TW202400793A - 增強免疫力之方法 - Google Patents

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Ｗ 馬克 薩茲曼
艾斯瑞羅 班傑明 高盛
毛天陽
布魯斯 登納
陶德 偉德
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美商薩納度生物公司
耶魯大學
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Abstract

本發明係關於一種增強免疫力之方法。

Description

增強免疫力之方法
本發明係關於一種增強免疫力之方法。
基於mRNA的SARS-CoV-2疫苗已證明mRNA療法在一般人群中安全且有效使用的巨大潛力。然而，近期研究已證明在使用基於mRNA-脂質奈米顆粒(LNP)之方案接種第二劑疫苗後約4個月開始在無症狀感染以及有症狀及嚴重感染方面的疫苗效用降低。此外，病毒持續進化，免疫逃逸性增加，特別是所關注的貝塔(B.1.351)、德爾塔(B.1.617.2)及如今之奧米克戎(B.1.529)關切變異體(Variants of Concern (VOC))，亦促使針對COVID-19之疫苗效用降低。當前疫苗不僅在預防SARS-CoV-2感染方面變得不太有效，而且其亦變得不能夠防止病毒傳播。
因此，仍需要增強針對COVID-19之免疫力。本發明滿足此需求。
本發明涵蓋增強有需要之人對抗原之免疫反應的方法，該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗原或編碼抗原之核酸，其中該人先前已針對病毒進行疫苗接種或感染病毒。在一些實施例中，該人具有升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞。在一些實施例中，升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞由先前針對病毒之疫苗接種引起。
在一些實施例中，升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞由先前病毒感染引起。
在一些實施例中，黏膜部位選自由以下組成之群：直腸、陰道、膀胱、眼部、口腔、舌下、食道、鼻、胃腸道、肺及耳黏膜部位。
在一些實施例中，抗原包含蛋白質或多肽。
在一些實施例中，抗原為多價抗原。
在一些實施例中，抗原包含編碼蛋白質或多肽之核酸。
在一些實施例中，核酸為DNA或RNA。
在一些實施例中，核酸為mRNA。
在一些實施例中，抗原源於微生物病原體。
在一些實施例中，微生物病原體為分枝桿菌、細菌、真菌、病毒、寄生蟲或普里昂蛋白(prion)。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：輪狀病毒、諾羅病毒、腺病毒、星狀病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒、間質肺炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、波卡病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：第1型單純疱疹病毒(HSV-1)、第2型單純疱疹病毒(HSV-2)、人類乳突病毒(HPV)、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：人類免疫不全病毒(HIV)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰白質炎、日本腦炎、天花、流感病毒、黃病毒、ECHO病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、人類嗜T淋巴球病毒(HTLV)、登革熱病毒、人類乳突病毒(HPV)、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、蟲媒病毒性腦炎病毒、SARS-CoV-2、Henoch-Schonlein二氏紫癜病(HSP)、RNA病毒、DNA病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，RNA病毒選自由以下組成之群：感冒、流感、SARS、MERS、Covid-19、登革熱病毒、C型肝炎、E型肝炎、西尼羅河熱、伊波拉病毒病、狂犬病、脊髓灰質炎、腮腺炎、麻疹、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，DNA病毒選自由以下組成之群：單純疱疹病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰狀病毒、艾司坦-巴爾病毒、玫瑰疹病毒(roseolo virus)、人類疱疹病毒第7型、卡波西氏肉瘤相關病毒(Kaposi's sarcoma-associated virus)、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，醫藥組合物藉由黏膜遞送投與。
在一些實施例中，黏膜遞送選自由以下組成之群：直腸遞送、口頰遞送、經肺遞送、經眼遞送、經鼻遞送、鼻內遞送、陰道遞送及經口遞送。
在一些實施例中，醫藥組合物投與至人類個體之黏膜組織。
在一些實施例中，黏膜組織選自由以下組成之群：前鼻孔、鼻竇、直腸、陰道、食道、尿道、舌下及口頰。
在一些實施例中，經口、靜脈內、肌內、皮內、皮下、鼻內或藉由吸入投與醫藥組合物。
在一些實施例中，藉由鼻內噴霧投與醫藥組合物。
在一些實施例中，醫藥組合物不包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含脂質奈米顆粒(LNP)。
在一些實施例中，抗原囊封於脂質奈米顆粒(LNP)內。
在另一態樣中，本發明係關於增強有需要之人對SARS-CoV-2之免疫反應的方法；該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含至少一種mRNA，其中該人先前已針對SARS-CoV-2進行疫苗接種或感染SARS-CoV-2。在一些實施例中，mRNA編碼SARS-CoV-2之棘蛋白或其片段。
在一些實施例中，醫藥組合物不包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。
在一些實施例中，mRNA囊封於脂質奈米顆粒(LNP)內。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一種陽離子脂質。
在一些實施例中，至少一種陽離子脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-雙-O-十八烯基-3-三甲銨丙烷(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)進一步包含至少一種磷脂。
在一些實施例中，至少一種磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑在約50 nm至約1000 nm之範圍內。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑在以下之範圍內：約50 nm至約400 nm、約50 nm至約200 nm、約200 nm至約1000 nm、約200 nm至約800 nm或約300 nm至約600 nm。
在一些實施例中，免疫反應為黏膜免疫反應。
在一些實施例中，黏膜免疫反應為抗原特異性IgA抗體產生。
在一些實施例中，黏膜免疫反應為抗原特異性IgG抗體產生。
在一些實施例中，人具有升高之IgA抗體。
在一些實施例中，人具有升高之IgG抗體。
定義除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用之冠詞「一(a/an)」用以指一個/種或多於一個/種(亦即至少一個/種)文法冠詞對象。例如，「一要素」意謂一個/種要素或多於一個/種要素。
術語「變異體(variant)」意謂在一或多個(例如若干)位置處包括更改(亦即取代、插入及/或缺失)之多肽或核苷酸。在一些實施例中，術語「變異體」係指SARS-CoV-2病毒變異體。
術語「棘蛋白免疫(spike)」「追加免疫(boost)」「加強劑(booster)」可互換地使用。
如本文中所使用，術語「免疫原性劑(immunogenic agent)」涵蓋任何物質、物質組合物或有機材料組合物，例如細胞或細胞組分之懸浮液，當以適合量且與適合物質混合投與時，免疫原性劑能夠在人類個體中引起針對冠狀病毒之實質性免疫反應。
術語「免疫學上等效(immunologically equivalent)」意謂多肽就其引發免疫反應之能力而言在功能上等效於具有任何S蛋白之胺基酸序列的多肽。
如本文中所使用，術語「多肽(polypeptide)」涵蓋長度為2-10個胺基酸殘基、寡肽(11-100個胺基酸殘基)的短肽及較長肽(常見解釋為多肽，亦即長度超過100個胺基酸殘基)以及蛋白質(功能性實體包含至少一種肽、寡肽或多肽，其可藉由糖基化來化學修飾或與其他化學基團結合)。多肽之定義亦包含SARS-CoV-2中之天然形式之多肽或蛋白質以及亦為化學合成肽之轉化任何種類宿主之任何類型表現載體中的重組蛋白或肽。
如本文中所使用之術語「核酸(nucleic acid)」係指含有至少兩個呈單股或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸且包括其DNA、RNA及雜合物的聚合物。DNA可呈反義股分子、質體DNA、cDNA、PCR產物或載體形式。RNA可呈小髮夾RNA (shRNA)、信使RNA (mRNA)、反義RNA、miRNA、micRNA、多價RNA、切丁酶受質RNA或病毒RNA (vRNA)及其組合形式。核酸包括含有已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵聯之核酸，其為合成的、天然存在的及非天然存在的，且具有與參考核酸類似之結合性質。
本發明係關於針對病毒對人類個體進行疫苗接種之方法，其中人類個體先前針對病毒進行全身性疫苗接種或感染病毒。該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗原。此方法亦稱作「初免且棘蛋白免疫」或「初免且追加免疫」。在一些實施例中，初免且棘蛋白免疫方法利用無佐劑之鼻內棘蛋白追加免疫，其利用由初級全身性疫苗接種產生的現有免疫力來引發呼吸道內之黏膜免疫記憶。此外，使用相異的棘蛋白，初免且棘蛋白免疫能夠誘導針對薩貝冠狀病毒(sarbecovirus)之交叉反應免疫力。在一些實施例中，初免且棘蛋白免疫使得能夠針對薩貝冠狀病毒，諸如MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2或其變異體作出多價反應。
在一個態樣中，本發明涵蓋增強有需要之人中對抗原之免疫反應的方法，該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗原或編碼抗原之核酸，其中該人先前已針對病毒進行疫苗接種或感染病毒。在一些實施例中，該人具有升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞。在一些實施例中，升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞由先前針對病毒之疫苗接種引起。在一些實施例中，先前疫苗接種藉由非經腸投與進行。
在一些實施例中，升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞由先前病毒感染引起。在一些實施例中，升高之抗體為免疫球蛋白G (IgG)、IgM及IgA。
在一些實施例中，黏膜部位選自由以下組成之群：直腸、陰道、膀胱、眼部、口腔、舌下、食道、鼻、胃腸道、肺及耳黏膜部位。
在一些實施例中，抗原包含蛋白質或多肽。
在一些實施例中，抗原包含至少一種編碼蛋白質或多肽之核酸。
