DSMB，以i}监督参与本HERALD：CV-NCOV-004试验的个体的安全性；ii)评估试验的进展和进行；iii)审查来自试验的累积安全性数据；iv)对潜在安全问题的不良事件进行持续审查(参见章节5.5.2节)；及v)向试验委托者提出是否继续、修改或暂停试验的建议(参见章节5.5.2节)。
DSMB将举行定期安排的会议以执行此等责任。在此等会议期间，亦将告知DSMB对CVnCoV的其他进行中的临床试验中所产生的安全性数据进行告知。如章节5.5.2中所描述，为了进一步确保在进行中的基础上的个体安全，潜在的安全问题的AE清单通常由DSMB主席(或被指派者)以规则时间间隔常规地监测。如章节7.3.2中所描述，DSMB可在试验期间的任何时间请求个体的非盲或特定数据集。
除安全性数据以外，亦将要求DSMB在期间分析时或可能在试验期间的其他时间点审查功效数据以便继续评估试验的风险与益处。作为风险与益处的部分，DSMB将定期监测VDE讯息的COVID-19病例。若需要，则亦将要求DSMB进行COVID-19病例的发病率的非盲审查以推荐增加样品大小。
DSMB特许权将详细地描述DSMB的组成及目标；DSMB、CureVac及CRO的责任；DSMB会议的时间表及进行；及待回顾的数据集。特许权将含有DSMB的统计分析计划(SAP)。
9.3.9.2裁定委员会
将形成临床医师的独立委员会以裁定COVID-19病例以用于评估主要指标。委员会将对个体的治疗分配盲化。所述病例将由成员关于章节9.2.1.4中所呈现的问题来裁定。用以裁定病例的会议及方法的方案将定义于特许权中。委员会主席将作为特别成员出席DSMB会议。
9.4免疫原性评定
因为免疫原性结果将使个体的治疗分配无效，所以进行分析的实验室将使结果保持严格的可信度。在试验开始时命名且与试验进行无关的非盲人员将周期性审查免疫原性数据的质量。此个人将使结果维持严格的可信度。
9.4.1对CVnCoV疫苗接种(S蛋白的RBD及病毒中和抗体)的抗体反应
对CVnCoV疫苗接种的抗体反应仅将在试验的2b期部分中且仅在时间点评估免疫原性子组中的个体。在延伸研究中，抗体持久性将在疫苗接种后第二年每3个月评价。
借由用CVnCoV疫苗接种诱导的免疫反应将借由2个分析评价：
·借由免疫分析在血清中量测的S蛋白的SARS-CoV-2RBD的结合抗体。
·借由功能活性分析量测血清中针对SARS-CoV-2的病毒中和抗体。
9.4.2对SARS-CoV-2(N蛋白)的抗体反应
针对在所有试验部分中且针对所有个体的SARS-CoV-2的抗体反应将借由在上文所指定的时间点量测SARS-CoV-2N蛋白(疫苗构筑体中不含有病毒抗原)的结合抗体来评估且将借由免疫分析进行。
作为SARS-CoV-2预先感染的量度，N蛋白的血清学状态将用于以下：
1.回顾性地，若个体在进入试验及第43天为SARS-CoV-2感染的未经感染或经感染的个体。
a.评估在未经感染的个体中的2剂方案的CVnCoV的功效，个体在基线及第43天必须对N蛋白呈血清反应阴性。
b.评估在未经感染的个体中的第一剂的CVnCoV的功效，个体将必须仅在基线对N蛋白呈血清反应阴性。
2.借由在试验期间量测血清反应阴性个体中N蛋白的血清转化，测定用2剂方案的CVnCoV的疫苗接种能否可以减少SARS-CoV-2感染。如上文1a中所描述，此等个体在基线及第43天必须对N蛋白呈血清反应阴性。
9.4.3出现COVID-19病例的个体对CVnCoV疫苗接种的抗体反应
对于试验中进行的COVID-19所有病例，将在试验第1天(疫苗接种前基线)、第43天、第211天及第393天采集的个体血液样品中测定针对试验疫苗接种的抗体反应。此等分析将仅需要针对不在免疫原性子组中的2b期部分中的个体及针对3期个体进行。2b期免疫原性子组中的个体将已执行此等个体作为群组的部分。此等结果将用于探究由CvnCoV疫苗接种诱导的保护性免疫的相关性。
9.4.4细胞介导的免疫性
将在400名个体中评估CMI：200名接受CVnCoV且200名接受安慰剂。在各CVnCoV及安慰剂组中，100名个体将为18至60岁且100名个体将为≥61岁。此意欲在欧洲一个临床位点中且另一个在拉丁美洲国家(大约100个CVnCoV+100个安慰剂个体参与各位点)中进行。
与基线相比，将在PBMC中确定在抗原刺激之后的S专一性T细胞反应SARS-CoV-2RBD的频率及功能性。例如，用以研究Th1反应及Th2标记产生的ICS将用于研究疫苗接种是否诱导Th1自基线偏移。其他高剖析T细胞免疫反应可利用其他技术(诸如ELISpot或CyTOF)、对基因体生物标记的分析或任何其他现有分析来研究。将在第1天(基线)、第29天、第43天、第120天及第211天进行CMI评定。应注意，第120天及第211天的测试将仅对在第29天及/或第43天判定为T细胞反应者的个体进行。
9.5针对SARS-CoV-2感染的测试
9.5.1 COVID-19疾病的病毒学确认
在试验期间，临床上怀疑患有COVID-19疾病的个体将进行如下所述SARS-CoV-2病毒的测试。测试的样品收集可借由试验工作人员在位点或家庭访视时进行。理想地，应在症状发作5天内收集样品。将在合适eCRF页上记录测试结果。
·具有COVID-19的临床怀疑的个体将使用在位点进行的快速抗原测试进行SARS-CoV-2感染的测试，结果提供至该个体。鼻咽拭子将用于收集样品以用于快速抗原测试。
·无关于快速抗原测试的结果，将同时收集的鼻咽拭子样品送至中央实验室进行SARS CoV 2专一性RT-PCR测试。RT-PCR测试结果将视为决定SARS-CoV-2感染。在不大可能自个体收集仅1个样品的情况下，应借由中央实验室的RT-PCR测试样品。
ο若RT-PCR测试是阴性，但仍基于个体的暴露病史及临床表现怀疑患有COVID-19，则应尽快采集另一鼻咽癌拭子样品且送至中心实验室进行RT-PCR测试。RT-PCR复验结果将视为决定SARS CoV-2感染。
·对于所有测试呈阴性的个体将视为SARS-CoV-2感染的未经感染的个体。在不大可能的情况下，个体借由快速抗原测试测试呈阳性但借由RT-PCR呈阴性，个体仍将视为无需借由RT-PCR呈阳性病毒学证实(除非另外借由对N蛋白呈血清反应阳性测试来测定)的未经感染的个体。
9.5.2在超出位点外进行针对SARS-CoV-2感染的阳性测试证实
关于报告在超出位点外进行针对SARS-CoV-2感染的阳性测试的个体的追踪，参见章节9.2.1.1.2及章节9.2.2。
对于报告在超出位点外进行针对SARS-CoV-2感染的阳性测试的个体，无关于测试类型，应尽快对个体进行重新测试以确认结果。应对鼻咽拭子样品传送至中央实验室进行证实的RT-PCR测试。中央实验室处的复验结果将视为决定性的。
10统计考虑因素
10.1样品大小测定
10.1.1主要功效协同目标
此为事件驱动的试验。样品大小及功效考虑因素是基于协同主要目标，以用于证明CVnCoV在预防符合协同主要功效病例定义的任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例或中度或高于严重程度的COVID-19病例中的功效。使用O'Brien及Fleming型误差损耗函数(Lan等人,1983年)计划对任何严重程度的COVID-19病例进行2次期间分析的组连续设计以用于表明高功效或无效，且样品大小是基于一个单一(亦即在所有病例中，CVnCoV组中病例的比例)的测试。组连续设计是基于任何严重程度COVID-19指标，因为符合此指标所需的病例数目较高。
为控制2个协同主要目标的一种错误类型，5％的总体双边α已在2个协同主要目标之间平等分配。总体双边α为2.5％，最终分析时需要185个任何严重程度的COVID-19病例(满足共同主要疗效病例定义的任何严重程度的COVID-19)，当考虑对立假设下的VE为60％时(即等效证明CVnCoV组病例比例低于0.4118，基于考虑对立假设下比例时比例的CI上限等于0.2857)，以90％的功效证明基于针对VE的CI下限，VE为30％以上。
总体双边α为2.5％，最终分析时需要60个中度至重度的COVID-19病例(满足共同主要疗效病例定义的中度或重度的COVID-19)，当考虑对立假设下的VE为70％时(即等效证明CVnCoV组病例比例低于0.4444，基于考虑对立假设下比例时比例的CI上限等于0.2308)，以90％的功效证明基于针对VE的CI下限，VE为20％以上。若COVID-19个病例中的1/3个为中度至重度，则当COVID-19个病例的总数为180时，将获得60个中度至严重病例。不存在针对此指标计划的期间分析。
一旦已累积56/111个病例(大约30％/60％病例)，则将进行任何严重程度的COVID19病例的协同主要目标的高功效或无效的两个期间分析。
假设安慰剂个体中COVID-19的发病率为每月0.15％，在试验期间20％的总体不可评估比率(对应于排除自EAS及退出的个体)且VE为60％，持续3个月对36,500名个体登记(每个疫苗组18,250)将在第一次疫苗接种之后大约9个月累积目标185个COVID-19病例。较低发病率、较长登记持续时间或较高非可评估比率或VE将延缓185个病例的获取及最终分析的时间。个体将随机化以1:1比率接收CVnCoV或安慰剂，按国家及年龄组分级(18至60岁及≥61岁)。
10.1.2关键次要功效目标
对于评估预防经病毒学证实的重度COVID-19病例的关键次要功效目标，与主要指标相比，将在最终分析时收集更低数目的病例。基于Verity等人2019年对大数据库的分析，大约20％COVID-19病例可以在临床上定义为重度或致命，后者需要重症监护。
对于37个重度COVID-19病例(20％的185个病例)，试验将具有88％功效以在假定VE为70％时侦测到超过10％的VE的95％CI的下限。若VE针对重度病例为75％，则功效增加至90％。在HERALD试验CV-NCOV-004中所有可评估个体完全追踪1年的情况下，预期第二次疫苗接种后累积的COVID-19个病例的额外数目将允许对严重疾病的CVnCoV功效进行更稳健的评估。此分析将呈现于SAP中。
对于下一关键次要功效目标，假定45％SARS-COV-2感染为无症状(Daniel等人2020年)，对于所有可评估个体，在第二次疫苗接种追踪1年之后预期大约300名无症状感染。在此数目的情况下，当假设针对无症状感染的VE为28％时，试验将具有80％功效以侦测到VE超过0％的95％CI的下限。
10.2用于分析的群体
在安全性分析集(SAS)、安全性分析集2(SAS 2)及征集到的AE安全性分析集(SASsol)中，个体将在其实际上接受的组中进行分析(如「治疗」)。
遵循功效集及符合方案集中的「意向治疗」原则，个体将在其经随机化的组中进行分析(如「随机化」)。
10.2.1安全性分析集(SAS)
SAS将包括在接受至少一剂的CVnCoV或安慰剂的2b或3期随机化的所有个体。
SAS将为在所有个体上收集的安全指标(亦即医疗介入的AE、AESI、导致废止或试验中断的AE及SAE)的主要人群，且用于评估第一剂后的功效的功效目标。
10.2.2安全性分析集2(SAS 2，SASsol)
由于征集到的及非征集到的AE仅针对2b期个体收集，此等分析随后将受限于2b期个体。
SAS 2群体将包括SAS的所有2b期个体且将用于非征集到的AE分析。
SASsol群体将包括SAS的所有2b期个体，其中至少一个日记集合指示征集到的AE的发生或缺乏且将用于征集到的AE分析。
10.2.3功效分析集(EAS)
EAS将包括随机化于2b期或3期中的所有个体，所述个体：
·根据试验疫苗的随机化接受两剂的试验疫苗(2剂的CVnCoV或2剂的安慰剂)。
·在试验进入之前(基于排除标准1)或在第二次疫苗接种之后15天之前未发展出经病毒学证实的COVID-19病例。
·在第二次疫苗接种之后15天之前未停止试验。
·在基线时为SARS-CoV-2未经感染的(基于基线时采集的血液样品中对N蛋白呈血清反应阴性)。
EAS将为所有功效指标(除了关于血清转化的关键次要功效指标及评估第一剂后开始的功效的功效指标以外)的主要分析群体。
10.2.4血清转化的功效分析集(EASS)
EASS群体将包括在基线及第43天针对SARS-CoV-2的N蛋白(亦即在第二次疫苗接种之后15天之前的所有测试时间点)测试呈血清反应阴性且针对第二次疫苗接种(第211天或393天)后≥15天测试N蛋白的至少一种血清学测试结果可用于分析的EAS的所有个体。
与血清转化为SARS-CoV-2(无症状感染)的N蛋白相关的关键次要功效指标的主要分析将在此群体上进行。
10.2.5符合方案功效集(PPE)
符合方案功效集将包括符合试验进入时的所有合格性标准且不具有将影响如SAP中所指定的功效结果的主要方案偏差的EAS个体。
PPE将为功效指标(除了关于血清转化的关键次要功效指标及评估第一剂后开始的功效的功效指标以外)的支持性群体。
10.2.6符合方案免疫原性集(PPI)
PPI集将包括属于免疫原性子组(IS)的所有2b期个体{亦即约登记至2b期中的2个年龄群(18至60岁及61岁)中的每一者的前600名个体且个体：
·随机接收两剂且在方案中所定义的窗内接收。
·无主要方案偏差预期影响如SAP中指定的免疫原性结果。
·尚未接受可能干扰所提出的免疫原性量测中的一或两者的医学治疗(诸如血液产品、免疫球蛋白疗法)。
·在第二次疫苗接种后14天(第43天)开始收集至少一种血液样品可用于分析。
PPI将为S蛋白的SARS-CoV-2RBD抗体反应及SARS-CoV-2病毒中和抗体的主要分析群体。
将在试验的非盲之前举办的盲化数据审查会议上进行鉴别及审查自PPE/PPI排除的个体。将列举及概述主要方案偏差。
表18提供计划用于分析各指标的主要及支持性群体的概述。其他分析群体可定义于SAP中。
表18：用于各指标分析的主要及支援群体
Figure GDA0003858923850003581
Figure GDA0003858923850003591
10.3统计分析
10.3.1一般考虑因素
计划进行五项分析：2个期间(当达到56/111个病例时)；最终分析(当达到185个病例时)；1年追踪(对直至第393天访视的所有数据)；及2年追踪(对直至延伸研究结束的所有数据)。中期及最终分析的SAP将最迟在数据库锁定之前的制备及完结。本文件将提供关于用以解决所有试验目标及遗漏数据的处置的分析变数的定义及分析方法的其他细节。针对最终分析计划的所有分析将在1年追踪及2年追踪分析中更新。
10.3.2人口统计、病史及其他基线特征
数据将关于人口统计及基线特征(例如年龄、性别、身高、体重)、病史、基线免疫状态及所有安全量测使用描述性统计资料(定量数据)及列联表(定性数据)总体、借由疫苗组及根据年龄组及疫苗组概述。
10.3.3试验疫苗投予
将列举CVnCoV或对照组的投予，且将借由疫苗组概述实际上接受疫苗接种剂的个体的数目。
10.3.4伴随药品及疫苗接种
在开始试验之后伴随药品/疫苗接种一般将总体借由解剖治疗化学术语及疫苗组列出及概述。
10.3.5功效分析
10.3.5.1协同主要功效指标分析
主要功效分析
在主要功效分析中，定义为与接受安慰剂的个体相比，经疫苗接种的个体中任何及中度至重度COVID-19病例(根据原发病例定义)的频率减少百分比的VE将用精确95％*CI计算如下：
VE＝1-RR＝1-(ARV/ARP)＝1-{p/r(1-p)}
其中
ARV＝经疫苗接种组的侵袭率＝nv/Nv＝报告CVnCoV组中至少一个COVID-19发作的个体数目/CVnCoV组中可评估个体的总追踪时间(人/月数目)。
ARP＝安慰剂组中的侵袭率＝np/Np＝报告安慰剂组中至少一个COVID-19发作的个体数目/安慰剂组中可评估个体的总追踪时间(人/月数目)。
RR＝相对风险＝ARV/ARP
p＝在所有病例中的CVnCoV组的COVID-19病例(根据原发病例定义)的比例＝nv/(nv+np)。
r＝CVnCoV组中可评估个体的总追踪时间与安慰剂组中可评估个体的总追踪时间的比率＝Nv/Np。
*归因于顺序设计，可略微调节CI水平(参见章节10.3.8)。
协同主要功效指标的统计假设为：
H0A：VE≤30％对H1A：VE>30％
及
H0S：VE≤20％对H1S：VE>20％
A与任何严重程度的COVID-19病例相关；
S与中度至重度COVID-19病例相关；
对于任何严严重程度的所有COVID-19病例，若VE指标的准确双边97.5％(考虑到顺序设计需稍微调整)CI的下限(LL)为>30％或对于重度至中度COVID-19病例，若VE指标的精确双边97.5％CI的下限(LL)为>20％，则试验将成功。
若在分别报告56/111个及185个病例后，对任何严重程度的COVID-19病例进行2次期间分析和最终分析，根据O'Brien Fleming型误差损耗函数，在最终分析时考虑的单边α-风险将为0.01209，且若CVnCoV组中185个病例中有60个或以下病例(观察到的VE≥52.0％)，则在最终分析时将证明功效；对于中度至重度COVID-19的最终分析大风险为0.025，且和若CVnCoV组中60个病例中有17个或以下病例(观察到的VE≥60.5％)，则将证明功效。应注意，若r≠1(两个群组中的总追踪时间不同)，则关于分开展现功效的病例的规则可略微不同。
敏感性分析
作为关键敏感性分析，将分析经病毒学证实的COVID 19病例(根据原发病例定义)的第一次出现时间。
卡本-麦尔(Kaplan-Meier)曲线将显示未产生COVID 19的估计概率，且将进行对数秩检定。
经病毒学证实的COVID-19的第一次出现时间(症状发作日期)将在第二次疫苗接种之后15天开始。
未发展COVID-19的个体将在试验终止日期或分析截止日期(以先出现者为准)检查。
额外敏感度分析可包括经调整用于SAP中指定的相关基线共变数的Cox比例危险回归模型。
