CN104962561A

CN104962561A - 酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法

Info

Publication number: CN104962561A
Application number: CN201510357003.5A
Authority: CN
Inventors: 张超; 杨国宇; 孔江南; 韩莹倩
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体设计一种酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法。该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示。相较于现有的cGAMP生成量检测方法，本发明的主要技术优点体现在：1、本发明中的RNA适配体通过体外转录获得，无需切胶纯化，较好的保证了RNA适配体的完整性；2、相较于HPLC法，检测成本低廉，操作简便，相较于TLC法，操作安全无风险，检测样品数量大，可实现大规模样品检测；3、本发明中的RNA适配体可进一步纯化或者与其他试剂完善配制成标准化检测试剂盒，便于检测使用。

Description

酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法。

背景技术

环鸟苷----腺苷酸(cGAMP)是由鸟苷三磷酸(GTP)和腺苷三磷酸(ATP)通过两个磷酸二酯键形成的杂合环状分子(分子结构如图1所示)，该分子是继新型第二信使分子环二鸟苷酸(c-di-GMP)和环二腺苷酸(c-di-AMP)发现之后，新发现的第二信使分子。

cGAMP最先由Davies等（Cell，2012，149（2）：358-370）在研究霍乱弧菌(Vibrio cholera)毒力岛相关基因时发现的。他们发现其中一个毒力基因表达一个新型的环二核苷酸合成酶VC0179，该酶利用ATP和GTP作为底物合成cGAMP，合成的cGAMP影响霍乱弧菌在肠道定植、菌群的趋化和代谢。

2013年Chen, Z. J研究组（Science，2013，339（6121）：826-830）发现真核细胞内也存在cGAMP，他们研究发现L929细胞经外源DNA（ISD，poly(dA:dT)，poly(dI:dC)，HT-DNA）刺激后，细胞内产生一种对热稳定性的环二核苷酸小分子cGAMP，该分子是由真核细胞内的cGAMP合成酶(cGAS)感受外源DNA分子刺激后利用ATP和GTP合成的，合成的cGAMP与细胞内的干扰素基因刺激因子(sting)结合，诱导sting活化，活化的sting蛋白激活干扰素相关因子3(IRF3)，进而诱导细胞产生I型干扰素，调节细胞的天然免疫应答反应。最新研究表明cGAMP可以作为潜在的免疫佐剂提高疫苗的免疫能力(PLOS One，2014，9(10): e110150)。

由于cGAMP在调节天然免疫应答方面的巨大潜在应用价值及其作为新型的免疫佐剂巨大的市场应用前景，人们对于cGAMP的合成及检测表现出了巨大的兴趣。就现有技术而言，目前获得cGAMP的途径主要有两种：一种是通过化学合成方法获得，但其步骤繁琐，价格昂贵，限制了它的广泛应用；另一种普遍采用方法是利用cGAMP合成酶(cGAS)进行体外酶促反应生成，这种方法所制备的cGAMP成本低廉，操作简单，具有广阔的应用前景。但是不管哪种方法所制备的cGAMP，都面临一个检测其含量的问题。

现有技术中，检测体外酶促反应cGAMP生成量的方法主要有反相高压液相色谱分析法(HPLC)和薄层层析法(TLC)两种。HPLC法原理是：采用高压输液系统，将样品经流动相输入固相的色谱柱中，根据样品的不同组分在色谱柱中的结合程度不同，从而将不同组分依次洗脱。但是由于HPLC检测需要昂贵的仪器设备，而且样品处理繁琐，检测时间长，检测成本较高，因而具有很大的局限性。TLC法属于一种固-液吸附色谱法，其原理是：通过虹吸作用，流动相沿层析板上的固定支持物展开，在此过程中样品中的不同组分因在固定支持物中的展开距离不同从而被分开。该方法虽然操作较为简单，但是由于检测过程需用到放射性标记材料，容易给操作者带来潜在的身体危害，且由于单次检测样品数量较少，因而在实际应用中也受到了较大的限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于体外酶促反应cGAMP生成量检测所用的RNA适配体，同时提供了一种基于该RNA适配体的体外酶促反应cGAMP生成量的检测方法。该方法相较于现有的cGAMP生成量检测方法，具有操作简便、安全无风险、检测成本较低等特点。