在一些實施例中，核酸為DNA或RNA。
在一些實施例中，核酸為mRNA。在一些實施例中，mRNA為N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA。在一些實施例中，mRNA為假尿苷修飾之mRNA。在一些實施例中，抗原包含兩種或更多種不同mRNA。該兩種或更多種mRNA編碼兩種或更多種不同蛋白質以誘導多價反應。
在一些實施例中，抗原源於微生物病原體。
在一些實施例中，微生物病原體為分枝桿菌、細菌、真菌、病毒、寄生蟲或普里昂蛋白。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：輪狀病毒、諾羅病毒、腺病毒、星狀病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒、間質肺炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、波卡病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：第1型單純疱疹病毒(HSV-1)、第2型單純疱疹病毒(HSV-2)、人類乳突病毒(HPV)、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：人類免疫不全病毒(HIV)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰白質炎、日本腦炎、天花、流感病毒、黃病毒、ECHO病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、人類嗜T淋巴球病毒(HTLV)、登革熱病毒、人類乳突病毒(HPV)、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、蟲媒病毒性腦炎病毒、SARS-CoV-2、Henoch-Schonlein二氏紫癜病(HSP)、RNA病毒、DNA病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，RNA病毒選自由以下組成之群：感冒、流感、SARS、MERS、Covid-19、登革熱病毒、C型肝炎、E型肝炎、西尼羅河熱、伊波拉病毒病、狂犬病、脊髓灰質炎、腮腺炎、麻疹、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，DNA病毒選自由以下組成之群：單純疱疹病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰狀病毒、艾司坦-巴爾病毒、玫瑰疹病毒、人類疱疹病毒第7型、卡波西氏肉瘤相關病毒、其變異體及其任何組合。
在一些實施例中，醫藥組合物藉由黏膜遞送投與。
在一些實施例中，黏膜遞送選自由以下組成之群：直腸遞送、口頰遞送、經肺遞送、經眼遞送、經鼻遞送、鼻內遞送、陰道遞送及經口遞送。
在一些實施例中，醫藥組合物投與至人類個體之黏膜組織。
在一些實施例中，黏膜組織選自由以下組成之群：前鼻孔、鼻竇、直腸、陰道、食道、尿道、舌下及口頰。
在一些實施例中，經口、靜脈內、肌內、皮內、皮下、鼻內或藉由吸入投與醫藥組合物。
在一些實施例中，藉由鼻內噴霧投與醫藥組合物。
在一些實施例中，醫藥組合物不包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含聚(胺-共-酯) (PACE)聚合物。在一些實施例中，PACE聚合物描述於美國專利第10,682,422號；第10,465,042號；第9,272,043號；第9,895,451號；第PCT/US2012/067447號；及美國專利公開案第US20200399424號中，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗原囊封於脂質奈米顆粒(LNP)內。
在一些實施例中，人已在以下時間針對病毒進行疫苗接種或感染病毒：約一週前、兩週前、三週前、一個月前、兩個月前、三個月前、四個月前、五個月前、六個月前、七個月前、八個月前、九個月前、十個月前、十一個月前或十二個月前。
在一些實施例中，核酸為RNA。在一些實施例中，RNA為選自以下之一或多者：小RNA、核糖核酸酶、小干擾RNA (siRNA)、不對稱干擾RNA (aiRNA)、微小RNA (miRNA)、切丁酶受質RNA (dsRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、轉移RNA (tRNA)、信使RNA (mRNA)及自擴增mRNA (SAM)。在一些實施例中，核酸為DNA。在一些實施例中，核酸在投與人類個體後將最終轉譯成蛋白質，其中蛋白質實現治療功能或疫苗接種。
在一些實施例中，奈米顆粒包含美國專利第10,106,490號、第10,723,692號、第9,737,619號、第9,738,593號及第WO2015199952A1號中所描述之一或多種化合物，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，奈米顆粒包含美國專利第10,682,422號、第10,465,042號、第9,272,043號、第9,895,451號、第PCT/US2012/067447號及美國專利公開案第US20200399424號中所描述之一或多種化合物，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，顆粒之平均粒度為約100 nm至約300 nm，較佳約150 nm至約275 nm。在一些實施例中，聚合物:多肽之重量:重量比介於約25:1與250:1之間。
當前審批通過之基於SARS-CoV-2 mRNA-LNP及基於載體疫苗依賴於肌內投與，其在動物模型及人類中誘導高含量之循環抗體、記憶B細胞及循環效應CD4 +及CD8 +T細胞。然而，非經腸疫苗在感染部位不誘導高含量之強效抗病毒免疫記憶，諸如組織駐留記憶T細胞(T RM)及B細胞(B RM)以及黏膜IgG及二聚IgA。此與穩固地誘導CD8+ T RM之人類及小鼠中SARS-CoV-2感染形成對比。靶向呼吸道黏膜之疫苗可解決非經腸疫苗接種之缺點，因為最近鼻內遞送SARS-CoV-2棘蛋白編碼腺病毒載體之臨床前評估已顯示出令人佩服的黏膜免疫原性以及在小鼠、倉鼠及非人類靈長類動物中之保護及減少之病毒脫落。臨床前黏膜流感病毒疫苗研究亦已顯示黏膜免疫力可經由CD8 +T RM或二聚IgA增強針對異源亞型攻擊之保護且可改良免疫力之持久性。
雖然初始呼吸道投與疫苗誘導強效黏膜免疫反應，但全身性初免繼之以鼻內追加免疫引起類似全身性免疫力，但具有增強黏膜免疫力之附加益處。
近期研究已證明，FDA審批通過之mNRA疫苗針對COVID-19在接種第二劑疫苗後約4個月開始在無症狀感染以及有症狀及嚴重感染方面的有效性降低。在來自非經腸疫苗接種方案之此類減弱免疫力的環境中，本發明描述增強針對COVID-19之免疫力的方法：利用基於mRNA-LNP之疫苗的強全身性初免，繼之以藉由無佐劑之棘蛋白或免疫沉默聚合複合體囊封mRNA的鼻內追加免疫(IN)追加免疫。
為評估IN無佐劑次單元疫苗追加免疫對呼吸道黏膜免疫力發展的可能性，藉由IM注射向K18-hACE2小鼠接種1 μg之mRNA-LNP (Comirnaty) (初免)，隨後在第14天藉由IN投與接種1 μg之重組無佐劑棘蛋白(初免且棘蛋白免疫)。額外對照組包括僅接受IM初免之K18-hACE2小鼠及僅在追加免疫時接受IN棘蛋白免疫之小鼠。在第21天或第28天(追加免疫後7天或14天)使小鼠安樂死且評估黏膜體液免疫力之發展(圖1A)。評估鼻洗液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及血清中之抗SARS-CoV-2棘蛋白S1 IgG及IgA。只有接受初免且棘蛋白免疫之小鼠在鼻洗液及BALF中產生高含量之抗SARS-CoV-2 IgA及IgG (圖1 B-E)。僅IM初免或僅IN棘蛋白免疫均不足以引起黏膜抗體之發展。在血清中，僅IM初免足以誘導低含量之IgA及IgG；然而，初免且棘蛋白免疫使得抗棘蛋白S1 IgA及IgG均顯著全身性加強(圖1 F、G)。此等抗體含量增加與BALF及血清中之中和力價增加相關(圖1 H-K)。此等結果表明單次劑量無佐劑之鼻內單獨棘蛋白免疫無免疫原性，且藉由無佐劑棘蛋白誘導強效黏膜及全身性抗體反應在此情況下需要先前藉由mRNA-LNP進行全身性初免。
使用與對棘蛋白之受體結合域(RBD)具有特異性之B細胞四聚物合併的靜脈內(IV) CD45標記，發現初免且棘蛋白免疫使得肺組織內之抗原特異性B細胞(IV -CD19 +B220 +四聚物 +)增加(圖1L)。鑒於僅評估四聚物之RBD結合，亦查看可能表示對肺組織內之全部棘蛋白具有反應性之更完整B細胞集合的多株組織反應。發現表現IgA或IgG之肺組織中之類別切換型抗體分泌細胞(ASC) (IV -CD19 +/-CD138 +)增加(圖1 M、N)，且發現表現IgA或IgG之類別切換型B RM(IV -CD19 +B220 +IgD -IgM -CD38 +)增加(圖1 O、P)。此等結果與黏膜抗體產生增加一致且表明初免且棘蛋白免疫引發肺中之局部B細胞反應。
類似於上文，將區分肺組織內循環免疫細胞之CD45 IV標記與主要組織相容性複合體(MHC) I類四聚物組合至保守性薩貝冠狀病毒棘蛋白抗原決定基(VNFNFNGL)。發現在肺組織(圖2 B-D)、下呼吸道BALF內(圖2 E-G)及在上呼吸道鼻甲骨中(圖2 H-J)中顯著誘導表現包括CD69 +及CD103 +之T RM之典型標記物的棘蛋白IV -四聚物 +CD8 +T細胞。另外，發現抗原經歷的CD4 +T細胞(IVCD44 +CD4 +)顯著增加，其中許多亦在肺組織內(圖2 K-M)及來自從BALF回收的下呼吸道(圖2 N-P)表現T RMCD69 +及CD103 +之標記物。此等結果表明初免且棘蛋白免疫不僅誘導體液黏膜反應，且亦穩固地引發肺薄壁組織及呼吸道CD8 +T RM及CD4 +T RM。
對接受1 μg IM初免之K18-hACE2小鼠在84天後使用IN棘蛋白免疫進行追加免疫。吾人在第91天(追加免疫後7天)及第140天(追加免疫後56天)取樣體液及細胞黏膜免疫反應。吾人發現，IN棘蛋白免疫延遲足以誘導CD8 +T RM，其保持至少56天。早在追加免疫後7天誘導CD4 +T RM；然而，其長壽性到56天似乎減弱，至少在多株方面是這樣。類似於CD8 +T RM反應，發現其不僅對延遲追加免疫具有足夠體液反應，但在BALF中黏膜IgA及IgG強且增加，且在追加免疫後56天時血清IgA及IgG強且增加。此等結果表明以3個月劑量間間隔給予初免且棘蛋白免疫足以引發持久黏膜及全身體液及細胞免疫反應。
在另一態樣中，本發明係關於增強有需要之人對SARS-CoV-2之免疫反應的方法；該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含至少一種mRNA，其中該人先前已針對SARS-CoV-2進行疫苗接種或感染SARS-CoV-2。在一些實施例中，mRNA編碼SARS-CoV-2之棘蛋白或其片段。
在一些實施例中，該人先前已接種一或多種選自由以下組成之群的COVID-19疫苗：BNT162b2 (Pfizer/BioNTech)、mRNA-1273 (Moderna)、AZD1222/ChAdOxl AstraZeneca/Oxford Univ)、Ad5載體化之COVID-19疫苗(CanSino Biologies)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV2373 (Novavax)及其組合。
在一些實施例中，該人具有升高之IgG抗體，其由先前針對MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體進行疫苗接種引起。
在一些實施例中，該人具有升高之IgM抗體，其由先前針對MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體進行疫苗接種引起。
