CN116621990B - 一种SARS-CoV-2疫苗抗原的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种SARS‑CoV‑2疫苗抗原的制备方法及其应用,该疫苗抗原为直径为706~710nm的纳米颗粒,是由N蛋白和Ferritin蛋白的融合蛋白自组装形成。Ferritin为幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白,其具备自组装特性,与N蛋白融合表达后可将N蛋白展示于Ferritin纳米颗粒的表面,提高抗原提呈细胞对N蛋白抗原分子的识别效率,高效启动特异性免疫应答反应,促进机体产生针对N蛋白的中和性抗体,延长机体对N抗原的免疫记忆,产生更加高效且持久的免疫保护,为SARS‑CoV‑2通用疫苗的开发提供候选抗原。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种SARS-CoV-2疫苗抗原的制备方法及其应用。
背景技术
COVID-19的病原体为新型冠状病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2),由于病毒基因极易发生变异给该病防控带来极大困难。目前变异新冠状病毒主要有Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda和Omicron六大类。Omicron的严重程度从传播速度和病死率两个维度来看都远高于流感和此前的新冠其他变异株。
全球在研的新冠疫苗可达近200余种,部分已经进入临床实验阶段。我国推进研发的新冠疫苗包括以下5类:灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗和减毒流感病毒载体疫苗。灭活疫苗具有制备周期短,安全性高的优点,但其免疫原性较低,诱发的主要为体液免疫。减毒活疫苗的免疫原性更强且不需要添加额外佐剂,可同时诱发体液免疫和细胞免疫,但可能会在体内出现毒力返强的情况,所以其安全性评估格外重要。腺病毒载体疫苗是用经过改造后无害的腺病毒作载体,装入新冠病毒的S蛋白基因,刺激人体产生抗体,但由于部分人群感染过腺病毒可能影响疫苗免疫效果。重组亚单位疫苗的主要成分则是通过生物工程方法大量表达S蛋白或RBD抗原,这种疫苗成分单一、安全性非常好,量产流程也比较成熟,但由于免疫原性相对较弱,需要对疫苗组分和构建方式进行优化。核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗,其基因组成均为S或RBD区编码基因,核酸成分设计及制备都相对简单,但需要特定的佐剂及递送系统才能有效发挥生物活性;同时此项技术较新其安全性还有待进一步的观察分析。减毒流感病毒疫苗作为载体,携带新冠病毒的S蛋白,共同刺激人体产生针对两种病毒的抗体,但此类疫苗研发周期相对较长。
以上几类获批或在研的新冠疫苗除灭活疫苗为全病毒灭活处理产物及减毒活疫苗包含病毒全部结构蛋白成分外,其他几类疫苗的靶抗原均为S蛋白或重组RBD蛋白,S蛋白特别是其RBD区极易发生突变致使现有疫苗有效性降低,而疫苗的研究又滞后于病毒突变速度,无法抵抗流行毒株的攻击。因此,亟需开发一种能够有效防御新冠变异毒株的新型疫苗。
发明内容
针对现有技术存在的问题和缺陷,本发明提供一种SARS-CoV-2疫苗抗原的制备方法及其应用,该抗原免疫后有望刺激机体相关免疫细胞的活化并产生抵抗SARS-CoV-2的抗体,且抗体的滴度更高、免疫记忆维持时间更长。本发明的技术方案为:
第一方面,本发明提供一种SARS-CoV-2疫苗抗原,该疫苗抗原为直径为706~710nm的纳米颗粒,是由N蛋白和Ferritin蛋白的融合蛋白自组装形成。
进一步地,所述N蛋白为SARS-CoV-2N蛋白,所述SARS-CoV-2N蛋白的氨基酸序列如SEQ_1所示,编码该SARS-CoV-2N蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_2所示。
进一步地,所述Ferritin蛋白的氨基酸序列如SEQ_3所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_4所示。
进一步地,所述SARS-CoV-2N蛋白融合于Ferritin蛋白的N-端获得N-Ferritin融合蛋白,所述N-Ferritin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ_5所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_6所示。
第二方面,本发明还提供了一种表达载体,其包括有上述疫苗抗原的融合蛋白的编码序列,该表达载体用于转载上述疫苗抗原的编码序列。