本发明所采取的技术方案如下。

一种体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示，即：

GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGCGGCCGGAUGUAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCACACGCACAGAGCAAACCAUUCGAAAGAGUGGGACGCAAAGCCUCCGGCCUAAACCAGAAGACAUGGUAGGUAGCGGGGUUACCGAUGUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGUAACUAGUUACAUCCGGCCGCGGGUCCAGGGUUCAAGUCCCUGUUCGGGCGCCA；

该RNA适配体具有二级结构，具体如图2所示，其中spinach2部分作为荧光检测指示部分，用于结合类似荧光素的小分子化合物，如DFHBI，从而形成类似绿色荧光蛋白的复合物；VC2/g20a部分用于特异性的识别、结合底物分子cGAMP；而tRNA部分则用以增加RNA适配体整体结构的稳定性。

所述RNA适配体的制备方法，利用T7 RNA聚合酶体外转录体系转录生成，具体包括以下步骤：

（1）人工合成制备转录用DNA模板，根据RNA适配体序列，人工合成制备转录用DNA链模板，具体为：首先人工合成单链DNA模板，然后以人工合成单链DNA序列为模板，PCR扩增得到双链DNA片段后即可作为后续体外转录反应所需模板；扩增后产物回收备用；

所述单链DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

5’-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA GCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCACACGCACAGAGCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCAAAGCCTCCGGCCTAAACCAGAAGACATGGTAGGTAGCGGGGTTACCGATGTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA；

需要说明的是，上述序列中带下划线标记部分序列为T7启动子序列，加黑标记部分序列为转录后生成RNA适配体的模板序列；

PCR扩增设计引物序列如下：

上游引物，Sp-u：5-CGATCCCGCGAAATTAATACG，

下游引物，Sp-d：5-TGGCGCCCGAACAGGGAC；

PCR反应体系设置如下：

人工合成单链DNA模板，1 ng/μL、1 μL；

上游引物、Sp-u，10 μM、2 μL；

下游引物、Sp-d，10 μM、2 μL；

Taq DNA Polymerase，5 U/μL、1 μL；

10 x Taq Buffer with KCl，5 μL；

MgCl₂，25 mM、5 μL；

dATP，100 mM、1 μL；

dTTP，100 mM、1 μL；

dGTP，100 mM、1 μL；

dCTP，100 mM、1 μL；

H₂O，30 μL；

PCR程序设置如下：1）95℃变性3 min；2）95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；3）72℃延伸5 min；

需要说明的是，上述双链DNA模板也可采用如下方式制备获得， 1）人工合成短引物，然后通过搭桥PCR扩增得到长双链DNA片段；2）人工合成两条互补单链DAN片段，然后将它们退火配对成双链DNA片段；3）人工直接合成长双链DNA片段；

（2）体外转录RNA适配体，利用T7 RNA聚合酶构建体外转录体系，转录RNA适配体，体外转录体系设置如下：

5x转录缓冲液，20 μL；

ATP，100 mM、2 μL；

GTP，100 mM、2 μL；

CTP，100 mM、2 μL；

UTP，100 mM、2 μL；

步骤（1）所制备DNA模板，0.1 μg/μL、10 μL；

RNA酶抑制剂，40 U/μL、4 μL；

T7 RNA 聚合酶，10 U/μL、4μL；

焦磷酸酶，0.1 U/μL、4 μL；

MgCl₂，100 mM、2 μL；

V/V 0.1%的DEPC水，48 μL；

37℃下反应2 h后加入DNase I 2μL，继续在37℃下反应30 min，然后加入2 μL EDTA（0.5 M）溶液终止反应；

将终止后反应液在70℃条件下加热5 min，然后缓慢退火至室温（退火后RNA适配体自动折叠成如图2所示二级结构），冰上放置备用即可；此时由于反应液中含有RNA适配体，因此可直接应用，亦可提纯后再行使用。