在一些實施例中，該人具有升高之IgA抗體，其由先前針對MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體進行疫苗接種引起。
在一些實施例中，該人具有升高之IgG抗體，其由先前感染MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體引起。
在一些實施例中，該人具有升高之IgM抗體，其由先前感染MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體引起。
在一些實施例中，該人具有升高之IgA抗體，其由先前感染MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或其變異體引起。
在一些實施例中，升高之IgG在以下之範圍內：約100-150、約100-200、約100-300、約100-400、約150-200、約150-250、約150-300、約150-400、約200-250、約200-300、約200-350或約200-400 BAU /ml。
在一些實施例中，升高之IgG為約150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、280、290、295或300 BAU/ml。
在一些實施例中，升高之IgM在以下之範圍內：約25-100、約25-150、約25-200、約25-300、約50-100、約50-150、約50-200、約50-300、約75-100、約75-150、約75-200、約75-300、約100-150、約100-200、約150-300、約125-200、約125-300、約150-200、約150-300、約200-300、約250-300 AU /ml。
在一些實施例中，升高之IgM為約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、180、190、195或200 AU/ml。
在一些實施例中，升高之IgA在以下之範圍內：約10-100、約10-150、約10-200、約25-100、約25-150、約25-200、約50-100、約50-150、約50-200、約75-100、約75-150、約75-200、約100-150、約100-200、約125-150、約125-200、約150-200 AU/ml。
在一些實施例中，升高之IgA為約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150 AU/ml。
在一些實施例中，至少一種mRNA編碼SARS-CoV-2之棘蛋白或其變異體或其片段。在一些實施例中，至少一種mRNA為多價抗原。在一些實施例中，醫藥組合物包含兩種或更多種不同mRNA。該兩種或更多種mRNA編碼兩種或更多種不同蛋白質以誘導針對SARS-CoV-2之多價反應。在一些實施例中，mRNA為N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA。在一些實施例中，mRNA為假尿苷修飾之mRNA。
在一些實施例中，醫藥組合物不包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含佐劑。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含聚(胺-共-酯) (PACE)聚合物。
在一些實施例中，至少一個mRNA囊封於脂質奈米顆粒(LNP)內。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一種陽離子脂質。
在一些實施例中，至少一種陽離子脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-雙-O-十八烯基-3-三甲銨丙烷(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒(LNP)進一步包含至少一種磷脂。
在一些實施例中，至少一種磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑在約50 nm至約1000 nm之範圍內。
在一些實施例中，脂質奈米顆粒之平均直徑在以下之範圍內：約50 nm至約400 nm、約50 nm至約200 nm、約200 nm至約1000 nm、約200 nm至約800 nm或約300 nm至約600 nm。
在一些實施例中，免疫反應為黏膜免疫反應。
在一些實施例中，黏膜免疫反應為抗原特異性IgA抗體產生。
在一些實施例中，人已在以下時間針對病毒進行疫苗接種或感染病毒：約一週前、兩週前、三週前、一個月前、兩個月前、三個月前、四個月前、五個月前、六個月前、七個月前、八個月前、九個月前、十個月前、十一個月前或十二個月前。
在一些實施例中，本文中所描述之醫藥組合物包含作為抗原之多肽，其用於向人類個體針對SARS-CoV-2及其免疫原性變異體進行疫苗接種。在一些實施例中，多肽為冠狀病毒棘(S)蛋白質、其免疫原性變異體或其抗原片段。在一些實施例中，多肽具有與任何已知S蛋白或其次單元或片段具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性程度的胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有與任何已知S蛋白或其次單元或片段具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性程度的胺基酸序列。在一些實施例中，變異體為發現於SARS-CoV-2之不同菌株中的SARS-CoV-2棘蛋白變異體。變異體包括(但不限於)來自SARS-CoV-2、B.1.1.7菌株、B.1.351菌株、P.1菌株、CAL 20菌株或其任何組合之阿爾法、貝塔或德爾塔變異體之棘蛋白。
在一些實施例中，SARS-CoV-2變異體包括(但不限於)阿爾法(B.1.1.7及Q譜系)、貝塔(B.1.351及後代譜系)、伽馬(P.1及後代譜系)、德爾塔(B.1.617.2及AY譜系)、艾普西隆(B.1.427及B.1.429)、伊塔(B.1.525)、約塔(B.1.526)、卡帕(B.1.617.1)、1.617.3、謬(B.1.621、B.1.621.1)、澤塔(P.2)、謬(B.1.621、B.1.621.1)、奧密克戎(Pango譜系B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3)及其組合。
來自不同菌株之棘蛋白的例示性變異體闡述於表1中。
表 1.棘蛋白不同變異體相對於祖型武漢菌株棘蛋白(SEQ ID NO: 2)之胺基酸位置及相對胺基酸變化清單。
蛋白质 位置 武汉菌株 B1.1.7 B1.351 P.1 CAL.20
S 13 S          I
S 18 L    F F   
S 20 T       N   
S 26 P       S   
S 69 H Del         
S 70 V Del         
S 80 D    A      
S 138 D       Y   
S 145 Y Del         
S 152 W          C
S 190 R       S   
S 215 D    G/H      
S 241 L    Del      
S 242 L    Del      
S 243 A    Del      
S 417 K    N T   
S 452 L          R
S 484 E    K K   
S 501 N Y Y Y   
S 570 A D         
S 614 D G G G G
S 655 H       Y   
S 681 P H         
S 701 A    V      
S 716 T I         
S 938 L          F
S 982 S A         
S 1027 T       I   
S 1118 D H         
S 1176 V       F   
S 1191 K          N
在一些實施例中，多肽包含SARS-CoV-2菌株S蛋白之其他胺基酸序列，包括在Deng (2020) Science, 8:eabb9263及Taboada (2020) J. Virol. 94:e01056中揭示之彼等胺基酸序列中之任一者。然而，其他SARS-CoV-2菌株很可能將展現與來自此類菌株之阿爾法變異體S蛋白、其片段及次單元實質上相同的免疫性質。在一些實施例中，多肽選自由以下組成之群：來自SARS-CoV-2之M蛋白、E蛋白、N蛋白，或其變異體及其組合。
在一些實施例中，本文中所描述之S蛋白變異體包含在與阿爾法變異體中位置501N對應之位置處的突變。在一些實施例中，對應於位置501N之胺基酸經Y取代。在一些實施例中，包含對應於位置501N之位置處之突變的本文中所描述之S蛋白變異體可包含一或多個其他突變。此類一或多種其他突變可為選自在與阿爾法變異體相關之位置處以下胺基酸對應之位置處的突變中之一或多者：18L、69H、70V、80D、144Y、215D、246R、242L、243A及244L、417K、484E、570A、614D、681P、701A、716T、982S及1118D。在一些實施例中，缺失對應於阿爾法變異體中位置69H之胺基酸。在一些實施例中，缺失對應於位置70V之胺基酸。在一些實施例中，缺失對應於位置144Y之胺基酸。在一些實施例中，對應於位置570A之胺基酸為D。在一些實施例中，對應於位置614D之胺基酸為G。在一些實施例中，對應於位置681P之胺基酸為H。在一些實施例中，對應於位置716T之胺基酸為I。在一些實施例中，對應於位置982S之胺基酸為A。在一些實施例中，對應於位置1118D之胺基酸為H。在一些實施例中，對應於位置80D之胺基酸為A。在一些實施例中，對應於位置215D之胺基酸為G。在一些實施例中，對應於位置484E之胺基酸為K。在一些實施例中，對應於位置701A之胺基酸為V。在一些實施例中，對應於位置18L之胺基酸為F。在一些實施例中，對應於位置246R之胺基酸為I。在一些實施例中，對應於位置417K之胺基酸為N。在一些實施例中，缺失對應於位置242L之胺基酸。在一些實施例中，缺失對應於位置243A之胺基酸。在一些實施例中，缺失對應於位置244L之胺基酸。
在一些實施例中，本文中所描述之S蛋白變異體為SARS-CoV-2德爾塔之S蛋白。在一些實施例中，SARS-CoV-2德爾塔之S蛋白相對於阿爾法變異體具有以下棘蛋白取代：T19R、V70F、T95I、G142D、156E缺失、157F缺失、R158G、A222V、W258L、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N。
在一些實施例中，本文中所描述之S蛋白變異體為SARS-CoV-2奧密克戎之S蛋白。在一些實施例中，SARS-CoV-2奧密克戎之S蛋白相對於阿爾法變異體具有以下棘蛋白取代：A67V、胺基酸69-70之缺失、T95I、胺基酸142-144之缺失、Y145D、胺基酸211之缺失、L212I、胺基酸EPE在214處之插入、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K及L981F。
在一些實施例中，投與本文中所描述之醫藥組合物可藉由單次投與來進行或藉由多次投與來加強。
在一些實施例中，本文中所描述之醫藥組合物可經靜脈內、動脈內、皮下、皮內或肌內投與。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於局部投與或全身投與。全身投與可包括經腸投與(其涉及經由胃腸道吸收)或非經腸投與。如本文所用，「非經腸投與(parenteral administration)」係指以除胃腸道外之任何方式投與，諸如藉由靜脈內注射。
在一些實施例中，本文中所描述之醫藥組合物可經鼻內投與。