优选地,该表达载体为pET28a。
第三方面,本发明还提供上述疫苗抗原的制备方法,其包括在使宿主细胞能够产生上述疫苗抗原的条件下,将一个或多个上述表达载体导入宿主细胞。
优选地,所述宿主细胞选自大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
进一步地,所述制备方法还包括将表达载体导入宿主细胞后获得的菌株进行培养从而获得以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白。
进一步地,所述菌体培养获得以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白的过程包括:
(1)将携带pET-N-Ferritin质粒的菌株以1:1000的比例接种于Kan+抗性的LB培养基中,于37℃、200rpm条件下培养12-16h;
(2)进一步将新鲜活化的菌液以1.5:100的比例接种于Kan+抗性的LB培养基中,于37℃、200rpm条件下培养至OD值为0.6-0.8之间;
(3)在细菌培养液中加入IPTG诱导剂,使其终浓度为0.8M,于37℃、200rpm条件下继续培养4-5h;
(4)培养结束后离心,收集菌体。
进一步地,所述步骤(4)中离心条件为:3~5℃,6000~10000rmp离心10~15min。
进一步地,所述制备方法还包括将以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白处理成包涵体溶解物,以及将包涵体溶解物进行纯化。
进一步地,所述将以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白处理成包涵体溶解物的过程包括:
1)将菌体采用非变性裂解液重悬后进行超声裂解;超声裂解结束后,离心弃上清,加入1×PBS重悬清洗后再次离心弃上清,保留沉淀物;
2)沉淀物中加入含8M尿素的Binding/washing buffer,重悬沉淀物;将重悬物以1:1000的比例加入DTT溶液,混合均匀后采用超声促溶解;
3)收集超声产物离心后上清液,得到包涵体溶解物。
进一步地,所述离心条件为:4℃、12000rpm离心5~25min。
进一步地,所述将包涵体溶解物进行纯化的过程包括:
①从4℃冰箱中取出Ni-TED蛋白纯化柱,排空保存液,加入含8M尿素的Binding/washing buffer,平衡纯化柱;
②将包涵体溶解物加入含8M尿素的Binding/washing buffer稀释后加至Ni-TED蛋白纯化柱中,反复穿流3次,收集穿流液;
③利用含20mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并收集洗涤液,重复该步骤1次;
④利用含40mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并收集洗涤液,重复该步骤1次;
⑤利用含60mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集,重复该步骤1次;
⑥利用含80mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集,重复该步骤1次;
⑦利用含8M尿素的洗脱液将Ni-TED蛋白纯化柱上吸附的目的蛋白进行洗脱,将洗脱液收集,重复该步骤3次;
⑧分别取②-⑦步骤中所收集的穿流液、洗涤液和洗脱液80μL,再分别与20μL5×SDS蛋白上样缓冲液混合,将全部样品置于100℃金属浴中处理15min,冰浴5min后,利用SDS-PAGE蛋白电泳对实验结果进行分析;
⑨将纯化好的蛋白置换缓冲液并浓缩。
进一步地,所述步骤⑨中将纯化完毕的蛋白置换缓冲液浓缩,是采用超滤管将溶解于变性洗脱液中的蛋白置换至PBS置换缓冲液中并进一步浓缩,然后使用超微量核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度。
进一步地,所述浓缩的过程具体包括:
1.蛋白上柱:将纯化好的蛋白加至超滤管中,于4℃、4000rmp离心7min,至液面到达1.5ml标记以下;
2.置换缓冲液:加入蛋白液体积3倍量的PBS置换缓冲液,共置换3次;每次于4℃、4000rmp离心7min,至液面到达1.5ml标记以下,加入PBS吹匀后再离心。
第四方面,本发明还提供一种免疫原性组合物,包括上述的疫苗抗原。
进一步地,所述组合物还包括佐剂。
优选地,所述佐剂为弗氏佐剂。
第五方面,本发明还提供一种在对象中产生针对SARS-CoV-2的免疫应答的非疾病诊断治疗的方法,该方法包括给予对象有效量的上述免疫原性组合物。
