CN102952896A

CN102952896A - 一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102952896A
Application number: CN2011102485338A
Authority: CN
Inventors: 姜涛; 刘娟; 于学东; 秦鄂德; 秦成峰
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CN102952896B

Abstract

本发明公开了一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用。本发明提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本发明的实验证明，本发明的专用引物适用于对甲型流感病毒进行特异性检测。本发明的优点：(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于基层医疗单位临床标本的快速检测。

Description

一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科，分甲、乙、丙三种型别，甲型和乙型流感对人类威胁较大，其中甲型流感抗原变异频繁，可引起世界性大流行，对人类威胁最大。这类病毒所致疾病的临床表现为起病急、高热、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛，严重时可能导致人死亡，严重威胁人类健康。尤其是流感大流行传播迅速，波及范围广，发病率和死亡率高，严重威胁着人类健康。1918年的H1N1“西班牙流感”、1957年H2N2“亚洲流感”和1968年H3N2“香港流感”三次流感大流行导致全球超过5千万人死亡。最近暴发的2009年H1N1流感大流行，全球估计有数亿人感染，至少1万2千余人死亡。

流感病毒检测方法的临床意义在很大程度上取决于方法的快速性。对于流感病毒早期快速诊断对于流感流行的防控亦起着至关重要的作用。目前临床应用的流感病毒的检测方法有免疫荧光法、酶免疫测定法、免疫色谱法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR技术等。这些方法或者需时较长，或者需要特殊的仪器，难以广泛应用。免疫层析法是近年来发展的一种快速诊断技术，该技术应用免疫胶体金或免疫酶染色可使特定区域显示一定的颜色，从而实现特异性的快速免疫诊断，但灵敏度不高。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用4条特异引物在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断大量复制扩增核酸。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBR green I染料或者与钙黄绿素指示LAMP反应。SYBRgreen I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn2+结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg2+游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。由于LAMP方法试验要求条件低，结果易于判断，非常适宜缺少仪器设备的基层单位或者现场进行流感病毒的筛查。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测甲型流感病毒的专用引物。

本发明提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。

所述专用引物由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成；

所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒H1N1亚型A/Beijing/501/2009株。

所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端还可根据靶序列进行延长；所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100％的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。

本发明的第二个目的是提供一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增(LAMP)试剂。

本发明提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物。

所述扩增试剂还包括钙黄绿素；

所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；

所述的专用引物中的引物1和引物2在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L；所述的专用引物中的引物3和引物4在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L；所述的专用引物中的引物5在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为20pmol/L；

所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10μg以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。

所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为0.004U/μL；

所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；

所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为0.32U/μL；

所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50μmol/L；

所述2×环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备：将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO₄)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、吐温20(Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl₂)和dNTPs(脱氧核苷三磷酸混合物：dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；

在所述2×环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为0.2％(质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述氯化锰的浓度为1mmol/L，每种所述dNTP的浓度均为2.8mmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测甲型流感病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括所述的环介导等温扩增试剂；

所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂在制备用于鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒的试剂盒中的应用也是本发明保护的范围；

或所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中甲型流感病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

用所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物；

所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；

所述环介导等温扩增反应条件为：先60℃-65℃反应35-60min，然后75℃2min终止反应。

所述环介导等温扩增反应条件为：先63℃反应35min，然后75℃2min终止反应；

所述待测样本为咽拭子或含漱液。

本发明的检测对象不局限于咽拭子或含漱液，还可涉及动物或人的血清、尸解脏器组织等。

所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下1)-3)中的至少一种：

1)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有荧光(黄绿色荧光)，则待测样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有甲型流感病毒；

2)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若有特异扩增曲线，则待测样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；若无特异扩增曲线，则待测样本中不含有或者候选不含有甲型流感病毒；

3)电泳检测所述环介导等温扩增反应产物，得到梯度样条带的扩增反应产物，则待测样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；若环介导等温扩增反应产物不为梯度样条带，则待测样本中不含有或者候选不含有甲型流感病毒；