在一些實施例中，每次劑量可投與本文中所描述之多肽的量為0.1 μg至300 μg、0.5 μg至200 μg或1 μg至100 μg，諸如約1 μg、約3 μg、約10 μg、約30 μg、約50 μg或約100 μg。在一些實施例中，本發明設想單次劑量投與。在一些實施例中，本發明設想投與初免劑量，接著投與一或多次加強劑劑量。在投與初免劑量後約一週、約兩週、約三週、約四週或約五週，可投與加強劑劑量或第一加強劑劑量。在一些實施例中，在投與初免劑量之後約一個月、約兩個月、約三個月、約四個月或約五個月、約六個月、約七個月、約八個月、約九個月、約十個月、約十一個月或約十二個月，可投與加強劑劑量或第一加強劑劑量。
在一些實施例中，每劑量可投與的本文中所描述之多肽之量為60 μg或更低、50 μg或更低、40 μg或更低、30 μg或更低、20 μg或更低、10 μg或更低、5 μg或更低、2.5 μg或更低或1 μg或更低。
在一些實施例中，每劑可投與的本文中所描述之多肽之量為至少0.25 μg、至少0.5 μg、至少1 μg、至少2 μg、至少3 μg、至少4 μg、至少5 μg、至少10 μg、至少20 μg、至少30 μg或至少40 μg。
在一些實施例中，每劑量可投與的本文中所描述之多肽之量為0.25 μg至60 μg、0.5 μg至55 μg、1 μg至50 μg、5 μg至40 μg或10 μg至30 μg。
本文中所描述之醫藥組合物及產品可以用於注射溶液之冷凍濃縮物形式提供，例如以0.50 mg/mL之濃度提供。在一些實施例中，為了製備注射用溶液，將藥品解凍且用等張氯化鈉溶液(例如0.9% NaCl、生理鹽水)稀釋，例如藉由一步稀釋法。在一些實施例中，抑菌氯化鈉溶液(例如0.9% NaCl、生理鹽水)不可用作稀釋劑。在一些實施例中，經稀釋之藥品為灰白色懸浮液。用於注射之最終溶液的濃度視待投與之各別劑量水平而變化。
本發明亦涵蓋包含本文中所描述之醫藥組合物及用於投與之構件的套組。在一些實施例中，套組包含用於鼻內投與之鼻用噴霧裝置。鼻用噴霧裝置為此項技術中所熟知且描述於Djupesland, Drug Deliv. Transl. Res. (2013) 3(1): 42-62中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。套組可方便用於針對SARS-CoV-2或其變異體接種的自我投與。
在根據本發明之套組中，醫藥組合物包含0.5至75 μg之多肽，諸如0.5至50 μg之多肽或5至50 μg之多肽。
實例參考以下實例將更容易理解已大體描述之本發明教示內容，該等實例出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的而包括在內。
方法及材料 ：所有程序均在由耶魯實驗動物照護及使用委員會(Yale Institutional Animal Care and Use Committee)及耶魯環境健康及安全(Yale Environmental Health and Safety)批准之BSL-3設施(用於SARS-CoV-2感染小鼠)中進行。
細胞及病毒 在37℃及5% CO2下，在補充有1%丙酮酸鈉及5%胎牛血清(FBS)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中培養過度表現hACE2及TMPRSS2之Vero E6細胞(由Barney Graham NIH-VRC友情提供)。SARS-CoV-2分離株hCOV-19/USA-WA1/2020 (NR-52281)獲自BEI Resources且在過度表現hACE2及TMPRSS2之VeroE6細胞中擴增。以MOI 0.01持續感染細胞兩至三天，產生操作儲備液且在培育之後，藉由離心澄清上清液(500 g×5分鐘)，且經由0.45微米過濾器過濾且儲存在-80℃下。藉由標準斑塊檢定使用過度表現hACE2及TMPRSS2之Vero E6細胞量測病毒力價。
小鼠 自The Jackson Laboratory購買B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (K18-hACE2)小鼠且隨後在耶魯大學培育及圈養。使用八至十二週齡雌性小鼠進行免疫接種實驗。在此研究中使用之所有程序(性別匹配、年齡匹配)遵從聯邦指導原則及耶魯醫學院動物照護及使用委員會(Yale School of Medicine Animal Care and Use Committee)之機構政策。
實例 1 ： SARS-CoV-2 感染使用稀釋於丙二醇中之30% v/v異氟醚麻醉小鼠。使用移液管，鼻內遞送50 μL含有6×10 5PFU SARS-CoV-2。
實例 2 ： 自 Comirnaty mRNA-LNP 之 mRNA 萃取使用本文所描述之TRIzol/氯仿分離方法自疫苗調配物萃取mRNA。簡言之，以1:6.6疫苗與TRIzol體積比將疫苗等分試樣溶解於TRIzol LS (Thermo Fisher Scientific)中。在培育15分鐘(37℃，搖動)之後，每1 mL之TRIzol添加0.2 mL之氯仿。劇烈搖動溶液1分鐘且接著在室溫下培育3分鐘。在4℃下將溶液以12,000×g離心8分鐘。遵循製造商方案，使用購自Qiagen (Germantown, MD, USA)之RNeasy Maxi Kit，進一步純化含有分離之mRNA的水性層。在最終步驟上用升溫至37℃之醋酸鈉緩衝液(25 mM，pH 5.8)自管柱溶離RNA。藉由260、280及230 nm下之吸光度的NanoDrop量測值來分析所萃取mRNA的濃度及純度，其中純度評定為A260/A280＞2及A260/A230＞2。使用瓊脂糖凝膠電泳測定長度且檢驗mRNA保持完整。將含有1:100 SYBR Safe染料(Thermo Fisher Scientific)之所萃取mRNA裝載至1%瓊脂糖凝膠上且在75V下用含有1:5000 SYBR Safe染料之TAE緩衝液操作。
實例 3 ： PACE 聚合複合體調配物及表徵如先前所描述合成且表徵PACE聚合物。以聚合物與mRNA之50:1重量比調配所有聚合複合體。將PACE聚合物以100 mg/mL溶解於DMSO (37℃，搖動)中隔夜。在聚合複合體製造之前，藉由混合含有端基修飾及聚乙二醇尾端之PACE聚合物的溶液產生最優PACE聚合物摻合物。將mRNA及聚合物稀釋至等體積之醋酸鈉緩衝液(25 mM，pH 5.8)中。隨後將聚合物稀釋液渦旋15秒，與mRNA稀釋物混合，且再渦旋25秒。在使用之前，在室溫下培育聚合複合體10分鐘。
實例 4 ：疫苗接種在開封24小時內使用購自耶魯健康(Yale Health)藥房的小瓶裝Comirnaty疫苗且儲存在4℃下。小瓶含有殘餘疫苗(根據製造商說明書稀釋至100 μg/mL)，將其用脊髓注射器移出且合倂。將合併之殘餘疫苗等分且儲存在-80℃下。使用氯胺酮(50 mg/kg)及甲苯噻𠯤(5 mg/kg)之混合物經腹膜內注射麻醉小鼠。在無菌PBS中稀釋疫苗，且如所指示，用31 g注射器將10 μL或20 μL注射至左側四頭肌中，最終劑量為1 μg或0.05 μg。根據製造商方案，對於鼻內疫苗接種，在無菌無內毒素的水中使用SARS-CoV-2穩定化棘蛋白(ACRO biosystems，SPN-C52H9)或SARS-CoV-1棘蛋白(ACRO biosystems, SPN-S52H6)還原，接著稀釋於無菌PBS中且儲存在-80℃下。使用稀釋於丙二醇中之30% v/v異氟醚麻醉小鼠且經由IN途徑以50 μL投與1 μg或5 μg (如所指示)。對於IN mRNA-PACE而言，以指定劑量給予50 μL溶液中之聚合複合體。
實例 5 ： 病毒力價分析在所指示之時間點，使小鼠在100%異氟醚中安樂死。將約50%之總肺放入具有1 mL含2% FBS及2%抗生素/抗黴菌劑(Gibco)之PBS的珠粒均質機試管中且儲存於-80℃下。藉由離心(3900 rpm，持續10分鐘)清除肺部均質物碎屑。藉由斑塊檢定在補充有NaHCO3、2% FBS及0.6% Avicel RC-581之DMEM中測定過度表現hACE2及TMPRSS2之VeroE6細胞中之SARS-CoV-2的感染力價。在感染後40至42小時時藉由在10%中性緩衝福馬林中固定1小時，接著在20%乙醇中持續30分鐘的0.5%結晶紫中染色1小時來溶解斑塊。在水中洗滌培養盤以觀察斑塊。
實例 6 ： SARS-CoV-2 特異性抗體量測如先前所描述，出於方便起見在此根據所指出且複製之修正進行ELISA。96孔MaxiSorp培養盤(Thermo Scientific #442404)每孔塗佈有50 μL在PBS中呈2 μg/mL之濃度的重組SARS-CoV-2 S1蛋白質(ACRO Biosystems S1NC52H3)或SARS-CoV-1 S1蛋白質(ACRO Biosystems S1N-S52H5)且在4℃下隔夜培育。移除塗佈緩衝液，且將培養盤在室溫下與250 μL之阻斷溶液(含0.1% Tween-20、5%奶粉之PBS)一起培育1小時。將血清或支氣管肺泡灌洗液(BALF)稀釋於稀釋溶液(具有0.1% Tween-20及2%奶粉之PBS)中，且添加100 μL經稀釋血清或BALF且在室溫下培育兩小時。使用自動培養盤洗滌器(每次循環250 μL)用PBS-T (具有0.05% Tween-20之PBS)洗滌培養盤五次且將50 μL稀釋於稀釋溶液中之HRP抗小鼠IgG (Cell Signaling Technology #7076, 1:3,000)或HRP抗小鼠IgA (Southern Biotech #1040-05, 1:1,000)添加至各孔中。在室溫下培育1小時之後，用PBS-T在自動培養盤洗滌器中洗滌培養盤三次。用50 μL之TMB Substrate Reagent Set (BD Biosciences #555214)顯影培養盤且在15分鐘後藉由添加50 μL 2 N硫酸停止反應。接著在450 nm及570 nm之波長下讀取培養盤，且報告差異。
實例 7 ： 免疫組織化學及病理性分析耶魯病理學進行肺組織之包埋、切片及H&E染色。肺部病理學家盲態審查玻片且鑑別免疫細胞浸潤及其他相關病理學。如下評分1至4分：(1)輕度片狀單核浸潤、實質及血管周，具有可變反應性肺細胞及基質反應；(2)中度片狀單核浸潤、實質及血管周，具有可變反應性肺細胞及基質反應；(3)輕度密集混合浸潤，包括單核細胞及粒細胞/嗜中性球；(4)中度密集混合浸潤，包括單核細胞及粒細胞/嗜中性球。
實例 8 ： 血管內標記、細胞分離及流式細胞分析技術為將血管內與血管外細胞區分，用30%異氟醚麻醉小鼠且靜脈內注射APC/Fire 750 CD45抗體(30-F11, AB_2572116, BioLegend, #103154)且在3分鐘標記之後，使小鼠安樂死。用剪刀絞碎肺且在含有1 mg/mL膠原蛋白酶A (Roche)及30 μg/mL DNA酶I (Sigma- Aldrich)之RPMI消化混合液中在37℃下培育45分鐘。接著經由70 μm過濾器過濾組織。用氯甲酸銨緩衝液處理細胞且再懸浮於具有1% BSA之PBS中。在4℃下將單細胞懸浮液與Fc阻斷劑及水性細胞存活率染料一起培育20分鐘。在表面染色之前用PBS洗滌細胞一次。對於T細胞分析，用抗CD103 (BV421, 2E7, AB_2562901, BioLegend #121422)、抗CD3 (BV605, 17A2, AB_2562039, BioLegend #100237)、抗CD44 (BV711, IM7, AB_2564214, BioLegend #103057)、抗CD62L (FITC, MEL-14, AB_313093, BioLegend #104406)、抗CD8a (PerCP/Cy5.5, 16-10A1, AB_2566491, BioLegend #305232)、抗CD69 (PE/Cy7, H1.2F3, AB_493564, BioLegend #104512)、抗CD183 (CXCR3) (APC, CXCR3-173, AB_1088993, BioLegend #126512)、抗CD4 (AF700, GK 1.5, AB_493699, BioLegend #100430)及PESARS- CoV-2 S 539-546 MHC I類四聚物(H-2K(b))在4℃下對細胞染色30分鐘。對於B細胞分析，用抗GL7 (Pacific Blue, GL7, AB_2563292, BioLegend #144614)、抗IgM (BV605，RMM-1，AB_2563358，BioLegend #406523)、抗CD138 (BV711，281-2，AB_2562571，BioLegend #142519)、抗CD19 (BV785，6D5，AB_11218994，BioLegend #115543)、抗IgA (FITC，多株AB_2794370，SouthernBiotech #1040-02)、抗B220 (PerCP/Cy5.5，RA3- 6B2，AB_893354，BioLegend #103236)、PE-SARS-CoV-2 RBD四聚物、抗CD38 (PE/Cy7，90，AB_2275531，BioLegend #102718)、APC-SARS-CoV-2 RBD四聚物及抗IgD (AF700，11-26c.2a，AB_2563341，BioLegend #405730)在4℃下對細胞染色30分鐘。在用PBS洗滌之後，使用4%多聚甲醛固定細胞。在Attune NxT Flow Cytometer上獲得細胞群體資料且使用FlowJo Software (10.5.3；Tree Star)分析。