关于分析方法的更多细节将描述于SAP中。
10.3.5.2次要功效指标分析
2个关键次要功效指标的统计测试将根据条件阶层式测试程序使用目标/指标部分中定义的次序来执行。从而：
·CVnCoV关于重度病例的功效仅当存在主要功效目标的成功论证时才将展现。
·CVnCoV关于无症状感染的功效仅当存在重度病例的主要功效目标及次要目标的成功论证时才将展现。
否则，此等指标将作为探索性指标分析而无需成功标准测试。
为了评定预防重度疾病及无症状感染的功效，将进行与对主要功效指标进行的彼等分析类似的分析。若对于重度疾病VE的准确双边95％CI的LL为10％以上且对于无症状感染为0％以上，则功效将得到证实。
将类似于主要功效指标分析其他次要功效指标，但彼等指标将不进行形式测试。对于在第一剂后的功效，经病毒学证实的COVID-19的第一次出现时间(症状发作日期)将在第一次疫苗接种之后开始。将使用2个不同评分系统分析BoD。两个BoD评分系统均对针对重度COVID-19疾病或重度疾病(如住院或死亡所反映)的功效提供更多权重。另外，将针对BoD类别中的每一者计算VE及相关联CI。
10.3.5.3探索性功效指标分析
在所有病例中轻度及重度COVID-19病例(根据原发病例定义)的比例将按组概述。
频率及百分比的描述将由以下个体的组提供：
·需要由COVID-19所致的补充氧合。
·需要由COVID-19所致的机械通风。
·由COVID-19所致的住院。
·由COVID-19所致的死亡。
·由任何原因所致的死亡。
此将针对在第二次试验疫苗接种后≥15天出现的事件(完整VE)且接着针对在第一次试验疫苗接种之后的任何时间出现的事件进行。
针对在第二次试验疫苗接种之后≥15天出现的病例，及接着在第一剂后出现的所有病例，在基线处无论个体血清学状态任何，在预防任何严重程度的经病毒学证实的COVID-19病例的第一发作中的VE将针对所有个体再次评估。
最后，将按组显示产生COVID-19的第二次发作的个体的数目及百分比。
10.3.6次要及探索性免疫原性分析
将不测试关于免疫原性的正式假设。将为各疫苗组及整体以及由疫苗组及年龄组提供免疫原性指标的描述性统计。数据将在各疫苗剂之后呈现。
以下分析将针对S蛋白的SARS-CoV2 RBD的抗体水平及总体中和抗体且分别针对在基线呈血清反应阴性的个体及在基线呈血清反应阳性的个体来进行：
·在各血液取样时间点将以其95％CI概述几何平均值效价(GMT)。
·将针对各个体计算相对于基线的倍数变化(FC)且FC的几何平均值(GMFC)将在基线之后各血液取样时间点由其95％CI显示。
非可侦测抗体任意经用于GMT及GMFC计算目的的侦测截至值的一半置换。
对于各读数，观测到血清转化的基线处个体SARS CoV-2血清反应阴性的数目及百分比将概述且基线之后的各血液取样时间点由精确95％CI呈现。血清转化定义为血清中的可侦测抗体。
将概述S蛋白的SARS CoV-2RBD抗体及SARS CoV-2中和抗体血清转化的个体百分比。将概述借由疫苗诱导的免疫细胞群体的频率。T细胞免疫反应的进一步特征可用其他技术完成，如ELISpot、CyTOF及/或基因体生物标记的分析。
在适当时，包括图的额外免疫原性分析将在SAP中描述。
10.3.7安全性分析
未计划针对安全性数据的正式统计测试。
描述性安全性分析将总体上借由疫苗组以及年龄组及疫苗组来进行。
将总体且单独地对在基线呈血清反应阴性的个体中及在基线呈血清反应阳性的个体中进行SARS-CoV2 N蛋白抗体水平的以下分析：
征集到的AE：在各疫苗接种之后7天内经历各征集到的局部及全身性AE的个体的频率及百分比将借由强度及总体呈现。对于疫苗接种之后7天内具有相同AE的超过1次发作的个体而言，最大强度将用于制成表格。将借由与试验疫苗接种的关系对征集到的全身性AE进行制成类似表格。征集到的局部AE按照定义视为与试验疫苗相关。各征集到的局部及全身性AE亦将概述发作时间(以天为单位)及持续时间(以天为单位)。亦将呈现展示各疫苗接种之后7天内至少一种局部或全身性征集到的AE的出现的概述表。
非征集到的AE：包括SAE及AESI的非征集到的AE将使用监管活动医学词典(MedDRA)词典借由系统器官类别(SOC)及较佳术语(PT)编码。
在各疫苗接种之后28天内报导各非征集到的AE的个体的频率及百分比且总体将以SOC及PT水平制成表格。
针对以下提供类似表：在第二次试验疫苗接种之后6个月内出现的相关非征集到的AE、3级或更高级的非征集到的AE、医疗介入的AE；SAE、相关SAE、AESI、相关AESI、导致废止或试验中断的AE以及在第二次试验疫苗接种之后1年导致死亡的SAE。
当个体在1次疫苗接种后28天内出现超过一次AE时，将对与疫苗组的最大严重程度及最强关系进行计数。
在概述表中仅考虑第一次疫苗接种后的AE。开始于第一次疫苗接种之前的AE将记录为病史。
将借由个体提供致命及SAE的数据清单。
生命体征将在各访视时借由描述性统计概述，其包括相对于基线的变化，且将提供清单。
10.3.8期间分析
将针对此试验借由非盲非依赖性统计学家进行两次期间分析，且当观察到56/111个COVID-19病例的任何严重程度(满足协同主要功效病例定义)时借由DSMB审查。此分析旨在评估主要功效指标的早期高功效或无效且将仅对EAS群体进行。亦将描述在此时间点可用的安全性数据。
为了较高功效或无效的早期论证，累积O'Brien Fleming型误差损耗函数(Lan等人1983年)用以基于累积直至彼特定中期阶段的资讯提供针对期间分析的针对高功效(α-边界)及无效(β-边界)的统计停止规则。
在中期阶段，若用于主要目标的测试的p值低于α边界，则将声明CVnCoV的高水平功效。相反地，若p值高于β-边界，则将出现无效的论证。
计划期间分析在已观测到56/11个任何严重程度的COVID-19病例时进行。以下表19展示用于使用累积误差耗费函数在单边p值量表上计算的展现高功效或无效的边界。
表19：具有56个及111个病例的期间分析及185个病例的最终分析的两阶段分批逐次设计
Figure GDA0003858923850003651
Figure GDA0003858923850003661
*若可评估个体的总数目在两组中不同(r≠1)，则关于分开展现功效/无效的案例的规则可略微不同。
若期间分析在已报告56/111个病例之后准确进行，则低于0.00001/0.00126的单边p值(亦即双边99.99％/99.99％CI的下限>30％)将产生高功效的结论，而高于0.73596/0.15716的单边p值将导致无效的论证。否则，最终分析将在185个病例下进行。类似，若两个组中可评估个体的数目相等，若56/111个病例中的7/29个病例或更少病例来自CVnCoV组中则试验将得出早期较高功效的结论；相反地，若26/41个病例或更多病例来自CVnCoV组中则试验将展现出无效。
值得重视地，用于做出决策的实际边界将视在各分析(期间及最终)处出现及报告的病例的准确数目而定。
边界将以非结合方式应用，因为存在许多将为做出决策过程的一部分的其他因素。
10.3.9遗漏数据及中断
对疫苗接种变数的分析将基于有效病例进行，亦即对于遗漏观测值，将不应用遗漏数据的设算，诸如最后一次观测值结转。
对于S蛋白的SARS-CoV-2RBD抗体，标记为低于定量下限(LLOQ)的浓度值将设定为0.5*LLOQ。
对于任何分析，不进行漏测值的设算(除如SAP中所指定的AE及伴随药品的缺失部分日期的设算之外)。
目前未预见到中途退出的个体的替代。
实施例14：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA疫苗接种大鼠
本实施例显示具有包含3'端(A64-N5-C30-hSL-N5或hSL-A100)及UTR组合(i-3(-/muag)或a-1(HSD17B4/PSMB3))的替代形式的mRNA的SARS-CoV-2S mRNA疫苗在大鼠中诱导强体液以及细胞免疫反应。包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的编码SARS-CoV-2S_stab的mRNA显示即使在第一次疫苗接种之后的免疫反应的较强及极早期诱导，其借由结合及中和抗体的较强诱导展现。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
向大鼠肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表18中所指示。作为阴性对照组，一组大鼠经缓冲液(A组)疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第14天、第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价。
表20：疫苗接种方案(实施例14)：
Figure GDA0003858923850003671
Figure GDA0003858923850003681
使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价：
ELISA如实施例12中所描述进行。
测定病毒中和抗体效价(VNT)
如先前实施例6中所描述用小鼠血清分析大鼠血清样品的病毒中和抗体效价(VNT)。
结果：
如图16A中所示，在使用0.5μg、2μg、8μg、20μg及40μg的剂量进行一次第一次疫苗接种之后第14天及第21天，用调配于LNP(R9709)中具有包含3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的非编码区的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中诱导稳健及剂量依赖性水平的结合抗体效价(借由IgG1及IgG2a指标效价显示)。在使用较高剂量(8μg、20μg及40μg)进行一次第一次疫苗接种之后第14天及第21天，用调配于LNP(R9515,CVnCov)中具有包含3'端A64-N5-C30-hSL-N5及UTR组合i-3(-/muag；)的非编码区的mRNA全长S稳定蛋白的疫苗接种在大鼠中诱导稳健及剂量依赖性水平的结合抗体效价(借由IgG1及IgG2a指标效价显示)。
如图16B中所示，在用至少2μg剂量进行一次第一次疫苗接种之后第14天，用调配于LNP(R9709)中具有包含3'端hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的非编码区的编码全长S稳定蛋白的mRNA的疫苗接种在大鼠中诱导剂量依赖性及极高水平的VNT。
如图16C中所示，用两种调配于LNP中的编码全长S稳定蛋白的mRNA疫苗型式的疫苗接种以剂量依赖型方式诱导强VNT。当与编码包含A64-N5-C30-hSL-N5及UTR组合i-3(-/muag)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA相比时，具有编码包含hSL-A100及UTR组合a-1(HSD17B4/PSMB3)的SARS-CoV-2S_stab的mRNA的VNT的诱导甚至在仅2μg的剂量下显示出较强且极稳健的中和抗体效价的诱导。借由包含mRNA R9709的疫苗组成物培养的中和抗体的效价可借由第二次疫苗接种进一步显著增加。
包含R9709的疫苗组成物的强度可支持用于治疗或预防个体的针对冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的免疫方案，其仅包含一种单一剂的组成物或疫苗。
实施例15：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA的NHP疫苗接种及攻击
调配于LNP(CVnCoV)中编码S_stab的mRNA的保护功效阐述于恒河猕猴SARS-CoV-2攻击模型中。非人类灵长类动物显现轻度临床疾病，在上呼吸道及下呼吸道中具有高水平病毒复制，且病理学变化指示在SARS-CoV-2感染后出现病毒肺炎(Munoz-Fontela等人,2020年)。认为CVnCoV在COVID-19的NHP活体内模型中经由鼻内(IN)及气管内(IT)途径对5×106PFU攻击具有保护性影响的结果。保护指标包括除保护免于肺病变以外显著减少的病毒负荷。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种及攻击：
十八只印度血统的恒河猕猴(Macaca mulatta)划分成三组，每组六只，各组各包含三个雄性及三个雌性(其中重量>4.5kg且年龄为3-6岁)。动物经0.5μg或8μg经LNP调配的编码SARS-CoV-2抗原S_stab(SARS-CoV-2S-2P(CvnCoV))的mRNA疫苗接种两次，或在第二次接种四周后用野生型SARS-CoV-2攻击之前保持未经疫苗接种(参见图17A)。动物用mRNA疫苗组成物以0.5ml的体积及如表21中所指示的剂量在上臂的二头肌肌肉处进行肌内(i.m.)注射。作为阴性对照组，一组NHP在攻击之前未经处理/未经疫苗接种(A组)。在第0天、第14天、第28天(第一次疫苗接种后)、在第42天及第56天(第二次疫苗接种后)及在攻击后第1天、第3天、第5天、第7天采集血液样品以测定抗体效价。在第56天以5.0×106PFU SARS-CoV-2的剂量对动物进行鼻内攻击，其借由使用支气管镜将2ml病毒制剂于气管的前隆凸部分施用，随后经鼻内使用1ml(0.5ml/鼻孔)。各组的两只动物在攻击后6、7或8天(p.c.)且在实验的第62、63或63天安乐死。
表21：疫苗接种方案(实施例15)：
Figure GDA0003858923850003701
Figure GDA0003858923850003711
IgG ELISA
SARS-CoV-2棘蛋白的全长三聚及稳定版本由莱克制药公司(Lake Pharma)供应(#46328)。重组SARS-CoV-2受体结合域(319-541)MycHis经MassBiologics公司研发且借友情提供。重组SARS-CoV-2棘蛋白及RBD专一性IgG反应借由ELISA测定。高结合96孔板(NuncMaxisorp，442404)涂布有50μl/孔的2μg/ml于1×PBS(Gibco)中的棘蛋白三聚体或棘蛋白RBD且在4℃下培育隔夜。洗涤ELISA板且在室温下用含5％胎牛血清(FBS，Sigma，F9665)的1×PBS/0.1％吐温20阻断1小时。疫苗接种后自动物收集的血清以1/50开始稀释，接着进行8次双倍连续稀释。使攻击后样品在0.5％特立通(triton)中且以1/100开始稀释，接着进行8次三倍连续稀释去活化。在10％FBS/1×PBS/0.1％吐温20中进行连续稀释。在洗涤板之后，将50μl/孔的各血清稀释液一式两份添加至经抗原涂布的培养板中，且在室温下培育2小时。洗涤之后，将共轭于HRP(Invitrogen，PA1-84631)的抗猴IgG稀释(1:10,000)于10％FBS/1×PBS/0.1％吐温20中，且向培养板中添加100μl/孔。培养板接着在室温下培育1小时。洗涤之后，制备1mg/ml邻苯二胺二盐酸盐溶液(Sigma P9187)且向其添加100μl/孔。用50μl/孔1M盐酸(Fisher Chemical，J/4320/15)中止显影，且使用Softmax(7.0版本)在分子装置versamax板读取器上读取490nm下的吸光度。所有测试样品剂反应曲线在Softmax Pro(7.0版本)中拟合至4PL模型且在OD为0.5时的指标效价(定义为提供0.5的吸收率反应所需的血清稀释度的倒数)自各曲线内插。其中结果低于侦测极限，对于免疫后样品其指定值为25且对于后攻击样品指定值为50。对于吸光度从未达到0.5值的低样品，自曲线的经外推部分估计效价。将截止值设定为自未经感染的动物(第0天)+1个标准偏差收集的血清的平均值效价。分别计算各抗原的截止值。
SARS-CoV-2焦点减少中和测试
在加热去活化血清样品(56℃，30min)中量测病毒中和效价。将浓度为100至250个病灶/孔的纯病毒对照孔的SARS-CoV-2(Victoria/01/2020，Doherty Institute)与1×抗生素/抗霉剂(Gibco，15240-062)以50:50的比例混合在1％FCS MEM中，且在96孔V形底板中以1:20至1:640(或更高的比例，视抗体水平而定)的血清倍增稀释液混合。培养板在37℃下在加湿箱中培育1小时以使血清样品中的抗体结合至病毒。随后将一百微公升血清/病毒混合物转移至96孔培养板中的病毒敏感性Vero/E6单层中，且在密封加湿箱中在37℃下再培育1小时。在吸附之后，移除病毒/抗体混合物且添加100μl完全培养基覆叠中的1％w/vCMC。重新密封于箱中且在37℃下培育24小时，随后用100μl 20％福尔马林/PBS溶液固定且使培养板离心隔夜，随后经免疫染色。在使用ELISA洗涤器(BioTek 405TSUS)用水洗涤之后，借由添加0.3％过氧化氢持续20分钟来移除残余内源性过氧化酶活性。培养盘接着以1:2,000稀释于PBS中的主要/侦测SARS-CoV-2抗RBD兔多株抗体(SinoBiologicals；40592-T62)且培育1小时。洗涤后，培养板与以1:4,000稀释于PBS中的二级抗兔HRP-共轭物抗体(Invitrogen；G-21234)一起培育1小时。在洗涤之后，使用TrueBlueTM过氧化酶基质(KPLseracare；5510-0030)使病灶显现，其后培养板用水洗涤且干燥。使用ImmunoSpot S6Ultra-V分析器(CTL)及BioSpot软体(7.0.28.4Professional；CTL)对焦点进行计数，且在SoftMax Pro(分子装置；v7.0.3GxP)中分析结果。简言之，计数数据表示为各血清稀释的VOC百分比，亦即百分比病灶减少且绘制于4参数对数(4PL)曲线上。病毒中和效价(VNT)报告为中和50％的病毒病灶地血清稀释。