进一步地,该方法可通过粘膜、皮内、皮下、肌肉内和/或口服来给予免疫原性组合物,在某些方面,接种引起的免疫应答使得该对象可以抵御一种或多种SARS-CoV-2的亚型。
本发明根据大肠杆菌密码子偏嗜性,通过基因优化合成的方法,首次将SARS-CoV-2N基因融合于Ferritin基因的N-端,获得N-Ferritin融合基因,利用基因克隆的方法将其克隆至pET28a表达载体中,获得pET-N-Ferritin重组质粒;将pET-N-Ferritin重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中,经诱导表达、蛋白纯化及浓缩流程,获得N-Ferritin融合蛋白;Ferritin为幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白,其具备自组装特性,与N蛋白融合表达后可将N蛋白展示于Ferritin纳米颗粒的表面,提高抗原提呈细胞对N蛋白抗原分子的识别效率,高效启动特异性免疫应答反应,促进机体产生针对N蛋白的中和性抗体,延长机体对N抗原的免疫记忆,产生更加高效且持久的免疫保护,为SARS-CoV-2通用疫苗的开发提供候选抗原。
附图说明
图1为本发明具体实施例中从抗原制备再到相关验证的技术流程图。
图2为本发明实施例1中N-Ferritin蛋白诱导表达结果;图中,M:蛋白质分子量标准;1:诱导前菌体蛋白表达情况;2:诱导后菌体蛋白表达情况;3:诱导后菌体经超声后上清中蛋白表达情况;4:诱导后菌体超声后沉淀中蛋白表达情况。
图3为本发明实施例1中N-Ferritin蛋白纯化结果;M:蛋白质分子量标准;1:纯化后的N-Ferritin蛋白;2:诱导后菌体总蛋白。
图4为N-Ferritin纳米颗粒的粒径分析结果。
图5为本发明实施例2中血清抗体水平ELISA检测结果;在第0、第21天和42天分别注射SARS-CoV-2N、SARS-CoV-2N-Ferritin抗原后,第7、28、49、90天时检测小鼠血清中N蛋白特异性IgG抗体滴度。
图6为本发明实施例3中流式细胞增殖检测结果,其中,图A为DC细胞及Mф细胞分析结果,图B为Tfh细胞及Active CD4+分析结果,图C为脾脏中GC B细胞及MB细胞分析结果。
具体实施方式
本发明研发一种COVID-19通用疫苗的候选抗原,该抗原免疫后有望刺激机体相关免疫细胞的活化并产生抵抗SARS-CoV-2的抗体,且抗体的滴度更高、免疫记忆维持时间更长。
基于此,本发明进行抗原制备及相关验证的流程如图1所示,包括:
1.抗原制备:
以相对保守的SARS-CoV-2N蛋白为靶抗原,利用Ferritin的自组装及抗原展示特性,设计N-Ferritin融合基因;利用大肠杆菌表达系统对融合蛋白进行表达,纯化后可自组装为纳米颗粒的融合N-Ferritin。
所述SARS-CoV-2N蛋白的氨基酸序列如SEQ_1所示,编码该SARS-CoV-2N蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_2所示。
所述Ferritin蛋白的氨基酸序列如SEQ_3所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_4所示。
所述SARS-CoV-2N蛋白融合于Ferritin蛋白的N-端获得N-Ferritin融合蛋白,所述N-Ferritin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ_5所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_6所示。
2.动物免疫:
以Balb/c小鼠为动物模型,将其分为PBS空白对照组、N组、N-Ferritin组,每组6只小鼠;空白对照组只注射PBS溶液,N组和N-Ferritin组分别免疫N蛋白和N-Ferritin融合蛋白,于0d、21d、42d进行免疫,共免疫3次。
3.相关免疫细胞增殖检测:
在上述2过程的基础上,于首次免疫后4h、10d、42d取小鼠脾脏和淋巴,进行流式细胞术。检测DC、Mф、Tfh、ActiveCD4+T、GC B及MB细胞进行检测。
4.N蛋白特异性抗体水平监测:
在上述2过程的基础上,首次免疫后7、28、49、90天,小鼠尾静脉采血,收集血清,利用实验室建立的ELISA检测方法测定小鼠血清中anti-NIgG的滴度水平。
在本发明的描述中,需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
1.菌体制备