實例 9 ： SARS-CoV-2 受體結合域 B 細胞四聚物產生將Recombinant SARS-CoV-2 Spike RBD His Biotin Protein, CF (R&D/BT10500-050)以4:1莫耳比與卵白素-PE (Prozyme PJRS25)或卵白素-APC (Prozyme PJ27S)一起在4℃培育30分鐘。接著純化混合物且在Amicon Ultra (50 kDA MWCO)旋轉管柱中濃縮且用無菌冷PBS洗滌1次。對奈米液滴且使用螢光團特異性吸光度測定濃度，且將四聚物在PBS中稀釋至1.0 μM且儲存在4℃下。
實例 10 ： 假病毒產生如先前所描述產生基於VSV之假型病毒。在HHSN272201400008C下產生含有SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1棘醣蛋白基因之載體pCAGGS且經由BEI Resources (NR-52310)獲得。Wuhan-Hu-1分離株棘醣蛋白之序列與USA-WA1/2020分離株之序列一致。SARS-CoV-1棘蛋白編碼質體由Dr. Vincent Munster提供且先前已描述。293T細胞經二者中之一者的棘蛋白質體轉染，接著在37℃下用複製缺陷型VSV表現海腎螢光素酶接種1小時。接著移除病毒接種物，且用溫熱PBS洗滌細胞三次。接種之後24及48小時收集含有假病毒之上清液，藉由離心澄清，用Amicon Ultra離心式過濾器單元(100 kDa)濃縮，且在-80℃下以等分試樣儲存。在Huh7.5細胞中滴定假病毒以達成約600倍僅細胞對照背景之相對光單位信號。
實例 11 ： 假病毒中和分析在感染前一天，將過度表現hACE2及TMPRSS2之VeroE6 (圖1)或Huh7.5細胞(圖5)接種(3×10 4)於96孔培養盤之各孔中。在感染當天，在56℃下加熱不活化血清及BALF持續30分鐘。圖1血清在1:50之起始稀釋度下測試且BALF樣品在1:4之起始稀釋度下測試，兩者均具有8次兩倍連續稀釋。圖5血清在1:40之起始稀釋度下藉由8次三倍連續稀釋測試。將連續稀釋液與假病毒以1:1混合且在37℃下培育1小時。隨後自細胞抽吸生長培養基且用100 μL之血清/病毒混合物置換。在24小時時，移除感染培養基且盤在-80℃下急驟冷凍培養盤。將30 μg被動溶胞緩衝液(Promega)添加至各孔中且在室溫下培育培養盤15分鐘。將30 μg之Renilla-Glo Luciferase Assay System受質(Promega)添加至各孔中且在室溫下培育15分鐘。在微量盤讀取器(SpectraMax i3, Molecular Devices)上量測冷光。使用Prism 9 (GraphPad Software)將IC50按非線性回歸計算。
實例 12 ： 用無佐劑 SARS-CoV-2 棘蛋白之 IN 追加免疫誘導黏膜體液免疫力。為評估IN無佐劑次單元疫苗追加免疫對呼吸道黏膜免疫力發展的可能性，吾人決定利用mRNA-LNP之強全身性免疫原性。吾人另外自廣泛SARS-CoV-2棘蛋白工程獲益，其有助於藉由在弗林蛋白酶裂解位中添加C末端T4纖維蛋白三聚模體、六個脯胺酸取代(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P)及丙胺酸取代(R683A及R685A)幫助蛋白質在其確認中穩定。此等突變集合已顯示可顯著增強免疫原性且提高蛋白質穩定性，其中一些用於當前疫苗中。
吾人藉由IM注射用1 μg之mRNA-LNP (Comirnaty) (初免)，隨後在第14天藉由IN投與(初免且棘蛋白免疫)用1 μg之重組無佐劑棘蛋白對K18-hACE2小鼠進行疫苗接種。額外對照組包括僅接受IM初免之K18-hACE2小鼠及僅在追加免疫時接受IN棘蛋白免疫之小鼠。在第21天或第28天(追加免疫後第7天或第14天)使小鼠安樂死且評估黏膜體液免疫力之發展( 圖 1A)。
首先，吾人評估鼻洗液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及血清中之抗SARS-CoV-2棘蛋白S1 IgG及IgA。吾人發現只有接受初免且棘蛋白免疫之小鼠在鼻洗液及BALF中產生高含量之抗SARS-CoV-2 IgA及IgG ( 圖 1B (B-E))。僅IM初免或僅IN棘蛋白免疫均不足以引起黏膜抗體之發展。在血清中，僅IM初免足以誘導低含量之IgA及IgG；然而，初免且棘蛋白免疫使得抗棘蛋白S1 IgA及IgG均顯著全身性加強( 圖 1B (F ， G))。此等抗體含量增加與BALF及血清中之中和力價增加相關( 圖 1C (H-K))。此等結果表明單次劑量無佐劑之鼻內單獨棘蛋白免疫無免疫原性，且藉由無佐劑棘蛋白誘導強效黏膜及全身性抗體反應在此情況下需要先前藉由mRNA-LNP進行全身性初免。
已顯示肺中之組織駐留記憶B細胞(B RM)在小鼠流感模型中二級異源攻擊後有助於抗體分泌B細胞之快速回憶反應，且可為抵抗SARS-CoV-2之重要局部免疫效應子。使用與對棘蛋白之受體結合域(RBD)具有特異性之B細胞四聚物合併的靜脈內(IV) CD45標記，吾人發現初免且棘蛋白免疫使得肺組織(IV -CD19 +B220 +四聚物 +)內之抗原特異性B細胞增加( 圖 1D (L))。鑒於僅評估四聚物之RBD結合，吾人亦查看可能表示對肺組織內之全部棘蛋白具有反應性之更完整B細胞集合的多株組織反應。吾人發現表現IgA或IgG之肺組織中之類別切換型抗體分泌細胞(ASC) (IV -CD19 +/-CD138 +)增加( 圖 1D (M 、 N))，且吾人發現表現IgA或IgG之類別切換型B RM(IV -CD19 +B220 +IgD -IgM -CD38 +)增加( 圖 1D (O/P))。此等結果與黏膜抗體產生增加一致且表明初免且棘蛋白免疫引發肺中之局部B細胞反應。
實例 13 ： 初免且棘蛋白免疫誘導黏膜 T 細胞免疫力。鑒於吾人發現初免且棘蛋白免疫在呼吸道中誘導黏膜體液記憶反應，吾人接下來想要評估肺組織駐留記憶T細胞(T RM)之誘導。雖然次單元疫苗傳統上不為抗原特異性T細胞反應之強效誘導劑，但吾人假設藉由mRNA-LNP初免產生之免疫記憶將能夠實現次單元介導之T細胞加強反應，mRNA-LNP初免已顯示足以在動物模型及人類中誘導T細胞記憶反應。類似於上文，吾人將區分肺組織內循環免疫細胞之CD45 IV標記與主要組織相容性複合體(MHC) I類四聚物結合至保守性薩貝冠狀病毒棘蛋白抗原決定基(VNFNFNGL)。吾人發現在肺組織( 圖 2B (B-D))、下呼吸道BALF ( 圖 2B (E-G))內及在上呼吸道鼻甲骨中( 圖 2 (H-J))中顯著誘導表現包括CD69 +及CD103 +之T RM之典型標記物的棘蛋白IV -四聚物 +CD8 +T細胞。另外，吾人發現抗原經歷的CD4 +T細胞(IVCD44 +CD4 +)顯著增加，其中許多亦在肺組織內( 圖 2C (K-M))及來自從BALF回收的下呼吸道( 圖 2C (N-P))表現T RMCD69 +及CD103 +之標記物。此等結果表明初免且棘蛋白免疫不僅誘導體液黏膜反應，且亦穩固地引發肺薄壁組織及呼吸道CD8 +T RM及CD4 +T RM。
實例 14 ： 延遲時間間隔之初免且棘蛋白免疫足以誘導黏膜免疫力。儘管吾人展示初免與追加免疫時間間隔14天下之初免且棘蛋白免疫顯著誘導黏膜體液及細胞免疫記憶反應，但吾人想知道延遲追加免疫是否亦可誘導顯著黏膜體液及細胞反應。為了測試此問題，對接受1 μg IM初免之K18-hACE2小鼠在第84天使用IN棘蛋白免疫進行追加免疫。吾人在第91天(追加免疫後第7天)及第140天(追加免疫後第56天)取樣體液及細胞黏膜免疫反應( 圖 6A)。吾人發現，IN棘蛋白免疫延遲足以誘導CD8 +T RM，其保持至少56天( 圖 6B (B-D))。在追加免疫後第7天及早誘導CD4 +T RM；然而，其長壽性到第56天似乎減弱，至少在多株方面是這樣(圖 6B (E-G))。類似於CD8 +T RM反應，吾人發現其不僅對延遲追加免疫具有足夠體液反應，但在BALF中黏膜IgA及IgG強且增加( 圖 6C (H,I))，且在追加免疫後第56天時血清IgA及IgG強且增加( 圖 6C (J,K))。此等結果表明以3個月劑量時間間隔給予初免且棘蛋白免疫足以引發持久黏膜及全身體液及細胞免疫反應。
實例 15 ： mRNA 聚合複合體之 IN 遞送亦介導黏膜追加免疫。吾人接下來評估替代性平台用於IN棘蛋白追加免疫之能力。聚(胺-共-酯) (PACE)為可生物降解的三聚物，已經研發以在活體內囊封諸如mRNA或DNA之核酸且將其遞送至指定組織，具體視聚合物性質而定。近期研究已顯示遞送至呼吸道之mRNA-LNP在小鼠中以劑量依賴性方式致死。相比之下，已開發相對免疫沉默型PACE材料，使得能夠投與至對免疫病理學更敏感的位置，諸如呼吸道。為評估編碼棘蛋白之PACE囊封mRNA的安全性及功效，自Comirnaty萃取mRNA且囊封於PACE聚合複合體中。對於疫苗接種，向K18-hACE2小鼠注射1 μg IM初免(mRNA-LNP)，且在14天後接受1 μg囊封於PACE中且IN投與(PACE-棘蛋白免疫)之mRNA。額外對照組包括僅PACE-棘蛋白免疫及IM初免+無PACE囊封之所萃取mRNA免疫(裸mRNA) ( 圖 3A)。類似於吾人發現使用初免且棘蛋白免疫，初免且PACE-棘蛋白免疫誘導表現典型組織駐留標記物(CD69 +及CD103 +)之抗原特異性CD8 +T RM(IV -四聚物 +) ( 圖 3B)。另外，PACE-棘蛋白免疫加強之小鼠出現高含量之BALF抗SARS-CoV-2 IgA；BALF IgG及血清IgA及IgG之含量類似於僅IM初免小鼠( 圖 3C)。IM初免繼之以IN裸mRNA免疫不能誘導高於僅IM初免之黏膜或全身性免疫反應，表明由PACE囊封之mRNA為黏膜追加免疫所必需的。另外，單次劑量之僅IN PACE-棘蛋白免疫不足以在此劑量下引發任何可偵測之黏膜或全身性抗體反應。
實例 16 ： 在減弱 mRNA-LNP 免疫力之情形下的初免且棘蛋白免疫或初免且 PACE- 棘蛋白免疫防止致死性 SARS-CoV-2 攻擊。雖然當前疫苗最初在引發保護性免疫力方面極其有效，但減弱的抗體含量及免疫逃避使得針對SARS-CoV-2之加強劑可預見未來成為必要；然而，用於加強之最佳方法仍是一個問題。為測試IN投與是否將提供替代性保護性追加免疫，吾人使用低劑量mRNA-LNP疫苗攻擊模型以模擬減弱的免疫力；吾人用0.05 μg mRNA-LNP進行單次劑量免疫接種。儘管經此等低劑量mRNA-LNP疫苗接種的小鼠均產生全身性抗體反應，但吾人先前已說明此劑量不足以防止SARS-CoV-2攻擊。小鼠在初免後十四天接受IN棘蛋白(1 μg無佐劑之棘蛋白)。類似於吾人先前所描述之1 μg IM初免小鼠，用IN棘蛋白追加免疫之經0.05 μg IM初免的小鼠在追加免疫後42天在肺中之抗原特異性CD8 +T RM以及BALF中之IgA及IgG顯著增加( 圖 7A)。此等資料亦表明，即使藉由低劑量mRNA-LNP初免產生之免疫記憶含量極低，亦可藉由無佐劑IN棘蛋白免疫有效地加強以誘導黏膜及全身性體液及細胞記憶。
