CN106591494A - 鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用 - Google Patents

鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用 Download PDF

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CN106591494A CN201611270921.5A CN201611270921A CN106591494A CN 106591494 A CN106591494 A CN 106591494A CN 201611270921 A CN201611270921 A CN 201611270921A CN 106591494 A CN106591494 A CN 106591494A
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Abstract

本发明公开了一种鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用。本发明提供的引物组合由序列1至序列6所示的6种DNA分子组成。所述引物组合可应用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒，还可应用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。本发明成功建立了甲型流感病毒的RT‑LAMP检测方法。本发明所建立的检测方法准确性高、灵敏度高、特异性强，具有极大的应用前景。

Description

鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术应用领域，具体涉及一种鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，具有传染性强、传播速度快的特点。流感病毒主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。流感典型的临床症状是高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状，一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。世界卫生组织估计北半球每年1亿人感染流感，5000万次就诊，30万次住院，每年1万人死于流感，主要是虚弱的老年人。该病是由流感病毒引起，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。乙型流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部暴发。丙型流感病毒的抗原稳定，且致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲、乙型流感病毒的临床症状相似，引起的病症较严重，特别是甲型，导致的住院率四倍于乙型，由于易于与其他呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难，因此实验室诊断显得非常重要。
早期快速诊断流感感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。目前检测常见流感病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阳性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义；酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体，但一次仅能检测一种病毒。PCR检测法近年来在临床检测中应用颇多，如常规PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR等，在病原微生物的检测以及疾病诊断方面作用重大，但其一般需要能够进行精密控温的仪器来进行高级复杂的分析，并且对检测人员的操作要求较高，反应时间较长，不适用于样品的现场检测，不利于基层推广，无法满足疾病防控简单、快速、准确的检测要求。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)通过识别靶序列上6个特异区域的引物，在一种具有链置换特性的DNA聚合酶——Bst酶(BstDNApolymerase)的作用下，能够在恒温条件下高效、快速、特异地扩增DNA靶序列。在反应体系中加入逆转录酶，即可检测RNA靶序列。在LAMP体系中加入荧光染料，可根据反应体系中的荧光信号强度来判断反应的进行情况。目前，LAMP技术已经被广泛应用于病原微生物的检测中，包括人类致病微生物、动植物病毒以及寄生虫所致疾病的诊断。对LAMP技术而言，引物设计是其核心。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用。
本发明提供了一种引物组合，由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LF-1和引物LB-1组成；
所述引物F3-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-1为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-1为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(c2)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的总RNA；以总RNA为模板，采用所述引物组合进行RT-LAMP扩增反应，如果采用所述引物组合可以实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为甲型流感病毒，如果采用所述引物组合不能实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为非甲型流感病毒。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的总RNA是否含有所述引物组合的靶序列相应的RNA，如果所述总RNA中含有所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测病毒为或候选为甲型流感病毒，如果所述总RNA中不含有所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测病毒为或候选为非甲型流感病毒。
本发明还保护一种检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的方法，包括如下步骤：提取待测样本的总RNA；以总RNA为模板，采用所述引物组合进行RT-LAMP扩增反应，如果所述采用引物组合可以实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测样本感染或疑似感染了甲型流感病毒，如果采用所述引物组合不能实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测样本未感染或疑似未感染甲型流感病毒。
本发明还保护一种检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总RNA是否含有所述引物组合的靶序列相应的RNA，如果所述总RNA中含有所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测样本感染或疑似感染了甲型流感病毒，如果所述总RNA中不含有所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测样本未感染或疑似未感染甲型流感病毒。
以上任一所述RT-LAMP扩增反应体系中F3-1的终浓度为0.3-0.5μM，B3-1的终浓度为1-2μM，FIP-1的终浓度为2.4-3.4μM，BIP-1的终浓度为2.4-3.4μM，LF-1的终浓度为1-2μM，LB-1的终浓度为1-2μM。