或者，如先前实例中9中所描述用SARS-CoV-2病毒(特征为突变D614G)量测病毒中和效价。
ELISpot
借由密度梯度离心，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，USA)自肝素化血液分离周边血液单核细胞(PBMC)。IFN-γELISpot分析用于使用人类/猿猴IFN-γ套组(MabTech,Nacka,Sweden)估计PBMC中SARS-CoV-2专一性T细胞的频率及IFN-γ产生能力。以2×105个细胞/孔分析细胞。细胞用SARS-CoV-2肽池及棘蛋白的‘巨池’(Mimotopes，Australia)刺激隔夜。肽序列是基于GenBank:MN908947.3。使用包含由11个氨基酸重叠的15聚体肽的十个肽池。三个巨池按如此构成：巨池1(MP1)包含肽池1-3、巨池2(MP2(包含肽池4-6及巨池3(MP3)包含肽池7-10。所有肽以1.7μg/ml/肽的最终浓度使用。佛波醇12-肉豆蔻酸酯(Sigma-Aldrich Dorset，UK)(100ng/ml)及离子霉素(CN Biosciences，Nottingham，UK)(1mg/ml)用作阳性对照组。结果经计算以报告为点形成单位(SFU)/百万细胞。一式两份地分析所有SARS-CoV-2肽及巨池，且仅减去培养基孔以得到抗原专一性SFU。使用CTL扫描仪及软体(CTL，Germany)分析ELISpot板，且使用GraphPad Prism(8.0.1版本)(U GraphPad软体，USA)进行进一步分析。
支气管肺泡灌洗(BAL)
使用6ml或10ml PBS使用插入至第二分叉上方右侧肺的小支气管镜进行活体BAL洗涤。在用20mLPBS结扎左主支气管后，在右肺叶进行死后BAL洗涤。
定量聚合酶链反应
自鼻拭子、咽喉拭子、经EDTA处理的全血BAL及组织样品(脾、肾、肝、结肠、十二指肠、扁桃体、气管及肺)分离RNA。RNAprotect(Qiagen)中的组织样品在Precellys 24均质器中均质化，该均匀器补充有1％(v/v)β-巯基乙醇的CK28硬组织均质化2.0ml管(Bertin)及1ml RLT缓冲液(Qiagen)。使组织均质物通过QIAshredder均匀器(Qiagen)，且使用BioSprintTM96 One-For-All vet套组(Qiagen)及Kingfisher Flex平台按照制造商说明书萃取等同于17.5mg组织的体积。借由将样品置放于AVL缓冲液(Qiagen)中且添加100％乙醇来使非组织样品去活化。按照制造商说明书，使用BioSprintTM96 One-For-All vet套组(Qiagen)及Kingfisher Flex平台进行此等样品的萃取。
反转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)使用TaqPathTM 1-Step RT-qPCR MasterMix、CG(AppliedBiosystemsTM)、2019-nCoV CDC RUO套组(Integrated DNA Technologies)及UQuantStudioTM7 Flex即时PCR系统(AppliedBiosystemsTM)进行。PCR扩增子以试管内经转录RNA N基因片段为标准进行定量。侦测到低于10个复本/μl的定量下限(LLOQ)的阳性样品指定为5个复本/μl的值，未侦测到的样品指定为2.3个复本/μl的值，等效于分析LLOD。对于鼻拭子、咽喉拭子、BAL及血液样品萃取样品，此等于1.29×104个复本/毫升的LLOQ及2.96×103个复本/毫升的LLOD。对于组织样品，此等于5.71×104个复本/g的LLOQ及1.31×104个复本/g的LLOD。
使用TaqManTMFast Virus 1-Step Master Mix(Thermo Fisher Scientific)分别以250nM、125nM及500nM的最终浓度用正向引子、探针及反向引子在QuantStudioTM7 Flex即时PCR系统上进行次基因体RT-qPCR。sgE引子及探针的序列为：2019-nCoV_sgE-正向,5'CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC 3'(SEQ ID NO:22729)；2019-nCoV_sgE-反向,5'ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3'(SEQ ID NO:22730)；2019-nCoV_sgE-探针,5'FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 3'(SEQ ID NO:22731)。循环条件为50℃持续10分钟、95℃持续2分钟，接着为45个循环在95℃下持续10秒及在60℃下持续30秒。RT-qPCR扩增子以全长SARS-CoV-2 E ORF(寄存编号NC_045512.2)的试管内经转录RNA标准来定量，其前面为UTR前导序列及推定的E基因转录调节序列。侦测到低于定量下限(LLOQ)的阳性样品指定为5个复本/μl的值，未侦测到的样品指定为≤0.9个复本/μl的值，等效于侦测下限(LLOD)的分析。对于鼻拭子、咽喉拭子、BAL及血液样品萃取样品，此等于1.29×104个复本/毫升的LLOQ及1.16×103个复本/毫升的LLOD。对于组织样品，此等于5.71×104个复本/g的LLOQ及5.14×103个复本/g的LLOD。
组织病理学
将来自左前及尾肺叶、气管、喉、纵隔淋巴结、扁桃体、心脏、胸腺、胰脏、脾、肝、肾、十二指肠、结肠、脑、疫苗接种位点(包括皮下组织及底层肌肉的皮肤)及引流淋巴结(左及右)的组织样品固定于10％中性经缓冲的福尔马林中且包埋于石蜡中。切割4μm厚的切片且用苏木精及曙红(HE)染色。组织玻片由对治疗及分组详情盲化的两个兽医学病理学家独立地扫描及检测。
对于肺，自不同位置取样自各左肺叶的三个切片：主叶支气管的近端、内侧及远端。评分系统(Salguero等人，2020年)用于客观地评估肺组织切片中所观测到的组织病理学病灶。各组织病理学参数的评分计算为在每只动物评估的六个肺组织切片中观测到的评分的平均值。
另外，RNAscope原位杂合(ISH)技术用于鉴别两个肺叶中的SARS-CoV-2病毒。简言之，组织用过氧化氢预处理10分钟(RT)，目标恢复15分钟(98-101℃)且蛋白酶加30分钟(40℃)(所有高级细胞诊断)。将靶向S蛋白基因的V-nCoV2019-S探针(高级细胞诊断)在组织上在40℃下培育2小时。在RNAscope方案(RNAscope 2.5HD侦测试剂-红色)之后使用RNAscope2.5HD红色套组(高级细胞诊断)进行讯息扩增。各ISH处理中包括适当对照组。用NikonNIS-Ar软体进行数位影像分析，以便计算对病毒RNA呈阳性的肺切片的总面积。
电脑断层扫描摄影(CT)放射学
使用16片层Lightspeed CT扫描仪(General Electric Healthcare，Milwaukee，WI，USA)在俯卧及仰卧位自镇静动物收集CT扫描。所有轴向扫描均在120KVp下用Auto mA(范围在10与120之间)进行且使用较小扫描视野获取。旋转速度为0.8s。影像显示为11cm视野。
为便于在后攻击的心脏/肺血管、淋巴结及肺外组织的完整检查，以2ml/kg体重静脉内(IV)投予Niopam 300(Bracco，Milan，Italy)非离子碘化对比介质，且在注射之后立即收集及自注射中点九十秒后扫描。
针对COVID疾病特征的存在评估扫描：毛玻璃状阴影(GGO)、实变、碎石路状样式(crazy paving)、节结、小叶周围实变；分布-上部、中间、下部、中心2/3、周围、支气管中心及肺栓塞。估计肺受累程度(<25％、25-50％、51-75％、76-100％)且使用针对COVID疾病研发的评分系统定量。
结果
对S蛋白的三聚形式或分离的受体结合域(RBD)的结合效价的分析显示在单次疫苗接种之后以8μg疫苗接种的动物中的棘蛋白(图17B)及RBD专一性IgG效价(图17C)的较小增加。在研究第42天第二次疫苗接种之后，在IgG效价中观测到较大增加，其中针对S及RBD反应性抗体，动物的中值指标效价分别展现1.6×103及3.2×103的显著增加(图17B及C)。在攻击后在此组中发现棘蛋白及RBD专一性IgG效价的增加，尤其在终止时(研究第62、63及64天)收集的血清中。
如所预期，在疫苗接种期期间在0.5μg CVnCoV(刻意次佳剂量)或未经疫苗接种的对照组中未看到棘蛋白或RBD专一性IgG抗体的显著增加。然而，在攻击之后，在疫苗接种0.5μg CVnCoV的动物的取样点中的每一者处观测到棘蛋白及RBD专一性IgG效价的逐渐增加(图17B及C)。在未经疫苗接种的对照组中未观测到棘蛋白或RBD专一性IgG效价增加(图17B及C)。
与结合抗体的诱导一致，在8μg组中第二次疫苗接种之后，可侦测到稳健水平的病毒中和效价(VNT)(图17D)。VNT在第42天在2.7×104的中值效价处达到峰值。中和抗体效价在攻击后保持相对不变直至实验第62天、第63天及第64天。0.5μg及未经疫苗接种的对照组中的动物在攻击之前保持阴性，而SARS-CoV-2感染分别在0.5μg及未经疫苗接种的组中的4/6及5/6的动物中诱导抗体效价的较小增加。类似的结果也出现在以D614G突变为特征的SARS-CoV-2病毒上。
为了评定CVnCoV诱导的细胞反应，疫苗接种及攻击后不同时间点分离的周边血液单核细胞(PBMC)用跨越SARS-CoV-2棘蛋白的肽池刺激。经刺激细胞的IFN-γ释放借由ELISpot量测。对疫苗接种期中总计池的反应的分析显示，经8μg CVnCoV疫苗接种的动物中的棘蛋白专一性IFN-γ增加，其在第一次疫苗接种之后两周增加且在第二次疫苗接种之后两周明显增加(图18A图1)。用十个个别池(各池覆盖S蛋白的大约140个氨基酸)进行刺激，证明在疫苗接种8μg CVnCoV后，在整个S长度上诱导对肽产生反应的细胞(图18A图3)。
在疫苗接种期中，0.5μg CVnCoV或未经疫苗接种的动物中不存在明显反应(图18A图1、2及4)。阴性对照组中的一只雌性动物在整个实验中的肽池2(覆盖N末端域(NTD))及d56上的肽池3(覆盖NTD及RBD的一部分)刺激之后显示尤其高IFN-γ分泌(图18A图1及4)。
数据表明对经CVnCoV疫苗接种动物中的S专一性细胞反应的强诱导。在经8μgCVnCoV疫苗接种的动物中，在第一次及第二次疫苗接种之后，引发针对覆盖S蛋白的全长的肽的增加的反应。此等数据与在小鼠中证实CVnCoV诱导高S专一性CD4+及CD8+T细胞反应的能力的先前数据一致(例如实施例6及7)。稳健T细胞反应的产生可能支持针对SARS-CoV-2的疫苗功效。近期数据已表明CD8+T有助于恒河猕猴模型中的病毒控制(McMahan等人,2020)。对SARS-CoV-2的T细胞反应易于在人类中侦测到且可在长期保护中起作用(Grifoni等人,2020)(Sekine等人,2020)(Ni等人,2020)。
增加的棘蛋白专一性IFN-γ反应在攻击后第62-64天在所有动物中均可侦测到(图18B图1-4)。值得重视地，在经8μg CVnCoV疫苗接种的动物中细胞反应的增加比在其他组中更不明显，可能指示此等动物中病毒复制量较低(图18B图3)。
攻击感染后病毒RNA复本的定量证明在经8μg CVnCoV疫苗接种的动物中上呼吸道中病毒复制的减少。重要地，此疫苗剂量能够保护经攻击动物的肺。保护是借由不可侦测水平的病毒RNA及借由与未经疫苗接种的动物相比在攻击感染时减少的病理学变化两者证实。在稳健免疫反应存在下对低于上呼吸道的更好保护与仓鼠(实施例9)中的结果及在NHP攻击模型中基于SARS-CoV-2疫苗的其他mRNA的结果(Corbett等人,2020)(Vogel等人,2020)一致。
经由qRT-PCR监测上呼吸道及下呼吸道中的呈现或SARS-CoV-2总RNA(图19)。上呼吸道中的病毒复制在第59天在未经疫苗接种的动物中达到峰值，其在鼻拭子中达到2.7×107cp/ml的中值(图19A)且保持可侦测直至在第62-64天终止。用鼻拭子量测，经0.5μgCVnCoV疫苗接种及未经疫苗接种的对照组动物的动物中病毒复制之间无显著差异。总体而言，8μg CVnCoV疫苗接种诱导上呼吸道中病毒RNA复本的最低数目，其中鼻拭子中的2.9×106cp/ml的中值在第59天分别为可侦测的。然而，研究组之间的差异在统计学上不显著。可比较结果在咽喉拭子中产生(图20A)。
经由qRT PCR评定次基因体(sg)RNA的额外分析指示病毒复制在上呼吸道产生总低sgRNA水平。在所有动物中值在第59天达到峰值且在第62天返回至基线。在鼻拭子中，在未经疫苗接种的对照组动物中，与3.7×104cp/ml相比，经0.4×104cp/ml CVnCoV疫苗接种的动物中sg RNA水平最低。经8μg CVnCoV疫苗接种的组中的6只动物中的3只在所有时间点处保持阴性，而未经疫苗接种组中的5/6只动物具有次基因体病毒RNA可侦测的水平(图19D)。咽喉拭子的分析显示，各组之间的次基因体RNA无显著差异且中值保持低于所有动物中定量的下限(图20B)。
活体(d59)及死后(d62-d64)支气管肺泡灌洗(BAL)样品的下呼吸道的平行分析显示在两个时间点在经8μg CVnCoV疫苗接种后总病毒RNA的水平显著降低(图19B)。在第59天及第62-64天总RNA的中值在对照组中为4.3×106及1.1×105cp/ml，而在经8μg CVnCoV疫苗接种的动物分别具有0.6×104及0.3×104的中值效价的特征。在第59天BAL中的RNA水平低于8μg CVnCoV组中除一只动物之外的所有动物的定量下限，其特征为低RNA计数。经0.5μgCVnCoV疫苗接种的动物中的总病毒RNA水平与对照组可比。值得重视地，第59天的BAL分析仅描绘雌性动物及未经疫苗接种组的一只雄性动物。其余动物自此分析排除，因为已选择了防止进一步评估的次佳BAL取样条件。
在尸检时收集的肺组织的分析证实在BAL样品中获得的结果。在未经疫苗接种组中可侦测到2.9×108cp/g的中值效价，而所有经8μg CVnCoV疫苗接种组中的动物保持低于定量下限(图19C)。0.5μg CVnCoV组及未疫苗接种组中的动物之间不存在统计显著差异。
就疫苗安全性而言，注射0.5μg或8μg CVnCoV未引发对疫苗接种的不良反应，且在该研究的疫苗接种期期间未在各组之间观测到体重或温度差异(数据未示出)，此支持在所用剂量下在恒河猕猴中的疫苗的有利的安全轮廓。此外，在此研究中不可侦测到疫苗增强疾病的迹象。
BAL及肺组织样品中的次基因体病毒RNA分析产生类似结果：指示复制病毒的RNA可分别在未经疫苗接种的BAL及肺样品及在第59天及第62-64天接受0.5μg CVnCoV疫苗接种的动物中侦测。8μg CVnCoV组中的所有动物在此等分析中为阴性的(图19E及F)。
在尸检时收集的其他组织样品的评价显示0.5μg CVnCoV及未经疫苗接种动物中SARS-CoV-2总RNA的较低但可侦测的讯息，而经8μg CVnCoV疫苗接种动物则保持阴性(图20C及D)。在任何组中在脾、十二指肠、结肠、肝或肾中未侦测到病毒RNA(图20E-I)。
尸检时获取的肺样品的组织病理学分析显示病灶与经攻击动物的肺中SARS-CoV-2感染一致(图21)。简言之，肺实质展示多病灶以聚结由不受影响的实质包围的肺炎区域。肺泡损伤伴肺细胞坏死为感染区域的显著特征。此等区域内的肺泡间隙通常增厚且受损的肺泡壁含有混合性炎性细胞(包括巨噬细胞淋巴球、活及退化的嗜中性球及偶发性嗜酸性球)。亦观测到肺泡水肿及肺泡II型肺细胞增生。在远端小支气管及小支气管肺泡交接点处，存在上皮细胞的退化及松弛。在较大气管中，在呼吸道上皮细胞中观测到偶发性、病灶性上皮退化及松弛。低数目的包含嗜中性球、淋巴细胞及偶发性嗜酸性球的混合性炎性细胞浸润支气管及小支气管壁。在一些气管的内腔中可见与退化细胞(主要嗜中性球及上皮细胞)混杂的黏液。在实质内，亦观测到血管周及小支气管周围围管，主要为包含浸润物的淋巴细胞。在非肺部组织中未观测到显著变化。
与病毒RNA水平降低一致，使用组织病理学评分系统评估肺样品显示与经0.5μgCVnCoV疫苗接种及未经疫苗接种组相比，经CVnCoV疫苗接种动物中肺病灶的严重程度显著降低(图22A及B)。
在肺泡上皮细胞中及炎性细胞浸润物内观察到病毒RNA(图21)。当相比于0.5μgCVnCoV及未经疫苗接种时，借由原位杂合(ISH)观测到的病毒RNA的数量亦在经8μgCVnCoV疫苗接种的动物中显著降低(图22C)。
为获得在完整肺中SARS-CoV-2感染后诱导的病理性变化的活体视图，在研究第61天攻击前及攻击后执行CT扫描。总体而言，此等疾病的明显程度相对较轻且仅影响不到25％的肺。攻击后，在0.5μg CVnCoV组中6/6只动物中侦测到肺中的异常，在未经疫苗接种的对照组中5/6只动物侦测到肺中的异常，而经8μg CVnCoV疫苗接种的组中仅3/6只动物展现出可侦测变化。CT扫描中的总评分的最低水平见于经8μg CVCoV疫苗接种的动物中(图22D)。值得重视地，在此分析中最高评分见于0.5μg CVnCoV组中。然而，值在统计学上与对照组不同。