1.1将携带pET-N-Ferritin重组质粒的E.coli BL21(DE3)菌株以1:1000的比例接种于含有Kan+抗性的LB培养基中,置于37℃摇床中200rpm过夜培养15h;所述pET-N-Ferritin重组质粒的BL21(DE3)菌株的获得是通过pET28a表达载体转载N-Ferritin融合基因,再将获得的pET-N-Ferritin重组质粒导入宿主细胞大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经诱导后可表达N-Ferritin融合蛋白,蛋白表达鉴定正确后,将携带pET-N-Ferritin重组质粒的E.coli BL21(DE3)菌体冻存于-80℃备用。
1.2将新鲜活化的菌种以1.5:100的比例接种于200mLKan+的LB培养基中,37℃、200rpm培养2h40min左右,测定OD值,当OD值达到0.6-0.8之间时,在细菌培养液中加入IPTG诱导剂,使其终浓度为0.8M,37℃、200rpm继续培养5h后,4℃、6000rpm、10min离心收获菌体。
2.包涵体蛋白收集及处理
2.1取200ml细菌培养液离心所获得菌体,利用4mL非变性裂解液将菌体重悬后转移至10mL离心管中,利用超声波破碎机(参数设置功率:30%,时间:40min,超声开3s停3s)在0℃条件下,对菌体进行超声裂解;
2.2超声结束后,4℃、12000rpm离心25min,彻底弃掉上清液,加入适量1×PBS缓冲液清洗沉淀物,再次4℃、12000rpm离心5min,弃掉上清液,保留沉淀物;
2.3取适量含8M尿素的蛋白纯化用Binding/washing buffer重悬溶解沉淀物,以1:1000的比例加入DTT溶液混匀,超声促溶解(参数设置功率:10%,时间:20min,超声开3s停3s),期间观察沉淀是否完全溶解,如不溶解延长超声时间,整个过程需保证在0℃条件下进行;超声结束后,4℃12000rpm离心20min,收集上清液,弃掉无法溶解的沉淀物;
2.5向上清液中加入8M尿素的蛋白纯化用Binding/washing buffer将其总体积补足至10mL,以进行后续纯化实验。
3.蛋白纯化
3.1取出Ni-TED蛋白纯化柱,排空保存液,加入10ml含8M尿素的Binding/washingbuffer,平衡纯化柱;
3.2将包涵体溶解物加入含8M尿素的Binding/washing buffer稀释后加至Ni-TED蛋白纯化柱中,反复穿流3次,并将穿流液收集至10ml离心管中;
3.3利用10ml含20mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集至10mL离心管中,(此步骤重复1次);
3.4利用10ml含40mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集至10mL离心管中,(此步骤重复1次);
3.5利用10ml含60mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集至10mL离心管中,(此步骤重复1次);
3.6利用6ml含80mM咪唑8M尿素的Binding/washing buffer洗涤Ni-TED蛋白纯化柱,并将洗涤液收集至10mL离心管中,(此步骤重复1次);
3.7利用5ml含8M尿素的Elution buffer洗脱液将Ni-TED蛋白纯化柱上吸附的N-Ferritin目的蛋白洗脱,将洗脱液收集至10ml离心管中,(此步骤重复3次);
3.8蛋白纯化完成,3.1-3.6步骤中所收集的样品,均分别取80μL与20μL5×SDS蛋白上样缓冲液混合,利用100℃金属浴处理15min,冰浴5min,利用SDS-PAGE蛋白电泳对实验结果进行分析。
4.蛋白浓缩
4.1超滤管处理:在未使用过的超滤管中加入15ml纯水,在4℃、4000rmp条件下每次离心7min,此步骤重复3次;
4.2蛋白置换缓冲液及浓缩:将纯化好的蛋白也加至超滤管中,4℃、4000rmp离心7min,至液面到达1.5ml标记以下;加入3倍体积的PBS,4℃4000rmp离心7min,至液面到达1.5ml标记以下,共置换3次,最终将蛋白液终体积控制在1.5mL左右。
4.4测蛋白浓度:使用超微量核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度约为1.5mg/mL,供抗原免疫时使用。
4.5纳米颗粒组装情况分析:将N-Ferritin蛋白置换至PBS缓冲液中后,可组装为多聚体的纳米颗粒,利用Zeta电位及纳米粒度分析仪对纳米颗粒的直径进行分析。
图2提供了N-Ferritin蛋白在E.coliBL21(DE3)菌株中的诱导表达结果;图中,M:蛋白质分子量标准;1:诱导前菌体蛋白表达情况;2:诱导后菌体蛋白表达情况;3:诱导后菌体经超声后上清中蛋白表达情况;4:诱导后菌体超声后沉淀中蛋白表达情况。表明N-Ferritin蛋白诱导表达成功,并于沉淀中表达。