所述梯度样条带的大小为100bp-2000bp，所述梯度样条带的大小主要分布在100bp-2000bp间；

所述检测环介导等温扩增反应产物采用肉眼观察浊度变化、肉眼观察荧光染料变化或实时浊度仪检测，具体如下：

1)肉眼观察浊度

若肉眼观察浊度增大，则环介导等温扩增反应为阳性，表明样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；反之为阴性。

具体为核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg²⁺(或Mn²⁺)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以直接肉眼观测，根据反应液的浊度变化判断是否有特异性扩增发生和特异核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。

2)肉眼观察荧光染料变化

当采用钙黄绿素荧光染料进行反应时，若LAMP反应产物在自然光下由开始的橙色变为黄绿色且在紫外光下显荧光，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有甲型流感病毒。

具体为：应用荧光染料颜色变化进行判定时，可采用SYBR green I染料或钙黄绿素。SYBR green I染料可与双链DNA结合，但反应中有大量产物产生时，反应体系颜色变为黄绿色。核酸大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，焦磷酸根离子的存在，使得Mg²⁺游离出来，钙黄绿素和Mg²⁺结合，反应液呈现微浊的黄绿色。基于该原理，可以根据反应液的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。也可根据反应原理，选择本领域其他荧光染料进行LAMP反应的判定。

3)实时浊度仪检测

采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测反应液的浊度变化，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有甲型流感病毒。

还可以用如下方法进行检测：

4)电泳：

LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，若LAMP反应产物呈现梯状带型(100～2000bp)，则LAMP反应阳性，即表明待测样本含有或候选含有甲型流感病毒。

5)当采用SYBR green I染料时，可通过实时PCR仪及其配套程序软件实时检测反应液的荧光进行判定，当检测到荧光信号时，表明LAMP反应为阳性。

本发明的实验证明，本发明提供的专用引物和方法，适用于对甲型流感病毒(AIV)进行特异性检测和定量分析，其优点如下：(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。

附图说明

图1为在自然光(A)和紫外灯(B)下各个样本LAMP结果

图2为琼脂糖凝胶电泳图

图3为实时浊度仪扩增曲线

图4为LAMP反应特异性检测实时浊度仪扩增曲线

图5为样本的实时浊度仪扩增曲线

图6为RT-PCR检测样本结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用无机化学试剂和有机试剂均符合分子生物学实验的要求。

引物由上海英骏技术公司合成AMV逆转录酶(Avian Myeloblastosis VirusReverse Transcriptase)：普洛麦格(北京)生物技术有限公司(Promega)，cat.No.M5101。脱氧核糖核苷磷酸盐混合物(dNTPs)：普洛麦格(北京)生物技术有限公司(Promega)，cat.No.U1515。BstDNA聚合酶：NEB(北京)有限公司，cat.No.M0275。RNA提取试剂盒：RNeasy Mini Kit，QIAgen公司产品，Cat No.74014。RNA酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor)：大连宝生物(TAKARA)公司产品，cat.No.D2310。Tris盐酸盐(Tris-HCl)pH8.8：Sigma公司，cat.No.T9443。氯化钾(KCl)：Sigma公司，cat.No.P9514。硫酸镁(MgSO₄)：Sigma公司，cat.No.M3409、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)：Sigma公司，cat.No.A4418。吐温20(Tween20)：Sigma公司，cat.No.P9416。甜菜碱(Betaine)：Sigma公司，cat.No.B0300。氯化锰(MnCl₂)：Sigma公司，cat.No.M3634。钙黄绿素：Sigma公司，cat.No.17783。DMEM培养基：上海英骏生物技术有限公司，CatNo.C11885。LA-320C实时浊度仪，日本荣研公司产品。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