在评估攻击后临床病征时未侦测到疾病增强的指示，且发现组成物在恒河猕猴中具有高度免疫原性。后攻击或发烧的任何病征之间各组的体重或温度无明显差异。疫苗增强的疾病可由抗体(抗体依赖性增强疾病，ADE(综述于(Lee等人,2020)中)引起，如先前针对猫冠状病毒所描述(Olsen等人,1992)。此类抗体最可能具有非中和活性，且增强引起增加的病毒复制及疾病恶化的病毒进入。此处呈现的结果未指示经CVnCoV疫苗接种的动物中病毒复制增加。重要地，在研究的0.5μg组中，呼吸道或诸如脾、十二指肠、结肠、肝或肾的远端器官中的增强复制亦未侦测到。此等动物的S结合低水平但在攻击感染后具有不可侦测的VNT水平，从而产生ADE可假设出现的条件。
疾病增强的另一原因可为疫苗相关的增强的呼吸道疾病(VAERD)，其特征为借由由TH2偏压的免疫反应所致的增加的发炎及非中和抗体与中和抗体的高比率(综述于(Graham,2020)、(Lee等人,2020)、(Smatti等人,2018))。对经CVnCoV疫苗接种的动物中的肺病变的分析展现8μg CVnCoV具有保护作用且对次佳剂量的动物增加的发炎及病理性变化无明显的指示。
结果延伸吾等在SARS-CoV-2的高度相关模型系统中对CVnCoV安全性、免疫原性及保护功效的了解。在非人类灵长类动物的免疫原性、保护功效和病理学方面的研究总体结果与仓鼠模型的结果可比(参见实施例9)，为仓鼠作为SARS-CoV模型系统提供支持。因此，在COVID-19NHP攻击模型中CVnCoV在8μg的低剂量下高度有效，同时在两种剂量下测试为安全的，无任何疾病增强的迹象。
在另一类似NHP研究疫苗组成物中，分析且与CVnCoV(R9515)比较，该疫苗组成物包含调配于LNP中包含本发明形式的3'端(hSL-A100)及UTR组合(a-1(HSD17B4/PSMB3))的编码S_stab的mRNA(R9709)。
实施例16：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA疫苗接种小鼠
本实施例显示，含包含改良的非编码区的mRNA的SARS-CoV-2S mRNA疫苗诱导强免疫反应。一些其他小鼠组接受包含经化学修饰的核苷酸(N(1)-甲基假尿苷，m1ψ)的mRNA疫苗组成物。一组小鼠接受包含具有替代性帽(3'OME Clean Cap)产生的mRNA的mRNA疫苗组成物。更多细节指示于表22中。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
人类周边血液单核细胞(PBMC)的免疫刺激
人类PBMC的制备
借由标准Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Ficoll 1.078g/ml)自匿名供体的全血分离人类周边血液单核细胞(PBMC)。PBMC用PBS洗涤且再悬浮于补充有20％热去活化FCS、1％青霉素/链霉素及1％L-麸酰胺酸的RPMI 1640中。计数之后，细胞以50百万个细胞/毫升再悬浮于胎牛血清、10％DMSO中，且冷冻。使用之前，将细胞解冻。
PBMC刺激
在37℃下，在潮湿的5％C02大气中以200μl的总体积的4×105个细胞的密度用10μg/ml的经LNP调配的mRNA(表22，B-M列)刺激PBMC。为定量背景刺激，PBMC仅与培养基(表22，A列)一起培育。在转染24小时之后，收集上清液。
细胞介素水平的定量
根据制造商说明书使用来自PBL的IFNa ELISA定量人类IFNa。PBMC上清液以1:20或1:40稀释度使用，且50μl稀释度添加至50μl预填缓冲液中。
免疫接种：
如表22中所指示，向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，n＝8)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液(A组)疫苗接种。所有动物在第0天及第21天疫苗接种。在第21天(初打后)及42天(加打后)收集血液样品以测定抗体效价，在第42天分离脾细胞以用于T细胞分析。
表22：疫苗接种方案(实施例16)：
Figure GDA0003858923850003831
Figure GDA0003858923850003841
*mRNA R10160(K组)及R10161(L组)是用3'OME Clean Cap产生。
如实施例6中所描述，进行使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价、经由CPE(细胞病变效应)测定病毒中和效价。如实施例6中所描述，借由细胞内细胞介素染色(ICS)进行T细胞分析。
结果：
如图23A中所示，编码全场S稳定蛋白(S_stab)的mRNA诱导人类PBMC中不同的IFNa水平。对于大部分构筑体，诱导中等水平的IFNa，而包含经化学修饰的核苷酸的经LNP调配的mRNA不诱导IFNa。
用编码包含改良非编码区的全长S稳定蛋白(S_stab)的mRNA的疫苗接种在第一次疫苗接种之后第21天诱导强水平的病毒中和抗体效价(VNT)(图23B中所示)。所有mRNA疫苗组成物(C-G组，I-M组)具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA，显示出VNTs的此改良、早期及强诱导。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'端处。
引入经化学修饰的核苷酸(H、I、J、M组)产生可比的VNT。
第二次疫苗接种之后在第42天(图23C中所示)，大部分mRNA疫苗显示高效价VNT的稳健诱导。另外，CVnCoV，即包含具有3'端A64-N5-C30-hSL-N5的mRNA的疫苗组成物(B组)诱导极高的VNT。引入经化学修饰的核苷酸(m1ψ，H组)导致水平降低。所有mRNA疫苗组成物(C-G组，I-M组)具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA，显示出VNTs的此改良、早期及强诱导，与是否使用m1ψ无关。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'端处。
实施例17：用调配于LNP中编码SARS-CoV-2抗原S_stab的mRNA疫苗接种小鼠
本实施例显示，含包含改良的非编码区的mRNA的SARS-CoV-2S mRNA疫苗诱导强免疫反应。此研究比较「仅初打」与「加打」疫苗接种方案。一些小鼠组接受包含经化学修饰的核苷酸(N(1)-甲基假尿苷，m1ψ)的mRNA疫苗组成物。更多细节指示于表23中。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。用如实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种：
如表23中所指示，向雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，n＝8)肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物。作为阴性对照组，一组小鼠经缓冲液(K组)疫苗接种。动物在第0天仅疫苗接种一次(A-E组)，或在第0天及第21天疫苗两次(F-J组)。在第21天及42天收集血液样品以测定抗体效价，在第42天分离脾细胞以用于T细胞分析。
表23：疫苗接种方案(实施例17)：
Figure GDA0003858923850003851
Figure GDA0003858923850003861
如实施例6中所描述，经由CPE(细胞病变效应)进行病毒中和效价的测定。如实施例6中所描述，借由细胞内细胞介素染色(ICS)进行T细胞分析。
结果：
图24A显示在仅一次疫苗接种之后的VNT的诱导。如之前在实施例17中所示。mRNA疫苗组成物(A、D、E、G、I及J组)具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA，显示出VNTs的改良、早期及强诱导。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'末端处。
图24B说明在第42天仅一次疫苗接种(A-E组)之后或在两次疫苗接种(F-J组)之后的VNT的诱导。包含R9709的mRNA疫苗组成物(B组)在接受仅一次疫苗接种的组之间诱导最显著的VNT效价。包含R9709的疫苗组成物的强度可支持用于治疗或预防个体的针对冠状病毒，较佳SARS-CoV-2冠状病毒的免疫方案，其仅包含一种单一剂的组成物或疫苗。
mRNA疫苗组成物(A、D、E、G、I及J组)具有包含3'端「hSL-A100」或「A-100」的mRNA，显示出VNTs的改良、早期及强诱导。在此等构筑体中，多(A)序列直接位于RNA的3'端处。
实施例18：mRNA疫苗在针对SARS-CoV2感染的K18-hACE2小鼠模型中的功效
小鼠不易受SARS-CoV-2感染，但已研发出表现人类受体ACE2(hACE2)的经基因工程改造的小鼠模型，该人类受体ACE2为病毒在K18启动子下进入宿主细胞中所需。该模型最初经开发以研究SARS的病原体(SARS-CoV)(MCCRAY，Paul B.等人,「感染严重急性呼吸症候群冠状病毒的K18-hACE2小鼠的致死性感染(Lethal infection of K18-hACE2 miceinfected with severe acute respiratory syndrome coronavirus)」),病毒学杂志(Journal of virology),2007,81,Jg.,Nr.2,S.813-821)，但现亦用作为COVID-19的适合小动物模型。先前，hACE2小鼠已显示对SARS-CoV-2易感且展现出具有体重减轻、肺病变及类似于人类症状的症状的疾病(如BAO,Linlin等人，「SARS-CoV-2在hACE2转基因小鼠中的致病性(The pathogenicity of SARS-CoV-2in hACE2 transgenic mice)」,自然(Nature),2020,583.Jg.,Nr.7818,S.830-833或YINDA,Claude Kwe等人,「K18-hACE2小鼠发展成类似于重度COVID-19的呼吸系统疾病(K18-hACE2 mice develop respiratorydisease resembling severe COVID-19)」,公共科学图书馆病原体(PLoS pathogens)，2021,17.Jg.,Nr.1,S.e1009195；DE ALWIS,Ruklanthi M.等人,「基于单一剂自我转录的复制RNA的SARS-CoV-2疫苗在小鼠中产生保护性适应性免疫(A Single Dose of Self-Transcribing and Replicating RNA Based SARS-CoV-2Vaccine Produces ProtectiveAdaptive Immunity In Mice)」,BioRxiv,2020)。原则上，K18-hACE2小鼠适合于疫苗研究以研究SARS-CoV-2感染的预防或病毒负荷的降低，且同时用与公认免疫方法研究针对COVID-19的mRNA疫苗的保护效应的相关性及原因，所述方法一般可用于小鼠模型。
本实施例显示，SARS-CoV-2S mRNA疫苗在K18-hACE2小鼠中诱导强体液以及细胞免疫反应。SARS-CoV2 S mRNA疫苗保护K18-hACE2小鼠免于SARS-CoV2病毒攻击，其可例如借由量测所感染动物的病毒负荷、借由监测疾病进展与体重减轻、肺病变及其他症状或借由组织病理学及存活率显示。
经LNP调配的mRNA疫苗的制备：
SARS-CoV-2S mRNA构筑体如实施例1(RNA试管内转录)中所描述来制备。在活体内疫苗接种实验使用之前，用根据实施例1.4的LNP调配经HPLC纯化的mRNA。
免疫接种及攻击：
向K18-hACE2小鼠肌内(i.m.)注射mRNA疫苗组成物且剂量如表24所指示。作为阴性对照组，一组经缓冲液疫苗接种。作为对照组，一组肌内注射有明矾佐剂的20μl福尔马林去活化SARS-CoV-2病毒(106PFU)。所有动物在第0天及第28天疫苗接种。在第0天、第28天(初打后)及第56天(加打后，在攻击前)收集血液样品以测定抗体效价。动物在第56天用例105PFU SARS-CoV-2(Bavaria 1)经鼻内攻击。在攻击后四至十天追踪动物。
表24：疫苗接种方案(实施例18)：
Figure GDA0003858923850003891
如实施例6中所描述，进行使用ELISA测定IgG1及IgG2抗体效价、经由基于CPE(细胞病变效应)的微量中和分析测定病毒中和效价及借由细胞内细胞介素染色(ICS)进行T细胞分析。
如本发明实施例中所描述的K18-hACE2小鼠的免疫接种及攻击可用于测定其他本发明mRNA构筑体及组成物的保护功效。此外，借由使用突变病毒变异体或SARS-CoV-2分离株(例如B.1.351，亦参见表25)，其可以展示本发明mRNA疫苗组成物除针对此等突变病毒变异体或分离株以外有效。
实施例19：针对新兴SARS-CoV-2变异体的mRNA疫苗的中和活性
对来自20名1期临床试验参与者(年龄为18-60岁，男性及女性)的血清的中和活性进行测试，所述参与者接受两剂的2μg、4μg、8μg或12μg CVnCoV(参见实施例10关于临床研究概述)以针对新兴SARS-CoV-2变异体或分离株进行测试。在临床研究的第36天、第43天或第57天获得血清样品且展现出10-1280(MN25TCID50)范围的病毒中和抗体效价(VNT)，代表具有低(10-20)及具有高(452-1280)VNT的样品。
如例如针对在实施例9中仓鼠血清的分析所描述进行VNT分析，其中血清样品与新兴病毒变异体一起培育。病毒株SARS-CoV-2/人类/ITA/INMI1/2020或UVE/SARS-CoV-2/2020/FR/702可用作参考(「野生型病毒株」)。用于分析的新兴SARS-CoV-2变异体或分离株列举于表25中。可产生其他变异体且亦可测试所述变异体。
表25：新兴SARS-CoV-2变异体的清单(实施例19)：
Figure GDA0003858923850003901
中和亦可借由并入SARS-CoV-2变异体病毒株中存在的棘蛋白突变的基于重组VSV或慢病毒的假病毒中和(PsVN)检定量测。
结合抗体的能力可在如上文实施例10中的ELISA分析中测试，其中用于涂布的重组棘蛋白特征在于出现的病毒变异体的突变。
亦可在攻击模型中测试mRNA疫苗的功效，如例如在实施例17中针对hACE小鼠、在实施例15中针对NHP及在实施例9中针对仓鼠使用新兴SARS-CoV-2变异体进行攻击感染的描述。

Claims (275)

1.一种核酸，其包含至少一个编码序列，该至少一个编码序列编码来自或衍生自SARS-CoV-2冠状病毒的至少一种抗原肽或蛋白，或其免疫原性片段或免疫原性变异体，其中该核酸包含至少一个异源非转译区(UTR)。
2.如权利要求1的核酸，其中该核酸适用于疫苗。
3.如权利要求1或2的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由至少一种肽或蛋白组成，该至少一种肽或蛋白为或衍生自结构蛋白、辅助蛋白或复制酶蛋白或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体。
4.如权利要求3的核酸，其中该结构蛋白为或衍生自棘蛋白(S)、套膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核酸蛋白壳体蛋白(N)或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体。
5.如权利要求1至4中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白为或衍生自棘蛋白(S)或其免疫原性片段或免疫原性变异体。
6.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
7.如权利要求4至6中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)包含或由棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体组成。
8.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1-27、29、31-48、58-111、274-1345、1480-1546、1614-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
9.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：27、1279-1345、29、1480-1546、13243-13309、22733-22736、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
10.如权利要求4至9中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)包含或由以下者组成：棘蛋白片段S1或其免疫原性片段或免疫原性变异体，及棘蛋白片段S2或其免疫原性片段或免疫原性变异体。
11.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1-26、31-48、58-111、274-1278、1614-11663、13377-13510、13521-14177、22732、22737-22758、22929-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