图3提供了N-Ferritin蛋白纯化结果;M:蛋白质分子量标准;1:纯化后的N-Ferritin蛋白;2:诱导后菌体总蛋白,表明成功纯化出目的蛋白N-Ferritin,纯化后的蛋白只出现一条目的带,与预期的大小结果相符合。
图4提供了N-Ferritin纳米颗粒粒径分析结果,结果显示N-Ferritin纳米颗粒的粒径为706~710nm。
实施例2
动物免疫试验
1.动物分组
将6周龄Balb/c小鼠分为3组,每组6只。分别为PBS空白对照组、N蛋白组、N-Ferritin融合蛋白组。
2.免疫程序
于第0天、21天、42天进行蛋白抗原免疫,共免疫3次。每次免疫,PBS空白对照组腹部皮下注射100μL1×PBS,剩下两组注射适量佐剂及蛋白抗原混合物,每只100μL(含50μg抗原及50μL佐剂)。然后于首免后第7、28、49、90天采血小鼠尾静脉血,分离血清,利用ELISA检测方法测定小鼠血清中anti-NIgG抗体的滴度水平。
4.血清抗体水平ELISA检测
1.首次免疫后7、28、49、90天,采集小鼠尾静脉血,静置4h后,4℃、2500rmp离心30min,收获血清;
2.取ELISA高吸附板,每孔加入100μLN蛋白(4μg/mL),4℃、过夜孵育12-16h;
3.彻底弃去孔中液体,每孔加入200μL封闭液,37℃封闭90min;
4.彻底弃去孔中液体,每孔加入250μL PBST洗涤液,洗涤3-5次;
5.彻底去除每孔洗涤液,将待测血清以适当倍数倍比稀释后,取100μL加入反应孔中,37℃孵育1h;
6.彻底去除孔中液体后,每孔加入250μL PBST洗涤液,洗涤3-5次;
7.每孔分别加入100μL 1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗,37℃孵育1h;
8.彻底去除孔中液体后,每孔加入250μL PBST洗涤液,洗涤3-5次;
9.彻底去除孔中液体后,向每孔分别加入200μL TMB底物溶液,37℃避光反应10min;
10.每孔50μL 1M H2SO4终止反应;
11.使用酶标仪检测450nm吸光度下的OD值。
图5给出了抗体滴度监测结果。首免后7天,N、N-Ferritin免疫组anti-NIgG滴度略高于PBS对照组。首免后28天,N、N-Ferritin免疫组间anti-N IgG滴度基本持平,N-Ferritin免疫组略高于N免疫组(P<0.05),免疫组IgG水平均显著高于PBS对照组(P<0.001);首免后49天,免疫组IgG滴度均达最高值且显著高于PBS对照组(P<0.0001),N-Ferritin免疫组anti-N IgG滴度显著高于N免疫组(P<0.001)。首免后90天,N-Ferritin免疫组anti-N IgG滴度显著高于N免疫组(P<0.0001),免疫组抗体滴度显著高于PBS对照组;与49天相比,N及N-Ferritin免疫组抗体滴度均有所下降,N免疫组抗体滴度由1:350万倍降至1:125万倍,N-Ferritin免疫组抗体滴度由1:400万倍降至1:300万倍,N免疫组滴度降幅显著高于N-Ferritin免疫组。以上结果表明与N单体抗原相比,N-Ferritin纳米颗粒能够诱导机体产生滴度更高且维持时间更久的anti-N IgG抗体。
实施例3
相关免疫细胞增殖检测
1.单细胞悬液制备
取小鼠腹股沟淋巴结与脾脏,于细胞筛中分别研磨淋巴与脾脏,放入15ml离心管中,于4℃、1500rmp离心7min。弃上清,淋巴使用1ml PBS重悬。脾脏使用1ml红裂冰上裂解15min后4℃、1500rmp离心7min,弃上清,使用1ml PBS重悬;
2.细胞表面分子染色
将单细胞悬液分至流式管中,加入表面分子染色抗体,染色30min后加入1ml PBS终止染色后4℃、1500rmp离心7min,弃上清,使用200μl PBS重悬,准备上机;
3.细胞胞内分子染色
将单细胞悬液4℃、1500rmp离心7min,弃上清,使用1ml PRIM-1640完全重悬,取100μL细胞悬液至96孔板中,按照1:100比例加入细胞因子刺激剂,刺激8h后吹下细胞收至流式管中。4℃、1500rmp离心7min,弃上清,加入100μL PBS重悬细胞后加入表染抗体,染色30min。加入1ml PBS终止染色后4℃、1500rmp离心7min,弃上清。
加入200μL Fix/Perm破膜45min后加入1ml Perm/wash终止破膜。4℃、1800rmp离心7min,弃上清,加入100μL Perm/wash重悬细胞,加入胞染抗体进行染色,染色30min后加入500μL Perm/wash终止染色。
4℃、1800rmp离心7min,弃上清,加入1ml PBS重悬后再次离心、弃上清,加入200μlPBS重悬,准备上机。
