TWI814499B - 用以連續製備及分析ｒｎａ的裝置以及利用該裝置來合成ｒｎａ的方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種用以合成RNA的裝置。依據本揭示內容的實施方式，該裝置包含一活體外轉錄(in vitro transcription,IVT)模組、一分解模組及一處理器。非必要地，本發明裝置更包含一反應監測構件、一分解反應監測構件及/或一純化構件。本揭示內容亦關於利用本發明裝置來合成RNA的方法。

Description

用以連續製備及分析RNA的裝置以及利用該裝置來合成RNA 的方法
本揭示內容是關於核酸合成的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種用以連續合成及分析核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的新穎裝置。
傳訊RNA(Messenger RNA,mRNA)疫苗是一種新型疫苗，主要藉由mRNA來刺激個體產生免疫反應，以保護個體對抗疾病。具體來說，mRNA疫苗是由一種用以編碼疾病特異性抗原(例如，第2型嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)之棘蛋白)的mRNA所組成。一旦經免疫細胞(例如樹突細胞)吞噬後，免疫細胞會利用mRNA攜帶的基因資訊來製備抗原。產生的抗原會表現於細胞表面，作為免疫原來刺激個體產生後天性免疫反應以對抗抗原及抗原相關疾病(例如，由SARS-CoV-2造成的COVID-19)。
mRNA疫苗在疾病治療的應用主要受限於mRNA的製備技術。一般來說，可利用固相合成或酵素轉錄法來製備mRNA。固相合成僅能製備長度為 40-80個核苷酸的RNA，其中RNA的產量會隨著核苷酸長度的增加而大幅降低。至於酵素轉錄法，其通常是以分批方式進行製備。基於各批次或反應之間的延誤時間，以及樣本運輸時的污染風險，分批製備RNA的效率通常較為不足。此外，分析流程(即，分析RNA擴增物)與合成流程分離，亦會導致不必要的時間及費用支出。
有鑑於此，相關領域亟需一種可更有效率地合成RNA的新穎裝置。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容是關於一種用以合成RNA的裝置。本發明裝置包含一活體外轉錄(in vitro transcription,IVT)模組、一配置於該IVT模組下游的分解模組，以及一與該IVT模組及分解模組耦接的處理器。
所述IVT模組在結構上包含：一第一容器，用以裝載RNA聚合酶及對應該RNA的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)；一第二容器，用以裝載複數個核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate,NTP)；一第一混合單元，其係配置為以第一流速來接收及混合RNA聚合酶、DNA及複數個NTP，以製備第一混合物；以及 一IVT槽，其係配置為使來自第一混合單元的第一混合物進行IVT反應。
所述分解模組包含：一第三容器，用以裝載去氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)；一第二混合單元，其係配置為以第二流速來接收及混合DNase及IVT槽產生的IVT反應產物，以製備第二混合物；以及一分解槽，其係配置為使來自第二混合單元的第二混合物進行分解反應，以製備合成RNA。
依據本揭示內容的實施方式，處理器是配置為控制第一及該第二流速，以及IVT反應及分解反應的反應條件(例如，溫度及反應時間)。
依據某些實施方式，第一流速約為每分鐘0.1-100微升(0.1-100μl/min)。在該些實施方式中，第一混合物在第一流速下的剪應力(shear stress)約為每平方公分0.02-20達因(dyn)。
依據某些實施方式，第二流速約為每分鐘0.1-100微升。在該些實施方式中，第二混合物在第二流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。
較佳地，本揭示內容之裝置更包含一IVT反應監測構件，其係與IVT槽耦接，以監測IVT槽中的IVT反應產物。此外或亦或是，本揭示內容之裝置更包含一分解反應監測構件，其係與分解槽耦接，以監測分解槽中的分解產物。
非必要地，本發明裝置更包含一與分解槽耦接的純化構件，以純化合成的RNA。