12.如权利要求4至11中任一项的核酸，其中该棘蛋白(S)为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
13.如权利要求12的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含以下氨基酸取代：K986P及V987P。
14.如权利要求12或13的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含空腔填充突变。
15.如权利要求14的核酸，其中该至少一个空腔填充突变是选自包含T887W；A1020W；T887W及A1020W；或P1069F的清单。
16.如权利要求12至15中任一项的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变包含突变的质子化位点。
17.如权利要求16的核酸，其中该至少一个突变的质子化位点是选自包含H1048Q及H1064N；H1083N及H1101N；或H1048Q及H1064N及H1083N及H1101N的清单。
18.如权利要求12至17中任一项的核酸，其中该至少一个融合前稳定性突变产生至少一个人工分子内双硫键。
19.如权利要求18的核酸，其中该至少一个人工分子内双硫键是借由以下氨基酸取代产生：I712C及T1077C；I714C及Y1110C；P715C及P1069C；G889C及L1034C；I909C及Y1047C；Q965C及S1003C；F970C及G999C；A972C及R995C；A890C及V1040C；T874C及S1055C或N914C及S1123C。
20.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10-26、40-48、85-111、341-1278、1681-2618、2686-3623、3691-4628、4696-5633、5701-6638、6706-7643、7711-8648、8716-9653、9721-10658、10726-11663、13377-13510、13521-14123、22732、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
21.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10-26、341-407、609-1278、13521-13587、22738、22740、22742、22744、22746、22748、22750、22752、22754、22756、22758、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
22.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列另外编码选自以下者的一或多种异源肽或蛋白元件：信号肽、连接子、辅助表位、抗原簇聚元件、三聚元件、跨膜元件及/或VLP形成序列。
23.如权利要求22的核酸，其中该至少一种异源肽或蛋白元件为异源抗原簇聚元件、异源三聚元件及/或VLP形成序列。
24.如权利要求22或23的核酸，其中该至少一种异源抗原簇聚元件是选自铁蛋白元件、二氧四氢喋啶(lumazine)合酶元件、B型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或囊封素(encapsulin)。
25.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：58-75、85-102、3624-5633、7644-9653、13588-13721、13856-13989、22733、22735、22736中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
26.如权利要求22或23的核酸，其中该至少一种异源三聚元件为折叠子(folden)元件，较佳纤维蛋白(fibritin)折叠子元件。
27.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：76-84、103-111、5634-6638、9654-10658、13722-13788、13990-14056、22734、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
28.如权利要求22或23的核酸，其中该至少一种VLP形成序列为土拨鼠肝炎核心抗原元件(WhcAg)。
29.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6639-7643、10659-11663、13789-13855、14057-14123中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
30.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1、10、21、22、25、27、274、341、408、475、542、743、810、1011、1145、1212、1279、8716、10726、22732-22758、22929-22942、22947-22964中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
31.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白包含或由以下氨基酸序列中的至少一者组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：10、22960、22961或22963中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
32.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由至少一种核酸序列组成，该至少一种核酸序列与SEQ ID NO：116-132、134-138、140-143、145-175、11664-11813、11815、11817-12050、12052、12054-13147、13514、13515、13519、13520、14124-14177、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23184、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
33.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一种抗原肽或蛋白是包含融合前稳定性K986P及V987P突变的S蛋白，其包含或由氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：10或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致。
34.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列为密码子经修饰的编码序列，其中与借由对应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，借由至少一个密码子经修饰的编码序列编码的该氨基酸序列较佳未经修饰。
35.如权利要求34的核酸，其中该至少一个密码子经修饰的编码序列是选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人类密码子使用调适编码序列、G/C含量修饰的编码序列及G/C最佳化编码序列，或其任何组合。
36.如权利要求34或35的核酸，其中该至少一个密码子经修饰的编码序列为G/C最佳化编码序列、人类密码子使用调适编码序列或G/C含量修饰的编码序列。
37.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由G/C最佳化编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO：136-138、140、141、148、149、152、155、156、159、162、163、166、169、170、173、11731-11813、11815、11817-11966、12271-12472、12743-12944、13514、13515、14124-14132、14142-14150、14160-14168、22759、22764-22786、22791-22813、22818-22839、22969-23040、23077-23148、23189-23260、23297-23368、23409-23480、23517-23588、23629-23700、23737-23808、23849-23920、23957-24028、24069-24140、24177-24248、24289-24360、24397-24468、24509-24580、24617-24688、24729-24800、24837-24908、24949-25020、25057-25128、25169-25240、25277-25348、25389-25460、25497-25568、25609-25680、25717-25788、25829-25900、25937-26008、26049-26120、26157-26228、26269-26340、26377-26448、26489-26560、26597-26668、26709-26780、26817-26888、26925-26937中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
38.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由人类密码子使用调适编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO：142、143、145、150、153、157、160、164、167、171、174、11967-12033、12473-12539、12945-13011中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
39.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列包含或由G/C含量修饰的编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO：146、147、151、154、158、161、165、168、172、175、12034-12050、12052、12054-12203、12540-12675、13012-13147、13519、13520、14133-14141、14151-14159、14169-14177、23041-23076、23149-23184、23261-23296、23369-23404、23481-23516、23589-23624、23701-23736、23809-23844、23921-23956、24029-24064、24141-24176、24249-24284、24361-24396、24469-24504、24581-24616、24689-24724、24801-24836、24909-24944、25021-25056、25129-25164、25241-25276、25349-25384、25461-25496、25569-25604、25681-25716、25789-25824、25901-25936、26009-26044、26121-26156、26229-26264、26341-26376、26449-26484、26561-26596、26669-26704、26781-26816、26889-26924中的任一者或此等序列中的任一者的片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
40.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列的G/C含量为至少约50％、55％或60％，较佳约63.9％。
41.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个编码序列编码包含融合前稳定性K986P及V987P突变的S蛋白，其中该编码序列包含或由G/C最佳化编码序列组成，该编码序列包含核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO：137、23090、23091、23093、23094或其片段或变异体一致。
42.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该至少一个异源非转译区是选自至少一个异源5′-UTR及/或至少一个异源3′-UTR。
43.如权利要求42的核酸，其中该至少一个异源3′-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列衍生自选自以下者的基因的3′-UTR：PSMB3、ALB7、α-球蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1及RPS9，或此等基因中的任一者的同源物、片段或变异体。
44.如权利要求42的核酸，其中该至少一个异源5′-UTR包含或由核酸序列组成，该核酸序列衍生自选自以下者的基因的5′-UTR：HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B及UBQLN2，或此等基因中的任一者的同源物、片段或变异体。
45.如权利要求42的核酸，其中该至少一个异源5′-UTR及该至少一个异源3′UTR是选自UTR设计a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、e-2(RPL31/RPS9)及i-3(-/muag)，其中UTR设计a-1(HSD17B4/PSMB3)及i-3(-/muag)是尤其较佳的。
46.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含至少一个多(A)序列，较佳包含30至200个腺苷核苷酸及/或至少一个多(C)序列，较佳包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
47.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含至少一个组蛋白茎-环。
48.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为DNA或RNA。
49.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为编码RNA。
50.如权利要求49的核酸，其中该编码RNA为mRNA、自我复制RNA、环状RNA或复制子RNA。
51.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸，较佳该编码RNA，为mRNA。
52.如权利要求51的核酸，其中该mRNA不是复制子RNA或自我复制RNA。
53.如权利要求51的核酸，其中该mRNA包含至少一个包含30至200个腺苷核苷酸的多(A)序列，且3′末端核苷酸为腺苷。
54.如权利要求48至51中任一项的核酸，其中该RNA，较佳该编码RNA，包含5′-帽结构，较佳m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构，较佳5′-帽1结构。
55.如权利要求48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5′-至3′-方向包含下列元件：
A)5′-帽1结构；
B)根据SEQ ID NO.137的编码序列或其片段或变异体；
C)较佳根据SEQ ID NO：267或268的衍生自α-球蛋白基因的3′-UTR的3′-UTR；
D)包含约64个A核苷酸的多(A)序列；
E)包含约30个C核苷酸的多(C)序列；
F)根据SEQ ID NO：178或179的组蛋白茎-环。
56.如权利要求48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5′-至3′-方向包含下列元件：
A)5′-帽1结构；
B)较佳根据SEQ ID NO：231或232的衍生自HSD17B4基因的5′-UTR的5′-UTR；
C)根据SEQ ID NO.137的编码序列或其片段或变异体；
D)较佳根据SEQ ID NO：253或254的衍生自PSMB3基因的3′-UTR的3′-UTR；
E)选自SEQ ID NO：178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列。
57.如权利要求56的核酸，其中该3′末端核苷酸为腺苷。