（3）提纯，将步骤（2）中冰上放置备用混合液进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶（含有8 M尿素）电泳；电泳结束后，切下含有RNA产物的凝胶块；所切凝胶块用TE(10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA)溶液在37℃下浸泡12 h，然后以12000 rpm/min离心10 min，取上清；将上清中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，在4℃以12000 rpm/min离心20 min，可见白色RNA沉淀，然后弃去上清，将沉淀用75%乙醇洗两次，即可得到纯的RNA适配体产物。

所述RNA适配体用于体外酶促反应cGAMP生成量检测，检测体系设置如下：

酶促反应产物，80 μL；

含有RNA适配体混合物，10 μL；

KCl（1.5 M），8 μL；

MgCl₂（100 mM），5 μL；

DFHBI (1 mM)，1 μL；

检测体系在冰上配制，各组分混合均匀后，放入恒温孵育器中，25℃下结合30 min，然后加入到96孔微孔板中，利用荧光微孔板读数仪检测荧光信号，从而确定cGAMP生成量。

所述酶促反应产物，为利用原核表达系统表达纯化VC0179酶蛋白所进行的cGAMP酶促反应生成物，VC0179酶蛋白基因编号为GeneBank：NC_002505.1。

本发明的主要技术原理如图3所示：在cGAMP存在下，RNA适配体的VC2/g20a特异性的识别、结合底物分子cGAMP，一旦与cGAMP结合，VC2/g20a的结构发生转变从而诱导spinach2与DFHBI结合生成类似绿色荧光蛋白的复合物，可以在激发波长和发射波长分别为488 nm和513 nm的状态下检测该复合物；如果无cGAMP存在，VC2/g20a的结构不会发生转变，不能诱导Spinach2与DFHBI结合形成类似绿色荧光蛋白的复合物。

本发明提供了一种体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，同时提供了一种利用该RNA适配体的简单、快捷的体外酶促反应cGAMP生成量检测方法。相较于现有的cGAMP生成量检测方法，本发明的主要技术优点体现在：1、本发明中的RNA适配体通过体外转录获得，实际使用过程中无需进一步切胶纯化，较好的保证了RNA适配体的完整性；2、相较于HPLC法，检测成本低廉，操作简便，相较于TLC法，操作安全无风险，检测样品数量大，可实现大规模样品检测；3、本发明中的RNA适配体可进一步纯化或者与其他试剂完善配制成标准化检测试剂盒，便于检测使用。综上，本发明所提供的RNA适配体及体外酶促反应cGAMP生成量检测方法，具有较好的优点及较好的推广应用价值。

附图说明

图1为cGAMP的分子结构图；

图2为本发明所提供的RNA适配体二级结构示意图；注意，图2中相应框形标记仅是为了区分各部分结构，并非对于具体结构的限制；

图3为RNA适配体检测cGAMP生产量的原理示意图；

图4为纯化得到的VC0179酶蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图5为RNA适配体检测VC0179酶蛋白酶促反应cGAMP的生成量结果，其中第一列为无添加底物分子ATP和GTP但含有VC0179酶蛋白的对照组，所读取的荧光值作为背景信号，第二列为添加有底物分子ATP和GTP但未添加VC0179酶蛋白的对照组；其他列为具体的试验组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，在具体介绍实施例前，首先对本发明中所用到的部分仪器设备及试剂简要介绍如下。

主要实验仪器设备有：

PCR仪，Biometra，Germany；

离心机、恒温孵育器，Eppendorf，Germany；

紫外分光光度计，Thermo Scientific，USA；

荧光微孔板读数仪，Thermo Scientific，USA；

超声波破碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；

电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

主要试剂有：

T7 RNA聚合酶、焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、NTP Mix、限制性内切酶HindIII和XhoI等购买于Fermentas (Thermo Scientific)公司；