所述F3-1的终浓度具体可为0.3μM，B3-1的终浓度具体可为2μM，FIP-1的终浓度具体可为2.4μM，BIP-1的终浓度具体可为2.4μM，LF-1的终浓度具体可为1μM，LB-1的终浓度具体可为1μM。
以上任一所述RT-LAMP扩增反应体系中还含有荧光染料Eva-Green。
以上任一所述RT-LAMP扩增的反应体系具体组成可为：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μLddH2O。
所述混合引物即为所述引物组合I中的各条引物组成的混合物。
以上任一所述RT-LAMP扩增的反应程序具体可为：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
本发明还保护引物组合II或引物组合III。
所述引物组合II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LF-2和引物LB-2组成；
所述引物F3-2为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-2为如下(d3)或(d4)：
(d3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-2为如下(d5)或(d6)：
(d5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(d6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-2为如下(d7)或(d8)：
(d7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(d8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-2为如下(d9)或(d10)：
(d9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(d10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-2为如下(d11)或(d12)：
(d11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(d12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-3、引物BIP-3、引物LF-3和引物LB-3组成；
所述引物F3-3为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(e2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-3为如下(e3)或(e4)：
(e3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(e4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-3为如下(e5)或(e6)：
(e5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(e6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-3为如下(e7)或(e8)：
(e7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(e8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-3为如下(e9)或(e10)：
(e9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(e10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-3为如下(c11)或(c12)：
(e11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(e12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合II的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
所述引物组合III的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
本发明还保护所述的引物组合II或引物组合III的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合II的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(c2)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。
本发明还保护含有所述引物组合III的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(c2)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。
以上任一所述待测病毒具体可为肠道病毒71型(EV71)、甲型流感病毒(IAV)或鸭肝炎病毒(DHV)。
本发明成功建立了甲型流感病毒的RT-LAMP检测方法。本发明所建立的检测方法准确性高、灵敏度高、特异性强。由于设计了一对环引物，极大地加速了反应的进程，缩短了反应所需的时间。在本发明检测方法中加入了荧光染料Eva-Green。该染料能够在反应液配制时加入，反应过程中，能够通过采集的荧光值变化来检测反应情况，无需开盖，极大地降低了污染的可能性，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为实施例3反应温度为62.5℃时得到的扩增曲线。
图2为实施例3反应温度为63℃时得到的扩增曲线。
图3为实施例3反应温度为64℃时得到的扩增曲线。
图4为实施例3反应温度为65℃时得到的扩增曲线。
图5为实施例4反应体系1的扩增结果。
图6为实施例4反应体系2的扩增结果。
图7为实施例4反应体系3的扩增结果。
图8为实施例4反应体系4的扩增结果。
图9为实施例4反应体系5的扩增结果。
图10为实施例4反应体系6的扩增结果。
图11为实施例4反应体系7的扩增结果。
图12为实施例5中甲型流感病毒(IAV)为模板的扩增结果。
图13为实施例5中肠道病毒71型(EV71)为模板的扩增结果。
图14为实施例5中人疱疹病毒(EBV)为模板的扩增结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的RT-LAMP扩增中使用的Reaction Mix.和酶Mix.均来自Loopamp RNA扩增反应试剂盒。
Loopamp RNA扩增反应试剂盒：日本荣研化学。
鸭肝炎病毒减毒疫苗：南京天邦生物科技有限公司。
实施例1、引物设计及制备
进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定甲型流感病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定甲型流感病毒的三套引物组合。
用于鉴定甲型流感病毒的引物组合I，包括一对外引物(F3-1、B3-1)，一对内引物(FIP-1、BIP-1)和一对环引物(LF-1、LB-1)，各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-1(序列表的序列1)：CTTCTAACCGAGGTCGAA；
B3-1(序列表的序列2)：CCCTTAGTCAGAGGTGAC；
FIP-1(序列表的序列3)：CAAGTCTCTGTGCGATCTCGGCTACGTACGTTCTCTCTATCAT；
BIP-1(序列表的序列4)：GTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCAGGATTGGTCTTGTCTTTAGC；
LF-1(序列表的序列5)：TTGAGGGGGCCTGACGG；
LB-1(序列表的序列6)：GAGGTTCTCATGGAATG。