依據某些實施方式，除了IVT模組與分解模組之外，本揭示內容之裝置更包含一監測模組，其係配置於分解模組的下游。在該些實施方式中，監測模組包含：一第四容器，用以裝載稀釋緩衝液；一第三混合單元，其係配置為接收及混合稀釋緩衝液及來自分解槽的合成RNA，以稀釋合成RNA；以及一RNA監測構件，用以監測第三混合單元中的稀釋產物。
依據某些實施方式，稀釋緩衝液與合成RNA的混合比例是由處理器所控制。
依據某些例示性的實施方式，本發明裝置更包含一純化構件，其係配置於分解模組的下游以純化合成RNA。
依據某些非必要的實施方式，本發明裝置更包含一閥門，其係與分解模組、監測模組及純化構件耦接，用以控制合成的RNA由分解模組傳送至監測模組或純化構件。
本揭示內容亦提供一種利用本揭示內容任一實施方式所述之裝置來合成RNA的方法。本發明裝置為可操控式地(即，於第一及第二混合單元中使用特定的流速及剪應力)接收及混合反應物(即，分別裝載於第一及第二容器中的RNA聚合酶、DNA模板及NTP)，使反應物連續於IVT槽及分解槽進行IVT反應與分解反應，以製備欲求的RNA。
依據某些實施方式，將第一混合單元中的第一流速設定為每分鐘約0.1-100微升，其中第一混合物在第一流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20 達因。依據某些例示性的實施方式，IVT槽中的IVT反應是在約16℃到約37℃的溫度中進行至少1小時。
依據某些實施方式，將第二混合單元中的第二流速設定為每分鐘約0.1-100微升，其中第二混合物在第二流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。依據某些例示性的實施方式，分解槽中的分解反應是在約37℃的溫度中進行至少10分鐘。
非必要地，本發明方法更包含一利用適當方法(舉例來說，純化管柱)來純化合成RNA的步驟。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
元件符號說明如下：
10、20A、20B、20C、30、40、50:裝置
110、210a、210b、310、410、510:IVT模組
111、211:第一容器
112、212:第二容器
115、215:第一混合單元
117、217:IVT槽
130、230a、230b、330、430、530:分解模組
131、231:第三容器
135、235:第二混合單元
137、237、337、437、537:分解槽
150、250、350、450、550:處理器
218:IVT反應監測構件
238:分解反應監測構件
370、590:純化構件
470、570:監測模組
471:第四容器
475、575:第三混合單元
478、578:RNA監測構件
580:閥門
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖是依據本揭示內容一實施方式所繪示的示意圖，其係關於用以合成RNA的裝置10；第2A到2C圖是依據本揭示內容某些實施方式所繪示的示意圖，其係關於用以合成RNA的裝置20A、20B、20C；第3圖是依據本揭示內容另一實施方式所繪示的示意圖，用以闡述包含一純化構件的裝置30；第4圖是依據本揭示內容一實施方式所繪示的示意圖，用以闡述包含一監測模組的裝置40； 第5圖是依據本揭示內容另一實施方式所繪示的示意圖，用以闡述包含一監測模組及一純化構件的裝置50；以及第6圖是依據本揭示內容實施例1所繪示的線性圖，用以闡述利用本發明裝置或分批製備所得到之RNA的濃度。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I.定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、 時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「流速」(flow rate)一詞是指每單位時間內流體的體積。在本揭示內容中，「流速」(flow rate)一詞是指單位時間內流體通過一特定單元(例如，本揭示內容第一或第二混合單元)中某一位點的速率。舉例來說，「流速」(flow rate)的典型測量單位是每分鐘公升或微升。「流速」(flow rate)一詞可指實際流速、測量流速或估計流速。