图6给出了流式细胞技术检测N及N-Ferritin抗原对机体免疫系统的活化情况,免疫后4h(A),N-Ferritin抗原免疫组腹股沟淋巴结中DC细胞水平显著高于N抗原免疫组及空白对照组(p<0.05,p<0.0001),N蛋白免疫组显著高于空白对照组(p<0.05),巨噬细胞(MΦ)检测结果显示N及N-Ferritin抗原免疫组高于PBS空白对照组,但组间差异不显著;表明N-Ferritin更易被DC及巨噬细胞所识别,将其提呈给Tfh细胞进而启动特异性免疫应答。首次免疫后43天(B),N-Ferritin抗原免疫组脾脏及腹股沟淋巴结中Tfh细胞水平均显著高于N抗原免疫组及空白对照组(p<0.05,p<0.01;p<0.01,p<0.001)脾脏中活化的CD4+T细胞与N抗原免疫组间无显著差异,显示N-Ferritn能够更有效的活化Tfh细胞,而Tfh细胞偏向辅助体液免疫应答,此结果间接说明与N抗原相比较N-Ferritin能够更有效的启动机体的体液免疫应答。首次免疫后43天(C),N-Ferritin抗原免疫组脾脏中的GC B细胞水平显著高于N抗原免疫组及空白对照组(p<0.05,p<0.001),N抗原免疫组显著高于空白对照组(p<0.01);MB(记忆性B)细胞高于N抗原免疫组但差异不显著,免疫组显著高于PBS空白对照组(p<0.001);此结果说明N-Ferritin能够更有效的激活机体产生体液免疫应答,同时能够刺激机体产生较高水平的记忆性B细胞,使机体能够生产更持久的体液免疫保护。
综上所述,本发明获得的疫苗抗原和以表达S蛋白或RBD抗原获得疫苗抗原相比,具有以下优点:
1.抗原保守性好
本发明基于SARS-CoV-2N蛋白保守性好,且能够刺激机体产生中和性抗体的特点,以其作为靶抗原,为SARS-CoV-2通用疫苗的研发提供候选抗原;
2.免疫原性好
为克服N蛋白单体免疫原性差的问题,本发明将N基因与亚铁蛋白Ferritin基因融合,利用原核表达系统对N-Ferritin融合蛋白进行表达,复性后的N-Ferritin可组装为直径为706-710nm的纳米颗粒,提高靶抗原被体内抗原提呈细胞识别效率,从而高效启动特异性免疫应答;
3.制备简单、适于大规模生产
本发明设计的融合蛋白为原核表达产物,表达量高、纯化效果好、制备流程简单、有益于批量生产;
4.免疫效果好
本发明提供抗原能被DC及巨噬细胞有效识别,有效活化Tfh细胞,提高机体内GC B细胞及记忆性B细胞的数量及存续时间,诱导机体产生抗体滴度高、免疫记忆持久的体液免疫应答,为机体提供长期的有效保护。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种SARS-CoV-2疫苗抗原,其特征在于:该疫苗抗原为直径为706~710nm的纳米颗粒,是由N蛋白和Ferritin蛋白的融合蛋白自组装形成;所述N蛋白为SARS-CoV-2N蛋白,所述SARS-CoV-2N蛋白的氨基酸序列如SEQ_1所示,编码该SARS-CoV-2N蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_2所示;所述Ferritin蛋白的氨基酸序列如SEQ_3所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_4所示;所述SARS-CoV-2N蛋白融合于Ferritin蛋白的N-端获得N-Ferritin融合蛋白,所述N-Ferritin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ_5所示,编码该Ferritin蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ_6所示。
2.一种表达载体,其特征在于:其包括有权利要求1所述的疫苗抗原的融合蛋白的编码序列,该表达载体用于转载所述疫苗抗原的编码序列。
3.权利要求1所述的疫苗抗原的制备方法,其特征在于:其包括在使宿主细胞能够产生所述疫苗抗原的条件下,将一个或多个权利要求2所述的表达载体导入宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的疫苗抗原的制备方法,其特征在于:所述制备方法还包括将表达载体导入宿主细胞后获得的菌株进行培养从而获得以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的疫苗抗原的制备方法,其特征在于:所述制备方法还包括将以包涵体形式存在的N-Ferritin融合蛋白处理成包涵体溶解物,以及将包涵体溶解物进行纯化。
6.一种免疫原性组合物,其特征在于:包括权利要求1所述的疫苗抗原。
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