隨後用6×10 4PFU同源/祖型WA1菌株SARS-CoV-2攻擊未治療小鼠、僅低劑量初免小鼠及低劑量初免且棘蛋白免疫小鼠。在2 DPI時使小鼠安樂死且藉由斑塊檢定自鼻甲骨及肺評估病毒負荷，在5 DPI時使其安樂死且評估肺病理學，或監測其體重損失及死亡率持續14天( 圖 4A)。給予初免且棘蛋白免疫之所有小鼠均完全受保護免於體重減輕或死亡，但未治療小鼠及僅低劑量初免小鼠均未免受病毒攻擊( 圖 4B (B-D))。另外，接受初免且棘蛋白免疫之小鼠之發病率及死亡率的此顯著改良伴隨著上呼吸道(鼻甲骨)及下呼吸道(肺)中之病毒負荷降低( 圖 4B (E 、 F))。另外，初免且棘蛋白免疫引起對肺病理學之顯著保護，其中6隻小鼠中僅1隻在5 DPI時出現有限的單核浸潤，而其餘小鼠完全得到保護，其肺架構與未感染小鼠中所見之肺架構類似( 圖 4B (G) 、圖 4C)。為了評估mRNA-PACE IN追加免疫之保護能力，吾人再次使用低劑量初免mRNA-LNP小鼠且用10 μg之mRNA-PACE IN追加免疫。吾人發現，初免且PACE-棘蛋白免疫顯著防止發病率及死亡率( 圖 4D 、圖 4E)。此等資料表明，在臨床前小鼠模型中，IN無佐劑棘蛋白或mRNA-PACE編碼棘蛋白充分加強黏膜免疫力以防止COVID-19樣肺病及死亡率。此等結果亦突出顯示此疫苗策略之穩固性、通用性及安全性，因為藉由二者中之任一模態進行之全身性mRNA-LNP初免之鼻內追加免疫以誘導黏膜免疫力且防止致死性SARS-CoV-2攻擊。
實例 17 ： 初免且棘蛋白免疫引發類似於基於 mRNA-LNP 之非經腸追加免疫的穩定全身性免疫力。基於mRNA-LNP之IM注射疫苗為許多國家當前標準推薦的追加免疫策略，因為免疫原性及疫苗功效研究大部分集中於此追加免疫方法。為比較初免且棘蛋白免疫與IM mRNA-LNP初免/追加免疫，吾人用1 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行初免，隨後14天後進行1 μg IN棘蛋白免疫或1 μg IM mRNA-LNP。在追加免疫後31天使小鼠安樂死且藉由流式細胞分析技術評估抗原特異性CD8 +T RM，藉由ELISA評估來自BALF及血清之抗體，且進行VSV假病毒中和分析以評估血清抗體中和反應( 圖 8A- 圖 8C)。吾人發現IM mRNA-LNP追加免疫之動物及IN棘蛋白追加免疫之動物之血管外(IV -)四聚物 +CD8 +T細胞含量均提高；然而，僅IN棘蛋白追加免疫之動物在肺中產生表現CD69 +及CD103 +之CD8 +T RM( 圖 8B)。藉由ELISA，吾人發現僅IN棘蛋白追加免疫之動物在BALF中產生抗SARS-CoV-2 IgA。BALF IgG含量與IM mRNA-LNP及IN棘蛋白追加免疫之小鼠中類似，可能表示因IM mRNA-LNP追加免疫之小鼠中全身性抗體含量升高引起的胞吞轉送。吾人類似地發現在IM mRNA-LNP及IN棘蛋白追加免疫之小鼠中抗SARS-CoV-2 IgA及IgG之等效血清含量。來自血清之中和分析亦顯示IM mRNA-LNP與IN棘蛋白追加免疫之間類似的IC50。此等資料證明初免且棘蛋白免疫誘導與IM mRNA-LNP追加免疫類似的全身性中和抗體含量，其已被證明為一種關聯保護，且獨特地引發黏膜IgA及CD8 +T RM。
實例 18 ： 異源棘蛋白在無抗原原罪 (original antigenic sin) 下穩固地引發交叉反應性免疫力。以上實驗清楚地證明，藉由無佐劑次單元棘蛋白或藉由PACE-棘蛋白免疫編碼之棘蛋白在不同解剖位置(在此情況下為呼吸道黏膜)追加免疫，使得能夠在新的追加免疫部位形成新黏膜免疫記憶且增強對彼抗原之全身性免疫力。在無佐劑次單元棘蛋白及mRNAPACE中，追加免疫抗原與全身性初免抗原(mRNA-LNP)同源。SARS-CoV-2之當前流行菌株，特別地德爾塔及奧密克戎，其棘蛋白序列及結構發生顯著變化。德爾塔具有T19R、G142D、Δ156-157、R158G、Δ213-214、L452R、T478K、D614G、P681R及D950N突變，而奧密克戎具有A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、N211I、L212V、ins213-214RE、V215P、R216E、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K及L981F突變。此等突變已使得德爾塔及奧密克戎更快速地傳輸且避開預先存在之體液免疫力，且未來變異體很可能將甚至更多地分化，表明引發廣泛反應性免疫力之追加免疫策略將為中和未來變異體所必需的。為測試無佐劑異源棘蛋白用於IN追加免疫之能力，吾人用1 μg mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行初免，之後在14天後，用5 μg的含有三聚物穩定化突變(R667A、K968P、V969P)之SARS-CoV-1棘蛋白追加免疫，或初免且棘蛋白免疫X( 圖 5A)。儘管SARS-CoV-1為相關薩貝冠狀病毒，但其棘蛋白與由當前使用之mRNA-LNP疫苗編碼之原始SARS-CoV-2棘蛋白序列僅具有76%同源性。為了比較，吾人亦用1 μg IM mRNA-LNP對mRNA-LNP初免小鼠進行追加免疫。在追加免疫後31天，使用CD45 IV標記，吾人發現表現典型T RM標記物CD69 +及CD103 +之IV -四聚物 +CD8 +T細胞( 圖 5B)。如前面所指出，此MHC I四聚物序列在SARS-CoV-1及SARS-CoV-2均為之一部分的薩貝冠狀病毒家族內高度保守。隨後，吾人評估抗SARS-CoV-1抗體在BALF及血清中之發展且發現相對於IM mRNA-LNP初免/追加免疫，在初免且棘蛋白免疫X中抗SARS-CoV-1 IgA及IgG在呼吸道黏膜及循環中顯著增加。與先前研究一致，吾人發現兩種劑量之SARS-CoV-2 mRNA-LNP足以誘導結合SARS-CoV-1棘蛋白之可偵測抗體。隨後，吾人評估BALF及血清中之抗SARS-CoV-2抗體。吾人發現初免且棘蛋白免疫X誘導之BALF IgA高於IM SARS-CoV-2 mRNA-LNP初免/追加免疫。吾人發現BALF中之抗SARS-CoV-2 IgG之類似含量，此可能表示吾人發現之增加的血清IgG ( 圖 5C (I-L))。隨後，使用基於VSV之假病毒中和分析，吾人表明相較於用I SARS-CoV-2 mRNA-LNP追加免疫之小鼠，來自初免且棘蛋白免疫X小鼠之血清針對SARS-CoV-1產生較高中和力價( 圖 5C (M 、 N))。類似地，且與血清IgG含量一致，IM SARS-CoV-2 mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠針對SARS-CoV-2之中和力價顯著高於初免且棘蛋白免疫X小鼠( 圖 5C (O 、 P))。綜合而言，此等資料表明，在無抗原原罪的情況下，用無佐劑異源棘蛋白之IN追加免疫可誘導針對大量相異棘蛋白之強效黏膜細胞及體液記憶。
實例 19 ： 初免且棘蛋白免疫誘導針對 SARS-CoV-2 之黏膜免疫力在過去兩年SARS-CoV-2大流行期間，含有囊封於脂質奈米顆粒(LNP)中之經修飾mRNA的疫苗非常有效。3期臨床試驗及後續市售疫苗有效性研究最初展示＞90%針對有症狀疾病之疫苗功效。不幸的是，近期研究已證明在使用基於mRNA-LNP之方案接種第二劑疫苗後約4個月開始就無症狀感染以及有症狀及嚴重感染而言疫苗有效性降低。此研究用以分析初免且棘蛋白免疫對於先前經過SARS-CoV-2疫苗接種或感染SARS-CoV-2之患者的作用。為此目的，將先前經過SARS-CoV-2疫苗接種或感染SARS-CoV-2之患者均勻地分成兩個組。一個組為對照組且投與含有安慰劑之鼻內調配物；另一組投與含有FDA批准通過之mRNA疫苗的鼻內調配物。在患者感染或疫苗接種之後的1個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月或十二個月時投與。為評估初免且棘蛋白免疫之有效性，將在疫苗投與之黏膜部位量測CD8 +T細胞、CD4 +T細胞、記憶T細胞(T RM)及B細胞(B RM)以及黏膜IgG及二聚IgA。
實例 20 ： 初免且棘蛋白免疫誘導針對人類乳突病毒 (HPV) 之黏膜免疫力此研究用以分析初免且棘蛋白免疫對於先前經過HPV疫苗接種或感染HPV之患者的作用。為此目的，將先前經過HPV疫苗接種或感染HPV之患者均勻地分成兩個組。一個組為對照組且投與含有安慰劑之陰道調配物；另一組投與含有針對HPV之疫苗的陰道調配物。在患者感染或疫苗接種之後的1個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月或十二個月時投與。為評估初免且棘蛋白免疫之有效性，將在疫苗投與之黏膜部位量測CD8 +T細胞、CD4 +T細胞、記憶T細胞(T RM)及B細胞(B RM)以及黏膜IgG及二聚IgA。
實例 21 ： 初免且棘蛋白免疫誘導針對輪狀病毒之黏膜免疫力此研究用以分析初免且棘蛋白免疫對於先前經過輪狀病毒疫苗接種或感染輪狀病毒之患者的作用。為此目的，將先前經過輪狀病毒疫苗接種或感染輪狀病毒之患者均勻地分成兩個組。一個組為對照組且投與含有安慰劑之經口調配物；另一組投與含有針對輪狀病毒之疫苗的經口調配物。在患者感染或疫苗接種之後的1個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月或十二個月時投與。為評估初免且棘蛋白免疫之有效性，將在疫苗投與之黏膜部位量測CD8 +T細胞、CD4 +T細胞、記憶T細胞(T RM)及B細胞(B RM)以及黏膜IgG及二聚IgA。
圖 1A繪示實驗，其中用1 μg之編碼全長SARS-CoV-2 (SCV2)棘蛋白的mRNA-脂質奈米顆粒(LNP)對K18-hACE2小鼠進行肌內(IM)免疫接種，隨後在mRNA-LNP免疫接種之後14天用1 μg之融合前穩定化三聚重組SARS-CoV-2 (SCV2)棘蛋白進行鼻內(IN)免疫接種。在IN追加免疫後十四天，收集血清、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及鼻洗液以評估結合及中和抗體反應。收集肺組織用於血管外B細胞分析。
圖 1B顯示未治療小鼠、經mRNA-LNP IM免疫接種(IM初免)之小鼠、經棘蛋白IN免疫接種(IN棘蛋白免疫)之小鼠或經IM初免及用棘蛋白IN追加免疫接種(初免且棘蛋白免疫)之小鼠中SCV2棘蛋白S1次單元特異性鼻洗液IgA ( B)、鼻洗液IgG ( C)、BALF IgA ( D)、BALF IgG ( E)、血清IgA ( F)及血清IgG ( G)之量測結果。
圖 1C顯示針對BALF ( H,I)及血清( J,K)中SCV2棘蛋白假型水皰性口炎病毒(VSV)之中和力價的量測結果。
圖 1D顯示來自IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之肺組織中各種血管外(靜脈內標記抗體陰性) B細胞子集合(包括RBD四聚物結合B細胞、IgA +駐留記憶B細胞(B RM)、IgG +B RM、IgA +抗體分泌細胞(ASC)及IgG +ASC)的量測結果。
圖 2A繪示實驗，其中用1 μg mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免且14天後用1 μg SCV2棘蛋白進行IN追加免疫。收集肺組織、BALF及鼻甲骨以用於血管外T細胞分析。在追加免疫後14天收集肺組織，在追加免疫後7天收集BALF及鼻甲骨。
圖 2B顯示血管外CD8 T細胞反應：肺組織( B- D)、BALF( E- G)中之SCV2棘蛋白特異性四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞之量化。
