KR102163425B1

KR102163425B1 - 중동호흡기증후군 바이러스 진단을 위한 세포-유리 시스템 및 이의 이용방법

Info

Publication number: KR102163425B1
Application number: KR1020180107086A
Authority: KR
Inventors: 김홍기; 김범태; 박대의; 백승화; 김미화
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2020-10-08
Also published as: KR20200028684A

Abstract

본 발명은 중동호흡기중후군 바이러스에 특이적인 RNA에 대하여 반응할 수 있는 리보조절인자를 포함하는 바이러스 검출 또는 진단용 조성물 및 그의 사용방법을 제공한다.

Description

중동호흡기증후군 바이러스 진단을 위한 세포-유리 시스템 및 이의 이용방법 {Cell-free system for middle east respiratory syndrome virus and methods of use thereof}

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스(Middle east respiratory syndrome virus; MERS virus)의 효과적인 검출 또는 진단을 위하여 세포-유리 시스템을 사용하는 기술에 관한 것이다.

세포-유리 시스템(Cell-free system)이란 세포에서 일어나는 생물학적 반응을 세포를 사용하지 않고 시험관내(in vitro) 환경에서 구축한 것을 말하며, 많은 다른 세포 소기관 없이 반응할 수 있도록 세포 내 분자 구성성분을 초원심분리를 통해 얻어낸 용액을 의미한다.

다양한 정제된 효소와 조효소의 혼합물을 이용한 세포-유리 시스템은 미생물 발효시스템과 비교하여 비용을 절감할 수 있는 생물학적 제조방법으로 여겨지고 있으며, 단백질 합성을 E.coli 배양없이 빠르게 수행할 수 있는 새로운 대체 수단으로 평가되고 있다.

핵산 서열과 직접 반응하여 핵산 서열을 조절할 수 있는 일렬의 RNA서열을 리보조절인자(또는 '스위치(Switch) RNA'라 함)라고 한다. 단백질 발현되는 과정에서 특정 mRNA의 부위와 결합(hybridization)하여 번역을 조절하거나, RNA 자체를 분해 시키기도 한다. 이와 같은 RNA 기반의 리보조절인자는 단백질 발현 제어, 대사 경로에서의 특정 대사 물질 조절 및 세포 사멸 유도등을 비롯한, 합성 생물학 분야에서 많은 적용을 위해 사용되어 왔다.

세포-유리 시스템은 세포막 없이 쉽게 조작 및 접근이 가능하고, 이전에 할 수 없었던 살아있는 병원체나 화학 촉매를 사용한 생물학적 반응을 시행할 수 있게 한다. 부산물을 생성하거나 대량의 세포배양 없이 많은 양의 생성물을 얻을 수 있게 된다. 종이 위에서 반응시킬 수 있어 휴대가 간편하며, 저비용의 바이러스를 포함하는 다양한 진단 플랫폼으로 제작할 수 있는 장점을 바탕으로 살균된 상태로 의료, 건강, 산업, 연구, 교육 등의 다양한 분야에 배포 및 적용할 수 있다. 또한, 눈으로 검출할 수 있도록 색깔로 측정할 수 있는 생산물을 만들어 현미경 없이 현장에서 바로 사용할 수 있기 때문에 차세대 진단 시스템으로 각광받고 있다.

한편, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스로, 코로나바이러스(Coronaviridae) 군에 속하며 사스 코로나바이러스와 유사한 바이러스로 알려져 있다. 최근 중동 외 미국이나 영국까지 확산되고 있어 해당 국가의 여행력이 있는 경우 증상이 나타나면 객담이나 폐포세척액, 분변, 혈액 등의 검체에서 분자생물학적 방법이나 항체 검출을 하여 확진할 수 있다.

최근들어, MIT의 Collins 그룹에서는 PT7 세포-유리 시스템과 S30 E. coli 세포 추출 시스템을 이용하여 비교하였고, PT7 시스템은 NEB회사에 판매하는 사용 세포-유리 유전자 발현 시스템으로서 S30 시스템보다 50배 정도의 민감성의 보이는 것을 확인하였고, 세포-유리 시스템과 리보조절인자를 이용하여 지카 바이러스를 검출하는데 성공하였으나, 본 발명에서와 같이 '중동호흡기증후군 바이러스 진단용 세포-유리 시스템'에 대해서는 개시된 바가 없다.