用于鉴定甲型流感病毒的引物组合II，包括一对外引物(F3-2、B3-2)，一对内引物(FIP-2、BIP-2)和一对环引物(LF-2、LB-2)，各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-2(序列表的序列7)：GCTAAAGACAAGACCA；
B3-2(序列表的序列8)：TGCTTTGTCCATGTTAT：
FIP-2(序列表的序列9)：ACTGGGCACGGTGAGCGTGAATCCTGTCACCTCTGACTAA；
BIP-2(序列表的序列10)：GAGCGAGGACTGCAGCGTAGTTGGATCCCCGTTCCCATTAA；
LF-2(序列表的序列11)：ACAAATCCTAAAATCC；
LB-2(序列表的序列12)：GCTTTGTCCAAAATGC。
用于鉴定甲型流感病毒的引物组合III，包括一对外引物(F3-3、B3-3)，一对内引物(FIP-3、BIP-3)和一对环引物(LF-3、LB-3)，各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-3(序列表的序列13)：TGAGTCTTCTAACCGAGGT；
B3-3(序列表的序列14)：TACGCTGCAGTCCTCGCTC；
FIP-3(序列表的序列15)：AGTCTCTGTGCGATCTCGGCTTTCGAAACGTACGTTCTCTCTA；
BIP-3(序列表的序列16)：AAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTACTGGGCACGGTGAGCGTGA；
LF-3(序列表的序列17)：GGGCCTGACGGGATGA；
LB-3(序列表的序列18)：GGATTTTAGGATTTGTGT。
实施例2、引物优化
1、人工制备甲型流感病毒RNA标准品溶液，RNA序列如序列表的序列19所示。
2、取步骤1得到的甲型流感病毒RNA标准品溶液，95℃加热30s，以加热后的RNA标准品溶液作为模板，分别采用实施例1中制备的引物组合I、引物组合II和引物组合III进行RT-LAMP扩增。
当采用引物组合I时，RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH2O。混合引物即引物组合I中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-1的终浓度为0.3μM，B3-1的终浓度为2μM，FIP-1的终浓度为2.4μM，BIP-1的终浓度为2.4μM，LF-1的终浓度为1μM，LB-1的终浓度为1μM。
当采用引物组合II时，RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL ReactionMix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH2O。混合引物即引物组合II中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-2的终浓度为0.3μM，B3-2的终浓度为2μM，FIP-2的终浓度为2.4μM，BIP-2的终浓度为2.4μM，LF-2的终浓度为1μM，LB-2的终浓度为1μM。
当采用引物组合III时，RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH2O。混合引物即引物组合III中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-3的终浓度为0.3μM，B3-3的终浓度为2μM，FIP-3的终浓度为2.4μM，BIP-3的终浓度为2.4μM，LF-3的终浓度为1μM，LB-3的终浓度为1μM。
RT-LAMP扩增的反应程序：64℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
结果显示，采用引物组合I、引物组合II或引物组合III对模板进行扩增均可以得到扩增曲线，采用引物组合I时，反应体系的出峰时间早于采用引物组合II或引物组合III时反应体系的出峰时间，引物组合I为最优引物组合。
实施例3、反应温度优化
1、人工制备甲型流感病毒RNA标准品溶液，RNA序列如序列表的序列19所示。
2、取步骤1得到的甲型流感病毒RNA标准品溶液，95℃加热30s，以加热后的RNA标准品溶液作为模板，采用实施例1中制备的引物组合I进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH2O。混合引物即引物组合I中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-1的终浓度为0.3μM，B3-1的终浓度为2μM，FIP-1的终浓度为2.4μM，BIP-1的终浓度为2.4μM，LF-1的终浓度为1μM，LB-1的终浓度为1μM。
RT-LAMP扩增的反应程序：一定温度下恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
分别设置如下反应温度：
反应温度I：62.5℃；
反应温度II：63℃；
反应温度III：64℃
反应温度IV：65℃。
每个反应体系设置3次重复。
结果如图1-图4所示。图1为反应温度为62.5℃时得到的扩增曲线。图2为反应温度为63℃时得到的扩增曲线。图3为反应温度为64℃时得到的扩增曲线。图3为反应温度为65℃时得到的扩增曲线。图1-图4中，横坐标为循环数，纵坐标为ΔRn。
结果表明，反应温度为65℃时，检测效果最好。
实施例4、灵敏度
1、用ddH2O10倍梯度稀释实施例2步骤1得到的甲型流感病毒装甲RNA标准品溶液，得到各个稀释液。
2、将步骤1得到的各稀释液95℃加热1min，以加热后的稀释液作为模板，采用实施例1中制备的引物组合I进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH20。混合引物即引物组合I中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-1的终浓度为0.3μM，B3-1的终浓度为2μM，FIP-1的终浓度为2.4μM，BIP-1的终浓度为2.4μM，LF-1的终浓度为1μM，LB-1的终浓度为1μM。
RT-LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×107个拷贝；
反应体系2中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×106个拷贝；
反应体系3中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×105个拷贝；
反应体系4中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×104个拷贝；
反应体系5中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×103个拷贝；
反应体系6中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×102个拷贝；
反应体系7中，甲型流感病毒RNA的初始含量为2×101个拷贝。
每个反应体系设置4次重复。
结果如图5-图11所示。图5为反应体系1的扩增结果。图6为反应体系2的扩增结果。图7为反应体系3的扩增结果。图8为反应体系4的扩增结果。图9为反应体系5的扩增结果。图10为反应体系6的扩增结果。图11为反应体系7的扩增结果。图5-图11中，横坐标为循环数，纵坐标为ΔRn。
结果表明，本方法最低检出限为200个拷贝的病毒核酸。
实施例5、特异性
待测样本为人工制备的肠道病毒71型(EV71)装甲RNA标准品溶液(RNA序列如序列表的序列19所示)、人工制备的甲型流感病毒(IAV)装甲RNA标准品溶液(RNA序列如序列表的序列20所示)、鸭肝炎病毒减毒疫苗。
1、提取待测样本的总RNA。
2、以步骤1提取的总RNA作为模板，分别采用实施例1中制备的引物组合I进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH2O。混合引物即引物组合I中的各条引物组成的混合物。反应体系中，F3-1的终浓度为0.3μM，B3-1的终浓度为2μM，FIP-1的终浓度为2.4μM，BIP-1的终浓度为2.4μM，LF-1的终浓度为1μM，LB-1的终浓度为1μM。
RT-LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
