CN101659999A

CN101659999A - 一种检测环介导等温核酸扩增技术产物的方法

Info

Publication number: CN101659999A
Application number: CN200910305164A
Authority: CN
Inventors: 高利增; 孙国明
Original assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Current assignee: TRUEHIGH TECH Co Ltd
Priority date: 2009-08-04
Filing date: 2009-08-04
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2029-08-04
Also published as: CN101659999B

Abstract

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测环介导等温核酸扩增技术(Loop－mediated isothermal amplification，LAMP)产物的方法，首先制备标记有分子探针的纳米金颗粒，用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测的DNA或RNA，再利用分子探针标记的纳米金颗粒与环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子进行分子杂交，从而促进纳米金颗粒相互靠近，导致颜色变化。根据颜色信号变化，判断待检测样品是否含有待检测的DNA或者RNA。本方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便，快速、不需要专业设备等优点。

Description

一种检测环介导等温核酸扩增技术产物的方法

技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测环介导等温核酸扩增技术产物DNA的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr.Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测环介导等温核酸扩增技术产物DNA的方法，结合环介导等温核酸扩增技术，以提高生物分子检测的灵敏度，开发一种操作简单、快速、准确、不需要专业仪器设备的方法，广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的DNA或RNA检测。

本发明提出的纳米金颗粒检测环介导等温核酸扩增技术产物DNA的方法，包括以下步骤：

(1)制备标记有分子探针的纳米金颗粒

将经过修饰的分子探针加入到纳米尺寸的金颗粒溶液中，经过反应后，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

(2)环介导等温核酸扩增目的DNA或目的RNA

环介导等温核酸扩增技术将目的DNA分子大量复制或先经逆转录后大量复制目的RNA分子，目的分子被放大10⁹倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

(3)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交(如图1所示)

将环介导等温核酸扩增技术产物DNA与纳米金颗粒上能识别环介导等温核酸扩增技术产物DNA的分子探针杂交。

(4)纳米金颗粒聚集，导致颜色改变

纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有目的DNA或RNA。

附图说明

图1纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交示意图

图2用纳米金颗粒进行HIV检测结果

图3用纳米金颗粒进行流感检测结果

图4用纳米金颗粒进行大肠杆菌检测结果

具体实施方式

实施例一

HIV检测

利用LAMP扩增技术从样品中扩增HIV病毒感染的特异性信使RNA(mRNA)，用纳米金颗粒探针检测扩增后的产物，从而判断样品的来源(人、动物)是否已被HIV感染。主要用于HIV感染的快速诊断。

实验材料与方法

1.针对HIV病毒设计LAMP扩增的引物，设计用于纳米金颗粒探针检测的巯基修饰DNA探针。

靶向序列

AAGGCTTTTAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTACAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGTTAAATACAGTAGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGATACCATCAATGAAGAGGCTGCAGAATGGGATAGATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCAGTGGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACTCTTCAGGAGCAAATAGGATGGATGACAAGTAATCCACCTATCCCAGTAGGAGA

巯基修饰的DNA探针序列

5’-AGTGGCACCAGGCCAGAAAAAAAA-SH-3’

引物序列

HIV的FIP引物

5’-TTTAACATTTGCATGGCTGCT-TACCCATGTTTACAGCATTATC-3’

HIV的BIP引物

5’-ATGAGAGAACCAAGGGGAAGT-GTCATGGATCCTATTTGCTCC-3’

HIV的F3引物

5’-AAGGCTTTTAGCCCAGAAG-3’

HIV的B3引物

5’-TCTCCTACTGGGATAGGTGG-3’

HIV的LoopF引物

5’-TAAATCTTGTGGGGTGGCTC-3’

HIV的LoopB引物

5’-CATAGCAGGAACTACTAGTACTCTT-3’