1. 대한민국 공개특허 제2015-0083115호

1. Cell. (2014) 159;940-954 2. Cell. (2016) 165;1255-1266

본 발명의 세포-유리 시스템은 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단을 위한 저비용 고효율 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여,

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스(Middle East respiratory syndrome virus, MERS virus) 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자 서열을 제공한다. 상기 중동호흡기증후군 바이러스 특이적인 RNA는 upE, orf1a, orf1b, N 및 RdRp 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인 리보조절인자일 수 있다. 상기 중동호흡기증후군 바이러스 특이적인 RNA는 서열 1 내지 5 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것인 리보조절인자일 수 있다.

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자를 발현할 수 있는 벡터를 제공한다. 상기 리보조절인자는 검출가능한 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 리포터 유전자는 eGFP, mNeonGreen, Ypet, SYFP, mScarlet-i, mCherry, luciferase 또는 lacZ에서 선택되는 것인 벡터일 수 있고, 바람직하게는 eGFP 또는 lacZ이다. 상기 벡터는 벡터는 pET21a, pET32a, pGEM, pBT7 또는 pBIC-A를 포함하는 것일 수 있다. 상기 리보조절인자는 EcoRV, NruI, HindIII, BamHI 또는 Eco-R1 제한효소 위치에 클로닝되는 것인 벡터일 수 있다.

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단용 조성물을 제공한다. 상기 바이러스 검출 또는 진단은 세포외에서 반응하여 수행하는 것일 수 있다. 상기 바이러스 검출 또는 진단은 종이, 금속기판 또는 플라스틱 기판 위에서 검체와 반응시켜 수행하는 것일 수 있다. 상기 바이러스 검출 또는 진단은 형광 측정, 발광 측정, 컬러 측정 또는 눈으로 직접 확인가능한 것일 수 있다.

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자를 발현할 수 있는 벡터를 사용하여 분리된 중동호흡기증후군 바이러스를 포함하는 검체에서 바이러스의 존재유무에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 검체는 객담, 폐포세척액, 분변, 소변 및 혈액 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 다양한 검체에서 세포-유리 시스템을 사용한 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단관련 기술을 제공한다.

본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단에 있어 작은 비용으로 안정적이며 고효율로 세포-유리 시스템을 사용하는 기술을 제공한다. 이 기술은 다양한 검체에서 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단에 활용 가능하다.

도 1은 세포-유리 시스템의 개념도이다.
도 2는 세포-유리 시스템에서 종이 위에 벡터와 NEB solution을 반응시킨 결과이다.
도 3은 MERS-CoV 진단을 위한 후보 부위이다.
도 4는 실시예 2에서 사용한 pBIC-A 벡터에 리보조절인자를 삽입한 경우를 나타내는 모식도이다.
도 5는 실시예 3에서 MERS-CoV 리보조절인자의 후보 스크리닝에서 나타난 RNA 포름알데히드 겔 전기영동의 결과이다.
도 6은 실시예 3에서 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp trigger RNA 발현테스트의 결과이다.
도 7은 실시예 5의 MERS-CoV 리보조절인자와 MERS-CoV upE RNA 반응 후 나타난 형광량을 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 6의 MERS-CoV 리보조절인자와 MERS-CoV orf1a RNA 반응 후 나타난 형광량을 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 6의 MERS-CoV 리보조절인자와 MERS-CoV orf1b RNA 반응 후 나타난 형광량을 측정한 결과이다.
도 10은 실시예 6의 MERS-CoV 리보조절인자와 MERS-CoV N RNA 반응 후 나타난 형광량을 측정한 결과이다.
도 11은 실시예 6의 MERS-CoV 리보조절인자와 MERS-CoV RdRP RNA 반응 후 나타난 형광량을 측정한 결과이다.
도 12는 실시예 7의 MERS-CoV 리보조절인자와 human corovanvirus RNA를 이용하여 교차반응을 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