甲型流感病毒H1N1亚型A/Beijing/501/2009株记载在：Kang Xiao-ping，JiangTao，Li Yong-Qiang，et al.A duplex real-time RT-PCR assay for detecting H5N1avian influenza virus and pandemic H1N1 influenza virus.Virology Journal.7：113.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，该所保证，可在符合国家和军队有关生物安全管理规定下，且经相关部门批准后向有资质从事第二类病毒病原体以上的单位提供。

实施例1、LAMP反应鉴定甲型流感病毒

一、专用引物的设计以及各个专用引物的制备

根据甲型流感病毒基因组序列设计特异性引物序列如下，人工合成：

F3(序列1，引物1)：AGACGCTTTGTCCAAAATGC；

B3(序列2，引物2)：TCACAAGTGGCACACACTAG；

PIP(序列3，引物3)：CCTTGGCCCCATGGAACGTTATTTTTGGGGACCCGAACAACATG；

BIP(序列4，引物4)：TCAACTGGTGCACTTGCCAGTTTTTGTGGTCACTGTTCCCATCC；

LB(序列5，引物5)：TGCATGGGCCTCATATACAACA；

二、病毒样本的制备

1、病毒样本的制备

甲型流感病毒H1N1亚型A/Beijing/501/2009株(简称501株)的病毒液，通过蚀斑试验计算蚀斑滴度(蚀斑形成单位/毫升，PFU/ml)。使用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释，得到8种不同浓度的病毒液(浓度分别为100000PFU/ml、10000PFU/ml、1000PFU/ml、100PFU/ml、10PFU/ml、1PFU/ml、0.1PFU/ml和0.01PFU/ml)。

2、病毒基因组RNA的提取(采用RNA提取试剂盒)

将210μl病毒样本加入1.5ml离心管中，补加700μl RLT溶液和7μl β-巯基乙醇，振荡混匀后加入490μl无水乙醇，剧烈振荡后分两次加至硅胶柱中，进行硅胶柱过滤。

硅胶柱过滤：将加样后的硅胶柱10,000g离心15s；加700μl RW1缓冲液，10,000g离心15s；用500μl RPE缓冲液离心洗硅胶柱两次；将硅胶柱转至新的离心管中，10,000g离心2min；将硅胶柱转至新的离心管中，加入50μl无核酸酶水，室温静置2min，然后10,000g离心2min，收集洗脱液；在洗脱液中加入1μl RNA酶抑制剂，即为待测RNA，-80℃保存。

将得到的8种病毒RNA作为8个样本，用于下述检测。

样本1：自浓度为100000PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本2：自浓度为10000PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本3：自浓度为1000PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本4：自浓度为100PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本5：自浓度为10PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本6：自浓度为1PFU/ml的的501株病毒液提取的RNA。

样本7：自浓度为0.1PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

样本8：自浓度为0.01PFU/ml的501株病毒液提取的RNA。

三、专用引物应用于甲型流感病毒的检测

用步骤一得到的专用引物检测步骤二得到的待测样品，分别在8个0.2ml反应管中进行LAMP反应。

LAMP反应体系25μl：F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LB的浓度为20pmol/L，AMV逆转录酶0.004U/μL，Bst DNA聚合酶0.32U/μL，钙黄绿素50μmol/L，12.5ul的2×环介导等温扩增缓冲液，2.5μl待测RNA，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水补足25μl；以上浓度均为体系中的终浓度。

2×环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备：将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO₄)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、吐温20(Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl₂)和脱氧核苷三磷酸混合物(dNTPs：dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；

在所述2×环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为0.2％(质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述氯化锰的浓度为1mmol/L，每种所述脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.8mmol/L。

LAMP反应体系在63℃反应35min。恒温反应可按本领域常规方法进行，例如LA320C实时浊度仪，普通PCR仪、可控温度水浴锅等，

终止反应后，自然光下反应管的照片见图1A，1至8依次为样本1至样本8，阳性为黄绿色，阴性为橙黄色；可以看出，管1至管7(即样品1至样品7)为阳性(黄绿色)，管8(即样品8)为阴性(橙黄色)。