2.纳米金颗粒探针标记

取1ml纳米金颗粒(20nm，1.2nM)，4℃，13200rpm离心15分钟，去除上清，加入1ml磷酸缓冲液(10mM，pH7.0)加入35ul巯基探针达到终浓度约3uM。室温放置反应16小时。逐滴加入浓氯化钠溶液使之终浓度达到0.1M，室温反应至少40小时，期间振摇若干次。

4℃，13200rpm离心30分钟，去除上清，沉淀重悬于1ml含有0.1M NaCl的磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)，重复两次。最后4℃，13200rpm离心30分钟去除上清，沉淀重悬于100ul含有0.25M NaCl的磷酸缓冲液(10mM，pH7.0)，4℃保存。

3.RT-LAMP扩增HIV感染特异性的mRNA

在PCR反应管中进行25ul的反应，反应成分包括：0.2uM F3和B3引物，1.6uM FIP和BIP引物，0.8uM LoopF和LoopB引物，0.4M betaine(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，10mMMgSO₄，1.4mM dNTPs，1xThermoPol reaction buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，8U Bst DNA polymerase(New England Biolabs)，0.625U AMV逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，10ul提取的核酸或者热处理后的血液样品.整个反应在循环恒温水浴中进行，60℃反应60分钟，然后80℃加热2分钟终止反应。

4.纳米金颗粒探针检测

探针通过巯基偶联到纳米金颗粒表面。将LAMP扩增HIV的DNA产物经95℃反应20分钟，置冰上快速冷却，加入适量纳米金颗粒探针，55℃杂交反应1-2小时，至溶液由红色变为浅紫色。

5.鉴定

如果溶液变色，则判定样本中含有HIV感染特异性的mRNA，溶液保持红色不变则不含有HIV感染特异性的mRNA。如图2所示，左侧呈淡紫色的PCR管中的样品含有HIV感染特异性的mRNA，如果样品是血液样品，那么提供血样的人已经被HIV病毒所感染。而右侧呈红色的管中的样品则不含有HIV感染特异性的mRNA。

实施例二

流感病毒检测

利用LAMP扩增技术从样品中扩增流感病毒(H1N1，H3N2 and H5N1)M1蛋白的DNA，纳米金颗粒探针检测扩增后的DNA产物，从而判断样品中是否含有流感病毒。主要用于流感病毒的快速诊断。

实验材料与方法

1.针对流感病毒M1蛋白设计LAMP扩增的引物，设计用于纳米金颗粒探针检测的巯基修饰DNA探针。

靶向序列

ATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGGAAAGAACACCGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCGATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCACTGAGCGAGGACTGCATCGTACACTCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAATAATATGGACAGAGCAGTTAAACTGTATAGAAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATA

巯基修饰的DNA探针序列

5’-GATCGCACAGAGACTTAAAAAAAA-SH-3’

引物序列

M1的F3引物

5’-GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’

M1的B3引物

5’-TTCCCATTGAGGGCATTTTGGAC-3’

M1的BIP引物

5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAGGTACGATGCAGTCCTCGCTCAGTGGG-3’

M1的FIP引物

5’-TGTCTTTAGCCATTCCATGAGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3’

M1的LoopF引物

5’-GTTCTTTCCAGCAAAGACATC-3’

M1的LoopB引物

5’-GTGTTCACGCTCACCG-3’

2.纳米金颗粒探针标记

3.LAMP扩增流感病毒的DNA

在PCR反应管中进行25ul的反应，反应成分包括：0.2uM F3和B3引物，1.6uM FIP和BIP引物，0.8uM LoopF和LoopB引物，0.4M betaine(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，10mMMgSO₄，1.4mM dNTPs，1xThermoPol reaction buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，8U Bst DNA polymerase(New England Biolabs)，10ul提取的核酸或者热处理后的血液样品.整个反应在PCR扩增仪中进行，60℃反应60分钟，然后80℃加热2分钟终止反应。