세포-유리 시스템은 일반적으로 다음 단계를 통해 바이러스의 존재여부를 확인할 수 있다(도1 참조). 1단계: 바이러스를 검출하기 위한 리보조절인자를 넣은 플라스미드를 제작; 2단계: 바이러스 유무 및 정량적 확인을 위해 reporter gene으로 녹색 형광을 나타내는 eGFP(Enhanced green florescence protein) 또는 눈으로 직접 확인이 가능한 lacZ를 사용함; 3단계: 세포가 아닌 마이크로튜브에 세포-유리 전사 및 번역 시약과 제작한 플라스미드를 섞어줌; 4단계 만들어진 혼합물을 종이 위에 떨어트려 동결건조 시킨 후 감염된 바이러스 등 표적 RNA를 넣어주면 리보조절인자와 반응해 reporter gene이 발현되어 바이러스 유무를 확인할 수 있다.

eGFP는 720bp의 크기를 가지며, sensor vector에 사용되어 시각적으로 확인하기 위한 reporter gene의 역할을 한다. 리보조절인자 바로 다음에 연결되어 전사를 거쳐 발현되면 형광현미경으로 녹색의 형광을 관찰할 수 있어 정량적으로 발현 여부를 확인 가능하다.

LacZ gene은 이전에 reporter gene으로 사용한 eGFP를 대신하여 사용할 수 있는 또 다른 reporter gene 중 하나로 LacZ gene은 발현됐을 경우 eGFP와 다르게 현미경 없이 눈으로 직접 관찰이 가능하다. 그만큼 사이즈가 eGFP보다 크며 CPRG(Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside)를 사용해 노란색이었던 CPRG가 lacZ gene이 발현 산물과 반응하여 점점 주황색이 되고, 최종적으로 보라색으로 변하는 것을 볼 수 있다.

본 연구에 사용된 세포-유리 시스템 solution은 PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit(NEB) 로 빠르게 유전자 발현 분석이 가능하며 E.Coli translation에 필수적인 정제된 구성성분을 대체할 세포-유리 전사/번역 시스템이다. PURExpress platform은 nuclease, protease가 없어 완전한 형태의 DNA, RNA templates 상태로 유지하고 결과적으로 단백질의 변형과 분해가 자연스럽게 일어난다. 전사와 번역은 단지 2개의 tube만을 이용해 원스텝으로 반응이 수행되며 1 시간 후에 결과를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 예비실험에서 Reporter 유전자인 eGFP가 세포-유리 시스템에서 최대 발현 농도 지점을 확인하기 위해 (saturation point) 3시간(240분)이 이상 반응하였으며, 결과적으로 eGFP는 2시간일때까지 발현이 계속 이루어지다가 포화되었다. 세포-유리 시스템에서 eGFP의 형광 발현 세기(RFU)는 대조군과 비교하여 약 600배까지 차이나는 것으로 결과를 얻었다.

세포-유리 시스템에서 NEB solution을 사용했을 때 eGFP expression 테스트를 진행한 경우 NEB solution만 넣었을 때 RFU 값이 측정되지 않지만 eGFP translation vector를 NEB solution에서 2시간 반응시킨 후 end point 값을 각각 PCR tube, 384 well plate에서 수행한 결과 eGFP가 발현된 것을 확인 할 수 있었다.

NEB solution을 사용해 세포-유리 시스템에서 eGFP가 expression 되는 시간을 테스트하기 위해 eGFP가 들어있는 translation vector와 NEB solution을 섞어 384 well에 넣고 37℃에서 5분 간격으로 4시간(240분)동안 관찰한 결과 약 150분이 지나면서 포화상태에 도달하였다. 또한, 37℃에서 5분 간격으로 30분 동안 관찰한 결과 약 20분 후 RFU가 100에 도달하였다.

시간 테스트와 마찬가지로 NEB solution을 사용해 세포-유리 시스템에서 eGFP가 발현되는 적정온도를 찾기 위해 eGFP가 들어있는 translation vector(pBT7)와 NEB solution을 섞어 384 well에 넣고 온도별로 1시간 간격으로 4시간(240분)동안 관찰한 결과 RFU 값이 농도 의존적으로 증가해 실험이 제대로 진행되었다는 것을 알 수 있었다. 4도, 10도에서는 반응이 일어나지 않았으며 20도에서는 3시간 경과 후 100가까이 RFU값이 나왔고, 37도에서 가장 발현 효율이 높은 것을 확인하였다.