DFHBI购买于Lucerna（USA）公司；

镍NTA琼脂糖凝胶购买于GE (USA) 公司；

DEPC水由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；

HEPES由上海生工生物工程公司提供。

需要说明的是，实施例中所用PCR所用引物以及DNA序列合成于上海生工生物工程公司。

本发明中体外酶促反应cGAMP生成方法，以原核表达系统表达纯化的霍乱弧菌VC0179酶蛋白为cGAMP合成酶，其基因编号为GeneBank: NC_002505.1，酶促反应生成cGAMP的具体过程如下。

1、利用原核表达系统表达纯化霍乱弧菌VC0179酶蛋白，具体步骤如下：

（1）构建VC0179基因的表达载体

依据VC0179基因序列，其基因编号为GeneBank: NC_002505.1，设计如下引物，

上游引物F：5’-CACGGATCCATGACCTGGAACTTCCACCAG-3’，下划线标记为HindIII酶切位点；

下游引物R：5’-AGCCTCGAGTTAACCAGAAACCATGGTAGAA-3’，下划线标记为XhoI酶切位点。

利用上述引物从霍乱弧菌基因组上通过PCR扩增得到包含VC0179基因的DNA片段。

对扩增后包含VC0179基因的DNA片段经限制性内切酶HindIII和XhoI进行双酶切，同时对原核表达载体pET-28b采用HindIII和XhoI进行双酶切，分别回收双酶切产物并连接，构建pET-28b-VC0179质粒表达载体，所构建的质粒表达载体进一步进行测序验证，确保构建正确。

（2）利用大肠杆菌表达系统表达纯化VC0179酶蛋白

将步骤（1）中测序验证正确的pET-28b-VC0179质粒表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

取100 μL转化后的感受态细胞涂在含有50 μg/mL卡那抗生素的LB平板上，37℃培养过夜。

挑取单个阳性菌落接种到LB液体培养基中扩大培养，37℃下培养到OD₆₀₀=0.6~0.8时，加入1 mM IPTG诱导表达4 h。

诱导表达结束后，离心收菌。

将所收集菌体重悬后，利用超声波细胞破碎仪破碎收集的菌体(超声8 s，停4 s，共30 min)，4℃下以12000 rpm/min离心20 min，收集上清。

将上清溶液通过镍NTA琼脂糖凝胶，按其说明书操作，纯化得到VC0179蛋白，对所得纯化蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4所示。

为便于长期使用，可将纯化所得VC0179酶蛋白加入50 %甘油后-80℃存放备用。

2、利用步骤1纯化所得VC0179酶蛋白在体外进行酶促反应生成cGAMP，

酶促反应体系设置如下：

ATP (100 mM)，2 μL；

GTP (100 mM )，2 μL；

MgCl₂ (100 mM)，5 μL；

HEPES（1 M，PH 7.5），2 μL；

VC0179酶蛋白(10 μM)，用量根据需要添加；

无菌水，补充到100 μL。

上述酶促反应体系在冰上配制，混合均匀后放入恒温孵育器中，37 ℃反应2 h。

反应结束后，将反应产物煮沸10 min，然后以12000 rpm/min离心10min后收取上清。上清液用0.22 μM滤膜(Millipore)过滤备用，即可用于检测cGAMP生成量。

实施例1

本发明所提供体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示，即：

该RNA适配体具有二级结构，具体如图2所示，其中spinach2部分用于结合类似荧光素的小分子化合物，如DFHBI，从而形成类似绿色荧光蛋白的复合物，VC2/g20a部分用于特异性的识别、结合底物分子cGAMP；而tRNA部分则用以增加RNA适配体整体结构的稳定性。