58.如权利要求48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5′-至3′-方向包含下列元件：
A)5′-帽1结构；
B)根据SEQ ID NO.23090或23091的编码序列或其片段或变异体；
C)较佳根据SEQ ID NO：267或268的衍生自α-球蛋白基因的3′-UTR的3′-UTR；
D)包含约64个A核苷酸的多(A)序列；
E)包含约30个C核苷酸的多(C)序列；
F)根据SEQ ID NO：178或179的组蛋白茎-环。
59.如权利要求48至54中任一项的核酸，其中该核酸、较佳该mRNA依5′-至3′-方向包含下列元件：
A)5′-帽1结构；
B)较佳根据SEQ ID NO：231或232的衍生自HSD17B4基因的5′-UTR的5′-UTR；
C)根据SEQ ID NO.23090或23091的编码序列或其片段或变异体；
D)较佳根据SEQ ID NO：253或254的衍生自PSMB3基因的3′-UTR的3′-UTR；
E)选自SEQ ID NO：178或179的组蛋白茎-环；
F)包含约100个A核苷酸的多(A)序列。
60.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO：148-175、12204-13147、14142-14177、22786-22839、23189-23404、23409-23624、23629-23844、23849-24064、24069-24284、24289-24504、24509-24724、24729-24944、24949-25164、25169-25384、25389-25604、25609-25824、25829-26044、26049-26264、26269-26484、26489-26704、26709-26937148组成的群的核酸序列或此等序列中的任一者的片段或变异体。
61.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与以下者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致：选自由SEQ ID NO：149、156、12338、150、157、151、158、12541、163、170、12810、164、171、165、172、13013、12342-12351、12545-12554、12814-12823、13017-13026、14133组成的群的核酸序列或此等序列中的任一者的片段或变异体，较佳选自SEQ ID NO：149、150、151、163、164、165或此等序列中的任一者的片段或变异体。
62.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自SEQ ID NO：163的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
63.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自SEQ ID NO：149的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
64.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自SEQ ID NO：24837的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
65.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自由SEQ ID NO：23311、23531、24851组成的群的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
66.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自由SEQ ID NO：23310、23530、24850组成的群的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
67.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸包含或由核酸序列、较佳RNA序列组成，该序列与选自由SEQ ID NO：23313、23533、24853、23314、23534、24854组成的群的核酸序列或其片段或变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
68.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为不包含1-甲基假尿苷取代的RNA。
69.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为不包含经化学修饰的核苷酸的RNA。
70.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为试管内转录RNA，其中RNA试管内转录已在序列最佳化核苷酸混合物及帽类似物存在下进行，较佳其中该序列最佳化核苷酸混合物不包含经化学修饰的核苷酸。
71.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，较佳为已借由RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA。
72.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，其已借由RP-HPLC及/或TFF纯化且包含比尚未用RP-HPLC及/或TFF纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
73.如前述权利要求中任一项的核酸，其中该核酸为经纯化的RNA，其已借由RP-HPLC及/或TFF纯化且包含比已用Oligo dT纯化、沉淀、过滤及/或阴离子交换层析纯化的RNA少约5％、10％或20％的双股RNA副产物。
74.一种组成物，其包含至少一种如权利要求1至73中任一项的核酸，其中该组成物视需要包含至少一种医药学上可接受的载剂。
75.如权利要求74的组成物，其中该组成物包含根据SEQ ID NO：149、163、24837、23311、23531、23310、23530、23313或23533的mRNA或此等序列中的任一者的片段或变异体。
76.如权利要求74的组成物，其中该组成物为包含多种或至少多于一种如权利要求1至73中任一项的核酸的多价组成物。
77.如权利要求76的组成物，其中所述多价组成物的多种或至少多于一种核酸序列各自编码不同的棘蛋白，较佳融合前稳定化棘蛋白。
78.如权利要求77的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白是衍生自不同SARS-CoV-2病毒变异体/分离株。
79.如权利要求78的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白是至少衍生自B.1.1.7、B.1.351、P.1或CAL.20C。
80.如权利要求78的组成物，其中所述不同的棘蛋白或融合前稳定化棘蛋白在S蛋白中具有氨基酸变化，所述氨基酸变化包含：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V；
(iv)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I；及/或
(v)S13I、W152C、L452R及D614G。
81.如权利要求76至78中任一项的组成物，其中该多价组成物包含至少两种核酸物种，所述核酸物种包含编码氨基酸序列的编码序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：10、22961；22960、22963、22941、22964中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
82.如权利要求76至78中任一项的组成物，其中该多价组成物包含至少两种RNA物种，所述RNA物种与SEQ ID NO：149或24837、23531或24851、23530或24850、23533或24853、23439或24759或23534或24854中的任一者一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
83.如权利要求74至80中任一项的组成物，其中该组成物包含具有70％或更高的RNA完整性的mRNA。
84.如权利要求74至83中任一项的组成物，其中该组成物包含具有70％或更高的加帽度的mRNA，较佳其中至少70％、80％或90％的所述mRNA物种包含帽1结构。
85.如权利要求74至84中任一项的组成物，其中该至少一种核酸与一或多种阳离子或聚阳离子化合物，较佳阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或缔合或至少部分复合或部分缔合。
86.如权利要求85的组成物，其中该至少一种核酸是与一或多种脂质或基于脂质的载体复合或缔合，从而形成脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、脂复合体(lipoplex)及/或纳米脂质体，较佳囊封该至少一种核酸。
87.如权利要求85或86的组成物，其中该至少一种核酸与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子。
88.如权利要求86或87的组成物，其中该LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
Figure FPA0000324413920000151
89.如权利要求86至88中任一项的组成物，其中该LNP包含式(IVa)的PEG脂质：
Figure FPA0000324413920000152
其中n具有范围为30至60的平均值，较佳其中n具有约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54的平均值，最佳其中n具有49或45的平均值。
90.如权利要求86至88中任一项的组成物，其中该LNP包含式(IVa)的PEG脂质：
Figure FPA0000324413920000161
其中n为经选择以使得该PEG脂质的平均分子量为约2500g/mol的整数。
91.如权利要求86至90中任一项的组成物，其中该LNP包含一或多种中性脂质及/或一或多种类固醇或类固醇类似物。
92.如权利要求91的组成物，其中该中性脂质为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，较佳其中该阳离子脂质与DSPC的摩尔比在约2∶1至约8∶1范围内。
93.如权利要求91的组成物，其中该类固醇为胆固醇，较佳其中该阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约2∶1至约1∶1范围内。
94.如权利要求86至93中任一项的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质，较佳式(III)的脂质，更佳脂质III-3；
(ii)至少一种中性脂质，较佳1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种聚合物共轭脂质，较佳衍生自式(IVa，其中n＝49)的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
95.如权利要求86至93中任一项的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质，较佳式(III)的脂质，更佳脂质III-3；
(ii)至少一种中性脂质，较佳1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，较佳胆固醇；及
(iv)至少一种聚合物共轭脂质，较佳衍生自式(IVa，其中n＝45)的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
96.如权利要求94或95的组成物，其中(i)至(iv)的摩尔比为约50∶10∶38.5∶1.5，较佳47.5∶10∶40.8∶1.7或更佳47.4∶10∶40.9∶1.7。
97.如权利要求87至96中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且该组成物包含小于约20％游离(未经复合或未经囊封)RNA，较佳小于约15％游离RNA，更佳小于约10％游离RNA。
98.如权利要求87至97中任一项的组成物，其中脂质与核酸的wt/wt比为约10∶1至约60∶1，较佳约20∶1至约30∶1，例如约25∶1。
99.如权利要求87至98中任一项的组成物，其中所述囊封核酸的LNP的n/p比率是在约1至约10范围内，较佳在约5至约7范围内，更佳为约6。
100.如权利要求87至99中任一项的组成物，其中该组成物的多分散性指数(PDI)值为小于约0.4，较佳小于约0.3，更佳小于约0.2，最佳小于约0.1。
101.如权利要求86至100中任一项的组成物，其中所述LNP的Z平均尺寸在约60nm至约120nm范围内，较佳小于约120nm，更佳小于约100nm，最佳小于约80nm。
102.如权利要求86至101中任一项的组成物，其中所述LNP包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％具有超过约500nm的粒度的LNP。
103.如权利要求86至102中任一项的组成物，其中所述LNP包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％具有小于约20nm的粒度的LNP。
104.如权利要求86至103中任一项的组成物，其中至少约80％、85％、90％、95％基于脂质的载体具有球形形态，较佳包含实心核心或部分实心核心。
105.如权利要求86至104中任一项的组成物，其中该组成物的浊度在约150FNU至约0.0FNU范围内，较佳为约50FNU或以下，更佳为约25FNU或以下。
106.如权利要求74至105中任一项的组成物，其进一步包含浓度为约50至约300mM的糖，较佳浓度为约150mM的蔗糖。
107.如权利要求74至106中任一项的组成物，其进一步包含浓度为约10mM至约200mM的盐，较佳浓度为约75mM的NaCl。
108.如权利要求74至107中任一项的组成物，其进一步包含浓度为1mM至约100mM的缓冲剂，较佳浓度为约10mM的Na3PO4。
109.如权利要求74至108中任一项的组成物，其中该组成物的pH在约pH 7.0至约pH8.0范围内，较佳约pH 7.4。
110.如权利要求86至109中任一项的组成物，其包含囊封编码SARS-CoV-2S蛋白的RNA的脂质纳米粒子，该蛋白包含融合前稳定性K986P及V987P突变，其中所述LNP包含
(i)式III-3的阳离子脂质；
(ii)1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)胆固醇；及
(iv)式IVa的PEG脂质(n＝49))，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4％阳离子脂质、10％DSPC、40.9胆固醇、1.7％PEG脂质；
其中该RNA与SEQ ID NO.163或149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中该RNA未经化学修饰；
其中该RNA包含5′-帽1结构；
其中该RNA的完整性为至少约70％；
其中所述囊封RNA的LNP的n/p比率为约6；
其中所述囊封RNA的LNP的Z平均尺寸为约60nm至约120nm；
其中该组成物包含小于约20％的游离(未经复合；未经囊封)RNA；
视需要，其中该组成物进一步包含浓度为约150mM的蔗糖、浓度为约75mM的NaCl、浓度为约10mM的Na3PO4；
视需要，其中该组成物的pH为约pH 7.4。
111.如权利要求86至109中任一项的组成物，其包含囊封编码SARS-CoV-2 S蛋白的RNA的脂质纳米粒子，该蛋白包含融合前稳定性K986P及V987P突变，其中所述LNP包含
(i)式III-3的阳离子脂质；
(ii)1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)胆固醇；及
(iv)式IVa的PEG脂质(n＝45))，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.4％阳离子脂质、10％DSPC、40.9胆固醇、1.7％PEG脂质；
其中该RNA与SEQ ID NO.163或149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致；
其中该RNA未经化学修饰；
其中该RNA包含5′-帽1结构；
其中该RNA的完整性为至少约70％；
其中所述囊封RNA的LNP的n/p比率为约6；
其中所述囊封RNA的LNP的Z平均尺寸为约60nm至约120nm；