또한, 세포-유리 시스템의 가장 큰 장점 중에 하나로 종이 위에서 반응이 일어나 현장진단이 가능한 것인데, 이를 확인하기 위해 종이 위에 벡터와 NEB solution을 섞어 떨어트린 후 37℃에서 2시간동안 반응 시킨 후 형광을 측정하였다. 측정 결과 eGFP와 stop codon을 제거한 경우 형광이 잘 나타나는 것을 확인하였다. 앞서 했던 실험을 종이 위에서 실현가능한 것으로 확인되었으며, 앞으로 바이러스를 진단함에 있어 충분히 적용 가능할 것으로 예상되었다(도2 참조).

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 하기 실시예에 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> MERS-CoV 리보조절인자 제작

MERS-CoV PCR 진단을 위해 WHO에서 추천하는 부위는 전부 5곳이며, upE(93bp), orf1a(84bp), orf1b(84bp), Rdrp(242bp), N(312bp) 부위로 각각의 사이즈는 100bp 내외이다(도3 참조). 본 과제는 한국에서 발생한 서열을 사용하였고, 각 서열은 다음과 같다.

upE:gcaacgcgcgattcagttcctcttcacataatcgccccgagctcgcttatcgtttaagcagctctgcgctactatgggtcccgtgtagaggct

orf1a:ccactactcccatttcgtcagcgctgattgcagttgcaaattggcttgcccccactaatgcttatatgcgcactacacatactg

orf1b:ttcgatgttgagggtgctcatgcttcccgtaatgcatgtggcaccaatgtgcctctacaattaggattttcaactggtgtga

Rdrp:tgctattagtgctaagaatagagctcgcactgttgcaggcgtgtccatacttagcacaatgactaatcgccagtaccatcagaaaatgcttaagtccatggctgcaactcgtggagcgacttgcgtcattggtactacaaagttctacggtggctgggatttcatgcttaaaacattgtacaaagatgttgataatccgcatcttatgggttgggattaccctaagtgtgatagagctatgc

N:ccttcggtacagtggagccattaaacttgacccaaagaatcccaactacaataagtggttggagcttcttgagcaaaatattgatgcctacaaaaccttccctaagaaggaaaagaaacaaaaggcaccaaaagaagaatcaacagaccaaatgtctgaacctccaaaggagcagcgtgtgcaaggtagcatcactcagcgcactcgcacccgtccaagtgttcagcctggtccaatgattgatgttaacactgattagtgtcactcaaagtaacaagatcgcggcaatcgtttgtgtttggcaaccccatc

위의 서열을 바탕으로 리보조절인자 서열을 디자인하였다. 이때 벡터가 전사되어 구조가 형성되는 과정에서 안정성을 알아보기 위하여 에너지를 계산하고 이차구조를 예측할 수 있다.

MERS-CoV 리보조절인자는 NUPACK(The nucleic acid package) 소프트웨어를 이용하여 핵산의 최소 자유 에너지(MFE) 2차구조를 계산하여 총 131개의 5' UTR 3D 서열을 분석하였고, 후보 서열을 얻었다.

대표적인 리보조절인자 서열(sensor)은 하기(서열번호 1 내지 5)와 같다.

orf1a17 sensor(서열 1) :

GGGGCAAGCCAAUUUGCAACUGCAAUCAGCGCUGACGGACUUUAGAACGAAGGAGAUAAAGAUGGUCAGCGCUGACAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

N73 sensor(서열 2) :

UUCUUAGGGAAGGUUUUGUAGGCAUCAAUAUUUUGCGGACUUUAGAACGAAGGAGAUAAAGAUGGCAAAAAAAUAUAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

Rdrp66 sensor(서열 3) :

CCAUGGACUUAAGCAUUUUCUGAUGGUACUGGCGAUGGACUUUAGAACGAAGGAGAUAAAGAUGAUCGCCAGU ACGAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

Rdrp177 sensor(서열 4) :

AACCCAUAAGAUGCGGAUUAUCAACAUCUUUGUACAGGACUUUAGAACGAAGGAGAUAAAGAUGUGUACAAAG AUAAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

Rdrp198 sensor(서열 5) :