所述RNA适配体的制备方法，利用T7RNA聚合酶体外转录体系转录生成，具体包括以下步骤：

（1）人工合成制备转录用DNA模板，根据RNA适配体序列，人工合成制备转录用DNA链模板，具体为：首先人工合成单链DNA模板，然后以人工所述单链DNA序列为模板，PCR扩增得到双链DNA片段后即可作为后续体外转录反应所需模板；扩增后产物回收备用；

所述单链DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

需要说明的是，上述序列中带下划线标记部分序列为T7 启动子序列（即TAATACGACTCACTATA部分序列），加黑标记部分序列为转录后生成RNA适配体的模板序列（即T7启动子后部分序列）；

PCR扩增设计引物序列如下：

上游引物，Sp-u：5-CGATCCCGCGAAATTAATACG，

下游引物，Sp-d：5-TGGCGCCCGAACAGGGAC；

PCR反应体系设置如下：

人工合成单链DNA模板，1 ng/μL、1 μL；

上游引物 Sp-u，10 μM、2 μL；

下游引物 Sp-d，10 μM、2 μL；

Taq DNA Polymerase，5 U/μL、1 μL；

10 x Taq Buffer with KCL，5 μL；

MgCl₂，25 mM、5 μL；

dATP，100 mM、1 μL；

dTTP，100 mM、1 μL；

dGTP，100 mM、1 μL；

dCTP，100 mM、1 μL；

H₂O，30 μL；

5x转录缓冲液，20 μL；

ATP，100 mM、2 μL；

GTP，100 mM、2 μL；

CTP，100 mM、2 μL；

UTP，100 mM、2 μL；

步骤（1）所制备DNA模板，0.1 μg/μL、10 μL；

RNA酶抑制剂，40 U/μL、4 μL；

T7 RNA 聚合酶，10 U/μL、4μL；

焦磷酸酶，0.1 U/μL、4 μL；

MgCl₂，100 mM、2 μL；

V/V 0.1%的DEPC水，48 μL；

37℃下反应2 h后加入DNaseI 2 μL，继续在37℃下反应30 min，然后加入2 μL EDTA（0.5 M）溶液终止反应；

将终止后反应液在70℃条件下加热5 min，然后缓慢退火至室温，冰上放置备用即可；此时由于反应液中含有RNA适配体，因此可直接应用，亦可提纯后再行使用。

实施例2

利用实施例1中所制备RNA适配体（为便于简化相关操作步骤，因而未提纯，相当于含有RNA适配体的混合物），对体外酶促反应cGAMP的生成量进行了检测，检测体系设置如下：

酶促反应产物，80 μL；

实施例1中含有RNA适配体混合物，10 μL；

KCl（1.5 M），8 μL；

MgCl₂（100 mM），5 μL；

DFHBI (1 mM)，1 μL。

所述酶促反应产物参考前述具体实施方式部分内容，需要说明的是，为检测VC0179蛋白对于cGAMP生成量的影响，设置了4个实验组，VC0179酶蛋白加入量分别为1 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL。

上述检测体系在冰上配制，各组分混合均匀后，放入恒温孵育器中，25℃下结合30 min，然后加入到96孔微孔板中，利用荧光微孔板读数仪(Thermo Scientific)检测荧光信号，从而确定cGAMP生成量。

具体检测结果如图5所示。其中第一列为无添加底物分子ATP和GTP但含有VC0179酶蛋白的对照组，所读取的荧光值作为背景信号，第二列为添加有底物分子ATP和GTP但未添加VC0179酶蛋白的对照组；其他列为具体的试验组。

从图5中可以看出，随着VC0179酶蛋白加入量的增加，利用荧光微孔板读数仪检测到的荧光信号值也随之增加，这表明，随着cGAMP生产量的增加，由RNA适配体所反应出的荧光信号值也表现出相应的增加，即通过本发明所提供的RNA适配体可以用于检测cGAMP的生成量。