4.纳米金颗粒探针检测

5.鉴定

如果溶液变色，则判定样本中含有流感病毒，溶液保持红色不变则不含有流感病毒。如图3所示，左侧呈淡紫色的PCR管中的样品含有流感病毒，如果样品是血液样品，那么提供血样的人已经被流感病毒所感染。而右侧呈红色的管中的样品则不含有流感病毒。

实施例三

大肠杆菌检测

利用LAMP扩增技术从样品中扩增大肠杆菌的特异性DNA，纳米金颗粒探针检测扩增后的产物，从而判断样品中是否含有大肠杆菌。主要用于大肠杆菌快速检测。

实验材料与方法

1.针对大肠杆菌设计LAMP扩增的引物，设计用于纳米金颗粒探针检测的巯基修饰DNA探针。

靶向序列

GCCATCTCCTGATGACGCATAGTCAGCCCATCATGAATGTTGCT*GTCGATGACAGGTTGTTACAAAGGGAGAAGGGCATGGCGAGCGTACAGCTGCAAAATGTAACGAAAGCCTGGGGCGAGGTCGTGGTATCGAAAGATATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG*AATTCGTGGTGTTTG TCGGACCGTCTGGCTGCGGTAAAT

巯基修饰的DNA探针序列

5’-TGTAACGAAAGCCTGGAAAAAAAA-SH-3’

引物序列

大肠杆菌的F3引物

5’-GCCATCTCCTGATGACGG-3’

大肠杆菌的B3引物

5’-ATTTACCGCAGCCAGACG-3’

大肠杆菌的BIP引物

5’-CTGGGGCGAGGTCGTGGTAT TCCGAACAAACACCACGAATT-3’

大肠杆菌的FIP引物

5’-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3’

大肠杆菌的Loop F引物

5’-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3’

大肠杆菌的Loop B引物

5’-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3’

取1ml纳米金颗粒(20nm，1.2nM)，4℃，13200rpm离心15分钟，去除上清，加入1ml磷

酸缓冲液(10mM，pH7.0)加入35ul巯基探针达到终浓度约3uM。室温放置反应16小时。逐滴加入浓氯化钠溶液使之终浓度达到0.1M，室温反应至少40小时，期间振摇若干次。

3.LAMP扩增大肠杆菌的DNA

在在PCR反应管中进行25ul的反应，反应成分包括：0.2uM F3和B3引物，1.6uM FIP和BIP引物，0.8uM LoopF和LoopB引物，0.4M betaine(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，10mM MgSO₄，1.4mM dNTPs，1xThermoPol reaction buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，8U Bst DNA polymerase(New England Biolabs)，10ul提取的核酸或者热处理后的血液样品。整个反应在PCR扩增仪中进行，60℃反应60分钟，然后80℃加热2分钟终止反应。

4.纳米金颗粒探针检测

5.鉴定

如果溶液变紫色，则判定样本中含有大肠杆菌，溶液保持红色不变则不含有大肠杆菌。如图4所示，左侧呈淡紫色的PCR管中的样品含有大肠杆菌。而右侧呈红色的管中的样品则不含有大肠杆菌。

序列表

<110>天津朝海科技有限公司

<120>一种检测环介导等温核酸扩增技术产物的方法

<130>Demo

<160>24

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>296

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>1

aaggctttta gcccagaagt aatacccatg tttacagcat tatcagaagg agccacccca 60

caagatttaa acaccatgtt aaatacagta gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta 120

aaagatacca tcaatgaaga ggctgcagaa tgggatagat tgcatccagt gcatgcaggg 180

ccagtggcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg aactactagt 240

actcttcagg agcaaatagg atggatgaca agtaatccac ctatcccagt aggaga 296

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>2

agtggcacca ggccagaaaa aaaa 24

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>3

tttaacattt gcatggctgc ttacccatgt ttacagcatt atc 43

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>4

atgagagaac caaggggaag tgtcatggat cctatttgct cc 42

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>5

aaggctttta gcccagaag 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>6

tctcctactg ggataggtgg 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>7

taaatcttgt ggggtggctc 20

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>8

catagcagga actactagta ctctt 25

<210>9

<211>355

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>9

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aggccccctc aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgctg gaaagaacac 120