UAUCACACUUAGGGUAAUCCCAACCCAUAAGAUGCGGGACUUUAGAACGAAGGAGAUAAAGAUGCGCAUCUUA UGAAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

<실시예 2> MERS-CoV 벡터 디자인

MERS-CoV 리보조절인자를 제작하기 위하여 시험관내 전사가 가능한 바이오니아에서 제공하는 pBIC-A 벡터를 이용하여 벡터를 제작하였다. T7 프로모터 다음에 EcoR1 사이에 클로닝 위치가 존재하며, 세포-유리 시스템에서 리포터 유전자가 발현하는지 확인하기 위하여 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp 서열 뒤에 eGFP(720bp. NC_025025.1)을 클로닝하였다(도4).

MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp 리보조절인자를 만들기 위해 시험관내에서 전사과정을 수행하여 RNA 생성능을 확인하였다. 바이오니아 시험관내 전사 벡터인 pBIC-A의 원형을 제한효소 EcoRV를 사용하여 선형을 만들고 Ambion의 전사 키트인 MEGAscript(Cat: AM1334)를 사용하여 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRP 리보조절인자를 만들었다.

<실시예 3> MERS-CoV 리보조절인자 후보 스크리닝(1)

RNA 포름알데히드 겔 전기영동을 통하여 벡터의 전사결과를 확인하였다. 후보군인 MERS-CoV upE(6, 9, 10, 22, 22, 31, 45, 51, 57, 58), orf1a(1, 16, 17, 23, 27, 28, 38, 39, 40, 46), N(5, 14, 59, 73, 114, 136, 201, 223, 234, 275) 그리고 RdRP(66, 112, 177, 120, 198)을 시험관내 전사과정 후 생성된 리보조절인자를 RNA 포름알데히드 겔 상에서 확인하였으며, 화살표로 표시된 부분에서 MERS-CoV 리보조절인자와 reporter gene으로 연결된 eGFP가 전사된 밴드가 나타남으로 인하여 리보조절인자가 시험관내 전사과정이 적절히 수행된 것으로 확인하였다(도5).

MERS-CoV 5’UTR 과 3D trigger RNA를 만들기 위해 리보조절인자와 동일하게 in vitro transcription 하여 RNA 생성능을 확인하였다. 3D trigger RNA는 실제 바이러스 센서 서열을 사용하기 전에 테스트용으로 사용한 것으로, MERS-CoV의 RNA를 의미하는 것이다. pBIC-A 벡터의 원형(circular)을 제한효소 EcoRV를 사용해 절단하여 선형(linear)을 만들고 Ambion의 transcript kit인 MEGAscript(Cat: AM1334)를 사용하여 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp trigger RNA 만들었다. 전사된 RNA가 생성되었는지는 RNA 포름알데히드 겔 전기영동으로 확인한 결과 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp trigger RNA을 RNA formaldehyde gel 상에서 밴드를 확인으로 trigger RNA가 in vitro transcription이 잘 된 것으로 확인되었다(도6).

<실시예 4> MERS-CoV 리보조절인자 후보 스크리닝(2)

나노드랍 측정을 통한 벡터 전사결과 확인을 수행하였다. 나노드랍은 생성된 RNA를 260nm에서 측정하여 나온 흡광도를 이용하여 농도로 환산한 것이다. RNA 정량시 260nm/280nm 비가 1.6~2.2 정도에서 순수도를 확인하였다.

만들어진 각 MERS-CoV 리보조절인자는 모두 평균 2.2로 순수한 RNA로 확인되었고, 결과적으로 MERS-CoV upE 리보조절인자 농도는 11718 ~ 16691 ng/ul, orf1a 리보조절인자 농도는 10914 ~ 20168 ng/ul, orf1b 리보조절인자는 9837 ~ 17330 ng/ul, N 리보조절인자 농도는 8509 ~ 14165 ng/ul, 그리고 RdRp 리보조절인자 농도는 11164 ~ 15461 ng/ul로 확인되었다. 각 후보 리보조절인자의 나노드랍 결과는 하기 표 1 내지 표 3에 정리하였다.