其中该组成物包含小于约20％的游离(非复合)RNA；
视需要，其中该组成物进一步包含浓度为约150mM的蔗糖、浓度为约75mM的NaCl、浓度为约10mM的Na3PO4；
视需要，其中该组成物的pH为约pH 7.4。
112.如权利要求86至110中任一项的组成物，其包含未经化学修饰的RNA，该未经化学修饰的RNA与在脂质纳米粒子(LNP)中调配的SEQ ID NO.163的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，
所述LNP具有大约50∶10∶38.5∶1.5，较佳47.5∶10∶40.8∶1.7或更佳47.4∶10∶40.9∶1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质。
113.如权利要求86至110中任一项的组成物，其包含未经化学修饰的RNA，该未经化学修饰的RNA与在脂质纳米粒子(LNP)中调配的SEQ ID NO.149的核酸序列一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，所述LNP具有大约50∶10∶38.5∶1.5，较佳47.5∶10∶40.8∶1.7或更佳47.4∶10∶40.9∶1.7比例(mol％)的摩尔比的阳离子脂质III-3、DSPC、胆固醇及式(IVa)的PEG脂质。
114.如权利要求74至112中任一项的组成物，其中该组成物包含编码SARS-CoV-2棘蛋白(S)的mRNA，该棘蛋白(S)为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
115.如权利要求114的组成物，其中该mRNA编码与SEQ ID NO：163至少95％一致的SARS-CoV-2棘蛋白或编码与SEQ ID NO：163一致的冠状病毒棘蛋白。
116.如权利要求114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；及
(iv)至少一种PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
117.如权利要求114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
118.如权利要求114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5∶10∶40.8∶1.7。
119.如权利要求114的组成物，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4∶10∶40.9∶1.7。
120.如权利要求107至118中任一项的组成物，其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
121.如权利要求120的组成物，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5∶10∶40.8∶1.7，且其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
122.如权利要求120的组成物，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含：
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iV)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4∶10∶40.9∶1.7，且其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
123.如权利要求74至99或110至122中任一项的组成物，其中该组成物为冻干组成物。
124.如权利要求123的组成物，其中该冻干组成物的含水量为小于约10％。
125.如权利要求124的组成物，其中该冻干组成物的含水量在约0.5％与5％之间。
126.如权利要求86至122中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定至少约两周。
127.如权利要求126的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定至少1个月。
128.如权利要求126的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物在约5℃的温度下以液体形式储存之后稳定约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。
129.如权利要求126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少约两周，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
130.如权利要求129的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后至少1个月，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
131.如权利要求126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存之后约2周至约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年，至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA为完整的。
132.如权利要求126的组成物，其中该核酸为RNA且其中在约5℃的温度下以液体形式储存约两周之后，至少80％的RNA为完整的。
133.如权利要求86至132中任一项的组成物，其中该组成物包含聚集减少脂质。
134.如权利要求86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA的浓度在约10μg/ml至约10mg/ml范围内，较佳在约100μg/ml至约1mg/ml范围内。
135.如权利要求86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA的浓度为至少100μg/ml，更佳至少200μg/ml，最佳至少500μg/ml。
136.如权利要求86至135中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA具有至少约50％，较佳至少约60％，更佳至少约70％，最佳至少约80％的RNA完整性。
137.如权利要求86至136中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物包含小于约20％游离RNA，较佳小于约15％游离RNA，更佳小于约10％游离RNA。
138.如权利要求86至137中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该组成物包含每g RNA小于约100nM二价阳离子，较佳每g RNA小于约50nM二价阳离子，更佳每g RNA小于约10nM二价阳离子。
139.如权利要求138的组成物，其中所述二价阳离子是选自Mg2+及/或Ca2+。
140.如权利要求86至139中任一项的组成物，其中脂质的浓度在约250μg/ml至约250mg/ml范围内，较佳在约2.5mg/ml至约25mg/ml范围内。
141.如权利要求86至140中任一项的组成物，其中脂质的浓度为至少约2.5mg/ml，较佳至少5mg/ml，更佳至少12.5mg/ml。
142.如权利要求133至142中任一项的组成物，其中聚集减少脂质的浓度在约17.5μg/ml至约17.5mg/ml范围内，较佳在约175μg/ml至约1.75mg/ml范围内。
143.如权利要求133至142中任一项的组成物，其中聚集减少脂质的浓度为至少约175μg/ml，较佳至少约350μg/ml，更佳至少875μg/ml。
144.如权利要求86至143中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中脂质与RNA的wt/wt比为约10∶1至约60∶1，较佳约20∶1至约30∶1，更佳约25∶1。
145.如权利要求86至144中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中基于脂质的载体与RNA的N/P比率在约1至约10范围内，较佳在约5至约7范围内，更佳为约6。
146.如权利要求86至143中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中所述囊封RNA的基于脂质的载体包含摩尔比率为约0.5％-15％，较佳摩尔比率为约1.0％至约2.5％，更佳摩尔比率为约1.7％的聚集减少脂质。
147.如权利要求133至143中任一项的组成物，其中该聚集减少脂质为聚合物共轭脂质，例如PEG共轭脂质。
148.如权利要求86至147中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA及囊封RNA的基于脂质的载体已借由至少一个纯化步骤，较佳借由至少一个TFF步骤及/或至少一个澄清步骤及/或至少一个过滤步骤纯化。
149.如权利要求86至148中任一项的组成物，其中该组成物包含小于约500ppM乙醇，较佳小于约50ppM乙醇，更佳小于约5ppM乙醇。
150.如权利要求86至154中任一项的组成物，其中该组成物的容积渗透浓度(osmolarity)为约250mOsmol/kg至约450mOsmol/kg，较佳为约335mOsmol/kg。
151.如权利要求86至150中任一项的组成物，其中该组成物在约25℃下以液体形式储存之后稳定至少1周，较佳至少2周，更佳至少3周，最佳至少4周。
152.如权利要求86至151中任一项的组成物，其中该组成物在约40℃下以液体形式储存之后稳定至少1天，较佳至少2天，更佳至少3天，最佳至少4天。
153.如权利要求86至152中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该RNA的完整性降低小于约30％，较佳小于约20％，更佳小于约10％。
154.如权利要求86至153中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，游离RNA的量增加不超过10％，较佳不超过5％。
155.如权利要求86至154中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中在以液体形式储存时，所述囊封RNA的基于脂质的载体的PDI值增加不超过约0.2的值，较佳不超过约0.1的值。
156.如权利要求86至155中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中在以液体形式储存时，所述囊封RNA的基于脂质的载体的Z平均尺寸增加不超过20％，较佳不超过10％。
157.如权利要求86至156中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该组成物的浊度增加不超过20％，较佳不超过10％。
158.如权利要求86至157中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，pH及/或重量渗透浓度(osmolality)增加或减少不超过20％，较佳不超过10％。
159.如权利要求86至158中任一项的组成物，其中在以液体形式储存时，该组成物的效力降低小于约30％，较佳小于约20％，更佳小于约10％。
160.如权利要求86至133中任一项的组成物，其中该核酸为RNA且其中该RNA为经纯化的RNA，较佳RP-HPLC纯化的RNA及/或切向流过滤(TFF)纯化的RNA。
161.如权利要求74至160中任一项的组成物，其另外包含至少一种RNA感应样式辨识受体的至少一种拮抗剂，较佳TLR7受体及/或TLR8受体的至少一种拮抗剂。
162.如权利要求161的组成物，其中该TLR7受体及/或TLR8受体的至少一种拮抗剂为单股寡核苷酸，较佳p5′-GAG CGmG CCA-3′。
163.一种用于疫苗的多肽，其包含至少一种为或衍生自冠状病毒SARS-CoV-2的抗原肽或蛋白，或其免疫原性片段或免疫原性变异体，较佳其中该抗原肽或蛋白的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：1-111、274-11663、13176-13510、13521-14123、22732-22758、22917、22923、22929-22964、26938、26939中的任一者或此等中的任一者的免疫原性片段或免疫原性变异体一致或至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
164.一种疫苗，其包含如权利要求1至73中任一项的核酸及/或如权利要求74至162中任一项的组成物及/或如权利要求163的多肽。
165.如权利要求164的疫苗，其中该疫苗引发适应性免疫反应，较佳针对冠状病毒，较佳针对冠状病毒SARS-CoV-2的保护性适应性免疫反应。
166.如权利要求164或165的疫苗，其中该疫苗为多价疫苗，其包含多种或至少多于一种如权利要求1至73中任一项的核酸或多种或至少多于一种如权利要求74至162中任一项的组成物。
167.一种套组或部件套组(kit of parts)，其包含如权利要求1至73中任一项的核酸，及/或如权利要求74至162中任一项的组成物，及/或如权利要求163的多肽，及/或如权利要求164至166的疫苗，视需要包含用于溶解的液体媒剂，且视需要包含提供关于所述组分的投予及剂量的资讯的技术说明书。
168.一种如权利要求1至73中任一项的核酸、如权利要求74至162中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗、如权利要求167的套组或部件套组，其用作医药品。
169.一种如权利要求1至73中任一项的核酸、如权利要求74至162中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗、如权利要求167的套组或部件套组，其用于治疗或预防冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒感染或与此类感染相关的病症，较佳COVID-19。
170.一种治疗或预防病症的方法，其中该方法包含向有需要的个体施用或投予如权利要求1至73中任一项的核酸、如权利要求74至162中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗及/或如权利要求167的套组或部件套组。
171.如权利要求170的治疗或预防病症的方法，其中该病症为冠状病毒感染，较佳SARS-CoV-2冠状病毒感染或与此类感染相关的病症，较佳COVID-19。
172.如权利要求170或171的治疗或预防病症的方法，其中该有需要的个体为哺乳动物个体，较佳人类个体。
173.如权利要求170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体为老年人类个体，较佳年龄为至少50、60、65或70岁。
174.如权利要求173的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体的年龄为61岁或更大。
175.如权利要求170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体的年龄为18至60岁。
176.如权利要求170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该个体怀孕。
177.如权利要求170至175中任一项的方法，其中不超过25％的个体在第一剂的该组成物之后经历3级全身不良事件，或其中不超过30％的个体在第一剂的该组成物之后经历2级或更高局部不良事件。
178.如权利要求170至175中任一项的方法，其中不超过40％的个体在第二剂的该组成物之后经历3级全身不良事件。
179.如权利要求170至172中任一项的治疗或预防病症的方法，其中该人类个体为新生儿或婴儿，较佳年龄不超过3岁、不超过2岁、不超过1.5岁、不超过1岁(12个月)、不超过9个月、6个月或3个月，或年龄在6个月与2岁之间。
180.如权利要求170的方法，其进一步定义为减轻该个体中的疾病负荷的方法。
181.如权利要求180的方法，其中该方法减轻COVID-19疾病的一或多种症状的严重程度。
182.如权利要求181的方法，其中该方法降低该个体将需要住院、住进加护病室、用补充氧气治疗及/或用呼吸器治疗的机率。
183.如权利要求181的方法，其中该方法降低该个体将发展成重度或中度COVID-19疾病的机率。
184.如权利要求181的方法，其中该方法预防该个体中的重度COVID-19疾病至少约6个月。
185.如权利要求184的方法，其中该方法在该个体曝露于与SEQ ID NO：1相比在S蛋白中具有至少第一氨基酸变化的SARS CoV-2变异体时，预防该个体中的重度COVID-19疾病。