cgatcttgag gctctcatgg aatggctaaa gacaagaccg atcctgtcac ctctgactaa 180

ggggatttta ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccact gagcgaggac tgcatcgtac 240

actctttgtc caaaatgccc ttaatgggaa tggggatcca aataatatgg acagagcagt 300

taaactgtat agaaagctta agagggagat aacattccat ggggccaaag aaata 355

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>10

gatcgcacag agacttaaaa aaaa 24

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>11

gagtcttcta accgaggtcg aaacg 25

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>12

ttcccattga gggcattttg gac 23

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>13

ccttagtcag aggtgacagg tacgatgcag tcctcgctca gtggg 45

<210>14

<211>41

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>14

tgtctttagc cattccatga gtcaggcccc ctcaaagccg a 41

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>15

gttctttcca gcaaagacat c 21

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>16

gtgttcacgc tcaccg 16

<210>17

<211>204

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>17

gccatctcct gatgacgcat agtcagccca tcatgaatgt tgctgtcgat gacaggttgt 60

tacaaaggga gaagggcatg gcgagcgtac agctgcaaaa tgtaacgaaa gcctggggcg 120

aggtcgtggt atcgaaagat atcaatctcg atatccatga aggtgaattc gtggtgtttg 180

tcggaccgtc tggctgcggt aaat 204

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>18

tgtaacgaaa gcctggaaaa aaaa 24

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>19

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<211>18

<212>DNA

<213>Escherichia coli

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<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>21

ctggggcgag gtcgtggtat tccgaacaaa caccacgaat t 41

<210>22

<211>42

<212>DNA

<213>Escherichia coli

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cattttgcag ctgtacgctc gcagcccatc atgaatgttg ct 42

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>23

ctttgtaaca acctgtcatc gaca 24

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>24

atcaatctcg atatccatga aggtg 25

Claims

1.一种用纳米金颗粒检测环介导等温核酸扩增技术产物DNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)制备标记有分子探针的纳米金颗粒；(2)用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的目的DNA或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的目的RNA；(3)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交；(4)杂交引发纳米金颗粒聚集，导致纳米金颗粒聚集处颜色改变，以此判断待检测样品是否含有目的DNA或RNA。

2.根据权利要求1，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。

3.根据权利要求1，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针。

4.根据权利要求1，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。

5.根据权利要求1，纳米金颗粒探针和环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发生在溶液中或者固体表面。

6.根据权利要求1，纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检测。

7.根据权利要求3，分子探针是指可以识别环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能分子，这些分子包括DNA，RNA，PNA，蛋白质，化学分子。

8.根据权利要求4，相同反应条件包括但不限于：溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反应时间等。

9.根据权利要求1，本方法可以用于检测HIV、乙肝、丙肝、包括甲型H1N1在内的流感、手足口病、脑膜炎等病毒性疾病的病原体病毒，大肠杆菌、葡萄球菌等细菌性疾病的病原体细菌，脚气、灰指(趾)甲等真菌性疾病的病原体真菌，鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体等致病衣原体。

10.根据权利要求1，本方法可以用于肿瘤的诊断，包括肝癌，肺癌，脑癌，食道癌，前列腺癌，乳腺癌，子宫癌，骨癌，白血病等恶性肿瘤，也可用于肿瘤恶性程度的鉴定。

11.根据权利要求1，本方法可以用于人体疾病的诊断、动物疾病的诊断、植物疾病的诊断、食品卫生的监测、胎儿性别的鉴定、基因变异的鉴定、单核甘酸多态性的检测、细胞内基因变化的检测。