Nanodrop은 생성된 RNA를 260nm에서 측정하여 나온 흡광도를 이용하여 농도 환산하였다. RNA 정량시 260/280비로 리보조절인자와 같이 1.6~2.2 정도에서 순수도를 확인하며 만들어진 각 MERS-CoV trigger RNA는 모두 평균 2.1로 순수한 RNA로 확인되며, 결과적으로 MERS-CoV upE trigger RNA 농도는 12564 ng/ul, MERS-CoV orf1b trigger RNA 농도는 12785 ng/ul, MERS-CoV orf1b trigger RNA 농도는 11614 ng/ul, MERS-CoV N trigger RNA 농도는 14518 ng/ul, 그리고 MERS-CoV RdRp trigger RNA 농도는 11395 ng/ul으로 확인되었다.

Nanodrop으로 측정된 각 trigger RNA 농도를 이용하여 아래 수치에 대입하여 MERS-CoV upE, orf1a, orf1b, N 그리고 RdRp trigger RNA의 copy 수를 계산하였다. MERS-CoV RNA는 499.5 dalton/bp 이며 아보가드르수(6.022 * 10²³)를 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

Number of copies (coipes/ml) = (ng * 6.022 * 10²³) / (length * 1 * 10⁹ *499.5)

<실시예 5> MERS-CoV 리보조절인자 스크리닝

(1) MERS-CoV upE 리보조절인자

만들어진 MERS-CoV upE 리보조절인자 10종(6, 9, 10, 20, 22, 31, 45, 51, 57, 58)을 cell free protein synthesis solution에 MERS-CoV upE RNA와 함께 넣고 반응 후 생성된 형광의 양을 측정하여 MERS-CoV RNA에 반응하는 upE 리보조절인자를 확인하였다. 만들어진 MERS-CoV upE 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul)와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, MERS-CoV RNA(1 x 10¹¹ copies/ml)를 넣고 microplate reader에서 37℃온도에서 2시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인하였다. 도 7과 같이 MERS-CoV upE 리보조절인자_6번에서 대조군 대비 3.1배, MERS-CoV upE 리보조절인자_22번에서 대조군 대비 4.7배, MERS-CoV upE 리보조절인자_31번에서 대조군 대비 2.4배, MERS-CoV upE 리보조절인자_45번에서 대조군 대비 2.2배, MERS-CoV upE 리보조절인자_51번에서 대조군 대비 2.7배의 증가분이 확인 되었지만, RFU 값 평균이 1000을 넘지 못하는 것으로 관찰되어 MERS-CoV upE 리보조절인자는 선정되지 않았다(도7).

(2) MERS-CoV orf1a 리보조절인자

MERS-CoV orf1a 리보조절인자 5종(1, 16, 17, 44, 49)을 위의 upE 리보조절인자와 같은 조건으로 cell free protein synthesis solution을 이용하여 MERS-CoV orf1a RNA에 반응하는 orf1a 리보조절인자를 확인하였다. 만들어진 MERS-CoV orf1a 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul)와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, MERS-CoV RNA (1 x 10¹¹ copies/ml)를 넣고 microplate reader에서 37℃온도에서 2시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인하였다. 도 8과 같이 MERS-CoV orf1a 리보조절인자_1번에서 대조군 대비 6.1배, MERS-CoV orf1a 리보조절인자_16번에서 대조군 대비 4.5배, MERS-CoV orf1a 리보조절인자_17번에서 대조군 대비 6.4배, MERS-CoV orf1a 리보조절인자_44번에서 대조군 대비 6.7배 증가분이 확인 되었으나, MERS-CoV orf1a 리보조절인자_1번, 16번 그리고 44번의 RFU 값이 1000 이하로 나타났으며, 그에 반에 MERS-CoV orf1a 리보조절인자에서는 17번 만인 RFU 값을 1335로 확인되어 MERS-CoV orf1a 리보조절인자는 17번이 선정되었다(도8).