每个反应体系设置3次重复。
结果如图12-图14所示。图12为甲型流感病毒(IAV)装甲RNA标准品溶液的扩增结果，图13为肠道病毒71型(EV71)装甲RNA标准品溶液的扩增结果，图14为鸭肝炎病毒(DHV)的扩增结果。图12-图14中，横坐标为时间(min)，纵坐标为荧光强度。
结果表明，只有甲型流感病毒的样本可以得到阳性扩增曲线，肠道病毒71型或鸭肝炎病毒的样本均未得到阳性扩增曲线，本方法具有良好的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 鉴定甲型流感病毒的引物组合及其应用
<160> 20
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cttctaaccg aggtcgaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cccttagtca gaggtgac 18
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
caagtctctg tgcgatctcg gctacgtacg ttctctctat cat 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gtctttgcag ggaagaacac cgatcaggat tggtcttgtc tttagc 46
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ttgagggggc ctgacgg 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
gaggttctca tggaatg 17
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gctaaagaca agacca 16
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
tgctttgtcc atgttat 17
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
actgggcacg gtgagcgtga atcctgtcac ctctgactaa 40
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gagcgaggac tgcagcgtag ttggatcccc gttcccatta a 41
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
acaaatccta aaatcc 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
gctttgtcca aaatgc 16
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
tgagtcttct aaccgaggt 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
tacgctgcag tcctcgctc 19
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
agtctctgtg cgatctcggc tttcgaaacg tacgttctct cta 43
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
aagaccaatc ctgtcacctc tgactactgg gcacggtgag cgtga 45
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
gggcctgacg ggatga 16
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
ggattttagg atttgtgt 18
<210> 19
<211> 891
<212> RNA
<213> 肠道病毒71型
<400> 19
ggagauaggg uggcagaugu aauugaaagu uccauaggag auagcgugag cagagcccuc 60
acucacgcuc uaccagcacc cacaggccag aacacacagg ugagcaguca ucgacuggau 120
acaggcaagg uuccagcacu ccaagcugcu gaaauuggag caucaucaaa ugcuagugac 180
gagagcauga uugagacacg cuguguucuu aacucgcaca guacagcuga gaccacucuu 240
gauaguuucu ucagcagggc gggauuaguu ggagagauag aucucccucu uaagggcaca 300
acuaacccaa augguuaugc caacugggac auagacauaa cagguuacgc gcaaaugcgu 360
agaaagguag agcuauucac cuacaugcgc uuugaugcag aguucacuuu uguugcgugc 420
acacccaccg gggaaguugu cccacaauug cuccaauaua uguuugugcc accuggagcc 480
ccuaagccag auucuaggga aucccuugca uggcaaaccg ccacuaaccc cucaguuuuu 540
gucaagcugu cagacccucc agcgcagguu ucagugccau ucaugucacc ugcgagugcu 600
uaucaauggu uuuaugacgg auaucccaca uucggagaac acaaacagga gaaagaucuu 660
gaauacgggg cauguccuaa uaacaugaug ggcacguucu cagugcggac uguggggacc 720
uccaagucua aguacccuuu agugguuagg auuuacauga ggaugaagca cgucagggcg 780
uggauaccuc gcccgaugcg uaaccagaac uaccuauuca aagccaaccc aaauuaugcu 840
ggcaacucca uuaagccaac uggugccagu cgcacagcga ucaccacucu u 891
<210> 20
<211> 982
<212> RNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 20
augagucuuc uaaccgaggu cgaaacguac guucuuucua ucaucccguc aggcccccuc 60
aaagccgaga ucgcgcagag acuggaaagu gucuuugcag gaaagaacac agaucuugag 120
gcucucaugg aauggcuaaa gacaagacca aucuugucac cucugacuaa gggaauuuua 180
ggauuugugu ucacgcucac cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgcuuuguc 240
caaaaugccc uaaaugggaa uggggacccg aacaacaugg auagagcagu uaaacuauac 300
aagaagcuca aaagagaaau aacguuccau ggggccaagg aggugucacu aagcuauuca 360
acuggugcac uugccaguug caugggccuc auauacaaca ggaugggaac agugaccaca 420
gaagcugcuu uuggucuagu gugugccacu ugugaacaga uugcugauuc acagcaucgg 480
ucucacagac agauggcuac uaccaccaau ccacuaauca ggcaugaaaa cagaauggug 540