「剪應力」(shear stress)一詞是指作用力與面積的比值。在本揭示內容中，「剪應力」(shear stress)是指單元(例如，本揭示內容第一或第二混合單元)中流動之流體速度對溶液分子(例如，DNA、RNA及/或蛋白)產生的機械應力。通常以固定流速通過具有固定管徑及/或長度之導管或單元來測量「剪應力」(shear stress)。
「閥門」(valve)一詞在本揭示內容是指任何可調節流量的裝置或系統。舉例來說，「閥門」(valve)一詞包含，但不限於，任何可調控、允許、防 止或禁止空氣或液體流過通道(例如，本發明裝置的監測模組及純化構件)的裝置或系統。「閥門」(valve)一詞可以是夾管閥(pinch valve)、旋轉閥(rotary valve)、旋塞閥(stop cock)、壓力閥(pressure valve)、梭閥(shuttle valve)、機械閥(mechanical valve)、電動閥(electrical valve)、機電流量調節器(electro-mechanical flow regulator)，或是其組合。依據一例示性的實施方式，閥門是6通閥門(6-way valve)等常用於高效能液相色層分析儀(high-performance liquid chromatography,HPLC)的閥門。
II.發明詳細說明
本揭示內容是關於一種用以連續性合成及分析RNA的裝置。相較於傳統分批製備RNA的方法(即，在時間範圍內製備特定組別或數量的RNA)，本發明裝置至少具有以下三項優勢：(1)使反應及/或批次之間的延誤時間最小化；(2)降低樣本運輸過程中遭受污染的風險；以及(3)即時監測、評估及控制RNA的合成流程。
本揭示內容的第一態樣因此是關於一種裝置，其特徵在於包含二種模組，即一種IVT模組及一種配置於IVT模組下游的分解模組。依據本揭示內容的實施方式，IVT模組是配置為以一適當流速及剪應力來混合轉錄材料(例如，DNA模板及NTP)及試劑(例如，RNA聚合酶)，以進行IVT反應。分解模組則是藉由混合IVT反應產物與DNase來分解IVT反應產物中的DNA模板，以製備RNA擴增物。
首先參見第1圖，其繪示用以合成RNA的裝置10。裝置10至少包含一IVT模組110、一配置於IVT模組110下游的分解模組130，以及一與二模組耦接的處理器150，據以控制及監測IVT模組110及分解模組130。
顧名思義，IVT模組110是用以進行IVT反應的地方，其結構上包含：(1)用以裝載RNA聚合酶及DNA模板(即，作為模板的DNA分子，以合成互補的RNA轉錄本)的第一容器111；(2)用以裝載複數個NTP(包含ATP、UTP、CTP及GTP)的第二容器112；(3)第一混合單元115，其係與第一及第二容器111、112耦接，且配置為以第一流速來接收及混合分別由第一及第二容器111、112輸出的化合物，以製備第一混合物(即，RNA聚合酶、DNA模板及複數個NTP的混合物)；以及(4)IVT槽117，其係配置於第一混合單元115的下游，據以使由第一混合單元115輸出的第一混合物進行IVT反應。
操作時，是將RNA聚合酶、DNA模板及複數個NTP分別溶解於適當的緩衝液(例如，Tris或Tris-HCl緩衝液)後，裝載於第一及第二容器111、112中。依據使用目的不同，RNA聚合酶可以是SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或任何其他已知可由DNA模板合成RNA擴增物的RNA聚合酶。為了使IVT反應最佳化，緩衝液可以選擇性地包含RNase抑制劑、金屬離子(例如，Mg2+)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)及/或TRITONTM X-100。
之後，將裝載於第一容器111及第二容器112中的RNA聚合酶、DNA模板及NTP分別傳送到第一混合單元115，並以穩定流速進行混合。依據本揭示內容某些實施方式，流速約為每分鐘0.01-1,000微升(例如，每分鐘0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000微升)，據以產生每平方公分約0.002-200達因(例如，每平方公分0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200達因)的剪應力。較佳地，流速約為每分鐘0.1-100微升，據以產生每平方公分約0.02-20達因的剪應力。依據某些實施方式，第一混合單元115中的流速及剪應力可確保RNA聚合酶、DNA模板及NTP能有效地混合而不會產生分子與分子之間的解離反應(molecule-molecule dissociation)。