(3) MERS-CoV orf1b 리보조절인자

MERS-CoV orf1b 리보조절인자 10종(1, 16, 17, 23, 27, 28, 38, 39, 40, 46)을 위와 같은 조건으로 cell free protein synthesis solution을 이용하여 MERS-CoV orf1b RNA에 반응하는 orf1b 리보조절인자를 확인하였다. 만들어진 MERS-CoV orf1b 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul)와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, MERS-CoV RNA (1 x 10¹¹ copies/ml)를 넣고 microplate reader에서 37℃온도에서 2시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인함. 도 9와 같이 MERS-CoV orf1b 리보조절인자_23번에서 대조군 대비 2.7배 증가분이 관찰되었지만, RFU 값이 38으로 평균값 1000에 미치지 못하는 것으로 확인되었으며, 나머지 군에서도 평균에 미치는 값이 나타나지 않았기에 MERS-CoV orf1b 리보조절인자는 선정되지 않았다(도9).

(4) MERS-CoV N 리보조절인자

MERS-CoV N 리보조절인자 10종(5, 14, 59, 73, 114, 136, 201, 223, 234, 275)을 위와 같은 조건으로 cell free protein synthesis solution을 이용하여 MERS-CoV N RNA에 반응하는 N 리보조절인자를 확인하였다. 만들어진 MERS-CoV N 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul)와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, MERS-CoV RNA (1 x 10¹¹ copies/ml)를 넣고 microplate reader에서 37℃온도에서 2시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인하였다. 도 10과 같이 MERS-CoV N 리보조절인자_5번에서 대조군 대비 4.4배, MERS-CoV N 리보조절인자_14번에서 대조군 대비 3.5배, MERS-CoV N 리보조절인자_73번에서 대조군 대비 4.9배, MERS-CoV N 리보조절인자_136번에서 대조군 대비 2.4배 증가분, MERS-CoV N 리보조절인자_136번에서 대조군 대비 2.4배, MERS-CoV N 리보조절인자_201번에서 대조군 대비 2.4배, MERS-CoV N 리보조절인자_234번에서 대조군 대비 6.7배, MERS-CoV N 리보조절인자_275번에서 대조군 대비 5.2배 증가분이 관찰되었지만, RFU 값이 평균값 1000 이상인 군은 3개로 나타났다. MERS-CoV N 리보조절인자_73번이 RFU 3414로 가장 높은 형광값을 나타냈으며, MERS-CoV N 리보조절인자_136번은 RFU 1831, MERS-CoV N 리보조절인자_1216번은 RFU 1216 순으로 확인되었다. 따라서 MERS-CoV N 리보조절인자_73번이 선정되었다(도10)

(5) MERS-CoV RdRp 리보조절인자

MERS-CoV RdRp 리보조절인자 5종(66, 112, 177, 120, 198) 위와 동일한 조건으로 cell free protein synthesis solution을 이용하여 MERS-CoV RdRp RNA에 반응하는 RdRp 리보조절인자를 확인하였다. 만들어진 MERS-CoV RdRp 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul)와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, MERS-CoV RNA (1 x 10¹¹ copies/ml)를 넣고 microplate reader에서 37℃온도에서 2시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인하였다. 도 11과 같이 MERS-CoV RdRp 리보조절인자_66번에서 대조군 대비 13.5배, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_112번에서 대조군 대비 5.5배, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_177번에서 대조군 대비 7.6배, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_120번에서 대조군 대비 4.0배 증가분, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_198번에서 대조군 대비 5.8배 증가분이 확인되었다. RFU 값은 MERS-CoV RdRp 리보조절인자_66번이 2256, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_112번이 1192, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_177번이 11596, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_번이 1148 으로 확인되었으며, 전반적으로 MERS-CoV RdRp 리보조절인자가 5종의 MERS-CoV 리보조절인자 중에 가장 높은 반응 비율이 확인되었다. 그 중 MERS-CoV RdRp 리보조절인자_177번 가장 높은 RFU 값을 나타냈으며, MERS-CoV RdRp 리보조절인자_66번은 가장 높은 증가분을 나타내었다. 따라서 MERS-CoV RdRp 리보조절인자는 66번, 177번, 198번 순으로 선정되었다(도11).

<실시예 6> MERS-CoV 리보조절인자 스크리닝

MERS-CoV 리보조절인자 스크리닝 결과 RFU 값 평균 1000이상으로 대조군 대비 높은 증가율을 보인 MERS-CoV 리보조절인자를 선정하였다(표 4 참조).