186.如权利要求185的方法，其中该SARS CoV-2变异体在S蛋白中具有氨基酸变化，所述变化包含：
(i)delH69、delV70、Y453F、D614G、I692V及M1229I；
(ii)delH69、delV70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A及D1118H；
(iii)L18F、D80A、D215G、delL242、delA243、delL244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G及A701V；
(iV)L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y及T1027I；及/或
(v)S13I、W152C、L452R及D614G。
187.如权利要求181的方法，其中该方法降低该个体将产生发烧、呼吸困难；嗅觉丧失及/或味觉丧失的机率。
188.如权利要求181的方法，其中该方法降低该个体将产生发烧、呼吸困难；嗅觉丧失及/或味觉丧失的机率。
189.如权利要求170的方法，其中该个体患有疾病或为免疫功能不全的。
190.如权利要求189的方法，其中该个体患有肝病、肾病、糖尿病、高血压、心脏病、肺病、癌症或为HIV阳性。
191.如权利要求170的方法，其中该个体在过去6个月内尚未用免疫抑制剂药物治疗超过14天。
192.如权利要求170的方法，其中该个体在该投予之前至少28天尚未接受活疫苗及/或在该投予之前至少14天尚未接受不活化疫苗。
193.一种刺激个体中的免疫反应的方法，其中该方法包含向该个体投予至少第一组成物，该第一组成物包含如权利要求1至73中任一项的核酸，较佳mRNA、如权利要求74至162中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗，及/或如权利要求167的套组或部件套组。
194.如权利要求193的方法，其中该个体先前感染了SARS CoV-2。
195.如权利要求193的方法，其中该个体先前用至少第一SARS CoV-2疫苗组成物治疗。
196.如权利要求195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为mRNA疫苗。
197.如权利要求196的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为BNT162或mRNA-1273。
198.如权利要求195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为蛋白次单位疫苗。
199.如权利要求198的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为NVX-CoV2373或COVAX。
200.如权利要求195的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为腺病毒载体疫苗。
201.如权利要求200的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物为ADZ1222或Ad26.COV-2.S。
202.如权利要求193至201中任一项的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2结合抗体。
203.如权利要求202的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2S蛋白结合抗体。
204.如权利要求202的方法，其中该个体具有可侦测的SARS CoV-2N蛋白结合抗体。
205.如权利要求195至201中任一项的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物是在至少约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年前向该患者投予。
206.如权利要求195至201中任一项的方法，其中该第一SARS CoV-2疫苗组成物是在约3个月至2年前或在约6个月至2年前向该患者投予。
207.如权利要求193至206中任一项的方法，其中该方法预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
208.如权利要求207的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约1年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
209.如权利要求207的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
210.如权利要求193至209中任一项的方法，其中该方法在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARS CoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
211.如权利要求210的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约1年，在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARSCoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
212.如权利要求211的方法，其中该方法在该投予之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年，在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经治疗个体中预防该个体感染SARS CoV-2及/或预防来自该个体的SARS CoV-2传播。
213.如权利要求193至212中任一项的方法，其进一步包含向该个体投予至少第二组成物，该第二组成物包含如权利要求1至61中任一项的核酸，较佳mRNA、如权利要求74至128中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗，及/或如权利要求167的套组或部件套组。
214.如权利要求213的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后至少约7天投予。
215.如权利要求214的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后至少约10天、14天、21天、28天、35天、42天、49天或56天投予。
216.如权利要求213的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后约7天与约56天之间投予。
217.如权利要求216的方法，其中该第二组成物在该第一组成物之后约14天与约56天；约21天与约56天；或约28天与约56天之间投予。
218.如权利要求193至212中任一项的方法，其进一步包含向该个体投予至少第三组成物，该第三组成物包含如权利要求1至61中任一项的核酸、如权利要求74至162中任一项的组成物、如权利要求163的多肽、如权利要求164至166的疫苗，及/或如权利要求167的套组或部件套组。
219.如权利要求213至218中任一项的方法，其中该方法预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
220.如权利要求219的方法，其中该方法在投予该第二或后续组成物之后约2周至约1年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
221.如权利要求219的方法，其中该方法在投予该第二或后续组成物之后约2周至约3个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年或3年预防至少80％、85％、90％或95％的经治疗个体中的中度及重度COVID-19疾病。
222.如权利要求193至221中任一项的方法，其进一步定义为刺激该个体中的抗体、CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应的方法。
223.如权利要求193至221中任一项的方法，其进一步定义为刺激该个体中的中和抗体反应的方法。
224.如权利要求193至221中任一项的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对该个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约10至约500个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
225.如权利要求224的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约200个棘蛋白结合抗体。
226.如权利要求224的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约10至约300；约20至约300；约20至约200；或约30至约100个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
227.如权利要求226的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约30至约80个冠状病毒棘蛋白结合抗体。
228.如权利要求223的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对该个体中的每一冠状病毒中和抗体产生约1至约500个冠状病毒棘蛋白受体结合域(RBD)结合抗体。
229.如权利要求228的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生不超过约50个棘蛋白RBD结合抗体。
230.如权利要求228的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约1至约200；约2至约100；约3至约200；约5至约100或约5至约50个棘蛋白RBD结合抗体。
231.如权利要求230的方法，其中该方法刺激抗体反应，该抗体反应针对每一冠状病毒中和抗体产生约5至约20个冠状病毒棘蛋白RBD结合抗体。
232.如权利要求222的方法，其中该个体先前已感染SARS-CoV-2。
233.如权利要求222的方法，其进一步定义为刺激该个体中的保护性免疫反应的方法。
234.如权利要求193至233中任一项的方法，其中该个体为人类个体。
235.如权利要求234的方法，其中该个体的年龄在6个月与100岁、6个月与80岁、1岁与80岁、1岁与70岁、2岁与80岁或2岁与60岁之间。
236.如权利要求234的方法，其中该个体为新生儿或婴儿，其年龄不超过3岁、不超过2岁、不超过1.5岁、不超过1岁(12个月)、不超过9个月、6个月或3个月，或在6个月与2岁之间。
237.如权利要求234的方法，其中该个体为老年个体，其年龄为至少50、60、65或70岁。
238.如权利要求237的方法，其中该个体为老年个体，其年龄为至少60岁。
239.如权利要求234至238中任一项的方法，其中该个体具有美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。
240.如权利要求238的方法，其中该个体具有至少约10％、25％或50％美洲原住民、非洲、亚洲或欧洲遗传性。
241.如权利要求238的方法，其中该个体具有美洲原住民遗传性。
242.如权利要求238的方法，其中该个体具有至少约10％、25％或50％美洲原住民遗传性。
243.如权利要求193至242中任一项的方法，其中该方法基本上不诱导该个体中的Th2细胞介素，较佳IL-4、IL-13、TNF及/或IL-1β的增加。
244.如权利要求193至242中任一项的方法，其进一步定义为在该个体中诱导Th1导向免疫反应的方法。
245.如权利要求193至244中任一项的方法，其中该个体正在接受抗凝疗法。
246.如权利要求193至245中任一项的方法，其中该组成物借由肌内注射投予。
247.如权利要求193至246中任一项的方法，其中该组成物包含编码冠状病毒棘蛋白(S)的mRNA，该冠状病毒棘蛋白为包含至少一个融合前稳定性突变的融合前稳定化棘蛋白(S_stab)。
248.如权利要求247的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO：163至少95％一致的冠状病毒棘蛋白。
249.如权利要求248的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO：163一致的冠状病毒棘蛋白。
250.如权利要求247的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO：149至少95％一致的冠状病毒棘蛋白。
251.如权利要求248的方法，其中该mRNA编码与SEQ ID NO：149一致的冠状病毒棘蛋白。
252.如权利要求250或251的方法，其中单剂的该组成物提供足够的免疫反应以保护该个体免于重度COVID-19疾病至少约6个月。
253.如权利要求252的方法，其中单剂的该组成物提供足够的免疫反应以保护该个体免于重度COVID-19疾病约6个月至约1年、1.5年、2年、2.5年、3年、4年或5年。
254.如权利要求247至249中任一项的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成LNP。
255.如权利要求254的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；及
(iv)至少一种PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
256.如权利要求255的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇及0.5-15％PEG脂质。
257.如权利要求256的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5∶10∶40.8∶1.7。
258.如权利要求256的方法，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4∶10∶40.9∶1.7。
259.如权利要求254至258中任一项的方法，其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
260.如权利要求249的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约47.5∶10∶40.8∶1.7，且其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
261.如权利要求249的方法，其中该mRNA与一或多种脂质复合，从而形成脂质纳米粒子(LNP)，其中该LNP包含
(i)至少一种根据式III-3的阳离子脂质；
(ii)DSPC；
(iii)胆固醇；及
(iv)根据式IVa的PEG脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为47.4∶10∶40.9∶1.7，且其中mRNA与总脂质的比率为约0.03-0.04w/w。
262.如权利要求247至261中任一项的方法，其中向该个体投予包含约2μg与约50μg之间的mRNA的组成物。
263.如权利要求262的方法，其中向该个体投予约10μg与约50μg之间的mRNA的组成物。
264.如权利要求263的方法，其中向该个体投予约10μg与约30μg之间的mRNA的组成物。
265.如权利要求264的方法，其中向该个体投予包含约12μg mRNA的组成物。
266.如权利要求264至265中任一项的方法，其中该投予在100％投予该组成物的个体中提供血清转化。
267.如权利要求193至266中任一项的方法，其中该人类个体的年龄为61岁或更大。
268.如权利要求193至266中任一项的方法，其中该人类个体的年龄为18至60岁。
269.如权利要求193至268中任一项的方法，其中该人类个体已经历先前疫苗过敏。
270.如权利要求193至269中任一项的方法，其中该个体具有可侦测的抗PEG抗体。
271.如权利要求193至270中任一项的方法，其包含：
(i)获得如权利要求74至162中任一项的组成物，其中该组成物是冻干的；
(ii)使该冻干组成物溶解于医药学上可接受的液体载体中以产生液体组成物；及
(iii)向该个体投予有效量的该液体组成物。
272.一种使如权利要求74至162中任一项的组成物稳定的方法，其包含冻干该组成物以产生稳定化组成物。
273.如权利要求272的方法，其中该稳定化组成物的含水量小于约10％。
274.如权利要求273的方法，其中该稳定化组成物的含水量在约0.5％与5.0％之间。
275.一种稳定化的冻干组成物，其借由如权利要求272至274中任一项的方法产生。
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