终止反应后紫外灯照射下反应管的照片见图1B，1至8依次为样本1至样本8，阳性为黄绿色荧光，阴性无荧光；可以看出，管1至管7(即样品1至样品7)为阳性(黄绿色荧光)，管8(即样品8)为阴性(无荧光)。

采用肉眼观察，自然光下或紫外光下检测方法的灵敏度为0.1PFU/ml。待测RNA中病毒RNA的浓度＝(0.1PFU/ml×200μl)/50μl＝0.0004PFU/μl。每个LAMP反应体系中病毒RNA的含量＝0.0004PFU/μl×2.5μl＝0.001PFU。即灵敏度为0.001PFU/反应体系。

采用紫外灯照射下观察，检测方法的灵敏度为0.001PFU/反应体系。

四、专用引物应用于甲型流感病毒的检测(琼脂糖电泳观察)

用步骤一得到的专用引物检测步骤二得到的样品1待测RNA。LAMP反应体系中可不加入钙黄绿素，其它同步骤三的LAMP反应体系。

LAMP反应体系在63℃反应35min，然后75℃2min终止反应。

终止反应后，取LAMP反应产物0.5μl进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2.5％，电泳缓冲液为1×Tris-硼酸(TBE)缓冲液，100V电泳40分钟，紫外光源下观察电泳结果。

结果见图2，泳道1为样品1的LAMP反应产物，为阳性，LAMP产物可见典型梯度样的条带带型(100bp-2000bp)。

五、专用引物应用于甲型流感病毒检测(实时浊度仪)

LAMP反应体系同步骤三的LAMP反应体系。将LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63℃反应35min，然后75℃2min终止反应。反应体系中可不加入钙黄绿素。

实时浊度仪扩增曲线见图3，从上到下的曲线依次为样本1-8，样本1至样本7有特异的扩增曲线(有明显的S曲线)，为阳性，样本8为阴性。

浊度仪观察的灵敏度为0.01PFU/反应体系。

六、LAMP反应特异性检测

用步骤一得到的专用引物检测步骤二得到的样本1RNA，以H3N2亚型A/Beijing/073103/2009株，H5N1亚型A/Beijing/01/2003株，副流感2型病毒Greer株，副流感3型病毒C243株，腺病毒7型Gomen株，呼吸道合胞病毒Long株，乙型流感病毒B/Hong Kong/5/72株为对照。上述病毒(均为100000PFU/ml)提取RNA后，采用本发明所述引物进行LAMP反应(方法与步骤五相同)，结果为图4，甲型流感病毒包括H1N1亚型A/Beijing/501/2009株，H3N2亚型A/Beijing/073103/2009株和H5N1亚型A/Beijing/01/2003株的LAMP反应均有扩增曲线，结果呈阳性，其他病毒反应均无明显扩增曲线为阴性，表明本发明所述引物有良好的特异性。

副流感2型病毒Greer株(ATCC No.VR-92)，副流感3型病毒C243株(ATCC No.VR-93)，腺病毒7型Gomen株(ATCC No.VR-7)，呼吸道合胞病毒Long株(ATCC No.VR-26)，乙型流感病毒B/Hong Kong/5/72株(ATCC No.VR-823)均可购自美国标准培养物保藏中心(ATCC)。

甲型流感病毒H3N2亚型A/Beijing/073103/2009株记载在：KangXiao-ping，JiangTao，Li Yong-Qiang，et al.A duplex real-time RT-PCR assay for detecting H5N1avian influenza virus and pandemic H1N1 influenza virus.Virology Journal.7：113.核酸数据库Genbank登陆号：JF316724。