<실시예 7> MERS-CoV 리보조절인자 교차반응 테스트

MERS-CoV 리보조절인자 스크리닝으로 확인된 MERS-CoV 리보조절인자을 이용하여 human coronavirus RNA를 이용하여 교차 반응 테스트를 실시하였다. MERS-CoV 리보조절인자(최종 농도 300 ng/ul) 와 cell free solution을 384 well에 넣고 37℃에서 20분 동안 pre-incubation하여 cell free solution에서 리보조절인자를 안정화 시킨 후, human coronavirus RNA (5 x 10¹³copies/ml)로 처리한 후 microplate reader에서 37℃온도에서 5분에 한번씩 4시간 동안 형성되는 eGFP 형광값인 RFU 값을 확인하였다. 도 12의 그래프와 같이 어느 MERS-CoV 리보조절인자에서도 human coronavirus RNA에서 반응하는 군은 확인되지 않았으며, 따라서 선정되어진 MERS-CoV 리보조절인자는 human coronavirus RNA 교차 반응이 일어나지 않는 것으로 확인되었다(도12).

이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KRICT <120> Cell-free system for middle east respiratory syndrome virus and methods of use <130> Switch RNA-01 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS virus_orf1a17 sensor <400> 1 ggggcaagcc aauuugcaac ugcaaucagc gcugacggac uuuagaacga aggagauaaa 60 gauggucagc gcugacaacc uggcggcagc gcaaaag 97 <210> 2 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS virus_N73 sensor <400> 2 uucuuaggga agguuuugua ggcaucaaua uuuugcggac uuuagaacga aggagauaaa 60 gauggcaaaa aaauauaacc uggcggcagc gcaaaag 97 <210> 3 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS virus_Rdrp66 sensor <400> 3 ccauggacuu aagcauuuuc ugaugguacu ggcgauggac uuuagaacga aggagauaaa 60 gaugaucgcc aguacgaacc uggcggcagc gcaaaag 97 <210> 4 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS virus_Rdrp177 sensor <400> 4 aacccauaag augcggauua ucaacaucuu uguacaggac uuuagaacga aggagauaaa 60 gauguguaca aagauaaacc uggcggcagc gcaaaag 97 <210> 5 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS virus_Rdrp198 sensor <400> 5 uaucacacuu aggguaaucc caacccauaa gaugcgggac uuuagaacga aggagauaaa 60 gaugcgcauc uuaugaaacc uggcggcagc gcaaaag 97

Claims

중동호흡기증후군 바이러스(Middle East respiratory syndrome virus, MERS virus) 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 서열 1 내지 5 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것인 리보조절인자
삭제
삭제
청구항 제1항의 리보조절인자를 발현할 수 있는 벡터
제4항에 있어서, 상기 리보조절인자는 검출가능한 리포터 유전자를 추가로 포함하는 것인 벡터
제5항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 eGFP, mNeonGreen, Ypet, SYFP, mScarlet-i, mCherry, luciferase 또는 lacZ에서 선택되는 것인 벡터
제4항에 있어서, 상기 벡터는 pET21a, pET32a, pGEM, pBT7 또는 pBIC-A를 포함하는 것인 벡터
제7항에 있어서, 상기 리보조절인자는 EcoRV, NruI, HindIII, BamHI 또는 Eco-R1 제한효소 위치에 클로닝되는 것인 벡터
청구항 제4항의 벡터를 포함하는 중동호흡기증후군 바이러스 검출 또는 진단용 조성물
제9항에 있어서, 상기 중동호흡기증후군 바이러스 진단은 세포외에서 반응하여 수행하는 것인 조성물
제9항에 있어서, 상기 중동호흡기증후군 바이러스 진단은 종이, 금속기판 또는 플라스틱 기판 위에서 검체와 반응시켜 수행하는 것인 조성물
제9항에 있어서, 상기 중동호흡기증후군 바이러스 진단은 형광 측정, 발광 측정, 컬러 측정 또는 눈으로 직접 확인가능한 것인 조성물
청구항 제4항의 벡터를 사용하여 중동호흡기증후군 바이러스를 포함하는 검체에서 바이러스의 존재유무에 대한 정보를 제공하는 방법
제13항에 있어서, 상기 검체는 객담, 폐포세척액, 분변, 소변 및 혈액 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인 방법