cuggcuagca cuacggcaaa ggcuauggaa cagauggcug gaucgaguga acaggcagcg 600
gaggccaugg agguugcuaa ucagacuagg cagaugguac augcaaugag aacuauuggg 660
acucauccua gcuccagugc uggucugaaa gaugaccuuc uugaaaauuu gcaggccuac 720
cagaagcgaa ugggagugca gaugcagcga uucaagugau ccucucguca uugcagcaaa 780
uaucauuggg aucuugcacc ugauauugug gauuacugau cgucuuuuuu ucaaauguau 840
uuaucgucgc uuuaaauacg guuugaaaag agggccuucu acggaaggag ugccugaguc 900
caugagggaa gaauaucaac aggaacagca gagugcugug gauguugacg auggucauuu 960
ugucaacaua gagcuagagu aa 982

Claims (9)

1.引物组合，由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LF-1和引物LB-1组成；
所述引物F3-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-1为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-1为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述的引物组合的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(c2)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的方法，为方法甲或方法乙：
所述方法甲包括如下步骤：提取待测病毒的总RNA；以总RNA为模板，采用权利要求1所述引物组合进行RT-LAMP扩增反应，如果采用所述引物组合可以实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为甲型流感病毒，如果采用所述引物组合不能实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为非甲型流感病毒；
所述方法乙包括如下步骤：检测待测病毒的总RNA是否含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA，如果所述总RNA中含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测病毒为或候选为甲型流感病毒，如果所述总RNA中不含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测病毒为或候选为非甲型流感病毒。
6.一种检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的方法，为方法丙或方法丁：
所述方法丙包括如下步骤：提取待测样本的总RNA；以总RNA为模板，采用权利要求1所述引物组合进行RT-LAMP扩增反应，如果采用所述引物组合可以实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测样本感染或疑似感染了甲型流感病毒，如果采用所述引物组合不能实现以所述总RNA为模板的阳性扩增、待测样本未感染或疑似未感染甲型流感病毒；
所述方法丁包括如下步骤：检测待测样本的总RNA是否含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA，如果所述总RNA中含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测样本感染或疑似感染了甲型流感病毒，如果所述总RNA中不含有权利要求1所述引物组合的靶序列相应的RNA、待测样本未感染或疑似未感染甲型流感病毒。
7.引物组合II或引物组合III；
所述引物组合II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LF-2和引物LB-2组成；
所述引物F3-2为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-2为如下(d3)或(d4)：
(d3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-2为如下(d5)或(d6)：
(d5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(d6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-2为如下(d7)或(d8)：
(d7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(d8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-2为如下(d9)或(d10)：
(d9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(d10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-2为如下(d11)或(d12)：
(d11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(d12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物组合III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-3、引物BIP-3、引物LF-3和引物LB-3组成；
所述引物F3-3为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(e2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-3为如下(e3)或(e4)：
(e3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(e4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-3为如下(e5)或(e6)：
(e5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(e6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-3为如下(e7)或(e8)：
(e7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(e8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物LF-3为如下(e9)或(e10)：
(e9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(e10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物LB-3为如下(c11)或(c12)：
(e11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(e12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。
8.权利要求7所述的引物组合II或引物组合III的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否感染了甲型流感病毒的试剂盒。
9.含有权利要求7所述的引物组合II或引物组合III的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为甲型流感病毒；
(c2)检测待测样本是否感染了甲型流感病毒。
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