為由DNA模板合成RNA擴增物，接著將RNA聚合酶、DNA模板及NTP的混合物由第一混合單元115傳送到IVT槽117，以進行IVT反應。依據某些實施方式，IVT反應的溫度約為16℃到37℃(例如，約為16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃)，反應時間至少1小時(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10小 時，或更久)；較佳地，IVT反應是於約37℃的溫度中進行1-3小時。依據一操作實施例，IVT反應是於37℃進行3小時。當可想見，反應條件(例如，溫度及反應時間)會隨著合成RNA的長度、RNA聚合酶的種類及反應試劑的濃度等因素而有所不同。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可依據使用目的之不同來適度調整IVT反應的流程及操作參數。
製得的IVT反應產物包含DNA模板及合成的RNA擴增物。為移除DNA模板，將IVT反應產物傳送到分解模組130進行分解反應。分解模組130在結構上包含：(1)用以裝載DNase的第三容器131；(2)第二混合單元135，其係與IVT槽117及第三容器131耦接，配置為以第二流速來接收及混合DNase及IVT反應產物，以製備第二混合物(即，IVT反應產物及DNase的混合物)；以及(3)分解槽137，其係與第二混合單元135耦接，用以分解由第二混合單元135傳送的第二混合物，以製備合成RNA。
依據本揭示內容某些實施方式，是將裝載於第三容器131中的DNase(即，一種可分解單股及雙股DNA的核酸內切酶)溶解於適當的緩衝液中。例示性之適合用以溶解DNase的緩衝液包含，但不限於，磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)、經焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理的水、參(羥甲)胺基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)緩衝液、Tris-HCl緩衝液或其結合。非必要地，緩衝液可包含一或多種金屬離子，例如Mg2+、Ca2+及/或Mn2+，使分解功效最佳化。
接著，將IVT槽117中的IVT反應產物及第三容器131中的DNase分別傳送至第二混合單元135，並以適當的流速及剪應力進行混合，以確保IVT反應產物及DNase可有效地混合而不會產生分子與分子之間的解離反應。依據本 揭示內容某些實施方式，流速約為每分鐘0.01-1,000微升，據以產生每平方公分約0.002-200達因的剪應力。較佳地，流速約為每分鐘0.1-100微升，據以產生每平方公分約0.02-20達因的剪應力。
IVT反應產物及DNase於第二混合單元135均勻混合後，將混合物傳送至分解槽137進行DNase分解反應。依據本揭示內容某些實施方式，分解反應的反應溫度約為37℃，反應時間至少10分鐘(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59分鐘；或是1、2、3、4、5或6小時，或是更久)。在某些例示性的實施方式中，於37℃反應15分鐘即足以分解及移除IVT反應產物中的DNA模板。依據一實施例，分解反應是於37℃進行1小時。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可依據使用目的之不同來適度調整分解反應的流程及操作參數。
IVT模組110及分解模組130皆是由處理器150所控制。依據本揭示內容的實施方式，處理器150是配置為控制IVT模組110及分解模組130的運作，包含第一混合單元115中的第一流速、第二混合單元135中的第二流速、IVT槽117中IVT反應的條件(例如，溫度及反應時間)，以及分解槽137中分解反應的條件(例如，溫度及反應時間)。
非必要地，本發明裝置更包含一監測構件，據以即時偵測及/或分析IVT反應產物及/或分解產物。參見第2A圖，其繪示用以合成RNA的裝置20A。裝置20A與第1圖(即，裝置10)不同之處在於裝置20A更包含一與IVT槽217耦接的IVT反應監測構件218。裝置20A之IVT模組210a中各元件(包含第一及第二容器 211、212，第一混合單元215及IVT槽217)與分解模組230a中各元件(包含第三容器231，第二混合單元235及分解槽237)，以及各元件的配置皆與裝置10之IVT模組110及分解模組130相似。為求簡潔，在此不再贅述其技術特徵。