为准确测定体外酶促反应中cGAMP的生成量，可进一步按如下方法进行实验：首先利用本发明所提供的RNA适配体检测不同浓度的cGAMP标准品；然后根据不同浓度cGAMP所对应的荧光信号值绘制标准曲线，从而得到荧光信号值和cGAMP浓度之间的函数关系；最后依据荧光信号值和cGAMP浓度之间的函数关系，定量求出不同的体外酶促反应中cGAMP的具体生成量数值。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 233

<212> RNA

<213> RNA适配体

<400> 1

gcccggauag cucagucggu agagcagcgg ccggauguaa cugaaugaaa uggugaagga 60

cggguccaca cgcacagagc aaaccauucg aaagaguggg acgcaaagcc uccggccuaa 120

accagaagac augguaggua gcgggguuac cgauguuguu gaguagagug ugagcuccgu 180

aacuaguuac auccggccgc ggguccaggg uucaaguccc uguucgggcg cca 233

<210> 2

<211> 264

<212> DNA

<213> DNA 模板

<400> 2

cgatcccgcg aaattaatac gactcactat agcccggata gctcagtcgg tagagcagcg 60

gccggatgta actgaatgaa atggtgaagg acgggtccac acgcacagag caaaccattc 120

gaaagagtgg gacgcaaagc ctccggccta aaccagaaga catggtaggt agcggggtta 180

ccgatgttgt tgagtagagt gtgagctccg taactagtta catccggccg cgggtccagg 240

gttcaagtcc ctgttcgggc gcca 264

Claims

1.一种体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，其特征在于，该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示，即：

GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGCGGCCGGAUGUAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCACACGCACAGAGCAAACCAUUCGAAAGAGUGGGACGCAAAGCCUCCGGCCUAAACCAGAAGACAUGGUAGGUAGCGGGGUUACCGAUGUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGUAACUAGUUACAUCCGGCCGCGGGUCCAGGGUUCAAGUCCCUGUUCGGGCGCCA。

2.权利要求1所述RNA适配体的制备方法，其特征在于，该RNA适配体利用T7 RNA聚合酶体外转录体系转录生成，具体包括以下步骤：

（1）人工合成制备转录用双链DNA模板，首先人工合成单链DNA模板，然后以人工合成单链DNA序列为模板，PCR扩增得到双链DNA片段后即可作为后续体外转录反应所需模板；

所述单链DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

5’-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCACACGCACAGAGCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCAAAGCCTCCGGCCTAAACCAGAAGACATGGTAGGTAGCGGGGTTACCGATGTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA；

（2）体外转录RNA适配体，利用T7 RNA聚合酶构建体外转录体系，转录RNA适配体。

3.如权利要求2所述RNA适配体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中体外转录体系设置如下：

5×转录缓冲液，20 μL；

ATP，100 mM、2 μL；

GTP，100 mM、2 μL；

CTP，100 mM、2 μL；

UTP，100 mM、2 μL；

步骤（1）所制备DNA模板，0.1 μg/μL、10 μL；

RNA酶抑制剂，40 U/μL、4 μL；

T7 RNA聚合酶，10 U/μL、4μL；

焦磷酸酶，0.1 U/μL、4 μL；

MgCl₂，100 mM、2 μL；

V/V 0.1%的DEPC水，48 μL；

37℃下反应2 h后加入DNaseI 2μL，继续在37℃下反应30 min，然后加入2 μL EDTA溶液终止反应；

将终止后反应液在70℃条件下加热5 min，然后退火至室温，冰上放置备用。

4.权利要求1所述RNA适配体在体外酶促反应cGAMP生成量检测中的应用，其特征在于，检测体系设置如下：

酶促反应产物，80 μL；

RNA适配体，10 μL；

KCl，1.5 M、8 μL；

MgCl₂，100 mM、5 μL；

DFHBI，1 mM、1 μL；

5.如权利要求4所述RNA适配体在体外酶促反应cGAMP生成量检测中的应用，其特征在于，所述酶促反应产物，为利用原核表达系统表达纯化VC0179酶蛋白所进行的cGAMP酶促生成反应产物，VC0179酶蛋白基因编号为GeneBank：NC_002505.1。