圖 2C顯示血管外CD8 T細胞反應：鼻甲骨中SCV2棘蛋白特異性四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞之量化( H- J)；( K- P)血管外CD4 T細胞反應：來自未治療小鼠、IM初免小鼠、IN棘蛋白免疫小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠肺組織( K- M)或BALF ( N- P)中之活化多株CD4 T細胞、CD69 +CD103 -CD4 T細胞或CD69 +CD103 +CD4 T細胞之量化。
圖 3A繪示實驗，其中用1 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免，隨後在IM初免後14天用1 μg之裸mRNA (IN裸mRNA免疫)或1 μg之由PACE囊封之mRNA (IN PACE-棘蛋白免疫)進行IN追加免疫。在IN追加免疫後十四(14)天，收集BALF及血液用於抗體量測。收集肺組織用於CD8 T細胞分析。
圖 3B顯示來自未治療小鼠、IM初免小鼠、IN PACE-棘蛋白免疫小鼠、IM初免+IN裸mRNA免疫小鼠或初免且PACE-棘蛋白免疫小鼠之肺組織中的所有四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞、或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞之量化。
圖 3C顯示未治療小鼠、IM初免小鼠、IN PACE-棘蛋白免疫小鼠、IM初免+IN裸mRNA免疫小鼠或初免且PACE-棘蛋白免疫小鼠中SARS-CoV-2棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( E)、BALF IgG ( F)、血清IgA ( G)及血清IgG ( H)之量測結果。
圖 4A繪示實驗，其中用0.05 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免且在IM初免後14天用1 μg之棘蛋白IN進行IN追加免疫。追加免疫後第6週，用6×10 4PFU SARS-CoV-2 (2019n-CoV/USA_WA1/2020)攻擊小鼠。第一組用於評估直至感染後14天(DPI)之體重減輕及存活率。第二組用於收集2 DPI之肺及鼻甲骨組織以用於量測病毒力價。第三組用於收集5 DPI之肺組織以用於組織學評估。
圖 4B顯示自1至14 DPI之未治療小鼠、IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之體重減輕及存活率。( E- F)藉由斑塊檢定量測在2 DPI之肺及鼻甲骨組織中的感染性病毒力價。( G)藉由蘇木素-伊紅(H&E)染色之肺切片在5 DPI的病理學分數。
圖 4C顯示來自未感染小鼠、IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠的代表性H&E染色結果。
圖 4D繪示實驗，其中用0.05 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免且在IM初免後第14天用10 μg之由PACE囊封之mRNA (IN PACE-棘蛋白免疫)進行IN追加免疫。追加免疫後6週，用6×10 4PFU SARS-CoV-2 (2019n-CoV/USA_WA1/2020)攻擊小鼠。
圖 4E顯示自1至14 DPI之未治療、IM初免或初免且PACE-棘蛋白免疫K18-hACE2小鼠之體重減輕及存活率。
圖 5A繪示實驗，其中用1 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免，在IM初免後14天用1 μg之mRNA-LNP IM或5 μg之融合前穩定化三聚重組SARS-CoV-1 (SCV1)棘蛋白IN (IN棘蛋白免疫X)進行追加免疫。在追加免疫後三十一天，收集肺組織以藉由流式細胞分析技術進行T細胞分析，且收集BALF及血液以用於抗體量測。
圖 5B顯示來自未治療小鼠、mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠或初免且棘蛋白X免疫小鼠之肺組織中所有四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞之量化。
圖 5C顯示未治療小鼠、mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠或初免且棘蛋白X免疫小鼠中SCV1棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( E)、BALF IgG ( F)、血清IgA ( G)及血清IgG ( H)的量測結果。( I- L)未治療小鼠、mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠或初免且棘蛋白X免疫小鼠中SCV2棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( I)、BALF IgG ( J)、血清IgA ( K)及血清IgG ( L)的量測結果。( M,N)針對SCV1棘蛋白-假型VSV之中和力價的量測結果。( O, P)針對SCV2棘蛋白-假型VSV之中和力價的量測結果。
圖 6A繪示實驗，其中用1 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免且在IM初免後12週用1 μg SCV2棘蛋白進行IN追加免疫。在追加免疫後七天及56天，收集肺組織以藉由流式細胞分析技術進行T細胞分析，且收集BALF及血液以用於抗體量測。
圖 6B顯示( B- D)在追加免疫後7天及56天來自IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之肺組織中全部四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞的量化。( E- G)在追加免疫後7天及56天來自IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之肺組織中全部活化多株CD4 T細胞、CD69 +CD103 -CD4 T細胞或CD69 +CD103 +CD4 T細胞的量化。
圖 6C顯示追加免疫後7天及56天在IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠中SCV2棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( H)、BALF IgG ( I)、血清IgA ( J)及血清IgG ( K)的量測結果。
圖 7A繪示實驗，其中用0.05 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免且在IM初免後14天用1 μg之棘蛋白IN進行IN追加免疫。追加免疫後六週，收集肺組織以藉由流式細胞分析技術進行CD8 T細胞分析，且收集BALF及血液用於抗體量測。
圖 7B顯示來自未治療小鼠、IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之肺組織中全部四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞的量化。
圖 7C顯示未治療小鼠、IM初免小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠中SCV2棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( E)、BALF IgG ( F)、血清IgA ( G)及血清IgG ( H)的量測結果。
圖 8A繪示實驗，其中用1 μg之mRNA-LNP對K18-hACE2小鼠進行IM初免，隨後在IM初免後14天用1 μg之mRNA-LNP IM或1 μg之SCV2棘蛋白IN (IN棘蛋白免疫)進行追加免疫。追加免疫後四十五天，收集肺組織以藉由流式細胞分析技術進行T細胞分析，且收集BALF及血液用於抗體量測。
圖 8B顯示來自未治療小鼠、mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠之肺組織中全部四聚物 +CD8 T細胞、CD69 +CD103 -四聚物 +CD8 T細胞或CD69 +CD103 +四聚物 +CD8 T細胞的量化。
圖 8C顯示未治療小鼠、mRNA-LNP初免/追加免疫小鼠或初免且棘蛋白免疫小鼠中SARS-CoV-2棘蛋白S1次單元特異性BALF IgA ( E)、BALF IgG ( F)、血清IgA ( G)及血清IgG ( H)的量測結果。( I, J)針對SCV2棘蛋白-假型VSV之中和力價的量測結果。
圖 9顯示所萃取mRNA之長度及完整性係使用瓊脂糖凝膠電泳分析。將所萃取mRNA與SYBR Safe染料混合，隨後裝載至1%瓊脂糖凝膠上，使其在TAE緩衝液中操作，且用凝膠成像系統成像。
圖 10A-圖 10B顯示( A)鑑別血管外抗原特異性CD8 T細胞及多株活化CD4 T細胞之選通策略。( B)鑑別血管外抗原特異性及多株B細胞子集合之選通策略。
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Claims (69)

  1. 一種增強有需要之人中對抗原之免疫反應的方法，該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含該抗原或編碼該抗原之核酸，其中該人先前已針對病毒進行疫苗接種或感染該病毒。
  2. 如請求項1之方法，其中該人已針對該病毒進行非經腸疫苗接種。
  3. 如請求項1之方法，其中該抗原為多價抗原。
  4. 一種增強有需要之人中對抗原之免疫反應的方法，該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含該抗原，其中該人具有升高之抗體、記憶B細胞、效應CD4 +及/或CD8 +T細胞。
  5. 如請求項4之方法，其中該等升高之抗體、記憶B細胞、效應CD4 +及/或CD8 +T細胞由先前針對病毒之疫苗接種引起。
  6. 如請求項4之方法，其中該等升高之抗體、記憶B細胞及效應CD4 +及CD8 +T細胞由先前病毒感染引起。
  7. 如請求項5或請求項6之方法，其中該等升高之抗體為免疫球蛋白G (IgG)、IgM、IgA或其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該黏膜部位為鼻。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該抗原包含至少一種蛋白質或多肽。
  10. 如請求項1之方法，其中該核酸為DNA或RNA。
  11. 如請求項1之方法，其中該核酸為mRNA。
  12. 如請求項11之方法，其中該mRNA為N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA。
  13. 如請求項11之方法，其中該mRNA為假尿苷修飾之mRNA。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該抗原源於微生物病原體。
  15. 如請求項14之方法，其中該微生物病原體為分枝桿菌、細菌、真菌、病毒、寄生蟲或普里昂蛋白(prion)。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該病毒選自由以下組成之群：輪狀病毒、諾羅病毒、腺病毒、星狀病毒、其變異體及其任何組合。
  17. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該病毒選自由以下組成之群：流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒、間質肺炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、波卡病毒、其變異體及其任何組合。