如上所述，IVT模組210a與第1圖(即，IVT模組110)不同之處在於其包含一與IVT槽217耦接的IVT反應監測構件218。在接收來自IVT槽217的IVT反應產物後，IVT反應監測構件218可提供IVT反應產物即時的分析結果，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可依據此分析結果來決定是否繼續分解反應，以及/或是即時調整IVT反應的條件，例如即時調整第一及第二容器211、212中轉錄材料/試劑的濃度及/或比例，第一混合單元215中的流速及剪應力，以及/或是IVT槽217中的溫度及/或反應時間。
或者是，本揭示內容之裝置更包含一監測構件，用以即時偵測及/或分析分解產物。參見第2B圖，其繪示用以合成RNA的裝置20B。分解模組230b與第1圖(即，分解模組130)不同之處在於其更包含一與分解槽237耦接的分解反應監測構件238，以即時監測分解槽237中的分解產物。裝置20B之IVT模組210b中各元件(包含第一及第二容器211、212，第一混合單元215及IVT槽217)及分解模組230b中各元件(包含第三容器231，第二混合單元235及分解槽237)，以及各元件的配置皆與裝置10之IVT模組110及分解模組130相似。為求簡潔，在此不再贅述其技術特徵。在接收來自分解槽237的分解產物後，分解反應監測構件238可提供分解產物即時的分析結果，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可依據此分析結果即時調整分解反應的條件，例如即時調整第三容器231中DNase的濃度，來自IVT槽217之分解產物及來自第三容器231之DNase的混合濃度，第二混合單元235中的流速及剪應力，以及/或是分解槽237中的溫度及/或反應時間。
亦或是，本發明裝置可同時包含IVT反應監測構件及分解反應監測構件。參見第2C圖，其繪示用以合成RNA的裝置20C。相較於裝置10，裝置20C的特徵在於具有一與IVT槽217耦接的IVT反應監測構件218，以及一與分解槽237耦接的分解反應監測構件238。如此一來，裝置20C可用以即時監測IVT槽217中的IVT反應產物，以及分解槽237中的分解產物，據以提供反饋控制到處理器250，使IVT及分解反應最佳化。
依據欲求目的之不同，IVT反應監測構件218及分解反應監測構件238可個別為紫外線光譜儀(UV spectroscopy；亦稱為紫外線-可見光分光譜儀(visible spectrophotometry)，可藉由測量波長260奈米之UV吸光值來監測RNA擴增物)、表面電漿子共振式(surface plasmon resonance,SPR)感應器(例如，BIACORETM系統，藉由測量RNA聚合酶於延長及中止位置的解離及轉錄本釋放速率來監測RNA的轉錄反應)、螢光或化學冷光偵測器(例如，毛細管電泳或微流體晶片，其係利用與RNA分子互補且與螢光或化學冷光分子鍵結的核酸探針來確認合成的RNA分子)，或是任何已知可用以偵測、監測及/或定量分析RNA分子的裝置或設備，舉例來說，質譜儀(mass spectrometry,MS)、液相色層分析儀(liquid chromatography,LC；例如，HPLC或快效能液相色層分析儀(fast-performance liquid chromatography,FPLC))，或是其組合。或者是，IVT反應監測構件218及分解反應監測構件238可個別是包含一或多個感應器的裝置或設備，據以測量IVT反應產物及/或分解產物的特性(例如，物理、光學及電化學特性)；舉例來說，IVT反應監測構件218及分解反應監測構件238可個別包含一或多個流體感應器以監測IVT反應產物及/或分解產物的壓力、流速、氣泡及/或pH值；一或多個光學感應器以監測IVT反應產物及/或分解產物的光強度、散射光及/或吸收光譜；以及/ 或是一或多個電導率感應器以監測IVT反應產物及/或分解產物的電導率及電阻率。
非必要地，除了IVT模組、分解模組及處理器之外，本發明裝置可更包含一與分解模組耦接的純化構件，以純化分解產物(即，合成的RNA)。參見第3圖，其中裝置30更包含一配置於分解槽337下游的純化構件370(例如，一管柱)，以分離及/或純化合成的RNA。依據本揭示內容某些實施方式，純化構件370的運作是由處理器350所控制。例示性之適用於本揭示內容的純化構件包含，但不限於，純化管柱、磁珠、過濾器、電泳或其組合。