甲型流感病毒H5N1亚型A/Vietnam/1194/2004株记载在：Ng Enders，Cheng Peter，et al.Influenza A H5N1 detection.Emerging Infectious Disease.2005.11(8)：1303-1305.核酸序列Genbank登陆号：EF587274～EF58781。

上述两种病毒公众均可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。该所保证，可在符合国家和军队有关生物安全管理规定且经相关部门批准后向有资质从事第二类病毒病原体以上的单位提供。

上述病毒均为呼吸道传染病病原体，可引起流感样的临床表征。

实施例2、待检样品LAMP反应检测

检测15份(1～15分别为#080311，#080509，#080302，#081208，#080701，#080707，#073103，#090915，#090914，#091108，#081002，#080705，#080702，#091120，#091116)临床流感疑似患者的咽拭子样本(来源于中国人民解放军总医院，已与患者签署知情同意书，同时样本为匿名随机编号)，将咽拭子浸液作为样本按实施例1的步骤二进行RNA制备，以实施例1步骤二样本1RNA作为阳性对照，无菌水作为阴性对照，用专用引物进行检测，方法同实施例1的步骤五。

实时浊度仪扩增曲线见图5，可以看出，其中14份为阳性结果(有扩增曲线)，1份为阴性结果(没有扩增曲线)，阴性样本为样本#081002。说明LAMP方法能用于检测临床病例标本中包含的甲型流感病毒。

采用《全国流感/人禽流感监测实施方案：2005-2010》甲型通用引物(上游引物：CCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGAT，下游引物为：GGCAAGTGCACCAGCAGAATAACT，退火温度为52℃)对15份样本进行RT-PCR检测，检测结果见图6(1～15分别为#080311，#080509，#080302，#081208，#080701，#080707，#073103，#090915，#090914，#091108，#081002，#080705，#080702，#091120和#091116，16为阴性对照，17为阳性对照)。由图6可以看出，#081002和阴性对照无特异扩增条带，为阴性。而其余样本和阳性对照的RT-PCR产物均有特异扩增条带，为阳性。其中，080311，#080707，#090914，#080705，#080702，#091120和#091116为弱阳性。

结果与本发明的结果一致。

Claims

1.一种检测甲型流感病毒的通用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。

3.根据权利要求1或2所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成；

4.一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、权利要求1-3所述的专用引物。

5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：

所述扩增试剂还包括钙黄绿素；

所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2×环介导等温扩增缓冲液、权利要求1-3所述的专用引物和钙黄绿素组成；

所述的专用引物中的引物1和引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L；所述的专用引物中的引物3和引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L；所述的专用引物中的引物5在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度为20pmol/L；

所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；

所述2×环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备：将KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、吐温20、甜菜碱、MnCl₂和dNTPs溶于浓度为40mmol/L、PH值为8.8的Tris盐酸盐缓冲液得到；

在所述2×环介导等温扩增缓冲液中，所述KCl的浓度为20mmol/L，所述MgSO₄的浓度为16mmol/L，所述(NH₄)₂SO₄的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为0.2％(体积百分比)，所述甜菜碱的浓度为1.6mol/L，所述MnCl₂的浓度为1mmol/L，每种所述dNTP的浓度均为2.8mmol/L；

6.一种检测甲型流感病毒的试剂盒，包括权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂；

7.权利要求1-3中任一所述专用引物或权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂在制备用于鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒的试剂盒中的应用；

或权利要求1-3中任一所述专用引物或权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒中的应用；

8.一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中甲型流感病毒的方法，包括如下步骤：

用权利要求1-3中任一所述专用引物或权利要求4或5所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物；

所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述待测样本为咽拭子；

所述甲型流感病毒为甲型流感病毒H1N1亚型A/Beijing/501/2009株。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下1)-4)中的至少一种：

1)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有荧光，则待测样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫外光下无荧光，则待测样本中不含有或者候选不含有甲型流感病毒；

所述梯度样条带的大小为100bp-2000bp。