  18. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該病毒選自由以下組成之群：第1型單純疱疹病毒(HSV-1)、第2型單純疱疹病毒(HSV-2)、人類乳突病毒(HPV)、其變異體及其任何組合。
  19. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該病毒選自由以下組成之群：人類免疫不全病毒(HIV)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰白質炎、日本腦炎、天花、流感病毒、黃病毒、ECHO病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、人類嗜T淋巴球病毒(HTLV)、登革熱病毒、人類乳突病毒(HPV)、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、蟲媒病毒性腦炎病毒、SARS-CoV-2、Henoch-Schonlein二氏紫癜病(HSP)、RNA病毒、DNA病毒、其變異體及其任何組合。
  20. 如請求項19之方法，其中該RNA病毒選自由以下組成之群：感冒、流感、SARS、MERS、Covid-19、登革熱病毒、C型肝炎、E型肝炎、西尼羅河熱、伊波拉病毒病、狂犬病、脊髓灰質炎、腮腺炎、麻疹、其變異體及其任何組合。
  21. 如請求項19之方法，其中該DNA病毒選自由以下組成之群：單純疱疹病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰狀病毒、艾司坦-巴爾病毒、玫瑰疹病毒(roseolo virus)、人類疱疹病毒第7型、卡波西氏肉瘤相關病毒(Kaposi's sarcoma-associated virus)、其變異體及其任何組合。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該抗原藉由黏膜遞送投與。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗原投與至人類個體之黏膜組織。
  24. 如請求項23之方法，該黏膜組織選自由以下組成之群：前鼻孔、鼻竇、直腸、陰道、食道、尿道、舌下及口頰。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該醫藥組合物經鼻內投與。
  26. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該醫藥組合物不包含佐劑。
  27. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含佐劑。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含脂質奈米顆粒(LNP)。
  29. 如請求項28之方法，其中該抗原囊封於該脂質奈米顆粒(LNP)內。
  30. 如請求項28之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一種陽離子脂質。
  31. 如請求項30之方法，其中該至少一種陽離子脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-雙-O-十八烯基-3-三甲銨丙烷(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)。
  32. 如請求項28之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)包含聚(胺-共-酯) (PACE)聚合物。
  33. 如請求項28之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)進一步包含至少一種磷脂。
  34. 如請求項33之方法，其中該至少一種磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該人已在以下時間針對該病毒進行疫苗接種或感染該病毒：約一週前、兩週前、三週前、一個月前、兩個月前、三個月前、四個月前、五個月前、六個月前、七個月前、八個月前、九個月前、十個月前、十一個月前或十二個月前。
  36. 一種增強有需要之人對SARS-CoV-2之免疫反應的方法，該方法包含在黏膜部位向個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含至少一種mRNA，其中該人先前已針對病毒進行疫苗接種或感染該病毒。
  37. 如請求項36之方法，其中該人先前已接種一或多種選自由以下組成之群的COVID-19疫苗：BNT162b2 (Pfizer/BioNTech)、mRNA-1273 (Moderna)、AZD1222/ChAdOxl (AstraZeneca/Oxford)、Ad5載體化之COVID-19疫苗(CanSino Biologies)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV2373 (Novavax)及其組合。
  38. 如請求項36之方法，其中該至少一種mRNA編碼SARS-CoV-2之棘蛋白或其變異體或其片段。
  39. 如請求項36之方法，其中該醫藥組合物包含編碼兩種或更多種不同抗原之mRNA。
  40. 如請求項36之方法，其中該兩種或更多種抗原為SARS-CoV-2之棘蛋白或其變異體或其片段。
  41. 如請求項40之方法，其中該兩種或更多種抗原包含表1中所列之至少一種突變。
  42. 如請求項36至41中任一項之方法，其中該醫藥組合物不包含佐劑。
  43. 如請求項36至41中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含佐劑。
  44. 如請求項36至43中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。
  45. 如請求項44之方法，其中該至少一種mRNA囊封於該脂質奈米顆粒(LNP)內。
  46. 如請求項45之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)包含至少一種陽離子脂質。
  47. 如請求項46之方法，其中該至少一種陽離子脂質包含1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲銨丙烷(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)。
  48. 如請求項45之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)包含聚(胺-共-酯) (PACE)聚合物。
  49. 如請求項45之方法，其中該脂質奈米顆粒(LNP)進一步包含至少一種磷脂。
  50. 如請求項49之方法，其中該至少一種磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)。
  51. 如請求項36至50中任一項之方法，其中該脂質奈米顆粒之平均直徑在約50 nm至約1000 nm之範圍內。
  52. 如請求項36至50中任一項之方法，其中該脂質奈米顆粒之平均直徑在以下之範圍內：約50 nm至約400 nm、約50 nm至約200 nm、約200 nm至約1000 nm、約200 nm至約800 nm或約300 nm至約600 nm。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該免疫反應為黏膜免疫反應。
  54. 如請求項53之方法，其中該黏膜免疫反應為抗原特異性IgA抗體產生。
  55. 如請求項53之方法，其中該黏膜免疫反應為抗原特異性IgG抗體產生。
  56. 如請求項53之方法，其中該黏膜免疫反應為抗原特異性IgM抗體產生。
  57. 如請求項36之方法，其中該人具有升高之中和抗體含量，此係由先前針對選自由以下組成之群的病毒進行疫苗接種引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  58. 如請求項36之方法，其中該人具有升高之中和抗體含量，此係由先前感染選自由以下組成之群的病毒引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  59. 如請求項57或請求項58中任一項之方法，其中該升高之中和抗體為IgG、IgM、IgA或其組合。
  60. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgG抗體，此係由先前針對選自由以下組成之群的病毒進行疫苗接種引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  61. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgM抗體，此係由先前針對選自由以下組成之群的病毒進行疫苗接種引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  62. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgA抗體，此係由先前針對選自由以下組成之群的病毒進行疫苗接種引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  63. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgG抗體，此係由先前感染選自由以下組成之群的病毒引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  64. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgM抗體，此係由先前感染選自由以下組成之群的病毒引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  65. 如請求項59之方法，其中該人具有升高之IgA抗體，此係由先前感染選自由以下組成之群的病毒引起：MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-Cov-2及其變異體。
  66. 如請求項35至65中任一項之方法，其中該人已在以下時間針對該病毒進行疫苗接種或感染該病毒：約一週前、兩週前、三週前、一個月前、兩個月前、三個月前、四個月前、五個月前、六個月前、七個月前、八個月前、九個月前、十個月前、十一個月前或十二個月前。
  67. 如請求項35至65中任一項之方法，其中SARS-CoV-2變異體選自由以下組成之群：阿爾法(B.1.1.7及Q譜系)、貝塔(B.1.351及後代譜系)、伽馬(P.1及後代譜系)、德爾塔(B.1.617.2及AY譜系)、艾普西隆(B.1.427及B.1.429)、伊塔(B.1.525)、約塔(B.1.526)、卡帕(B.1.617.1)、1.617.3、謬(B.1.621、B.1.621.1)、澤塔(P.2)、謬(B.1.621、B.1.621.1)、奧密克戎(Pango譜系B.1.1.529、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3)及其組合。
  68. 如請求項35至67中任一項之方法，其中該至少一種mRNA為N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA。
  69. 如請求項35至67中任一項之方法，其中該至少一種mRNA為假尿苷修飾之mRNA。
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