第4圖依據本揭示內容某些實施方式繪示裝置40。裝置40的結構與第1圖之裝置10的結構相似，其差異在於除了包含IVT模組410及分解模組430之外，裝置40更包含一監測模組470，其係與處理器450耦接，且配置於分解模組430的下游。監測模組470結構上包含：(1)一用以裝載稀釋緩衝液的第四容器471；(2)一與第四容器471及分解槽437耦接的第三混合單元475，用以接收及混合稀釋緩衝液及分解槽437的分解產物，據以稀釋合成RNA；以及(3)一RNA監測構件478，以即時偵測及/或分析稀釋產物(即，經稀釋的RNA)。
依據某些實施方式，稀釋緩衝液及合成RNA的混合比例、第三混合單元475中的流速，以及RNA監測構件478的運作皆是由處理器450所控制。
如上所述，RNA監測構件478可以是紫外線光譜儀、SPR感應器、螢光或化學冷光偵測器，或是任何已知可用以偵測、監測及/或定量分析RNA分子的裝置或設備，舉例來說，MS、HPLC、FPLC或其組合。或者是，RNA監測構件478可以是包含一或多個感應器的裝置或設備，據以測量經稀釋之RNA的特性(例如，物理、光學及電化學特性)；舉例來說，RNA監測構件478可以包含一 或多個流體感應器以監測經稀釋之RNA的壓力、流速、氣泡及/或pH值；一或多個光學感應器以監測經稀釋之RNA的光強度、散射光及/或吸收光譜；以及/或是一或多個電導率感應器以監測經稀釋之RNA的電導率及電阻率。
當可想見，裝載於第四容器471中的稀釋緩衝液會隨著RNA監測構件478種類的不同而有所差異；舉例來說，當RNA監測構件是紫外線光譜儀時，稀釋緩衝液較佳是不含RNase的水；當RNA監測構件是SPR感應器時，稀釋緩衝液可以是磷酸鹽緩衝液、HEPES緩衝液、醋酸鈉緩衝液、醋酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液或其組合；當RNA監測構件是螢光偵測器時，稀釋緩衝液可以是不含RNase的水、HEPES緩衝液或Tris-HCl緩衝液。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可依據欲求目的來選擇適合的稀釋緩衝液。
非必要地，除了第4圖繪示的IVT模組、分解模組及監測模組之外，本發明裝置可更包含一與分解模組耦接的純化構件(例如，純化管柱、磁珠、過濾器、電泳或其組合)，以純化分解產物(即，合成的RNA)。參見第5圖，其依據本揭示內容某些實施方式繪示裝置50。裝置50的結構與第4圖之裝置40的結構相似，其差異僅在於除了IVT模組510、分解模組530及監測模組570之外，裝置50更包含一純化構件590及一閥門580，其係可操作式地與處理器550耦接。如第5圖所示，監測模組570及純化構件590分別配置於分解模組530的下游，且經由閥門580(例如，6通閥門)與分解模組530耦接。閥門580是配置為控制分解產物由分解槽537傳送至第三混合單元575或純化構件590的流向。操作上，分解產物會先由分解槽537傳送到第三混合單元575，接著如上所述，利用RNA監測構件578來偵測及/或分析分解產物。一旦經監測構件578分析後，合成RNA的品質及/或 數量等於或高於預設值時，閥門580會將分解產物的流向由第三混合單元575轉移到純化構件590，以確保純化RNA的品質和數量。
本揭示內容之裝置的優勢在於：(1)可連續運作以避免不同反應/批次之間產生的時間延誤；(2)可調控剪應力並提供穩定的層流，據以在溫和的條件下有效混合反應物，並使蛋白與核酸之間的解離反應最小化；(3)準確地控制反應時間；(4)即時原位(in situ)控制RNA合成；(5)即時確認質量並提供可能的反饋控制，使試劑成本最小化；(6)與管柱純化相容；(7)可控性高，可實現自動化操作，據以降低人為操作產生的誤差或差異；(8)具規模友善性且符合優良的製造規範(good manufacturing practice,GMP)；以及(9)可直接由小規模的反應條件建立大規模的反應。
本揭示內容的第二態樣是關於一種利用上述任一實施方式所述之裝置來合成RNA的方法。本發明裝置係配置為可控性地(即，於第一及第二混合單元中提供特定流速及剪應力)接收及混合反應物(即，分別裝載於第一及第二容器中的RNA聚合酶、DNA模板及NTP)，使反應物可連續地於IVT槽進行IVT反應，且於分解槽進行分解反應，據以製備所需的RNA。
較佳地，是將RNA聚合酶、DNA模板及NTP分別溶解於適當的緩衝液(例如，Tris或Tris-HCl緩衝液)後，裝載於第一及第二容器中。緩衝液可非必 要地包含RNase抑制劑、金屬離子(例如，Mg2+)、DTT及/或TRITONTM X-100，以使IVT反應最佳化。
依據本揭示內容某些實施方式，將第一混合單元中反應物的流速設定為每分鐘約0.01-1,000微升，據以於第一混合物(即，RNA聚合酶、DNA模板及NTP的混合物)產生每平方公分約0.002-200達因的剪應力。較佳地，將第一混合單元中反應物的流速設定為每分鐘0.1-100微升，據以於第一混合物產生每平方公分約0.02-20達因的剪應力。依據某些較佳的實施方式，IVT槽中IVT反應的反應溫度約為16℃到37℃，反應時間至少1小時。
依據本揭示內容某些實施方式，將第二混合單元中反應物的流速設定為每分鐘約0.01-1,000微升，據以於第二混合物(即，IVT反應產物及DNase的混合物)產生每平方公分約0.002-200達因的剪應力。較佳地，將第二混合單元中反應物的流速設定為每分鐘0.1-100微升，據以於第二混合物產生每平方公分約0.02-20達因的剪應力。依據某些較佳的實施方式，分解槽中分解反應的溫度約為37℃，反應時間至少10分鐘。
非必要地，本發明方法更包含純化合成RNA的步驟。用以分離及純化RNA分子的方法為本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的技藝，舉例來說，管柱、苯酚-氯仿萃取，或是磁珠。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
使用包含於市售RNA合成套組中的試劑及客制化的DNA模板來確認本發明裝置於合成RNA的功效。在IVT模組中，將原料由二個獨立的入口加至系統，各流速設定為每小時3.6微升(總流速為每小時7.2微升)，並在37℃以連續流動的方式反應3小時。之後將IVT反應的生合成產物(crude)注入DNase模組，並與DNase以每小時28.8微升的流速混合後，於37℃反應1小時。接著於稀釋模組利用緩衝液以1：30的體積比稀釋反應溶液。另於系統測試高於35倍的流速，結果確認可產生相似的系統效能。
實施例1 確認本發明裝置合成的RNA
以螢光定量系統、磁帶機(tape station)及電泳來分析由本發明裝置所製備的IVT反應產物。第6圖的結果指出，在3小時反應後，本發明裝置可穩定製備與傳統分批製備數量相當的RNA。以磁帶機來確認RNA的長度(結果未顯示)，且原位監測RNA產物之光學及電導性，以確保流程運作的穩定性(結果未顯示)。電泳分析結果證實DNase模組可成功分解DNA(結果未顯示)。結果亦確認本發明裝置可連續運作至少8小時，且具有穩定的製備能力。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
10:裝置
110:IVT模組
111:第一容器
112:第二容器
115:第一混合單元
117:IVT槽
130:分解模組
131:第三容器
135:第二混合單元
137:分解槽
150:處理器

Claims (19)

  1. 一種用以合成核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)的裝置，包含： 一活體外轉錄( in vitrotranscription, IVT)模組，包含： 一第一容器，用以裝載一RNA聚合酶及一對應該RNA的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)； 一第二容器，用以裝載複數個核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate, NTP)； 一第一混合單元，其係配置為以第一流速來接收及混合該RNA聚合酶、該DNA及該複數個NTP，以製備第一混合物；以及 一IVT槽，其係配置為使來自該第一混合單元的該第一混合物進行IVT反應； 一分解模組，其係配置於該IVT模組的下游，且包含： 一第三容器，用以裝載一去氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)； 一第二混合單元，其係配置為以第二流速來接收及混合該DNase及該IVT槽的IVT反應產物，以製備第二混合物；以及 一分解槽，其係配置為使來自該第二混合單元的該第二混合物進行分解反應，以製備該合成RNA；以及 一處理器，其係與該IVT模組及該分解模組耦接，用以控制該第一及該第二流速，以及該IVT反應及該分解反應的反應條件。
  2. 如請求項1所述之裝置，其中該第一流速約為每分鐘0.1-100微升。
  3. 如請求項2所述之裝置，其中該第一混合物在該第一流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。
  4. 如請求項1所述之裝置，其中該第二流速約為每分鐘0.1-100微升。
  5. 如請求項4所述之裝置，其中該第二混合物在該第二流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。
  6. 如請求項1所述之裝置，更包含一與該IVT槽耦接的IVT反應監測構件，用以監測該IVT槽中的該IVT反應產物。
  7. 如請求項1所述之裝置，更包含一與該分解槽耦接的分解反應監測構件，用以監測該分解槽中的該分解產物。
  8. 如請求項1所述之裝置，更包含一與該分解槽耦接的純化構件，用以純化該合成RNA。
  9. 如請求項1所述之裝置，更包含一監測模組，其係配置於該分解模組的下游，且包含： 一第四容器，用以裝載一稀釋緩衝液； 一第三混合單元，其係配置為接收及混合該稀釋緩衝液及來自該分解槽的該合成RNA，以稀釋該合成RNA；以及 一RNA監測構件，用以監測該第三混合單元中的稀釋產物， 其中該稀釋緩衝液及該合成RNA的混合比例是由該處理器所控制。
  10. 如請求項9所述之裝置，更包含一純化構件，其係配置於該分解模組的下游以純化該合成RNA。
  11. 如請求項10所述之裝置，更包含一閥門，其係與該分解模組、該監測模組及該純化構件耦接，用以控制該合成RNA由該分解模組傳送至該監測模組或該純化構件。
  12. 一種利用一裝置來合成核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)的方法，其中該裝置包含： 一活體外轉錄( in vitrotranscription, IVT)模組，包含： 一第一容器，用以裝載一RNA聚合酶及一對應該RNA的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)； 一第二容器，用以裝載複數個核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate, NTP)； 一第一混合單元，其係配置為以第一流速來接收及混合該RNA聚合酶、該DNA及該複數個NTP，以製備第一混合物；以及 一IVT槽，其係配置為使來自該第一混合單元的該第一混合物進行IVT反應； 一分解模組，其係配置於該IVT模組的下游，且包含： 一第三容器，用以裝載一去氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)； 一第二混合單元，其係配置為以第二流速來接收及混合該DNase及該IVT槽的IVT反應產物，以製備第二混合物；以及 一分解槽，其係配置為使來自該第二混合單元的該第二混合物進行分解反應，以製備該合成RNA；以及 一處理器，其係與該IVT模組及該分解模組耦接，用以控制該第一及該第二流速，以及該IVT反應及該分解反應的反應條件， 其中該方法包含分別將該RNA聚合酶及該對應該RNA的DNA分別裝載至該第一容器，以及將該複個NTP裝載至該第二容器，以合成該RNA。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該第一流速約為每分鐘0.1-100微升。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該第一混合物在該第一流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。
  15. 如請求項12所述之方法，其中該 IVT反應是在約16°C到約37°C的溫度中進行至少1小時。
  16. 如請求項12所述之方法，其中該第二流速約為每分鐘0.1-100微升。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該第二混合物在該第二流速下的剪應力約為每平方公分0.02-20達因。
  18. 如請求項12所述之方法，其中該分解反應是在約37°C的溫度中進行至少10分鐘。
  19. 如請求項12所述之方法，更包含一純化該合成RNA的步驟。
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